Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение методов фрагментации ДНК и дополнительной гибридизации встыкдля диагностики мутаций и секвенирования ДНК методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Применение методов фрагментации ДНК и дополнительной гибридизации встыкдля диагностики мутаций и секвенирования ДНК методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами"

чо Российская Академия Наук

^ хИнститут Молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта.

о.

~~ На правах рукописи

Паринов Сергей Валерьевич

Применение методов фрагментации ДНК и дополнительной лбридизации встык для диагностики мутаций и секвенирозания ДНК методом гибридизации с олигонукпеотидными микрочипами.

Специальность - 03.00.03 - Молекулярная биология

; АВТОРЕФЕРАТ ,

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной организации хромосом Института молекулярной биологии им. В.А_Энгельгардта Российской Академии Наук, зав. д.х.н., акад. А.Д.Мирзабеков

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, академик А. ДМирзабеков

Оффициальные оппоненты:

■ д.б.н А.А.Колесников, МГУ д.х.н. А.Г.Габибов, ИМБ РАН

Ведущая организация: ' Институт общей генетики им, Н.И.Вавилова

Защита состоится " " 1996 г в </'часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардга

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Использование коротких олигокуклеоткдных проб для анализа нуклеотидной последовательности ДНК при помощи гибридизации находит повышенное применение для различных задач таких как: диагностика наследственных болезней и маркеров роста опухолей, тигшрование генов ги сто совместимости, молекулярная дактилоскопия, кгртирование генома, секвенирование ДНК и т.д. Каждая из этих задач требует проведения гибридизации исследуемой ДНК с большим набором олигонуклеотидсв, что в свою очередь предусматривает усовершенствования существующих технологий, лучшего понимания, свойств нуклеиновых кислот и оптимизации процедур гибридизации, детекции и анализа гибридизационных сигналов. Значительные преимущества в цене и скорости аналитических тестов могут бьгть получены в результате миниатюризации диагностических инструментов. Использование микрочипов с набором ДНК-проб большой плотности представляется потенциальным решением этой проблемы.

Одним из Основных препятствий использования метода гибридизации с короткими олигонуклеотидами для полного секвенмрования являются повторы в исследуемой ДНК. Теоретически последовательности только 80% случайных фрагментов длиной 200 нт.может быть однозначно определена при гибридизации с матрицей, содержащей полный набор 8-меров [Khrapko el ai, ]989]. Эффективность методз секвенирования гибридизацией может быть повышена методом дополнительной гибридизации встык (ДПВ) с пентамерами.

Цель работы. Целыо настоящей работы является разработка методических подходов гибридизации-с олигонуклеотидной матрицей для анализа последовательности ДНК: разработка методов фрггментации длинной ДНК и дополнительной гибридизации встык (ДГВ) с пентамерами для диагностики и секвенирования.

Научная новизна работы. Разработана и оптимизирована методика псевдослучайной фрагментации ДНК реагентами Максама-Гилберта, позволяющая значительно повысить гибридизационную эффективность длинных молекул ДНК. Детально исследована чувствительность метода дополнительной гибридизации встык с флуоресцентно-меченными пентамерами для выявления одиночных замен оснований в ДНК. Полученные данные позволяют дать количественную оценку преимуществ

данного подхода по сравнению с обычной гибридизацией на матрице, а также подтверждают возможность использования ДГВ для секенирования ДНК. На примере мутаций Р-глобинового гена демонстрируется практическое применение метода гибридизации с олигонуклеотидной матрицей и ДГВ для задач медицинской диагностики.

Научно-практическое значение работы. Развитие новых методов и технологий анализа последовательности ДНК является одним из ключевых направлений Международной программы "Геном человека". Метод гибридизации нуклеиновых кислот с олигонуклеотидной матрицей, представленный в данной работе предусматривает значительное упрощение существующих технологий и снижение цены аналитических тестов. ...

