Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Усовершенствование лечебно-диагностических мероприятий при стрептококковом мастите коров

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование лечебно-диагностических мероприятий при стрептококковом мастите коров"

На правах рукописи

005051895

Титова Марина Александровна

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛЕЧЕБНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ ПРИ СТРЕПТОКОККОВОМ МАСТИТЕ КОРОВ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

06.02.03 — ветеринарная фармакология с токсикологией

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

1Я ДПР 2013

Новосибирск - 2013

005051895

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор, Шкиль Николай Алексеевич

Научный консультант:

кандидат биологических наук, Афонюшкин Василий Николаевич

Официальные оппоненты:

Лопатин Сергей Викторович,

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник, ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии, ведущий научный сотрудник;

Барышников Петр Иванович,

доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный аграрный университет», заведующий кафедрой

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Омский государственный

аграрный университет им. П.А. Столыпина»

Защита состоится Ж, марта 2013 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 006.045.01 при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ а/я 8; тел./факс (383)348-44-62, E-mail: dis.ievsidv@list.ra

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « / февраля 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. ветеринар, наук

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Маститы коров — одно из заболеваний, наносящих животноводческим предприятиям страны значительный экономический ущерб, который выражается в снижении молочной продуктивности, ухудшении качества молока и молочных продуктов, возрастании затрат на ветеринарное обслуживание. Особое место занимает субклинический мастит, который чаще всего поражает высокопродуктивных коров в лактационный период (В.А. Париков и др., 2000, 2005; В.А. Париков, Н.Т. Климов и др., 2007; Н.Т. Климов, 2009; Г.М. Скогорева и др., 2010; A.M. Булгаков, В.В. Королев, 2011).

Ведущую роль в возникновении и развитии болезни играет условно-патогенная микрофлора, в том числе микроорганизмы рода Streptococcus (JI.A. Ряпис и др., 2010). Серогрупповая специфичность микроорганизмов рода Streptococcus имеет практическое значение в диагностике вызываемых ими болезней, лечении и профилактике. Отсюда вытекает необходимость их дифференциации (В. Терехов, О. Терехова и др., 2008; JI.A. Ряпис, Н.И. Брико, A.C. Ещина и др., 2010). Несмотря на то, что в последние годы все больше внимания направлено на разработку миниатюризированных высокочувствительных тест-систем для диагностики - биочипов (В.Р. Чечеткин, Д.В. Прокопенко и др., 2006; Б.Б. Дзантиев, 2010), их используют преимущественно в биологии, биотехнологии и медицине (A.B. Шишкин, 2008; A.B. Шишкин, И.И. Шмырев, 2008; A.B. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев, 2011; C.J. Koester et al., 2003). В России отсутствуют данные о разработке и применении в •ветеринарной практике биочипов для серологического анализа различных групп стрептококков.

В большинстве случаев терапия субклинического мастита (в том числе стрептококового) сводится к применению антибиотиков, что приводит к формированию устойчивых штаммов микроорганизмов, которые, оставаясь в молоке и после лечения, могут способствовать развитию дисбактериоза и снижению иммунного статуса у молодняка. Кроме того, антибиотики являются ингибиторами, и молоко по окончании курса терапии коров больных маститом подлежит браковке (A.B. Галкин, 2003; С.С. Першин и др., 2010). В.А. Париков и др. (2000); Г.И. Григорьева и др. (2006); С.С. Першина и др. (2010); М.С. Данилов и др. (2012) считают, что следует ограничить использование антибиотиков для терапии субклинического мастита. По мнению некоторых авторов целесообразно применять серебросодержащие препараты, обладающие широким антибактериальным спектром (В.А. Бурмистров и др., 2005; Е.В. Гарасько и др., 2008; О.В. Дементьева, М.А. Филиппенко, 2008); низкой токсичностью и аллер-генностью (П.П. Родионов, 1996; Е.М. Егорова и др., 2001; И.Б. Павлова и др., 2010; A.M. Смирнов и др., 2011).

В связи с этим возникает необходимость изыскания нового способа диагностики и терапии стрептококкового мастита коров.

Цель работы. Усовершенствовать лечебно-диагностические мероприятия при стрептококковом мастите коров.

Задачи исследований:

1. Изучить частоту выделения и биологические характеристики микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных из молока коров больных субклиническим маститом.

2. Разработать метод серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus на основе биочипа.

3. Разработать препарат, содержащий наночастицы серебра и изучить его антибактериальное и раздражающее действие.

4. Апробировать схему применения препарата, содержащего наночастицы серебра, при субклиническом мастите коров.

5. Дать терапевтическую и экономическую оценку применения разработанного препарата, содержащего наночастицы серебра при субклиническом мастите коров.

Научная новизна. Разработан новый метод серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus на основе биочипа в реакции связывания антиген-антитело. Установлена высокая чувствительность и специфичность иммунологического биочипа.

Разработан новый препарат, включающий наночастицы серебра, стабилизированные поливинилпирролидоном, получивший название «Аргомаст». Установлен широкий антибактериальный спектр действия препарата. Отработана схема его применения при терапии субклинического мастита коров. Показана высокая терапевтическая и экономическая эффективность препарата, содержащего наночастицы серебра при лечении коров с субклиническим маститом.

Приоритет выполненных исследований подтвержден патентом РФ «Способ определения антигенов микроорганизмов» (№ 2451083 от 08.12.2010 г.).

Теоретическая и прастическая значимость работы. Выполненные исследования по разработке метода серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus с применением иммунологического биочипа вносят определенный теоретический и практический вклад в идентификацию микроорганизмов рода Streptococcus.

Обоснованы показания, дозы и способ применения разработанного препарата «Аргомаст», включающего наночастицы серебра для терапии субклинического мастита коров. Установлена высокая терапевтическая эффективность антибактериального препарата «Аргомаст» при лечении коров с субклиническим маститом по сравнению с лечением антибиотиками. Препарат обеспечивает санацию вымени, сокращая в 2 раза сроки лечения коров с субклиническим маститом по сравнению с применением антибиотиков.

По результатам исследований подготовлено методическое пособие «Рекомендации по диагностике и лечению мастита коров с применением препаратов в сверхмалых дозах», утвержденное на заседании подсекции «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 07.02.2012).

Апробация работы. Материалы проведенных исследований доложены на заседаниях Ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии (20082012 гг .), на VII региональной научно-практической конференции молодых

ученых и специалистов (Новосибирск, 2009), II Сибирском ветеринарном конгрессе (Новосибирск, 2010), международной научной конференции молодых ученых (Краснообск, 2010), международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию АНИИСХ (Барнаул, 2010), X Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2011), региональной научно-практической конференции (Томск, 2011), Ш международной научно-практической конференции (Горно-Алтайск, 2011), V Международной научно-практической конференции «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», (Краснообск, 2012).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная медицина», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 страницах компьютерного текста и включает в себя введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 15 рисунками. Список использованной литературы включает 220 источников, в том числе 175 отечественных и 45 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Биологическая характеристика микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных из молока коров больных маститом.

