Структура, стабильность и комплексообразование сахар-связывающих белков с лигандами. Возможность их использования в качестве чувствительного элемента биосенсорных систем на глюкозу

Фонин, Александр Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура, стабильность и комплексообразование сахар-связывающих белков с лигандами. Возможность их использования в качестве чувствительного элемента биосенсорных систем на глюкозу
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура, стабильность и комплексообразование сахар-связывающих белков с лигандами. Возможность их использования в качестве чувствительного элемента биосенсорных систем на глюкозу"

На правах рукописи

ФОНИН

Александр Владимирович

СТРУКТУРА, СТАБИЛЬНОСТЬ И КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ САХАР-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ С ЛИГАНДАМИ. ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА БИОСЕНСОРНЫХ СИСТЕМ НА ГЛЮКОЗУ

03.01.03 - молекулярная биология

005530956

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17 !т-м 2013

Санкт-П етербург 2013

005530956

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук (ИНЦ РАН), Санкт-Петербург

Научные руководители: доктор биологических наук

КУЗНЕЦОВА Ирина Михайловна ИНЦ РАН

доктор физико-математических наук, профессор ТУРОВЕРОВ Константин Константинович, ИНЦ РАН

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

ТИМКОВСКИЙ Андрей Леонидович Федеральное государственное бюджетное учреждение Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова

доктор биологических наук БОРОВИКОВ Юрий Сергеевич ИНЦ РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биологического приборостроения с опытным производством Российской академии наук

Защита диссертации состоится «28» июня 2013 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе ИНЦ РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Адрес электронной почты ИНЦ РАН: cenbio@m3il.cvtspb.rssi.nl Сайт: Ьнр^/ц-ут-ууЕфЬ.гая.т Факс: 8(8Т2)29705-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЦ РАН Автореферат разослан «27» мая 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

В течение последнего десятилетия представления о том, как осуществляется фолдинг белков, и даже представления о нативном белке как о белке с жесткой, строго детерминированной структурой, претерпели существенное изменение. На рубеже столетий стали появляться работы, свидетельствующие о том, что полипептидные цепи многих белков в принципе не способны образовывать компактное глобулярное состояние. Тем не менее, такие белки, будучи частично или полностью неупорядоченными, выполняют в клетке присущую им функцию, т.е. являются нативными [1-3]. Эти белки могут переходить в компактное глобулярное состояние только при взаимодействии со своими партнерами: низкомолекулярными лигандами, другими белками, нуклеиновыми кислотами и т.д. В связи с этим изучение влияния лигандов на стабильность и процесс фолдинга белков представляет значительный интерес.

Двухдоменные лиганд-связывающие белки периплазмы грам-отрицательных бактерий (РВР) могут быть удобной моделью для изучения роли лигандов в процессах фолдинга и стабилизации структуры белков в нативном состоянии. Эти белки участвуют в переносе различных веществ (углеводов, аминокислот, пептидов) через клеточную мембрану, используя энергию, высвобождаемую в результате гидролиза АТФ. Отличительной особенностью РВР, выделяющей их из других классов белковых рецепторов, являются значительные изменения пространственной структуры при взаимодействии со своими лигандами [4]. Понимание механизмов комплексообразования этих белков и роли лигандов в процессах их фолдинга и стабилизации структуры особенно важно в связи с возможностью их использования в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем на ряд аналитов, в частности, на глюкозу.

В настоящей работе объектами исследования были сахар-связывающие белки: Э-глюкоза/О-галактоза-связывающий белок из Е.соН (ООВР) и трегалоза/мальтоза-связывающий белок из термофильной бактерии ТЪегтососсия ПюгаШ (ТМВР). Связывание этих белков с лигандами (сахарами) приводит к значительным изменениям их третичной структуры, что делает возможным использование этих белков при конструировании социально значимых биосенсоров для определения содержания глюкозы в биологических жидкостях. Последнее имеет важное практическое значение для медицины в связи с острой необходимостью создания неинвазивного глюкометра непрерывного действия. Поскольку при использовании лиганд-связывающих белков в качестве чувствительного элемента биосенсоров важно использовать такие формы белков,

которые отличаются высоким уровнем стабильности к агрессивному действию окружающей среды, немаловажным является изучение стабильности этих белков.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является исследование структуры, фолдинга, стабильности и комплексообразования с глюкозой сахар-связывающих белков ООВР и ТМВР, а также ряда их мутантных форм с точки зрения их возможного использования в качестве чувствительного элемента глюкометра. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение устойчивости ООВР и ТМВР к действию различных денатурирующих факторов.

2. Исследовать роль лигандов в стабилизации этих белков и, в частности, роль иона Са в фолдинге и стабилизации ООВР.

3. Изучить процессы разворачивания-сворачивания мутантных рекомбинантных форм ООВР и ТМВР, которые потенциально могут быть использованы в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Комплексообразование с ионом Са приводит к значительному увеличению устойчивости структуры апоформы (¡ОВР к денатурирующим воздействиям, что позволяет отнести ООВР к белкам с частично неупорядоченной структурой.

2. Комплексообразование с глюкозой существенно повышает стабильность ООВР. Связывание иона Са комплексом ООВР с О-глюкозой не оказывает сколько-нибудь заметного влияния на стабильность структуры холоформы ООВР.

3. Процесс разворачивания как ООВР, так и его комплекса с О-глюкозой под действием Ос1пНС1 является одностадийным и обратимым. Тепловая денатурация ООВР и его комплекса с О-глюкозой осложнена агрегацией. Степень агрегации определяется концентрацией белка, температурой нагрева и продолжительностью инкубации белка при высокой температуре.

4. ТМВР обладает исключительно высокой устойчивостью к денатурирующим воздействиям, значительно большей по сравнению с ООВР.

5. Способность связывать глюкозу и чрезвычайно высокая стабильность ТМВР делают мутантные рекомбинантные формы этого белка предпочтительными кандидатами на роль чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу по сравнению с мутантными рекомбинантными формами ООВР.

6. Наиболее перспективными из числа исследованных мутантных форм ТМВР и ООВР для использования в качестве чувствительного элемента биосенсорной

системы на глюкозу следует считать мутантные формы TMBP/C182S/A14C (Kd = 3.4 ± 0.1 мМ, амплитуда изменения полезного сигнала 40 %) и GGBP/H152C/A213R/L238S (K,j - 5.2 ± 0.3 мМ, амплитуда изменения полезного сигнала 200 %)

Научная новизна работы

В настоящей работе получены новые данные о влиянии комплексообразования GGBP с глюкозой и ионом Са на стабильность этого белка. Обнаружено, что отщепление иона кальция оказывает дестабилизирующее действие на структуру открытой формы GGBP.

В работе впервые проведено подробное изучение устойчивости трегалоза/мальтоза-связывающего белка из термофильной бактерии Thermococcus litoralis к денатурирующим воздействиям. Показано, что этот белок обладает значительно большей стабильностью по сравнению с GGBP. Предложены, получены и охарактеризованы мутантные формы ТМВР, обеспечивающие ковалентное присоединение флуоресцентного красителя BADAN. Показано, что мутантная форма TMBP/C182S/A14C с красителем, присоединенным по 14-му положению, представляет наибольший интерес для использования в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу.

Теоретическое и практическое значение работы

Новые данные о сворачивании-разворачивании Ц-галактозаВ-глюкоза-связывающего белка, а также о влиянии глюкозы и иона Са на этот процесс, существенны для понимания роли лигандов при фолдинге этого белка и в стабилизации его структуры к денатурирующему действию химических денатурантов и нагревания. Эти данные существенны также для понимания процессов фолдинга частично неупорядоченных белков. Полученные в работе данные об исключительной стабильности трегалоза/мальтоза-связывающего белка из термофильной бактерии Thermococcus litoralis подтверждают представление о взаимосвязи стабильности белков и средой обитания организмов.