Разработана методология фрагментации ДНК, позволяющей успешно использовать короткие олигонуклеотиды для гибрвдизационных методов анализа ДНК. Работа демонстрирует возможность практического применения метода гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами для медицинской диагностики на примере мутаций Р-талассемии. Использование ДГВ значительно расширяет возможности гибридизационных методов секвестрования ДНК и диагностики мутаций. Апробация работы. Результаты работы представлены на межденародных конференциях: Cold Spring Harbor Laboratory. May 11-15, 1994; DOE Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop IV, Santa Fe, NM, Nov. 13-17, ¡994; The CHI conference "Micrafabrication Technology for Research and Diagnostics " Sep. 28-29, 1995 Структура и объем работы. Диссертация изложена на 89 стр., включая 4 таблиц, 8 рисунков и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение и выводы. Библиография включает 112 наименований. Основные результаты получены автором самостоятельно.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Олигонуклеотиды иммобилщпвывались внутрь,элементов полиакриламвдного геля закрепленных на стеклянной поверхности стандартных предметных стекол для микроскопа. Слой геля (20 мкм) нарезался механически на микроквадраты размером 100x100 мкм. Нанесение микрообъемов (1 нл.) олигонуклеотида на элементы микроматрицы производили с помощью специально сконструированного робота [Yershav el aL, 1996, Proc. Natl Acad. Sei. USA], Перед нанесением олигонуклеотиды, содержащие 3 '-З-меггилуридин окислялись периодатом калия; гель обрабатывался _ гидразингидратом.

Фрагментация ДНК.

Гибридизация с длинными молекулами ДНК может осложняться плохим проникновением в пористую структуру геля и образованием вторичных структур.

Замечательным является тот факт, что низкая гибридизационная эффективность длинных ДНК значительно повышается при удлинении иммобилизованных олигонуклеотидов (от 8-нт. До 10-нт.)

Вероятнее всего заключить, что основным препятствием для гибридизации длинной ДНК является не плохая проницаемость длинной ДНК в гель,-а вторичная • структура длинной ДНК. Очевидно, что образование внутримолекулярных дуплексов в ДНК наиболее термодинамически выгоднее, чем образование межмолекулярных дуплексов между длинной ДНК и иммобилизованными олигонуклеотидами [IVetmur, 1991 Crit. Rev. Biochem. MoLBiol.]. таким образом, более короткие внутренние вторичные структуры могут вполне конкурировать с межмолекулярными дуплексами большей длины.

Для _ преодоления вышеизложенных препятствий было предложено фрагментировать длинную ДНК на более короткие фрагменты.

Было показано, что фрагментация ДНК химическим методом приводит к повышению эффективности гибридизации длинной и двухцепочечной ДНК с иммобилизованными олигонуклеотидами.

По нашему мнению методы фрагментации должны удовлетворять следующим требованиям. Разрывы в ДНК должны вноситься случайным Образом (или приблизительно случайным ("псевдослучайным"), например для использования в

диагностике известных мутаций). Необходимо найти условия максимального выхода фрагментов, входящих в диапазон длин, способных эффективно гибридизоваться с ДНК.

Большинство известных процедур фрагментации ДНК не являются случайными. В данной работе используется фрагментация реагентами, используемыми в методе секвенирования Максама-Тилберта Щахат & Gilbert, .1980 Melh. enzymol.], с приблизительно равным уровнем разрывов по пуринам и пиримидннам. Так как гидразин реагирует с С эффективней, чем с Т, абсолютно случайные условия фрагментации не могут был. получены.

Требование случайности фрагментации менее существенно в . случае диагностики известных мутаций, когда мы - сравниваем пары олигонуклеотидов, образующих совершенный и несовершенный дуплексы с исследуемой ДНК. Таким образом, становится возможным использование более простых методов дробления ДНК, вносящих разрывы неслучайным образом. Таким альтернативным подходом может служить ферментативная фрагментация (например, дезоксирибонуклеазой 1) в растворе и на поверхности кристаллов фосфата кальция [Rhodes et а!., 1980 Nature]. Как известно, ДНКаза I вносит разрывы в двухцепочечную ДНК, адсорбированную на поверхности кристаллов, преимущественно через виток, и можно было бы ожидать получения смеси фрагментов приблизительно 10 нт. ' длиной "и случайного распределения разрывов. Наши исследования показывают, что даже в этом случае дробление происходит неслучайным образом. Дополнительным фактором, вносящим специфичность дробления, является ориентация молекулы дцДНК относительно концов. Тем не менее, фрагментация дцДНК на кристалле действител^о обеспечивает хорошее распределение длин получаемых фрагментов (60-80% продуктов имеют длину 8-12 нт.)

Диагностика мутаций р-талассемии

ДНК из крови различных пациентов Р-талассемии была использована для модельных экспериментов по диагностике мутаций, расположенных на границе 1 экзонаи 1 интрона ¡5-глобиносого гена [Yerskov et al, 199S\.