2. Метод серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus с применением иммунологического биочипа.

3. Результаты изучения антимикробной активности и безвредности препарата «Аргомаст», включающего наночастицы серебра.

4. Терапевтическая и экономическая эффективность препарата «Аргомаст», включающего наночастицы серебра при лечении субклинического мастита коров инфекционной этиологии.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 2008-2012 гг. в лаборатории по изучению болезней молодняка сельскохозяйственных животных Государственного научного учреждения Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и в хозяйствах Новосибирской области.

В опытах использовано 97 коров черно-пестрой породы, 10 белых мышей, 6 морских свинок, 9 кроликов.

Диагностику мастита, а также изучение частоты выделения микроорганизмов рода Streptococcus из 125 проб молока от коров с субклиническим маститом проводили согласно «Методическим указаниям по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров», утв. Управлением ветеринарии РФ (2005). Бактериологические исследования молока проводили по общепринятым методикам

согласно «Рекомендациям по лабораторной диагностике стафилококкозов и стрептококкозов животных» (2008). Определение чувствительности стрептококков к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом в соответствии с «Методическими указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных» (1982).

При разработке тест-системы (биочип) для серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus использовали: 37 изолятов стрептококков, выделенные из молока коров, больных маститом; антистрептококковые сыворотки серологических групп В и D производства ООО «НПП Аквапласт» г. Санкт-Петербург. В качестве контроля проводили реакцию преципитации (РП) капиллярным способом согласно методике (Д.И.Скородумов и др., 2005). Экстракцию полисахаридных антигенов стрептококков проводили методом Лансфилд согласно инструкции по использованию набора группоспецифиче-

ских стрептококковых сывороток.

Антибактериальный препарат «Аргомаст», предназначенный для лечения мастита коров, включает в себя комплекс наночастиц серебра и диоксида титана, стабилизированный поливинилпирролидоном с концентрацией действующего вещества 20,0 мг/кг и представляет собой суспензию светло-желтого цвета. Препарат разработан совместно с ИХТТиМ СО РАН.

Исследование антибактериальных свойств препарата проводили методом серийных разведений в соответствии с «Микробиологической диагностикой бактериальных болезней животных» (2005).

Исследование местного раздражающего действия препарата «Аргомаст» на лабораторных животных проводили согласно «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005); «Методических указаний по определению токсических свойств препаратов,'применяемых в ветеринарии и животноводстве» (1988), а также при внутрицистернальном введении здоровым лактирующим коровам согласно методики Н.Т. Климова (2009). Исследования на лабораторных животных проводили с учетом «Требований к обращению с животными» ГОСТ Р ИСО 10993-22009 (Приказ Ростехрегулирования от 03.09.2009 № 315-ст).

Экономическую эффективность применения препарата «Аргомаст» определяли согласно материалам пособия «Организация и экономика ветеринарного

дела» И.Н. Никитина (2007).

Достоверность результатов проверяли путем статистической обработки. Расчеты проводили с помощью программы для стандартанализа «Microsoft Exel», входящей в пакет программ «Microsoft Office 7.0».

Выражаем благодарность сотрудникам лаборатории химии твердого тела Института химии твердого тела и механохимии Сибирского отделения Российской академии наук за помощь в проведении совместных исследований!

2.2 Результаты исследований 2.2.1 Изучение распространения и биологических характеристик микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных из молока коров больных маститом

Микроорганизмы рода Streptococcus из молока коров больных маститом выделяли в 80,8% случаев, при этом в моноварианте - в 23,2%, а в ассоциации с другими микроорганизмами в 76,8% случаев.

Из проб молока от коров больных маститом в ассоциации со стрептококками чаще всего выделяли микроорганизмы родов Staphylococcus (58,4%), Escherichia (35,2%) и Klebsiella (26,4%); меньше - Citrobacter (9,6%) и Enterobacter (3,2%).

Для выявления гемолитической активности изолятов микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных из молока коров с субклиническим маститом, провели посев 101 пробы на 5%-ный кровяной мясо-петонный агар (МПА).

В 33,6% случаев культуры стрептококков, образующие вокруг колоний зону просветления среды, относили к ß-гемолитическим. В 66,4% случаях микроорганизмы рода Streptococcus обладали у-гемолитической активностью, то есть не изменяли цвет кровяного агара. Культуры стрептококков, выделенные из молока коров с субклиническим маститом, а-гемолитической активностью не обладали.

Определение чувствительности 125 изолятов стрептококков выделенных из молока лактирующих коров, больных маститом к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом с бензилпенициллином, оксациллином, ампициллином, амоксиклавом, амоксициллином, тетрациклином, доксициклином, цефуроксимом, цефазолином, цефотаксимом, норфлоксацином, офлоксацином, ципрофлоксацином, энрофлоном, гентамицином, амикацином, неомицином, нетилмицином, тилозином, олеандомицином, линкомицином, эритромицином, левомицетином, полимиксином.

В результате исследований установлено, что изоляты стрептококков, выделенные из молока коров больных маститом, обладали высокой чувствительностью к ципрофлоксацину (84,8%), энрофлону (79,2%), гентамицину (76,8%), норфлоксацину (73,6%), цефуроксиму (71,2%), левомицетину (70,4%) и низкой чувствительностью к бензилпенициллину (11,2%), неомицину (24,0%), окса-циллину (24,8%) и полимиксину (28,8%). К ампициллину, амоксиклаву, амок-сицидлину, тетрациклину, амикацину, тилозину, олеандомицину, эритромицину чувствительность находилась в пределах 30-40%.

2.2.2 Разработка метода серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus

Сущность метода серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus с использованием иммунологического биочипа заключается в принципе ковалентного связывания антигена с антителом. При этом в качестве антигена выступают инактивированные культуры ß-гемолитических стрептококков, меченные флуоресцирующим красителем.

С целью изучения серогрупповой специфичности микроорганизмов рода Streptococcus исследовано 37 изолятов (29 ß-гемолитических стрептококков), выделенных из патологического секрета вымени коров больных маститом. Изучение чувствительности и специфичности тест-системы - иммунологический биочип проводили в сравнении с реакцией преципитации.

Последовательность изготовления биочипа.

На предметное стекло наносили 3%-ный раствор альбумина, 0,1% глицерина и 0,01% красителя амидочерного 10В; инкубировали при +80°С - 2 часа. На подготовленные подложки наносили антистрептококковую сыворотку по 0,1-0,5 мкл на точку. Биочип подсушивали в течение 3-5 часов, инкубировали при +5°С в 0,2%-ом растворе глутарового альдегида в течение 16-18 часов. Далее биочип поочередно промывали дистиллированной водой, фосфатно-солевым буфером и высушивали.

Последовательность анализа.

