Мониторинг образования и распада комплексов водорастворимого и мембранных цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в реальном времени

Иванов, Юрий Дмитриевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Мониторинг образования и распада комплексов водорастворимого и мембранных цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в реальном времени
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Мониторинг образования и распада комплексов водорастворимого и мембранных цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в реальном времени"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ ПАУК _ПИН БИОМЕДПЦППСКОЙ ХИМИИ_

УДК 612.015.1:577.152.162.08 На правах рукописи

ИВАНОВ ЮРИЙ ДМИТРИЕВИЧ

МОНИТОРИНГ ОБРАЗОВАНИЯ И РАСПАДА КОМПЛЕКСОВ ВОДОРАСТВОРИМОГО И МЕМБРАННЫХ ЦИТОХРОМОВ Р450 С ИХ РЕДОКС-ПАРТНЕРАМИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ.

03.00.04 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ ПА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва, 2000

Работа выполнена в лаборатории микросомального окисления НИИ Биомедицинской химии РАМН

Научный консультант

академик РАМН, профессор Арчаков А.И.

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, профессор Егоров A.M.

Доктор биологических наук Медведев А.Е.

Академик РАМН, профессор Владимиров Ю. А.

Ведущая организация - Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Кардиологии Российского Кардиологического Научно-производственного комплекса МЗ РФ

Защита диссертации состоится « 29 » июня 2000 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.001.10.01 в НИИ Биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, Погодинская ул., д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ Биомедицинской химии РАМН по адресу: Москва, Погодинская ул., д. 10.

Автореферат разослан «_(V/2» .¿LCiJ<

2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.001.10.01 кандидат биологических наук

B.C. Былинкина

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность Актуальность изучения взаимодействия редокс-тартнеров цигохром Р450- содержащих монооксигеназных систем збусловлена вьшолпением этими системами важных функций в организме. Цитохром Р450 -содержащие монооксигеназные системы ответственны за метаболизм широкого класса эндогенных (холестерин, стероидные •ормоны, простагладины) и экзогенных (лекарственные препараты, санцерогены, мутагены) веществ [Archakov and Bachmanova, (1990)]. Тревращая исходный гидрофобный субстрат в более полярный продукт, щгохромы Р450 выполняют функцию по удалению неполярных молекул из ¡рганизма и препятствуют накоплению токсичных гидрофобных »единений. Одной го важных стадий процесса стероидогенеза является февращение холестерина в прегненолон, осуществляемое цитохромом '450scc - холесгерингидроксилирующей системой.

По своей молекулярной организации цитохром Р450 (Р450)-»держащие монооксигеназные системы могут быть условно разделены на ри основных типа. Первый - наиболее эволюционно ранний тип -¡акгериальный. Он представляет собой систему, состоящую из трех юдорасгворимых белков редокс-партнеров. В случае Pseudomonas putida то NADH-специфичный флавопротеин - путидаредоксин редуктаза (PdR), [утидаредоксин (Pd) и цитохром Р450 101 (Р450сам) [Gunzalus, (1969), junzalus et al., (1971)]. Ко второму - промежуточному типу - относится штохондриальная гидроксилазная система коры надпочечников. Она >бъединяет в себе признаки растворимой и мембранной системы. Два ее лектрон-транспортных белка - адренодоксин редуктаза (AdR) и дренодоксин (Ad) являются водорастворимыми и находятся в штохондриальном матриксе (межмембранном пространстве), а третий елок - цитохром Р450 11Al (P450scc) - встроен в мембрану [ Sato and )müra, (1978)]. Третий тип представляет микросомальная монооксигеназная истема, состоящая из мембранных электрон-транспортных белков: IADPH- зависимой редуктазы (Fp) , цитохрома Р450 2В4 (2В4), а также ;итохрома Ь5 (Ь5) [Archakov and Bachmanova, (1990)]. Все три типа Р450-одержащих монооксигеназных систем объединяет одно важное свойство -ни представляют собой электрон-транспортные цепи из белков редокс-

партнеров. Функционирование монооксигеназных систем определяется взаимодействием этих белков между собой, во время которого происходит межбелковый перенос электронов от редукгазы к цитохрому Р450 либо через железо-серный белок Pd • или Ad , в случае Р450саш или P450scc-содержащих монооксигеназных систем, либо напрямую, как в случае Р450 2В4-содержащей системы, в активных центрах которых при этом происходит процесс окисления субстратов. Поэтому изучение взаимодействия белков редокс-партнеров в Р450-содержащих монооксигеназных системах и выяснение природы этих взаимодействий является актуальной проблемой. Взаимодействия редокс-партнеров могут приводить к образованию комплексов. Литературные данные о роли гидрофобных и электростатических взаимодействий в образовании этих комплексов в Р450-содержащих монооксигеназных системах

противоречивы [Sligar et al., (1974)], [Yasukochi et a]., (1994)], [Aoki et al., (1998)], [Voznesensky and Schenkman, (1992)], [Tamburini and Schenkman, (1987)] [Unno et al., (1996)], [Geren et al., (1986)], [Lambeth and Kricngsiri, (1985)], [Bernhardt et ai., (1988)], [Tamburini and Schenkman,(1986)], [Davydov et al., (1996)], [Bachmanova et al., (1994)]. Эти противоречия могут быть объяснены особенностями методов, используемых в этих работах. Так, например, исследования процесса комплексообразования, проводимые по спектрам поглощения белков, в частности, измерением сдвига спинового равновесия железа цитохрома Р450, являются косвенными методами и, в ряде случаев, не позволяют зарегистрировать образование комплексов, в которых не происходит сдвиг спинового равновесия железа [Радюк и др., (1983)]. Методы, включающие химическую модификацию белка, либо использующие точечный мутагенез, могут изменять структуру белка, что приводит к изменению характеристик комплексообразования. Важными параметрами образующихся комплексов являются их электрон-транспортные характеристики. При функционировании Р450-содержащго монооксигеназных систем могут образовываться комплексы, в теченш времени жизни которых наблюдается межбелковый перенос электрон; (электрон-переносящие комплексы), так и комплексы, в которых он н реализуется вообще (непродуктивные комплексы). Для понимани функционирования Р450-содержащей монооксигеназной систем]

¡обходимо выяснить механизм образования таких комплексов. Для ого требуется измерять кинетические параметры комплексообразования, в ютности, характеристическое время жизни комплексов, в течение гторого может переноситься определенное количество электронов, юбходимое для реализации полного цикла гидроксилирования, а также гаснить роль различных сил межмолекулярных взаимодействий, особствующих формированию таких комплексов. Это позволит щелить из всех образующихся комплексов такие комплексы, которые >гут формировать электрон-транспортную цепь в Р450-содержащей стеме. Так, например, имеются противоречивые данные о том, >рмируется ли тройной комплекс AdR/Ad/P450scc в P450scc- содержащей шооксигеназной системе, и если формируется, может ли он участвовать в акции гидроксилирования холестерина [Usanov et al., (1985), Radyuk et , (1982)], или же перенос электрона от AdR к P450scc происходит по лночному механизму, через последовательное образование бинарных IR/Ad и Ad/P450scc комплексов [Lambeth et. al, (1984), Vickery, (1997)]. н ответа на эти вопросы, необходимо зарегистрировать все ¡рмирующиеся комплексы и провести сравнительный анализ их времени вни со временем полного цикла гидроксилирования. Ранее такой анализ проводился из-за отсутствия методов, позволяющих измерять нетические параметры комплексообразования в реальном времени. В 90-х пах был разработан и сконструирован оптический биосенсор езонансное зеркало» для регистрации процесса образования комплексов fikob и их распада в реальном времени без применения специальных ток. Физический принцип действия оптического биосенсора яовывается на измерении изменения показателя преломления среды при мплексообразовании в тонком пристеночном слое измерительной веты. Этот метод позволяет регистрировать все образующиеся мплексы и был использован для исследования комплексообразования чорастворимых белков [Davies et al., (1994)]. Для исследования 1имодействия мембранных белков он не использовался из-за сложности юты с ними. В представленной работе метод оптического биосенсора л применен для исследования взаимодействия редокс-партнеров не п>ко в водорастворимой, содержащей Р450сам-, но и в мембранной

системе, содержащей 2В4-, а также в Р450$сс-содержащей монооксигеназной системе, включающей как мембранные, так и водорастворимые белки.

Продуктивными считались такие комплексы, в которых время жизни равнялось или превышало время переноса одного электрона и они могли эффективно функционировать в цикле восстановления-окисления.

Цель работы - исследование в реальном времени формирования и распада комплексов цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в водорастворимой (цитохром Р450сам), мембранной (Р4502В4) и смешанной (цитохром . Р450$сс) системах, содержащей как водорастворимые, так и мембранные белки для определения роли гидрофобных и электростатических взаимодействий в образовании и распаде продуктивных комплексов.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. На базе оптического биосенсора создать биочипы с иммобилизованными редокс-партнерами из водорастворимой Р450сам, мембранной Р4502В4 и смешанной Р450бсс систем, включающей как водорастворимые, так и мембранные белки для регистрации формирования их комплексов .

2. Расчет констант скоростей образования комплексов редокс-партнеров и их распада.

3. Проведение сравнительного анализа кинетических параметров I комплексообразования редокс-партнеров в Р450сам, Р450зсс и Р4502В4-системах с их электрон-транспортными характеристиками для выявления электрон-переносящих продуктивных комплексов.

4. Определение роли электростатических и гидрофобных взаимодействий в формировании и распаде электрон-переносящих продуктивных комплексов редокс-партнеров.

. Проведение сравнительного анализа параметров взаимодействия редокс-партнеров в этих трех системах для выявления общих закономерностей и различий в механизме их функционирования.

Гаучняя новизна

В работе впервые проведено измерение образования в реальном ¡ремени электрон-переносящих комплексов редокс-партнеров в Р450-одержащих монооксигеназных системах с помощью оптического шосенсора. Причем, метод оптического биосенсора был использован не олько для исследования водорастворимых, но также и мембранных Р450-дадержащих монооксигеназных систем, что особенно важно.

Было показано, что в водорастворимой Р450сат -содержащей «шооксигеназной системе все образующиеся бинарные РсЗ/Р450сат и 'с1/Рс1Я комплексы характеризуются продолжительным временем жизни, соторое в более чем в тысячу раз превышает время межбелкового переноса шекгрона. Их образование определяется силами электростатического ¡заимодействия редокс-партнеров.

В этих же системах были обнаружены тройные комплексы ?<ЗК/Р11/Р450сат, время жизни которых достаточно для реализации 60 толных циклов гидроксилирования камфоры. Сравнительный анализ зремени жизни бинарных электрон-переносящих комплексов со временем, необходимым для реализации полного цикла гидроксилирования, показал, это хотя эти комплексы могут быть электрон-переносящими, большая продолжительность времени их жизни исключает их эффективное участие в гидроксилазной реакции, так как они не могут эффективно функционировать в цикле восстановления-окисления Р450сам. Напротив, в гройном комплексе РёЯ/Рс1/Р450сат с Рс1, функционирующим как мостик между Р(1Я и Р450сат, реакция гидроксилирования камфоры может эффективно реализовываться. На основании этого предложена новая схема электронного транспорта в тройном комплексе в Р450сам - содержащей монооксигеназной системе.

Продемонстрировано, что в Р450ясс - содержащей монооксигеназной системе, включающей два водорастворимых белка А<Ш. иАёиз трех

рсдокс-партнеров, все образующиеся бинарные Аё/Р450зсс и А<1/А<Ш. комплексы характеризуются продолжительным временем жизни, которое более чем в сто раз превышает время переноса электрона. Их образование определяется силами электростатического взаимодействия так же, как и в Р450сам -содержащей монооксигеназной системе.

Методом оптического биосенсора обнаружено формирование долгоживущих тройных комплексов АсШ/Ас1/Р4505сс, что подтверждает гипотезу о возможности реализации в них полного цикла гидроксилирования также, как в Р450сам - содержащей монооксигеназной системе.

Показано, что в мембранной Р450 2В4 -содержащей монооксигеназной системе образование Бр/2В4 и Ь5/2В4 бинарных комплексов характеризуется временем жизни, которое в несколько раз превышает характеристическое время межбелкового переноса электрона. В отличие от двух предыдущих случаев, не электростатические, а взаимодействие гидрофобных мембранных фрагментов 2В4, Рр и Ь5 является движущей силой образования продуктивных электрон-переносящих комплексов. Показано, что роль электростатических взаимодействий в этой системе заключается в стабилизации 2В4Лф бинарных комплексов за счет увеличения их времени жизни. В отсутствии гидрофобных мембранных фрагментов белков электростатические взаимодействия приводят, в основном, к образованию непродуктивных комплексов. Уникальной особенностью является то, что межбелковый перенос электрона между Бр и Ь5 реализуется при случайных столкновениях редокс-партнеров без образования комплексов. Тройные комплексы Рр/2В4/Ь5 также обнаружены в 2В4-содержащей монооксигеназной системе, время жизни которых достаточно для реализации полного цикла гидроксилирования. Это указывает на возможность реализации полного цикла гидроксилирования не только в бинарных Рр/2В4, но и в тройных комплексах. Образуются эти продуктивные тройные комплексы также за счет взаимодействия гидрофобных мембранных фрагментов редокс-партнеров. Предложена новая схема электронного транспорта в 2В4 -содержащей монооксигеназной системе.

Определено влияние комплексообразования 2В4 и Рр на структуру активных центров этих белков методом спектроскопии комбинационного рассеяния. Показано, что при комплексовании Ир с 2В4 затрагиваются водородные связи колец П и П1 изоаллоксазинового цикла флавопротеина, увеличивая прочность связывания циклических структур с белковой глобулой. В то же время ИЛИ не участвует непосредственно в комплексовании с поверхностью 2В4. При комплексообразования происходит повышение электронной плотности на разрыхляющей к* орбитали гема цитохрома Р4502В4 .

Показана возможность применения атомно-силовой микроскопии для визуализации как отдельных молекул, так и комплексов редокс-партнеров в Р4502В4 - содержащей монооксигеназной системе.

Научно-практическая ценность работы. Полученные в работе результаты необходимы для понимания механизмов функционирования Р450сам, Р450$сс и 2В4-содержащих монооксигеназных систем и открывают новые возможности для создания на их основе биосенсоров и биореакторов.

Отношение времени жизни комплексов ко времени межбелкового переноса электрона является важным параметром, характеризующим »ффекгивность работы Р450 - содержащих монооксигеназных систем. ?асчет этого параметра для Р450сам,- Р450зсс-и Р450 2В4-содержащих монооксигеназных систем позволил сделать вывод о возможности функционировании этих систем путем образования тройных комплексов, гго дает возможность целенаправленно создавать эффективно функционирующие Р450 -содержащие монооксигеназные системы на >снове формирования коньюгатов из трех белков-партнеров.

Продемонстрировано использование метода атомно-силовой шкроскопии для визуализации редокс-партнеров и их комплексов в 2В4 -одержащей монооксигеназной системе, что дает возможность изучать юлекулярную организацию Р450-содержащих монооксигеназных систем. Создание фосфолипидных биочипов открывает новые перспективы в сследовании белок-липидных взаимодействий и моделировании ¡ембранных Р450-содержащих монооксигеназных систем, а также в

создании биосенсоров и биореакторов на основе таких биочипов со

встроенными в них рсдокс-партнерамн.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В водорастворимой Р450саш и в смешанной Р450$сс -содержащих монооксигеназных системах все образовавшиеся бинарные комплексы РЛ/РсЖ и Ра/Р450сат, а также А^АаЯ и А£№450всс могут быть электрон-переносящими комплексами и их формирование определяется электростатическими взаимодействиями.

2. В этих системах могут также формироваться тройные комплексы Р(®/Рс1/Р450сат и АсЖ/Ас1/Р450зсс . Хотя бинарные комплексы могут быть электрон-переносящими, однако реализация цикличного механизма гидроксилирования субстратов с их участием маловероятна из-за того, что время жизни этих комплексов на несколько порядков превышает время полного цикла гидроксилирования, то есть они должны быть тупиковыми. Эффективно гидроксилирование может реализовываться в тройных РсШЛМ/Р450сат и А(Ж/А(1/Р4505сс комплексах соответствующих систем. В каждом таком тройном комплексе может быть реализовано 60 и 5 полных циклов гидроксилирования, соответственно.

3. В отличие от Р450сам и Р450зсс -содержащих монооксигеназных систем, в мембранной 2В4-содержащей системе взаимодействие гидрофобных мембранных фрагментов полноразмерных Р4502В4 (й-2В4), Рр (с!-Рр) и Ь5 (сй>5) является движущей силой образования продуктивных бинарных с1-Рр/(1-2В4 и ё-Ь5/ё-2В4 комплексов. В отличие от этих комплексов электронный транспорт между сЗ-Рр и ё-Ь5 реализуется при случайных столкновениях редокс- партнеров.

4. В монооксигеназной Р4502В4 -системе, содержащей й-Ир, (1-2В4 и ё-Ы гидрофобные взаимодействия играют решающую роль также и I формировали обнаруженных тройных комплексов. Центрол комплексообразования в этих комплексах является с1-2В4. Он може получать первый электрон от ё-Рр, а второй - от <!-Рр или от <3-Ь5 который в свою очередь восстанавливается ¿-Рр посредство! случайных столкновений.

пробаччп работы Основные положения диссертации были доложены на ой международной конференции по биохимии и биофизике цитохрома 150 (Москва, 1991), на 8-ой международной конференции по цитохрому 150: биохимия, биофизика и молекулярная биология (Лиссабон, 1993), на 1-ом международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» оронто, 1994), на YII международной конференция по химии »рфиринов и их аналогов (С.-Петербург, 1995), на 9-ой международной шферснции «Цитохром Р 450: биохимия, биофизика и молекулярная гология» (Цюрих, 1995), на 3 Российском национальном конгрессе [еловек и лекарства» (Москва, 1996), на 7 международном симпозиуме >отоиндуцированный перенос заряда: процессы в органических средах» очестер, 1996), на 1 конференции по высокоорганизованным единениям (Минск, 1996), на 11-ом международном симпозиуме 1икросомы и окисление лекарств» (Лос-Анджелес, 1996), на 10-ой якдународной конференции «Цитохром Р450: биохимия, биофизика и шекулярная биология» (Сан-Франциско, 1997), на 2-ом Биохимическом езде (Москва, 1997), на 4 международной научной рабочей встрече иосенсоры и биосенсорные приборы в медицине и науке об окружающей еде» (Ташкент, 1997), на 12-ом международном симпозиуме 1икросомы и окисление лекарств» ( Монпелье, 1998), на 11 ждународной конференции по цитохрому Р450 (Сендай, 1999) ^бликацни. По теме диссертации опубликовано 34 работы, из них 5 в ечественных и 29 в международных изданиях.

>ъем н структура работы. Диссертация изложена на 313 стр. и люстрирована 44 рисунками и 21 таблицей. Диссертация состоит из едения, обзора литературы (Глава 1), экспериментальной части (Главы 2-

содержащей описание материалов и методов, результатов исследований ix обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 8 работ.

П. МАТЕРИАЛЫ П МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

работе использовались путидаредоксин редуктаза, путидаредоксин, тохром Р450сам, которые были экспрессированы в культуре клеток cherihia coli; адренодоксин редуктаза, адренодоксин, цитохром P450scc из

митохондрий коры надпочечников быка; микросомальные NADPH-зависимая цитохром Р450 редуктаза, цитохром Р4502В4, цитохром Ь5 из микросом печени кролика, любезно предоставленные Dr. Hui Bon Hoa (Institut de Biologie Physico Chemique, Париж, Франция), проф. Усановым С.А. (Институт биоорганической химии, Минск) и к.б.н. Саменковой Н.Ф. и к.б.н. Кузнецовой Г.П. (Институт биомедицинской химии РАМН, Москва) Результаты были получены, используя следующие методы:

1. Метод оптического биосенсора. Он основан на регистрации показателя преломления среды, содержащей реагирующую пару партнеров в приповерхностном слое измерительной юоветы с очень высокой чувствительностью за счет оптимального подбора оптических структур, формирующих конструкцию «резонансное зеркало» из призмы и волновода [Cush et al. (1993)]. На чувствительной поверхности волновода, являющейся поверхностью дна кюветы, иммобилизуется один из партнеров взаимодействующей пары. Другой партнер добавляется в кювету при различных концентрациях. При формировании комплексов меняется показатель преломления в приповерхностном слое, что регистрируется по положению резонансного угла падения зондирующего лазерного излучения. Мониторинг изменения этого угла падения от времени позволяет регистрировать кинетическую кривую образования комплексов. Регистрируя эти кривые для различных концентраций взаимодействующих партнеров, рассчитывали константы скорости ассоциации и диссоциации комплексов [Yeung et al., (1995) ].

2. Метод атомно-силовой микроскопии. Метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) основан на измерении межмолскулярных взаимодействий между зондом атомно-силового микроскопа и объектом, расположенным на подложке. Перемещении зонда вдоль поверхности объекта позволяло определять пространственную структуру объекта с точностью до нанометра [Edstrom et al., (1990)].

3. Метод спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния . Метод основан на регистрации резонансного комбинационного рассеяния (РКР) лазерного излучения молекулами белка. Неупругое взаимодействие лазерного излучения с длиной волны 457.9 нм с гемом цитохрома Р450 и с FAD и FMN цитохром Р450 редуктазы сопровождается изменением

частоты рассеиваемого света, регистрация которого дает колебательные спектры этих простетических групп [Hildebrandt et., (1989); Sigiyama et al., [1985)]. Селективно регистрируя спектры РКР отдельных простегических групп в белках и их комплексах, была получена информация о никроокружении этих групп в цитохроме Р450 и флавопротеине при их сомплексообразовании.

Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Доказательство правомочности применения методов

оптического биосенсора и атомно-силовой микроскопии для исследования систем, содержащих мембраппые белки в растворе.

.1. Сравнительный анализ результатов, полученных методом оптического носепсора с литературными дачными.

}ыявление формирования комплексов редокс-партнеров в Р450-эдержащих монооксигеназных системах и роли гидрофобных и тектростатических взаимодействий, участвующих в образовании и распаде гих комплексов, проводилось с использованием метода оптического яосенсора. Ранее он применялся для исследования взаимодействия, в жовном, водорастворимых белков. В диссертационной работе метод тгического биосенсора позволил обнаружить продуктивные электрон-;реносящие комплексы белков не только в растворимой (Р450сам-) , но в мембранных P450scc- и Р4502В4 -содержащих монооксигеназных [стемах. Формирование комплексов редокс-партнеров в трех Р450-держащих монооксигеназных системах исследовалось в условиях, при торых возможна была их реконструкция и эффективное акционирование. Так, Р450сам- и Р450зсс-содержащие

шооксигеназные системы были исследованы в 50 мМ Трис-HCl буфере, Г 7.4, содержащем 200 мМ КС1 и 0.4 мМ камфоры и в 50 мМ калий -юфатном буфере, рН 7.4 (КР), соответственно [Primo et al., (1997), Радюк др., (1983)]. 2В4 -содержащую монооксигеназную систему удалось конструировать в 50-500 мМ КР буферах, содержащих 0.25 г/л эмульгена

913 (КР/Е) [ВасЬтапоуа е1 а1., (1994)] . Доля продуктивных электрон-переносящих комплексов рассчитывалась из отношения времени, необходимого для межбелкового переноса одного электрона, ко времени жизни этих комплексов. Для выяснения участия положительно заряженных аминогрупп, расположенных на поверхности белка, в электростатических взаимодействиях с отрицательно заряженными группами другого белка-партнера, каждый из партнеров

иммобилизовывался через свои аминогруппы на поверхности кюветы оптического биосенсора поочередно. Если параметры взаимодействия -константы скорости комплексообразования или распада комплексов -зависели от того, какие из партнеров иммобилизованы, то это означало, что аминогруппы белков участвуют в формировании электрон-переносящих комплексов. Если нет, то аминогруппы белков не принимают участия в образовании или распаде комплексов.

Так как метод оптического биосенсора впервые использовался для изучения Р450-содержащих монооксигеназных систем, то представляло интерес сравнить полученные нами данные с имеющимися в литературе. Для определения кинетических и термодинамических параметров комплексов, образующихся в этих системах, ранее использовались две группы методов. Первая -это спектральные измерения сдвига спинового равновесия железа гема цитохрома Р450 при комплексообразовании [ЗсЬспктап е1 а1., (1972)]]. Метод является не прямым, так как измеряемая система включает в себя по меньшей мере два равновесных состояния: А+ВоАВ (1) ШоЬз (2),

где А и В -взаимодействующие белки-партнеры, один из них цитохром Р450, Ш-высокоспиновое состояние железа гема, Ьв-низкоспиновое состояние железа гема. Вторая -это, как правило, измерение тушения флуоресценции меченых белков, один из которых цитохром Р450, а второй -его партнер (15ауу(1оу а а!., (1996)]. Недостатком является химическая модификация одного из белков меткой. Метод оптического биосенсора дает возможность измерять константы скорости ассоциации коп и диссоциации к0ц комплексов, а из отношения этих констант рассчитыват* величину константы равновесия реакции комплексообразования К«,. В

штературе имеются данные о величинах констант равновесия для пар МЛЧ50сат, А(1/Р4508сс, Л(И1/А(1, Рр/2В4 и Ь5/2В4, измеренные >азличными методами. Эти данные в сравнении с нашими результатами [риведены в таблице 1. Из таблицы видно, что наблюдается хорошее оответсгвие результатов, полученных с помощью оптического иосенсора, с литературными данными. Что касается сравнения инетических параметров комплексообразования, полученных с помощью птического биосенсора, с литературными, то можно отметить, что нформации о таких параметрах в литературе крайне мало.