А. норма 1

ЯР Ч" ■

- , 1

1* ' >1 г1 * <

Рисунок 1.

норма

4 3 1-'

N8-1-С. гомозигота

4 3

Гибриднзованная ДНК:

Норма: ТШ-5' -..

ТМЯ-Б' -.. Иммобилизованные 10-меры:

1. норма С26+ гель-3'-

2. С26- гель-3'-.

3. норма 1У31

4. 1УЗ-1-1

5. 1УЭ-1-5

6. 1УЗ-1-6

.ТССТСАСССССТССССАСбТТССТАТ...- 3' .ТССТ6А0ССССТССССАСаТТССТАТ...-3'

АССАСТСССС-5' ■АССАЬТСССС-5'

гель-3'-ТССААССАТА-5' гель-З'-ТСЪААССАТА-5' гель-3'-ТССААСдАТА-5' гель-3'-ТССААССдТА-5'

Диагностика мутаций /З-талассемии. ДНК из крови различных пациентов Ь-талассемии бьша использована для модельных экспериментов по диагностике мутаций расположенных внутри 1 экзона н 1 интрона Ь-глобинового гена. Диагностировались мутации: Г/8-1-1(С->А), 1У8-1-5(С-»С), 1У5-1-6(Т-»С) и С2б(0-»А). 10-меры соответствующие этим мутациям и дикому типу (в качестве контроля) были иммобилизованы на микроматрицы с размером элементов 100x100x20 р.м. Микроматрицы были гибридизованы с цельными одноцепочечными ДНК длиной 85 (В,С) оснований и двухцепочечной ДНК длиной 176 п.о. фрагментированной химическим методом (А).

Диагностировались мутации: 1У5-1-5(С-*С), Пге-]-6(Т-»С) и

С2б(С->А) (Рис. 1). 10-меры соответствующие этим мутациям и дикому типу (в качестве контроля) были иммобилизованы на микроматрицы с размером элементов 100x100x20 мкм. Все иммобилизованные олигонуклеотиды выбирались так, чтобы замены оснований были внутренними (концевые мисматчи хуже дискриминируются).

10-меры были выбраны потому что они гибрид изуются с длинной ДНК значительно эффективней, чем 8-меры.

Для диагностических экспериментов использовались одноцепочечные нативные 85 нт. ДНК и двухцепочечные 176 п.н. ПЦР продукты, фрагментированные химическим методом для уменьшения негативного эффекта оказываемого на гибридизацию вторичных структур и увеличения скорости проникновения длинной ДНК в структуру геля. ■ >

Гибридизационные результаты (Рис. 1) показывают значительное различие в интенсивности гибрид изационных сигналов совершенных и несовершенных дуплексов. Сходные результаты были получены при гибридизации с нативной одноцепочечной ДНК длиной 85 нт. и с фрагментированной двуцелочечной ДНК длиной 176 п.н. . Таким образом, данная процедура позволяет с высокой степенью надежности использоваться для идентификации различных мутаций р-талассемии с использованием короткой одноцепочеченой ДНК и длинной фрагментированной ДНК.

Применение дополнительной гибридизации встык (ДГВ) Схема различных приложений дополнительной гибридизации встык, исследованных в данной работе представлена на Рис. 2. Синтетический 21-мер . соответствующий участку Р-глобиновосо гена на границе 1-го экзона и 1-го интрона. был использован в настоящей работе для изучения различных факторов, влияющих на ДГВ с иммобилизованными 8- и 10-мерами и флуоресцентно меченными 5-мерзми (Рис. 3,4).

Влияние различных замен оснований в пентамерах на ДГВ Четыре 21-нт. олигонуклеотида, каждый из которых содержал одно из четырех

--природных оснований в позиции "И" (Рис. 3) и 20 НЕХ-меченкых лентамсров,

содержащих все возможные основания во всех позициях гибридизовалнсь в различной последовательности и разных комбинациях с микроматрицей. На микроматрице были иммобилизованы 5 перекрывающихся 8-меров комплементарных гибридизуемой ДНК и сдвинутых друг относительно друга на одно основание.

А.

В.

С.

В.

Рнсунок 2.