Данные о характере процессов сворачивания-разворачивания GGBP и ТМВР и их мутантных рекомбинантных форм с присоединенным внешним красителем и измененной константой связывания глюкозы могут иметь важное практическое значение при разработке чувствительных элементов социально значимых биосенсорных систем на глюкозу и ряд других аналитов.

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.

Личный вклад автора

Все экспериментальные процедуры, описанные в работе, за исключением синтеза плазмид, кодирующих целевые белки, проведены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.

Апробация работы:

По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы (8 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых изданиях и 15 тезисов). Материалы работы представлены в качестве устных докладов на следующих конференциях:

1) Политехническом симпозиуме «Молодые ученые - промышленности СевероЗападного региона» (Санкт-Петербург, 2010);

2) VI Международной конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2010);

3) VII Международной конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2011);

5) III конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012);

6) IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012);

7) Международной конференции "Weak Protein-Ligand Interaction; New Horizons in Biophysics and Cell Biology" (Китай, Пекин, 2012).

Финансовая поддержка:

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (руководитель К.К. Туроверов), Министерства образования и науки РФ (государственные контракты № 16.512.11.2114, № П1198, № 02.512.11.2277, №02.740.11.5141), Российского фонда фундаментальных исследований (проект 12-04-31708 мол а), Совета по грантам президента РФ (стипендия СП-2390.2012.4).

Объем и структура диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных и их обсуждения, представленных в четырех главах, выводов и списка цитируемой литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. D-глюкоза (Sigma, США), NaCl (Вектон, Россия), флуоресцентный краситель BADAN (AnaSpec, США), флуоресцентный краситель АТТО-590 (АТТО-ТЕС GmbH, Германия), гуанидингидрохлорид (Nacalai Tesque, Япония), ацетонитрил (Sigma,

США), глицерин (Merck, Германия), сульфат хинин (AnaSpec, США) использовались без дополнительной очистки. Концентрацию GdnHCl и глицерина определяли с помощью рефрактометра Аббе (JIOMO, Россия).

На начальных этапах в работе использовали препараты GGBP и ТМВР, предоставленные проф. Д'Ауриа (Институт биохимии белка Национального совета по науке Италии, Неаполь). Д'Ауриа также любезно предоставил ген mglB, кодирующий белок GGBP, и ген malE, кодирующий ТМВР. Эти гены были переклонированы из плазмид pTzl8u-mglB и pRHolOOO, соответственно, в плазмиду pET-Ild (Stratagene) с заменой собственного промотора на Т7 промотор (вставка гена была проведена по сайтам для рестриктаз Nco\ и ßg/II). Полученные плазмиды, содержащие нуклеотидные последовательности гена mglB и malE, использовали для создания мутантных форм GGBP и ТМВР, соответственно. Векторная ДНК, подвергаемая мутагенезу, была изолирована из бактериальных клеток с использованием стандартных методик щелочного лизиса [5] с помощью наборов фирмы Omnix (Россия). Сайт-направленный мутагенез выполнен с помощью наборов Quick-Change Mutagenesis Kit (Stratagene) с использованием коммерческих синтетических праймеров, кодирующих соответствующую аминокислотную замену. Очистка праймеров была осуществлена с использованием методов обратнофазной хроматографии или электрофореза в полиакриламидном геле. Химерные конструкции sfGFP-GGBP/W183A/T185C и sfGFP-GGBP/T185C получали в два этапа: сначала были синтезированы плазмиды рЕТ-1 ld-GGBP/W183A/T185C и pET-lld-GGBP/T185C, затем с помощью ПЦР-амплификации в полученные конструкции были введен ген, кодирующий зеленый белок sfGFP. Эти работы выполнены в лаборатории проф. В.В. Верхуши в Медицинском Колледже им. Альберта Эйнштейна. Плазмиды рЕТ-lld, кодирующие сахар-связывающие белки GGBP и ТМВР и их мутантные формы, химерные конструкции sfGFP-GGBP/W183A/T185C и sfGFP-GGBP/T185C, предоставленные проф. В.В. Верхушей, использовали для трансформации клеток Escherichia coli BL21(DE3). Экспрессию белков в Escherichia coli индуцировали 0.5 мМ IPTG (Nacalai Tesque, Япония). Наращивание клеточной массы проводили в течение 24 ч при 37 "С. Белки очищали с помощью №++-агарозы (колонки His GraviTrap, GE Healthcare, Швеция). Контроль чистоты полученных белковых препаратов осуществляли с помощью SDS-электрофореза в денатурирующих условиях в 15 %-ном полиакриламидном геле согласно стандартной методике [6].

Присоединение флуоресцентных красителей к мутантным формам GGBP и ТМВР осуществляли согласно методике, описанной Ханом [7].

Эксперименты выполнены при концентрации растворов белков 0.2-0.8 мг/мл. Для образования комплекса белок-лиганд в раствор белка добавляли D-глюкозу в концентрации 10-20 мМ. Измерения проводили в буферных растворах, содержащих лимонную кислоту и Na2HP04 (рН 2.8, 4.2, 6.0, 7.1), PBS рН 7.4, или TrisHCl рН 7.2, 9.6.

Анализ пространственной структуры белков. Свойства микроокружения и особенности локализации аминокислотных остатков в GGBP и ТМВР (файлы 2GBP.ent, 2FWO.ent, lEU8.ent из Международного банка белковых структур PDB [8]) анализировали с использованием данных о координатах атомов пространственной структуры этого белка. Микроокружение аминокислотных остатков определяли как совокупность атомов, расположенных на расстоянии менее г0 от геометрического центра индольного или фенольного кольца; го было принято равным 7 Á [9].

Флуоресцентные измерения. Флуоресцентные измерения проводили с использованием спектрофлуориметра Сагу Eclipse (Varian, Австралия). Измерение анизотропии флуоресценции и времени жизни возбужденного состояния выполнены с использованием спектрофлуориметрических установок собственного изготовления [10] со стационарным и импульсным возбуждением в микрокюветах (101.016-QS 5 х 5 мм; Hellma, Германия). Измерение кинетики связывания GGBP/H152C-BADAN с глюкозой было выполнено с помощью аппаратуры остановленного потока MOS 450 (Bio-Logic, Франция).

Собственную УФ флуоресценцию измеряли при возбуждении светом с длинами волн 280, 297 нм. Флуоресценцию красителя BADAN возбуждали при длинах волн 350, 387 и 405 нм. Флуоресценцию химерных конструкций SÍGFP-GGBP/W183A/T185C и sfGFP-GGBP/T185C возбуждали при длинах волн 460 и 490 нм. Для характеристики положения и формы спектров триптофановой флуоресценции использовали параметр А = IrjJhfó (/320 и /зб5 - интенсивность флуоресценции, измеренная при длинах волн 320 и 365 нм, соответственно). Спектры флуоресценции и параметр А корректировали на спектральную чувствительность установки. Квантовый выход флуоресценции BADAN определяли согласно методике, описанной ранее [11]. В качестве эталона использовали раствор хинин сульфата в 0.1 М H2SO4.

Константа диссоциации комплексов белков с глюкозой определена согласно [12]. Равновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик GGBP от концентрации GdnHCl измеряли после инкубации белка в растворах GdnHCl соответствующей концентрации при 4 °С в течение 24 ч. Измерения выполнены при 23 "С.

Анализ затухания флуоресценции. Кривые затухания флуоресценции анализировали в мультиэкспоненциальном приближении. Расчет проводили по методу

наименьших квадратов с использованием алгоритма минимизации Маркуардта [13]. В качестве эталона использовали растворы р-терфенила в этиловом спирте или N-ацетилтриптофанамида в воде [14].