В забуференную суспензию инактивированной бактериальной культуры стрептококков в концентрации 1х10б КОЕ/мл добавляли пропидиум иодид (флюоресцентный краситель) в концентрации 1,0 мкг/мл. Суспензию наносили на поверхность биочипа и инкубировали в водяной камере со 100% влажностью при температуре +22-37 °С в течение 1 часа. После завершения инкубации биочип отмывали от несвязавшихся бактериальных клеток буферным раствором (50мМ, pH 7,2-7,4).

Опенка результатов.

Учет реакции проводили в трансиллюминаторе. Бактериальные клетки, содержащие флюоресцентный краситель, при взаимодействии со специфическими антителами, иммобилизированными на поверхности биочипа, образовывали комплекс «антиген - антитело» в виде скопления светящихся пятен. Проведенные исследования показали, что из 37 изолятов стрептококков в реакции преципитации и с использованием биочипа 51,4% изолятов были идентифицированы как серогруппа В, 16,2% - серогруппа D; не типированы 32,4% изолятов (табл. 1).

Таблица 1 - Серогрупповая идентификация микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных из молока коров больных маститом

Метод выделения Серогруппа Количество изолятов % Расход сыворотки, мкл Время исследования, мин.

Реакция В 19 51,4

D 6 16,2 20-25 140

преципитации _ 12 32,4

В 19 51,4

Биочип D 6 16,2 0,1 -0,5 65

- 12 32,4

Таким образом, проведенные исследования по сравнительной оценке двух методов серологической диагностики показывают высокую чувствительность и специфичность способа идентификации серогрупп стрептококков на основе биочипа. При этом преимущества применения биочипа по сравнению с реакци-

ей преципитации заключаются в следующем: иммобилизация нескольких различных антител на подложке одного биочипа; снижение расходования антистрептококковой сыворотки (0,1-0,5 мкл на точку), сокращение времени затрачиваемого на исследование на 53,6% по сравнению с традиционным методом.

2.2.3 Исследование биологического действия препарата, содержащего наночастицы серебра 2.2.3.1 Исследование антибактериальных свойств композиций, содержащих комплекс наночастиц серебра и диоксида титана на различных носителях

Для определения наиболее эффективных стабилизаторов комплекса наночастиц серебра и диоксида титана были испытаны образцы:

- комплекс наночастиц серебра и диоксида титана с концентрацией 2,0 мг/кг, нанесенный на гидрофильную мембрану, которая в дальнейшем растворялась в 0,9%-ом растворе хлорида натрия;

- комплекс наночастиц серебра и диоксида титана с концентрацией 2,0 мг/кг в вазелиновом масле;

- комплекс наночастиц серебра и диоксида титана с концентрацией 2,0 мг/кг, стабилизированный поливинилпирролидоном.

Исследования антибактериальной активности в отношении культуры Str. agalactiae (1x10 КОЕ/мл) проводили методом серийных разведений в микропланшетах. Опыт - композиция + бульонная культура, контроль - бульонная культура. Планшет с культурой и композициями инкубировали при температуре 37±1°С. Сразу после внесения, а также через 4, 12 и 24 часа были произведены замеры оптической плотности (ед.) жидкой среды в лунках (табл. 2).

Таблица 2 - Сравнительная оценка антибактериальных свойств комплекса наночастиц серебра и диоксида титана на различных носителях

Группа Гидрофильная мембрана, ед. Вазелиновое масло, ед. Поливинилпирроли-ДОН, ед.

после внесения через 24 ч после внесения через 24 ч после внесения через 24 ч

Опытная 1,3 304,7 1,4 239,2 1,45 62,0

Контрольная 1,2 282,5 1,34 242,4 1,35 152,3

В результате исследований, установлено, что гидрофильная мембрана и вазелиновое масло не подходят в качестве стабилизаторов комплекса наночастиц серебра и диоксида титана, так как рост бактерий контрольной и опытной групп был одинаковым. Наиболее выраженным антибактериальным действием обладал комплекс наночастиц серебра и диоксида титана стабилизированный поливинилпирролидоном, что выражается снижением роста бактерий на 59,3% относительно контроля.

2.2.3.2 Исследование антибактериальной активности наночастиц серебра, стабилизированных поливинилпирролидоном

Определение длительности антибактериальной активности наночастиц серебра, стабилизированных поливинилпирролидоном в отношении полевых

культур Str. agalactiae, Staph, albus, Esch, coli, Eni. agglomerans выделенных из молока коров больных маститом, осуществляли методом серийных разведений на микропланшете (аналогично выше изложенному).

В опыте использовали следующие концентрации наночастиц серебра: 40,0; 20,0; 10,0; 2,0 мг/кг стабилизатора. Измерения оптической плотности среды проводили сразу после внесения препарата и через 4, 12, 24 часа инкубации при температуре 37±1°С.

В результате проведенных исследований, установлено, что наночастицы серебра, стабилизированные поливинилпирролидоном обладают высокой антибактериальной активностью в концентрации 20,0 и 40,0 мг/кг стабилизатора; длительность бактериостатической фазы роста бактерий составляла 12 часов.

В дальнейших испытаниях препарат, включающий комплекс наночастиц серебра и диоксида титана, стабилизированный поливинилпирролидоном, получил условное название «Аргомаст».

2.2.3.3 Оценка местного раздражающего действия и острой токсичности при подкожном введении антибактериального препарата «Аргомаст» на лабораторных животных

Изучение раздражающего действия препарата «Аргомаст» на слизистые оболочки проводили на клинически здоровых кроликах. Препарат с максимальной концентрацией 40,0 мг/кг вносили в конъюнктивальный мешок глаза (1-2 капли). Через 15 минут (быстрая реакция) и через 1, 6 и 24 часа от начала опыта признаков керато-конъюнктивита не наблюдали, что свидетельствовало об отсутствии раздражающего действия препарата «Аргомаст» при нанесении

на слизистые оболочки.

Для изучения местного раздражающего действия препарата «Аргомаст» проводили биопробу на клинически здоровых кроликах и морских свинках. Препарат с максимальной концентрацией 40,0 мг/кг наносили в виде аппликации на кожу лабораторных животных (белые кролики, морские свинки). Установили отсутствие признаков поверхностного дерматита на месте аппликации через 3, 6, 12, 24 и 48 часов. Эти данные свидетельствуют об отсутствии местного раздражающего действия препарата «Аргомаст».

Исследование острой токсичности при подкожном введении препарата «Аргомаст» с максимальной концентрацией 40,0 мг/кг проводили на белых мышах. Препарат вводили подкожно в область холки в количестве 0,5 мл.

Установили, что через 24 часа, все животные живы, изменений в поведении, а также признаков воспаления на месте введения не наблюдали.

2.2.3.4 Оценка раздражающего действия препарата «Аргомаст» на молочную железу коров

Исследование раздражающего действия препарата «Аргомаст» с максимальной концентрацией 40,0 мг/кг проводили на клинически здоровых лакти-рующих коровах. Препарат вводили интрацистернально в дозе 10,0 мл однократно.