■ ...... I 'I— ДНК

у'-1 ' 1 '

/ НчмобнлюоыкниВ V

' . й-*.«, °

6-ыср

Флуорссцеитно-мсченкый 5-«ер

1111111— ДНК

/ Иммобклюошмый V \

Ъ Ъ

{-мер

5-иеры, мечешше разнима флуорееоентшмн крдсетемми

м

-и-

днк

ш4

П „ ^ VI

Иммоонлюоынкые

м

/Иммоб

• ДНК

лдаш \

Имиобклнзоиикый _

_3 ШШ ч»

п стт О»

тииА ч

жшсЛ

шдасЛ ... кшг^

Дополнительная гибридизация встык (ДГВ). (А) Схема ДГВ. (В) Схема множественной гибридизации встЬнс с двумя пентамерами меченными различными флуоресцентными красителями. (С) Схема организации микроматрицы для диагностики мутаций методом ДГВ (О) Схема 20 пентамеров для диагностики мутаций методом ДГВ. (М- универсальное основание или смесь всех четырех оснований).

Экспериментальная процедура состояла из двух шагов. Микрочип вначале гибридизовался с одним из четырех 1мкМ 21-меров в 2-5 мкл гибридизационного буфера и затем со смесью четырех пентамеров. 5-меры в каждой смеси были сдвинуты друг относительно друга на одно основание, гибридизуясь встык к различным иммобилизованным 8-мерам и образуя с ними и 21-мером непрерывный дуплекс, лишенный одной( фосфодиэфирной. связи. Несколько последовательных, раундов гибридизации с одним и тем же прегибридизованным 21-мером проводилось на микроматрице после отмывки в мягких условиях (1М гибридизационный буфер, 20°С,

5 минут) только пентамеров (дуплексы 21-меров с иммобилизованными олигонуклеотидами в таких условиях остаются стабильными). В случае, когда менялся 21-мер, отмывка проводилась в 0.01М гибридизационном буфере 30 минут при 20°С. В большинстве экспериментов сигналы совершенных дуплексов пентамеров превосходили сигналы от дуплексов с мисматчами более чем в 10 раз. Даже наименее дестабилизирующий £-Т мисматч на 5'-конце был надежно определен: гибрид изационная интенсивность пентамера, содержащего замену г АТАС, была по меньшей мере в 5-раз слабее, чем в случае полностью комплементарного пентамера СТТАА (Рис.3).

Рисунок 3.

Гнбриднзуемм оцЦНХ S' -TGGGCAGCTTGGTMIIAAGGT-3' 1.3- -клъ-сатссмсскткл-нЕХ-5 '

2 . Э ' -пль-СТССДИССДГДдТ-ДЕУ-5 '

3. з ' -гель-тсашсс&глл тт-нех-5

4. 3 ' -гель-ССААССАТАпТТС-ИЕХ-5 '

5.' Э' -гмь-алссмлдггсс-ЯЕХ-J

Влияние одиночных замен оснований в пентсшерах на ДГВ. На микроматрицу было иммобилизовано 5 перекрывающихся 8-меров, комплементарных гибридкзуемой ДНК и сдвинутых друг относительно друга на одно основание. Микрочип вначале гибридизовался с одним из четырех 21-меров, каждый из которых содержал одно из четырех природных оснований в позиции "N" (замены указаны над гибридизационными картинами) разных комбинациях и затем со смесью четырех из 20 НЕХ-меченных пентамеров, содержащих все возможные основания во всех позициях (основания, соответствующие V в пентамерах, указаны над стрелками)..

Эффект мнсматчен в иммобилизованных олигонуклеотид:<,:, на ДГВ.

. Микроматрица представленная на Рис. 4 состояла из 10 иммобилизованных 10-меров. Пять из этих 10-меров были сдвинуты друг относительно друга на один нуклеотид и являлись полностью комплементарными гибридизуемому 21-меру, другие пять образовывали сходные дуплехсы и содержали слабо дестабилизирующую замену G-t в 5'-терминальной и внутренних позициях. Рис. 4 показывает результаты гибридизации микроматрицы с 21-мером и затем с 5-мерами. Пентамер GATA С не гибридизовался в случае расположения мисматча в 5'-терминальной позиции иммобилизованного олигонуклеотида (Рис. 4). Напротив, внутренние мксматчи в

иммобилизованных 10-мерах слегка ослабляют гибридизационные сигналы к не препятствуют ДГВ (Рис. 4). Концевой мисматч нарушает стэкинг взаимодействия, в то время как внутренние мисматчи только ослабляют гибридизацию 21-мера с иммобилизованными 10-мерами. Так как дестабилизирующий эффект мисматча на гибридизацию иммобилизованных олигонуклеотидов, а следовательно и на ДГВ, существенно выше для 8-меров, чем для 10-меров в подобных условиях (!М гибридизациоиный буфер, 0°С) мисматчи в Ю-мерах разрешаются слабо.