Измерение спектров КД. Измерение спектров КД проводили с использованием спектрополяриметра J-810 (Jasco, Япония). Для измерения спектров КД в дальней УФ области использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 мм, в ближней УФ и видимой областях - кюветы с длиной оптического пути 1 см. Для улучшения соотношения сигнал/шум каждый спектр регистрировали 5 раз и полученные данные усредняли. Спектры КД белков построены с учетом КД соответствующего буферного раствора.

Тушение флуоресценции акриламидом. Для того чтобы получить информацию о доступности триптофановых остатков и хромофора молекулам растворителя, проводили эксперименты по тушению их флуоресценции внешним тушителем акриламидом. Полученные данные представляли в координатах Штерн-Фольмера и аппроксимировали линейной зависимостью. При обработке данных делали поправку на вклад в регистрируемое свечение растворителя. Бимолекулярная константа (кч) была рассчитана на основании константы Штерн-Фольмера (Ksv) и времени жизни (г) как kq— Ksv! т.

Дифференциальная сканирующая калориметрия. Калориметрические измерения были выполнены с использованием дифференциального адиабатного сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (НПО "Биоприбор", Пущино), как описано в работах [15-17]. Раствор белка в концентрации 0.65 мг/мл нагревали с постоянной скоростью 1 К/мин при избыточном давлении 2.4 атм. Обратимость теплового перехода определяли путем сравнения повторного прогрева образца, выполненного сразу после охлаждения образца до исходной температуры, и предыдущего прогрева. Из полученных данных вычитали инструментальную базовую линию, полученную при прогреве калориметра с двумя ячейками, заполненными буферным раствором. Избыточная теплоемкость была рассчитана как описано в работе [18]. Зависимости избыточной теплоемкости от температуры анализировали с помощью программы Origin (Micro-Cal Inc., Northampton, МЛ). Стабильность белков была охарактеризована температурой, отвечающей максимуму пика теплопоглощения (Гщ), и величиной энтальпии теплового перехода (A//cai), рассчитанной как площадь под кривой избыточной теплоемкости.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Была изучена стабильность двух сахар-связывающих белков, способных связывать глюкозу: О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка из Escherichia coli и

трегалоза/мальтоза-связывающего белка из термофильной бактерии Thermococcus litoralis. Исследования структуры этих белков были выполнены в апо и холоформах. Было также исследовано влияние иона Ca в связи с ролью этого лиганда в процессе фолдинга GGBP и стабилизации его пространственной структуры.

В связи с возможным использованием этих белков в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем на глюкозу были исследованы мутантные формы GGBP и ТМВР с присоединенным внешним красителем и с измененными значениями константы связывания глюкозы.

Роль лигандов в стабилизации структуры GGBP

Р-галактоза/О-глюкоза-связывающий белок (GGBP) из Escherichia coli имеет типичную для лиганд-связывающих белков двухдоменную структуру. Сайт связывания молекулы глюкозы, расположен в глубокой щели между N и С-концевыми доменами, сайт связывания иона кальция локализован в петле С-концевого домена молекулы GGBP и имеет структуру, характерную для мотива "EF-руки", часто встречающегося у внутриклеточных кальций-связывающих белков [19].

Показано, что отщепление иона кальция как от GGBP, так и от комплекса GGBP/Glc не приводит к заметным изменениям вторичной структуры белка, о чем свидетельствует неизменность спектров КД в дальней УФ области. В то же время, используя триптофоновую флуоресценцию, удалось зарегистрировать небольшие различия в третичной структуре этих форм белков. Положение спектра флуоресценции сдвигается в длинноволновую область в следующем порядке: GGBP/Glc < GGBP-Ca/Glc ~ GGBP < GGBP-Ca, что свидетельствует о некоторой компактизации пространственной структуры белка при связывании иона кальция. Наибольшее изменение структуры происходит при связывании иона Ca с апоформой GGBP. Компактность закрытой формы белка при отщеплении иона Ca изменяется незначительно.

Сворачивание-разворачивание апо н холоформы GGBP под действием GdnHCl.

Равновесные и квазиравновесные зависимости различных флуоресцентных характеристик (интенсивности флуоресценции при фиксированной длине волны регистрации, параметра А и анизотропии флуоресценции), а также зависимость величины эллиптичности при длине волны 222 нм для GGBP и GGBP/Glc от концентрации GdnHCl имеют S-образную форму, что свидетельствует об одностадийном характере разворачивания GGBP и комплекса GGBP/Glc (Рис. 1). Об этом же свидетельствует линейный характер параметрической зависимости для GGBP и комплекса GGBP/Glc, построенный на

основании измерения зависимостей интенсивности триптофановой флуоресценции при длинах волн регистрации 320 и 365 нм от концентрации Ос1пНС1.

0 9 р. 0.8 I <"

Р.

5 06

0.5

Ру □ в %°А U

г -

0.16

0,14

0.12

0.10 '

0.08

0.06

0.04 -

ОЛЛС|, М ОйпНС1, М

Рис. 1. Конформационные изменения ОСВР и СОВР-Са (красные и розовые кружки, соответственно), ССВР/Ис и ССВРЛ31с-Са (синие и голубые кружки, соответственно) под действием СёпНС!. (а) Изменения интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 320 нм. (б) Изменения параметра А. (в) Изменения анизотропии флуоресценции при длине волны возбуждения 297 нм. (г) Изменения эллиптичности при 222 нм. Открытые символы соответствуют процессу денатурации, закрытые -ренатурации

Середина перехода денатурационной кривой сдвигается в область больших значений Сс1пНС в следующем порядке: СОВР-Са < ОвВР < ССВР-Са/Ис < СвВР/ас (Рис. 1). Причем для СвВР-Са значения всех зарегистрированных характеристик существенно изменяются уже при небольших концентрациях ОёпНС1 и вся денатурационная кривая для ООВР-Са сдвинута в область значительно меньших концентраций Ос)пНС1 по сравнению с кривой, зарегистрированной для апоформы вОВР, что свидетельствует о существенной роли иона кальция в стабилизации нативной структуры белка.

Стационарные кривые, отражающие процесс сворачивания - разворачивания ООВР, после инкубации белка в течение 24 ч в растворах, содержащих ОёпНО различной концентрации, совпадают. Это свидетельствует о том, что процесс обратим и что связывание иона Са при ренатурации белка (ООВР-Са^ является достаточно быстрым процессом, а лимитирующей стадией сворачивания белка является формирование его нативной структуры

(ООВР-Са)и (ОвВР-Са^ ^^ (ООВР)ы

к-1 +Са

Взаимодействие GGBP и Glc при ренатурации, вследствие высокой константы связывания GGBP с Glc, казалось бы, не должно являться лимитирующей стадией

образования нативного комплекса ООВР/С1с. Однако оказалось, что кривая, отвечающая ренатурации комплекса, измеренная после 24 ч инкубации предварительно развернутого белка в растворах с различной концентрацией ОёпНС1 в присутствии глюкозы (Рис. 2, а, синие закрытые квадраты), не совпадает с кривой, отвечающей процессу денатурации, а близка к кривой, отвечающей процессу сворачивания-разворачивания свободного белка (Рис. 2, а, красный цвет).

сипна, м

Рис. 2. (а) Конформационные изменения ООВР и ООВР/С1с под действием Ос1пНС1, зарегистрированные по изменению параметра А =/з2о//зб5- Кривые денатурации ООВР были измерены после инкубации белка в растворах с соответствующий концентрацией денатуранта в течение суток при 4 °С (красная сплошная линия и открытые красные кружки) и для ООВР/С1с после инкубации с течение сугок (синяя штриховая линия и синие открытые квадраты) и 10 дней (синяя сплошная линия и синие открытые кружки). Данные по ренатурации из полностью развернутого состояния белка были получены после инкубации в растворе соответсвующей концентрации денатуранта при 4 °С в течение суток для ООВР (красные закрытые кружки) и в течение суток (синие закрытые квадраты) и 10 дней для ООВРЛ31с (синие закрытые кружки). Хех—291 нм. (б) Кинетическая схема, характеризующая процессы разворачивания - сворачивания СОВР и ООВРЛ31с.