Установлено, что через 12 часов после введения препарата «Аргомаст», общее состояние исследуемых животных было в пределах физиологических

границ. Местная температура опытных и контрольных четвертей молочной железы не была повышена; кожа вымени эластичная, безболезненная.

Подсчет соматических клеток (СК) в молоке (табл. 3) показал, уменьшение их количества к 12 часам в опытной (на 48,6% относительно уровня СК в начале исследования) и контрольной четвертях (на 30,2%).

Таблица 3 — Содержание соматических клеток в молоке здоровых коров после _интрацистернального введения препарата «Аргомаст»_

Доли вымени Сроки исследования, часы

до введения 12 24 48 72

Опытная 468,8±73,3" 241,05±22,5* 265,8±20,3" 295,2±48,2" 327,1±57,1*

Контрольная 501,8±43,8' 419,8±32,2' 474,5±36,8' 455,2±53,8* 458,3±52,0"

Примечание: Р<0,05

К 72 часам наблюдали постепенное увеличение количества СК до уровня, не превышающего нормативные показатели (ГОСТ 52054-2003 «Молоко натуральное коровье — сырье»).

Уровень СК в молоке коров опытной группы к 72 часам снижался до 327,1 ± 57,1 тыс/мл, то есть на 16,3% относительно начала исследования; в контрольной до 458,3 ± 52,0 тыс/мл - на 8,7% соответственно. Данные могут свидетельствовать о нормальном физиологическом колебании количества СК в молоке (табл. 3).

Результаты опыта свидетельствуют о том, что препарат не оказывал раздражающего дейстзия на паренхиму вымени коров.

2.2.4 Отработка схемы применения препарата «Аргомаст»

С целью определения оптимальной терапевтической концентрации препарата «Аргомаст» по принципу аналогов были сформированы четыре опытные группы коров черно-пестрой породы второй-четвертой лактации с признаками субклинического мастита: 1-ая опытная (9 коров) концентрация наночастиц серебра 2,0 мг на кг стабилизатора; 2-ая опытная (12 коров) — 10,0 мг/кг; 3-я опытная (16 коров) - 20,0 мг/кг; 4-я опытная (15 коров) - 40,0 мг/кг. Коровам всех групп дважды в сутки интрацистернально вводили препарат «Аргомаст» в дозе 10,0 мл. Перед введением препарата молоко выдаивали из пораженной доли вымени, сосок дезинфицировали 70° спиртом. Терапевтическую эффективность препарата определяли по отрицательной пробе калифорнийского мастит-теста, а также путем подсчета соматических клеток и контрольному бактериологическому исследованию проб молока.

В ходе исследования у коров 1-ой опытной группы установили осложнение течения воспалительного процесса с переходом у 6 (88,8%) животных субклинического мастита в клинический, что потребовало дополнительных лечебных мероприятий.

Общее состояние коров 2-ой опытной группы после введения в больную долю вымени препарата «Аргомаст» было в пределах физиологических границ.

Доли молочных желез к концу лечения становились более мягкими; кожа вымени эластичной. При этом период выздоровления занимал 7,8 ± 0,8 суток.

Препарат с концентрацией действующего вещества 20 мг/кг в 100% случаев обладал терапевтическим эффектом, что выражалось в удовлетворительном общем состоянии животных. К моменту выздоровления местная температура долей молочных желез, подвергшихся лечению, не повышалась; кожа вымени была эластичной и безболезненной. Срок выздоровления коров в 3-ей опытной группе составил 4,18 ± 0,82 суток. Применение препарата в концентрации 20 мг/кг по сравнению с концентрацией 10 мг/кг сократило продолжительность лечения на 3,6 суток (табл. 4).

Таблица 4 — Терапевтическая эффективность препарата «Аргомаст» _при различных концентрациях действующего вещества_

Группа (концентрация действующего вещества, мг/кг) Всего в опыте Выздо ровело Сроки выздоровления, сутки

коров больных долей коров % долей %

1-я опытная (2,0) 9 11 1 11,2 1 9,1 14,5 ±0,55

2-я опытная (10,0) 12 14 12 100 14 100 7,8 ±0,8

3-я опытная (20,0) 16 17 16 100 17 100 4,18 ±0,82

4-я опытная (40,0) 15 15 15 100 15 100 4,06 ±0,69

Наибольший терапевтический эффект был достигнут от препарата «Аргомаст» с концентрацией действующего вещества 40 мг/кг. Так, срок выздоровления составил 4,06 ± 0,69 суток.

Уровень соматических клеток в молоке коров 1-ой опытной группы увеличился к концу лечения с 856,2 ± 42,3 до 1135,0 ± 32,6 тыс/мл - на 32,5%; 2-ой опытной - снизился с 798,6 ± 63,6 до 663,2 ± 32,5 тыс/мл, то есть на 16,9% по отношению к началу лечения; 3-ей опытной — снизился с 787,5 ± 32,2 до 336,8 ± 24,6 тыс/мл, то есть на 57,2%; 4-ой опытной - снизился с 800,3 ± 37,8 до 313,4 ± 21,2 тыс/мл, то есть на 60,8% соответственно (табл. 5).

Таблица 5 - Динамика содержания соматических клеток в молоке

Группа Количество соматических клеток, тыс./мл

начало лечения окончание лечения разность

1-я опытная (2,0) 856,2 ±42,3' 1135,0 ±32,6' + 278,8 ±9,7

2-я опытная (10,0) 798,6 ± 63,6' 663,2 ±32,5' -135,4 ±31,1

3-я опытная (20,0) 787,5 ±32,2' 336,8 ±24,6' -450,7 ±7,6

4-я опытная (40,0) 800,3 ±37,8' 313,4 ±21,2' - 486,9 ± 16,6

Примечание: Р<0,01

У одного животного (11,2%) из 1-ой опытной группы после выздоровления при контрольном посеве пробы молока на питательные среды была выделена микрофлора: St. aureus, St. albus, E. coli. Следовательно, препарат «Аргомаст» с концентрацией действующего вещества 2,0 мг/кг при лечении субклинического

мастита коров оказался малоэффективным. В молоке 25% животных 2-ой опытной группы при контрольном посеве обнаружена культура St. albus, 3-ей и 4-ой опытных групп — исходной микрофлоры не обнаружено.

Применение препарата с концентрацией действующего вещества 20,0 и 40 мг/кг характеризуется сходными показателями терапевтической эффективности, а именно отсутствием бакобсемененности контрольной пробы молока после лечения, снижением уровня CK и сроков выздоровления. Исходя из этого, в дальнейшем исследовали препарат «Аргомаст» с концентрацией наноча-стиц серебра - 20,0 мг/кг.