Рисунок 4.

Гибридшуемм оцДНК 5'-ТаКСАОЗТТЭЛХТСАЛ<ЗСТ-3 1.3' -гвЛ1.-СССётССЛЛССЛНв-ИЕХ-5 ь

2. 3' -гель-СССТССДАССЛМ(;г-й£У-5

t

3. 3' -реяъ—С(ЗТССААССА-5'

t

3' -гвль-сгссхАсаи:-5' 3' -ГКУП.-ТССЛЛССЛ.ТЛСТТСС-ИЕХ-5

Влияние замен оснований в иммобилизованных олигонуклеотидах на ДГВ. Микрочип, содержащий 10 перекрывающихся 8-меров (5 из которых содержали замену С—Н, в различных позициях), вначале гибридизовался с 21-мером а затем последовательно с пентамерами, гибридизующимися встык к различным иммобилизованным олигонуклеотидам.

Дополнительная гибридизация встык с двумя пентамерами, меченными различными флуоресцентными красителями

На Рис. 5, представлена гибридизация 21-мера с иммобилизованным 8-мером и двумя пентамерами, стабилизированными стэкинг взаимодействиями между собой и иммобилизованным 8-мером. Микроматрица содержала семь иммобилизованных

перекрывающихся 8-меров. Вначале матрииа гнбридизовалась с намеченным 21-мером а затем со смесью двух пентамеров РАМ-ОАТАС и НЕХ-АССТТ. меченных двумя флуоресцентными красителями.

Рисунок 5.

Ги5ркиюусшя оцДНК S' - TGGSaG<rrTGGa'raASST-3' ■ 1.3'-гель-ссегссдА-5'

г. 3'-гель -CSTCCMCCATAGrTCCA'-S'

3. 3' -гель —GTCCAACC-5'

4. 3 ' -Гель -TCCAACCA-5 '

5. 3'-гель~СОисС*Т-5'

6. 3' -гель -САДССАТА-5'

1. 3' -гель -А*ссмавггс«*-Д'

FAM HEX (-) (*)

Дополнительная гибридизация встык с двумя пентамерами, меченными различными флуоресцентными красителями. Микроматрица содержала семь . иммобилизовалньгс перекрывающихся 8-меров. Вначале матрица гибридизовалась с немеченным 21-мером, а затем со смесью двух пентамеров FAM-GATAC и НЕХ-АССТТ. меченных двумя флуоресцентными красителями. Пентамер FAM-GATAC содержал 50% немеченного. Последовательная детекция флуоресценции FAM и HEX производилась путем замены фильтров, подобранных для этих красителей.

Пентамер FAM-GATAC содержал 50% немеченного, так, как флуоресцентная метка на 5'-конце значительно ослабляет стэкинг взаимодействие (не показано). Таким образом, эксперимент представляет гибридизацию с немеченным GATAC и НЕХ-меченным АССТТ. Последовательная детекция флуоресценции FAM и HEX производилась путем замены фильтров,- подобранных для этих красителей. Каждый из этих пентамеров по отдельности образовывали стабильные 13 кт. дуплексы с соответствующими 8-мерами и 21-мером (Рис. 5, олигонуклеотид 2 - FAM и олигонуклеотид 7 - Hex). Было

продемонстрировано образование 18-п.н. дуплекса лишенного двух фосфодиэфирных связей (Рис. 5, олигонуклеотид 2 - HEX). Важно заметить, что стабилизация за счет стэкинг взаимодействий между двумя пентамерами недостаточна для образования стабильного 10-п.н. дуплекса при данных условиях. (Рис. 5, алигонуклеотид 1 не гпбридизовался). Для удерживания пентамеров вместе необходимо взаимодействие с иммобилизованным олигонуклеотидом.

ДГВ с пентамерами содержащими универсальные основания или смесь всех четырех оснований в различных позициях.