Это означает, что в этих условиях лимитирующей стадией в образовании нативного комплекса ООВРЛ31с из (ООВР)и в присутствии в1с и Са является взаимодействие белка с глюкозой. Кривые, измеренные после 24 ч инкубации белка в растворах с соответствующей концентрацией Ос1пНС1, не являются равновесными. Процесс сворачивания — разворачивания комплекса ООВР/С1с, который можно описать следующей кинетической схемой:

к[ к2 к3 (ООВР-Са)и (СвВР-Са^ (ОСВР)н > (СЮВР/01с)м.

+ ас, Са к., + ас, Са "Ъ + ас "1-з

Этот процесс оказался очень медленным - равновесные зависимости были получены только после 10 сут инкубации белка в растворах с соответствующей концентрацией Ос1пНС1 (Рис. 2, а, сплошная синяя линия). Наблюдаемые эффекты можно объяснить существованием активационного барьера между нативным и развернутым состоянием. До установления равновесия долгое время сохраняется избыточная концентрация (по

сравнению с равновесным значением) нативного комплекса (ООВРЛШс^ на пути разворачивания и (ООВР)и - на пути сворачивания, что объясняется существованием активационного барьера (Рис. 2, б). На пути разворачивания элементарный акт диссоциации комплекса еще не приводит к нарушению конфигурационного соответствия молекул СвВР и 01с и, следовательно, велика вероятность обратной реакции. Напротив, на пути сворачивания необходимо не только возникновение нативной молекулы (ООВР)м, но необходимо также конфигурационное соответствие молекул (ООВР)м и Ис.

В стабилизации комплекса 00ВР/01с ион Са также играет существенную роль. В отсутствие иона Са (00ВРЛ31с-Са) комплекс разворачивается при меньших концентрациях Ос1пНС1 по сравнению с С0ВР/01с. Равновесие достигается через 10 дней инкубации в растворах с соответствующими концентрациями денатуранта, а процесс ренатурации требует даже несколько большего времени.

Тепловая денатурация вСВР и ОС1И7С1с. В связи с существованием в литературе различных точек зрения относительно обратимости процесса денатурации ОвВР и образования агрегатов [20-22] было проведено исследование тепловой денатурации ООВР. Были зарегистрированы кривые теплопоглощения белка в отсутствие и в присутствии лигандов - О-глюкозы и иона Са (Рис. 3).

Рис. 3. Температурные зависимости теплоемкости ООВР и ООВР-Са (красная и розовая кривая, соответственно), СвВР/Яс и СвВР/Ос-Са (синяя и голубая кривая, соответственно). Концентрация белка была 0.65 мг/мл. Два последовательных скана (сплошная и пунктирная кривая, соответственно) характеризуют обратимость перехода.

Образование комплекса ОСВР/С1с приводит к заметному (на 13.9 °С) сдвигу кривой теплопоглощения ООВР/Ис в область более высоких температур (Тт = 64.4 °С). При этом пик теплопоглощения становится более выраженным и узким, что свидетельствует о существенном увеличении кооперативности денатурационного перехода для комплекса

30 40 50 60 70

Температура, "С

СвВР/Ок по сравнению с ССВР и об увеличении стабильности белка при связывании О-глюкозы.

Отщепление иона кальция как от ООВР, так и от комплекса ССВР/01с приводит к смещению пика теплопоглощения в область более низких температур на 8 и 3 "С, соответственно (Рис. 3). При этом если для П0ВР/01с-Са пик теплопоглощения остается выраженным и узким, то для ООВР-Са его полуширина значительно увеличивается, а амплитуда уменьшается. Это еще раз подтверждает заключение о существенной роли иона кальция в стабилизации структуры апоформы ООВР. Таким образом, данные по тепловой денатурации апоформы ООВР, также как и данные по его денатурации Ос1пНС1, свидетельствуют о том, что белок становится стабильным только в присутствии иона Са, что позволяет рассматривать ООВР как белок с частично неупорядоченный структурой. Существуют и другие белки, в которых упорядоченная структура возникает только после присоединения ионов металлов [23].

Было показано, что тепловая денатурация ООВР в отсутствие и в присутствии лигандов обратима. При охлаждении растворов белка до комнатной температуры наблюдается восстановление параметра А и анизотропии флуоресценции до уровня, присущего этим параметрам белка в нативном состоянии. Однако при нагревании белка до температур выше температуры окончания денатурационного перехода и продолжительной инкубации белка при высокой температуре возникает частичная необратимость тепловой денатурации белка, проявляющаяся в неполном совпадении кривых плавления при повторном нагревании белка (Рис. 3), а также в уменьшении интенсивности триптофановой флуоресценции и сигнала КД в ближней и дальней УФ областях белка, что свидетельствует об агрегации белка в этих условиях. Эти процессы имеют место и в том случае, если тепловая денатурация осуществляется и в присутствии Ос1пНС1. Степень агрегации определяется концентрацией белка, температурой нагрева и продолжительностью инкубации белка при высокой температуре.

Влияние аминокислотных замен в положение 16 и 183 на стабильность СвВР и комплексообразование этого белка с глюкозой

Активный центр ООВР образуют ароматические аминокислотные остатки Тгр 183 и РЬе 16, формирующие "карман" из индольного и фенольного колец [19]. Стекинг-взаимодействия между этими остатками и молекулой сахара вносят основной вклад в связывание белка с лигандом. Стерическое соответствие между структурами активного центра и лиганда определяет высокую специфичность и аффинность лиганд-связывающих

белков к своим субстратам и, в частности, высокую специфичность и аффинность связывания СвВР с глюкозой.

Были исследованы мутантные формы с точечными заменами этих аминокислотных остатков: СОВРЛУ183А и ООПР/Р16Л. Показано, что в этих мутантах сохранялась способность связывать глюкозу, хотя константа диссоциации комплекса белок/глюкоза значительно увеличилась по сравнению со значением, отвечающим белку дикого типа (Таблица).

Таблица. Комплексообразование мутантных форм GGBP и ТМВР с глюкозой

Мутантная форма К<! комплекса белок/глюкоза, мМ Изменение амплитуды регистрируемого сигнала, %

собственная УФ флуоресценция флуоресценция присоединенного красителя

GGBP/W183A 0.25 10 -

GGBP/F16A 1.5 15 -

GGBP/H152C 0.0085 10 300

GGBP/H152С/А213R 0.08 8 200

GGBP/H152C/L238S 0.6 10 200

GGBP/H152C/A213R/L238S 5.2 10 200

ТМВР/С182S/A14С 3.4 - 40

В то же время, численные значения констант диссоциации этих мутантных форм меньше минимальной концентрации глюкозы в крови здоровых людей (3 мМ) и тем более пациентов, больных диабетом (свыше 8 мМ).

Анализ спектров КД в дальней УФ области и характеристик собственной флуоресценции показал, что структура обеих мутантных форм несколько отличается от структуры белка дикого типа. При связывании глюкозы ОСВРЛЛЧвЗА и ООВРЛЧбА приобретают более компактную пространственную структуру, а их вторичная структура становится сходной со структурой белка дикого типа.

Устойчивость ССВРЛУ183А и СвВР/ЛбА к денатурирующему действию гуаниди м гидрохлорид а. Характер равновесных зависимостей интенсивных флуоресцентных характеристик: параметра А и анизотропии флуоресценции (Рис. 4) свидетельствует о разворачивании СОВРЛУША и ООВР/ПбА и комплексов этих белков с сахаром под действием гуанидингидрохлорида по принципу «все или ничего». Зависимости экстенсивных флуоресцентных характеристик (интенсивности флуоресценции при длинах волн регистрации 320 и 365 нм) и удельной молярной эллиптичности при 222 нм (Рис. 4) комплексов мутантных форм ООВР с глюкозой от концентрации Ос1пНС1 имеют максимум при небольших концентрациях

гуанидингидрохлорида (0-0.1 М). Это обстоятельство можно объяснить стабилизирующим действием ОёпНС1, которое наблюдались для других объектов [24]. Разворачивание мутантных форм ООВР/\¥183А и СвВРуЛбА в отсутствие и в присутствии лиганда под действием Сс1пНС1 является обратимым процессом, что подтверждается совпадением кривых различных флуоресцентных характеристик и эллиптичности при 222 нм при денатурации и ренатурации. Установлено, что середина перехода между нативным и развернутым состоянием открытой формы ССВР/\У183А (0.27 М вс1пНС1) и ОСВР/Р16А (0.17 М вс1пНС1) смещена в область меньших концентраций денатуранта по сравнению с ОвВР дикого типа (0.36 М вс1пНС1).

0.16 0.14 0.12 ~ 0.10 0.08 0.06

0.14 0.12 0.10 1 0.08 0.06

0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 (ОапНС11, М [СёпНС1|, М

Рис. 4. Конформационные изменения ООВРЛЧбА и СОВР-Р1бА/С1с (красные кружки и синие квадраты, соответственно; левые панели) и ООВРЛ\П83А и ССВРЛ\П83А/01с {красные кружки и синие квадраты, соответственно; правые панели) под действием вс1пНС1. Флуоресцентные характеристики СвВР^ (серая сплошная кривая) и ОСВР\у1Л31с (серая пунктирная кривая), {а и д) - изменения интенсивности флуоресценции при длине волны регистрации 320 нм. (б и е) - изменения параметра А. (в и ж) - изменения анизотропии, (г и з) - изменения эллиптичности при 222 нм. Открытые символы соответствуют процессу денатурации, закрытые символы соответствуют ренатурации.

Это свидетельствует о том, что аминокислотная замена в положении 16 оказывает большее дестабилизирующее действие на открытую форму ОвВР по сравнению с заменой в 183-м положении.

Показано, что связывание глюкозы с мутантными формами белка практически не влияет на ход денатурационных кривых и на разность свободной энергии Гиббса белков в развернутом и нативном состояниях.

Тепловая денатурация мутантных форм GGBP-W183A и GGBP-FÍ6A, а также комплексов этих белков с глюкозой. Тепловая денатурация мутантных форм GGBP/W183A и GGBP/F16A, так же как и комплексов этих белков с глюкозой, является обратимым процессом, что подтверждается совпадением различных флуоресцентных параметров этих белков в нативном состоянии и при охлаждении до комнатной температуры после нагревания.

Введение точечных аминокислотных замен в активный центр GGBP-wt приводит к значительному снижению температуры, при которой наблюдается максимум кривой теплопоглощения: для GGBP/W183A Тт составляет 42.3 °С, для GGBP/F16A - 38.9 °С. Комплексообразование с глюкозой приводит к смещению максимума пика теплопоглощения Тт мутантной формы GGBP/F16A на 6.6 "С. Кооперативность денатурационного перехода при этом значительных изменений не претерпевает. В то же время взаимодействие с глюкозой мутантной формы GGBP/W183A выражается в увеличении Тт на 9.7 °С и резком увеличении кооперативности денатурационного перехода, что свидетельствует о более высокой стабильности мутантной формы GGBP/W183A по сравнению с GGBP/F16A, а также о том, что GGBP/W183A при связывании с глюкозой в значительной степени восстанавливает свою структуру.

Структура и стабильность ТМВР

Так же как и GGBP, ТМВР из термофильной бактерии Thermococcus litoralis относится к одному из подклассов ABC транспортеров - периплазматическим лиганд-связывающим белкам. Третичная структура ТМВР состоит из двух доменов, связанных подвижным участком, сформированным двумя антипараллельными (З-слоями и одной а-спиралью. В щели между доменами расположен активный центр ТМВР. Природными лигандами этого белка являются трегалоза и мальтоза, однако ТМВР способен также связывать глюкозу со значительной большей константой диссоциации комплекса белок/глюкоза (3-8 мМ), чем GGBP.

Для оценки стабильности ТМВР и его комплекса с глюкозой (TMBP/Glc) было выполнено исследование конформационных изменений белка и комплекса TMBP/Glc под действием GdnHCl (Рис. 5). Были измерены зависимости различных флуоресцентных характеристик, таких как интенсивности флуоресценции при разных длинах волн регистрации и степени поляризации флуоресценции, а также эллиптичности при 222 нм,

от концентрации Ос)пНС1. Сигмоидальный характер зависимости интенсивности флуоресценции и эллиптичности свидетельствует о том, что разворачивание ТМВР и ТМВР/в1с осуществляется по принципу «всё или ничего». Линейный характер параметрической зависимости ТМВР и ТМВР/Ис, построенной на основании зависимостей интенсивности флуоресценции белка при длинах волн регистрации 320 и 365 нм, от концентрации Ос1пНС1, подтверждает вывод об одностадийности разворачивания ТМВР и его комплекса с О-глюкозой. Однако наличие максимума на кривых зависимости степени поляризации белка и его комплекса с глюкозой от концентрации Ос1пНС1 позволяет предположить существование промежуточного состояния, в котором степень поляризации выше, чем в нативном и развернутом состояниях. Степень поляризации флуоресценции нативного белка имеет очень низкое значение (Р = 0.08). Одной из возможных причин этого может быть безызлучательный перенос энергии возбуждения практически между всеми 12 триптофановыми остатками белка. Можно предположить, что при увеличении концентрации ОёпНС1 возникают локальные изменения структуры белка, приводящие к уменьшению эффективности переноса энергии, что приводит к увеличению степени поляризации белка в области предденатурационных концентраций Ос1пНС1. На основании зависимостей 132о и 1365 от концентрации Ос1пНС1 была рассчитана разница между величиной свободной энергией нативного и развернутого состояний ТМВР и ТМВР/01с (Рис. 5), которая оказалась в несколько раз выше соответствующих значений, рассчитанных для белков из мезофильных организмов (Рис. 5).

Рис. 5. Денатурация ТМВР (красные символы) и ТМВР/ас (серые символы) под действием Ос1пНС1. Зависимости интенсивности флуоресценции /320 (открытые символы), эллиптичности $222 (закрытые символы) и степени поляризации флуоресценции Р от концентрации 0<1пНС1, зарегистрированные через 24 ч инкубации белка в растворах С}с!пНС1

1.25

2 3 4 5 6 [Ос1пНС1], М

Сделан вывод о том, что уникальная стабильность ТМВР может сделать этот белок и его мутантные рекомбинантные формы хорошими кандидатами на роль чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу.

Возможность использования сахар-связывающих белков GGBP и ТМВР в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу

Перспективным направлением развития непрерывных методов мониторинга глюкозы является разработка биосенсорной системы, чувствительный элемент которой представлял бы собой белок, реакция которого с глюкозой носила бы обратимый характер. Именно такими белками являются GGBP и ТМВР. Для того, чтобы динамический диапазон чувствительности биосенсорной системы отвечал диапазону концентраций глюкозы в крови здоровых людей (3-6 мМ) и пациентов, больных диабетом (свыше 8 мМ), константа диссоциации комплекса белок/глюкоза должна быть численно близка к этим значениям. Kj комплекса GGBP/Glc составляет 1 мкМ (Vyas et al., 1988), что на три порядка ниже содержания глюкозы в крови человека. Для разработки чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу на основе GGBP необходимо создать мутантные формы этого белка с более низким сродством к глюкозе по сравнению с белком дикого типа.

С этой целью нами были созданы и исследованы мутантные формы GGBP/W183A и GGBP/F16A (см. раздел «Влияние аминокислотных замен в положении 16 и 183 на стабильность GGBP и комплексообразование этого белка с глюкозой»). Численные значения констант диссоциации комплексов этих белков с глюкозой (0.25 мМ и 1.5 мМ (таблица), соответственно), определенные с помощью собственной УФ флуоресценции, несколько меньше концентрации глюкозы в крови здоровых людей. Кроме того, изменение полезного сигнала при комплексообразовании GGBP/W183A и GGBP/F16A с глюкозой не превышает 15 %. Это означает, что использование этих белков в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу малоперспективно. Вряд ли перспективным можно считать использование собственной УФ флуоресценции в качестве полезного сигнала биосенсорной системы. Флуоресцентный сигнал с большой амплитудой изменения в ответ на связывание глюкозы может быть получен путем регистрации флуоресценции связанного с белком красителя или FRET-сигнала химерной конструкции на основе GGBP.

В связи с этим нами была создана серия мутантных форм GGBP с различным сродством к глюкозе, меченных тиол-реактивным флуоресцентным красителем BADAN:

GGBP/H152C/W183A, GGBP/H152C/F16A, GGBP/H152C/W183F, GGBP/W183A/T185C, GGBP/T185C, GGBP/H 152C, GGBP/H 152C/A213R, GGBP/H152C/L238S, GGBP/H 152C/A213R/L238S, GGBP/E149C/D154L/A213R/L238S, а также синтезированы FRET-конструкции sftJFP-GGBP/W183A/T185C и sfGFP-GGBP/T185C с присоединенным по 185-му положению красителем АТТО-590.

Показано, что оптимальным сайтом посадки флуоресцентного красителя (BADAN является тиол-реактивным красителем и присоединяется к цистеиновому амионкислотному остатку) является 152-е положение - амплитуда изменения интенсивности флуоресценции BADAN, присоединенного к GGBP/H152C, составляет 300 % при связывании этим белком глюкозы. BADAN незначительно снижает сродство белка к глюкозе - К,/ комплекса GGBP/H152C/Glc, определенная с помощью собственной УФ-флуоресценции для несвязанного с красителем белка, составляет 5.6 мкМ, Kj комплекса GGBP/H152C-BADAN/Glc, определенная по изменению интенсивности флуоресценции BADAN, равна 8.5 мкМ (Таблица). Этот эффект можно объяснить стерическим нарушением BADAN конфигурационного соответствия между активным центром белка и молекулой глюкозы.

Аминокислотные замены - мишени точечного сайт-специфического мутагенеза, введенные в GGBP с целью оптимизации константы его связывания с глюкозой, были выбраны исходя из анализа пространственной структуры GGBP в закрытой форме. Установлено, что точечные замены аминокислотных остатков, расположенных вблизи остатков, непосредственно участвующих в связывании сахара, могут изменить сродство GGBP к глюкозе. Из всего числа созданных мутантных рекомбинантных форм GGBP наиболее перспективной для использования в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу следует считать GGBP/H152C/A213R/L238S. При связывании глюкозы интенсивность флуоресценции присоединенного к этому белку BADAN возрастает в 2 раза, константа диссоциации комплекса GGBP/H 152С/А213R/L238S-BADAN/Glc составляет 5.2 мМ.

Известно, что константа диссоциации комплекса TMBP/Glc лежит в пределах изменения содержания сахара в крови здоровых людей [25]. Поэтому в качестве основы для разработки чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу можно использовать дикий тип ТМВР. Так же, как и в случае с GGBP, собственная УФ-флуоресценция ТМВР мало изменяется при взаимодействии этого белка с глюкозой. ТМВР содержит один собственный цистеиновый остаток, расположенный в активном центре белка. Нами не обнаружено изменения флуоресценции BADAN, присоединенного к дикому типу ТМВР при комплексообразовании этого белка с глюкозой. Это

обусловлено тем, что цистеиновый остаток 182 расположен глубоко внутри лиганд-связывающего центра ТМВР и микроокружение этого остатка практически не изменяется при взаимодействии белка с глюкозой. Из анализа пространственной структуры ТМВР в комплексе с трегалозой, а также на основании знаний, полученных при работе с GGBP, следует, что наиболее перспективной областью для присоединения красителя являются периферийные участки активного центра ТМВР. В связи с этим были созданы мутантные формы TMBP/C182S/A14C и TMBP/C182S/A43C (замена C182S введена для обеспечения специфичности пришивки красителя). Показано, что мутантная форма TMBP/C182S/A14C с присоединенным флуоресцентным красителем BADAN перспективна для использования в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу: константа диссоциации комплекса TMBP/C182S/A14C-BADAN/Glc составляет 3.4 мМ, амплитуда изменения полезного сигнала - 40 %. Следует отметить, что использование мутантных форм ТМВР в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу представляется более перспективным, чем использование мутантных форм GGBP, так как ТМВР обладает исключительно высокой устойчивостью к денатурирующим воздействиям (см. раздел «Структура и стабильность ТМВР»).

ВЫВОДЫ

1. Апоформа GGBP приобретает стабильную структуру только после присоединения иона Са, что позволяет отнести GGBP к белкам с частично неупорядоченной структурой.

2. Лиганды играют существенную роль в стабилизации белка: ион Са - в стабилизации апоформы, D-глюкоза - в стабилизации холоформы.

3. Процесс разворачивания как GGBP, так и его комплекса с D-глюкозой под действием GdnHCl является одностадийным и обратимым. Тепловая денатурация GGBP и его комплекса с D-глюкозой осложнена агрегацией. Степень агрегации определяется концентрацией белка, температурой нагрева и продолжительностью инкубации белка при высокой температуре.

4. ТМВР обладает исключительно высокой устойчивостью к денатурирующим воздействиям, значительно большей по сравнению с GGBP.

5. Способность связывать глюкозу и высокая стабильность ТМВР делают мутантные рекомбинантные формы этого белка предпочтительными кандидатами на роль чувствительного элемента биосенсора на глюкозу по сравнению с мутантными рекомбинантными формами GGBP.

6. Наиболее перспективными из числа исследованных мутантных форм ТМВР и СОВР для использования в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу следует считать мутантные формы ТМВР/С1825/Л14С (К,/ = 3.4 ± 0.1 мМ, амплитуда изменения полезного сигнала 40 %) и ООВР/Н152С/Л213Г(/Ь2385 (К,/ = 5.2 ± 0.3 мМ, амплитуда изменения полезного сигнала 200 %)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1) Stepanenko Olga V., Povarova О.I., Stepanenko O.V., Fonin A.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Staiano M., D'Auria S. (2010). Structure and stability of D-galactose/D-glucose-binding protein. The role of D-glucose binding and Ca ion depletion. Spectroscopy 24(3-4): 355-359.

2) Stepanenko Olga V., Povarova O.I., Stepanenko O.V., Fonin A.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Staiano M., Varriale A., D'Auria S. (2011). New insight into protein-ligand interactions. The case of the D-galactose/D-glucose-binding protein from E. coli. J. Phys. Chem. В 115(12): 2765-2773.

3) Stepanenko Olga V., Fonin A.V., Stepanenko Olesya V., Morozova K.S., Verkhusha V.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K., Staiano M., D'Auria S. (2011). New insight in protein-ligand interactions. 2. Stability and properties of two mutant forms of the D-galactose/D-glucose-binding protein from E. coli. J. Phys. Chem. В 115(29): 9022-9032.