Таблица 1

¡начения К«, для А^/Р450ясс, Р(1/Р450саш и Рр/2В4 пар, измеренные с

омощью оптического биосенсора

Пара Оптический биосенсор Литературные данные

^»юЧг1 К^ЮЧг1

1/Р450саш Ke,i 0.19±0.07, Ке,2 0.14+0.07 0.19 [Davies et al., (1992)] 0.3 [Sligar et al., (1974)] 0.06 [Kodaetal., (1993)1

d/P450scc 10.5±5.3 7.6 [Tuls et al., (1987)] 6.3 [Katagjri et al„ (1977)] 1.2 [Coghlan et al., (1991)]

d/AdR 0.9Ю.5 3.0 [Lambeth etal., (1979)] 5.0 [Chu and Kimura, (1973)]

>/2В4 Kc,i 20.0+9.5, К.,2 1.7+1.2 26 [Davydov et al., (1996)] 10 [Miwa and Lu, (1984)] 8.3 [Nadler and Strobel,(1988)1

/2В4 К«,, 8.1±3.4, Кс.,2 1.8Ю.4 50 [Tamburini and Schenkman, (1987)] 1.9 [Tamburini et al., (1985)] 0.2 [Bendzko et al., (1982)]

,,.2 для Pd'P450cam, Ad/P450sccu Ad/AciR, Fp/2B4 иЪ5/2В4 пар были

мерены в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 7.4, содержащем 200 мМКС1 и 0.4 4камфоры, в 50 мМКР буфере, рН 7.4, в 50 мМКР буфере, держаи/ем 0.25 г/л эмулъгена 913, соответственно.

[Lambeth at al., (1980)] была измерена константа скорости диссоциации мплекса Ad/AdR по изменению спектра поглощения AdR при гсоциации ее комплекса с Ad. Полученная константа к „¡г оказалась ¡пой 300 с1. Это значение существенно отличается от данных, яведенных в диссертационной работе (к„ц = 0.02±0.01 с"1). Различие жег быть связано с тем, что изменение спектра поглощения AdR может >ажать не процесс диссоциации комплексов, а переходные процессы,

предшествующие диссоциации, так как природа изменения спектра AdR до сих пор не ясна. Одновременно с нашими данными появились результаты измерения значения константы скорости ассоциации для пары d-Fp/d-2B4, которая была получена методом тушения флуоресценции и составляла (6±2)*105 M"1 [Davydov et al., (1996)], что хорошо согласуется со значением ¿„„=(3-5) *105 М"1 , измеренным в диссертационной работе. Таким образом, наблюдается хорошее совпадение термодинамического параметра К«,,, полученного методом оптического биосенсора с литературными данными. В отношении кинетических параметров такого заключения сделать нельзя в связи с отсутствием достаточного литературного материала.

1.2. Визуализация редокс-паитнеров и их комплексов в Р4502В4-содержащей монооксигеназной системе.

Было показано, что метод атомно-силовой микроскопии позволяет получить важную информацию о пространственной организации комплексов. Известно, что этот метод дает возможность корректно определять высоту объекта [Wagner, (1994)]. Поэтому, высота наблюдаемых изображений была положена в основу критерия отнесения объектов к мономерам или комплексам . Так как известно, что в 100 мМ КР буфере, рН 7.4, не содержащем эмульгена, 2В4 и Fp присутствуют в виде агрегатов, а е присутствии эмульгена 913 в виде мономеров [Kanaeva et al., (1992)], тс вначале, для выбора условий визуализации были проведены эксперименть по выяснению возможности отнесения объектов к агрегатам и мономерам i соответствующих буферных средах. Визуализация олигомеров и мономера! 2В4 и Fp проводилась на подложках из высоко ориентированной пиролитического графита (ВОПГ) или свежесколотой слюды. Получении изображения имели колоколообразный профиль. Диаметр объект определялся как ширина изображения на полувысоте. Измеренная высот адсорбированных на ВОПГ молекул 2В4 в 100 мМ калий-фосфатном буфер (КР), рН 7.4, содержащем 0.25 г/л эмульгена, составляла около 2.5-3 нм, диаметр около 15-18 нм. Так как максимальная высота изображений с возможных посторонних включений в контрольном буферном растворе, i содержащем белков, не превышала 1 нм, то объекты высотой 2.5-3 н

юлжны быть молекулы белка. Утверждение, что это 2В4 в мономерном «стоянии основывается на том, что размер молекулы 2В4 близок к размеру '450сам ( 3.3*5.7*5.6 нм согласно [Bernstein et al, (1977)] индекс PDB СРР). Увеличенный диаметр 2В4 15-18нм является следствием уширения го относительно большим радиусом зонда. Изображения олигомеров тличались от изображения мономеров. Олигомеры представляют собой побулы с неразрешаемой структурой с размером по высоте около 10 нм и атеральным размером 50 нм. При сравнении высот олигомеров и ономеров было оценено количество мономеров в олигомере, которое эставляло около 40-60 молекул. Изображения мономеров 2В4 на слюде не 1алось получить, вероятно, из-за слабой адгезии гидрофобных молекул ;лка к отрицательно заряженной поверхности слюды. В отличие от ономеров, олигомеры 2В4 демонстрируют высокую адгезию к слюде, зображения олигомеров 2В4 на слюде существенно отличаются от ¡ображений на ВОПГ. На слюде кроме больших 50-нм объектов 1блюдаются частицы более мелких размеров. Эти частицы можно ¡определить на 4 группы по размерам. Первую группу частиц можно нести к мономерам, так как высота этих молекул приблизительно равна 5-3 нм , а их диаметр 15 нм. Вторую группу частиц можно отнести к тамерам. Остальные частицы являются объектами с более высокой епенью олигомеризации. Таким образом, нельзя исключить, что дрофильная, отрицательно заряженная поверхность слюды вызывает ссоциацию олигомеров 2В4 на менее агрегированные частицы, ■ссоциация олигомеров может быть связана с тем, что электростатические шмодействия между заряженными группами молекул 2В4 и заряженной верхностью слюды более существенны, чем межмолекулярные силы шмодействия между субъединицами 2В4 в их олигомерном комплексе.

ВОПГ гидрофобные взаимодействия между его гидрофобной зерхностью и молекулами 2В4 недостаточны для диссоциации ?гомерного комплекса. Изображения молекул Fp на ВОПГ имели :оту 4-5 нм и диаметр 20-22 нм. Известно, что размеры мономеров Fp гидрофобного мембранного фрагмента составляют 5*7*6 нм (Wang et al. •7). Размеры частиц с высотой 4-5 нм хорошо согласуются с ожидаемыми мерами мономеров Fp. Изображения мономеров Fp на слюде не удалось

получить из-за слабой адгезии гидрофобных молекул Рр к поверхности слюды. Изображения олигомеров Рр на В ОПТ образуют двухмерную сетку. Изображения олигомеров существенно отличаются от изображений мономеров Бр. Средняя высота олигомеров Бр была около 7-8 нм, а диаметр 40-60 нм. Оценки показали, что олигомер Ир может содержать 5 мономеров. В противоположность мономерам, наблюдалось высокое сродство олигомеров Бр к поверхности слюды. Взаимодействие между отрицательно заряженной поверхностью слюды и мономерами Бр в олигомере настолько существенное, что обнаруживаются только мономеры Рр, высотой 4-5 нм и диаметром 20-22 нм. Диссоциация олигомеров Рр на слюде свидетельствует о том, что электростатические взаимодействия Рр -слюда гораздо существеннее, чем взаимодействия молекул Рр в олигомере.

Как было отмечено ранее, изображения олигомеров 2В4 на слюде были распределены на 4 группы ( с высотами 2.5-3 нм, 5-6 нм, 8-9 н и 12-15 нм), в то время как агрегаты Рр на слюде были визуализированы в виде мономеров с высотой 4-5 нм. Таким образом, метод атомно-силовой микроскопии позволяет визуализировать и отличать мономеры Рр и 2В4 от их агрегатов. Невозможность для мономеров 2В4 и Рр адсорбироваться на слюде объясняется слабой адгезией мономеров к поверхности слюды. В то же время, удалось получить изображения комплексов 2В4/Рр на слюде (рис. 1). При визуализации 2В4/ Рр комплексов на слюде изображения распределяются по высоте следующим образом : 2.5-3, 4-5, 6-8, 10 нм у выше (таблица 2).

Таблица 2

Размеры и типы комплексов для 2В4/рр редокс-пары.

N группы Высота, пт Средний диаметр, пт Тип комплекса

1 2.5-3 15-18 2В4-мономер

2 4-5 20-22 Рр-мономер

3 6-8 25-30 2В4/Рр-комплексы

4 10 и выше 35 и выше агрегаты более высоких порядков

Таким образом, можно сделать вывод, что появляется новая групг объектов с высотой около 6-8 нм. Объекты такой высоты не наблюдакт

среди изображений олигомеров. Принимая во внимание, что (а) высота этих комплексов больше чем высота индивидуальных мономеров 2В4 (2.5-3 нм) и Ир (4-5 нм) и (б) высота бинарных комплексов в грубом приближении равна сумме высот мономеров 2В4 и Рр, можно заключить, что эти объекты - бинарные 2В4/Тр комплексы. Наличие изображений мономеров 2В4 и Бр на слюде, когда в растворе находилась смесь 2В4 и Рр, и отсутствие их изображений на слюде в случае нанесения этих белков в виде мономеров предполагает существенную диссоциацию 2В4/Рр комплексов на поверхности слюды за счет сильных электростатических взаимодействий между составляющими комплекс мономерами и подложкой.

1С. 1. АСМ изображения 2B4/Fp комплексов на слюде. Инкубационная месь включала раствор 0.2 цМ каждого белка в 100 тМКР буфере, рН ,4, содержащем 0.25 г/л эмульгена 913. Размеры изображения 0.54 цм х 54 цм. Стрелки 1,2 показывают изображения мономеров 2В4, мономеров з, соответственно; стрелки 3- комплексов 2B4/Fp и стрелка 4- агрегатов злее высоких порядков.

з вышеизложенного можно заключить, что мономеры Fp и 2В4 могут ¡разовывать бинарные комплексы, которые обнаруживаются методом ггического биосенсора

2. ФосФолипид-содеижашие биочипы для оптического биосенсора.

В работе была продемонстрирована необходимость мономеризации мембранных белков для их эффективного встраивания в фосфолипидный слой. Обычно, для исследования белок-липидных взаимодействий используют модельные системы: либо планарные фосфолипидные бислои, нековалеэтно сорбированные на подложку, либо везикулярные (липосомы) [Ramsden, (1996), Archakov and Bachmanova, (1990)]. Эти системы обладают существенным недостатком, связанным с их невысокой стабильность. В представленной работе были созданы стабильные фосфолипид-содержащие биочипы для оптического биосенсора. Для этого на стандартной измерительной кювете оптического биосенсора IAsys с аминосилановым покрытием были сформированы ковалентно иммобилизованные стабильные фосфолипидные слои из дилауроилфосфатидилэтаноламина (ДЛФЭ) и дистеароилфосфатидилэтаноламина (ДСФЭ).

Продемонстрировано, что такие фосфолипид-содержащие биочипы могут использоваться для исследования липид-белковых взаимодействий в реальном масштабе времени. Показано, что мембранные белки 2В4, Fp and Ь5 эффективно встраивались в фосфолипидные слои только после их предварительной мономеризации. На рис. 2А приведены кривые взаимодействия мономеров и агрегатов 2В4 фосфолипидным слоем . Как видно из рис. 2, добавление растворов мембранных белков в измерительную кювету с иммобилизованным фосфолипидным слоем приводит к росту сигнала, вызванного связыванием белка с фосфолипидным слоем. При этом, как правило, на поверхности происходя! сложные процессы , и общее количество связавшегося белка состоит кш из белка, сорбировавшегося на поверхности раздела фаз, так и из белка встроенного в фосфолипидный слой (1ь). Процесс встраивания белю останавливался заменой белкового раствора буферным. При это» наблюдалась диссоциация части непрочно адсорбировавшегося белка i поверхности фосфолипида. Затем, для удаления более прочм сорбировавшихся белковых молекул в кювету добавлялся 50 мМ КБ содержащий lMNaCl, рН 7.4 (далее -1 MNaCl).

Цс)

Рис.2. Связывание мономеров и агрегатов (3-2В4 с ДЛФЭ. Инкубационная смесь содержала 500 мМ КР/Е (для мономеров) или 500 мМ КР (для агрегатов), рН 7.4, Т=25°С. (А) -мономеры <3-2В4 (0.25 цМ), (Б) - агрегаты (1-2В4 (0.25 цМ). (---)-адсорбция белков на контрольной АС-гаовете; МаС1 - 1М КаС1; 2% СЪ - 2% раствор холата N8+1М ЫаС1; 20% СЬ - 20% раствор холата Ыа+ 1М №С1; 1ь-амплитуда сигнала от встроенного в фосфолипидный слой белка

Оставшийся на поверхности белок, который не мог быть удален 1М №С1, рассматривался как белок, встроившийся в фосфолипидный слой за счет гидрофобных взаимодействий и обозначался символом Ть- Удалялся он с поверхности биочипа только в результате обработки раствором детергента - холата Ка в концентрации 20% в 50 мМ КР, содержащем 1 М ЫаС1, рН 7.4 (СЬ). Из рис. 2А видно, что наблюдается различие в связывании мономеров с1-2В4 с поверхностью с иммобилизованным ДЛФЭ, и с немодифицированной поверхностью кюветы. Во-первых, наблюдается

гораздо более высокая амплитуда сигнала прибора при регистрации связывания белка с липид-модифицированной подложкой по сравнению с немодифицированной. Кроме того, взаимодействие мономеров белка с поверхностью немодифицированной кюветы характеризуется лишь обратимой адсорбцией, т.к. сорбировавшийся белок полностью удалялся с поверхности при инкубации в 1М №С1. В случае с липид-модифицированной подложкой он лишь частично десорбируется в 1М растворе №С1. Полная десорбция наблюдается только в растворе 1М ИаС1 + 20% холата натрия и указывает на то что мономеры (1-2В4 встраиваются Доля встроенного белка составляла 0.3. Агрегаты этого белка, в отличие 01 его мономерной формы, не полностью десорбировались ( немодифицированной АС-подложки 1М №С1 (см. рис. 2 Б). Полна* десорбция агрегатов с немодифицированной и модифицированной поверхностей наблюдается только при инкубации в 2% СЬ, в то время кш зга концентрация холата не удаляла полностью встроившийся монсмерньп белок (см. рис. 2 А). На основании приведенных результатов можнс сделать вывод, что агрегаты 2В4 не встраиваются в фосфолипидный слой. В этих же экспериментах была выявлена ведущая роль гидрофобньс мембранных фрагментов белков ё-Ъ5, ё-Рр и с!-2В4 во встраивании их ] липидный слой. Для примера на рис.3 представлены кривые встраивани полноразмерной формы ё-Ь5 и его усеченной (лишенной гидрофобног мембранного фрагменнта) формы 1;-Ь5 в ДЛФЭ.

80 60 40 20 0

Рис. 3. Связывание сЬ, 1-Ь5 с ДЛФЭ. Инкубационная смесь содержа; 500мМ КР/Е, Т=25°С. Стрелками указано добавление <1- Ь5 (-0-) или ЬЪ5 (-< (0.5 мкМ). Условные обозначения те же, что и на рис. 2.

идно, что (1-Ь5 встраивается как в ДЛФЭ, в то время как усеченный I- Ь5 е взаимодействовал с фосфолипидными слоями.

ыло показано, что наряду с гидрофобными взаимодействиями, в процессе страивания с1-Ь5 и с1-Рр принимают участие электростатические силы, величение электростатических взаимодействий с понижением ионной илы среды увеличивало способность Бр встраиваться в ммобилизованный слой ДЛФЭ. Эффективность встраивания сЗ-Рр и <1-Ь5 онижается с ростом длины цепи жирнокислотных остатков юсфолипидов. Встраивание <М5 в ДЛФЭ резко повышалось при емпературе фосфолипидного слоя выше точки фазового перехода.

Е. Роль гидрофобных и электростатических взаимодействий в

образовании комплексов интохром Р450 с их редокс-партнерамн в цитохром Р450сам, Р450зсс и Р4502В4 -содержащих моноокснгеначных системах.

.1 1. Р450сам- содержащая монооксигеназная система.

(ля Р450сам-содержащей монооксигеназной системы методом ютического биосенсора в реальном времени было зарегистрировано »бразование бинарных комплексов Р<!;„/Р(!К и Рс1,т/Р450сат при [ммобилизацин [><1 с константами скорости ассоциации и диссоциации, [риведенными в таблице 3. При иммобилизации РсШ. либо Р450сат |бразования комплексов этих белков с Рс1 не наблюдалось. Это указывало, гго аминогруппы РсШ. и Р450сам участвуют в процесс ммплексообразования и электростатические взаимодействия играют ¡едущую роль в комплексообразовании редокс-партнеров. Было показано, гго формирование и распад комплекса Р(1шУР450сат характеризуется даухфазной кинетикой, в отличие от монофазной для других пар партнеров. Это означает, что существует, по крайней мере, два типа комплексов Рс!„„ с >450сат; долгоживущие (т=50с) и доля таких комплексов меньшая (30%), и 5ыстро распадающиеся (лабильные) (т=2,9с) комплексы - их большинство 70%). Сродство партнёров друг к другу в обоих типах комплексов тссчнтывалось как Кецг= к0//к^ и Кея" = к„„'/к„/ .

Таблица 3

Константы скоростей комплексообразования и электронного транспорта для пар P450cam/Pd , PdR/Pd и P450cam/PdR_

Партнеры km' Ю4 M"1 с1 kaff c1 I C K«,*106 м-1 k> c1 '

Pdntl+P450cam P450cam,m+Pd 6.5il.5si(£) 1).28±0.06,9 (S) 0 0.34±0.1270(i) O.O2±O.O130(S) 0 2.9±1.0 (1) 50±25 (s) 0.19±0.07(f) 0.14+0.07(s) 46 (Nakamura et al. 1994)

Pdm+PdR PdR^+Pd 12±2.0 0 0.02±0.01 50Í25 6.0±3.2 26 (Roome and Peterson, 1988)

P450cam„,+PdR PdROI1+P450cam 0.34i0.14 0.73 Í0.2 0.047Í0.015 0.5 ±0.39 21+6.0 1.8Í1.2 0.07±0.03 0.013±0.010 0 0

PdR+PdR 4.6+2.1 0.03±0.01 33±19 1.5±0.1 -

P450cam+P450cam 26+12 0.33±0.15 3.0+1.5 0.78+0.55 -

Pd+Pd 0

(Pdm+PdR)+ P450cam I6±7 0.57+0.04 1.8ÍI.3 0.28+0.14

Инкубационная смесь содержала 50 мМ Трис-НС1 буфер, рН 7.4, 200 мМ KCI и 0.4 мМ камфоры, Т=25° С . (f) v (s) - быстрая и медленная фазы реакций ассоциации и диссоциации, соответственно. Доли (%) быстрой и медленной фаз реакций ассоциации и диссоциации указаны нижним индексом. Значения к цитированы из литературных источников, указанных в скобках.

Как видно из таблицы 3,эти величины не различаются (Keqf = Кеч"). В тс же время, если сопоставить время жизни комплексов с константаш скоростей реакции переноса электрона ке между Pd и Р450сат (табл. 3), то очевидно, что время жизни лабильных комплексов превышает время необходимое для реализации межбелкового переноса электронов в 13! раз. Это дает возможность предположить, что даже в лабильны

комплексах за время их существования (т=2,9с) возможен перенос 135 электронов (k/kef = 135) , в то время , как в долгоживущих комплексах второго типа (т=50с) возможен перенос 2300 электронов (к/к„/ = 2300). Учитывая, что в комплексе Pd/PdR наблюдается перенос электрона с PdR на Pd за характеристическое время 1/26 с, можно рассчитать, что в течение времени жизни одного образовавшегося комплекса может передаться около 1300 электронов. Время жизни комплексов Pd/P450cam и Pd/PdR много больше времени, необходимого для межбелкового переноса электрона. Так как при иммобилизации PdR и Р450саш через их аминогруппы не наблюдалось образования комплексов этих белков с Pd, то это означало, что в образовании электрон-переносящих комплексов Pd/PdR и Pd/P450cam решающий вклад вносят электростатические взаимодействия, в которые вовлечены аминогруппы Р450сат и PdR Пара Р450сат /PdR может образовывать непродуктивные комплексы и электростатические взаимодействия играют важную роль в их стабилизации, так как скорость диссоциации этих комплексов существенно зависит от того, какой из партнеров был иммобилизован. Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод, что редокс-партнеры могут образуют как электрон-переносящие комплексы, в которых возможен перенос электронов (Pd/P450cam, Pd/PdR), так и непродуктивные (PdR/P450cam), где перенос электронов отсутствует. Однако, сравнивая время жизни электрон-переносящих комплексов со временем,

необходимым для переноса электрона и реакции гидроксилирования, можно видеть, что функционирование их в цикле восстановления-окисления (что необходимо для осуществления реакции гидроксилирования) невозможно, так как время жизни Pd/PdR в сотни и тысячи раз превышает время межбелкового переноса электрона и гидроксилирования (каталитическая константа гидроксилирования камфоры составляет 34с"1 [Mueller et al., (1995)]). Комплексы Pd/PdR все время должны находиться в полностью восстановленном состоянии, а комплексы Pd/P450cam в полностью окисленном, то есть они не могут функционировать в циклическом режиме окисления-восстановления и должны быть тупиковыми. Учитывая продолжительность времени их жизни, можно утверждать, что Pd не может эффективно функционировать

в качестве переносчика электронов от одного бинарного комплекса к другому и поэтому было высказано предположение, что продуктивными, функционирующими в циклическом режиме гидроксюшрования,должны быть тройные комплексы.

3.1.2. P450scc-coflepacainaH монооксигеназняя система. Для этой системы методом оптического биосенсора было зарегистрировано образование бинарных комплексов Adml/AdR и Adim/P450scc при иммобилизации Ad с константами скорости ассоциации и диссоциации, приведенными в таблице 4. Комплексообразование Adim/P450scc характеризуется кш =0,2-106 М'с"1. Это указывает на то, что эта реакция диффузионно лимитируема. При иммобилизации другого партнера,^ для пары P450sccb»/Ad ниже, ее значение порядка 5-104 MV, что свидетельствует о наличии термодинамического барьера реакции. Сравнение времён жизни этих комплексов показывает на более высокую (на порядок) стабильность комплекса AdrlI)/P450scc. Такое соотношение коп и к0ц для этих пар является основой того, что Keq для Adi„/P450scc примерно в 100 раз выше, чем для P450scc/Ad, то есть положительно заряженные группы P450scc играют ведущую роль во взаимодействии этих партнеров. Их модификация меняет реакцию ассоциации белков, замедляя ассоциацию и уменьшая стабильность комплексов, и таким образом резко снижает их сродство друг к другу. Связывание пары Ad^/AdR также зависит от того, какой из партнёров был иммобилизован. AdRra не образовывала комплексов с Ad. С другой стороны, Adjm мог образовывать комплексы с AdR, что указывает на то, что положительно заряженные аминогруппы AdR абсолютно необходимы для комплексообразования с Ad. Зависимости кинетики образования комплексов от того, какой из партнёрог иммобилизован, указывает на решающую роль положительно заряженны? аминогрупп P450scc и AdR в комплексообразовании с Ad . Для парь Adro/AdR значение А™, составляет (0,018+0,004) • ЮЧгУ , что существен» меньше диффузионного предела. Это означает, что реакци: комплексообразования, вероятнее всего имеет термодинамический барьер Низкая константа скорости диссоциации для Adim/AdR и Adlm/P450sc комплексов - 0,02+0,01с'характеризует их высокую стабильность.

Таблица 4

Константы скоростей комплексообразования и электронного транспорта для пар Р4508сс/А(1, АЛЫ/Аё и Р450зсс/АсШ_

Партнеры Ln *106 M-'c1 kr,/j*\0\ c'1 T, с юЧг1 К o1

Adim+P450scc 0.23±0.02 0.02+0.01 50±25 10.5+5.3 3 [Lambeth and

P450sccim+Ad 0.05±0.02 0.4±0.1 2.5±0.6 0.13±0.07 Kriengsiri (1985)]

Adm+AdR AdRim+Ad 0.018±0.004 0 0.02±0.01 50+25 0.9±0.5 4.6 [Chu andKimura 1973]

P450scCj„+AdR 0.0039±0.0024 0.3±0.1 3.311.0 0.01310.009 не опр.

AdRira+P450scc 0.0024±0.0012 0.02±0.01 50+25 0.12+0.09 не опр.

Из сравнения констант скоростей диссоциации Ad/AdR и Ad/P450scc с константами скоростей переноса электрона между этими белками fkc) следует, что характеристическое время жизни комплексов (50+25 с) в сотни раз превышает время переноса электрона (0,33 и 0.22 с, соответственно).

Было также показано, что пара AdR/P450scc образует комплексы, причем константы скорости диссоциации для этих комплексов различаются в зависимости от того, какой из партнеров иммобилизован. Для комплекса P450im/AdR Kjf на порядок больше, чем для комплекса AcHWP450scc. Это указывает на то, что положительно заряженные аминогруппы цитохрома P450scc необходимы для стабилизации комплексов между AdR и P450scc. В то же время кт для этих пар одинаковое. Как известно, электронный транспорт между P450scc и AdR отсутствует. Поэтому все образовавшиеся комплексы P450scc/AdR непродуктивные.

Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод, что так же , как и в Р450сам-содержащей системе, редокс-партнеры в P450scc- системе могут образовывать как электрон-переносящие комплексы, в которых возможен перенос электронов (Ad/P450scc, Ad/AdR) так и непродуктивные (AdR/P450scc), где перенос электронов отсутствует. Однако, сравнивая время жизни электрон-переносящих комплексов со временем, необходимым для одного цикла гидроксшшрования, можно видеть, что функционирование P450scc их в цикле восстановления-окисления (что

необходимо для осуществления реакции гидроксилирования) в таких комплексах невозможно, так как время их жизни на порядок превышает продолжительность цикла гидроксилирования (константа гидроксилирования холестерина составляет порядка 0.2-0.3с"' [Hanukoglu, (1981)]. Комплексы Ad/AdR все время должны находиться в полностью восстановленном состоянии, а комплексы Ad/P450scc в полностью окисленном, то есть они не могут функционировать в циклическом режиме окисления-восстановления и являются тупиковыми. Учитывая продолжительность времени их жизни, можно утверждать, что Ad не может эффективно функционировать в качестве переносчика электронов от одного бинарного комплекса к другому и поэтому было высказано предположение, что продуктивными, функционирующими в циклическом режиме гидроксилирования, должны быть тройные комплексы.

3.1.3. Р4502В4-содержатяя монооксигеназная система

Мембранная Р4502В4-содержащая монооксигеназная система имеет до сих п( невыясненную молекулярную организацию [Archakov and Bachmanova, (1990)] же время хорошо известно, что изолированные мембранные белки в растворе существуют в виде олигомеров, что существенно затрудняет работу с ними [Guengerich et al, (1980), Calabro et al., (1976)]. Редоко партнеры в этой систег 2В4, Fp и Ь5- представляют собой амфипатические белки, имеющие гидрофоб мембранные фрагменты, с помощью которых эти белки встраиваются в биомембрану [Archakov and Bachmanova, (1990)]. Эти фрагменты можно удал либо генно-инженерным методом (в случае 2В4) либо трипсинолизом (в слу Ъ5) [Omura and Takesue (1970), Lehnerer et al., (1995)]. Для выяснения роли взаимодействия гидрофобных мембранных фрагментов белков в образовали! электрон-переносящих комплексов в этой системе, были проведены сравните исследования кинетических параметров комплексообразования редокс-парп со скоростью межбелкового переноса электрона для полноразмерных (d-) 6ej пар, в которых у одного либо сразу у обоих партнеров были удалены гидроф мембранные фрагменты (усеченные t-белки). Для выяснения роли электростатических взаимодействий был проведен сравнительный анализ параметров комплексообразования редокс - партнеров полноразмерных, а та] усеченных форм с константами скорости межбелкового транспорта в буфер

средах высокой (500 мМ К-фосфатный буфер) и низкой (50мМ) ионной силы. В буфере высокой ионной силы электростатические взаимодействия значительно ослаблены, а гидрофобные взаимодействия существенны. В буфере низкой ионной силы, электростатические взаимодействия становятся значительными. Эксперименты проводились в мономерной реконструированной системе (MPC) в К-фосфатном буфере разной ионной силы, содержащем 0.25 г/л эмульгена 913 [Bachmanova et al., (1994)]. Исследование влияния ионной силы буфера на скорость реакции переноса первого электрона и гидроксилирования (таблицы 5,6) показало, что повышение ионной силы буфера при увеличении концентрации КР с 50 до 500 мМ не приводит к существенному изменению в величине константы скорости восстановления 2В4 не только для полноразмерных форм белков, как было отмечено выше, но и для усеченных гемо- и флавопротеинов (согласно дисперсионному анализу проверки равенства нескольких средних [Поллард, (1982)], (F< F"1'1"1 при 5% уровне значимости). Константа скорости восстановления понижалась на порядок, когда в комплексообразовании участвовала молекула t-2B4, а не d-2B4, и падала до 0 в системе, содержащей t-Fp. Это означает, что гидрофобные мембранные d-Fp абсолютно необходимы для образования электрон-переносящих комплексов, в то время как усеченный t-2B4 может образовывать электрон-переносящие комплексы с d-Fp. В отсутствии d-b5 константа скорости N-демегилировання бензфетамина также не менялась с увеличением концентрации КР ( F< F",,lc!j). Добавление d-b5 к паре d- 2B4/d-Fp повышает скорость гидроксилирования бензфетамина в 1.5 раза во всех экспериментальных условиях. Для пары t - 2B4/d-Fp, содержащий усеченный 2В4, скорость гидроксилирования падает примерно в 1.5 раза с ростом КР с 50 до 500 мМ и, в то же время, составляет порядка 30 -40 % по сравнению с полноразмерными партнерами, как в отсутствии, так и в присутствии d-b5 как при низкой , так и при высокой ионной силе среды. Добавление Ь5 сопровождалось увеличением скорости окисления бензфетамина в 1.5 раза в MPC, содержащей t-2B4, так же как и для случая с полноразмерными 2В4 и Fp. Добавление t-b5 не влияло на константу скорости N - деметилирования бензфетамина во всех экспериментальных условиях. Окисление бензфетамина не наблюдалось при использовании t- Fp. Таким образом, повышение ионной силы среды на порядок в полноразмерной системе не приводит к существенному снижению как констант скорости переноса первого электрона, так и констант скорости N-демегилирования бензфетамина.

Таблица 5

ЫАОРН - зависимое восстановление 2В4 при различной ионной силе КР/Е буфера

концентрация КР/Е, шМ Р2л т? спИса!

Система 50 К в1 100 К,*1 500 Б

а-2В4-ьё-Рр 0.8310.25 0.75Ю.21 0.50±0.23 2.42 3.68

1-2В4+(1-Рр 0.085+0.02 0.082±0.030 0.063±0.020 1.83 3.68

с!-2В4+^Рр 0 0 0

1-2В4+1-Рр 0 0 0

Инкубационная смесь содержала КР/Е, рН 7.4, 0.5 рМ каждого белка, 2 тМ бензфетамина, 1 тМ ЫАБРН, 40 тМ глюкозы, 90 ед/мл глюкозоксидазы, 2500 ед/мл катапазы. Т-25°С. Гг,,""""' -3.68 (длят =15) т^Ы-3, где М-число значений кев 50, 100, 500 тМ КР/Е

Таблица 6

Влияние концентрации буфера и Ь5 на скорость N -деметшшрования бензфетамина

КРВ/Е, тМ р2^п г; С1йка1

Система 50 к, в'1 100 к,81 500 М"1

(3-2В4+а-Рр 0.12+0.03 0.09+0.01 0.08+0.01 1.75

+<1-Ь5 0.18±0.02 0.1410.02 0.1210.02 3.06 4.26

0.11+0.02 0.1010.02 0.0810.01 3.85

1-2В4+(1-Рр 0.036±0.002 0.02810.003 0.02210.003 57.11

+а-Ь5 0.053+0.004 0.037+0.004 0.030+0.002 49.50 4.26

+1-Ь5 0.037±0.002 0.02910.003 0.02110.002 20.38

с1-2В4+1-Рр 0 0 0

+(сМ)-Ь5 0 0 0

1>2В4+1-Рр 0 0 0

+(сЦ)-Ь5 0 0 0

Инкубационная смесь содерясала КР/Е, рН 7.3, 1 рМ каждого белка, 2 тМ бензфетамина, 2тМ ЫАОРН. Т=25°С. Е2,тт"са' = 4.26 (для т=9) т=И-3, где N - число значений к в 50, 100, 500 тМ КР/Е. В системе 1-2В4/<1-Рр, для которой скорость переноса первого электрона и

скорость гидроксилирования составляла около 10% от скорости переноса

электронов в полноразмерной системе и около 30-40% от скорости

гидроксилирования полноразмерной системы, наблюдается некоторое

снижение скорости гидроксилирования (в 1.5 раза) при таком же

повышении ионной силы среды. Во всех других системах, содержащих

усеченные партнеры, не наблюдалось реакций переноса первого электрона

и гидроксилирования ни в одном из буферных растворов различной ионной

силы. Это позволяет заключить, что роль электростатических взаимодействий в реакции переноса электронов и гидроксилирования для полноразмерных белков не существенна. С целью сравнения полученных результатов с данными анализа реакции образования комплексов в реальном масштабе времени их к„„ и кoff измерялись в тех же самых экспериментальных условиях. 3.1.3.1. Взаимодействие 2В4 с Fp.

Результаты измерения взаимодействия полноразмерных и усеченных форм 2В4 и Fp в буферных растворах разной ионной силы приведены в таблицах 7, 8. Наиболее интересные результаты получены в буферном растворе с высокой ионной силой (500 мМ КР/Е), где влияние электростатических взаимодействий значительно ослаблено. Отчетливо видно, что в случае полноразмерных белков d-2B4 и d-Fp порядок иммобилизации не играет никакой роли ( 1-я строка в таблице 7). Это значит, что электростатические силы взаимодействия не играют существенной роли в образовании комплексов d-2B4 и d-Fp, которые как видно из таблицы 8, являются электрон-переносящими. Удаление мембранного фрагмента как у одного из партнеров, так и у обоих, существенно изменяет картину взаимодействия. В этом случае появляется роль заряженных аминогрупп. При этом, положительно-заряженные группы d-2B4 абсолютно необходимы для образования его комплексов с t-Fp, а положительно заряженные группы t-2В4 как для образования комплексов с d-Fp, так и с t-Fp. В то же время иммобилизованный t-Fp не может образовывать комплексы как с d-2B4, так и с t-2B4. Все образующиеся комплексы , за исключением t-2B4/d-Fp, непродуктивные. Доля элекгрон-переносящих t-2B4/d-Fp комплексов по сравнению с таковой для d-2B4/d-Fp падает в 5 раз. Сходная ситуация наблюдается и с электрон-транспортными свойствами комплексов по 2-му электрону. В предположении, что перенос второго электрона может быть лимитирующей стадией реакции гидроксилирования [Imai, (1981), Archakov and Bachmanova, (1990)] отношение времени жизни 2B4/Fp комплексов ко времени протекания одного цикла гидроксилирования (t2e) определяет долю продуктивных комплексов по переносу второго электрона. Рассчитанная таким образом доля по второму электрону для полноразмерной пары d-2B4/d-Fp составляет 50% (Таблица 8).

Таблица 7

Кинетические константы комплексообразования для редокс-партнеров

2В4/Тр в КР/Е буферах.

Буф ер Пары коп'*106, М Б 1 Оиог\ М*1 э 1 Ц, э К«,1»106, М"1 К«,2*10' М'1

500 тМ с1-2В4+с1-Рр 0.45±0.20 - 0.20±0.10 2.2±1.0 -

1-2В4,т+(1-Рр с)-Ррга+1-2В4 0 4.0±2.0 - 0.30±0.10 13.3±7.8 -

й-2ЪАт+\гРр 1-РВт+а-2В4 0 0.50Ю.20 • 0.30Ю.Ю 1.67±0.80

1-2В4т+ЬРр 4-Рр,тН-2В4 0 1.5±0.4 - 0.40±0.10 3.8±1.3 _

й-2В4+<1-2В4 (3-2В4+Ь2В4 1-2ВЛ + 1-2В4 ЩЦ-Рр+сЩ)-Рр 0.06±0.04 0.3±0.1 1.8±0.2 0 - 0.13±0.07 0.3±0.1 0.20±0.05 0.45±0.038 1.0±0.5 9.1±2.5

100 тМ <1-2В4и+с1-Рр й-Рр,т+с1-2В4 0.17±0.11 0.22±0.09 (0.18)* 0.028*0.009 (0.82)** 0.20±0.03 0.016±0.005 0.85±0.57 13.8±7.2 1.8±0.£

1-2В41т+<1-Рр й-Рр,т+1-2В4 0 0.38±0.04 (0.23)* 0 0.04±0.01 (0.77)** 0 0.032±0.010 0 11.9±3.8 1.3±0У

с!-2В41тН-Рр 1-Рр1т+Й-2В4 0 0.12±0.07 (0.26)* 0.03±0.01 (0.74)** 0.018±0.004 6.7±4.1 1.7±0.(

«В^-Рр 1-Ррт+1-2В4 0 0.22±0.08 (0.30)* 0 0.05±0.02 (0.70)** 0.024±0.007 9.1 ±4.2 2.1±1.'

50т М <1-2В4ш,+(1-Рр (1-Рр,т+с1-2В4 0.33±0.21 0.52±0.24 (0.11)* 0 0.012±0.006 (0.89)** 0.27±0.07 0.026±0.003 1.7±1.2 20.0±9.5 о.4б±о.;

{-2В4|т-к1-Рр й-Рр1т+1-2В4 0 0.39±0.20 (0.36)* 0 0.025±0.005 (0.64)" 0 0.012±0.002 0 32.5±17.5 0 2.1±0.'

с1-2В4го+1-Рр 1-Рр1т+с1-2В4 0 0.56±0.06 (16)* 0.040±0.002 (84)** 0.011 ±0.001 50.9±7.2 3.7±0.!

Ы=р,т+1-2В4 0 0.43±0.05 (0.17)* 0 0.05±0.02 (0.83)** 0.013±0.002 33.1±6.4 3.8±1.1

Если значения к0„ и ¡соизмеренные при альтернативной иммобилизации,

были одинаковые, они приведены одной строкой, если же разные, то они приведены в двух строках. К<щ1 — к0£/к0ц- К.щ2 —к0„Укод",

(...)*,(...)** соответствующий вклад быстрой и медленной фазы.

Таблица 8

Доля элехтрон-переносящих 2В4/Рр комплексов в КР/Е буферах.

Буфер пары с Т2«С р по Iм5, электрону % рпо 2"1 электрону %

500тМ с!-2В4+(1-Рр 5.0±2.5 2.0±0.9 12.5±1.6 100 50

1-2В4й+<1-Кр а-Рр„,+1-2В4 0 3.3±1.1 15.9±5.1 45.5+6.2 21 7

<1-2В4»+1-Рр «-Ррь„+<1-2В4 0 3.3±1.1 0 0 0 0

1-Рр»-Н-2В4 0 2.5±0.7 0 0 0 0

100тМ а^^+а-Рр (3-Ррт,+а-2В4 5.0±0.8 62.5±19.5 1.3±0.4 11.Ш.2 100 100

1-2В4ОТ|-К1-рр <1-Рр1т+1-2В4 0 31.3±9.8 12.2±4.5 35.7±3.8 100 84

с1-2В4т+1-Рр 1-Рр„+()-2В4 0 55.6±12.3 0 0 0 0

1-2В4т+1-Рр 1-Рр„+1-2В4 0 41.7±12.2 0 0 0 0

50тМ (1-2В4т4<1-Рр 3.7±0.1 38.514.4 1.2±0.4 8.3±2.1 100 100

Ь2В4Ет-К!-Рр <1-Рр™-Н-2В4 0 83.3±13.9 11.8±2.8 27.7±1.5 100 100

а-2В4т-Ч-Рр '-РРт+<1-2В4 0 90.9±66.1 0 0 0 0

Ь2В4т+1-Рр 1-Ррт+1-2В4 0 76.9±11.8 0 0 0 0

р-доля :)'.ск!г,роц.переносящих комплексов

Удаление гидрофобного хвоста у 2В4 понижает эту долю комплексов до 7%, а удаление гидрофобного хвоста у Рр делает практически все комплексы непродуктивными по второму электрону. В буферных растворах с более низкой ионной силой наблюдается гораздо более сложная картина взаимодействия. Комплексы с1-2В4т1Л1-Рр, когда с!-2В4 был иммобилизован через его аминогруппы, характеризовались временем жизни порядка нескольких секунд и константой скорости образования порядка 106 М"'С"1 и не зависели от ионной силы среды. Независимость констант скорости переноса электрона для пары с[-2В4/(1-Рр от ионной силы буфера коррелирует с независимостью комплексования для пар с!-2В4|т/с1-Рр, обусловленной взаимодействием гидрофобных мембранных фрагментов белков. В случае иммобилизации Рр при понижении ионной силы буферной среды появляется двухфазная кинетика в реакции образования комплексов, в то время как кинетика их распада продолжает оставаться монофазной (таблица 7). Это позволяет утверждать, что все образовавшиеся комплексы гомогенны и двухфазность кинетики их образования является следствием участия различных сил взаимодействия. То есть, в условиях низкой ионной силы буфера при сохранении участия гидрофобных взаимодействий начинают играть существенную роль электростатические силы, особенно в случае укророченных форм белков. При этом, так как константа скорости появившейся медленной фазы реакции образования комплексов коп на порядок меньше (при вкладе около 80 %), чем быстрой фазы, то это означает, что формирование комплексов за счет электростатических взаимодействий имеет термодинамический барьер, а движущей силой образования комплексов остаются гидрофобные взаимодействия. Усиление влияния электростатических взаимодействий в условиях низкой ионной силы среды приводило к увеличению времени жизни комплексов на порядок, т.е резко увеличивало их стабильность. Эти результаты свидетельствуют о существовании в условиях пониженной ионной силы среды, в отличие от высокой , (при иммобилизации Рр) двух типов комплексов - с низким и высоким сродством партнеров друг к другу (КеЧ1= 6.7-50.9*106М"', К^г = (0.46-3.8)* ЮЧг1, соответственно). Полноразмерный иммобилизованный 2В4 сохранял возможность образования продуктивных комплексов с <1-Рр в 50 мМ КР/Е, в то время как Ь2В4 таких комплексов не

образовывал. Все комплексное которых хотя бы один партнер был усечен, за исключением 1-2В4/(1-Рр, были непродуктивными. Последняя пара обладала способностью поддерживать реакцию переноса электрона и гидроксилирования, но с гораздо меньшей скоростью.

В заключение следует отметить способность ё-2В4 образовывать комплексы с самим собой ( таблица 7 для 500 мМ КР/Е), в то время как у с!-Рр такая возможность отсутствует.

3.1.3.2. Взаимодействие 2В4 с Ь5.

Результаты измерения взаимодействия полноразмерных и усеченных форм 2В4 и Ь5 в буферных растворах разной ионной силы приведены в таблицах 9, 10. Так же,как и в случае с с!-2В4/У-Рр, наиболее интересные результаты получены в буферном растворе с высокой ионной силой (500 мМ КР/Е). Видно, что в случае полноразмерных белков, с1-2В4 и <)-Ь5, порядок иммобилизации не играет никакой роли ( 1-я строка в таблице 9). Это значит, что электростатические силы взаимодействия не играют существенной роли в образовании комплексов сЗ-2В4 г с!-Ь5, которые как видно из таблицы 10, должны быть продуктивными и за время их жизни может переноситься более 4 электронов. Отсутствие взаимодействия между усеченным Ыэ5 и полноразмерным 6-2В4 во всех экспериментальных условиях еще раз подтверждает этот вывод. Удаление мембранного фрагмента как у одного из партнеров, так и у обоих существенно изменяет картину взаимодействия. В этом случае отчетливо выявляется ведущая роль его положительно заряженных аминогрупп в образовании комплексов как с й-, так и с 1-Ь5. Иммобилизованный 1-2В4 не образовывал комплексы с <1-, 1-Ь5 во всех буферных растворах, в то время как иммобилизованный (1-, Ыэ5 образовывал комплексы с 1-2В4. Хотя при удалении гидрофобного мембранного фрагмента у 1-2В4 сохранялась возможность образовывать комплексы с с!-,г-Ь5^Г1 , тем не менее переноса электрона в них не наблюдалось. То есть, для образования продуктивных комплексов между 2В4 и Ь5 необходимо наличие гидрофобных мембранных фрагментов у обоих белков. Это указывает на ведущую роль гидрофобных взаимодействий в образовании продуктивных комплексов.

Таблица 9

Константы комплексообразования для 2В4/Ь5 редокс-партнеров в КР/Е буферах.

Буфер Пары имо6, м-1*-1 5-1 Кч,*10\ М"1 М-

с1-2В4+с!-Ь5 1.2±0.5 0.2±0.1 6.014.0 -

а-2В4+14э5 0 ■

500тМ 1-2В4„+с1-Ь5 <Н>5га +и2В4 0 2.4±1.2 0.5Ю.1 4.812.6 -

1-2В4„+(-Ь5 1-Ь5у +1-2В4 0 2.8±1.2 0.5±0.1 5.612.6 ;

(ВД-Ь5+ сВД-Ь5 0 - -

с!-2В41т+(3-Ь5 а-Ь5т +а-2В4 0.38Ю.13 0.095Ю.068 (0.17)* 0.010±0.001 (0.83)** 0.27Ю.02 0.018+0.007 1.4Ю.6 5.313.7 0.56К

<1-2В4+1-Ь5 0

ЮОтМ 1-2В4„+(1-Ь5 0

(3-Ь5„„ +1-2В4 0.4310.25 (0.29)* 0.04±0.01 (0.71)** 0.02110.002 20.515.6 1.9К

1-2В4„+1-Ь5 1-Ь5„, +1-2В4 0 2.7±1.9 0.1710.02 15.9110.6

<1-2В4„+<1-Ь5 ё-Ь5„+(1-2В4 0.9Ю.5 0.065±0.029 (0.13)* 0.015±0.002 (0.87)** 0.24М.05 0.008Ю.001 3.8+2.3 8.113.4 1.8К

(1-2В4Ч-Ь5 0

50тМ 1-2В4ь+(14>5 0

(1-Ъ5„, +1-2В4 0.42Ю.12 (0.16)* 0.03±0.01 (0.84)** 0.018Ю.002 23.312.2 1.41

1-2В4т+1-Ь5 1-Ь5„„ +1-2В4 0 0.7±0.3 0.28Ю.03 2.511.5

Если значения к„„ и к0дцзмеренные при альтернативной иммобилизации были одинаковые, они приведены одной строкой, если же разные, то они приведены в двух строках. Ке„, — к„// к0<[ КеЧ2 коп / ко£Г ,

(...) *,(...)** соответствующий вклад быстрой и медленной фазы.

Таблица 10

Доля электрон-переносящих 2В4/Б5 комплексов в КР/Е буферах.

Буфер Пары Т, с с Р

ё-2В4-Ш-Ь5 5.0±2.5 1.1±0.1 100

<1-2В4+Ыэ5 0 0 0

500тМ 1-2В4т+с1-Ь5 (1-Ь5тН-2В4 0 2.010.4 0 0

1-2В4т+1-Ь5 1-Ь5т-Ц-2В4 0 2.0±0.4 0 0

а-2В4т+с1-Ь5 <1-Ь5ь+(1-2В4 3.7±0.3 55.6±21.6 1.0±0.2 100

с!-2В4И-Ь5 0 0 0

• 100тМ 1-2В4„+с1-Ь5 а-Ь5ш+1-2В4 0 47.6±5.2 0 0

1-2В4т+1-Ь5 1-Ь5„+1-2В4 0 5.9±0.7 0 0

с1-2В4т-Н1-Ь5 с1-Ь5ня+с!-2В4 4.2±0.9 125.0±15.6 0.96 ±0.09 100

с1-2В41т+1-Ь5 0 0 0

50тМ |-2В4„+(1-Ь5 а-Ь5„Ч1-2В4 0 55.6±6.2 0 0

1-2В4,т+1-Ь5 1-Ъ5„+1-2В4 0 З.б±0.4 0 0

р-доля электрон-переносящюс комплексов.

В буферных растворах с низкой ионной силой наблюдается гораздо более сложная картина взаимодействия. В случае иммобилизации ё-Ь5 при понижении ионной силы буферной среды появляется двухфазная кинетика в реакции образования комплексов с!-Ь5ш/(1-, Ь2В4, в то время как кинетика их распада продолжает оставаться монофазной (таблица 9). Это позволяет утверждать, что все образовавшиеся комплексы гомогенны и двухфазность

кинетики их образования является следствием участия различных сил взаимодействия. То есть в условиях низкой ионной силы буфера при сохранении участии гидрофобных взаимодействий существенную роль начинают играть электростатические силы, особенно в случае усеченных форм белков. Усиление влияния электростатических взаимодействий в условиях пониженной ионной силы среды приводило к увеличению времени жизни комплексов на порядок, т.е резко увеличивало их стабильность, при этом продуктивность комплексов полноразмерных партнеров оставалась 100%, а комплексы усеченных форм белков оставались непродуктивными.

В заключение следует отметить невозможность для (1-Д-Ь5 образовывать комплексы между собой ( таблица 9).

При изучении взаимодействия с1-Рр/1:-2В4 с добавленным (1-Ь5 было найдено, что с1-Ь5 влияет на повышение скорости гидроксилирования в этой системе; в то же время не было зарегистрировано межбелкового электронного транспорта ё-Ь5Л-2В4. В то время как гидрофобный мембранный фрагмент 2В4 (как было показано выше) абсолютно необходим для комплексообразования <1-Ь5/(1-2В4, электростатические взаимодействия между 1-2В4 и сЗ-Ь5 обеспечивают выполнение цитохромом (!-Ь5 роли эффекторного белка в реакции гидроксилирования.

3.1.3.3. Взаимодействие Ри с Ь5

Не было зарегистрировано комплексов между Рр и Ь5 ни для их полноразмерных, ни для усеченных форм белков, хотя перенос электрона от Бр к Ь5 наблюдался с ке , равной 0.4 с"1, которая не зависела от того, был ли один из этих белков, либо оба одновременно полноразмерные или усеченной формы. Это означает, что перенос электрона между Рр и Ь5 происходит при случайных столкновениях.

Таким образом, для пар (!-2В4/с1-Рр и ё-2В4ЛЙ>5 движущая сила реакции образования продуктивных комплексов - гидрофобные взаимодействия между мембранными фрагментами белков. Понижение ионной силы буферной среды препятствует образованию комплексов, и при этом увеличивает их стабильность.

3.2. Исследование возможности образования тройных комплексов в Р450-содержящнх монооксигеназных системах.

3.2.1. Образование тройных РёШРс1/Р450сат комплексов в Р450сат-содержащей монооксигеназной системе.

Предположение о возможности образования тройных комплексов в системе РсИ1, Рё и Р450сат оказалось возможным проверить экспериментально. Был предложен метод прямой регистрации тройных комплексов. Для этого на подложке иммобилизовывался Рс1, к которому затем последовательно добавлялись два других партнера в разной последовательности. На рис. 4 представлена схема эксперимента. К предварительно сформированному комплексу Р^ЛЧЖ, полученному добавлением в кювету биосенсора Р<111, добавлялся Р450сам. При этом не наблюдалось увеличения сигнала от добавления Р450сам (рис. 4А). Так как Р450сам может образовывать комплексы с РсШ, как было показано ранее (см.табл.З), то отсутствие комплексов Р450сам с Рс1|га в присутствии 1МК в кювете может означать, что РсЗЯ, находящаяся в растворе, образует комплексы с Р450сам и поэтому, блокирует связывание Р450сам с Рс1;т. Для проверки этого предположения Р<Ж. удалялась из кюветы и заменялась КР буфером (рис.4 Б), после чего в кювету добавлялся Р450сам. В этом случае наблюдалось комплексообразование Р450сам с предварительно сформированным комплексом Рс^пЛ^Я. Оба процесса - ассоциация и диссоциация для связывания Р450сам с Р<1;т/Р(П1 удовлетворительно описываются монофазной экспоненциальной кривой. Как бьшо показано ранее, образование комплекса Р(1;„/Р450сат и его распад в отсутствии Р(Ш. (см. табл.3) следует двухфазной кинетике. В реакции комплексообразования Р450сам с предварительно сформированным комплексом Рё^/Рс®. отсутствуют вторая фаза ассоциации и диссоциации, характеризующиеся коп' и V-

Кс)

Рнс.4. Образование тройного комплекса в системе Р450сат,Рс1 Инкубационная смесь содержала 50тМТНа-НС1 буфер, рН 7.4, 200 тМКС1, 0.4 шМ камфоры.,Т= 25 °С. (А) Отсутствие связывания Р450сат с Рс^ в присутствии РсШ. в инкубационной смеси. (Б) Связьиание Р450сат с Рс^/РйЯ комплексами после удаления' РНТ? из раствора.На вставке показана та же зависнмост с более высоким временным разрешением . Стрелками показано добавление 1.5_цМР<Ш.н 1.5 цМ Р450сат к

Таким образом, в присутствии Рс®. один из центров Рс1, характеризующийся низкой скоростью ассоциации и диссоциации, блокируется РсП*, образующей комплекс с Рс)щ,. Поэтому Р450сам может взаимодействовать с Рё™ только через другой связывающий центр, характеризующийся высоким значением констант скоростей ассоциации и диссоциации. Это приводит к тому, что образование долгоживущего (Т =50с) комплекса Рс1|т/,Р450сат не наблюдается из-за конкуренции между Р450саш и РёЯ за общее или расположенное рядом место связывания. Время жизни тройного комплекса РсЖЛМтЛМЗОсат, рассчитанное из кривой диссоциации (рис.4Б), составляет 1,8 сек. Так как каталитическая константа гидроксилирования камфоры составляет порядка 34с"', то время

жизни тройного комплекса превышает время полного цикла гидроксилирования в 60 раз. Следовательно, в течение времени жизни гройного комплекса может реализоваться 60 циклов гидроксилирования и 5арегисгрированные тройные комплексы могут быть продуктивными, циклически функционирующими в ходе реакции гидроксилирования. На основании этих данных предложена схема электронного транспорта для Р450сат-содержащей монооксигеназной системы (рис. 5). Как уже /поминалось ранее, двухфазная кинетика образования и распада комплексов Р(1;т/Р450саш предполагает наличие ка Рс1 двух центров связывания с Р450. Связывание комплекса Рй„/Р(Ш. с Р450сат следует монофазной кинетике, что говорит о том, что один из центров связывания Рс1 с Р450саш занят РсЖ. стабильный лабильный стабильный лабильный

Рис. 5. Схема электронного транспорта в Р450сат-содержащей монооксигеназной системе.

В растворе, содержащем Рс1, РД* и Р450саш, возможно образование очень стабильных бинарных комплексов Рс1/Рс1Я и Рё/Р450сат. Хотя в этих комплексах могут переноситься электроны, большое время жизни этих комплексов исключает их возможное циклическое участие в гидроксилазной реакции из-за того, что Р(1 не может функционировать как переносчик электронов от одного бинарного комплекса к другому. В отличие от этого, в продуктивном циклическом функционирующем электрон-переносящем тройном комплексе Р<1 работает как мостик между РсШ. и Р450сат. В каждом образованном тройном комплексе может эффективно реализовываться до 60 циклов гидроксилирования камфоры. Таким образом, в Р450сам-содержащей монооксигеназной системе тройные электрон-переносящне РЖ/Рс1/Р450сат комплексы могут образовываться наряду с бинарными РсУРёЯ и Рс1/Р450сат комплексами. Медленный распад бинарных комплексов делает предпочтительным функционирование тройных комплексов в цикле восстановления-окисления цитохрома Р450сат в реакции окисления камфоры.

3.2.2. Образование тройных AdR/Ad/P450scc комплексов в P450scc-содержащей моноокснгеназной системе.

Ранее (см раздел 3.1.2) на основании данных о большом времени жизни бинарных комплексов Ad/AdR и Ad/P450scc было высказано предположение о невозможности эффективного функционирования Ad в качестве переносчика электронов от одного бинарного комплекса к другому, т.е. функционирование Р4505сс-содержащей системы по этому механизму, который является, по сути дела, общепринятым [Lambeth et al., 1984); Vickery, (1997)]. Одиночные работы свидетельствующие в пользу существования тройных комплексов в этой системе [Kido and Kimura, (1979), Usanov et al., (1985)], наряду с полученными кинетическими данными, заставили нас вернуться к экспериментальной проверке данной гипотезы. Так как Ad является переносчиком электронов от AdR к P450scc и его аминогруппы не участвуют в связывании обоих редокс-партнеров, то легко можно было проверить наличие или отсутствие конкурентности при связывании Adj„ с AdR и P450scc (рис.6).

Рис. б Связывание Ай^ с А<Ш. или с цнтохромом Р450эсс в отсутствии или присутствии Р450эсс или Ас! К , соответственно. Инкубационная смесь содержала 50 мМ КР буфер, рН7.4. Стрелки указывают добавление Р450эсс, AdR и КР буфера

Видно, что связывание цитохрома Р450бсс и Ad¡ln в присутствии и отсутствии различаются. В присутствии ЛёЯ связывание цитохрома Р450зсс с Adim несколько слабее, чем в отсутствии флавопротеина. Более

рачительные различия наблюдаются в случае связывания АсШ. с Ас!™ после юбавления Р450всс. Взаимодействие AdR с в присутствии цитохрома МбОвсс практически не наблюдается. Это указьгаает на то, что юложительно заряженные аминогруппы цитохрома Р450зсс и АйЯ юнкурируют за отрицательно заряженные группы Лс1;т в областях :вязывания. Следовательно, Ad имеет общие или перекрывающиеся :вязывающие участки для AdR и Р450$сс. Причем, эта конкуренция явно в гользу Р450бсс, что еще раз подтверждает полученные ранее данные о том, гго сродство гемопротеина к Ас!™ выше, чем флавопротеина (к^ = 10.5±5.3)*106М~' и К^ = (0.9+0.5)* Ю'М1, соответственно (табл. 4$ В силу •акой конкуренции между Р450$сс и AdR за места связывания/образование ¡3 Ad¡ш тройных комплексов невозможно. В то же время ранее (см. табл.4 ) юказано, что Ad не связывался с AdRim , в то время как Р4505ССщ1 такую юзможность сохраняет. Поэтому схема эксперимента была изменена таким >бразом, что исследовалось взаимодействие Ad с АсЖщ, до и после юбавления Р450$сс.

1(5)

Рис. 7. Сп5г:ыи:!1П1е Лг1 с; Лс1К. в отсутствии или присутствии Р4508СС или Ас!, соответственно.

Инкубационная смесь содержала 50 мМ КР буфер, рН 7.4. Стрелки Заказывают добавление Р^ЛОясс, А<1, АсШ. и КР буфера

1з рис. 7 отчетливо видно, что Ad, не связывающийся с AdRjm, хорошо вязывается с бинарным комплексом Ас®™, /Р450зсс, то есть возможность >бразования тройного комплекса существует и в этой системе. Время его шзни в несколько раз меньше, чем время жизни бинарного комплекса и оставляло 15с. Так как константа скорости цикла превращения

холестерина в прегненолон составляет 0.3-0.5с"' [Напико§1и, (1981)], то в течение времени жизни одного тройного комплекса может реализоваться 58 каталитических циклов.

На основании полученных результатов можно предположить следующую ( электронного транспорта в Р450зсс-содержащей монооксигеназной сис представленной на рис.8.

Три белка АсШ, А(1, Р450зсс образуют тройной комплекс, в котором АсЖ свя Р4508СС, а Аё - с каждым из своих партнеров- АёЯ и Р450эсс . Так как ком] А(®/Р450зсс непродуктивный, то между этими белками нет переноса элект Электроны могут передаваться в тройном комплексе от АёЯ к Р450зсс чере как показано стрелкой.

Рис.8 . Схема электронного транспорта в P450scc - содержащей монооксигеназной системе.

3.2.3. Образование тройных d-Fp/d-2B4/d-b5 комплексов в 2В4-содержащей монооксигеназной системе.

В литературе имеются многочисленные данные о том, что несмотря на то, что многие монооксигеназные реакции происходят в реконструированной системе, содержащей d-Fp и d-2B4, добавление d-b5 способно стимулировать некоторые из этих реакции [Backstrom et al., (1983), Morgan and Coon, (1984), Hlavica, (1984)]. Так как d-b5 не способен образовывать комплексы с d-Fp, а восстанавливается в результате случайных столкновений, и в то же время способен образовывать комплексы с d-2B4, было высказано предположение, что существует возможность образования тройных комплексов, в которых 2В4 может связывать d-Fp и d-b5 в разных местах. С целью доказательства этого положения исследовалось влияние предварительно добавленного к иммобилизованному d-2B4 цитохромов d-Fp или d-b5 на связывание d-b5 или d-Fp, соответственно. В случае

вильности нашего предположения не должно наблюдаться конкуренции 5 и (1-Рр за места связывания на ¿-2В4т. Правильность этого ^положения подтверждается приведенными экспериментальными [ными (рис. 9).

Рис. Я Связывание <1-Ь5 и ¿-Ир с 2В4нп в присутствии и в отсутствии ^

соответствующих редокс-партнероз. Инкубационная смесь ■ 500 мМКР/Е. Т=25 С. Стрелками показано добавление 1.5 мкМ <1-Ь5 или ¿-Рр .

идно, что присутствие насыщающих концентраций (1-Рр не сказывается на язывании <1-Ь5 с <1-2В4;т и, наоборот, присутствие насыщающих шцентраций (1-Ь5 не сказывается на связывании ё-Рр с А-2В4,т ля прямого обнаружения образующихся тройных комплексов была эедложена следующая схема опыта (рис.10). Вначале в кювету с 2В4,т зта добавлена ё-Рр (1.5 мкМ) и наблюдалось образование 2В4;т/У-Рр инарного комплекса. Вклад второй добавки ё-Рр относительно первой иеньшался, свидетельствуя о том, что первая добавка ё-Бр была сделана ри концентрации, близкой к насыщающей. Последующая замена аствора, содержащего с!-Рр, на буфер приводила к диссоциации бразовавшихся бинарных комплексов. Затем на фоне добавленного й-¥р 1.5 мкМ) вместо второй добавки с!-Рр к предварительно сформированному омплексу 2В4,т /У-Рр добавлялась смесь <1-Рр + с1-Ь5. Как видно из рисунка, [аблюдался рост сигнала с амплитудой, гораздо большей, чем от второй рбавки (1-Рр. Это означает, что с1-рр не конкурирует с <1-Ь5 за места ;вязывания на 2В4, а формирует тройной комплекс 2В4„, М-РрМ-Ь5.

к.

3.0ггМ<1Ь5 . буфер "^Л^М ЛЛД

з.о^магр

1000

2000 1(с)

3000

Рис. 10. Связывание с!-Ь5 н с1-Рр с 2В4ип и диссоциация тройных комплексов <1-Рр/с1г2В4цп/<3-Ь5 в присутствии и в отсутствии соответствующих редокс-партнеров. Инкубационная смесь -500 мМ КР/Е. Т=25 С.Стрелками показано добавление 1.5 или 3.0 мкМ <1-Ь5 КР/Е. Пунктиром показано добавление КР/Е.

Последующая замена смеси в кювете на буфер, содержащий с!-Рр и не содержащий <3-Ь5, приводила к снижению сигнала.

Так как в присутствии ё-Рр диссоциация с!-2В41т/с1-Рр комплекса невозможна, то это снижение сигнала обусловлена диссоциацией из тройного комплекса только (1-Ь5. Последующая добавка буфера приводила к полной диссоциации оставшихся бинарных с!-2В4шУс1-Рр комплексов. Аналогичная ситуация наблюдается при реализации другой последовательности добавок белков. Это означает, что (1-Рр и с!-Ь5 не конкурируют за места связывания на 2В4, а имеет место формирование тройного комплекса 2В4т, /с!-Ь5Л1-Гр. Для определения времени жизни таких комплексов в кювете с ё-2В4,„, содержащей сформированные тройные комплексы, заменяли смесь содержащую с1-Ь5 и (1-Рр на буферный раствор и анализировали процесс диссоциации. Время жизни тройного комплекса не зависало от последовательности добавления с!-Рр и ё-Ь5 к с1-2В4^ и было равно 7.0± 2.0 с. Сравнение этого времени жизни тройного комплекса с временем, требующимся для реализации цикла гидроксилирования бензфетамина в присутствии с1-Ь5 (т8.3±1.4 с) показывает, что за время жизни комплекса может реализоваться лишь один полный цикл гидроксилирования.

В противоположность системе, содержащей полноразмерные белки, в экспериментах с иммобилизованным t-2B4 не было зарегистрировано связывание его с d-Fp или d-b5. Такая ситуация наблюдалась для d-2B4;m/t-Fp,-b5 а также и для t-2B4-lm/t-Fp,-b5. Отсюда можно сделать вывод, что отсутствие мембранного фрагмента хотя бы у одного из редокс-партнеров| приводит к исчезновению способности образовывать тройные комплексы. Это означает, что взаимодействие гидрофобных мембранных фрагментов редокс-партнеров играет определяющую роль в образовании тройных шектрон-переносящих комплексов.

Таким образом, наряду с тем, что цикл гидрокснлирования в 2В4 системе может реализоваться в бинарных комплексах d-Fp/d-2B4, было показано юзможность его реализации и в тройных d-Fp/d-2B4/d-b5 комплексах, которые формировались за счет гидрофобных взаимодействий мембранных фрагментов партнеров. Основываясь на данных о взаимодействии юлноразмерных форм d-2B4,d- Fp, d-b5 можно предположить следующую ;хему функционирования электрон-транспортной цепи в MPC системе (рис. II).

случайные соударения;

>пс. 11 Схема электронного транспорта в 2В4 - содержащей «юносжсигеназной системе.

I- Рр может образовывать комплекс с d-2B4, при этом передавая ему юследовательно либо два электрона, либо второй электрон d-2B4 может

получить от (Ы>5, который акцептирует перед этим его у й- Бр прт случайном столкновении. Принимая во внимание, что (1- Бр и ё-Ь5 не могу] образовывать комплексов между собой и то, что (1-2В4 может образовывав комплекс как с <1- Ир, так и с <й>5 с продолжительным временем жизни, I течение которого имеется вероятность для переноса двух электронов , тс имеется возможность реализации реакции гидроксилирования в тройном комплексе с1-Рр/(1-2В4/с!-Ь5.

Таким образом, наряду с тем, что цикл гидроксилирования в 2В4 систем! может реализоваться в бинарных комплексах (1-Рр/(1-2В4, имеете: возможность его реализации и в тройных с!-Рр/(3-2В4М-Ь5 комплексах которые формируются за счет гидрофобных взаимодействий мембранньс фрагментов партнеров.

4. Исследование влияния комплексообразования на структура активных центров редокс-партнеров.

Важный вопрос, возникающий при анализе комплексообразования белков-партнеров, связан с влиянием комплексообразования на структуру белков. В работе методом спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния исследовалось такое влияние комплексообразования в 2В4 -содержащей монооксигеназной системе, реконструированной из двух белков ё-Рр и й-2В4. Эти белки имеют несколько неперекрывающихся полос в спектре РКР. Спектры комбинационного рассеяния регистрировались при длине волны возбуждения лазера 457 нм, лежащей в области поглощения флавина и гема. Анализ смещения положения линий резонансных спектров комбинационного рассеяния этих простетических групп белков при хомплексообразовании показал, что в комплексах ё-Рр/ё-2В4 изменяется прочность водородных связей колец П и III изоаллоксазинового цикла у ё-Рр. Увеличивается прочность связывания циклических структур с белковой глобулой. Это означает, что аминокислотные остатки с1-Рр , участвующие во взаимодействии, расположены на поверхности глобулы флавопротеина в области флавинов. В то же время РМИ не участвует непосредственно в комплексообразовании с поверхностью (1-2В4. В образовавшихся комплексах происходит повышение электронной плотности на разрыхляющей я* орбитали гема.

IV. выводы

. Показана применимость метода оптического биосенсора для исследования в реальном времени взаимодействия редокс-партнеров в Р 450- содержащих монооксигеназных системах, как водорастворимой, так и мембранной.

Показано, что электростатические взаимодействия играют ведущую роль в образовании электрон-переносящих бинарных комплексов Рс1/Рс1Я и Рс1/Р450сат в водорастворимой Р450сам- содержащей монооксигеназной системе, а также Аё/АёК и Ас1/Р450ясс комплексов в смешанной Р450бсс - содержащей монооксигеназной системе.

Были обнаружены тройные комплексы Р(Ш/Рс1/Р450сат и А(И*/Ас1/Р4505сс, за время жизни которых может быть реализовано до 60 и 5 полных циклов гидроксилирования камфоры и холестерина, соответственно. Поэтому, хотя бинарные Рс1/Рс1К, Р(1/Р450саш и Аё/АёЯ, Ас1Л>450зсс комплексы могут быть электрон-переносящими, однако превьпление их времени жизни над продолжительностью циклов гидроксилирования на порядки, соответственно, делает их участие в реакции гидроксилирования по челночному механизму малоэффективным. Более предпочтительна реализация

гидроксилирования в тройных комплексах Р(П1/Р<1/Р450сат и А<ША(1/Р4505сс.

В отличие от Р450сам и Р450бсс, в 2В4 -содержащей монооксигеназной системе, включающей только мембранные белки, движущей силой формирования электрон-переносящих комплексов с1-Рр/с!-2В4 и ё-Ь5М-2В4 являются гидрофобные взаимодействия. Реакция переноса электрона между белками ё-Бр и с!-Ь5 реализуется только при их случайных столкновениях. Зарегистрировано образование тройных с!-Рр/с1-2В4/с1-Ь5 комплексов в Р4502В4-содержащих системах, время жизни которых достаточно для реализации полного цикла гидроксилирования.

5.Показана возможность применения атомно-силовой микроскопии для визуализации как отдельных мембранных белков, так и их комплексен р Р450 2В4 -содержащей монооксигеназной системе.

6. Были созданы фосфолипид-родержащие биочипы для оптического биосенсора, которые могут использоваться для исследования белок-липидных взаимодействиий. С их помощию бьша продемонстрирована необходимость мономеризации мембранных белков для их эффективного встраивания в фосфолипидный слой и выявлена ведущая роль гидрофобных мембранных фрагментов белков во встраивание их в липидный слой.

7. С помощью спектроскопии комбинационного рассеяния показано, что комплексообразование влияет на структуру активных центров 2В4 и Fp. При связывании d-Fp с d-2B4 увеличивается прочность связывания флавиновых групп с белковой глобулой флавопротеина за счел увеличения прочности существующих водородных связей . В то же время FMN не участвует непосредственно в связывании с поверхностьк 2В4. При комплексообразовании повышается электронная плотность т разрыхляющей я* орбитали гема цитохрома Р4502В4.

V. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАП

1. Иванов Ю.Д., Изотов А.А., Шумянцева В.В., Уваров В.Ю. Раман спектроскопия микросомального цитохрома Р450 и эпоксидгидролазы. Тезисы на VII конференции по спектроскопии биополимеров. 1991, Харьков, с. 120.

2. Shumyantseva V.V., Pokrovskaya M.Yu., Ivanov Yu.D., Izotov A.A. Interact« between organophosphorasanalogues of biologically active compounds and cytochrome P450. Proceedings of the 7th International Conference of Biochemistry and Biophysics of Cytochrome P450: Structure and Function Biotechnological and Ecological Aspects (AI. Archakov, G.I. Bachmanova & p. 162- 164. Moscow, Russia, Inco-Tnc, Joint Stock Company, 1992.

3. Ivanov Yu.D., Makarov S.G., Uvarov V.Yu. The resolution of overlapped spectra bands by the Monte Carlo method. Vibrational Sectroscopy. 1993,V.5 p. 175-179.

4. AlexandrovaO.V., Ivanov Yu., Uvarov V.Yu. Resonance Raman Spectra of NADPH Cytochrome P 450 Reductase and Its Complex with Cytochrome P 450 2B4. Proceedings of the 8 -th International Conference Cytochrome P450 Biochemistry, Biophysics, and Molecular Biology. 1994, Lisbon, p.765-768.

5. Shumyantseva V.V., Meshkov S.V., Ivanov Yu.D., Alexandrova O.V., Uvaro V.Yu., Archakov A.I. Interaction of organophosphoms analogues of amino acids with P 450. Xenobiotica.l995, V. 25, N. 3, P. 219-227.

lyantseva V. V., Ivanov Yu.D., Uvarov V. Yu., Archakov A.I. Modelling he hydroxylation functions of the microsomal monooxigenase system by cial hemoprotein . Abstr. of 9 International Conference on Cytochrome 0. 1995, Zurich, p. 248.

мнцева В В., Булко T.B., Иванов Ю.Д, Ляшенко АА., Уваров В.Ю., аков АИ. Моделирование путей электронов в микросомальной еме с помощью искусственного гемопротеина. Тезисы докладов на Международной конференции по химии порфиринов и их аналогов. 5, С.Петербург, р.190-191.

iov Yu.D.,. Uvarov V.Yu, Romanov A.N., Gallyanov M.O.,Kiseliova O.I., linskiy I. V. Scanning tunneling microscopy study of cytochrome P 450 incorporated in proteoliposomes. Biochimie, 1996, V.78, p.780-784 iov Yu.D., Uvarov V.Yu.,Romanov A.N., Gallyanov M.O.,Kiseliova O.I., oinskiy I. V. STM study of charge transfer in cytochrome P450 irporated in proteoliposomes. Abstr. of 7th Annual Simposium otoinduced Charge Transfer: Reactive Process in Organized Media". 1996, ¡hester, p. 50

mov Yu.D., Kanaeva I.P., Archakov A.I. Optical Biosensor study of ochrome P 450 with its reductase and cytochrome b5 complex formation, str.of 11-th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations. »6, Los Angeles, p.196. Ivanov Yu.D,

anaeval.P., Davydov D.K^iitepanovaN.V., Bachmanova G.I. and A.I. ;hakov. The study of redox-partners interactions by spectral and optica! sensor echniques. Abstr.of 11-th International Symposium on Microsomes I Drug Oxidations.Book of abstracts, 1996, Los Angeles, p. 195. ,'anov Yu.D., Uvarov V.Yu., Romanov AN., ApletalinaE.V., Gallyanov O., Kiseliova O.I., Yaminskiy I.V. STM study of cytochrome P450 orporated in proteoliposomes Abstr. of 11 -th International Symposium on crosomes and Drug Oxidations.Book of abstracts, 1996, Los Angeles, p. 9.

плеталина Е.И., Галлимов М О., Иванов Ю.Д., Киселева О.И., ¡аров В.Ю., .Яминский И.В. Визуализация липосом и протеолипосом ¡годами сканирующей зондовой микроскопии. Тезисы 1 Конференции I высокоорганизованным соединениям, 1996, Минск, стр. 157-159. vanov Yu. D., Kanaeva I.P., Eldarov M. A., Skryabin K.G., Lehnerer M., ;hulze J., Hlavica P., and Archakov A. I. The optical biosensor study of the irameters and role of hydrophobic tails of cytochromes P4502B4, b5 and ADPH-flavoprotein in complex. Biochemistry and Molecular Biology temational.1997, V.42, p. 731-737.

vanov Yu.D., Archakov AI. An «Resonant mirror» biosensor study of ectron transferring complex formation ofP450 see and P450cam with its irtners. Abstr. of IV International Scientific Workshop Biosensors and iosensing Devices in Medicine and Environmental Science, Taskent, 1997. Ivanov Yu. D., Kanaeva I.P., Archakov A.I. Optical biosensors study of ytochrome 2B4 with its reductase and cytochrome b5 complex formation, .bst of German- Russian Summer School Analytical Biotechnology. 1996, ukenwaid.

Иванов Ю.Д, Уваров В.Ю., Никнтюк О.В., Канаева И.П., Арчаков А.И. [зучение комплексообразования микросомалыюго цитохрома Р-450 2В4 13 печени кроликов с NADPH-редуктазой цитохрома Р-450. Тезисы

докладов на Ш Российском Национальном Конгрессе « Человек и лекарство». 1996, Москва, с.23.