Включение универсальных оснований или\и смеси всех четырех природных оснований (jV) в одну или несколько позиций пентамеров (Рис. 2D) было предложено для увеличения эффективности ДГВ [Yerxhov et а!.. 1996]. Такая организация пентамеров позволяет снизить количество дополнительных гибридизаций встык, упростить микроматрицы для анализа последовательности ДНЮТНК и стабилизировать слабые дуплексы пентамеров. Тем не менее, включение смеси из четырех оснований в одну, две, три и четыре позиции пентамеров уменьшает относительное содержание полностью комплементарного пентамера в гибридизационной смеси в 4, 16, 64 и 254 раз соответственно, и может создавать большой гибридизационный фон за счет некомплементарных пентамеров. Включение смеси из четырех пентамеров тестировалось на примере полностью комплементарного пентамера ( 60% А/Т оснований) содержащим N в одной, двух и трех позициях (Таблица 1; пентамеры 2, 3 и 4). Дуплекс с этим пентамером Быдерживает короткую отмывку в мягких условиях (0°С, 5 • мин, в 1хгибридизационном буфере). Гибридизационный сигнал с NATAC легко детектировался непосредственно в течение гибридизации. Для детектирования гибридизации NNTAC была применена отмывка в мягких условиях. В случае N присутствующего в трех позициях: NfJNAC шбридизационного сигнала заяетектировать не удалось из-за слишком большого фона. Мы также исследовали возможность использования 5-нитроиндола в качестве универсального основания (Л), который, как известно, взаимодействует со всеми природными' основаниями в ДНК с одинаковой эффективностью [Loakes et al, ¡994, 1995]. Включение X в 5'-терминальное положение оказывало стабилизирующее влияние на пентамер ХАТ АС по сравнению с тетрамером АТАС (Таблица 1,

олигонуклеотилы 5 и 6) и на 6-мер ХТТАТА по сравнению с пентамером ТТАТА (100% А/Т оснований)(Таблица 1, олигонуклеотилы 10 и II). С другой стороны включение X во внутренние позиции дестабилизирует дуплексы пентамеров (Таблица 1, 5-мер 8). Даже дополнительное 5-терминальное X (Таблица 1, олигонуклеотид 9) не погашает этот эффект, чтобы можно было использовать 5-нитроиндол внутри пентамеров в исследуемых условиях.

Таблица 1.

оцЦНК#1

5 • -тсвкаетттазтдтаииазт-з'

1.3' -гель -СССетССААССЛГЛ5-НИ-5'

2. 3' -САТАЧ-НКХ-5' +

3. з• -САТ!Я1-НЕХ-5' ±

4. з• '-САНЮ1-НЕХ-5' -

5. 3' '-САТАг-НЕХ-З' -

е. 3' '-САТА-НЕХ-5' -

7. 3' -САТАХ-НЕХ-5' +

е. 3' •-САХЛ5-НЕХ-5' -

9. 3' '-САХАСХ-НЕХ-5' -

оцДНК #2 -

51 -ттсвслсэггаатапААВст-з' ю.з'-гель -сапххзлссАЫТЫОх-З' * 11. 3'-АТАТТХ-ЯЕХ-5' +

Влияние 5-нитроиндола и смеси всех четырех оснований на ДГВ. На мйкроматрицу было иммобилизовано 5 перекрывающихся 8-меров, комплементарных гибридизуемой ДНК и сдвинутых друг относительно друга на одно основание. Микрочип вначале гибридизовался с одним из четырех 21-меров, каждый из которых содержал одно из четырех природных оснований в позиции "К" (замены указаны над гибридизационными картинами) разных комбинациях и затем с со смесью четырех из 20 НЕХ-меченных пентамеров, содержащих все возможные основания во всех позициях. "+" - нормальный гибридизационный сигнал, - слабый

гибридизационный сигнал, - нулевой сигнал, - пентамер со 100% А/Т.

Влияние на ДГВ типа оснований, входящих в сгэкинг контакт, последовательности пентамеров, присутствия пропусков н перекрытия между олигонуклеотидами

Среди 16 возможных вариаций соседних пар оснований, входящих в состав сгакинг контакта были протестированы следующие восемь: СС, АС, ТА, ДТ А А., СА, (ЗА, (Рис. 3 и 4) и ТС (Рис. .5). Во всех случаях был получен надежный гибридизационный сигнал от совершенных пентамеров, гибридизованных встык к иммобилизованным олигонуклеотидам.'