4) Степаненко Ольга В., Поварова О.И., Фомин A.B., Степаненко Олеся В. (2010). Стабильность сахар-связывающих белков: О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка из Escherichia coli и трегалоза/мальтоза-связывающего белка из Thermococcus litoralis. Цитология 52 (11): 950-954.

5) Фонин A.B., Степаненко Ольга В., Верхуша В.В., Щербакова Д.М., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. (2011). Перспективы создания чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу. Вестник СпбГУ 4(4): 180-185.

6) Степаненко Ольга В., Степаненко Олеся В., Фонин A.B., Щербакова Д.М., Верхуша В.В., Кузнецова И.М., Туроверов К.К. (2011). 0-галактоза/Т>-глкжоза-связывающий белок - как чувствительный элемент социально значимой биосенсорной системы. Взаимодействие белка с глюкозой. Вестник СпбГУ 4(4): 171-179.

7) Stepanenko Olga V., Stepanenko Olesya V., Fonin A.V., Verkhusha V.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. (2012). Protein - ligand interactions of the D-galactose/D-glucose-binding protein as a potential sensing probe of glucose biosensors. Spectroscopy - Biomedical Applications 27(5-6): 373-379.

8) Stepanenko Olga, Fonin A., Stepanenko Olesya, Kuznetsova 1., Turoverov K. (2012). Ligand-binding proteins: structure, stability and practical application. In: Protein structure. InTech Chapter 12: 265 - 277.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Turoverov K.K. et al., 2010. Prog Biophys Mol Biol. 102(2-3):73-84. 2. Dunker A.K. et al., 2005. Febs J. 272: 5129-5148. 3. Uversky V.N. et al„ 2008. Annu Rev Biophys 37: 215-246. 4. Yesylevskyy S.O. et al., 2006. Biophys J. 91(8):3002-3013. 5. Birnboim H.C. et al., 1979. Nucleic Acids Res 7: 1513-1523. 6. Laemmli U.K. 1970. Nature. 227: 680-685. 7. Khan F. et al., 2010. Anal. Biochem. 399: 39^13. 8. Berman H.M. et al., 2000. Nucleic Acids Res 28: 235-242. 9. Turoverov K.K. et al., 1985. Biophys. Chem. 23: 79-89. 10. Туроверов К.К. и др., 1998. Цитология 40 (8/9): 806-817. 11. Kuznetsova I.M. et al., 2012. PLoS One 7: e40845. 12. Nölting B. 1999. Protein folding kinetics. Berlin. Springer. 222 p. 13. Marquardt D.W. 1963. J.

Soc. Indust. Apl. Math. 11: 431-441. 14. Zuker M. et al., 1985. Rev. Sci. Instrum. 56: 14-22. 15. Levitsky D.I. et al., 2000. Eur J Bioehem 267: 1869-1877. 16. Kremneva E. et al., 2004. Biophys J 87: 3922-3933. 17. Levitsky D.I. et al., 2004. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht Boston London. 18. Privalov P. L. and Potekhin S.A. 1986. Methods Enzymol 131: 4-51. 19. Vyas N.K. et al., 1988. Science 242: 1290-1295. 20. D'Auria S. et al., 2004. Biotechnol Prog 20: 330-337. 21. D'Auria S. et al., 2006. J Bioehem 139: 213-221. 22. Piszczek G. et al., 2004. Bioehem J

381: 97-103. 23. Permyakov S.E. et al., 2008. Proteins 72:822-836. 24. Povarova O.I. et al., 2010. PloS One 5: el5035. 25. Herman P. et al., 2007. BBA 1774: 540-544.

Подписано в печать 23.05.2013. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 10683Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фонин, Александр Владимирович, Санкт-Петербург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201360165 ФОНИН АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

Диссертация на соискание ученой степени Кандидата биологических наук 03.01.03 - Молекулярная биология

Научные руководители:

доктор биологических наук Ирина Михайловна Кузнецова

доктор физ.-мат. наук Константин Константинович Туроверов

Санкт-Петербург 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................3

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................4

Актуальность исследования..................................................................................................4

Цели и задачи исследования.................................................................................................5

Основные положения, выносимые на защиту:.................................................................5

Научная новизна работы.......................................................................................................6

Теоретическое и практическое значение работы..............................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................9

1.1. Нативные частично неупорядоченные белки.............................................................9

1.2. Лиганд-связывающие белки из периплазмы грам-отрицательных бактерий ..11

1.2.1. О-глюкоза/О-галактоза-связывающий белок.......................................................14

1.2.2. Трегалоза/мальтоза - связывающий белок..........................................................17

1.3. Методы мониторинга глюкозы...................................................................................19

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................................31

2.1. Материалы.......................................................................................................................31

2.2. Методы.............................................................................................................................32

2.2.1. Анализ пространственной структуры белков...................................................32

2.2.2. Флуоресцентные измерения...................................................................................33

2.2.3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции................................34

2.2.4. Измерение спектров кругового дихроизма...........................................................35

2.2.5. Тушение флуоресценции акриламидом................................................................36

2.2.6. Определение параметров связывания лиганд-рецептор с помощью интенсивных флуоресцентных характеристик..........................................................36

2.2.7. Расчет термодинамических параметров...........................................................38

2.2.8 Дифференциальная сканирующая калориметрия...............................................39

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................41

3.1. Роль лигандов в стабилизации структуры GGBP...................................................41

3.1.1. Сворачивание-разворачивание ano и холоформы GGBP под действием GdnHCl.................................................................................................................................47

3.1.2. Тепловая денатурация GGBP и GGBP/Glc...........................................................59

3.2. Влияние аминокислотных замен в положение 16 и 183 на стабильность GGBP и комплексообразование этого белка с глюкозой...........................................................62

3.2.1. Устойчивость GGBP/W183A и GGBP/F16A к денатурирующему действию гуан идингидрохлор ида.......................................................................................................68

3.2.2. Тепловая денатурация мутантных форм GGBP/W183A и GGBP/F16A, а также комплексов этих белков с глюкозой..................................................................74

3.3. Структура и стабильность ТМВР...............................................................................76

3.4. Возможность использования сахар-связывающих белков GGBP и ТМВР в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу..................80

ВЫВОДЫ....................................................................................................................................92

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................93

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

BAD AN - 6-бромацетил-2-диметиламинонафталин;

GGBP - D-глюкозаЮ-галактоза-связывающий белок из Escherichia coli;

GGBP-Ca - О-глюкоза/О-галактоза-связывающий белок из Escherichia coli с отщепленным ионом Ca;

Glc - глюкоза;

GGBP/Glc - комплекс GGBP с глюкозой;

GGBP/Glc-Ca - безкальциевая форма комплекса О-глюкоза/О-галактоза-связывающего белка с глюкозой;

GGBP/X_Y - мутантная форма О-глюкозаЛЭ-галактоза-связывающего

белка с заменой аминокислотного остатка X на Y;

GGBP/X Y-BADAN - мутантная форма Б-глюкоза/О-галактоза-связывающего белка с заменой аминокислотного остатка X на Y с присоединенным флуоресцентным красителем BAD AN;

FRET - безызлучательный перенос энергии по ферстеровскому механизму;

GdnHCl - гуанидингидрохлорид;

ТМВР - трегалоза/мальтоза-связывающий белок из Thermococcus litoralis.