18. Иванов Ю.Д., Усанов С.А., Арчаков А.И. Экспериментальное определение кинетических констант комплексообразования адренодоксин с адренодоксин редуктазой и цитохромом P450scc с помощью оптическог биосенсора. Тезисы докладов на Втором съезде биохимического обществг

1997, Пущино, с.ЗЗ.

19. Ivanov Yu. D., Kanaeva I.P., Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Shikin S.A., Usanov S.Aand Archakov A.I. Visualization of the cytochromes. P450 and their complexes with redox partners by atomic force microscopy. Abstr. of Fourth International Symposium on P450 Biodiversity and Biotechnology,

1998, Strasbourg, p.IIF-2.

20. Archakov AI., Ivanov Yu.D.and Hui Bon Hoa G. The optical biosensor study of cytochrome P450cam with its protein partners. Abstr. of Fourth International Symposium on P450 Biodiversity and Biotechnology. Book of abstracts, 1998, Strasbourg, p.lIF-3.

21. Ivanov Yu. D., Kanaeva I.P., Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. and Archakov A.I. The AFM study of complex formation between redox partners in reconstructed cytochrome P450 containing monooxygenase systems. Abstr. of 12-th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations, 1998, Montpcllier, p. 255.

22. Archakov A.I. and.Ivanov Yu.D. The optical biosensor study of interactions parameters for cytochromes P450 with redox partners and with lipid layer. Abstr. of 12-th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations. 1998, Montpellier, p. 256.

23. Kanaeva I.P., Ivanov Yu.D., Bachmanova G.I., Archakov AI. Investigation of nteraction of native and biotinilated cytochrome P450101 with protein partners using an optical biosensor. Abstr. of 12-th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations. 1998, Montpellier, p. 257.

24. Kanaeva I.P., Ivanov Yu.D., Bachmanova G.I., Archakov AI. Interaction of truncated 2B4 with redox partners in monomelic monooxygenase system. Abstr 12-th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations. 1998, Montpellier, p. 258.

25. Kuznetsov V.Yu., Ivanov Yu.D., Kanaeva I.P., Usanov S.Aand Archakov A.I. The optical biosensor study of interaction between P450scc and protein partners. 12-th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations. Abstr of 12-th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations. 1998, Montpellier, p. 425.

26. Ivanov Yu.D., Kanaeva I.P., Karuzina I.I., Archakov AI., Hui Bon Hoa G., and Sligar S. Direct monitoring of protein-protein interactions in P450cam monooxygenase system by using optical biosensor Abstr. of 11 International Conference on Cytochrome P 450. 1999, Sendai, p. 90.

27. Ivanov Yu.D., Kanaeva I.P., Kuznetsova G.P., Samenkova N.F. Archakov AI. Role of hydrophobic and electrostatic forces in productive redox partner interactions in P4502B4- containing monooxygenase system Abstr. of 11 International Conference on Cytochrome P 450. 1999, Sendai, p. 91.

28. Ivanov Yu.D., Kanaeva I.P., Kuznetsov V.Yu., Kiselyova O.I., Yaminsky I. V., Shikin S.A., Usanov S.A., and Archakov AI. Visualization of the cytochromes P450 by tunneling and atomic force. Abstr. of 11 International Conference on Cytochrome P 450.1999, Sendaip. 164.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Иванов, Юрий Дмитриевич

Введение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общие представления о молекулярной организации электрон-транспортных цепей в Р450-содержащих монооксигеназных системах, и новые методы исследования взаимодействия биообъектов.

1 1. Молекулярная организация электрон-транспортной цепи Р450сат-содержащей монооксигеназной системы.

1.2. Молекулярная организация электрон-транспортной цепи митохондриальной Р4 5 Оэсс-со держащей монооксигеназной системы.

1.3. Микросомальная Р450 2В4-содержащая моноок<?игеназная система.

1.3.1. Молекулярная организация электрон-транспортной цепи микросомальной Р450 2В4-содержащей монооксигеназной системы.

1.3.2. Моделирование липид - белковых взаимодействий в мембранной Р450-содержащей системе.

1.4. Новые методы определения параметров комплексообразования биомолекул.

1.4.1. Метод оптического биосенсора для исследования взаимодействия биомолекул в реальном масштабе времени.

1.4.2. Методы сканирующей туннельной и атомно -силовой микроскопии для исследования структуры белков и Pix комплексов.

1.4.2.1. Принцип действия туннельного микроскопа.

1.4.2.2. Механизмы проводимости, специфичные для СТМ.

1.4.2.3. Принцип действия атомно-силового микроскопа.

1.4.2.4. Визуализация белков и их комплексов методами СТМиАСМ.

1.4.3. Спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния в исследовании структуры флавопротеинов и гемсодержащих белков.

1.4.3.1. Спектроскопия РКР флавопротеинов.

1.4.3.2.Спектроскопия РКР цитохромов Р450.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Доказательство правомочности применения методов оптического биосенсора и атомно-силовой микроскопии для исследования Р450-содержащих монооксигеназных систем

3.1. Сравнительный анализ результатов, полученных методом оптического биосенсора с литературными данными.

3.2. Визуализация редокс-партнеров и их комплексов в Р4502В4- содержащей монооксигеназной системе.

Глава 4. Роль электростатических и гидрофобных взаимодействий в образовании комплексов в Р450-содержащих монооксигеназных системах методом оптического биосенсора.

4.1 Р450сам-содержагцая монооксигеназная система.

4.2. Р450зсс-содержащая монооксигеназная система.

4.3. Р4502В4-содержащая монооксигеназная система.

4.4. Сравнительный анализ образования электрон-переносящих комплексов в Р450сам, Р450бсс и Р4502В4-содержагцих монооксигеназных системах.

Глава 5. Определение влияния комплексообразования на структуру активных центров редокс-партнеров.

Глава 6. Фосфолипидные биочипы для оптического биосенсора для исследования взаимодействия мембранных и водорастворимых белков из цитохром Р450-содержащих монооксигеназных систем с иммобилизованными фосфолипидными слоями.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Мониторинг образования и распада комплексов водорастворимого и мембранных цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в реальном времени"

Актуальность Актуальность изучения взаимодействия редокс-партнеров цитохром Р450- содержащих монооксигеназных систем обусловлена выполнением этими системами важных функций в организме. Цитохром Р450 -содержащие монооксигеназные системы ответственны за метаболизм широкого класса эндогенных (холестерин, стероидные гормоны, простагладины) и экзогенных (лекарственные препараты, канцерогены, мутагены) веществ [Archakov and Bachmanova, (1990)]. Превращая исходный гидрофобный субстрат в более полярный продукт, цитохромы Р450 выполняют функцию по удалению неполярных молекул из организма и препятствуют накоплению токсичных гидрофобных соединений. Одной из важных стадий процесса стероидогенеза является превращение холестерина в прегненолон, осуществляемое цитохромом P450scc - холестерингидроксилирующей системой.

По своей молекулярной организации цитохром Р450 (Р450)-содержащие монооксигеназные системы могут быть условно разделены на три основных типа. Первый - наиболее эволюционно ранний тип -бактериальный. Он представляет собой систему, состоящую из трех водорастворимых белков редокс-партнеров. В случае Pseudomonas putida это NADH-специфичный флавопротеин - путидаредоксин редуктаза (PdR), путидаредоксин (Pd) и цитохром Р450 101 (Р450сам) [Gunzalus, (1969), Gunzalus et al., (1971)]. Ко второму - промежуточному типу - относится митохондриальная гидроксилазная система коры надпочечников. Она объединяет в себе признаки растворимой и мембранной системы. Два ее электрон-транспортных белка - адренодоксин редуктаза (AdR) и адренодоксин (Ad) являются водорастворимыми и находятся в митохондриальном матриксе (межмембранном пространстве), а третий белок - цитохром Р450 11А1 (P450scc) - встроен в мембрану [ Sato and Omnra, (1978)]. Третий тип представляет микросомальная монооксигеназная система, состоящая из мембранных электрон-транспортных белков: NADPH- зависимой редуктазы (Fp) , цитохрома Р450 2В4 (2В4), а также цитохрома Ь5 (Ь5) [Archakov and Bachmanova, (1990)]. Все три типа Р450-содержащих монооксигеназных систем объединяет одно важное свойство - они представляют собой электрон-транспортные цепи из белков редокс-партнеров. Функционирование монооксигеназных систем определяется взаимодействием этих белков между собой, во время которого происходит межбелковый перенос электронов от редуктазы к цитохрому Р450 либо через железо-серный белок PdR или AdR в случае Р450сат или P450scc- содержащих монооксигеназных систем , либо напрямую как в случае Р450 2В4-содержащей системы, в активных центрах которых при этом происходит процесс окисления субстратов. Поэтому изучение взаимодействия белков редокс-партнеров в Р450-содержащих монооксигеназных системах и выяснение природы этих взаимодействий является актуальной проблемой. Взаимодействия редокс-партнеров могут приводить к образованию комплексов. Литературные данные о роли гидрофобных и электростатических взаимодействий в образовании этих комплексов в Р450-содержащих монооксигеназных системах противоречивы [Sligar et al., (1974)], [Yasukochi et al., (1994)], [Aoki et al., (1998)], [Voznesensky and Schenkman, (1992)], [Tamburiiii and Schenkman, (1987)] [Unno et al., (1996)], [Geren et al., (1986)], [Lambeth and Kriengsiri, (1985)], [Bernhardt et al., (1988)], [Tamburini and Schenkman,(1986)], pavydov et al., (1996)], [Bachmanova et al., (1994)]. Эти противоречия могут быть объяснены особенностями методов, используемых в этих работах. Так, например, исследования процесса комплексообразования, проводимые по спектрам поглощения белков, в частности, измерением сдвига спинового равновесия железа цитохрома Р450, являются косвенными методами и, в ряде случаев, не позволяют зарегистрировать образование комплексов, в которых не происходит сдвиг спинового равновесия железа [Радюк и др., (1983)]. Методы, включающие химическую модификацию белка, либо использующие точечный мутагенез, могут изменять структуру белка, что приводит к изменению характеристик комплексообразования. Важными параметрами образующихся комплексов являются их электрон-транспортные характеристики. При функционировании Р450-содержагцих монооксигеназных систем могут образовываться комплексы, в течение времени жизни которых наблюдается межбелковый перенос электрона (электрон-переносящие комплексы), так и комплексы, в которых он не реализуется вообще (непродуктивные комплексы). Для понимания функционирования Р450-содержащей монооксигеназной системы необходимо выяснить механизм образования таких комплексов. Для этого требуется измерять кинетические параметры комплексообразования, в частности, характеристическое время жизни комплексов, в течение которого может переноситься определенное количество электронов, необходимое для реализации полного цикла гидроксилирования, а также выяснить роль различных сил межмолекулярных взаимодействий, способствующих формированию таких комплексов. Это позволит выделить из всех образующихся комплексов такие комплексы, которые могут формировать электрон-транспортную цепь в Р450-содержащей системе. Так, например, имеются противоречивые данные о том, формируется ли тройной комплекс АЖУАс1/Р4508СС в Р450эсс-содержащей монооксигеназной системе, и если формируется, может ли он участвовать в реакции гидроксилирования холестерина [Шалоу а1.,

1985), Radyuk et al, (1982)], или же перенос электрона от AdR к P450see происходит по челночному механизму, через последовательное образование бинарных AdR/Ad и Ad/P450scc комплексов [Lambeth et. al, (1984), Vickery, (1997)]. Для ответа на эти вопросы, необходимо зарегистрировать все формирующиеся комплексы и провести сравнительный анализ их времени жизни со временем полного цикла гидроксилирования. Ранее такой анализ не проводился из-за отсутствия методов, позволяющих измерять кинетические параметры комплексообразования в реальном времени. В 90-х годах был разработан и сконструирован оптический биосенсор «резонансное зеркало» для регистрации процесса образования комплексов белков и их распада в реальном времени без применения специальных меток. Физический принцип действия оптического биосенсора основывается на измерении изменения показателя преломления среды при комплексообразовании в тонком пристеночном слое измерительной кюветы. Этот метод позволяет регистрировать все образующиеся комплексы и был использован для исследования комплексообразования водорастворимых белков [Davies et al., (1994)]. Для исследования взаимодействия мембранных белков он не использовался из-за сложности работы с ними. В представленной работе метод оптического биосенсора был применен для исследования взаимодействия редокс-партнеров не только в водорастворимой, содержащей Р450сам-, но и в мембранной системе, содержащей 2В4-, а также в Р450зсс-содержащей монооксигеназной системе, включающей как мембранные, так и водорастворимые белки.

В диссертационной работе предложено следующее научное направление - мониторинг образования и распада комплексов изолированных цитохромов Р450 с их редокс-партнерами с последующим анализом их кинетических параметров с целью выявления продуктивных и непродуктивных комплексов, и роли гидрофобных и электростатических взаимодействий в их образовании и распаде. Продуктивными считались такие комплексы, в которых время жизни равнялось или превышало время переноса одного электрона и они могли эффективно функционировать в цикле восстановления-окисления.

Цель работы - исследование в реальном времени формирования и распада комплексов цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в водорастворимой (цитохром Р450сам), мембранной (Р4502В4) и смешанной (цитохром Р450бсс) системах, содержащей как водорастворимые, так и мембранные белки для определения роли гидрофобных и электростатических взаимодействий в образовании и распаде продуктивных комплексов.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

2. Расчет констант скоростей образования комплексов редокс-партнеров и их распада.

3. Проведение сравнительного анализа кинетических параметров комплексообразования редокс-партнеров в Р450сам, Р450бсс и Р4502В4-системах с их электрон-транспортными характеристиками для выявления электрон-переносящих продуктивных комплексов .

4. Определение роли электростатических и гидрофобных взаимодействий в формировании и распаде электрон-переносящих продуктивных комплексов редокс-партнеров. 5. Проведение сравнительного анализа параметров взаимодействия редокс-партнеров в этих трех системах для выявления общих закономерностей и различий в механизме их функционирования.

Научная новизна

В работе впервые проведено измерение образования в реальном времени электрон-переносящих комплексов редокс-партнеров в Р450-содержащих монооксигеназных системах с помощью оптического биосенсора. Причем, метод оптического биосенсора был использован не только для исследования водорастворимых, но также и мембранных Р450-содержащих монооксигеназных систем, что особенно важно.

Было показано, что в водорастворимой Р450сат -содержащей монооксигеназной системе все образующиеся бинарные Рё/Р450сат и Рс1/РсШ. комплексы характеризуются продолжительным временем жизни, которое в более чем в тысячу раз превышает время межбелкового переноса электрона. Их образование определяется силами электростатического взаимодействия редокс-партнеров.

В этих же системах были обнаружены тройные комплексы Р<ЖУР(5/Р450сат, время жизни которых достаточно для реализации 60 полных циклов гидроксилирования камфоры. Сравнительный анализ времени жизни бинарных электрон-переносящих комплексов со временем, необходимым для реализации полного цикла гидроксилирования, показал, что хотя эти комплексы могут быть электрон-переносящими, большая продолжительность времени их жизни исключает их эффективное участие в гидроксилазной реакции, так как они не могут эффективно функционировать в цикле восстановления-окисления Р450сам. Напротив, в тройном комплексе РсШ/Рс1/Р450сат с

Рс1, функщюнирующим как мостик между Рс1К и Р450саш, реакция гидроксилирования камфоры может эффективно реализовываться. На основании этого предложена новая схема электронного транспорта в тройном комплексе в Р450сам - содержащей монооксигеназной системе.

Продемонстрировано, что в Р450бсс - содержащей монооксигеназной системе, включающей два водорастворимых белка АсШ. и Ас! из трех редокс-партнеров, все образующиеся бинарные Ад/Р450зсс и Аё/АсШ комплексы характеризуются продолжительным временем жизни, которое более чем в сто раз превышает время переноса электрона. Их образование определяется силами электростатического взаимодействия так же, как и в Р450сам -содержащей монооксигеназной системе.

Методом оптического биосенсора обнаружено формирование долгоживущих тройных комплексов Ас1к/Ас1/Р4505сс, что подтверждает гипотезу о возможности реализации в них полного цикла гидроксилирования также, как в Р450сам - содержащей монооксигеназной системе.

Показано, что в мембранной Р450 2В4 -содержащей монооксигеназной системе образование Бр/2В4 и Ь5/2В4 бинарных комплексов характеризуется временем жизни, которое в несколько раз превышает характеристическое время межбелкового переноса электрона. В отличие от двух предыдущих случаев, не электростатические, а взаимодействие гидрофобных мембранных фрагментов 2В4, Бр и Ь5 является движущей силой образования продуктивных электрон-переносящих комплексов. Показано, что роль электростатических взаимодействий в этой системе заключается в стабилизации 2В4/Тр бинарных комплексов за счет увеличения их времени жизни. В отсутствии гидрофобных мембранных фрагментов белков электростатические взаимодействия приводят, в основном, к образованию непродуктивных комплексов. Уникальной особенностью является то, что межбелковый перенос электрона между Fp и Ь5 реализуется при случайных столкновениях редокс-партнеров без образования комплексов. Тройные комплексы Fp/2B4/b5 также обнаружены в 2В4-содержащей монооксигеназной системе, время жизни которых достаточно для реализации полного цикла гидроксилирования. Это указывает на возможность реализации полного цикла гидроксилирования не только в бинарных Fp/2B4, но и в тройных комплексах. Образуются эти продуктивные тройные комплексы также за счет взаимодействия гидрофобных мембранных фрагментов редокс-партнеров. Предложена новая схема электронного транспорта в 2В4 -содержащей монооксигеназной системе.

Определено влияние комплексообразования 2В4 и Fp на структуру активных центров этих белков методом спектроскопии комбинационного рассеяния. Показано, что при комплексовании Fp с 2В4 затрагиваются водородные связи колец II и III изоаллоксазинового цикла флавопротеина, увеличивая прочность связывания циклических структур с белковой глобулой. В то же время FMN не участвует непосредственно в комплексовании с поверхностью 2В4. При комплексообразовании происходит повышение электронной плотности на разрыхляющей л* орбитали гема цитохрома Р4502В4 .

Научно-практическая ценность работы. Полученные в работе результаты необходимы для понимания механизмов функционирования Р450сам, P450scc и 2В4-содержащих монооксигеназных систем и открывают новые возможности для создания на их основе биосенсоров и биореакторов.

Отношение времени жизни комплексов ко времени межбелкового переноса электрона является важным параметром, характеризующим эффективность работы Р450 - содержащих монооксигеназных систем. Расчет этого параметра для Р450сам, Р45(Ъсс и Р450 2В4-содержащих монооксигеназных систем позволил сделать вывод о возможности функционировании этих систем путем образования тройных комплексов, что дает возможность целенаправленно создавать эффективно функционирующие Р450 -содержащие монооксигеназные системы на основе формирования коньюгатов из трех белков-партнеров.

Продемонстрировано использование метода атомно-силовой микроскопии для визуализации редокс-партнеров и их комплексов в 2В4 -содержащей монооксигеназной системе, что дает возможность изучать молекулярную организацию Р450-содержащих монооксигеназных систем.

Создание фосфолипидных биочипов открывает новые перспективы в исследовании белок-липидных взаимодействий и моделировании мембранных Р450-содержащих монооксигеназных систем, а также в создании биосенсоров и биореакторов на основе таких биочипов со встроенными в них редокс-партнерами.

Апробация работы Основные положения диссертации были доложены на 7-ой международной конференции по биохимии и биофизике цитохрома Р450 (Москва, 1991), на 8-ой международной конференции по цитохрому Р450: биохимия, биофизика и молекулярная биология (Лиссабон, 1993) на 10-ом международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» (Торонто, 1994), на УИ международной конференция по химии

16 порфиринов и их аналогов (С.-Петербург, 1995), на 9-ой международной конференции «Цитохром Р 450: биохимия, биофизика и молекулярная биология» (Цюрих, 1995), на 3 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарства» (Москва, 1996), на 7 международном симпозиуме «Фотоиндуцированный перенос заряда: процессы в органических средах» (Рочестер, 1996), на 1 конференции по высокоорганизованным соединениям (Минск, 1996), на 11-ом международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» (Лос-Анджелес, 1996), на 10-ой международной конференции «Цитохром Р450: биохимия, биофизика и молекулярная биология» (Сан-Франциско, 1997), на 2-ом Биохимическом съезде (Москва, 1997), на 4 международной научной рабочей встрече «Биосенсоры и биосенсорные приборы в медицине и науке об окружающей среде» (Ташкент, 1997), на 12-ом международном симпозиуме «Микросомы и окисление лекарств» ( Монпелье, 1998), на 11 международной конференции по цитохрому Р450 (Сендай, 1999),

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Иванов, Юрий Дмитриевич

ВЫВОДЫ

1. Показана применимость метода оптического биосенсора для исследования в реальном времени взаимодействия редокс-партнеров в Р 450- содержащих монооксигеназных системах, как водорастворимой, так и мембранной.

2. Показано, что электростатические взаимодействия играют ведущую роль в образовании электрон-переносящих бинарных комплексов Рё/РсШ. и РсЗ/Р450сат в водорастворимой Р450сам- содержащей монооксигеназной системе, а также Аё/АсШ. и Ас1/Р450зсс комплексов в смешанной Р450зсс - содержащей монооксигеназной системе.

3. Были обнаружены тройные комплексы РсЖУР(3/Р450сат и АсШУА<3/Р450бсс, за время жизни которых может быть реализовано до 60 и 5 полных циклов гидроксилирования камфоры и холестерина, соответственно. Поэтому, хотя бинарные Рс1/РсИ1, РсЗ/Р450сат и АсЗ/А<Ж, Ас1/Р450зсс комплексы могут быть электрон-переносящими, однако превышение их времени жизни над продолжительностью циклов гидроксилирования на порядки, соответственно, делает их участие в реакции гидроксилирования по челночному механизму малоэффективным. Более предпочтительна реализация гидроксилирования в тройных комплексах РсШ/Рс1/Р450сат и АсШАё/Р4508сс.

4. В отличие от Р450сам и Р450зсс, в 2В4 -содержащей монооксигеназной системе, включающей только мембранные белки, движущей силой формирования электрон-переносящих комплексов <3-Рр/с1-2В4 и ё-Ь5/с!-2В4 являются гидрофобные взаимодействия. Реакция переноса электрона между белками ё-Бр и с!-Ь5 реализуется только при их случайных столкновениях. Зарегистрировано образование тройных <3-Рр/с1-2В4/с1-Ь5 комплексов в Р4502В4-со держащих системах, время жизни которых достаточно для реализации полного цикла гидроксилирования.

5. Показана возможность применения атомно-силовой микроскопии для визуализации как отдельных мембранных белков, так и их комплексов в Р450 2В4 -содержащей монооксигеназной системе.

6. Были созданы фосфолипид-содержащие биочипы для оптического биосенсора, которые могут использоваться для исследования белок-липидных взаимодействий . С их помощью была продемонстрирована необходимость мономеризации мембранных белков для их эффективного встраивания в фосфолипидный слой и выявлена ведущая роль гидрофобных мембранных фрагментов белков во встраивание их в липидный слой.

7. С помощью спектроскопии комбинационного рассеяния показано, что комплексообразование влияет на структуру активных центров 2В4 и Рр. При связывании ¿-Бр с с!-2В4 увеличивается прочность связывания флавиновых групп с белковой глобулой флавопротеина за счет увеличения прочности существующих водородных связей . В то же время ГМК не участвует непосредственно в связывании с поверхностью 2В4. При комплексообразовании повышается электронная плотность на разрыхляющей п* орбитали гема цитохрома Р4502В4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с поставленной целью - исследование в реальном времени формирования и распада комплексов цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в водорастворимой (цитохром Р450сам), мембранной (Р4502В4) и смешанной (цитохром P450scc) системах, содержащей как водорастворимые, так и мембранные белки для определения роли гидрофобных и электростатических взаимодействий в образовании и распаде продуктивных комплексов -были проведены исследования взаимодействия редокс-партнеров этих систем с помощью оптического биосенсора. Метод оптического биосенсора позволяет определять полное количество образовавшихся комплексов, как электрон-переносящих, так и непродуктивных. Под электрон- переносящими комплексами понимаются такие комплексы, в течение времени жизни которых возможен перенос электрона. Из отношения времени, необходимого для межбелкового транспорта электрона ко времени жизни комплексов, рассчитывалась доля электрон- переносящих комплексов. Для выяснения участия положительно заряженных аминогрупп, расположенных на поверхности белка, в электростатические взаимодействия с отрицательно заряженными группами другого белка-партнера, каждый из партнеров иммобилизовался через свои аминогруппы на поверхности кюветы оптического биосенсора. Если параметры связывания- константы скорости комплексообразования или распада функциональных комплексов- зависели от партнера иммобилизации, то это означало, что эти аминогруппы белков были вовлечены в формирование электрон- переносящих комплексов. Было продемонстрировано, что константа диссоциации реакции комплексообразования , измеренная методом оптического биосенсора для редокс-партнеров во всех исследуемых Р450-содержащих монооксигеназных системах совпадала с литературными данными, ' что указывало на применимость данного метода в исследовании Р450-содержащих систем. Для водорастворимой Р450сам - системы методом оптического биосенсора были зарегистрированы бинарные электрон-переносящие Рс1/Р450сат и Рё/РсШ комплексы, за время жизни которых может быть передано 2300 и 1300 электронов, соответственно. Было показано, что в образовании этих электрон-переносящих комплексов решающий вклад вносят электростатические взаимодействия, в которые вовлечены аминогруппы Р450сат и РсШ. Показано, что электростатические взаимодействия играют важную роль в стабилизации непродуктивных Р450саш /РсШ. комплексов. Обнаружено, что в отличие от Рс1 , который может образовывать комплексы с редокс-партнерами, Р450сат и РсШ могут образовывать комплексы сами с собой. В диссертационной работе был разработан метод прямой регистрации тройных комплексов. Для этого на подложке иммобилизовывался один из партнеров, к которому затем последовательно добавлялись два других партнера в разной последовательности. Образование тройного комплекса имело место если наблюдалось связывание третьего партнера с предварительно сформированным бинарным комплексом. Таким образом были обнаружены продуктивные электрон- переносящие тройные комплексы Р(1И/Рс1/Р450сат, за время жизни которых может реализовываться до 60 циклов гидроксилирования. В формировании этих комплексов электростатические взаимодействия играют ведущую роль. Сравнительный анализ вре!мени жизни бинарных электрон-переносящих комплексов с временем, необходимым для реализации полного цикла гидроксилирования, показал, что хотя эти комплексы могут быть электрон- переносящими (то есть межбелковый электронный транспорт в них может быть очень эффективным), большое время жизни этих комплексов более, чем в 1000 раз, исключает их эффективное участие в цикле восстановления-окисления, что необходимо для осуществления гидроксилазной реакции. Напротив,# тройном комплексе с Pd, функционирующем как мостик между PdR и Р450сат , может эффективно реализовываться до 60 циклов гидроксилирования камфоры. Связывание Pd с Р450сат и PdR в тройном комплексе наблюдались в разных местах глобулы молекулы Pd. Была предложена модель работы Р450сам-содержащей монооксигеназной системы, где Pd функционирует как мостик между PdR и Р450саш.