2.2.5 Оценка терапевтической и экономической эффективности применения препарата «Аргомаст» при терапии субклинического мастита коров 2.2.S.1 Определение терапевтической эффективности антибактериального препарата «Аргомаст»

Оценку терапевтической эффективности препарата «Аргомаст» провели на 20 коровах с субклиническим маститом. Коровам интрацистернально вводили антибактериальный препарат «Аргомаст» с концентрацией 20,0 мг/кг в дозе 10,0 мл дважды в сутки до выздоровления. Животным контрольной группы интрацистернально вводили антибактериальный препарат - «Неотил» (тилозина тартрат 0,25 г, неомицина сульфат 0,1 г) согласно наставлению. Данный препарат входил в схему лечения коров хозяйства. Эффективность способа лечения оценивали на основании результатов исследования проб молока калифорнийским мастит-тестом, подсчетом количества соматических клеток, учетом сроков выздоровления, контрольному бактериологическому посеву проб молока.

Как видно из таблицы 6, выздоровление опытных животных наступало в 96% случаев (95% долей) на 4,45 ± 0,27 сутки лечения препаратом «Аргомаст». В контроле вылечено 80% животных (81,8% долей) в течение 8,95 ± 0,53 суток.

Таблица 6 — Сравнительная терапевтическая эффективность антибактериальных _препаратов при терапии субклинического мастита коров_

Группа Всего в опыте Выздо ровело Срок выздоровления, сутки

коров больных долей коров % долей %

Опытная («Аргомаст») 20 25 19 95 24 96 4,45 ± 0,27

Контрольная («Неотил») 20 22 16 80 1S 81,8 8,95 ± 0,53

Примечание: Р<0,01

Из представленных в таблице 7 данных следует, что после лечения в молоке животных опытной группы содержание СК снизилось с 873,6±21,1 до 420,9±36,0 тыс/мл (на 51,8%), в контрольной - с 869,9±22,3 до 576,2±32,2 тыс/мл - на 33,8% (Р*<0,01).

Таблица 7 - Динамика содержания соматических клеток в молоке

Группа Количество соматических клеток тыс/мл

до лечения после лечения разность

Опытная («Аргомаст») 873,6 ±21,1' 420,9 ±36,0* -452,7 ±14,9

Контрольная («Неотил») 869,9 ±22,3' 576,2 ±32,2" -293,7 ±9,9

Примечание: Р<0,01

Выделенная микрофлора была представлена микроорганизмами родов Streptococcus (Str. agalactiae, Str. dysagalactiae, Str. spp.), Staphylococcus (St. albus, St. aureus), Escherichia (Esh. coli), Klebsiella (Kleb, pneumoniae), Enterobacter (Ent. agglomerans). До введения препаратов у всех коров обнаружили микрофлору в количестве от 6-96x103 КОЕ/мл секрета. После окончания лечения в секрете молочной железы у всех коров опытной группы ранее выделяемая микрофлора отсутствовала, у коров контрольной группы — 4-65x103 КОЕ/мл секрета.

Таким образом, эффективность лечения субклинического мастита коров препаратом «Аргомаст» была на 16% выше, чем при лечении животных по схеме принятой в хозяйстве, снижался уровень соматических клеток и бактериальная обсемененность молока, при этом сроки лечения сокращались с 8,95 до 4,45 суток, то есть на 50,2%.

2.2.5.2 Экономическая оценка применения препарата «Аргомаст» при субклиническом мастите коров

Исходя из проведенных ранее исследований, следует, что сроки лечения субклинического мастита коров препаратами «Аргомаст» и «Неотил» значительно отличались. Длительность сроков выздоровления сказывалась на снижении продуктивности, что выражалось в соответствующем виде ущерба, который для препарата «Аргомаст» был существенно ниже (на 55,5%), чем при использовании «Неотила» (табл. 8).

Таблица 8 — Сравнительная экономическая эффективность при лечении

Показатель «Аргомаст» «Неотил» Разность

Ущерб от снижения продуктивности 8800,00 15840,00 7040,0

Предотвращенный ущерб 92154,70 84840,80 7313,90

Затраты на проведение ветеринарных мероприятий 2953,00 8929,40 5976,40

Экономическая эффективность ветеринарных мероприятий 89201,70 75911,40 13290,30

Экономическая эффективность на рубль затрат 30,20 8,50 21,70

Расчёт сравнительной экономической эффективности лечения субклинического мастита препаратами «Аргомаст» и «Неотил» проводили исходя из цены молока 11 руб. за 1 л (цена 2011 г.).

В результате терапии субклинического мастита коров предотвращенный ущерб (Пу) при применении препарата «Аргомаст» составил 92154,70 рублей, что на 8,0% превышало показатели Пу при лечении «Неотилом». Затраты на проведение ветеринарных мероприятий при использовании препарата «Не-отил» составляли 8929,40 рублей, что на 66,9% больше, чем при применении препарата «Аргомаст». Экономическая эффективность ветеринарных мероприятий при использовании препарата «Аргомаст» в качестве на 14,9% выше, чем при применении «Неотила».

Экономическая эффективность на рубль затрат при использовании препарата «Аргомаст» составила 30,20 руб., «Неотила» - 8,50 руб.

3 ВЫВОДЫ

1. Микроорганизмы рода Streptococcus выделены из молока коров больных маститом в 80,8% случаев, при этом в моноварианте - в 23,2%; в ассоциации с микроорганизмами родов: Staphylococcus - 58,4%, Escherichia - 35,2%, Klebsiella - 26,4%, Citrobacter - 9,6%. В 33,6% случаев стрептококки обладают ß-гемолитической активностью.

2. Выделенные изоляты стрептококков обладают широкой вариабельностью чувствительности к антибиотикам: бензилпенициллину, оксациллину, ампициллину, амоксиклаву, амоксициллину, тетрациклину, неомицину, тилозину, олеандомицину, полимиксину (10-30%); к доксициклину, цефазолину, цефотак-симу, офлоксацину, амикацину, нетилмицину, эритромицину, линкомицину (40-60%); к цефуроксиму, норфлоксацину, ципрофлоксацину, энрофлону, ген-тамицину, левомицетину (70-80%).

3. Разработан метод серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus на основе биочипа, совпадающий по чувствительности и специфичности в 100% случаев с реакцией преципитации. Разработанный метод более технологичен, так как позволяет сократить расходование реактивов и проводить анализ разных серогрупп (С, D) стрептококков на одном биочипе.

4. Разработан препарат, содержащий наночастицы серебра стабилизированные поливинилпирролидоном. В концентрациях 2,0; 10,0; 20,0; 40,0 мг на кг стабилизатора наночастицы серебра обладают выраженным антибактериальным действием в отношении микроорганизмов родов - Streptococcus (Str. aga-lactiae, Str. dysagalactiae, Str. spp.), Staphylococcus (St. albus, St. aureus), Escherichia (Esh. coli), Klebsiella (Kleb, pneumoniae), Enterobacter (Enter, agglomérons). Продолжительность бакгериостатической фазы составляет 12 часов.