АНС -8-анилино-1-нафталин сульфат

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

В настоящей работе объектами исследования были сахар-связывающие белки: О-глюкоза/Б-галактоза-связывающий белок из E.coli (GGBP) и трегалоза/мальтоза-связывающий белок из термофильной бактерии Thermococcus litoralis (ТМВР). Связывание этих белков с лигандами (сахарами) приводит к значительным изменениям их третичной структуры, что делает возможным использование этих белков при конструировании социально значимых биосенсоров для определения содержания глюкозы в биологических жидкостях. Последнее имеет важное практическое значение для медицины в связи с острой необходимостью создания неинвазивного глюкометра непрерывного действия. Поскольку при использовании лиганд-связывающих белков в качестве чувствительного элемента биосенсоров важно использовать такие формы белков, которые отличаются высоким уровнем стабильности к агрессивному действию окружающей среды, немаловажным является изучение стабильности этих белков.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы является исследование структуры, фолдинга, стабильности и комплексообразования с глюкозой сахар-связывающих белков GGBP и ТМВР, а также ряда их мутантных форм с точки зрения их возможного использования в качестве чувствительного элемента глюкометра. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение устойчивости GGBP и ТМВР к действию различных денатурирующих факторов.

2. Исследовать роль лигандов в стабилизации этих белков и, в частности, роль иона Ca в фолдинге и стабилизации GGBP.

3. Изучить процессы разворачивания-сворачивания мутантных рекомбинантных форм GGBP и ТМВР, которые потенциально могут быть использованы в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Комплексообразование с ионом Са приводит к значительному увеличению устойчивости структуры апоформы ООВР к денатурирующим воздействиям, что позволяет отнести ООВР к белкам с частично неупорядоченной структурой.

2. Комплексообразование с глюкозой существенно повышает стабильность ООВР. Связывание иона Са комплексом ООВР с Э-глюкозой не оказывает сколько-нибудь заметного влияния на стабильность структуры холоформы ООВР.

3. Процесс разворачивания как ООВР, так и его комплекса с Э-глюкозой под действием Ос1пНС1 является одностадийным и обратимым. Тепловая денатурация ООВР и его комплекса с Б-глюкозой осложнена агрегацией. Степень агрегации определяется концентрацией белка, температурой нагрева и продолжительностью инкубации белка при высокой температуре.

6. Наиболее перспективными из числа исследованных мутантных форм ТМВР и ООВР для использования в качестве чувствительного элемента биосенсорной системы на глюкозу следует считать мутантные формы ТМВР/С1828/А14С (Ка = 3.4 ± 0.1 мМ, амплитуда изменения полезного сигнала 40 %) и ООВР/Н152С/А213Ы/Ь2388 = 5.2 ± 0.3 мМ, амплитуда изменения полезного сигнала 200 %)

Научная новизна работы

Теоретическое и практическое значение работы

Новые данные о сворачивании-разворачивании О-галактоза/Б-глюкоза-связывающего белка, а также о влиянии глюкозы и иона Са на этот процесс, существенны для понимания роли лигандов при фолдинге этого белка и в стабилизации его структуры к денатурирующему действию химических денатурантов и нагревания. Эти данные существенны также для понимания процессов фолдинга частично неупорядоченных белков. Полученные в работе данные об исключительной стабильности трегалоза/мальтоза-связывающего белка из термофильной бактерии Thermococcus litoralis подтверждают представление о взаимосвязи стабильности белков и средой обитания организмов.

социально значимых биосенсорных систем на глюкозу и ряд других аналитов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Нативные частично неупорядоченные белки

К началу XXI века сформировался новый взгляд на структуру белка в нативном состоянии - стали появляться работы, свидетельствующие о том, что многие белки не способны образовывать в водном растворе уникальную пространственную структуру, присущую глобулярным белкам, но при этом способны выполнять присущие им функции. Способность полипептидной цепи образовывать глобулярную структуру связана с величиной суммарного заряда и числом гидрофобных остатков. Чем меньше удельный вес аминокислот с гидрофобными боковыми радикалами и чем больше суммарный заряд полипептидной цепи, тем меньше вероятность образования этой полипептидной цепью компактной глобулярной структуры [5,6].

Показано, что аминокислотные последовательности частично или полностью неупорядоченных белков существенно отличаются от последовательностей глобулярных белков по целому ряду признаков [5]. Например, последовательности частично или полностью неупорядоченных белков, как правило, содержат меньшее количество таких остатков как триптофан, фенилаланин, тирозин, цистеин, валин, лейцин, гистидин. В тоже время, количество полярных и заряженных остатков (включая лизин, аргинин, глутамин, аспарагин, глутаминовую и аспарагиновую кислоты, серин и треонин) а также количество пролинов в таких белках заметно превосходит соответствующие значения для глобулярных белков [7,8]. Анализ первичной структуры большого числа белков показал, что аминокислотные последовательности, неспособные свернуться в глобулярную структуру, распространены в природе очень широко [7,9-11]. Длина аминокислотной последовательности, не способной образовать упорядоченную структуру, может быть разной [12]. Белок может быть полностью неструктурированным или содержать отдельные элементы вторичной структуры. В некоторых белках полностью неструктурированным

может быть один из доменов. Таким образом, спектр структурных свойств нативных частично или полностью неупорядоченных белков чрезвычайно широк. В литературе описаны, как полностью неупорядоченные белки, так и белки, обладающие в нативном состоянии свойствами расплавленной глобулы или предшественника расплавленной глобулы [13-16]. Существование небольших отрезков полипептидной цепи, не участвующих в образовании элементов вторичной структуры, давно известно. У некоторых белков, которые принято считать глобулярными, неструктурированными являются И- и С-концевые участки полипептидной цепи и ее петлевые участки, шарнирные участки, связывающие два домена. Таким образом, поскольку, степень неупорядоченности в белках может быть очень разной, граница между глобулярными и частично неупорядоченными нативными белками условна. Атомы аминокислотных остатков неструктурированных участков полипептидной цепи, как правило, обладают высоким уровнем подвижности. В случае глобулярных белков большей подвижностью обладают атомы аминокислотных остатков, входящих в состав активного центра ферментов или в петлевые участки, которые также участвуют во взаимодействии с партнерами и таким образом несут функциональную нагрузку. Так, например, в полимеризации актина участвуют петлевые сегменты [17]. Из этого следует, что для функционирования глобулярных белков также необходим определенный уровень подвижности. Большинство глобулярных белков - это ферменты, каждый из которых выполняет строго специализированную функцию. Поэтому понятно, что у ферментов высокой подвижностью должен обладать только активный центр, а вся молекула должна быть жесткой.

Неупорядоченные полипептидные цепи, неспособные образовать компактную глобулярную структуру за счет самоорганизации, могут образовать компактную структуру при взаимодействии с партнерами, если свободная энергия возникающего при этом комплекса меньше свободной энергии белка и его партнера до взаимодействия. Потенциальная способность

частично или полностью неупорядоченных белков к взаимодействию с различными партнерами является основой выполнения такими белками их функции, которая состоит в специфическом узнавании партнеров: лигандов, других белков, нуклеиновых кислот и т.д., образовании с ними комплексов и участии, за счет этого, в передаче сигналов, контроле и регуляции различных внутриклеточных процессов [1].

1.2. Лиганд-связывающие белки из периплазмы грам-отрицательных бактерий

Двухдоменные лиганд-связывающие белки периплазмы грам-отрицательных бактерий (РВР) могут быть удобной моделью для изучения роли лигандов в процессах фолдинга и стабилизации структуры белков в нативном состоянии. Эти белки представляют собой обширный класс промежуточных рецепторов ABC транспортных систем и участвуют в проведении активного транспорта растворимых молекул через клеточные мембраны за счет гидролиза АТФ. Комплексы РВР со своими лигандами: различными сахараМи, аминокислотами, иона�

Информация о работе

Фонин, Александр Владимирович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Структура, стабильность и комплексообразование сахар-связывающих белков с лигандами. Возможность их использования в качестве чувствительного элемента биосенсорных систем на глюкозу - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы