Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Измерение кривых плавления при гибридизации с олигонуклеотидными микроматрицами: определение термодинамических параметров и диагностика мутаций

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Измерение кривых плавления при гибридизации с олигонуклеотидными микроматрицами: определение термодинамических параметров и диагностика мутаций"



^ на правах рукописи

ДРОБЫШЕВ Алексей Леонидович

ИЗМЕРЕНИЕ КРИВЫХ ПЛАВЛЕНИЯ ПРИ ГИБРИДИЗАЦИИ

С ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫМИ МИКРОМАТРИЦАМИ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ И ДИАГНОСТИКА МУТАЦИЙ

(03.00.03 - Молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва, 1997

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор, академик Мирзабеков А.Д.

инженер Ершов Г.М.

кандидат химических наук Шик В.В.

Официальные оппоненты:

д.б.н., проф. Янковский Н.К. д ф.-м. н. Лившиц М.А.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится 14,10 1997г. в К. часов на заседании дссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта по адресу 117984 г.Москва, В-334, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан (Л- VI 1997г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук ' _____----ЛтМ7~Крицын

ГУШМ 0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы:

Применение гибридизации для секвенирования ДНК было независимо предложено в конце восьмидесятых годов четырьмя группами: в СССР (Лысов и др., 1988), в Югославии (Drmanac et al., 1989) и двумя в Англии (Bains & Smith, 1988; Southern, 1988). Сущность этого метода состоит в том, что исследуемую ДНК гибридизуют со всевозможными олигонуклеотвдами длины п и определяют те из них, которые образуют совершенные дуплексы. Затем последовательность исследуемой ДНК восстанавливают по перекрывающимся участкам (длины п-1) этих олигонуклеотидов. Но из-за сложности создания микроматрицы, содержащей полный набор олигонуклеотидов достаточной длины и с достаточной степенью чистоты, в настоящее время гибридизация с олигонуклеотидными матрицами не применяется к тем задачам, для которых она была предназначена изначально. Применение данного метода сейчас лежит в области диагностики мутаций (Mirzabekov, 1994; Yershov et al, 1996, Chee et al., 1996), наблюдения экспрессии генов (Lockhart et al., 1996) и сравнительного исследования гибридизационных свойств олигонуклеотидов (Case-Green & Southern, 1994; Southern et al,1994; Williams et al, 1994). В этих применениях метод гибридизации с олигонуклеотидными микроматрицами становится весьма эффективен из-за параллельности гибридизации. Вместе с тем, необходима высокая надежность результатов гибридизации и правильность их интерпретации. Цель работы:

Целью работы была разработка метода непрерывной регистрации сигналов при гибридизации с олигонуклеотидными микроматрицами и применение его для повышения надежности гибридизационных результатов и правильности их интерпретации. Это включает в себя разработку метода регистрации кривых

плавления (как равновесного так и не равновесного) и кривых изменения сигнала при ступенчатом изменении температуры. С помощью этих базисных процедур проводится измерение термодинамических параметров для дуплексов иммобилизованных олигонуклеотидов, дискриминация перфектных и неперфектных дуплексов при диагностике мутаций, и оценка относительного количества вещества, способного гибридизоваться с данной ячейкой микроматрицы. Научная новизна:

Был разработан основанный на регистрации равновесных кривых плавления метод определения термодинамических параметров для дуплексов, иммобилизованных в геле олигонуклеотидов. Были измерены термодинамические параметры ряда дезоксиоктадуплексов и обнаружена корреляция между параметрами для иммобилизованных в геле и находящихся в растворе дуплексов. Было показано, что флюоресцентная метка слабо понижает стабильность дуплексов. Предложено объяснение найденного понижения стабильности влиянием амидных групп геля. При диагностике Р-талассемических мутаций методом регистрации неравновесных кривых плавления были определены гомозиготные и гетерозиготные мутации. Для повышения надежности идентификации мутаций были использованы кривые роста гибридизационного сигнала. Публикации

По результатам диссертации опубликованы две печатные работы, ссылки на которые даны в конце автореферата. Структура работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав (литературный обзор, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов), выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 73 страницах машинописного текста, содержит 10 рисунков и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Кривые плавления и определение термодинамических параметров

Для надежной интерпретации гибридизационных результатов необходимо знать термодинамические параметры для дуплексов, образованных иммобилизованными олигонуклеотидами, поскольку существующие данные (Breslauer et al, 1986; Doctycz et al, 1995) относятся к свободным дуплексам и могут быть неверны для иммобилизованных. Указанные данные можно получить в виде удельных стабильностей для всевозможных наборов из двух соседних комплементарных пар. Но для получения таких статистически достоверных результатов необходимо большое число экспериментов (Doctycz et al, 1995). Альтернативой этому является поиск ответа в виде корреляции между данными для раствора и матрицы, что требует меньших затрат. В настоящей работе использовались данные для октамеров вида 5'-XYZTGGAC-3', где X,Y,Z - всевозможные основания (Doctycz et al, 1995). 64 таких октамера были иммобилизованы на матрице 8 на 8 ячеек и гибридизовались с олигонуклеотидами вида 5'-НЕХ-GTCCAGTCCA***-3', где *** - ATA, AGA, GAA, ТСА, САТ, ТСС, GGG, CCG и CGC. Соответствующие комплементарные дуплексы в растворе (1M NaCl) имеют Тт от 26.1°С до 44.0°С и AG при 25°С от 0.30 до 3.97 ккал/моль.

Для исследования процесса гибридизации была создана экспериментальная установка, общая схема которой изображена на рис. 3. Она состоит из гибридизационной камеры, флюоресцентного микроскопа и компьютера IBM PC 486, на котором выполнялась программа считывания и обработки флюоресцентного изображения. Для гибридизации каплю гибридизационного раствора объемом 510 ц1 (0.5-ЗрМ меченого олигонуклеотида, IM NaCl, ЮшМ NaH3P04 1% Tween-20 ImM EDTA) помещали на микроматрицу, расплющивали до толщины 100-130 микрон и герметизировали в специальной камере. Изменяя с заданной скоростью температуру камеры и снимая флюоресцентные изображения матрицы, строили

кривые плавления. При этом специально написанная программа окружала каждую ячейку двумя концентрическими рамками, вычисляла средний сигнал внутри внутренней рамки, V, и фон -средний сигнал по пространству между внутренней и внешней рамкой, Б. Для кривых плавления использовался гибридизационный сигнал 1=(У-Р)/Р. Нормировка на фон проводилась для компенсации температурной зависимости флюоресценции метки и неравномерности возбуждающего света.

/- флюоресцентный

микроскоп

внутренняя рамка

гибридизаиионная камера

верхнее стекло

□

внешняя рамка

гибридизационный раствор

схема обработки изображения

Рис. 1. Общая схема экспериментальной установки

Поскольку количество свободных олигонуклеотидов в гибридизационном растворе было намного больше количества олигонуклеотидов, гибридизовавшихся с микроматрицей (в растворе около 10 рто1; из них гибридизовалось приблизительно 0.1 рто1), то для нахождения термодинамических параметров нельзя применять формулы, используемые при плавлении дуплексов в растворе (Магкеу & ВгеБ1аиег, 1987). В нашем случае концентрацию олигонуклеотидов в растворе Г можно считать постоянной и записать:

К-Ь=Цт-Ь] К=Щт/Ь)-1]

где К(Т) - константа равновесия, b - концентрация гибрндизовавшихся олигонуклеотидов, ш - концентрация иммобилизованных олигонуклеотидов. Поскольку b пропорционально гибридизационному сигналу J,

K=f[(A/J)-l] (1)

где А - параметр, пропорциональный количеству иммобилизованных олигонуклеотидов. Согласно уравнению Вант-Гоффа, зависимость 1п(К) от (1УТ) линейна:

In(K)=ln{exp[(AST-AH)/RT]}=(AS/R)-(AH/R),(l/T), поэтому К можно найти, подбирая величину А и линию фона для J (она обычно отрицательна, т.е., пустые ячейки темнее раствора) так, чтобы логарифм вычисленных по (1) значений константы равновесия линейно зависел от 1/Т на как можно большем интервале. Угловой коэффициент этой зависимости равен -AH/R, а аддитивная постоянная AS/R, что позволяет найти энтальпию и энтропию плавления. Свободную энергию плавления при 298К, AG0, можно найти как 1п[К(298)].

3, 1.0 отн. ед. 0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.1

0.3

0.2

0.1

О.О

К, 1000.00 jjM

100.00

10.00

1.00

0.10

0.01

V

N \

\

\ %

\

-1 0 5 10 15 20 25 30 35 10 1.'С 3.2 3.3 3.1 3.5 3.6 3.7 ГДОХ

А Б

Рис. 2. Гибридизация 5-НЕХ-СГССААСС комплементарной ячейкой. А. Кривая равновесного плавления. Б. Зависимость константы равновесия, цМ, от обратной температуры.

На рис. 2А приведена характерная кривая равновесного плавления. По ней согласно (1) была вычислена константа равновесия (рис. 2Б), которая, как видно, линейно зависит от обратной температуры. Температуру плавления Тт обычно определяют как температуру точки перегиба на кривой плавления (Магкеу & Вгеэкиег, 1987). Однако, поскольку эта величина зависит от концентраций гибридизующихся олигонуклеотидов, сравнение температур плавления для различных экспериментов часто бывает затруднено. Например, в (Оос(усг е1 а!., 1995) концентрации обоих комплементов дуплексов были равны и составляли 2 |дМ, тогда как в нашем случае имеет место избыток олигонуклеотидов в растворе по отношению к матрице. Однако, практический интерес представляет не только сравнение Дв при одной температуре (25°С) но и сравнение температур, при которых константа равновесия (или Дв) имеет одну и ту же величину.

Для этого температуру, при которой К=1цМ назовем Ту1. Если оба комплемента присутствуют в равных концентрациях с, то при температуре плавления константа равновесия К(Т„,)=с/2, что соответствует 1 цМ для результатов (Боаусг е1 а!., 1995), т.е., в этом случае Тт =ТМ. Именно эта величина быдет использоваться в дальнейшем.

Термодинамические параметры дуплексов иммобилизованных олигонуклеотидов

Вычисленные из таких зависимостей термодинамические параметры для иммобилизованных дуплексов приведены в таблице 1. В фок1усг е1 а1, 1995) приводятся только данные для Тт и Дв0, значения для ДН и Д8 могут быть рассчитаны по формулам

ДН = -ДС^ТпУСГ,,, - 298); ДБ = ДО°/(Тт - 298) Данные для ДС° были пересчитаны к стандартным условиям (ДС°=0, когда К=1М, в то время как в (Оо1аусг е1 а1, 1995) 1 цМ) вычитанием из опубликованных значений ЯТ0-1п(Ю6)= 8.16 кса1/шо1 и умножением на -1. Аналогично, из величин для ДБ следует вычесть Я-1п10б=27.4са1/то1-К

Таблица 1. Термодинамические параметры для комплементарных дуплексов на матрице и в растворе, (Бо^усг е1 а1, 1995). М -данные для матрицы, Р - данные для раствора

олигонуклеотид

ДО0, кса1/то!

ДН, кса!/то1

Д8, са1/то1К

на матрице

М

Р М

Р

М

Р

Тц, °с

м

Р

5'-ТАТТСОАС-г1"!) 5.39 8.46 32 60 91 173 3 26.5

5'-ТСТГССАС-гп,и 5.72 8.82 35 55 97 156 5 28.6

5'-ТТСТССАС-г^и 6.49 9.16 35 56 96 158 12 30.4

>'-ТСАТССАС-гти 6.31 9.46 36 57 101 161 12 31.9

)'-АТОТСОАС-гти 6.52 9.71 32 58 84 162 11 33.2

5'-ССАТССАС-гти 6.52 10.23 38 61 105 172 13 36.6

5'-СССГССАС-г"'и 7.47 10.81 34 61 89 169 20 38.5

5'-СССТССАС-гти 8.27 11.31 32 63 80 172 26 40.8

>'-СССТСОАС-гти 8.05 12.13 34 66 87 181 24 44.0

5'-САСТССАС-гяи 7.22 9.99 38 64 97 181 17 33.8

Данные таблицы 1 свидетельствуют о значительном понижении стабильности дуплексов иммобилизованных олигонуклеотидов по сравнению со свободными дуплексами в растворе. Данные для ДС° суммированы на рис. ЗА. Для них имеет место корреляция