Проведенные с помощью метода оптического биосенсора эксперименты для P450scc -содержащей системы позволили определить кинетические константы комплексообразования для бинарных комплексов Ad/P450scc и Ad/AdR и показали ведущую роль электростатических взаимодействий в образовании электрон-переносящих комплексов Ad/P450scc и Ad/AdR, в течение времени жизни которых может быть передано до 230 и 150 электронов, соответственно. Были обнаружены непродуктивные AdR/P450scc комплексы и показано, что электростатические силы играют важную роль в стабилизации этих комплексов. Несмотря на то, что P450scc и AdR конкурировали за одно и то же или близко расположенные отрицательные группы на поверхности иммобилизованного Ad, было зарегистрировано формирование продуктивных тройных комплексов АёК/Аё/Р4505сс. Ас1 не связывался с иммобилизованным АсШ. через аминогруппы АсШ. , но мог связываться с Ас1К.ш только тогда, когда А(1Р1т был предварительно связан Р450зсс. Хотя АсРАсШ и Ас1/Р450зсс комплексы могут быть электрон-переносящими, однако продолжительность их времени жизни более чем в десять раз, соответственно, превышает время, необходимое для реализации полного цикла гидроксилирования. Это приводит к тому, что их функционирование в цикле восстановления-окисления, что необходимо для осущесвления реализации гидроксилирования, должно быть малоэффективным. Более эффективно реакция гидроксилирования должна происходить в тройных продуктивных комплексах АсШУАсРР450з с с, за время жизни которых может реализовываться до 5-8 циклов гидроксилирования холестерина, соответственно.

В случае мембранной 2В4 системы, ситуация была более сложная из-за того, что для исследования взаимодействия редокс-партнеров в этой системе необходимо было ее реконструировать. В качестве реконструированной была выбрана мономерная система на основе эмульгена 913, которая позволяла моделировать электрон-транспортную цепь 2В4-содержащей системы и при этом была возможность не усложнять ее присутствием фосфолипида. Редокс-партнеры в этой системе -2В4, Рр и Ь5- представляют собой амфипатические белки, имеющие гидрофобные мембранные фрагменты, с помощью которых эти белки встраиваются в биомембрану. Эти фрагменты можно удалить либо генно-инженерным методом ( в случае 2В4) либо трипсинолизом ( в случае Рр и Ь5). Для выяснения роли взаимодействия гидрофобных мембранных фрагментов белков в образовании электрон-транспортных комплексов в этой системе, были проведены сравнительные исследования кинетических параметров комплексообразования редокс-партнеров со скоростью межбелкового переноса электрона для полноразмерных пар этих белков и пар, в которых у одного либо сразу у обоих партнеров были удалены гидрофобные мембранные фрагменты. Для выяснения роли электростатических взаимодействий был проведен сравнительный анализ параметров комплексообразования редокс партнеров полноразмерных, а также, трункированных форм с константами скорости межбелкового транспорта в буферных средах высокой и более низкой ионной силы. В буфере высокой ионной силы электростатические взаимодействия значительно ослаблены, а гидрофобные взаимодействия существенны. В буфере более низкой ионной силы, электростатические взаимодействия становятся значительными. Сравнение параметров комплексообразования редокс -партнеров от ионной силы буфера позволило выявить роль электростатических взаимодействий в образовании электрон-транспортных комплексов.

Методом оптического биосенсора было показано, что пары с1-2В4/с1-Рр и с!-2В4/с1-Ь5 могут формировать комплексы двух типов, в зависимости от того, какой партнер иммобилизован. Первый тип комплексов образуется, когда &-2В4 был иммобилизован через его аминогруппы, и характеризовался временем жизни порядка 5 с и скоростью образования порядка 106 М^С1, которые не зависели от ионной силы среды. Независимость констант скорости межбелкового транспорта для пар с1-2В4/ё-Рр и &-2В4/с1-Ь5 от ионной силы буфера коррелируют с независимостью комплексования для пар ё-2В4Ш1/ё-Рр и ё-2В41т/'ё-Ь5 сформированных посредством взаимодействий гидрофобных хвостов. Второй тип комплексов наблюдался , когда были иммобилизованы ё-Рр или ё-Ь5. Для комплексов ё-Рр1т/ ё-2В4 и ё-Ь5Ш1/ ё-2В4 наблюдалось понижение константы скорости ассоциации и диссоциации при понижении ионной силы буфера на порядок. Установлено, что движущей силой эффективного образования ё-Рр/ ё-2В4 и ё-Ь5/ ё-2В4 продуктивных комплексов является взаимодействие мембранных гидрофобных фрагментов белков. Электростатические взаимодействия препятствует образованию электрон-переносящих комплексов на стадии реакции ассоциации за счет создания термодинамического барьера этой реакции и при этом увеличивают стабильность сформированных комплексов (время жизни комплексов возрастает с нескольких секунд до 50-100с при переходе с высокой ионной силы среды к низкой). Удаление гидрофобного хвоста у 2В4 приводит к понижению эффективности переноса как первого, так и второго электрона в комплексах 1-2В4/ё-Рр. При удалении гидрофобного хвоста у Рр продуктивные 2В4/Рр комплексы не образуются. Было показано, что межбелковый электронный транспорт может реализовываться не только через образование электрон-транспортных бинарных комплексов, но и посредством случайных столкновений для пар ё-Рр/ё-Ь5. Были зарегистрированы тройные продуктивные ё-Рр/ё-2В41т/ё-Ь5 комплексы, в которых 2В4 выступает как ядро комплексообразования и в формировании которых ведущую роль играют гидрофобные взаимодействия. Удаление гидрофобных мембранных фрагментов приводило к исчезновению возможности формирования тройных комплексов.

Это указывает на то, что реализация полного цикла гидроксилирования возможна не только при образовании бинарных электрон-транспортных комплексов, но и тройных комплексов.

В представленной работе была продемонстрирована возможность использования метода спектроскопии комбинационного рассеяния для изучения структурных изменений белков Р450-содержащей системы при комплексообразовании. Этим методом были исследованы комплексы Fp/2B4. Спектры комбинационного рассеяния наблюдались при длине волны возбуждения лазера 457 нм, лежащей в области поглощения флавина и гема. Проводился анализ смещения положения линий резонансных спектров комбинационного рассеяния этих простетических групп белков и структурных перестроек микроокружения этих групп, вызывающих смещения линий спектра РКР. Было показано, что при комплексовании Fp с 2В4 затрагиваются водородные связи колец II и Ш у Fp, увеличивая прочность их связывания с белковой глобулой. Это означает, что аминокислотные остатки Fp , участвующие во взаимодействии , расположены на поверхности глобулы флавопротеина в области флавинов. В то же время FMN не участвует непосредственно в комплексовании с поверхностью 2В4. При комплексообразовании происходит повышение электронной плотности на разрыхляющей П* орбитали гема.

В диссертационной работе была продемонстрирована возможность использования методов атомно-силовой микроскопии для обнаружения и визуализации комплексообразования белков в Р4502В4- содержащей системе. Эти методы позволили визуализировать отдельные белки и их комплексы, проводя анализ изменения межатомных взаимодействий между зондом микроскопа

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Иванов, Юрий Дмитриевич, Москва

1. Адамович Т.В., Пикулева И.А., Усанов С.А., Чащин В.Л. Исследование роли остатков лизина холестерингидроксилирующего цитохрома Р450 методом химической модификации. // Биохимия.-1989.-Т.54.-С. 1206-1215.

2. Ахрем А.А.; Шкуматов В.М., Чащин В.Л. Выделение отдельных компонентов стероидгидроксилирующей системы из митохондрий коры надпочечников быка. // Биоорганическая химия. 1977.-Т.3.-С. 780-786.

3. Ахрем A.A., Лапко А.Г.,Лапко В.Н., Морозова Л.А., Репин В.А., Тищенко И.В. и Чащин В.Л. Аминокислотная последовательность адренодоксина из митохондрий надпочечников свиньи. // Биоорганическая химия. 1978.-Т.4.-С. 462-475.

4. Биннинг F. Рорер Г. 1988. Сканирующая туннельная микроскопия от рождения к юности.// УФН,- 1988,- Т. 154, № 2. -С .262-277.

5. Данилов А.Й. Сканирующая туннельная и атомно-силовая микроскопия в электрохимии поверхности.// Успехи Химии,- 1995,Т. 64, №8. -С.818-833.

6. Жуков A.A., Арчаков А.И. Стехиометрия реакций микросомального окисления. Распределение редокс-эквивалентов между монооксигеназными и оксидазными реакциями.катализируемыми цитохромом Р450. // Биохимия,- 1985,- Т. 50. -С. 1382-1387.

7. Заслонко И.С., Сминов В.Н., Тереза А.М. Численное моделирование высокотемпературного распада метилнитрата. Кинетика и катализ. 1988.-Т.29, вып. 3,- €.519 -522.

8. Ивков В.Г. , Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного слоя. Наука, 1981. -293с.

9. Калиткин H.H. Численные методы. М:. Наука, 1979 . -512 с.

10. Канаева И.П., Скоцеляс Е.Д., Кузнецова Г.П., Антонова Г.И., Бачманова Г.И., Арчаков А.И. Реконструкция мембранной монооксигеназной содержащей цитохром Р450 системы печени с помощью детергента в растворе.// Биохимия,- 1985.-Т. 50,- С. 13821387.

11. Карузина И.И., Бачманова Г.И., Ментгазетдинов Д.Э. Выделение и свойства цитохрома Р450 из микросом печени кроликов.//Биохимия,- 1979,- Т. 44,- С. 1044-1057.

12. Кэри П. Применение спектроскопии KP и РКР в биохимии. М., Наука, 1985. -272 с.

13. Лепешева Г.И., Усанов С.А. Динамика и функциональная активность цитохрома P450scc селективно меченного флуоресцеиннизотиоцианатом. // Биохимия,- 1997.-Т.62 .-С. 758-768.

14. Лихтенштейн Г.И., Левченко Л.А., Раевский A.B. Изучение строения активного центра нитрогеназы методом электронной микроскопии .// Доклады АН СССР,- 1973,- Т. 213. -С. 1442-1444.

15. Мишин, Ляхович. Множественные формы цитохрома Р450. Новосибирск, Наука, 1985. -182с.

16. Полак Л.С., Гольденберг М.Я., Левицкий A.A. Вычислительные методы в химической кинетике. М.: Наука, 1984. -280с.

17. Поллард Д. Справочник по вычислительным методам статистики. М.:Финансы и статистика, 1982,- 344с.

18. Радюк В.Г., Шкуматов В.М., Чащин В.Л., Ахрем A.A. Анализ белок-белковых взаимодействий в полной по ферментному составу холестерингидроксилирующей системе. // Биохимия.-1982- Т. 47.-С. 1792-1800.

19. Радюк В.Г., Шкуматов В.М., Чащин В.Л., Ахрем A.A. Реконструкция холестерингидроксилирующей системы на основе иммобилизованного адренодоксина.// Биохимия.-1983.-Т.48. -С. 454463.

20. Реми Г. Курс неорганической химии: пер. с нем.- М.: Иностранная литература, 1963.-Т. 1.-463 с.

21. Спектроскопия порфиринов. Колебательные состояния / К.Н.Соловьев, JI.JI. Гладков, A.C. Старухин, С.Ф. Шкирман,-Минск.: Наука и Техника, 1985,- 415с.

22. Степанова Н.В. Роль цитохрома Ь5 в микросомальной монооксигеназной системе печени , реконструированной в растворе. Автореф. дис. канд. биол. наук,- М.,1996,- 19с.

23. Турко И.В., Кириллова Н.М., Усанов С.А., Чащин В.Л., Ахрем A.A. Ковалентно сшитый комплекс цитохрома Р450 садренодоксином. Локализация адренодоксин-связывающего участка цитохрома Р450. // Биохимия.-1988.-Т.53.-С. 1810-1816 (а).

24. Турко И.В,Усанов С.А., Ахрем А.А.,Чащин В.Л. Механизм электронного транспорта в холестерингидроксилирующей системе: тройной комплекс адренодоксинредуктазы, адренодоксина и цитохрома Р450 .//Биохимия.-1988.-Т.53.-С. 1352-1356 (б).

25. Уваров В.Ю., Бачманова Г.И., Мазуров A.B., Арчаков А.И. Влияние холестерина и степени окисленности фосфолипидов на встраивание в липосомы и конформационное состояние цитохромов Ь5 и Р450. // Биоорг.химия.-1981 .-Т.7.-С 621-627.

26. Усанов С.А., Пикулева И.А., Чащин В.Л., и Ахрем A.A. Селективная химическая модификация холестерин-гидроксилирующего цитохрома Р450 из митохондрий коры надпочечников тетранитрометаном// Биорганическая химия,- 1984,Т. 10,-С. 32-45.

27. Усанов С.А., Чащин В.Л., и Ахрем A.A. Взаимодействие холестерингидроксилирующего цитохрома Р450 с цитохромом Ь5Л Биохимия.- 1989,- Т. 54,- С. 472-486.

28. Усанов С.А., Турко И.В., Чащин В.Л.,Ахрем A.A. Ковалентно сшитый, функционально активный комплекс холестерингидроксилирующего цитохрома Р450 с адренодоксином.// Доклады АН СССР. -1985,- Т.280.-С. 1487-1492.

29. Усанов С.А., Турко И.В., Чащин В.Л.,Ахрем А.А. Молекулярная организация редуктазного комплекса митохондрий коры надпочечников. Исследование с помощью бифункциональных реагентов.// Биоорг.химия.-1986.-Т.12.-С. 185-194.

30. Цупрун В.Л., Мясоедова К.Н., Берндт П.,Зограф О.И., Черняк В.Я., Арчаков А.И., Скулачев В.П. Гексамерная организация цитохрома Р450, изолированного из микросом печени.// Докл. АН СССР.-1985,- Т. 285,- С. 1496-1499.

31. Чащин В.Л., Школина Л.В., Лапко В.Н., Шкуматов В.М. и Ахрем А.А. Исследование структурной организации адренодоксина методом ограниченного протеолиза.// Биохимия.-1983.-Т. 48.-С. 1697-1703.

32. Шкуматов В.М., Радкж В.Г., Гапонова Г.И., Чащин В.Л., Ахрем А.А., Сметтан Г., Рукпауль К. Ковалентно-сорбционная реконструкция стероидных гидроксилаз. //Биохимия.-1988.-Т.53. -С. 1962-1971.

33. Abe М., Kyogoku Y. Vibrational analysis of flavin derivatives: normal coordinate treatments of liimiflavin.// Spectrochimica Acta.- 1987.-Vol. 43,N 8,- P. 1027-1037.

34. Akhrem A.A., Lapko V.N., Lapko A.G., Shkumatov V.M., Chashchin V.L. Isolation, structural organization and mechanism of action of mitochondrial steroid hydroxylating systems// Acta Biol. Med. Germ.-1979,-Vol. 38,-P. 257-273.

35. Alecperov S.D., Vasilyev S.I., Kononenko A.A., Lukashev E.P., Panov V.L, Semenov A.E. Scanning tunneling microscopy of photothintetic reaction centers// Chem. Phys. Letts.-1989.- Vol. 164,- P. 151-154.

36. Amrein M., Durr R., Stasiak A., Gross H., Travaglini G. Scanning tunneling microscopy of uncoated recA-DNA complexes// Science.-1989,-Vol. 243.-P. 1708-1715.

37. Aoki M., Ishimuri K.,Morishima I. Roles of negatively charged surface residues of Putidaredoxin in interactions with redox partners in P450 cam monooxygenase system.// Biochem. Biophys Acta.- 1998.-Vol. 1386,N l.-P. 157-167. (a)

38. Aoki M., Ishimuri K., Morishima I. NMR studies of Putidaredoxin: associations of Putidaredoxin with NADPH Putidaredoxin Reductase cytochrome P450 cam,//Biochem. Biophys Acta.- 1998,- Vol. 1386,№ 1,-P. 168-178.(b)

39. Aoki M., Ishimuri K., Fykada M., Takahashi K., Mori Shimo I. Isotermal Titration Colometric Stadies on the association at Putidaredoxin to NADPH Putidaredoxin Reductase and P450 cam.// Biochem. Biophys, Acta.-1998,- Vol. 1384, N1,- P. 180-188.( c )

40. Aoyama T., Nagata K., Yamasoe Y. Cytochrome b5potentiation of cytochrome P450 catalytic activity demonstrated by a vaccinia virus mediated in situ reconstituted system// Proc. Nat. Acad.

41. Sci.(USA).-1990,- Vol. 87,-P. 5425-5429.

42. Archakov A.I., Bachmanova G.I. Cytochrome P450 and Active Oxygen.- London, New York, Philadelphia, Taylor&Francis, 1990.-275 c.

43. Archakov A.I., Bachmanova G.I., Karuzina I.I., Mengazetdinov D.E. The properties of cytochrome P450 and hydroxylase activity of reconstituted proteoliposomal membranes. // Acta Biol. Med. Germ.-1979,-Vol. 38 .-P. 299-306.

44. Archakov A.I., Karyakin A.V., Skulachev V.P. Intermembrane electron transfer in mitochondrial and microsomal systems. // FEBS Lett.-1974,- Vol. 39,-P. 239-242.

45. Archakov A.I., Karyakin A.V., Skulachev V.P. Intermembrane electron transfer in the absence of added watersoluble carriers. // Biochim. Biophys. Acta.- 1975,- Vol. 408,-P. 93-100.(a)

46. Archakov A.I., Karyakin A.V., Skulachev V.P. A hypothesis on membranous proteins specialized in lateral transport. // FEBS Lett.- 1975,-Vol. 60,- P. 244-246.(b )

47. Arinc E., Rzepeki L.M., Strittmatter P. Topography of the C-tenmnus of cytochrome b5 tightly boirnd to dimyristoylphosphatidylcholine vesicles // J. Biol. Chem.-1987.- Vol. 262,N 32,-P. 15563-15567.

48. Backstrom D., Ingelman-Simdberg M., Ehrenberg A. Oxidation -reduction potential of soluble and membrane bound rabbit liver microsomal cytochrome P450LM2// Acta Chem. Scand.-1983.- Ser.B, Vol. 37,- P. 891-894.

49. Bangcharoenpaurpong O., Rizos A.K., Champion P.M. Resonance Raman Detection of Bound Dioxygen in cytochrome P450cam.// J. Biol. Chem.-1986.- Vol. 261. P. 8089-8092.

50. Barron L.D. Raman optical activity.// Adv. Infrared Raman Spectrosc.-1978.- Vol. 4.-P. 271.

51. Benecky M.J., Li T.Y., Schmidt J., Frerman F., Waiters K.L., McFarland J.T. Resonance Raman Study of Flavins and the flavoprotein Fatty Acyl Coenzyme A Dehydrogenase. // Biochemistry.-1979.- Vol. 18,- P. 3471-3476.

52. Berg O.G., von Hippel P.H. Diffusion-controlled macromolecular interaction. //Ann. Rev. Biophys. Chem.-1985.- Vol. 14,-P. 131-160.

53. Bernhard R., Kraft R., Alterman M., Otto A., Schrauber H., Gunsalus L.C., Ruckpaul K. Common Mechanism of interaction between cytochrome P450 and electron donors in monooxygenase systems// Cytochrome P450 : Biochem. and Biophys. -1991 -P.204-209.

54. Bernhard R., Kraft R., Ruckpaul K. A simple determination of the sideness of the NH-terminus in the membrane bound cytochrome P450 LM2//Biochem. Internat.-1988.-Vol. 17,-P. 1143-1150.

55. Bhattacharyya, Lipka J., Waskell L., Tollin G. Laser flash photolysis studies of the reduction kinetics of NADPH:cytochrome P-450 reductase Biochemistry.-1991.- Vol. 30,- P. 759-765.

56. Binnig G., Gerber Ch., Stoll E., Albrecht T.R., Quate C.F. Atomic resolution with atomic force microscope// Europhys. Lett.-1987.- Vol.3,N 12,-P. 1281-1287.

57. Black S. Membrane topology of the mammalian P450 cytochromes// FASEB J.-1991.- Vol. 6,- P. 680-685.

58. Black S.D., Coon M.J. Structural features of liver microsomal NADPH-cytochrome P450 reductase. Hydrophobic domain and connection region. J. Biol. Chem.- 1982,- Vol 257.-P. 5929-5936.

59. Black S., Coon M.J. Studies on the identity of the heme-binding cysteinyl residue in rabbit liver microsomal cytochrome P450 isozyme 2// Biochem. Biophys. Res. Commim.-1985.- Vol. 128,- P. 82-89.9

60. Black S., French J.S., Williams C.H., Coon M.J. Role of a hydrophobic polipeptide in the N-terminal region of NADPH-cytochrome P450 reductase in complex formation with P450 LM// Biochem. Biophys. Res. Commun.-1979.-Vol. 91-P. 1538-1539.

61. Blanck J., Smettan G., Ristau O., Ingelman-Sundberg M. Ruckpaul K. Mechanism of rate control of the NADPH-dependent reduction of cytochrome P450 by lipids in phospholipid vesicles. // Eur. J. Biochem.-1984,- Vol. 144,-P. 509-513.

62. Blanck J., Smettan, G., Zeigler, M. and Ruckpaul, K. Vechanisms of component interactions in the cytochrome P-450 LM2 reduction. //

63. Cytochrome P450, Biochemistry, Biophysics and Induction, edited by L. Vereczkey and K.Magyar (Budapest: Akademia Kiado), -1985, P.121-128.

64. Boisvert D.C., Wang J., Otwinowski Z., Horwich A.L., Sigler P.B. The 2.4 A crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL compexed with ATPyS.// Nat. Struct. Biol.- 1996.- Vol. 3. P. 170-177.

65. Bosterling B., Trudell J.R., Association of cytochrome b5 and cytochrome P450 reductase with cytochrome P450 in the membrane of reconstituted vesicules.// J. Biol. Chem.- 1982.- Vol. 257,- P. 4783-4787.

66. Bowman W.D., Spiro T.G. Normal mode analysis of lumiflavin and interpretation of resonance Raman spectra of flavoproteins. // Biochemistry.-1981.- Vol. 20,-P. 3313-3318.

67. Braig K., Otwinowski Z., Hegde R., Boisvert D.C., Joachimiak A., Horwich A.L., Sigler P.B. The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A.//Nature.-1994.- Vol. 371.-P. 578-586.

68. Brandenburg A., Polzius R., Bier F., Bilitewski U., Wagner E. Direct observation of affinity reactions by reflected-mode operation of integrated optical grating coupler.// Sensor and Actuators.-1996,- Vol. B, N30,- P. 55-59.

69. Butt H.J., Downing K.H., Hansma P.K. Imaging the membrane protein bacteriorodopsin with the atomic force microscope// Biophys. J.-1990,-Vol. 58.-P. 1473-1480.

70. Butt H.J., Guckenberger R., Rabe J. Quantitative scanning tunneling microscopy an^d scanning force microscopy of organic materials. Ultramicroscopy.-1992.- Vol. 46 P. 375-393.

71. Calabro M., Kate J.T., Holloway P.W. Self-association of cytochrome b5 in aqueous solution. Gel filtration and ultracentrifugational studies//J. Biol. Chem.-1976.- Vol. 251,-P. 2113-2118.

72. Canova-Davis E., Waskell L. The identification of the heat-stable microsomal protein required for methoxyflurane metabolism as cytochrome b5// J. Biol. Chem.- 1984,-Vol. 259, N 4,- P. 2541-2546.

73. Champaing Mock D.M. (1978), Ph. D. Dissertation,The University of Texas Health Science Center at Dallas.

74. Champion P.M., Gunsalus I.C., Wagner G. C. // J. Am. Chem. Soc.-1978.- Vol. 100.-P. 3743-3751.

75. Charotle B., Hackenbrock C.R. Lateral diffusion as a rate limiting step in mitochondria. // Advances in membrane Biochemistry and Bioenergetics./ edited by Kim H. et al.- New York, Plenum Press, 1987,1. P. 75-86.