5. Препарат «Аргомаст» с максимальной концентрацией 40,0 мг/кг не обладает раздражающим действием на кожу, слизистые оболочки и при подкожном введении лабораторным животным. При интрацистернальном введении препарата здоровым коровам наблюдается физиологическое колебание соматических клеток в молоке, что свидетельствует об отсутствии раздражающего действия на паренхиму вымени коров.

6. Оптимальной терапевтической концентрацией наночастиц серебра, входящих в препарат «Аргомаст», при терапии субклинического мастита коров

является 20,0 мг/кг, о чем свидетельствует снижение уровня соматических клеток на 57,2% до физиологической нормы к 4 суткам и отсутствие исходной микрофлоры при контрольном посеве молока по окончании лечения.

7. Препарат «Аргомаст» при лечении коров с субклиническим маститом обусловливает выздоровление животных в 95% случаев (96% долей), уменьшением количества соматических клеток в молоке и сокращением сроков лечения на 49,7% по сравнению с антибиотикотерапией, отсутствием бактериальной обсемененности молока после лечения.

8. Экономическая эффективность применения препарата «Аргомаст» складывается из предотвращенного ущерба и затрат на проведение ветеринарных мероприятий при лечении субклинического мастита коров, которая возрастает с 8,5 до 30,2 рублей на 1 рубль затрат, что в 3,5 раза выше чем при анти-биотикотерапии.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus, участвующих в развитии стрептококкозов сельскохозяйственных животных разаботан новый метод на основе биочипа.

Для терапии субклинического мастита коров предложена схема лечения с использованием препарата «Аргомаст», содержащего наночасгицы серебра стабилизированные поливинилпирролидоном. Данная схема показала на практике более высокую терапевтическую и экономическую эффективность по сравнению со стандартной схемой лечения, включающей антибиотики.

По результатам исследований подготовлены рекомендации «Мероприятия по диагностике и лечению мастита коров с применением препаратов в сверхмалых дозах», утвержденные подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Рос-сельхозакадемии (протокол № 1 от 07.02.2012).

Результаты исследований используются в учебном процессе при подготовке студентов по специальности «Ветеринария» и научно-исследовательской работе на факультетах ветеринарной медицины Новосибирского ГАУ, Омского ГАУ им. П.А. Столыпина и факультете биотехнологии и ветеринарной медицины Иркутской ГСХА.

5 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Титова, М.А. Оценка антибактериальной и терапевтической эффективности препарата, включающего наночастицы серебра при мастите крупного рогатого скота ,/ М.А. Титова, H.A. Шкиль, В.Ю. Коптев, A.JI. Бычков // Ветеринарная медицина. - 2011. -№ 3-4. — С. 103-104.

2. Титова, М.А. Терапевтическая эффективность препарата Аргомаст при субклиническом мастите коров / М.А. Титова // Сибирский Вестник сельскохозяйственной науки. —2012. —№ 4. - С. 129-131.

3. Пат. 2451083 Российская Федерация, МПК C12Q1/00, G01N33/53, G01N33/533, Способ определения антигенов бактерий / В.Н. Афонюшкин, М.А. Титова, М.Л. Филиппенко, Ю.Г. Юшков, H.A. Шкиль, И.Н. Троменшле-гер; заявитель и патентообладатель Учр. Российск. акад. наук ин-т хим. биол. и фунд. мед. Сиб. отд. РАН, Гос. науч. учрежд. ин-т экспер. ветеринар. Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии. - № 2010150438/10; заявл. 08.12.10; опубл. 20.05.12.

4. Титова, М.А. Разработка иммунологического биочипа для серогруп-повой характеристики микроорганизмов рода Streptococcus / М.А. Титова, В.Н. Афонюшкин, H.A. Шкиль, В.Ю. Коптев // Современные достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и экономике: сб. тр. регион, науч.-пракг. конф. (Томск, 08 апр. 2011 г.). - Томск, 2011. - Вып. 13. - С. 32-35.

5. Титова, М.А. Разработка антибактериального препарата, включающего наночастицы серебра для терапии стрептококкозов мелких домашних животных / М.А. Титова // Актуальные проблемы сельского хозяйства горных территорий: материалы междунар. научно-практической конференции. (Горно-Алтайск, 1-4 июнь 2011г.). - Горно-Алтайск, 2011. - С. 281-287.

6. Титова, М.А. Оценка антибактериальной эффективности препарата, включающего наночастицы серебра в отношении микроорганизмов, вызывающих мастит крупного рогатого скота / М.А. Титова, В.Ю. Коптев, H.A. Шкиль // Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии: материалы науч.-практ. конф. (Красноярск, 25-28 июль 2011г.). - Красноярск, 2011. - С. 204-206.

7. Титова, М.А. Разработка нового метода иммунологической диагностики для серогруппового типирования микроорганизмов рода Streptococcus / М.А. Титова, H.A. Шкиль // Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии: материалы науч.-практ. конф. (Красноярск, 25-28 июль 2011г.). - Красноярск, 2011. - С. 206-207.

8. Титова, М.А. Доклиническое исследование антибактериального препарата «Аргомаст», включающего наночастицы серебра / М.А. Титова, H.A. Шкиль // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: материалы XI Сибирской ветеринар, конф. (Новосибирск, 22-23 марта 2012г.). - Новосибирск, 2012.-С. 165-166.

9. Титова, М.А. Оценка терапевтической и экономической эффективности различных препаратов при лечении субклинических маститов у коров / В.Ю. Коптев, М.А. Титова, A.B. Вольф, A.JL Бычков // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: тр. V междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых, посвящ. 10-летию ее проведения (пос. Красно-обск, 20 апреля 2012г.). - Новосибирск, 2012. - С. 104-106.

Подписано в печать 08.02.2013 г. Формат 60><84 '/16 Объем 1 п. л. Заказ №11. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ГНУ СибНСХБ Россельхозакадемии 630501, Новосибирская обл., пос. Краснообск

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Титова, Марина Александровна, Новосибирск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ СИБИРИ И

ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

На правах рукописи

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛЕЧЕБНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ ПРИ СТРЕПТОКОККОВОМ МАСТИТЕ КОРОВ

Титова Марина Александровна

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

06.02.03 — ветеринарная фармакология с токсикологией

Диссертация На соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

H.A. Шкиль' Научный консультант: кандидат биологических наук В.Н. Афонюшкин

Новосибирск 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................6

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................12

1.1 Историческая справка, общая характеристика распространение микроорганизмов рода Streptococcus....................12

1.1.1 Эпизоотологическое проявление стрептококкозов..............................16

1.1.2 Мастит. Субклинический мастит..........................................................................17

1.1.2.1 Общая характеристика....................................................................................................17

1.1.2.2 Этиология мастита..............................................................................................................20

1.2 Совершенствование аналитических методов диагностики. Разработка и применение биологических микрочипов на современном этапе..............................................................................................................25

1.2.1 Способ исследования антигенов клеток крови с помощью

иммунологического биочипа....................................................................................29

1.3 Совершенствование лечебных мероприятий при мастите

л актирующих коров............................................................................................................30