ДС°(матрица)=а-ДС°(раствор)-§, где а=1.1+0.2; §=3.2±0.4 ккал/моль. Поскольку а в пределах погрешности равно единице, следует принять

ДС0(матрица)=ДС°(раствор)+3.2 ккал/моль. Это соотношение имеет место для дезоксиоктануклеотидных дуплексов, когда 12ккал/моль > ДС°(раствор) > 8ккал/моль. Аналогичные рис. ЗА графики для ДН и ДБ не имееют заметно выраженной корреляции, поэтому для них следует принять ДН(матрица) = ДН(раствор) - (26±4) ккал/моль Д8(матрица) = Д8(раствор) - (75±12) кал/моль-К,

График корреляции для матрицы и раствора представлен на рис ЗБ. Наилучшая линейная зависимость для точек этого графика

Тй(матрица) = 1.3-ТДраствор) - 29.5 [°С]. Это чисто эмпирическое соотношение и ему не следует придавать какой-либо физический смысл.

AG0, ккал/моль

■И ■

10 12

РАСТВОР

30 25

ЕГ 20

К

& 15 |10 5 0

■■■

25

30

35 40

РАСТВОР

45

Б

8

Рис. 3. Корреляция термодинамических параметров для матрицы и раствора. А. Дв0, ккал/моль. АС°(матрица) = Дв0 (раствор) - 3.2 ккал/моль. Б. Тц , °С. ТДматрица) = 1.3-Тц(раствор) - 29.5 [°С].

Можно предположить, что обнаруженное понижение стабильности дуплексов вызвано влиянием либо геля, либо флюоресцентной метки. Однако, существующие литературные данные для дезоксидекамеров в растворе (Morrison & Stols 1993) свидетельствуют об обратном влиянии флюоресцентной метки: прилегая с 3'-конца непосредственно к дуплексу, она слабо повышала его стабильность (в пределах погрешности измерений), а прилегая с 5'-конца давала более значительное повышение (3.5 ккал/моль для AG0 при 37°С). Для выяснения влияния метки на иммобилизованные дуплексы были проделаны опыты по гибридизации с немечеными олигонуклеотидами.

Термодинамические параметры для немеченых дуплексов

Для исследования влияния флюоресцентной метки на стабильность дуплексов были проделаны опыты по гибридизации в присутствии меченого и немеченого олигонуклеотидов, комплементарных к одной и той же ячейке. Константы равновесия меченого (К]) и немеченого (К2) дуплексов

К1=(ш-Ь1-Ь2)-^/Ьь КгЦт-ЬрЬгНг/Ьг где ^ и ^ - концентрации свободных, а и Ь2 - связанных меченых и немеченых олигонуклеотидов соответственно. Тогда

К2 = f2 /[й/КО-Ст/Ь^) - 1] = {2 /[(№)■(АЛГ1) - 1] (2) где .Л - гибридизационный сигнал от данной ячейки. К2 можно найти из гибридизации без немеченого олигонуклеотида по формуле (1). Тогда

К2 = ЪдаГНт/ЬгЩш/ЬЧ) - 1] =

Ъ/К^ШАЛгЩАЛЧ)- 1] (3)

где Г и Ь' - концентрация свободного и связанного меченого олигонуклеотида при отсутствии немеченого, .Г - соответствующий гибридизационный сигнал. Таким образом, для нахождения К2 надо провести два эксперимента: гибридизацию с одним только меченым олигонуклеотидом и со смесью меченого и немеченого олигонуклеотида. Из первого опыта надо определить параметр А и Кь затем из (2) определить К2, или только А и определить К2 из (3), используя 1'. Из К2 можно получить термодинамические параметры для немеченых дуплексов.

На рис 4А приведена характерная пара кривых плавления для меченого олигонуклеотида и его смеси с немеченым, образующих комплементарные дуплексы с данной ячейкой. Они получены из (2). Эти кривые получены при гибридизации меченого олигонуклеотида 5'-НЕХ-АСАОТССАССТ в концентрации ЗцМ; и его смеси с немеченым олигонуклеотидом 5'-СТССАССТ, причем концентрация меченого олигонуклеотида была ЗцМ, а немеченого - 0.5 рМ. На рис 4Б приведены зависимости констант равновесия для меченого и немеченого олигонуклеотидов от обратной температуры. Поскольку при температурах выше 20°С кривые плавления для меченого олигонуклеотида и его смеси с немеченым практически совпадают, зависимость константы равновесия от

равновесия от обратной температуры для немеченого олигонуклеотида тонет в шумах при 1/Т<3.4х10"3 К"1.

и. 1.00

отн. ед.

0.10

0.01

1 5 10 15 20 25 30 35 40 ^С 3.30 3.35 3.40 3.45 3.50 3.55 3.60 3.65 1 П. 10"'К"

А Б

Рис 4. Гибридизация меченого олигонуклеотида 5'-НЕХ-АСАСГССАСОТ, ЗцМ; и его смеси с олигонуклеотидом 5'-СТССАССТ, в концентрациях 3 и 0.5 |лМ соответственно. А. Кривые равновесного плавления: зависимость нормированного флюоресцентного сигнала I (относительные единицы) от температуры, °С. (—■—) - меченый олигонуклеотид, (—о—) -смесь. Б. Константы равновесия, К (цМ), в зависимости от обратной температуры, КГ'К"1. (—»-) - меченый олигонуклеотид, (-о-) - немеченый.

Были проведены гибридизации с олигонуклеотидами вида 5'-СТССАХУг и 5'-НЕХ-АСАОТССАХУг, где ХУ2 = ОвС, ТвС, СОТ. Термодинамические параметры для соответствующих дуплексов приведены в таблице 2. Данные, полученные из (2) и из (3) совпадают в пределах погрешности измерений. Данные таблицы 2 показывают, что для иммобилизованных дуплексов флюоресцентная метка слабо понижает стабильность. Это понижение стабильности эквивалентно 1/10 разницы ДО0 между иммобилизованными и свободными дуплексами и 1/3-И/4 разности ДН и ДБ. Можно предположить, что оставшаяся разность параметров обусловлена влиянием геля.

ч ■

о > ч Ч—

Н к *г-—

Таблица 2. Термодинамические параметры для иммобилизованных дуплексов из меченых и немеченых олигонуклеотидов. М -дуплексы, образованные мечеными олигонуклеотидами, Н -немечеными.

AH, ккал/моль AS, кал/моль AG0, ккал/моль T °c

дуплекс M H M H M H M H

5'-GTCCAGGC З'-CAGGTCCG 47 51 135 148 7.03 7.21 17 20

5'-GTCCATGC З'-CAGGTACG 44 53 124 154 6.83 7.03 16 19

5'-GTCCAGGT З'-CAGGTCCA 40 46 113 131 6.13 6.75 10 16

5'-GTCCAGGt З'-CAGGTCCg 41 49 119 146 5.82 6.04 9 13

5'-GTCCAGGt 3'-CAGGTCCt 39 47 112 138 5.6 6.15 6 13

5'-GTCCAGGt З'-CAGGTCCc 34 44 96 130 5.53 5.79 3 10

5'-GTCCAGgT 3'-CAGGACaA 32 44 89 132 4.94 4.99 -3 5

В 8% ПААГ концентрация амидных групп составляет примерно 1М. Амидные группы обуславливают денатурантные свойства таких веществ, как мочевина и формамид. Последний в концентрации 1М вызывает понижение АН на 0.8 ккал/моль/п.о. (Blake & Delcourt, 1996), что составляет 6.4 ккал/моль для октамеров. С одной стороны, из-за меньшей подвижности амидных групп, эффект ПААГ должен быть меньше, чем эффект формамида, но с другой стороны, связывание иммобилизованного олишнуклеотида с прилегающими амидными группами геля является реакцией первого порядка и не зависит от концентрации, следовательно, ПААГ может влиять сильнее формамида.

Диагностика {3-талассемических мутаций

Была проведена диагностика распространенных талассемических мутаций первого экзона и первого интрона Р-глобинового гена: G->A в кодоне 26 GAG (известная как гемоглобин Е); мутации участка сплайсинга первого интрона IVS 1/1 G/A, IVS 1/2 Т/С, IVS 1/5 G/T, IVS 1/5 G/C, IVS 1/6 Т/С; причем как гомо- так и гетерозиготные. Для диагностики указанных мутаций были созданы олигонуклеотидные микроматрицы, которые содержали 12 декамеров для нормального и мутантных аллелей. В ячейках микроматриц были иммобилизованы олигонуклеотиды, последовательности которых указаны в таблице 3.

Таблица 4. Последовательности иммобилизованных декамеров, соответствующих мутациям интрона (1-10) и кодона 26 (11,12). Мутантные основания обозначены строчными буквами. _

№ Аллель место мутации % G/C Последовательность

1 ГУБ (Л) - 40 5' -A TAC CAA CCT-gel

2 1/1 С/А 8 30 5' -A TAC CAA tCT-gel

3 1/1 в/Т 8 30 5' -A TAC CAA aCT-gel

4 1/2 Т/А 7 40 5' -A TAC CAt CCT-gel

5 1/2 Т 1С 7 50 5' -A TAC CAg CCT-gel

6 1/2 ТАЗ 7 50 5' -A TAC CAc CCT-gel

7 1/5 С/А 4 30 5' -A TAt CAA CCT-gel

8 1У81/5 ас 4 40 5' -A TAg CAA CCT-gel

9 1/5 С/Т 4 30 5' -A TAa CAA CCT-gel

10 ГУБ 1/6 Т/С 3 50 5' -A TgC CAA CCT-gel

11 СО 26 ОТ - 70 5'- -G GCC TCA CCA-gel

12 СБ 26 в/А 6 60 5' -G GCC TtA CCA-gel

Для большей надежности опытов каждый из олигонуклеотидов был иммобилизован в 3-5 ячейках матрицы.

Общая схема опытов показана на рис. 5. После амплификации схема распадается на две ветви, соответствующие двум вариантам опыта. В одном из них продукт с промотором фага Т7 был транскрибирован с флюоресцентным мечением и затем

гибридизован с матрицей. В другом - продукт был транскрибирован, фрагментирован, химически мечен TMP и затем гибридизован.

_ Геномная ДНК из

лейкоцитов человека

J, ПЦР

промотор фага Т7 О транскрипция in vitro

1.76 kb с внутренним праймером

транскрипция in vitro с мечением

ДНК РНК

флорсцентная метка

ячейка геля с

иммобилизованными

олигонуклеотвдами

матрица

Рис. 5. Общая схема опытов по диагностике ß-глобиновых мутаций

Пример кривых плавления для проб РНК, содержащих Р-талассемические мутации, приведен на рис. 6. Они получены в неравновесных условиях при нагревании со скоростью 0.5°С/мин. Из рисунка видно, что стабильность дуплексов зависит как от их перфектности, так и от их в/С-состава.

Температуру, при которой сигнал от дуплекса понижается в 10 раз от уровня насыщения, обозначим Тю. Она равна 53°С для 1У51/2Т/А и 64°С для СВ26(№) и зависит от различных условий опыта: скорости нагрева, степени фрагментации, ионной силы и т.д. Однако эти параметры примерно одинаково влияют на все дуплексы, поэтому относительное изменение Тю не велико. Это дает возможность использовать Тю для определения перфектных дуплексов данного аллеля. Значения Тю для гибридизаций различных проб РНК приведены в таблице 5.

Рис. 6. Гибридизация нефрагментированной пробы 1У81/2Т/А, 70 нт. Кривые плавления регистрировались при нагревании 0.5°С/мин. А. (-■-) - ГУБ1/2Т/А, перфект, (■•□•■)- 1У81/2Т/С. Б. (-■-) -С026(И), (- •□• •) - С026С/А.

Таблица 5. Значения Тю для гибридизаций различных проб РНК длиной 75 и 133 нуклеотидов. Для первого интрона выделены два наиболее стабильных дуплекса. — означает неизмеримо низкое значение Тю ._

первый интрон кодон 2

№ т пгеш тш пгаш 1У51/2 1У51/2 1У81/5 ГУ5Ш1У51/5 1У51/6 СБ26 СО

(N0 в/А с/с Т/А Т/С Г/С С/А С/С С/Т Т/С ОТ а

1а 28 45 15 28 20 40 13 — — 25 65 5

2а 42 25 15 31 29 40 23 15 9 34 61 5

З6 24 16 3 44 28 36 7 — — 20 60 4

4" 41 34 26 53 42 44 22 22 - 34 64 5

5а 44 46 21 30 30 38 20 18 18 57 62 4

1 фрагментированная проба длины 133 нуклеотида. 6 нефрагментированная проба длины 133 нуклеотида. ' нефрагментированная проба длины 75 нуклеотидов.

Очевидно, что комплементарный дуплекс стабильнее чем такой же дуплекс с одной или несколькими некомплементарными парами и имеет большую Тю . Для каждой мутации (или группы близко расположенных мутаций) перфектные дуплексы могут образовать не более двух аллелей и не менее одного, если все возможные аллели присутствуют в матрице. Поэтому для данной мутации (или группы

мутаций) перфектным является дуплекс с наибольшим Тю , что дает возможность определить один аллель пробы. В случае гетерозиготы имеется еще один аллель, которому соответствует второй по стабильности дуплекс. Чтобы проверить, является ли данная проба гетерозиготой, надо определить, соответствует ли разность Тю двух самых стабильных дуплексов разности Тю для перфектов, соответствующих этим аллелям. Это можно сделать, анализируя состав этих дуплексов, проведя гибридизацию с синтетическими олигонуклеотидами, соответствующими этим аллелям, или сравнивая данную гибридизацию с результатами для других проб, мутации которых уже известны.

В таблице 5 для мутаций первого интрона выделены два самых стабильных дуплекса. Из них самый стабильный соответствует одному (возможно единственному) аллелю исследуемой пробы. Для проб 1-5 это ГУ81/Ш/А, 1У81/2Т/А, ГУ81/2Т/А и

1УБ1 /6Т/С соответственно. В пробах 1-4 второй по стабильности дуплекс образован аллелем 1У51/2Т/С1. Этот олигонуклеотид содержит 50% пар в/С (таблица 4), тогда как олигонуклеотиды более стабильных дуплексов содержат 30-40% этих пар. Следовательно, указанные пробы суть гомозиготы. В пробе 5 самый стабильный аллель содержит 50 % пар в/С, а второй по стабильности, 1УБ1/Ю/А, 30%. Результаты данной гибридизации не противоречат гетерозиготности этой пробы, причем второй зиготой может быть только ГУБ 1/1 С/А. Если эта проба гомозиготна, то дуплекс 1УБ1/6Т/С комплементарен, 1У5(Ы) содержит одну некомплементарную пару, а остальные - две. Но тогда 1У8(И) должен быть стабильнее, чем 1У81/Ю/А, но на самом деле 1У51/Ю/А стабильнее 1УБ(М) (Т10 для них 46°С и 44°С соответственно, таблица 5). Следовательно, проба 5 гетерозигота с аллелями 1УБ1/6Т/С и 1У81/Ш/А.

Во всех исследованных пробах более стабилен более в/С-богатый аллель кодона 26 СЭ26(М). Однако, для пробы №2 разность Тю составляет 6°С, для пробы N23 - 19°С (она транскрибирована с той же ДНК, что и проба №4), для остальных проб - 13-И4°С. Из этого можно заключить, что проба №2 является гетерозиготой по кодону 26, а в остальных этот кодон не содержит мутаций.

Кинетика роста гибридизаиионных сигналов

В двойной гетерозиготе (проба №5) Тю для дуплекса 1У5(Ы) всего лишь на 2°С меньше, чем для аллеля ГУ81/Ю/А. Последовательности, комплементарные аллелям 1У81/Ш/А и 1У81/6Т/С, образуют с аллелем 1У8(Ы) дуплексы, содержащие лишь одну неправильную пару А/С в третьем положении относительно 3'-и 5'-конца соответственно. Для этого аллеля в растворе содержится в два гибридизуемого продукта, чем для ГУ81/Ш/А. И хотя стабильность образующихся дуплексов меньше, чем у перфектных, Тю получается больше из-за большей концентрации. На Рис. 7А показана кинетика роста гибридизационных сигналов в ячейках аллелей 1У81/Ю/А и 1У8(Ы) для пробы №5. Видно, что в ячейке ГУБ(Н) сигнал нарастал в 2.5 раза быстрее, чем в 1У81/Ю/А (нижний график) и стремился примерно к тому же значению. Это означает более чем двукратный избыток пробы, гибридизуемой с 1У8(Ы) по сравнению с 1У81/Ю/А. Очевидно, с этим аллелем гибридизовались отличные от начала первого интрона участки исследуемого транскрипта.