Стабильность дуплексов 5-меров, гибридизованных встык к олигонуклеотидам на матрице сильно зависит от А/Т состава 5-меров. Дуплексы с 80-100% А/Т-богатых пентамеров недостаточно стабильны. Они могут быть отмьггы при понижении их концентрации разведением гибридизационной смеси несколькими объемами гибридизационного буфера. С другой стороны дуплексы пентамеров с содержанием й/С не менее 40% более стабильны и могут выдерживать отмывку при 0°С в 100-кратном избытке буфера.

Показано, что гибридизация не наблюдается, если существует промежуток или перекрытие в 1-4 основания между пентамерами и иммобилизованными олигонуклеотидами. Очевидно, что 5-меры по отдельности и даже два пентамера, гибридизуемые встык друг к другу (Рис. 5), не образовывают стабильных дуплексов с ДНК. Тем не менее слабые гибрид изационные сигналы детектировались в случае перекрывания на одно основание пентамеров йАТАС и ТОАТА и иммобилизованных 10-меров 2 и 3, соответственно (Рис. 4). Так как синтетические 10-меры не были специально очищены перед иммобилизацией, подобный результат можно объяснить присутствием в соответствующих элементах микрочипа примеси 9-меров. Эти 9-меры могут образовывать стабильные дуплексы с ДНК и гибридизоваться встык с 5-мерами в выбранных условиях и, таким образом, имитировать гибридизацию встык перекрывающихся 5-мера и 10-мера. В случае с иммобилизованными 8-мерами данный эффект был значительно слабее, так как присутствующие как примесь 7-меры не образуют достаточно стабильных дуплексов. Очевидно что ДГВ значительно чувствительней к присутствию примесей, чем простая гибридизация ДНК с иммобилизованными олигонуклеотидами.

Применение ДГВ для диагностики мутаций р-талассемии.

Процедура ДГВ была также применена для диагностики мутаций Р-талассемии (Рис. 6). Микроматрнца для ДГВ диагностики содержала два иммобилизованных 10-мера, расположенных рядом с мутировавшим основанием. Микроматрица была гибридизована вначале с одной из двух ИАМ-меченных 62-нт. амплифицированных оцЦНК, соответствующих нормальному генотипу или гомозиготе ГУ'5-1-1 (Рис. 6). Гибридизация наблюдалась при использовании комплекта микроскопных фильтров для детекции РАМ (1 и 2). Затем дуплексы ДНК-10-мер были последовательно гибридизованы с двумя смесями НЕХ-меченных 5-меров. Гибридизация

детектировалась после замены комплекта фильтров на HEX специфические (З-б). Каждая смесь содержала два перекрывающихся 5-мера шбридизуемых встык к различным иммобилизованным 10-мерам (I и II). Один из пентамеров в каждой смеси был полностью комплементарен нормальной ДНК, другой - мутирванной ДНК. Один из пентамеров в каждой смеси давал интенсивный гибридизационный сигнал, когда мугангный пектамер гибридизовался с мутанткой ДНК или нормальный пектамер с нормальной ДНК (Рис.6, П-За; 1-4а; 1-5Ь; П-бЬ). Другой пентамер в каждой смеси не гибридизовался (Рис.6; I-За; П-4а; П-5Ь; 1-6Ь).

Рисунок 6.

с. (IVS-1-6)

ГДМ-5'-.. .TGGCCAGGTTGGTArCRA. ..-3' (иоц»»!

L IL

t 2 1 * ( S

корм tvs-i-6 норма IVS-1-6 норм» IVS-1-6

FAM HEX

Диагностика мутаций fi-таласссмии при помощи ДГВ. Два перекрывающихся 10-мера, расположенных. рядом с мутирующим нуклеотидом (I и Н) -были иммобилизованы на микроматрицу с размером элементов 100x100 мкм. Микроматрица была гибрадизована с одноцепочечными ДНК длиной. 62 нт. меченными FAM, ■ которые соответствовали нормальному адлелю Р-глобинового гена (1,3 и 5) и гомозиготной мутации IVS-1-6(T->C) (2,4 и б). 1 и 2 - гибридизация нормальной и мутантной, FAM-ДНК соответственно. Затем две смеси НЕХ-меченых пентамеров (а: TGATA и GATGC; b GATAC и TGATG) последовательно гибридизовались встык к иммобилизованным декамерам соответственно. Два набора микроскопных фильтров использовались для последовательной детекции FAM-ДНК (1-2) и НЕХ-пентамеров (36). . ,

CfTAG-5' -ШХ Гып. -Э'-ССССТССААСсдтд5_5._Егх

ь

ATAGr-5'-iEX_lj Гмк -3' -CCGTCCAACC , .¡¡¡^-!

oLDj

выводы

1. Разработана и оптимизирована методика псевдослучайной фрагментации ДНК реагентами Максама-Гилберта. Фрагментация длинных молекул ДНК позволяет значительно повысить эффективность гибридизации длинных ДНК с короткими иммобилизованными олигонуклеотидами.

2. На примере мутаций Р-талассемии показана работоспособность метода для медицинской диагностики.

3. Исследовано влияние различных мисматчей на ДГВ (дополнительная гибридизация встык) с пентамерами. Показана, возможность выявления практически любых мисматчей во всех положениях пентамеров.

4. Предложено использовать универсальные основания (5-нитроиндол) для нормализации пентамеров и уменьшения количества дополнительных гибридизаций всгык.

5. Использование нескольких флуоресцентных красителей позволяет упростить схему ДГВ.

6. Проведенные модельные эксперименты демонстрируют возможность применения "двойной" ДГВ с двумя пентамерами, меченными различными флуоресцентными метками и гибридизованными всгык друг к другу и к иммобилизованному 8-меру, для разрешения длинных повторов в исследуемой ДНК

7. Продемонстрирована возможность практического применения ДГВ для диагностики мутаций (на примере р-талассемии).

Содержание работы изложено в следующих работах:

1. Иванов И.Б., Ершов Г.М., Барский В.Е., Бельговский А.И., Кириллов Е.В.,

Крейндлин., Паринов С.В., Мологина Н.В., Мирзабеков АД. (1996) Диагностика генетических мутаций на олигонукпеотидных микрочипах. Молекулярная биология (в печати) ^ . •

2. Yershov,G., Barsky.V., Belgovskiy,A, Kirillov,Е., Kreindlin,E., Ivanov,I., Parinov,S., Guschin,D., Drobyshev.A, Dubiley,S., and Mirzabekov.A (1996) DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips. Proc, Nat!. Acad. Sci. USA, 93,4913-4918

3. Parinov,S., Barsky.V., Yershov,G., Kirillov,E., Timofeev Ed., Belgovskiy,A. and Mirzabekov.A. (1996) DNA sequencing by hybridization to microchip octa- and decanudeotides extended by stacked pentanucleotides Nucleic Acids Res., 24 (15), 29983004

4. Mirzabekov, AD., Yershov, G.M., Parinov, S.V., Barsky, VJE., Kirillov, Eu.V. & Lysov, Yu.P. (1996) Patent application "Use of contiguous stacking hybridization as a diagnostic tool". DOE Case No. S-84,075. Contract W-3I-I09-ENG-38.

5. I.Ivanov, S.Parinov, E.Kirillov, E.Timofeev, G.Yershov, V.Florentiev, AMirzabekov. Matrix of gel immobilized oligonucleotides: application for DNA diagnostics and sequence comparison. The International Workshop on Sequencing by Hybridization. Houston Advanced Research Center. October 29-30,1993.

6. I.Ivanov, E.Kirillov, S.Parinov, E-Timofeev, G.Yershov, V-Barsky, E.Krendlin, V.Florentiev, AMirzabekov. Oligonucleotide microchip on gel support as an instrument for DNA analysis. Genome mapping and sequencing meeting. Cold Spring Harbor Laboratory. May 11-15, 1994.

7. Igor Ivanov, Eugene Kirillov, Victor. E.Barsky, Edward Kreindlin, Sergei Parinov, Edward Timofeev, Gennady Yershov, Vladimir L. Florentiev, and 'Andrei D. Mirzabekov Oligonucleotide Microchip is a Versatile Tool for DNA Analysis: Diagnostic Applications Department of Energy Human Genome Program Contractor-Grantee Workshop IV Santa Fe, Mi; November 13-17, 1994

8. Parinov, S., Barski, V., Kirillov, Eu., Timofeev, Ed., Yershov, G. & Mirzabekov A SHOM application of contiguous stacking hybridization with fluorescently-labeled pentamers for DNA sequencing and diagnostic.- The СШ conference "Microfabrication Technology for Research and Diagnostics. Sept.28-29, 1995, San Francisco, CA, USA.