1.3.1 Применение антибиотиков для терапии мастита

л актирующих коров............................................................................................................30

1.3.2 Наноструктурное серебро............................................................................................34

1.3.2.1 Влияние серебра на организм человека и животных..........................36

1.3.2.2 Антибактериальная активность препаратов серебра..........................38

1.3.2.3 Применение препаратов серебра в медицине и ветеринарии... 41

1.4 Заключение по обзору литературы........................................................................46

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................49

2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЕДОВАНИЙ........................................49

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ......................52

2.2.1 Распространение и биологические характеристики

микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных из молока

коров больных маститом..............................................................................................52

2.2.1.1 Частота выделения микроорганизмов рода Streptococcus..............52

2.2.1.2 Изучение гемолитических свойств изолятов микроорганизмов рода Streptococcus......................................................... 53

2.2.1.3 Изучение чувствительности к антибиотикам изолятов микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных из молока коров больных маститом................................................ 55

2.2.2 Разработка метода серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus................................. 57

2.2.3 Исследование биологического действия препарата, содержащего наночастицы серебра.................................. 62

2.2.3.1 Исследование антибактериальных свойств наночастиц серебра, водящих в состав различных композиции............... 62

2.2.3.2 Исследование антибактериальной активности наночастиц серебра, стабилизированных поливинилпирролидоном......... 66

2.2.3.3 Сравнительная оценка антибактериальной активности серебро содержащего препарата «Аргомаст» с антибиотико содержащим препаратом «Неотил».................................. 71

2.2.3.4 Оценка местного раздражающего действия антибактериального препарата «Аргомаст»........................ 73

2.2.3.4.1 Исследование раздражающего действия при нанесении препарата «Аргомаст» на слизистые оболочки.................... 73

2.2.3.4.2 Исследование острой токсичности при подкожном введении препарата «Аргомаст»................................................... 73

2.2.3.4.3 Исследование кожно-резорбтивного действия препарата «Аргомаст»................................................................. 74

2.2.3.4.4 Оценка раздражающего действия препарата «Аргомаст» на молочную железу коров................................................. 75

2.2.4 Отработка схемы применения антибактериального препарата «Аргомаст» при субклиническом мастите коров.................. 77

2.2.4.1 Определение оптимальной терапевтической концентрации

наночастиц серебра в препарате «Аргомаст»....................... 77

2.2.5 Оценка терапевтической и экономической эффективности применения препарата «Аргомаст» при субклиническом мастите коров............................................................. 81

2.2.5.1 Определение терапевтической эффективности антибактериального препарата «Аргомаст»........................ 81

2.2.5.2 Экономическая оценка применения препарата «Аргомаст»

при субклиническом мастите коров.................................. 83

3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ............ 85

4 ВЫВОДЫ.................................................................. 96

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................. 98

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................... 99

7 ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................... 123

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ДИССЕРТАЦИИ

МПА - мясопептонный агар МПБ - мясопептонный бульон ПВП - поливинилпирролидон СК - соматические клетки

ВВЕДЕНИЕ

Ежегодно подавляющее большинство животноводческих хозяйств сталкиваются с маститами коров (В .В. Субботин, П.В. Бутузов,

A.Х. Найманов, 2010). Мастит чаще всего поражает высокопродуктивных коров в лактационный период. Маститы, наносят животноводческим предприятиям страны значительный экономический ущерб, который выражается в снижении молочной продуктивности, ухудшении биологических и технологических свойств, а в некоторых случаях и выбраковке молока, вынужденном убое животных, увеличении затрат на ветеринарное обслуживание (В. А. Париков, В. Д. Мисайлов, 2005; Н.Т.Климов, 2009; Г.М. Скогорева, Н.Т. Климов, 2010; A.M. Булгаков,

B.В. Королев, 2011; Е.А. Рыжакина, 2011).

Согласно публикациям отечественных ученых, таких как В.А. Париков, Н.Т. Климов и др. (2005, 2006), A.A. Архипов (2012) заболеваемость коров маститом на животноводческих предприятиях РФ составляет от 10-20 до 7080%. При этом на долю субклинического мастита приходится 75-80% (Л.В. Бочарова, 2005; И.Н. Рыбченко, 2011; C.B. Шабунин и др., 2011).

В настоящее время большинство отечественных и зарубежных исследователей считают, что воспалительный процесс в молочной железе у коров, как правило, связан с инфекционными агентами (C.B. Сиренко,

C.JI. Сафронов, 2006; Н.Т. Климов, В.А. Париков и др., 2008; И.В. Козлова, Н.В. Головачева, 2011; Е.А. Рыжакина, 2011; Gruet P. et al., 2001). Развитию болезни предшествует снижение резистентности организма животного под воздействием неблагоприятных факторов внешней среды и как следствие активизация условно-патогенной микрофлоры, в том числе стрептококков. Микроорганизмы рода Streptococcus широко распространены в природе и их относят к убиквитарным микроорганизмам, способным как самостоятельно, так и в ассоциации с другими микроорганизмами вызывать массовую патологию (JI.A. Ряпис, Н.И. Брико, A.C. Ещина и др., 2010).

В связи с этим, маститное молоко из-за содержания условно-патогенных и патогенных микроорганизмов становится опасным для человека и молодняка крупного рогатого скота (JI.A. Черепахина, 2007; Е.А. Рыжакина, 2011).

Широкому распространению стрептококкозов способствуют слабая изученность этиологической структуры болезни. При этом серогрупповая специфичность стрептококков имеет практическое значение, так как является решающим моментом в диагностике вызываемых ими болезней; вакцины и сыворотки, изготовленные из одних штаммов (серотипов), активны против исходных, но не действуют против других. Отсюда вытекает необходимость дифференциации стрептококковых штаммов (Б. Шуляк, 2003; В. Терехов, О. Терехова и др., 2008; JI.A. Ряпис, A.B. Липницкий, 1998; Л.А. Ряпис, Н.И. Брико, A.C. Ещина и др., 2010).

В последние годы все более пристальное внимание привлекается к разработке аналитических методов диагностики, характеризующихся высокой доступностью и вместе с тем обладающих достаточными уровнями чувствительности и специфичности. Особенный интерес вызывает возможность миниатюризации подобных аналитических устройств. Наиболее яркими представителями аналитических систем, сочетающих в себе перечисленные качества, являются биочипы (В.Р. Чечеткин, Д.В. Прокопенко и др., 2006; A.B. Шишкин, И.И. Шмырев и др., 2008; Б.Б. Дзантиев, 2010). Их используют преимущественно в биологии, биотехнологии и медицине: для диагностики атеросклероза и ишемической болезни сердца (C.J. Koester et al., 2003); онкологии (A.B. Шишкин, 2008; A.B. Шишкин, И.И. Шмырев, 2008; A.B. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев, 2011). В России отсутствуют данные о разработке и применении в ветеринарной практике биочипов, в том числе для серологического анализа различных групп стрептококков.