Обращает на себя внимание то, что во всех пробах, кроме пробы №5 сигнал от аллеля 1У81/2Т/А был вторым по величине. При рассмотрении кинетики роста этого сигнала обнаруживается, что он релаксировал примерно в 1.5 раза быстрее, чем сигнал для перфектного дуплекса 1У81/Ш/А (рис. 10Б). Это тоже можно объяснить гибридизацией в ячейке аллеля ГУ81/2Т/А посторонних участков РНК, что вызвало аномально сильный сигнал от этой ячейки.

При исследовании более длинных фрагментов нуклеиновых кислот вероятность подобного влияния посторонних участков на гибридизационные сигналы возрастает. При этом информация о кинетике релаксации сигналов может оказаться очень важной для правильной интерпретации результатов эксперимента. Ее следует использовать вместе с данными о гибридизации синтетических олигонуклеотидов и проб с уже установленными мутациями.

J, отн. ед.

Je-J,

отн.

ед.

1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65 0.60 0.55 0.50

1.00

-« fr

РО V*

& 0

* и- d г

а Лш § J

' i а I

и IT

5000

0.10

0.01

1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.10 0.30 0.20 0.10 0.00

___©

V

У

/

f

F

» »

10000 15000

10000 20000 30000 юооо

l

Л

\ V

aß -üe V-' p- \

-■-

'♦'in

\a Й

d> \ * ■

L

5000 ЮООО 15000

Время, секунды

20000

10000 20000 30000 40000

Время, секунды

о

Рис. 10. Кинетика роста гибридизационнош сигнала. Верхние графики - гибридизационный сигнал I, произвольные единицы. Нижние графики - разность между равновесным сигналом (1е) и его текущим значением (I), 1е -I. А. Проба №5. (Н) - аллель 1У81/Ю/А, (- -□- -) - аллель Б. Проба №1. (-•-) - аллель

1У81/Ш/А, (- -О- -) - аллель 1У81/2Т/А.

выводы

1. На основе регистрации равновесных кривых плавления разработан метод определения термодинамических параметров доя дуплексов, образованных иммобилизованными в геле и свободными флюоресцентно мечеными олигонуклеотидами. Метод позволяет одновременно измерять термодинамические параметры для большого числа иммобилизованных дуплексов и таким образом проводить сравнение гибридизационных свойств большого числа олигонуклеотидов.

2. Впервые обнаружена корреляция между термодинамическими параметрами для дуплексов, иммобилизованных в геле и дуплексов, находящихся в растворе. Иммобилизованные дуплексы оказались менее стабильными, при этом свободная энергия плавления у них на 3.2±0.4 ккал/моль меньше, чем у соответствующих дуплексов в растворе, энтальпия плавления на 26±4 ккал/моль меньше, и энтропия плавления меньше на 75±12 кал/моль.

3. Разработан основанный на конкурентном связывании метод определения термодинамических параметров для дуплексов, образованных иммобилизованными в геле и свободными немечеными олигонуклеотидами. Обнаружено, что флюоресцентная метка слабо понижает стабильность, обуславливая около 1/10 разницы Ав0 между иммобилизованными и свободными дуплексами и 1/3-И/4 разности АН и АБ.

4. Впервые регистрация неравновесных кривых плавления применена для диагностики Р-талассемических мутаций. Этим методом были определены как гомозиготные, так и гетерозиготные мутации.

5. Предложено использовать регистрацию кривых роста гибридизационного сигнала для повышения надежности идентификации мутаций.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы

Yershov.G., Barsky,V., Belgovskiy.A., Kirillov,E., Kreindlin,E., Ivanov,I., Parinov,S., Guschin,D., Drobishev.A., Dubiley,S., Mirzabekov,A. (1996) DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchip Proc.Nat.Acad.Sci.USA 92, 4913-4918

Drobyshev,A., Mologina,N., Shik,V., Pobedimskaya,D., Yershov,G. and Mirzabekov,A. (1997) Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip: identification of (3-thalassemia mutations Gene 188, 45-52.