76. Chiang J.Y.L., Coon M.J. Comparative study of two highly purified forms of liver microsomal cytochrome P450: Circular dichroism and other properties. //Arch. Biochem. Biophys.-1979.-Vol. 195.-P. 178-187.

77. Chiang J.I.L. Interaction of purified microsomal cytochrome P450 with cytochrome b5// Arch. Biochem. Biophys.-1981.- Vol. 211, N 2,- P. 662-673.

78. Chottard G, Schappacher M., Ricard I., Weiss R. Resonance Raman spectra of iron(II) cytochrome P450 model complexes:Influence of the thiolate ligand.// Inorg. Chem.-1984.- Vol. 23. P. 4557-4561.

79. Chu J.-W., Kimura T. Studies on adrenal steroid hydroxylases // J. Biol. Chem.- 1973,- Vol. 248,- P. 5183-5189.(a)

80. Chu J.W, Kimura T. Studies on adrenal steroid hydroxylases. Molecular and catalytic properties of adrenodoxin reductase (a flavoprotein). // J. Biol. Chem.- 1973,- Vol. 248,- P. 2089-2094.(b)

81. Coghlan Y.M., Vickery L.E. Site-specific mutations in human ferredoxin that assect bonding to ferredoxin reductase and cytochrome P450scc.// J. Biol. Chem. -1991- Vol.266, N 28.- P.18606-18612. (a)

82. Coon M.J., Chiang Y.L., French J.S. Chemical characterization of enzymes involved in drug metabolism. // The induction of drug metabolismedited by R.W. Estabrook, E. Eindenlaub.- Stuttgart, New York: F.K. Schatlaner Verlag, 1979.-P. 201-2IE

83. Copeland R.A., Fodor S.P.A., Spiro T.G. Surface-enhanced Raman spectra of an active flavoenzyme: Glucose oxydase and riboflavin binding protein on silver particales.//J. Am. Chem. Soc.-1984.-Vol. 106. -P. 3872-3874.

84. Daily, Strittmatter. The role of COOH-terminal anionic residues in binding cytochrome b5 to phospholipid vesicles and biological membranes// J. Biol. Chem.-198E- Vol. 256, N 4,- P.1677-1680.

85. Davies M.D., Sligar S.G. Genetic Variants in the putidaredoxin-cytochrome P450cam electrontransfer complex: identification of the residues responsible for redox -state-dependent conformers. //

86. Biochemistry.-1992.- Vol. 31.- P. 11383-11389.

87. Davydov D., Knushko T., Kanaeva I., Koen Y., Samenkova N.F., Archakov A., Hui Bon Hoa G. Interactions of cytochrome P450 2B4 with NADPH-cytochrome P450 reductase studied by fluorescent probe. // Biochimie.- 1996,- Vol. 78,- P. 734-743.

88. Dawson J.H., Andersson L.A., Sono M. Spectroscopic investigation of cytochrome P450cam-ligand complexes: Identification ofthe ligand trans to cysteinate in the native enzyme.// J. Biol. Chem.- 1982.-Vol. 257,-P. 3606-3617.

89. Dignam ID., Strobel.W. NADPH-cytochrome reductase from rat liver: purification by affinity chromatografy and characterization. // Biochem.- 1977.-Vol. 26,-P. 1116-1123.

90. Dixon D.A., Lindner D.L., Branchaud B.,Lipscomb W.N. Conformations and electronic structures of oxidized and reduced isoalloxazine. // Biochemistry.-!979,- Vol. 18.-P. 5770-5775.

91. Dufourcq J., Faucon J.F., Lussian C., Bernon R. Study of lipid-protein interactions in membrane models: intrinsic fluorescence of cytochrome b5-phospholipid complexes. //FEBS Lett.-1975.- Vol. 57,- P. 112-116.

92. Dus K. On the structure of putidaredoxin and cytochrome P-450 cam and their mode of interaction.// Adv. Exp. Med. Biol.- 1975 .- Vol. 58,-P. 287-309.

93. Dutta P.K., Nestor J., Spiro T.G. Resonance coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) spectra of flavin adenine dinucleotide, riboflavin binding protein and glucose oxidase. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1978.- Vol. 83,- P. 209-216.

94. Edstrom R.D., Meinke M.H., Yang X., Yang R., Elings V., Evans D.E Direct visualization of phosphoiylase-phosphorylase kinase complexes by scanning tunneling and atomic force microscopy.// Biophys.

95. J.-1990.-Vol. 58.-P. 1437-1448.

96. Eisenberg D., Weiss R.M., Tervvillinger T.C., Wilcox W. Hydrophobic Moments and Protein Structure. // Faraday Simp. Chem. Soc.-1982. -Vol. 17.-P. 109-120.

97. Eley D.D., Spiveg D.I. Semiconductivity in hydrated haemoglobin.// Nature.-I960,- Vol. 188. P. 725.

98. Engelman D.M., Steitz T.A., Goldman A. Identifying nonpolar transbilayer helices in amino acid sequences of membrane proteins. // Ann. Rev. Biophys.Chem. -1986,- Vol. 15,- P. 321-353.

99. Enoch H., Strittmatter P. Cytochrome b5 reduction by NADPH cytochrome P450reductase.// J Biol. Chem.-1979.- Vol. 254,- P. 89768981.

100. Estabrook R.W., Werringloer J. The microsomal enzyme system responsible for the oxidative metabolism of many drugs.//The induction of drug metabolism / Estabrook R.W., Lindenlaub E., eds.- Stuttgart-N. Y.,Schattauer F.K. Verlag, 1979,-P. 187-199.

101. Facci P., Erokhin V., Nicolini C. Scanning tunneling microscopy on a monolayer of reaction centers// Thin Solid Films.-1994,- Vol. 234- P. 403-406.

102. Fan F. and Bard A.J. STM on wet insulators: Electrochemistry or tunnelling? // Science. -1995,- Vol.270.- P. 1849.

103. French J.S., Guengerich F.P., Coon M.J. Interaction of cytochrome

104. P450, NADPH-cytochrome P450 reductase, phospholipid and substrate in the reconstituted liver microsomal enzyme system// J.Biol. Chem.-1980.-Vol.255.-P. 4112-4119. (a)

105. French J.S., Guengerich F.P., Coon M.J. Interactions of cytochrome P450 , NADPH-cytochrome P450 reductase, phospholipid and substrate in the recinstituted liver microsomal enzyme system .// J. Biol. Chem-1980.- Vol.254.- P. 5015-5019.(b)

106. Garcia R., Garcia N. Electron conductance in organic chains: why are STM experiments possible on bare biological samples?// Chem. Phys. Lett.-1990.-Vol. 173.-P. 44-50.

107. Garcia R., Saenz J.J., Soler J.M., Garcia N. Tunneling current through localized surface states// Sur. Sci.- 1987,- Vol. 181- P. 69-77.

108. Garcia R., Tamayo J., Soler J.M., Bustamante C. Physical parameters that control imaging of purple membranes with scanning tunneling microscope//Langmuir.-l 995,-Vol. 11,N6.-P. 2109-2114.

109. Geren L.M., O'Brien P., Stonehuemer L., Millrt F. Identification of specific carboxylate groups on adrenodoxin that are involved in theinteraction with adrenodoxin reductase 11 J.Biol. Chem.-1984.- Vol.259.-P. 2155-2160.

110. Geren K., Tuls J., O'Brien P., Millett F., Peterson Y.A. The mvolvment of carboxylate groups of putidaredoxin reductase// J. Biol. Chem.-1986.- Vol. 261,- P. 15491-15495.

111. Gibson G.G., Sligar S.G., Cinti D.L. Purified cytochrome P450 : spin -state control of the hemoprotein redox potential.// Biochem. Soc. Trans.-1980,-Vol. 8,N l.-P. 101-102.

112. Gibson G.G., Tamburini P.P. Spin equilibrium of purified cytochrome P450. Effect of substrate and histidine modification. // Biochemistry, Biophysics and Regulation of cytochrome P450.-Amsterdam, 1980,- P.133-136.(b)

113. Golly I, Hlavica P., Schartau W. The function role of cytochrome b5 reincorporated into hepatic microsomal fractions.// Arch. Biochem. Biophys.-1988.- Vol. 260, N 1,- P. 232-240.

114. Griffin.W., Peterson, J. A. Camphor binding by Pseudomonas putida cytochrome P450. Kinetics and thermodynamics of the reaction.// Biochemistry.-1972.- Vol. 11,-P. 4740-4746.

115. Guckenberger R., Heim M., Cevc G., Knapp H.F., Wiegrabe W., Hillebrand A. Scanning tunneling microscopy of insulators and biological specimens based on lateral conductivity of ultrathin water films. // Science.- 1994,- Vol. 266,-P. 1538-1540.

116. Gum J.R., Strobel H.W. Purified NADPH-cytochrome P450 reductase. Interaction with hepatic microsomes and phospholipid vesicles// J. Biol. Chem.-1979.- Vol. 254,- P. 4177-4185.

117. Gum J.R., Strobel H.W. Isolation of the membrane-binding peptide of NADPH -cytochrome P450 reductase// J. Biol. Chem.-198L- Vol. 256,-p. 7478-7486.

118. Gunsalus I.C. A soluble methylene hydrolase system: structure and role of cytochrome P450 iron sulfor protein components// Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.-1969.-Vol. 349,- P. 1610-1613.

119. Gunsalus EC., Meeks J.R., Lipscomb J.D., Debrunner P.G., Munck E. Bacterial monooxygenase the P450 cytochrome system.// Molecular Mechanisms of Oxygen Activation; edited by O.Hayaishi.- New York: Acad. Press,1974.-P.559-613.

120. Gunsalus I.C., Sligar S.G. Oxygen reduction by the P450 monoxygenase systems // Adv. Enzymol. Rel. Areas Mol. Biol.- 1978,-Vol. 47,- P. 1-44.

121. Gunsalus I.G, Tyson C.A., Tsai R., Lipscomb S.D. P450cam hydroxylase: substrate-effector and electron transport reactions.// Chem.-Biol. Interact.-1971.-Vol. 4,- P. 75-78.

122. Gunsalus I.C., Wagner G.C. Bacterial P-450cam methylene monooxygenase components: cytochrome m , putidaredoxin and putidaredoxin reductase. // Methods Enzymology.-1978.- Vol. 52.- P.166-188.

123. Hackenbrock C.R., Gupte S.S., Charotle B. Mitochondrial electron transport: The random collision model. // Advances in membrane Biochemistry and Bioenergetics / edited by Kim H. et al.- New York, Plenum Press, 1987,-P. 61-74.

124. Hall R.F. The roles of cytochromes P450 in the synthesis and metabolism of steroids.// Biochemistry, Biophysics and Regulation of cytochrome P450/ Gustafsson J.A. et al., eds.- Amsterdam, Elsevier/North-Holland Biomed. Press, 1980,- №1,- P. 461-477.

125. Haniu M., Armes L.G., Yasunobi K.T., Shastry B.A. and Gunsalus L.C. Amino acid sequence of the Pseudomonas putida cytochrome P-450, parts I and II.// J. Biol. Chem. -1982.- Vol.257-P. 12657-12667.

126. Hanukoglu L, Spitsberg V., Bumpus J.A., Dus K.M., Jefcoate C.R. Adrenal mitochondrial cytochrome P450scc and adrenodoxin interactions of equilibrium and during turnover// J. Biol. Chem.- 1981.-Vol. 256,- P. 4321-4328.

127. Haniu M., Jyanagi T., Legesse K., Shively J.E. Structural analysis of NADPH-cytochrome P450 reductase from porcine hepatic microsomes.// J. Biol. Chem.-1984.- Vol. 259,- P. 13709-13711.

128. Haniu M., Iyanagi T., Miller P., Amino acid sequence of

129. COOH-terminal 20kDa fragment from pig liver microsomal NADPHcytochrome P450 reductase// Biochem. Biophys. Res. Commun.-1985.-Vol. 127,- P. 94-99.

130. Hara T., Kimura T.J. Active complex between adrenodoxin reductase and adrenodoxin in the cytochrome P-450scc reduction reaction. //J. Biochem. -1989,- Vol. 105,- P. 601-605.

131. Hedegaard J., Gunsalus I.C. Mixed function oxidation. IV. An induced methylene hydroxylase in camphor oxidation. // J.Biol.Chem.-1964.-Vol.240.-P.4038-4043.

132. Heinemann F.S., Ozols J. The complete amino acid sequence of fenobarbital induced liver microsomal cytochrome P450.// J. Biol. Chem.-1983,-Vol. 258,-P. 4195-4201.

133. Hildebrandt P., Greinert R., Stier A., Taniguchi H. Resonance Raman study on the structure of the active sites of microsomal cytochrome P450 isozymes LM2 and LM4// Eur. J. Biochem.-1989.- Vol. 186,N 2. -P. 291-302.

134. Hintz M. J., Mock D.M., Peterson L.L., Turtle K., Peterson J.A. Equilibrium and kinetic studies of the interaction of cytochrome P450cam and putidaredoxin.// J.Biol.Chem.- 1982.- Vol. 251.- P. 14324-14332.

135. Hlavica P. On the function of cytochrome P450-dependent oxygenase system,// Arch. Biochem. Biophys.- 1984,- Vol. 22, N 2.- P. 600-608.

136. Hlavica P., Kellrman J., Golly I., Lehnerer M. Chemical modification of Tyr34 and Tyrl29 in rabbit liver microsomal cytochrome b5 affects interaction with cytochrome P450 2B4.// Eur.J. Biochem.-1994,- Vol. 224,- P. 1039-1046.

137. Hoh J.H., Sosinsky G.E., Revel G.-P., Hansma P.K. Structure of the extracellular surface of the gap junction of atomic force microscopy// Biophys. J.-1993.-Vol. 65-P. 149-163.

138. Holden M., Mayhew M., Buuk D, Roiiberg A., Vilker V. Probing the interactions of putidaredoxin with redox partners in camphor P450 5-monooxygenase by mutagenesis of surface residues. // J.Biol.Chem.-1997,- Vol. 272,№ 35,- P. 21720-21725.

139. Holloway P.W., Katz T.J. Effect of cytochrome b5 on the size, density, and permeability of phosphatidylcholine vesicles. // J. Biol. Chem.-1975.- Vol. 250,- P. 9002-9007.

140. Honkakoski P., Linnaba Kankkuneu A., Usanov S.A., Lang M.A. Highly homologous cytochrome P450 and cytochrome b5 a model to study protein-protein interaction in a reconstituted monooxygenase system//Biochem. Biophys. Acta. 1992,- Vol.1122,Nl.-P.6-14 .

141. Hoofsteenge J., Vereiken J.M., Weijer W.J., Beintema J.J., Wierenga R.K., Drenth J. Primary and tertiary structure studies p-hydroxybenzoate hydroxylase from Pseudomonas fluorescens. // Europ. J. Biochem.- 1980,- Vol. 113,-P. 141.

142. Horber J.K.H., Lang C.A., Hansch T.W. Scanning tunneling microscopy of lipid films and embedded biomolecules// Chem. Phys. Letts.-1988,- Vol. 145,N2.-P. 151-158.

143. Hume R., Kelly R.W., Taylor P.L., and Boyd, G.S. The catalitic cycle of cytochrome P450scc and intermediates in the conversion of cholesterol to pregnenolone,// Eur. J. Biochem.- 1984,- Vol. 140,- P. 583591.

144. Jacobson K., Ishihara A., Inman K. Lateral diffusion of proteins in membranes. // Ann. Rev. Biochem.-1987.- Vol. 49- P. 163-176.

145. Jansson I., Schenkman J.B. Studies on three microsomal transfer enzyms systems.// Arch. Biochem. Biophys.-1977.- Vol. 178,- P. 89-107.

146. Jansson I., Tamburini F.P., Favreau L.V. The interaction of cytochrome b5 with four cytochrome P450 enzymes from the untreated rat//Drug Metab. Disp.-1985.- Vol.13.-P. 453-458.

147. Jefcoat C.R. Cytochrome P450 enzymes in sterol biosynthesis and metabolism.// In Cytochrome P-450. Structure, Mechanism, Biochemistry, edited by P.R. Ortiz de Montellano (New York : Plenum Press), -1986-P.387-428.

148. Jung C., Hui Bon Hoa G., Schroeder K.L., Simon M., Doucet J.P. Substrate analogue induced changes of the CO-stretching mode in thecytochrome P450cam-carbon monooxide complex.// Biochemistry.-1992,-Vol. 31.- P. 12855-12865.

149. Karuzina 1.1., Zgoda V.G., Kuznetsova G.P., Samenkova N.F. Archakov A.I. Heme and apoprotein modification of cytochrome P4502B4 during its oxidative inactivation in monooxygenase reconstituted system.

150. Free Rad. Biol. Med.-1999.- Vol. 26,- P. 620-632.

151. Katagiri M., Ganguli B.N., Gunsalus I.C. A soluble cytochrome P-450 functional in methylene hydroxylation. // J.Biol.Chem.- 1968,- Vol. 243.-P. 3543-3546.

152. Katagiri M., Takikawa O., Sato H., Suhara K. Formation of a cytochrome P-450scc-adrenodoxin complex. // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1977,- Vol. 77.- P. 804-809.

153. Keller D., Bustamante C., Keller R.W. Imaging of single uncoated DNA molecules by scanning tunneling microscopy// Proc. Natl. Acad. Sci. (USA).-1989,- Vol. 86 P. 5356-5360.

154. Kido T., Kimura T. The formation of binary and ternary complexes of cytochrome P 450scc with adrenodoxin and adrenodoxin reductase complex: The implication of ACTH fonction.// J. Biol. Chem.- 1979.- Vol. 254,-P. 11806-11815.

155. Kitagawa T., Nishina Y., Kyogoku Y., Yamano T., Ohishi., Takai-Suzuki A., Yagi K. Resonance Raman spectra of carbon-13 and nitrogen-15-labeled riboflavin bound to egg-white flavoprotein.// Biochemistry.-1979,- Vol. 18,- P. 1804-1808.

156. Kitagawa T., Ozaki Y., Kyogoku T. Resonance Raman studies on the ligand-iron interactions in hemoproteins and metallo-porphyrins. Q\1

157. Adv. Biophys.-1978.- Vol.11-P. 153-196.

158. Kleinfeld A.M., Lukacovic M.F. Energy transfer study of cytochrome b5 using antroxy fatty acid membrane probes// Biochemistry.-1985,-Vol. 24,-P. 1883-1890.

159. Knapp J.A., Dignam H.W., Strobel H.W. NADPH-cytochrome P-450 reductase: circular dichroism and physical properties.// J. Biol. Chem. -1977,- Vol.252.-P.437-443.

160. Kondo K, Tajima S., Sato R., Narita K. Primary structure of the membrane-binding segment of rabbit cytochrome b5. //J. Biochem. (Tokyo). -1979,- Vol. 86.-P. 1119-1128.

161. A.Y., Levin W. The resolution and reconstitution of the liver microsomal hydroxylation system.// Biochim. Biophys. Acta.-1974.- Vol. 344,-P. 205-240.

162. A.Y., Levin W., Kuntzman R. Reconstituted liver microsomal enzym system that hydroxylates of drugs, other foreign compounds and endogenous substrates. Effect of detergents./^Biochem. Biophys. Res. Commun.-1974.- Vol. 60,- P. 266-272.(a)

163. A.Y., West S.B., Vore D., Levin W. Role of cytochrome b5 in hydroxylation by a reconstituted cytochrome P450-containing system. // J.Biol. Chem.-1974.- Vol. 249,-P. 6701-6709.(c)

164. M.L. Ludwig, R.M. Burnett, G.D. Darling, S.R. Jordan, D.S. Kendall, W.W. Smith. The Enzymes. -N.Y., Acad. Press, 1975. 50 p.

165. Mancera P.L. The influence of salt on hydrophobic effects. Proc. 3rd Internal Conf. Mol. Biol. Vienna, 1999,- P. 92/P36

166. Mande S.C., V.Mehra, B.R.Bloom, W.G.Hol. Structure of the heat shock protein chaperonin 10 of Mycobacterium leprae.// Science.-1996,-Vol. 271,- P.203-207.

167. Marcus R.A., Sutin N. Electron transfer in chemistry and biology. // Biochim. Biophys. Acta. 1985,- Vol. 811,- P. 265-322.

168. Massashi Unno, Hideo Sclivmada, Yoko Toba, Ryu Makino, Yuzuru Ishimura. Role of Arg112 of cytochrome P450 cam in the Electron Transfer from Reduced Putidaredoxin.//' J.Biol.Chem.-1986.- Vol. 271,- P. 17869-17874.

169. Masters B.S.S., Prough R.A., Kamin H. Properties of the stable aerobic half-reduced states of NADPH-cytochrome c reductase. // Biochemistry.-1985,- Vol.14.- P. 607-613.

170. Mathews F.S., Czerwinski E.W. Cytochrome b5 and cytochrome b5 reductase from a chemical and X ray difraction view point.// The Enzymes of Biological Membrane / ed. A. Marttonozi.- N.Y., Plenum Press, 1976,- Vol.4.-P. 143-197.

171. Mathews F.S., Levine, M., Argos.P.' The structure of calf liver cytochrome b5 at 2.8 A resolution,// Nature Rev. Biol.- 1971,- Vol. 233,-P. 15-17.

172. Mathews F.S., Levine, M. Argos.P. Three -dimentional fourier synthesis of calf liver cytochrome b5 at 2.8 A resolution.// J. Biol. Chem.-1972.-Vol.64rP. 449-464.

173. Matsubara T, Baron J., Peterson L.L., Peterson J.A. NADPH -cytochrome P450 reductase. //Arch. Biochem. Biophys.-1976.- Vol. 172.-P. 463-469.

174. Mayhew S.G., Ludwig M.L. The Enzymes.-N.Y.: Acad. Press,1975,-421p.

175. Michel B., Travaglini G., Rohrer H., Soachim C., Amrein M. Images of cristalline alkanes obtained with scanning tunneling microscopy;/ Zeitschrift fur Physic B.-1989.- Vol. 16.- P. 99-105.

176. Miwa G.T., Lu A.Y.H. Studies of the stimulation of cytochrome P450-dependent monooxygenese activity by dilauroylphosphatidylcholin.// Arch. Biochem. Biophys.-1981.- Vol. 211.- P. 454-458.

177. Miwa G.T., Lu A.Y.H. The association of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductasein phospholipid membranes.// Arch. Biochem. Biophys.- 1984,- Vol. 234,-P. 161-166.

178. Mou J., Sheng S., Ho R., Shao Z. Chaperonics GroEL and GroES: View from Atomic Force Microscopy. // Biophys. J.-1996.- Vol. 71.1. P.2213-2221. (a)

179. Mou J., Czajkovsky D.M., Shao Z. Gramicidin A aggregation in supported gel state phosphatidylcholine bilayer// Biochemistry.-1996,-Vol. 35.-P. 3222-3226.(b)

180. Muller D.J., Schabert F.A., Buldt J., Engel A. Imaging purple membranes in aqueous solutions at sub-nanometer resolution by atomic force microscopy// Biophys. J.-1995.- Vol. 68.-P. 1681-1686.

181. Muller-Enoch D., Chirchill P., Fleisher S., Guenderich F.P. Interaction of liver microsomal cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase in the absence and presence of lipid. // J. Biol. Chem.-1984,- Vol. 259,-P. 8174-8182.

182. Nadler S.G., Strobel H.W. Role of electrostatic interaction in the reaction of NADPH-cytochrome P450 reductase with cytochrome P45Q// Arch. Biochem. Biophys.-1988.- Vol. 261,- P. 418-629.

183. Nassar A-E.F., Zhang Z., Chynvvat V., Frank M.A., and Rusling J.E. Orientation of Mioglobin in Cast Multibilayer Membranes of Amphipphilic Molecules. //J. Phys. Chem. -1995. Vol. 99.-P. 1101311017.

184. Nelson D.R., Strobel H.W. On the membrane topology of vertebrate cytochrome P450 proteins// J. Biol. Chem.-1988.- Vol. 263,- P. 6038-6050.

185. Nickerson D.P., Wong L.L. The dimerization of Pseudomonas putida cytochrome P450cam: practical consequences and engineering of monomelic enzyme.// Protein Engineering.- 1997.- Vol.10, № 12,- P.1357-1361.

186. Nishina Y., Kitagava T., Shiga K., Horiike K., Matsumara Y., Yamano Y. Resonance Raman spectra of riboflavin and its derivatives in the bound state with egg riboflavin binding proteins. //J. Biochem. (Tokyo).- 1978,- Vol. 84,- P. 925-932.

187. Nisimoto Y., Otsuka-Miirakami. Cytochrome b5, cytochrome c, and cytochrome P-450 interactions with NADPH-cytochrome P-450 reductase in phospholipid vesicles. // Biochemistry -1988.- Vol.27,N 16.-P.5869-5876.

188. Noshiro M., Harada N., and Omura T. Immunological study on the route of electron transfer from NADH and NADPH to cytochrome P450 of liver microsomes. // J. Biochem.- 1980.- Vol. 88.- P. 1521-1535.(a)

189. Omura T., Takesue S. A new method for simultaneous purification of cytochrome b5 and NADH-cytochrome b5 reductase from rat liver microsomes.// J. Biochem.-Vol. 67 -249-257.

190. Omata Y., Aibara K., and Ueno Y. Conformation between the substrate -binding side and heme of cytochrome P450 studied by excitation energy transfer. // Biochem. Biophys. Acta.- 1987,- Vol. 912. -P. 115-123.

191. Omata Y., Robinson R.C., Gelboin H. V., Pincus M.R. and Friedman F.K. Specificity of the cytochrome P-450 interaction with cytochrome b5. // FEBS Letters.-1994,- Vol.346.- P.241-245.