В большинстве случаев терапия субклинического мастита сводится к применению антибиотиков, что приводит к формированию устойчивых

штаммов микроорганизмов, которые, остаются в молоке и после лечения, таким образом, способствуя развитию дисбактериоза и снижению иммунного статуса у молодняка. Кроме того, антибиотики являются ингибиторами, и молоко по окончании курса терапии коров больных маститом подлежит браковке от 1 до 10 суток (A.B. Галкин, 2003; С.С. Першин и др., 2010). С целью ограничения использования антибиотиков (Г.И. Григорьева, И.В. Гордеева и др., 2006) перспективными в применении оказались серебросодержащие препараты, обладающие комплексом положительных свойств: широкий антибактериальный спектр в отношении условно-патогенной микрофлоры (О.В. Дементьева, М.А. Филиппенко, 2008); низкая токсичность и аллергенность (А.П. Родионов, 1995; Е.М. Егорова и др., 2001; И.Б. Павлова и др., 2010; A.M. Смирнов и др., 2011; N. Cioffi, L. Torsi, N. Ditaranto et al., 2005).

В связи с этим возникает необходимость изыскания нового способа диагностики и терапии стрептококкового мастита коров. Для этого требуется комплексный подход к изучению спектра биологических свойств, серогруппового полиморфизма микроорганизмов рода Streptococcus и совершенствование терапевтических мероприятий при стрептококковом мастите коров.

Цель работы. Усовершенствовать лечебно-диагностические мероприятия при стрептококковом мастите коров.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту выделения и биологические характеристики микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных из молока коров больных субклиническим маститом.

2. Разработать метод серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus на основе биочипа.

3. Разработать препарат, содержащий наночастицы серебра и изучить его антибактериальное и раздражающее действие.

4. Апробировать схему применения препарата, содержащего наночастицы серебра, при субклиническом мастите коров.

5. Дать терапевтическую и экономическую оценку применения разработанного препарата, содержащего наночастицы серебра при субклиническом мастите коров.

Научная новизна.

Разработан новый метод серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus на основе биочипа в реакции связывания антиген-антитело. Установлена высокая чувствительность и специфичность иммунологического биочипа.

Разработан новый препарат, включающий наночастицы серебра, стабилизированные поливинилпирролидоном, получивший название «Аргомаст». Установлен широкий антибактериальный спектр действия препарата. Отработана схема его применения при терапии субклинического мастита коров. Показана высокая терапевтическая и экономическая эффективность препарата, содержащего наночастицы серебра при лечении коров с субклиническим маститом.

Приоритет выполненных исследований подтвержден патентом РФ «Способ определения антигенов микроорганизмов» (№ 2451083 от 08.12.2010 г.).

Теоретическая и практическая иенность работы.

Выполненные исследования по разработке метода серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus с применением иммунологического биочипа вносят определенный теоретический и практический вклад в идентификацию микроорганизмов рода Streptococcus.

Обоснованы показания, дозы и способ применения разработанного препарата «Аргомаст», включающего наночастицы серебра для терапии субклинического мастита коров. Установлена высокая терапевтическая эффективность антибактериального препарата «Аргомаст» при лечении коров с субклиническим маститом по сравнению с лечением антибиотиками.

Препарат обеспечивает санацию вымени, сокращая в 2 раза сроки лечения коров с субклиническим маститом по сравнению с применением антибиотиков.

По результатам исследований подготовлено методическое пособие «Рекомендации по диагностике и лечению мастита коров с применением препаратов в сверхмалых дозах», утвержденное на заседании подсекции «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 07.02.2012).

Апробация работы.

Материалы проведенных исследований доложены на заседаниях Ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии (2008-2012 гг.), на VII региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Новосибирск, 2009), II Сибирском ветеринарном конгрессе (Новосибирск, 2010), международной научной конференции молодых ученых (Краснообск, 2010), международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию АНИИСХ (Барнаул, 2010), X Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2011), региональной научно-практической конференции (Томск, 2011), III международной научно-практической конференции (Горно-Алтайск, 2011), V Международной научно-практической конференции «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», (Краснообск, 2012).

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 — в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная медицина», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 122 страницах компьютерного текста и включает в себя введение, обзор литературы, материалы и методы

исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 15 рисунками. Список использованной литературы включает 220 источников, в том числе 175 отечественных и 45 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Биологическая характеристика микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных из молока коров больных маститом.

2. Метод серогрупповой идентификации микроорганизмов рода Streptococcus с применением иммунологического биочипа.

3. Результаты изучения антимикробной активности и безвредности препарата «Аргомаст», включающего наночастицы серебра.

4. Терапевтическая и экономическая эффективность препарата «Аргомаст», включающего наночастицы серебра при лечении субклинического мастита коров инфекционной этиологии.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Историческая справка, общая характеристика, распространение микроорганизмов рода Streotococcus

Впервые стрептококк выделил Л. Пастер в 1880 г., описал А. Розенбах в 1889 г.

Название представляет собой комбинацию из двух греческих слов — «strepto» (скрученный, сцепленный) и «coccos» (ягода) (З.Н. Кондрашова, А.Г. Сергеев, 2002).

Микроорганизмы рода Streptococcus — грамположительные, сферические или овальные клетки диаметром 0,5-0,2 мкм. Располагаются попарно или в виде коротких цепочек различной длины (З.Н. Кондрашова, А.Г. Сергеев, 2002; Б. Шуляк, 2003; В.И. Покровский, Н.И. Брико и др., 2006). Подвижностью не обладают, спор не образуют, некоторые виды имеют капсулу. Стрептококки - аэробы и факультативные анаэробы. Температурный оптимум роста составляет 36-38°С и кислотность - pH 7,27,6. Хемоорганотрофы, растут на средах богатых, органическими соединениями (В.И. Покровский, Н.И. Брико и др., 2006). Для их выращивания применяют среды, содержащие 0,5—1% глюкозы и 5% крови животных (лошади, барана, кролика). На МПА стрептококки образуют мелкие прозрачные колонии с голубым оттенком диаметром 0,5-2 мм (А.Н. Суворов, К.Б. Грабовская и др., 2010). При рассматривании колоний при слабом увеличении микроскопа они имеют мелкозернистое строение. В полужидком агаре стрептококки растут по уколу в виде тонкой нити, состоящей из отдельных колоний. В МПБ - помутнение, в последующем образуется осадок с просветлением бульона; на сывороточном агаре - мелкие прозрачные колонии, напоминающие капельки росы. В молоке различные виды и разновидности ведут себя неодинаково: одни, разлагая углеводы (глюкозу, лактозу), образуют кислоту; одни свертывают молоко, другие его

не свертывают (B.B. Кузьмин, 1960; Б.Ф. Бессарабов, A.A. Ватутин и др., 2007; JI. Бережная, 2008; В. Терехов, О. Терехова и др., 2008).

Метаболизм ферментативный, с образованием главным образом молочной кислоты; газ не образуют. Характерной