192. Omata Y., Ueno Y., Aibara K. Conformational change of cytochrome P450 indicated by the measurement of fluorescence energy transfer. //Biochem. Biophys. Acta.- 1986,- Vol. 870,-P. 392-400.

193. Omura T., Sato R. The carbon monoxide binding pigment of liver microsomes. 1.Evidence for its hemoprotein nature. 2.Solubilization, purification and properties. // J.Biol.Chem.- 1964,- Vol. 239,- P. 23702385.

194. Oprian D.D., Coon MJ. Reactions of oxygenated P450LM4. // Microsomes, Drug Oxidations, and Drug Toxicity, / edited by R.Sato , R.Kato.- Tokyo, New York, Japan Scientific Soc. Press Wiley-Interscience, 1982,-P. 139-146.

195. Orme Johnson N.R., Light D.R., White-Stevens R.W., Orme-Johnson W.H. Steroid binding properties of beef adrenal cortical cytochrome P450. Which catalyses the conversion of cholesterol into pregnenolone// J. Biol. Chem.-1979.- Vol. 254,- P. 2103-2111.

196. Ozaki Y,, Kitagawa T., Kyogoku Y., Shimada H., lizuka T., Ishimura Y. An anomaly in the resonance Raman spectra of cytochrome P-450cam in the ferrous high-spin state. // J. Biochem. (Tokyo).-1976,- Vol. 80.- P. 1447-1451.

197. Ozols J., Stritmatter P. The amino acid sequence of cytochrome b5.// J. Biol. Chem.-1968.- Vol. 243,- P. 3367-3375.

198. Pai E.F., Schulz G.E. Flavins and flavoproteins. // Devel Biochem.-1982,- Vol. 21,-P. 3.

199. Peterson J. Camphor binding by Pseudomonas Putida cytochrome P450 // Archives of Biochem. and Biophvs.- 1971,- Vol. 144,- P. 678-687.

200. Peterson J. A., Ishimura I.Y., Griffin. B.W. Pseudamonas putida cytochrome P450: Characterization of oxygenated form of the gemoprotein.// Arch. Biochem. Biophys.-1972,- Vol. 149,- P. 197-208.

201. Peterson J.A., O'Keeffe, Matsubara T., Estabrook R.W. Temperature dependence of cytochrome P450 reduction. A model for

202. NADPH cytochrome interactions.// J. Biol. Chemistry.-1976,- Vol. 251.-P. 4010-4016.

203. Pochapsky T.C., Lyons T.A., Kazanis S., Arakaki T., Ratnaswamy. A structure-bassed model for cytochrome P450cam-putidaredoxin interactions.//Biochemie,- 1996,-Vol. 78.-P. 723-733 .

204. Pompon D., Coon M.J. On the mechanism of activation of cytochrome P450 : Oxydation and reduction of the ferrous dioxygen complex of liver microsomal cytochrome P450 by cytochrome b5// J. Biol. Chem.- 1984,- Vol. 259,- P. 15377-15385.

205. Poulos T.L. The crystal structure of cytochrome P450cam.// In Cytochrome P450cam : Structure, Mechanism and Biochemistry./ edited by P.R.Ortiz de Montellano.- New York, London, Plenum Press,1986,- P. 505-523.

206. Poulos T.L. and Finzel B.C. Heme enzyme structure and function. //Peptide and Protein Rev.- 1984,- Vol. 4,- P. 115-171.

207. Poulos T.L., Finzel B.C., Gunsalus I.C., Wagner G.G, Kraut J. The 2,6A-crystal structure of Pseudamonas putida cytochrome P450cam. // J. Biol. Chem.-1985.- Vol. 260,- P. 16122-16130.

208. Pernios T.L., Finzel B.C. and Howard A.J. Crystal structure of substrate-free Pseudomonas Putida cytochrome P45Gcam.// Biochemistry-1986,-Vol. 25,-P. 5314-5322.

209. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam.// J. Mol. Biol.- 1987,- Vol. 195,- P. 687-700.

210. Poulos T.L., Perez M., Wagner G.G. Preliminery crystallographic data on cytochrome P450cam.// J. Biol. Chem.-1982.- Vol. 257,- P. 1042710429.

211. Primo C. , Deprez E., Sligar S.G., Hui Bon Hoa G. Origin of the photoacoustic signal in cytochrome P-450cam: role of the Argl86 -Asp251 Lysl78 bifurcated salt bridge// Biochemistry.-1997,- Vol. 36,- P. 112-118.

212. Radmacher M., Fritz M., Hansma H.G., Hansma P.K. Direct observation of Enzyme Activity with the Atomic Force Microscopy. //Science.-1994.- Vol. 265, N 9. P. 1577-1579.

213. Microsomes, Drug Oxidations, and Drug Toxicity / edited by R.Sato , R.Kato.- Tokyo, New York, Japan Scientific Soc. Press Wiley-Interscience, 1982,- P. 207-208.

214. Ramsden J.J., Bachmanova G.I., Archakov A.I. Immobilization of proteins to lipid bilayers. //Biosensor and Bioelectronics.-1996.- Vol.11,-P. 523-528.

215. Robinson N.C., Tanford C. The binding of deoxycholate, Triton X-100, sodium dodecyl sulfate, and phosphatidylcholine vesicles to cytochrome b5. // Biochemistry.-1975,- Vol.14.- P. 369-378.

216. Rogers M.J., Strittmatter P. The binding of reduced nicotinamide adenine cytochrome b5 reductase to hepatic microsomes. // J. Biol. Chem.-1974.- Vol. 249,- P. 5565-5569.(a)

217. Rogers M.J., Strittmatter P. Evidence for random distribution translational movement of cytochrome b5 in endoplasmic reticulum. // J. Biol. Chem.- 1974,- Vol. 249,- P. 895-906.(b)

218. Roome P.W., Peterson J. A. The oxidation of reduced putidaredoxin reductase by oxydized putidaredoxin.//Arch. Biochem. Biophys.-1988.-Vol. 266.-P. 41-50.

219. Roome P.W., Philley J.C., Peterson J.A. Purification and properties of putidaredoxin reductase.// J. Biol. Chem.-1983.- Vol. 258,- P. 25932598.

220. Roseman M.A., Holloway P.W7., Calabro M.A., Thompson T.E. Exchange of cytochrome b5 between phospholipid vesicles. //J. Biol. Chem.-1977.- Vol. 252,- P. 4842-4849.

221. Rosenberg. Electrical conductivity of proteins.// Nature.-1962,- Vol. 193-P. 364-365.

222. Ruckpaul K., Rein H. //Cytochrome P450, Berlin, Academie Verlag, 1984,-P.l 11-162,405.

223. Ruckpaul K., Rein H., Blanck J., Coon M.J. Molecular mechanisms of interactions between phospholipids and liver microsomal cytochrome P450LM2. // Acta Biol. Med. Germ.- 1982,- Vol. 41.- P. 190-203.

224. Saffrnan P.G., Delbrück M. Brownian motion in biological membranes. // Proc. Nath. Acad. Sei. USA- 1975,- Vol. 12.- P. 31113113.

225. Sakaguchi M., Mihara K., Sato R. A short amino-terminal segment of microsomal cytochrome P450 functions both as an insertion signal and as a stop transfer sequence// EMBO J.-1987.- Vol. 6,- P. 2425-2431.

226. Sato R. Distribution and physiological function.// Cytochrome P450, edited by R. Sato and T. Omura (Kodansha L.T.D.- Acad. Press, N. Y.Tokyo),-1978.-P.23-35.

227. Sato R., Imai Y., Taniguchi H. Reaction mechanism of liver microsomal cytochrome P450 as studied by reconstituted techniques. The induction of drug metabolism./ eds Estabrook R.W. Stuttgart, N.Y.,1979.-P. 213-224.

228. Schenkman J.B., Voznesensky A.I., Arcbakov A.I. Interaction between NADPH-cytochrome P450 CYP2B4.// Cytochrome P450 : Biochemistry and Biophysics, Moscow, -199L- P.240-247.

229. Schenkman J.B., Voznesensky A.I., Jansson I. Influence of ionic strength on the P450 monooxygenase reaction and role of cytochrome b5 in the process. H Arch. Biochem. Biophvs.-1994.- Vol. 314 .- P. 234-241.

230. Schmidt J., Coudron P., Thompson A.W., Waiters K.L., McFarland J.T. Hydrogen bonding between flavin and protein: a resonance Raman study. // Biochemistry.-1983.-Vol. 22,- P. 76-84.

231. Schmidt J., Lee M.-Y., McFarland J.T. Resonance raman studies on 8-mercaptoriboflavm. /7 Arch. Biochem. Biophys.-1982.- Vol. 215,- P.22.27.

232. Schopfer L.M., Morris M.D. Resonance Raman spectra of flavin derivatives containing chemical modifications in positions 7 and 8 of the isoalloxazine ring.//Biochemistry.-1980.- Vol. 19,- P. 4932-4935.

233. Schulz G.E., Schrimer R.H., Pai E.F J. FAD-binding site of glutathione reductase. // J. Mol. Biol.-1982.- Vol. 160,- P. 287-308.

234. Sevrukova I.F., Kanaeva LP., Koen Ya.M., Samenkova N.F., Bachmanova G.I, Archakov A.I. Catalitic activity of cytochrome P4501A2 in reconstituted system with emulgen 913. // Arch. Biochem. Biophys.- 1994,- Vol. 311.-P. 133-143.

235. Sevrioukova I.F., Li H., Zhang H., Peterson J.A., Poulos T.L. Structure of a cytochrome P450 -redox partner electron-transfer complex. // Proc. Natl. Acad. Sci.(USA).-1999.- Vol. 96. P. 1863-1868.

236. Sevrioukova IF., Peterson.NADPH-P 450 reductase: Structural and functional comparisons of the eukaryotic and prokaryotic isoforms. // Biochemie.- 1995,- Vol. 77,- P. 562-572.

237. Seybert D.W., Lambeth J.D., Kamin H. The participation of a second molecule of adrenodoxin in cytochrome P450 catalized 11-hydroxylation// J. Biol. Chem.- 1978,- Vol. 253,- P. 8355-8358.

238. Seybert D.W., Lancaster J.R., Lambeth J.D., Kamin H. Participation of the membrane in the side chain cleavage of cholesterol: Reconstitution of cytochrome P450scc into phospholipid vesicles.//' J. Biol. Chem.- 1979,- Vol.254.- P. 12088-12098.

239. Shimizu T., Nazawa T., Hatano M., Satake H., Imai Y., Hashimoto S., Sato R. Circular dichroism spectra of purified cytochromes P-450 from rabbit liver microsomes. // Biochim. Biophys. Acta. 1979.-Vol.579. -P.122-133.

240. Shimizxi T., Sadeque A.J.M., Sadeque G.N., Tataishi T., Ishiguka M., Hiroya K., Hatano M., Fuljii-Kuriyama Y. Protein engineering of cytochrome P450d (P4501A2)// Cytochrome P450 : Biochemistry and Biophysics.- Moscow, 1991,- P.45-50.

241. Shumko R.M., Gill R.,Wood S., De Meyts P.,Ogawa Y., Heding A. // 4-th European BIAsymposium on Biomolecular Interaction Analysis: Abstracts.- Heidelberg (Germany), 1994,-P. 24.

242. Sligar S.G., (1975), Ph. D. Dissertation,The University of Illinois.

243. Sligar S.G., Debranner P.G., Lipscomb I.D., Namtvett M.J., Gnnsalus I.C. Role of the putidaredoxin COOH-terminus in P-450cam hydroxylations. // Proc. Natl. Acad. Sci.( USA)- 1974,- Vol.71.- P. 3906-3910.(a)

244. Sligar S.G., Debrunner P.G., Lipscomb J.D., Gunsalus I.C. Superoxide anion production by the autooxidation of cytochrome P-450cam.// Biochem. Biophys. Res. Commun. -1974,- Vol.6l-P.290-296 (b)

245. Smith D.P.E., Bryant A., Quate C.F., Rabe J.P., Gerber Ch., Swalen J.D. Images of a lipid bilayer at molecular resolution by scanning tunneling microscopy// Proc. Natl. Acad. Sei. (USA).-1987.- Vol. 84,- P. 962-972.

246. Sono M., Dawson J.H. Formation of low spin complexes of ferric cytochrome P450cam with anionic ligands. Spin state and ligand affinity comparison to mioglobin.// J. Biol. Chem.-1982.- Vol. 257,- P. 5496-5502.

247. Spatz L., Strittmatter P. A form of cytochrome b5 that contain on additional hydrophobic sequence of 40 amino acid residues.// Proc. Natl. Acad. Sei. (USA).-1971,- Vol. 68,- P. 1042-1046.

248. Spiro T.G. Resonance Raman studies of hemocyanin hemoglobin and flavodoxin// Proeeding of 7th International Conference on Raman

249. Spectroscopy.- Amsterdam.1980.- p. 510-512.

250. Spiro T.G., Barker J.M. Protein control of porphyrin conformation. Comparison of resonance Raman spectra of heme proteins with mesoporphyrin IX analogues. // J. Am. Chem Soc.-1976.- Vol. 98,- P. 5482-5489.

251. Spiro T.G., Stong J.D., Stein P. Porphyrin core expansions and doming in heme proteins. New evidence from resonance Raman spectra of six-coordinate high-spin iron (III) hemes. // J. Am. Chem. Soc.-1979.-Vol. 101.-P. 2648.

252. Spong J.K., Mizes H.A., LaComb Jr. L.J., Dovek M.M., Frommer J.E., Foster J.S. Contrast mechanism for resolving organic molecules with tunneling microscopy.// Nature (Lond.)-1989.- Vol. 338. P. 137-139.

253. Stayton P.S., Sligar S.G. The cytochrome P-450cam binding surface as defined by site-directed mutagenesis and electrostatic modeling. // Biochemistry.- 1990. Vol. 29 .- P. 7381-7386.

254. Strittmatter P., Rogers M.G. Apparent dependence of interactions between cytochrome b5 and cytochrome b5 reductase upon translational diffusion in dimyristoyllecitine liposomes. // Pro. Natl. Acad. Sci. US At 1975,- Vol. 12.- P. 2658-2661.

255. Strobel H.W., Dignam j.d., Gum J.R. NADPH-cytochrome P450 reductase and its role in the mixed function oxidase reactions.// Pharm. Ther. A.-1980.- Vol.8.- P. 525-537.

256. Sullivan M.R., Holloway P.W. The binding of cytochrome b5 to phosphatidylcholine vesicle. // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1973,-Vol. 54.-P. 808-815.

257. Tamburini P.P., Schenkman J.B. Differences in the mechanism of functional interaction between NADPH-cytochrome P450 reductase and its redox partners.// Molecular Pharmacology.-1986.- Vol. 30 .- P. 178185.

258. Tamburini P.P. and Schenkman J.B. Purification of homogenity and enzymological characterization of a functional covalent complex composed of cytochromes P450 isozyme 2 and b5 from rabbit liver.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1987-Vol.84rBll-15.

259. Tamburini P.P., White P., Schenkman J.B. Chemical charecterization of protein-protein interactions between cytochrome P450 and cytochrome b5.// J.Biol.Chem.-1985.- Vol.260.-P4007-4015.

260. Tanaka M., Haniu M., Yasunobu K.T., Kimura T. The amino acid sequence of bovin adrenodoxin.// J. Biol. Chem.- 1973,- Vol. 248,- P. 1141-115.

261. Taniguchi H., Imai Y., Sato R. Protein-protein and lipid-protein interactions in a reconstituted liver microsomalmonooxygenase system// Microsomes, Drug Oxidation and Chemical Carcinogenesis / Eds. Coon M.J. et al. N.Y.,1980.- P.537-540.

262. Taniguchi H., Imai Y., Sato R. Role of the electron transfer system in microsomal drug monooxygenase reaction catalyzed by cytochrome P450.// Arch. Biochem. Biophys.-1984.- Vol.232.- P. 585596.

263. Taniguchi T., Kimura T. Studies on nitrotyrosine -82 and aminotyrosine -82 derivatives of adrenodoxin reductase.// Biochemistry.-1976,-Vol.15.-P. 2849-2853.

264. Tang S. and McChie. Imaging Individual Chaperonin and Immunoglobulin G Molecules with Scanning Tunneling Microscopy Langmuir. 1996.-V.12.-C. 1088-1093.

265. Tang S.L., McGhie A.G., Suna A. Molecular-resolution imaging of insulating macromolecules with the scanning tunneling microscope via a nontunneling, electric-field-induced mechanism// Phys. Rev. B.-1993.-Vol. 47.-P. 3850-3856.

266. Thompson G., Shen J., Connolly, Cooper J. Gold as a substrate to image-immobilized biomolecules by scanning tunneling microscopy: Part l.//Nanobiology.- 1993. Vol. 2.-P. 45.

267. Tsuprun V.L., Myasoedova K.N., Berndt P. Quaternarystructure of the liver microsomal cytochrome P450.// FEBS lett-1986.-Vol. 205.-P. 35-40.

268. Tuckey R.C., Kamin H. The oxyfero complex of adrenal cytochrome P450scc. Effect of cholesterol and intermediates on its stability and optical characteristics. // J. Biol. Chem.-1982.-Vol. 257.-C. 9309-9314.

269. Tuls J., Geren L., Lambeth J.D., and Mullet F. The use of specific fluorescence probe to study the interaction of adrenodoxin with adrenodoxinreductase and cytochrome P450scc. // J. Biol. Chem.-1987.-Vol. 262,- P. 10020-10025.

270. Turko I.V., Adamovich I.B., Kirillova N.M., Usanov S.A., Chashchin V.L. Cross-linking studies of the cholesterol hydroxylation system from bovine adrenocortical mitochondria. // Biochim. Biophys.

271. Acta.- 1989,- Vol. 996,- P. 37-42.

272. Tyson, C.A., Lipscomb J.D., Gunsalas I.C. The roles of putidaredoxin and cytochrome P450cam in methylene hydroxylation.// J. Biol. Chem.-1972.- Vol.247.- P. 5777-5784.

273. Unno M., Shimada H., Toba Y., Makino R., Ishimura Y. Role of Arg112 of cytochrome P450cam in the electron transfer from reduced putidaredoxin. //J. Biol. Chem.-1996.-Vol.271.-P. 17869-17874.

274. Usanov S.A., Turko I.V., Chashchin V.L., Akhrem A.A. Cross-linking studies of steroidogenic electron transfer: Covalent complex of adrenodoxin reductase with adrenodoxin// Biochim. Biophys. Acta.-1985,- Vol. 832,-P. 288-296.(b)

275. Uvarov V.Yu., Leshenko A.V., Rukavishnikov I.G., Dzhuzenova Ch.S., Archakov A.I. Effect of microenvironment and intermolecularcross-linking on the tertiary structure of cytochrome P450LM2. 11 Biokhimiya. -1988,-Vol. 53,-P. 1433-1438.(a)

276. Uvarov V.Yu, Tretiakov V.E., Leshenko A.V., Rukavishnikov LG., Dzhuzenova Ch.S., Tretiakova L.Z., Archakov A.I. Effect of microenviroment on the tertiary structure of cytochrome P450LM2// Eur. J. Biochem.-1990.- Vol. 181,- P. 391-396.(b)

277. Vatsis K.P., Theoharides A.D., Kupfer D., Coon M.J. Hydroxylation of prostaglandins in inducible isozymes of rabbit liver microsomal cytochrome P450 : Participation of cytochrome b5. // J. Biol. Chem.-1982.- Vol. 257,- P. 11221-11229.

278. Vermilion J.L., Ballon D.P., Massey V., Coon M.J. Separate roles for FMN and FAD in catalysis by liver microsomal NADPH -cytochrome P450 reductase/7 J. Biol. Chem.-1981.- Vol.256,N L- P. 266-277.

279. Vermillion J.L., Coon M.J. Highly purified detergent-solubilized NADPH-cytochrome P450 reductase from phenobarbital induced rat liver microsomes.// Biochem. Biophys. Res. Commun.-1974.- Vol. 60,- P. 1315-1322.

280. Vickery L.E. Molecular recognition and electron transfer in mitochondrial steroid hydroxylase systems. // Steroids.- 1997,- Vol.62.- P. 124-127.

281. Visser A.J.W.G., Vervoot J., O Kane D.J., Lee J., Carreira L.A. Raman spectra of flavin bound in fiavodoxins and in other flavoproteins.// Eur. J. Biochem.-1983.- Vol. 131-P. 639-645.

282. Voger F., Lumper L. Complet structure of the hidrophilic domain in the porcin NADPH-cytochrome P450 reductase// J. Biochem.-1986.-Vol. 236,-P. 871-878.

283. Voznesensky A.I., Schenkman J.B. The cytochrome P450 2B4 -NADPH-cytochrome P450 reductase electron transfer complex is not formed by charge-pairing// J. Biol. Chem.- 1992,- Vol. 267, N 21.- P. 14669-14676.

284. Voznesensky A.I., Schenkman J.B. Quantitative analyses of electrostatic interactions between NADPH-cytochrome P450 reductase and cytochrome P450 reductase and cytochrome P450 enzymes // J. Boil. Chem.-1994.-Vol. 269,-P. 15724-15731.

285. Wada A., Waterman M.R. Identification by site-directed mutagenesis of two lysine residues in cholesterol side chain cleavage cytochrome P450 that are essential for adrenodoxin binding.// J. Biol Chem. -1992. -Vol. 267.-P 22877-22882.

286. Wang M. Roberts, D.L. Paschke R., Shea T.M., Masters B.S.S., Kim J.J.P. Three- dimensional structure of NADPH-cytochrome P450 reductase: prototype for FMN- and FAD containing enzymes. // Proc.Nattl. Acad. Sci. (USA).- 1997,- Vol. 94,- P. 8411-8416.

287. Weisenhom A.L., Drake B., Prater C.B., Gould S.A.C., Hansma P.K., Ohnesorge F., Egger M., Heyn S.-P., Gaub H.E. Immobilized proteins in buffer solution at molecular resolution by atomic forcemicroscopy//Biophys. J.- 1990,- Vol. 58- P. 1251-1258.

288. Worcester D.L., Kim H.S., Miller R.G., Bryant P.J. Imaging bacteriorodopsin lattices in purple membranes with atomic force microscopy// J. Vac. Sci. Technol. A.-1990.-Vol. 8, N 1. P. 403-405.

289. Wu F.F., Vergeres G., Waskell L. Kinetics of the reduction of cytochrome b5 with mutations in its membrane -binding domain// Arch. Biochem. Biophys.-1994,- Vol. 308, N 2.- P. 380-386.

290. Yamada H., Hirata Y., Miyake J. Atomic force microscopy studies of photosynthetic protein membrane Langmuir-Blodgett films// J. Vac. Sci Technol. A .- 1995.- Vol. 13, N 3. P. 1742-1745.

291. Yang C.S., Baskin L.B., Wu N.S. Lateral mobility and organization of microsomal proteins// Abstr. 5-th Int. Symp. on Microsomes and drug oxidations.- Tokyo, Japan, 1981.-P. 6.

292. Yang J., Mou J., Shao Z. Structure and stability of pertussis toxin studied by in situ atomic force microscopy// FEBS Lett.-1994,- Vol. 338.-P. 89-92.

293. Yang J., Tamm L.K., Tillack T.H., Shao Z. New approach for atomic force microscopy of membrane proteins// J. Mol. Biol.-1993,- Vol. 229,-P. 286-290.

294. Yasukochi Y, Masters B.S.S. Some properties of a detergent-solnbilized NADPH-cytochrome c (cytochrome P450) reductase: Purified by biospecific affinity chromatography.// J. Biol. Chem.- 1976,- Vol. 251.-P. 5337-5344.

295. Yasukochi T., Okada O., Hata T., Sagara Y., Sekimura K., Hotiuchi T. Putative functions of phenylalanine-350 of Pseudomonas putida cytochrome P-450cam.// Biochem. Biophys Acta- 1994,- Vol.1204, № 1,-P. 84-90.

296. Yeung D., Gill A., Maule C.H., Davies R.J. Detection and quantification of biomolecular interactions with optical biosensor. //Trends in Analytical Chemistry. -1995.-Vol.14,- P. 49-56

297. Yuan J.Y., Shao Z., Gao C. Alternative method of imaging surface topologies of nonconducting bulk specimens by scanning tunneling microscopy// Phys. Rev. Lett-1991.- Vol. 67,- P. 863-866.312

298. Yuan J.Y., Shao Z. Simple model of image formation by scanning tunneling microscopy of non-conducting materials// Ultramicroscopy.-1996,-Vol. 34.-P. 223-226.

299. Yun Ch.-Ho., Ahn T. and P.Guengerich. Conformational Change and Activation of cytochrome P450 2B1 induced by salt and phospholipid. // Arch. Biochem. Biophys. -1998.-Vol.356.-P. 229-238.

300. Zhang J., Chi Q., Dong S., Wang E. SIM of folded and unfolded haemoglobin molecules electrochemicallya deposited on highly oriented pyrolytic graphite// J. Chem. Soc. Faraday Trans.-1995.-Vol. 91,N 10,- P. 1471-1475.

301. Zhang B. Wang E. In situ STM study of cytochrome c adsorbed on HOPG electrode surface.// Probe Microscopy.- 1997,- Vol. 1,- P. 57-64.(a)

Информация о работе

Иванов, Юрий Дмитриевич
доктора биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Мониторинг образования и распада комплексов водорастворимого и мембранных цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в реальном времени - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Мониторинг образования и распада комплексов водорастворимого и мембранных цитохромов Р450 с их редокс-партнерами в реальном времени - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы