Структура гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии

Каюмов, Айрат Рашитович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структура гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии"

На правах рукописи

КАЮМОВ АЙРАТ РАШИТОВИЧ

СТРУКТУРА ГЕНА СУБТИЛИЗИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ BACILLUS INTERMED/US И РЕГУЛЯЦИЯ ЕГО ЭКСПРЕССИИ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань -2006

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии ГОУВПО Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Шарипова Маргарита Рашидовна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, с.н.с. Коксин Владимир Петрович (РЦПБ СПИД, Казань)

Доктор биологических наук, с.н.с. Чернова Ольга Александровна (КИББ РАН, Казань)

Ведущая организация: Институт им. Белозерского МГУ (г. Москва)

Защита диссертации состоится 2006 г. в /5 часов на

заседании Диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете, 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, 18, главное здание, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан_ 2У 2006 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета, доктор биологических наук, профессору З.И.Абрамова

Актуальность проблемы. Эффективность метаболизма бактериальной клетки определяется балансом процессов анаболизма и катаболизма. На их активацию и репрессию влияют факторы окружающей среды. У бактерий выработались механизмы, позволяющие координировать метаболизм в зависимости от доступности и разнообразия питательных веществ. Долгое время исследования ученых были посвящены выяснению роли индивидуальных сигнальных систем. Взаимодействие различных регуляторных путей и их приоритетность все чаще становятся объектом внимания исследователей. Множественная регуляция экспрессии катаболитных генов отражается на организации структуры их промоторов. Анализ взаимного расположения сайтов регуляции в промоторной области гена позволяет предсказать возможные механизмы активации его транскрипции. Несмотря на революционный прорыв современных методов биоинформатики и молекулярной биологии идентификация участков взаимодействия с регуляторами транскрипции является сложной задачей. Даже в бактериальных клетках пока не установлены функции всех факторов транскрипции, обнаруженных при секвенировании геномов. Для многих из идентифицированных регуляторных белков остается невыясненной последовательность нуклеотидов в сайтах взаимодействия с ДНК (Joseph et al., 2005). Несмотря на это, методы биоинформатики позволяют прогнозировать результаты с высокой точностью (95-98%) (Mironov et al., 1999).

Бактерии Bacillus intermedins секретируют различные протеиназы, среди которых доминирует субтили зиноподобная сериновая протеин аза (AprBi), ее доля составляет до 80% от пула внеклеточных протеин аз, выделяемых этими бактериями в среду (Шарипова с соавт., 2000). Белок выделен из культуральной жидкости на разных фазах роста и изучены его основные физико-химические и каталитические свойства (Балабан с соавт., 1994, 2004). Ген протеиназы клонирован в лаборатории проф. С.В.Кострова (ИМГ РАН) на плазмиде pCS9, производной вектора рСВ22. Экспрессия гена aprBi в штамме B.subtilis AJ73, дефицитном по собственным внеклеточным протеиназам, показала два максимума протеолитической активности: в ранней и поздней стационарной фазах роста (Кириллова с соавт., 2006). Поздняя и ранняя протеиназы различаются по некоторым физико-химическим характеристикам и условиям биосинтеза. Предполагается, что это связано со сложной системой регуляции экспрессии гена этого фермента на различных фазах роста бактерий. Для выяснения механизмов регуляции экспрессии гена aprBi представляло интерес выяснить структуру гена этого фермента.

Целью работы явилось определение и анализ нуклеотидной последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius, и исследование влияния двухкомпонентной системы DegS-DegU и азотной катаболитной репрессии на экспрессию гена.

Основные задачи исследования:

1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы В.ШегтесИш, определение сайта инициации трансляции в гене аргШ.

2. Исследование экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы ВЛшегтесИш в условиях солевого стресса.

3. Выяснение роли двухкомпонентной системы DegS-DegU в регуляции экспрессии гена аргШ.

4. Определение вклада азотной катаболитной репрессии в регуляцию экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В ШегтесНш.

5. Исследование влияния белков №§А и участвующих в азотном обмене бацилл на экспрессию гена аргВг.

Научная новизна. Установлена последовательность нуклеотидов гена субтилизиноподобной протеиназы АргВ1 В.ШегтесИш. Для анализа структуры гена применен подход, основанный на оценке его последовательности современными методами биоинформатики. Определены потенциальные сайты регуляции в промоторе гена и особенности их расположения. Установлено, что трансляция в гене аргВг начинается с нестандартного вТв кодона. Впервые показано, что синтез протеиназы В.ШегтесИш активируется в условиях солевого стресса в отличие от субтилизина В.зиЫШз. Получены приоритетные данные о регуляции экспрессии гена аргВ1 двухкомпонентной системой трансдукции сигнала Бе£8-Ве§и. Впервые показано, что экспрессия гена протеиназы регулируется механизмом азотной катаболитной репрессии. Установлено, что в ранней стационарной фазе роста экспрессия гена аргВ1 зависит от белка NrgB, участвующего в азотном обмене бацилл.

Практическая значимость. Данные сиквенса гена субтилизиноподобной протеиназы В.ШегтесИш занесены в базу данных Международного ГенБанка (АЫ АУ754946) и могут быть использованы для сравнительного анализа белков этой группы. Примененные в работе методы биоинформатики позволили провести анализ структуры промотора гена, что в целом расширяет представление о строении «поздних» генов, находящихся под множественной регуляцией. Полученные в работе данные о механизмах контроля синтеза внеклеточных ферментов бацилл могут быть использованы при конструировании систем экспрессии для получения высокоэффективных промышленных штаммов-продуцентов целевых белков.

Связь работы с научными программами. Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Федерального агентства по образованию А04-2.12-783, Академии Наук

республики Татарстан 03-3.10-295/2004(Ф), программой ДААД и Минобрнауки РФ «Михаил Ломоносов» А/04/39635 и А/05/58617.

Положения, выносимые на защиту.

1. Определена нуклеотидная последовательность гена субтилизиноподобной протеиназы В.ШегтесИш.

2. Экспрессия гена аргШ регулируется двухкомпонентной системой Бе£8-Ве£и и механизмом азотной катаболитной репрессии.

Апробация работы Основные положения диссертации представлены на ежегодных научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003, 2004), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004,2005, 2006), Всероссийских научных конференциях "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004) и "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), Всероссийской конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», (Москва, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю профессору М.Р.Шариповой за внимательное отношение к работе; к.б.н. с.н.с. Н.П.Балабан за постоянную помощь в проведении экспериментов; профессору С.В.Кострову (ИМГ РАН) за предоставление плазмид рСБ9 и рСВ22; профессору Ю.Йомантасу (ГНИИ Генетика и Селекция Промышленных микроорганизмов) за предоставление протеазодефицитного штамма ВячЬиНз А173; к.б.н. с.н.с. И.В.Демидюку (ИМГ РАН) за консультацию при проведении экспериментов по мутагенезу точки инициации трансляции; профессору К.Форшхаммеру (Университет Гиссена, Германия) за научную консультацию в области регуляции азотного обмена бактерий; профессору Я. Маартен Ван Дижлу (университет Гронингена, Голландия) за предоставление штаммов В^чЬИШ, мутантных по Deg-бeлкaм; профессору Й.Штульке (Университет Геттингена, Германия) за предоставление штаммов В.яиЬНШ, дефектных по белкам №£А и №£В.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 22 рисунка. Библиография содержит 252 наименования российских и зарубежных авторов.

Материалы и методы

Штаммы и плазмиды. В качестве исходного штамма использовали штамм Bacillus intermedins 3-19 из музея Казанского университета. Штаммом-реципиентом для плазмид с геном субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius служил штамм Bacillus subtilis AJ73, дефицитный по внеклеточным протеиназам, предоставленный проф. Ю.Йомантасом, ГНИИ Генетика и Селекция Промышленных микроорганизмов. Штаммы B.subtilis 8G5 AdegSAdegU (like 8G5; degS, degU; Km1), дефектный по генам degS и degU, B.subtilis 8G5 degU32{Ну) (like 8G5; degU32(Ну); Km1) с мутацией по гену degU, ведущей к Ну-фенотипу и B.subtilis 8G5 (trpC2; tyr; his; nie; ига; rib; met; ade; sipP) с полноценными регуляторными белками предоставлены доктором Я. Маартен Ван Дижлом, университет Гронингена, Голландия. Штаммы B.subtilis 168 (trpC2), B.subtilis GP254 (trpC2\ nrgA, Cm1), B.subtilis GP253 (trpC2\ nrgB, Cmr) предоставлены проф. Штульке, университет Геттингена, Германия. Плазмида pCS9, несущая ген aprBi, и вектор рСВ22 предоставлены для работы проф. Костровым, ИМГ РАН, Москва. Плазмиды рКА, pKT, pKG, pKTG получены в работе на основе вектора рСВ22 (Sorokin et al., 1990).

Культивирование штаммов B.subtilis проводили на среде LB (Sambrook et al., 1989) и минимальной среде Спицайзена (Saxild et al., 1987), для создания условий солевого стресса в среду LB дополнительно вносили NaCl и цитрат Na до конечных концентраций 1 М и 0,25 М, соответственно. В среду для культивирования B.intermedius 3-19 добавляли стрептомицин 500 мкг/мл. При выращивании рекомбинантных штаммов B.subtilis с плазмидами pCS9, рКА, pKT, pKG, pKTG в среду вносили эритромицин (20 мкг/мл). При культивировании штаммов B.subtilis с дефектами белков NrgA и NrgB в среду дополнительно вносили хлорамфеникол 20 мкг/мл, для штаммов B.subtilis, мутантных по белкам DegS и DegU, - канамицин 20 мкг/мл.

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при 590 нм. Протеолитическую активность определяли по синтетическому хромогенному субстрату Z-Ala-Ala-Leu-pNA (Люблинская с соавт., 1987). Продуктивность культуры (удельную активность) определяли как отношение активности фермента в культуральной жидкости к количеству биомассы и выражали в условных единицах.

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). Трансформацию клеток В. subtilis плазмидной ДНК проводили как описано (Anagnostopolous et al., 1961). Трансформацию протопластов B.subtilis плазмидной ДНК (Chang et al., 1979) проводили при работе со штаммами, дефектными по ¿feg-генам.

Определение нуклеотидной последовательности гена aprBi проводили методом терминации цепи дидеоксинуклеотидами в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН. Амплификацию

ДНК проводили по (8атЬгоок й а1., 1989). 50 мкл реакционной смеси содержало: Рйд-ДНК полимераза («Сибэнзим») - 1 единица активности, буфер для Р&-ДНК полимеразы 10-кратный - 5 мкл, по 200 мкМоль каждого из дезоксинуклеотидов, по 10 пМоль каждого из праймеров, 0,01 мкг матричной ДНК. Рестрикцию и лигирование ДНК проводили как рекомендовано фирмой производителем («Сибэнзим»).

Схема конструирования плазмид с мутациями в гене аргВг представлена на рис. 1. Конструирование генов протеиназы В.ШегтесИш с мутацией в предполагаемом сайте инициации трансляции проводили в 2 этапа с предварительным синтезом мегапраймера как описано в (БатЬгоок I а!., 1989). Использованные синтетические олигонуклеотиды

представлены в табл. 1.

Таблица 1. Синтетические олигонуклеотиды, использованные в

Название праймера Последовательность праймера

Рт1 5' СААТССвСАТСССТТСАТТАСААССТССТСАС 3'

ЗиЬ ттв 5' СТТТТТСАСССАввАТССАСАТССС 3'

ЭиЬ 5' СТТТТТАвСССАСААТССАСАТССС 3'

ЭиЬ ттэ ств 5' СТТТТТАвСССАОвАТССАСАТССС 3'

БиЬ АТв 5' САСССААТААААСАСТТСТТАбСАС 3'

ЭиЬ term 5' АСА6АСССАТСССА6АСССАССССТСАС6ТСТТТТС 3'

* Нуклеотиды, ведущие к образованию мутаций выделены жирным. Сайт узнавания рестриктазой ВатН1 подчеркнут.

На первом этапе проводили амплификацию 5'- области гена аргВг. Правый праймер содержал замену нуклеотидов, приводящую к мутации одного из предполагаемых инициирующих кодонов: АТС->СТА (Ме1->Ьеи), вТО->ОСТ (Уа1->А1а), ТГС ->ТСС (Ьеи->8ег). Синтезированный полинуклеотид нес замену в одном из потенциальных сайтов инициации трансляции и служил левым праймером на втором этапе ПЦР, который проводился в этой же реакционной смеси после дополнительного внесения второго правого праймера, дезоксинуклеотидов и ДНК-полимеразы. У полученных линейных ДНК фосфорилировали 5'-конец киназой фага Т4 и лигировали с вектором рСВ22, который был предварительно линеаризирован рестриктазой ЕсоКЧ. Лигазную смесь снова рестрицировали ферментом ЕсоКЧ, чтобы отобрать те плазмиды, у которых имеется вставка по этому сайту. Клоны отбирали рестрикционным анализом: выделенные плазмиды рестрицировали по ВатШ и отбирали те, при расщеплении которых образовывались фрагменты величиной 1,8 кЬ в случае плазмид рКА и рКв и величиной 1,4 и 0,4 кЬ в случае плазмид рКТ и рКСГ.

PlV1 ^^Ётшш 3'

/SubTTG

■/упви-Я S обгок, ,-i / Sub QJQ -■-.^■J.JS.l^^ I SubATG

" Sub TTG GTG

ar- :c£c-

Bamr,

Мегапрайиеры M TTG (-*TCC) M GTG (-*GCT) MATG (-+CTA) | M TTG GTG (-+TCC GCT)

is-nrt! Мегапраймер Зап'г,

''- *M1H—ийи—^

I Sub term

s cnsp'rcsom -тойоне

4 модифицированы^ гена протеиназы с мутациями в предполагаемых стартовых кодонах- A(C)TG(A), TT(C)G(C), GT(C)G(T), а также TT(C)G(C) и GT(C)G(T) одновременно

I этап

амплификация 5' области гена аргВ1.

Синтез четырех мегапраймеров, несущих замену нуклеотидов в одном из потенциальных стартовых кодонов

II этап:

амплификация кодирующей области гена аргВ'1.

Полученные на первом этапе мегапраймеры, несущие замену нуклеотидов в одном из потенциальных стартовых кодонов служат левым праймером

III этап:

Полученные модифицированные гены были лигированы в шаттл-вектор рСВ22

по сайту EcoRV. Клоны отбирали рестрикционным анализом по сайту BamHl

Рис. 1. Схема конструирования плазмид рКТ pKG рКА и pKGT на основе вектора рСВ22.

Анализ последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius проводили с использованием пакета программ BLAST, представленных на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov') (Altschul et al., 1997). Поиск открытой рамки считывания и инициирующих кодонов проводили с помощью программы ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/gorf/gorf). Потенциальный старт-кодон трансляции определяли с использованием алгоритма SignalP (Bendtsen et al., 2004) (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalPA. Потенциальные -10 и -35 области для узнавания ст* фактором транскрипции в промоторной области гена aprBi идентифицировали с использованием сервера Softberry BPROM (http://www.softberrv.com). Потенциальные участки связывания с о-факторами транскрипции и с белками-регуляторами DegU, SpoOA, СсрА и AbrB в регуляторной области гена aprBi были выявлены с использованием пакета программ Vector NTI Suite 8.0.

Математическую обработку результатов проводили с помощью программы STATGRAPHICS Plus for Windows (Version 2.1).

Результаты и их обсуждение

1. Определение нуклеотидной последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius и ее анализ. Для

определения нуклеотидной последовательности была использована мультикопийная плазмида pCS9, производная вектора рСВ22 (Sorokin et al., 1990), содержащая клонированный фрагмент ДНК хромосомы B.intermedius с геном aprBi. Его последовательность была определена методом праймерной прогулки. Последовательность гена aprBi зарегистрирована в базе данных ГенБанка (AN AY754946).

В 6,06-kb участке хромосомной ДНК B.intermedius 3-19 идентифицирована открытая рамка считывания, которая кодирует полипептид, имеющий структурную гомологию с сериновыми протеиназами. Ее анализ выявил 3 потенциальных сайта инициации синтеза бежа: TTG (1), GTG (2) и ATG (3) (рис. 2). С помощью алгоритма SignalP, позволяющего предсказать функциональную активность синтезируемого лидерного пептида, нами установлена минимальная вероятность для стартового кодона ATG (67,7%). Два других кодона (TTG и GTG) с одинаковой степенью вероятности являются потенциальными старт-кодонами (99,8% и 96,4%, соответственно).

Чтобы выяснить, какой из них является началом рамки считывания, был проведен олигонуклеотид-направленный мутагенез и сконструированы гены с модификацией каждого из предполагаемых сайтов инициации трансляции. Получены плазмиды рКА, рКТ, pKG и pKTG, содержащие ген aprBi с мутациями в соответствующих сайтах: A(C)TG(A), TT(C)G(C), GT(C)G(T), а также TT(C)G(C) и GT(C)G(T)

одновременно (рис. 2). Экспрессию модифицированных генов изучали в протеазодефицитном штамме B.subtilis AJ73.

12 3

TAAGAAAAAAGGGATGTGGfl|rrgttgc|GrGhAAAAGAAAAATGTG|arg|RCAAGTT - - -- S TAAGAAAAAAGGGATGTGGA ttgtgcgcraaaaagaaaaatgtgargacaagtt 'Л G taagaaaaaagggatgtggatcetgcgrgaaaaagaaaaatgtgatgacaagtt ркг TAAGAAAAAAGGGATGTGGATCCIGCGCaRAAAAGAAAAATGTGArGACAAGTT oK " taagaaaaaagggatgtggaitgtgc gtgaaaaagaaaaatgtgcjmacaagtt fг i.

Рис. 2. Фрагмент последовательности гена aprBi. Предполагаемые старт-кодоны, идентифицированные с помощью программы ORF Finder, выделены курсивом и взяты в рамочку. Подчеркнуты триплеты, в которых проведены замены нуклеотидов и справа указаны соответствующие им плазмиды.

Динамика биосинтеза протеиназы штаммом B.subtilis AJ73 (рКА), несущим ген протеиназы с мутацией в сайте ATG, не отличалась от контрольного штамма Bsubtilis AJ73 (pCS9). Эти данные позволили заключить, что кодон ATG не является стартовым. Одновременная мутация триплетов GTG и TTG привела к отсутствию экспрессии модифицированного гена протеиназы B.intermedius штаммом B.subtilis AJ73 (pKTG). Изменение сайта TTG привело к снижению уровня экспрессии гена aprBi в среднем в 3 раза по сравнению с контролем. Экспрессия модифицированного гена aprBi полностью подавлялась у рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 (pKG), что позволило заключить, что синтез протеиназы начинается с нестандартного GTG кодона. Снижение уровня протеолитической активности в штамме с мутацией кодона TTG, возможно, связано с образованием шпильки (GGATCC) между последовательностью Шайна-Дельгарно и стартовым кодоном (GTG), что могло негативно отразиться на связывании рибосомы с матричной РНК. Отметим, что секвенирование генома B.subtilis показало, что в генетическом аппарате бацилл, кроме классического старт-кодона ATG, в пятой части генов стартовыми являются GTG и TTG. В том числе, в гене субтилизина B.subtilis стартовым является кодон GTG.

Таким образом, открытая рамка считывания гена aprBi состоит из 1146 нуклеотидных пар, что соответствует 381 аминокислотному остатку (рис. 3). В структуре кодирующей части идентифицированы 3 основных участка, которые характерны для субтилаз: пре-, пропоследовательность и зрелый белок. Последовательность, соответствующая сигнальному пептиду, кодирует полипептид из 29 аминокислотных остатков. Он включает три положительно заряженных лизина на N-конце, гидрофобный домен (VLLAVPLLFSAGFGG), за которым следует сайт расщепления для

102

153

204

255

306

357

408

459

510

561

612

663

714

765

816

867

918

969

1020

1071

1122

1173

1224

1275

1326

1377

1428

gaatggaaggtccttgattacaacgtggtcagccatttactccatcctcc cctttttaaagaacctgttattgtaacaggttntttttnaatgccaaaacc aaaaaataatatttttttatatcgaaattcgaaatagatgctagacgtttc tacctattttaaggcttttcgggtatcgaatatttgtccgaaaatggatca taagaaaaaaagcacacttcctttttaatagataaccgctgaaacagcaga acaaacatattttcccaacgtttccaagtgacttaattccccaattttcgc taggactttcacaaaaattcgggtctactcttatttgcctacttcccttaa

-35

actgaatatacagaataatcaaacgaatcattcttatagactacgaatgat

-10 RBS V К К К N

tattctgaaataagaaaaaagggatgtggattgtgc|gtg)aaaaagaaaaat

VMTSVLLAVPLLFSAGF gtgatgacaagtgttttattggctgtccctcttctgttttcagcagggttt

GGSMAKAETVSKSASEK ggaggctccatggcaaatgccgagacggtctcaaagtcagctagtgaaaag

SYIVGFKASATTNSSKK agctatattgttggctttaaagcctctgccaccacaaacagctctaagaaa

QAVTQNGGKLEKQYRL I caagccgtcactcaaaatggcggaaaactagaaaagcaatatcgtcttatt

NAAQVKMSEQAAKKLEH aatgccgcacaagtaaagatgtccgaacaagccgcaaaaaaacttgaacat DPSIAYVEEDHKAEAY A_ gaccctagcattgcttacgtagaagaagaccacaaagcagaagcatatgca

QTVPYGI P Q I К A P A V H A caaaccgtcccttatggaatccctcaaatcaaagctccagctgtacacgct

QGYKGANVKVAVLDTG I caaggttataaaggtgctaatgtcaaagtagctgtccttgatactggaatc

HAAHPDLNVAGGASFVP eacgctgcacatcctgacttaaatgttgcaggcggtgccagcttcgtccct

SEPNATQDFQSHGTHVA tcagagccaaatgccacccaagactttcaatcacatggaactcacgtagcc

GTIAALDNTIGVLGVAP ggaaccattgctgcccttgataacacaattggtgttcttggggtcgctcca

SASLYAVKVLDRNGDGQ agtgcttccctatatgctgttaaagtattagaccgcaatggcgacggacaa

YSWI ISGIEWAVANNMD tacagctggatcattagcggtattgaatgggctgtagccaataacatggat

VINMSLGGPNGSTALKN gtcatcaatatgagcttaggtggaccaaacggttcaacagcgcttaaaaat

AVDTANNRGVVVVAAAG gccgttgatacagcaaataaccgcggagtcgttgttgtggcggccgcaggt

NSGSTGSTSTVGYPAKY aattcaggttccactggctctacaagtacagttggctatccagcaaaatat

DSTIAVANVNSSNVRNS gattctacaattgccgttgccaatgtaaacagcagcaatgtcagaaactcg

SSSAGPELDVSAPGTS I tcttccagcgcaggtcctgaattagatgtttctgcacctggtacttctatt

LSTVPSSGYTSYTGTSM ttaagtacagtaccaagcagtggatacacatcttatactggaacttctatg

ASPHVAGAAALILSKNP gcgtctcctcatgtagcaggagcagcagcgcttattctttctaaaaatccg

NLSNSQVRQRLENTATP 147 9 aacctatcaaattcacaggttcgccagcgcttagaaaacacggcaacaccg

LGNSFYYGKGLINAQAA 1530 cttggtaactccttctattacggcaaagggttaatcaacgctcaagcggct SN*

1581 tctaactaaACAAGCGCAAAAAAAATCCGGCTGATCCAGCCGGATTTTATT 1632 TGTTTATTGCTTCCTCGACGTTTCCTCTTTTTCCGCTGCATTTTCCATCTC 1683 cATGATTCTCTCCATCATGGTTGGGTGTCCATAGCGGAAGACCTTCACTAA 1734 AAGCGGTGGATTCACCTGAGACAGCCCTGATTTTGCAAGCTTTTGAAAAGA 1785 CGTCACCCCTGCCTCTCCGTCTTTTGTCA

Рис. 3. Структура гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius. -10 и —35 области для связывания с а-А фактором транскрипции выделены. Сайт расщепления сигнальной пептидазой (ANA) выделен. N-конец зрелого белка, продуцируемого нативным штаммом B.intermedius 3-19 (Балабан с соавт., 1994, 2004), подчеркнут. Аминокислоты, входящие в каталитическую триаду, выделены. Подчеркнуты последовательности, которые могут участвовать в формировании терминатора транскрипции.

сигнальной пептидазы (ANA). Далее следует предполагаемый пропептид из 77 аминокислот, количество которых совпадает с пропептидами протеиназы BPN B.amyloliquefaciens и АргР B.pumilus. Зрелый белок AprBi состоит из 275 аминокислот, что характерно для известных субтилаз бактерий.

В последовательности аминокислот белка идентифицированы три аминокислоты, формирующие каталитический центр - аспарагиновая кислота, гистидин и серин (D32, Н64 и S221) (рис. 3) и отсутствуют остатки цистеина, что характерно для структуры субтилизиноподобных протеиназ бацилл. (Siezen et al., 1997).

Сравнительный анализ последовательности гена aprBi с использованием алгоритма BLAST позволил выявить высокую степень гомологии с геном субтилизиноподобной протеиназы B.pumilus (аргР): идентичность кодирующих областей составляет 94%. Большинство нуклеотидных замен локализованы в третьем положении кодонов и не оказывают влияния на аминокислотную последовательность белка. Первичная структура кодируемых белков гомологична на 98%, что объясняет сходство их физико-химических и каталитических свойств. Промоторы генов aprBi и аргР идентичны на 91%. Этот факт позволил предположить сходство механизмов регуляции их экспрессии. Выявлен 61% идентичности промоторов генов aprBi и субтилизина В. suhtilis (aprE) на протяжении 81 пары оснований. По данным литературы, в промоторе гена аргЕ установлен сайт связывания с о-А фактором транскрипции (Jan et al., 2000), который слабо выражен в гене aprBi. По-видимому, для эффективной транскрипции гена aprBi необходимы дополнительные

регуляторные факторы, повышающие сродство промотора и сигма-фактора РНК полимеразы. Кодирующие области генов aprBi и аргЕ имеют 76% идентичности, кодируемые белки гомологичны на 70%. Выявлена идентичность в 71% со структурной областью гена субтилизина BPN из B.amyloliquefaciens. Гомология наблюдается в последовательностях, формирующих каталитический центр фермента. Гомология белков составляет 70%. Выравнивание генов aprBi и протеиназы Карлсберг из B.licheniformis выявило гомологию в 80% на протяжении 88 пар оснований в области каталитического центра фермента; структура белков гомологична на 64%.

Был проведен анализ регуляторной области гена aprBi с целью выявления потенциальных сайтов регуляции. Она отличается повышенным содержанием А/Т пар оснований (AT/CG=1,96), что характерно для промоторов активно транскрибируемых генов. В этой области нами выявлены участки с гомологией к сайтам взаимодействия с минорными (о-L и ст-Н) и спороспецифичным (о-Е) сигма-факторами транскрипции. Обнаружен сайт связывания с белком-оператором АЬгВ, регулирующим экспрессию ряда генов в период перехода культуры к стационарному росту. В последовательности гена, которая соответствует лидерному пептиду, выявлен потенциальный сайт связывания с белком СсрА, контролирующим экспрессию генов по типу катаболитной репрессии. Этот факт позволяет предположить влияние 5' конца кодирующей области гена на регуляцию его экспрессии. Такие же результаты получены для рибонуклеазы B.amyloliquefaciens: в гене барназы существенный вклад в регуляцию экспрессии гена вносит структура препоследовательности белка. По-видимому, присутствие сайтов регуляции в кодирующей области гена широко распространено у бацилл и, возможно, характерно для ферментов, синтез которых активируется в период перехода в стационарную фазу.

В промоторе гена aprBi выявлены потенциальные участки для взаимодействия с регулятор ными белками DegU (AGAA Nn-13 TTCAG)(Dartois et al.,1998) и SpoOA (TGTCGAA)(Strauch et al., 1990) (рис. 4). Эти участки расположены в виде прямых тандемных повторов на протяжении 460 пар оснований. Выявленной нами особенностью является близкое расположение и частичное перекрывание потенциальных DegU- и SpoOA-боксов друг с другом. Видимо, обе регуляторные системы не могут одновременно оказывать влияние на транскрипцию гена aprBi и разнесены во времени. По данным литературы, в промоторе гена аргЕ сайт взаимодействия с белком DegU, установленный экспериментально, расположен в области -150, где отсутствует гомология промоторов генов аргЕ и aprBi. В регуляторной области гена aprBi нами идентифицировано 8 потенциальных сайтов связывания с белком DegU, из них 3 имеют высокую степень гомологии к консенсусной последовательности.

Рис. 4. Промоторная область гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius. SpoOA-боксы выделены рамкой, DegU-боксы подчеркнуты, жирным выделены DegU-боксы с максимальной гомологией с консенсусу. Инициирующий кодон подчеркнут.

Был проведен поиск SpoOA- и DegU-боксов в промоторах генов субтилаз различных видов бацилл (B.thuringiensis, B.pumilus, B.sp., B.licheneformis), последовательности которых находятся в свободном доступе на сайте NCBI. Нами установлено, что SpoOA- и DegU- боксы располагаются в виде прямых тандемных повторов и перекрываются друг с другом. Локализация идентифицированных DegU- боксов в промоторах генов протеиназ бацилл относительно точки инициации транскрипции и их гомология с консенсусной последовательностью, представлены в таблице 2.

Табл. 2. Расположение DegU-боксов в промоторах генов

Фермент Положение DegU-боксов и степень их гомологии с консенсусами

<60% 60-70% 70-80% >80%

Протеиназа B.intermedius 3-19 -364 -289 -65 -163 -193 -29 -116 -218 -

Протеиназа B.pumilus TYO-67 (АВ029082), - - -52 -113 -

Протеиназа АргА B.thuringiensis (AFI70567) - - -140 -207 -46

Термостабильная протеиназа Bacillus sp. (D13158, S50880), - -229 -354 -190 -83

Протеиназа Карлсберг B.licheniformis (X91261), -313 -191 -273 -237

Анализ промотора гена aprBi не выявил потенциальных сайтов взаимодействия с белками SinR и Нрг, которые участвуют в регуляции экспрессии гена субтилизина B.subtilis. Также не обнаружено сайтов для связывания с белком ТпгА - регулятором азотного метаболизма бацилл.

Результаты анализа позволяют заключить, что регуляция экспрессии гена aprBi может осуществляться при участии регуляторных систем DegS-DegU и SpoOA, а также глобальных регуляторов метаболизма СсрА и AbrB. Выявленные различия в строении регуляторной области генов сериновых протеиназ B.intermedius и B.subtilis позволяют предположить различия в регуляции их экспрессии.

2. Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius в условиях солевого стресса и вклад системы DegS-DegU в ее регуляцию. По данным литературы, в процессе ответа на повышение солености среды у бацилл активируется двухкомпонентная система трансдукции сигнала DegS-DegU, отвечающая за синтез ферментов деградации, таких как протеазы, рибонуклеазы, амилаза и пр. (Kunst et al., 1995; Steil et al., 2003). При этом экспрессия генов, регулируемых белками DegS и DegU, активируется или сильно подавляется в условиях солевого стресса. Нами установлено, что биосинтез субтилизиноподобной протеиназы исходным штаммом B.intermedius 3-19 повышается в условиях солевого стресса. В среде, содержащей 1 М хлорид натрия, удельная активность протеиназы увеличивалась в 1,5 раза, а в присутствии 0,25 М цитрата натрия - в 3 раза по сравнению с контролем (среда LB без дополнительно внесенных солей). При этом на среде с цитратом натрия рост бактерий снижался в 1,5-2 раза по сравнению с контрольной средой. По всей видимости, это связано с тем, что присутствие цитрата в среде культивирования подавляет рост микроорганизмов (Sleator et al., 2002).

Экспрессию гена протеиназы AprBi на средах с высоким содержанием солей в данном исследовании изучали в клетках рекомбинантного штамма В. subtilis. Хлорид натрия в концентрации 1 М не влиял на рост рекомбинантного штамма В. subtilis AJ73 (pCS9) (рис. 5 а). На среде с 0,25 М цитратом натрия, как и в случае нативного штамма B.intermedius, накопление биомассы происходило медленнее, чем на контрольной среде (рис. 5 а). По-видимому, на среде с добавлением цитрата натрия фаза экспоненциального роста и фаза замедления роста пролонгированы, и продукция фермента сохранялась стабильно высокой до 48 ч выращивания. В этот период в культуре наблюдали единичные споры после 40-го ч роста (на бессолевой среде - после 28 ч роста), что свидетельствовало об увеличении продолжительности стадии вегетативного роста бактерий. Продуктивность культуры в отношении синтеза протеиназы увеличивалась по сравнению с контролем в 2 раза на среде с хлоридом натрия и в 15 раз на среде с цитратом натрия (рис. 5 в).

(а)

(б)

Активность, ед/мл

Продуктивность, у.е.

32 40 48 Время, ч

32 40 Время, ч

Рис. 5. Влияние высоких концентраций солей в среде культивирования на экспрессию гена aprBi рекомбинантным штаммом B.subtilis AJ73 (pCS9). а - накопление биомассы, б - активность, в -продуктивность. J - среда без дополнительного внесения солей (контроль), 2 - среда, содержащая 1 M хлорид натрия, 3 - среда, содержащая 0.25 M цитрат натрия.

Синтез фермента в условиях солевого стресса активировался позже, чем в контроле, и в течение 36 ч роста уровень протеолитической активности оставался выше контроля (рис. 5 в). Так, первый пик активности, наблюдаемый на контрольной среде на 24 ч роста (рис. 5 б), приходился на 28 ч на среде с хлоридом натрия и на 40 ч на среде с цитратом натрия. Причиной поздней активации синтеза фермента может быть увеличение продолжительности стадии вегетативного роста, в течение которой транскрипция гена aprBi может подавляться белками АЬгВ и CodY, участие которых в регуляции гена субтилизина B.subtilis показано экспериментально (Strauch, 1993; Molle et al., 2003). Возможно, сдвиг пиков активности фермента по времени является также следствием увеличения продолжительности лаг-фазы, в течение которой происходит адаптация бактерий к новой среде.

Полученные данные об увеличении уровня экспрессии гена протеиназы AprBi в условиях солевого стресса, а также выявление участков ДНК с гомологией к DegU-боксам в промоторе гена, позволили предположить участие регуляторной пары DegS-DegU в контроле экспрессии гена фермента. Экспрессию гена aprBi изучали в штаммах В. subtilis, мутантных по генам белков регуляторной системы DegS-DegU. В клетках B.subtilis 8G5 AdegSAdegU с делецией обоих белков DegS и DegU, трансформированных плазмидой pCS9 с геном aprBi, на среде LB

наблюдалось снижение продуктивности протеиназы на 60% по сравнению с контрольным штаммом В. зиЫШз 8в5 (рСБ9) с полноценной системой Е>е§8-1^и (рис. 6 а).

(б)

Продуктивность, у.е 2000

160 -140 J 120 100 80 60 40 20 0

12 16 20 24 28 32 36 40 44 Время, ч

Рис. 6. Экспрессия гена aprBi на среде LB в рекомбинантных штаммах В. subtilis, дефектных по регуляторным белкам DegS и DegU. 1В. subtilis 8G5 (pCS9) (контроль), 2-В. subtilis №5AdegSMegU(pCS9), 3 -В. subtilis 8G5 DegU32 (Ну) (pCS9).

По-видимому, для эффективной экспрессии гена aprBi необходима система DegS-DegU в активном состоянии. Тем не менее, по нашим данным инактивация Deg-системы не привела к полному подавлению экспрессии гена aprBi, как в случае экспрессии гена субтилизина В.subtilis (Valle et al., 1989). По-видимому, Deg-система не является доминантной в регуляции экспрессии гена протеиназы AprBi. Возможно, это связано с перекрестной регуляцией большинства генов, входящих в состав DegS-DegU регулона, которые, как правило, подвержены регуляции со стороны нескольких регуляторных систем (Mader et al., 2002).

Экспрессию гена aprBi изучали в мутантном штамме В. subtilis 8G5 degU32( Ну), который характеризуется повышенной продукцией фосфорилированной формы регуляторного белка DegU. В этих мутантах наблюдается гиперпродукция белков, транскрипция генов которых позитивно регулируется белком DegU~P (Msadek et al., 1990). После трансформации этого штамма плазмидой pCS9 продуктивность в отношении протеиназы на среде LB возрастала в 6-10 раз по сравнению с контролем (рис. 6 б). Полученные данные позволили заключить, что белок DegU~P повышает уровень экспрессии гена aprBi, а значит, регуляторная пара DegS-DegU способна увеличить уровень синтеза фермента в определенных условиях.

Полученные результаты свидетельствуют о позитивной регуляции экспрессии гена протеиназы B.intermedius со стороны двухкомпонентной системы трансдукции сигнала DegS-DegU. Этот факт указывает на участие протеиназы в адаптационных процессах клетки, протекающих в процессе перехода к стационарной фазе роста. По данным литературы, биосинтез субтилизина B.subtilis наоборот подавляется в условиях солевого стресса (Kunst et al., 1995). По-видимому, регуляция генов, являющихся функциональными гомологами, может различаться. Известно, что при повышенной концентрации солей в среде бактерии интенсивно накапливают в клетках различные низкомолекулярные осмопротекторы (Sleator et al., 2002; Смирнова с соавт., 2001), включающие глутатион, глутамин, глутамат и пролин, которые не синтезируются клетками, а транспортируются из окружающей среды (McLaggan et al., 1990). Интенсивная деградация различных углеродсодержащих субстратов, в том числе и белков, необходима для поддержания внутриклеточного пула низкомолекулярных веществ. Возможно, повышение уровня биосинтеза внеклеточной протеиназы, которая участвует в неспецифическом расщеплении белков до аминокислот и олигопептидов, является одним из способов защиты клетки в условиях солевого стресса.

3. Влияние механизма азотной катаболнтной репрессии и белков NrgA н NrgB на экспрессию гена aprBi. В настоящее время установлена связь между углеродной и азотной катаболитной репрессией (Commichau et al., 2006). Для исходного штамма B.intermedius показано, что внесение хлорида или цитрата аммония в среду культивирования B.intermedius подавляет биосинтез сериновой протеиназы (Балабан с соавт., 2003). Этот факт позволяет нам предположить, что экспрессия гена aprBi может регулироваться механизмом азотной катаболитной репрессии. Предпочтительным источником азота для бактерий является аммоний, его присутствие подавляет образование ферментов утилизации альтернативных источников азота. Исследовали экспрессию гена протеиназы AprBi в процессе роста рекомбинантного штамма B.subtilis AJ73 (pCS9) на синтетических средах (SMM) с использованием в качестве источника азота хлорида аммония или нитрата натрия (рис. 7). На среде с ионами аммония уровень экспрессии гена aprBi снижался в 3-5 раз по сравнению с контрольной средой (рис. 76). Это свидетельствует о том, что синтез фермента связан с азотным метаболизмом клетки. Отметим, что в присутствии аммония активный синтез протеиназы наблюдался лишь в поздней стационарной фазе роста (42-44 часы культивирования), в отличие от контрольного варианта. По-видимому, в поздней стационарной фазе включаются системы регуляции, независящие от азотного обмена (регуляция спороспецифичными сигма факторами).

(а)

Биомасса, ОО$90

3 -г

(б)

Активность, ед./мл КЖ

О 12 24 36 48 60

0 12 24 36 48 60

Время, ч

Рис. 7. Влияние источника азота в среде культивирования на экспрессию гена aprBi рекомбинантным штаммом В. subtilis AJ73 (pCS9). а - накопление биомассы, б - продуктивность: 1 - среда с нитратом натрия (контроль), 2 - среда, содержащая хлорид аммония.

Таким образом, полученные нами данные позволили заключить, что экспрессия гена протеиназы B.intermedius в переходный период регулируется механизмом азотной катаболитной репрессии.

В клетках бацилл контроль азотного метаболизма осуществляют белки CodY, ТпгА и GlnR. При азотном голодании активируется фактор ТпгА, который запускает транскрипцию генов, кодирующих ферменты деградации азотсодержащих субстратов. Предполагается, что в модуляции его активности принимает участие белок NrgB, который вместе с мембранным белком NrgA составляет аппарат транспорта аммония в клетки и является близким гомологом белков-регуляторов азотного метаболизма PII в грам-отрицательных бактериях (Detsch et al., 2003). Наши результаты показали, что дефект белка NrgA не влияет на экспрессию гена протеиназы (рис. 8 б): уровень экспрессии гена aprBi в штамме с мутацией гена nrgA сопоставим с контролем. В штамме с мутацией белка NrgB происходило трехкратное повышение уровня экспрессии гена aprBi (рис. 8 б). Отметим, что эффект наблюдался только на стадии перехода к стационарному росту.

Чтобы подтвердить предположения об участии белка NrgB в регуляции биосинтеза протеиназы B.intermedius, мы исследовали динамику синтеза фермента на синтетической минимальной среде (SMM), в которой источником азота служили хлорид аммония или нитрат натрия.

Биомасса, СЮ590

(а)

(б)

Активность, ед./мл КЖ 160 -

140 -120 ч 100 -80

60 Н 40 -20

0 к—*

О 6 12 18 24 30 36 42

Время, ч

О 6 12 18 24 30 36 42 Время, ч

Рис. 8. Экспрессия гена аргВ1 на среде ЬВ в рекомбинантных штаммах В.яиЬйШ, дефектных по белкам NrgA и NrgB. а - накопление биомассы, б - активность ед/мл культуральной жидкости: 1- В.йиЫШз 168 (рС89) (контроль), 2 - В.зиЫШэ Ьпг%А (рС89), З-В.эиЫШх Ап^В (рС89).

Эксперименты показали, что в штамме, дефектном по белку NrgA, сохраняется зависимость экспрессии гена от системы азотной регуляции (рис. 9 в). При этом уровень продуктивности в отношении протеиназы остается на уровне контроля (штамм с полноценными белками Ыг^А и №вВ). Экспрессия гена аргВ1 в штамме, мутантном по белку №§В, не зависела от источника азота в среде (рис. 9 г).

Независимо от того, нитрат или аммоний был внесен в среду, уровень протеолитической активности оставался на одном уровне и соответствовал уровню экспрессии гена фермента контрольным штаммом при росте с аммонием (рис. 7). Этот факт позволил нам предположить, что белок в условиях недостатка азота способствует повышению уровня экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы.

В промоторе гена аргВг не идентифицируются последовательности для взаимодействия с фактором транскрипции ТпгА, который контролирует гены ассимиляции азота. По-видимому, этот регуляторный белок не принимает непосредственного участия в контроле транскрипции гена аргВи Тем не менее, в литературе описано непрямое участие фактора ТпгА в регуляции экспрессии гена, например, в случае гуанин деаминазы (Ку§ааг<1 й а!., 2000). Можно предположить, что контроль со стороны системы азотной катаболитной репрессии осуществляется опосредованно через другие регуляторные пути, например, белком Со<1У. Предпосылкой может служить тот факт, что механизм действия СоёУ в клетке основан на подавлении экспрессии ряда катаболических генов при избытке питательных веществ (КаЬиуаке-Ьесаптават ег а!., 2001). При попадании

(б)

Биомасса, СГО590

0,5 3 - А . т 0,25

0,4 2,5 -/ ц 2 0,2

0,3 0,2 2 ■ П ^-Сь* ■ '■ // Х-, 1-5 * V ; хе 0,15 ^ -г 0,1 |

0,1 17 г- J 0,05

0 0,5

-0,1 0 Т\ ■ и— ' г I ' 1 ■-1 -0,05

Время, ч

О 612182430364248546066

Время, ч

(в)

Активность, ед./мл КЖ

120 п

-Г-1

12 24 36 48 60

Время, ч

(г)

Активность, едУмл КЖ 120 ■

-I—р

24 36 48 60

Время, ч

Рнс. 9. Влияние источника азота в среде культивирования на экспрессию гена аргВг рекомбинантными штаммами В.зиЬИНз, дефектными по белкам №§А и №^В. а, в - накопление биомассы и экспрессия гена протеиназы штаммом, мутантном по гену п^Л, б, г -накопление биомассы и экспрессия гена протеиназы штаммом, мутантном по гену пг^В: 1 -среда с нитратом натрия (контроль), 2 - среда, содержащая хлорид аммония.

клеток бацилл в условия голодания, репрессия белком СЫУ снимается. Эксперименты со штаммами, мутантными по белку №§В, также продемонстрировали активацию экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы в условиях недостатка азота, а не репрессию предпочтительным источником азота. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что экспрессия гена аргВ1 регулируется по

типу азотной катаболитной репрессии, и повышается в условиях азотного голодания.

Таким образом, анализ последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы В.Шегте&ш выявил сложную организацию промоторной области, что свидетельствует о его множественной регуляции. Полученные нами данные позволяют сделать заключение, что экспрессия гена аргВг модулируется несколькими регуляторными системами, которые активны в различные периоды жизненного цикла бацилл. В фазе замедления роста и ранней стационарной фазе экспрессию гена протеиназы регулируют двухкомпонентная система DegS-DegU и механизм азотной катаболитной репрессии, которые не активны в поздней стационарной фазе роста.

ВЫВОДЫ

1. Определена нуклеотидная последовательность гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы В. ШегтесНия (аргВг) (AN АУ754946). Установлены потенциальные сайты регуляции и особенности их расположения в промоторной области гена. Выявлена высокая гомология (>90%) гена аргВ1 с геном субтилизиноподобной протеиназы В.ритИш (аргР). Установлено, что трансляция в гене аргВг начинается с нестандартного СТО-кодона.

2. Установлено, что экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы В. ШегтесИш рекомбинантным штаммом В.яиЫШв активируется в условиях солевого стресса (1 М хлорид натрия, 0,25 М цитрат натрия).

3. Установлено, что экспрессия гена аргВ1 позитивно регулируется двухкомпонентной системой трансдукции сигнала DegS-DegU, ответственной за синтез ферментов деградации, и зависит от фосфорилированной формы белка DegU.

4. Показано, что экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы В.ШегтесИш в рекомбинантном штамме В.яиЫШь- регулируется механизмом азотной катаболитной репрессии: уровень протеолитической активности при росте на синтетической среде с хлоридом аммония снижается в 3 раза по сравнению с нитратом натрия.

5. Установлена взаимосвязь экспрессии гена аргВг с азотным обменом: белок NrgB, участвующий азотном метаболизме бацилл, активирует экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы В.ШегтесИт в условиях азотного голодания.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Знаменская Л.В. Биосинтез новых высокомолекулярных секретируемых рибонуклеаз из Bacillus intermedius и Bacillus subtilis / Л.В. Знаменская, М.А. Харитонова, А.Р. Каюмов. С.И. Краснов // Микробиология. -2002. - Т.71, № 6 - С.801-808.

2. Знаменская Л.В. Роль промотора и лидерной последовательности внеклеточной рибонуклеазы Bacillus amyloliquefaciens в регуляции биосинтеза фермента / Л.В. Знаменская, А.Р.Каюмов, М.А.Харитонова,

B.И.Вершинина // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2005. -№3. -С.38-43.

3. Каюмов А.Р. Механизмы регуляции синтеза бактериальных субтилаз / А.Р. Каюмов, М.Р. Шарипова И Ученые Записки Казанского университета. -2005. -Т. 147, Серия Естественные науки, Книга 2, №1. -

C. 89-98.

4. Кириллова Ю.М. Особенности биосинтеза субтилизююподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis / Ю. М. Кириллова, Е. О. Михайлова, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, А. Р. Каюмов, Г. Н. Руденская, С. В. Костров, М. Р. Шарипова // Микробиология. -2006. -Т.73, №2. -С.8-14.

5. Sharipova М. The expression of the serine proteinase gene of Bacillus intermedius in Bacillus subtilis / M. Sharipova, N.Balaban, A.Kayumov, Y.Kirillova, L.Gabdrakhmanova, A.Mardanova, I.Leshchinskaya, G.Rudenskaya, T.Akimkina, D.Safina, I.Demidyuk, S.Kostrov // Microbiol. Res. -2006. (Принято в печать.)

6. Каюмов А. Р. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedius в условиях солевого стресса / А. Р. Каюмов, Н. П. Балабан, А. М. Марданова, С. В. Костров, М. Р. Шарипова // Микробиология. -2006. (Принято в печать.)

7. Каюмов А.Р. Биосинтез протеиназ Bacillus intermedius регулируется двухкомпонентной системы трансдукции сигнала DegS-DegU / А.Р. Каюмов, А.Р. Сабирова, Р.А.Байрамов, М.Р. Шарипова // Тезисы докладов IV научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета. -Казань. -16-17 марта 2004. -С.39.

8. Каюмов А.Р. Роль двухкомпонентной системы трансдукции сигнала DegS-DegU В регуляции синтеза протеиназ Bacillus intermedius / А.Р. Каюмов, А.Р. Сабирова, Р.А.Байрамов, Л.А. Габдрахманова, С.В. Костров, М.Р. Шарипова // Сборник тезисов 8-й Международной Путинской школы-конференции молодых ученых "БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА". -Пущино. -17-21 мая 2004 г. -С.13-14.

9. Каюмов А.Р. Участие двухкомпонентной системы трансдукции сигнала DegS-DegU в регуляции синтеза сериновой и металлопротеиназы Bacillus intermedius / А.Р. Каюмов, А.Р. Сабирова, Р.А.Байрамов, М.Р. Шарипова //Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». -Казань. -17-18 июня 2004.

С.46-47.

Ю.Кириллова Ю.М. Регуляция синтеза субтилизина Bacillus intermedius / Ю.М. Кириллова, А.Р. Каюмов, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова //Материалы научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». -Казань. -17-18 июня 2004. -С. 14-15.

11. Каюмов А.Р. Анализ нуклеотидной последовательности гена сериновой протеиназы Bacillus intermedius! А.Р. Каюмов, А.Р. Сабирова, Р.А.Байрамов, М.Р. Шарипова // Материалы 9-й международной путинской школы-конференции молодых ученых "БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА". -Пущино. -18-22 апреля 2005. -С.8.

12.Каюмов А.Р. Роль двухкомпонентной системы трансдукции сигнала DegS-DegU в регуляции синтеза протеиназ Bacillus intermedius / А.Р. Каюмов, Р.А.Байрамов, А.Р. Сабирова, М.Р. Шарипова //Материалы XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». -Казань. -4-8 апреля 2005.-С.14-15.

1 З.Кириллова Ю.М. Закономерности биосинтеза протеиназы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ73/ Ю.М. Кириллова, Е.О. Михайлова, А.Р. Каюмов, М.Р. Шарипова //Материалы XIII международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». -Казань. -4-8 апреля 2005. -С.44-45.

14.Каюмов А.Р. Анализ промоторной области гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius / А.Р. Каюмов, Р.А.Байрамов, А.Р. Сабирова, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова //Материалы V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес». -Казань. -9 июня 2005. -С.76-77.

15.Каюмов А.Р. Сравнительный анализ промоторной области последовательности генов субтилизинов бацилл / А.Р. Каюмов, А.Р. Сабирова, P.A. Байрамов, М.Р. Шарипова // Материалы Молодежной школы конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», 1-3 ноября 2005, Москва. -С.73-74.

16.Каюмов А.Р. Идентификация стартового кодона субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius / А.Р. Каюмов, P.A. Байрамов, М.Р. Шарипова // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». -Москва. -12-15 апреля 2006.

17.Шамсутдинов Т.Р. Влияние системы регуляции азотного обмена на биосинтез сериновых протеиназ B.intermedius в клетках B.subtilis / Т.Р. Шамсутдинов, А.Р. Каюмов, P.A. Байрамов, М.Р. Шарипова // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». -Москва. -12-15 апреля 2006.

18.Каюмов А.Р. Идентификация стартового кодона субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermediusl А.Р. Каюмов, P.A. Байрамов, М.Р. Шарипова // Материалы 10-й международной путинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 17-21 апреля, 2006, -С.21.

19.Шамсутдинов Т.Р. Влияние системы регуляции азотного обмена на биосинтез сериновых протеиназ B.intermedius в клетках B.subtilis / Т.Р. Шамсутдинов, А.Р. Каюмов, P.A. Байрамов, М.Р. Шарипова // Материалы 10-й международной путинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 17-21 апреля, 2006, -€.60.

Подписано в печать 49. С4. 2006г. Формат бумаги 60x84/16. Объем 1,5 уч.-изд. Тираж 100 экз. Заказ № ¿яг

Печатно-множительный отдел КГАСУ 420043, г. Казань, ул. Зеленая, 1.

I *

i i

I |i

¿ооб£

9¿>6f

906ft

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каюмов, Айрат Рашитович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

• ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Механизмы регуляции экспрессии генов бацилл.

1.1. Двухкомпонентные системы трансдукции сигнала.

1.2. Системы глобальной регуляции.

1.3. Сигма факторы транскрипции.

1.4. Посттрансляционная регуляция.

1.5. Регуляция путем внутриклеточного протеолиза факторов транскрипции.

II. Субтилизиноподобные протеиназы.

2.1. Семейство сериновых субтилизиноподобных протеиназ, структура и свойства.

2.2. Характеристика субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии"

Актуальность проблемы. Эффективность метаболизма бактериальной клетки определяется балансом процессов анаболизма и катаболизма. На их активацию и репрессию влияют факторы окружающей среды. У бактерий выработались механизмы, позволяющие координировать метаболизм в зависимости от доступности и разнообразия питательных веществ. Долгое время исследования ученых были посвящены выяснению роли индивидуальных сигнальных систем. Взаимодействие различных регуляторных путей, их значимость и приоритетность все чаще становится объектом внимания исследователей. Множественная регуляция экспрессии поздних катаболитных генов отражается на организации структуры их промоторов. Анализ взаимного расположения сайтов регуляции в промоторной области гена позволяет предсказать возможные механизмы активации его транскрипции. Несмотря на революционный прорыв современных методов биоинформатики и молекулярной биологии, идентификация последовательностей для взаимодействия с регуляторами транскрипции является сложной задачей. Даже в бактериальных клетках пока не установлены функции всех факторов транскрипции, обнаруженных при секвенировании геномов. Для многих из идентифицированных регуляторных белков остается невыясненной последовательность нуклеотидов в сайтах взаимодействия с ДНК (Joseph et al., 2005). Несмотря на это, методы биоинформатики позволяют прогнозировать результаты с достаточно высокой точностью (95-98%) (Mironov et al., 1999).

Бактерии Bacillus intermedius секретируют различные протеиназы, среди которых доминирует субтилизиноподобная сериновая протеиназа (AprBi), ее доля составляет до 80% от пула внеклеточных протеиназ, выделяемых этими бактериями в среду (Шарипова с соавт., 2000). Белок выделен из культуралыюй жидкости на разных фазах роста и изучены его основные физико-химические и каталитические свойства (Балабан с соавт., 1994, 2004). Ген протеиназы был клонирован в лаборатории проф.

С.В.Кострова (ИМГ РАН) на плазмиде pCS9, производной вектора рСВ22 (Sorokin et al., 1990). Экспрессия гена aprBi в штамме B.subtilis AJ73, дефицитном по собственным внеклеточным протеиназам, показала два максимума протеолитической активности: в ранней и поздней стационарной фазах роста (Кириллова с соавт., 2006). Поздняя и ранняя протеиназы различаются по некоторым физико-химическим характеристикам и условиям биосинтеза. Предполагается, что это связано со сложной системой регуляции экспрессии гена этого фермента на различных фазах роста бактерий. Для выяснения механизмов регуляции экспрессии гена aprBi на разных стадиях роста, включая период перехода в стационарную фазу роста, представляло интерес определить нуклеотидную последовательность гена фермента.

Целью работы явилось определение и анализ нуклеотидной последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы В .intermedins, и исследование влияния двухкомпонентной системы DegS-DegU и азотной катаболитной репрессии на экспрессию гена. В работе решались следующие задачи:

1. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius, определение сайта инициации трансляции в гене aprBi.

2. Исследование экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius в условиях солевого стресса.

3. Выяснение роли двухкомпонентной системы DegS-DegU в регуляции экспрессии гена aprBi.

4. Определение вклада азотной катаболитной репрессии в регуляцию экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius.

5. Исследование влияния белков NrgA и NrgB, участвующих в азотном обмене бацилл на экспрессию гена aprBi.

Научная новизна. Установлена последовательность нуклеотидов гена сериновой субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius. Для анализа структуры гена применен подход, основанный на оценке его последовательности современными методами биоинформатики. Определены потенциальные сайты регуляции в промоторе гена и особенности их расположения. Установлено, что трансляция в гене aprBi начинается с нестандартного GTG кодона. Впервые установлено, что синтез протеиназы B.intermedius активируется в условиях солевого стресса в отличие от субтилизина B.subtilis. Получены приоритетные данные о регуляции экспрессии гена сериновой протеиназы B.intermedius со стороны двухкомпонентной системы трансдукции сигнала DegS-DegU. Впервые показано, что экспрессия гена aprBi регулируется механизмом азотной катаболитной репрессии. Установлено, что в ранней стационарной фазе роста экспрессия гена протеиназы зависит от белка NrgB, участвующего в азотном обмене бацилл.

Практическая значимость. Данные сиквенса гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius занесены в базу данных Международного ГенБанка (AN AY754946) и могут быть использованы для сравнительного анализа белков этой группы. Примененные в работе методы биоинформатики позволили провести анализ структуры промотора гена, что в целом расширяет представление о строении «поздних» генов, находящихся под множественной регуляцией. Полученные в работе данные о механизмах контроля синтеза внеклеточных ферментов бацилл могут быть использованы при конструировании систем экспрессии для получения высокоэффективных промышленных штаммов-продуцентов целевых белков.

Связь работы с научными программами. Работа проводилась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Федерального агентства по образованию А04-2.12-783, Академии Наук республики Татарстан 03-3.10-295/2004(Ф), программой ДААД и Минобрнауки РФ «Михаил Ломоносов» А/04/39635 и А/05/58617.

Апробация работы Основные положения диссертации представлены на ежегодных научных конференциях молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003, 2004), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), Всероссийской научной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), всероссийской молодежной конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии», (Москва, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», (Москва, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю профессору М.Р.Шариповой за внимательное отношение к работе; к.б.н. с.н.с. Н.П.Балабан за постоянную помощь в проведении экспериментов; профессору С.В.Кострову (ИМГ РАН) за предоставление плазмид pCS9 и рСВ22; профессору Ю.Йомантасу (ГНИИ Генетика и Селекция Промышленных микроорганизмов) за предоставление протеазодефицитного штамма B.subtilis; к.б.н. с.н.с. И.В.Демидюку (ИМГ РАН) за консультацию при проведении экспериментов по мутагенезу точки инициации трансляции; профессору К.Форшхаммеру (Университет Гиссена, Германия) за научную консультацию в области регуляции азотного обмена бактерий; профессору Я. Маартен Ван Дижлу (университет Гронингена, Голландия) за предоставление для работы штаммов B.subtilis, мутантных по Deg-белкам; доктору биологических наук Й.Штульке (Университет Геттингена, Германия) за предоставленные штаммы B.subtilis, дефектные по белкам NrgA и NrgB.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Механизмы регуляции экспрессии генов бацилл

В процессе жизнедеятельности бактерии постоянно сталкиваются с неблагоприятными факторами. Поэтому у микроорганизмов в процессе эволюции выработались различные механизмы ответа на эти воздействия. Результатом адаптационных ответов является экспрессия одного или группы генов, обеспечивающих выживание и пролиферацию клетки: синтез и секреция внеклеточных ферментов, антибиотиков, различные формы таксиса, приобретение генетической компетентности и, наконец, переход в покоящееся состояние - споруляция.

Регуляция экспрессии генов у бактерий осуществляется в основном на уровне транскрипции. Ведущая роль в этом процессе принадлежит РНК-полимеразе. Ее взаимодействие со специфическими участками ДНК -промоторами осуществляется благодаря дополнительному полипептиду - а-фактору транскрипции, который специфически связывается с консервативными последовательностями нуклеотидов (Haldenwang, 1995). Комплекс а-фактора и ДНК взаимодействует с кор-ферментом РНК-полимеразы и инициирует процесс транскрипции. Кроме а-факторов, многие ДНК-связывающие белки способны оказывать существенное влияние на эффективность транскрипции, являясь ее репрессорами или активаторами. Благодаря взаимодействию этих регуляторных механизмов в клетке осуществляется многоуровневый контроль синтеза белков в ответ на воздействия окружающей среды.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Каюмов, Айрат Рашитович

выводы

1. Определена нуклеотндная последовательность гена субтилизиноподобной сериновой протеиназы B.intermedius {aprBi) (AN AY754946). Установлены потенциальные сайты регуляции и особенности их расположения в промоторной области гена. Выявлена высокая гомология (>90%) гена aprBi с геном субтилизиноподобной протеиназы B.pumilus (аргР). Установлено, что трансляция в гене aprBi начинается с нестандартного GTG-кодона.

2. Установлено, что экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius рекомбинантным штаммом B.subtilis активируется в условиях солевого стресса (1 М хлорид натрия, 0,25 М цитрат натрия).

3. Установлено, что экспрессия гена aprBi позитивно регулируется двухкомпонентной системой трансдукции сигнала DegS-DegU, ответственной за синтез ферментов деградации, и зависит от фосфорилированной формы белка DegU.

4. Показано, что экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius в рекомбинантном штамме B.subtilis регулируется механизмом азотной катаболитной репрессии: уровень протеолитической активности при росте на синтетической среде с хлоридом аммония снижается в 3 раза по сравнению с нитратом натрия.

5. Установлена взаимосвязь экспрессии гена aprBi с азотным обменом: белок NrgB, участвующий в азотном метаболизме бацилл, активирует экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius в условиях азотного голодания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время становится актуальным вопрос о координированном контроле экспрессии генов, активирующихся в стационарную фазу роста, со стороны различных регуляторных механизмов. Наглядным примером является взаимодействие регуляторных систем ComP-ComA, DegS-DegU и SpoOA, а также контроль метаболизма аминокислот одновременно системами углеродной и азотной катаболитной репрессии. Множественный контроль, осуществляемый различными регуляторными белками, отражается на построении и организации промоторной области генов. Современные методы биоинформатики позволяют путем анализа нуклеотидной последовательности установить потенциальные регуляторные системы, участвующие в контроле транскрипции гена.

Бактерии B.intermedius секретируют в среду субтилизиноподобную протеиназу в период постэкспоненциального роста. Установлено, что ферменты, соответствующие ранней и поздней стационарной фазе, являются продуктом одного гена (aprBi), но различаются по механизмам регуляции биосинтеза и свойствам соответствующих им белков (Кириллова с соавт., 2006). В регуляции экспрессии гена субтилизина B.subtilis в фазе замедления роста активное участие принимает двухкомпонентная система DegS-DegU (Kunst et al., 1995). Несмотря на то, что продукт гидролиза белков -аминокислоты являются источником восстановленного азота, в литературе нет сведений о регуляции синтеза протеиназ со стороны азотной катаболитной репрессии.

Данная работа посвящена исследованию структуры гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius с применением методов биоинформатики, а также выяснению роли двухкомпонентной системы DegS-DegU, участвующей в контроле синтеза ферментов деградации, и азотной катаболитной репрессии в регуляцию экспрессии гена фермента в период перехода бацилл от экспоненциального роста к стационарной фазе и споруляции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы и плазмиды. В качестве исходного штамма использовали штамм Bacillus intermedius 3-19 из музея Казанского университета. Штаммом-реципиентом для плазмид с геном субтилизиноподобной протеиназы В .intermedius служил штамм Bacillus subtilis AJ73, дефицитный по внеклеточным протеиназам, предоставленный проф. Ю.Йомантасом, ГНИИ Генетика. Штаммы B.subtilis 8G5 AdegSAdegU (like 8G5; degS, degU; Кшг), дефектный по генам degS и degU, B.subtilis 8G5 degU32(Ну) (like 8G5; degU32(Ну); Km1) с мутацией по гену degU, ведущей к Ну-фенотипу и B.subtilis 8G5 (trpC2; tyr; his; nic; ига; rib; met; ade; sipP) с полноценными регуляторными белками предоставлены доктором Я. Маартен Ван Дижлом, университет Гронингена, Голландия. Штаммы B.subtilis 168 (trpC2), B.subtilis GP254 (trpC2; nrgA, Cmr), B.subtilis GP253 (trpC2\ nrgB, Cm1) предоставлены проф. Штульке, университет Геттингена, Германия.

Плазмида pCS9, несущая ген aprBi, и вектор рСВ22 были предоставлены для работы проф. Костровым, ИМГ РАН, Москва. Плазмида pCS9 сконструирована путем лигирования в шаттл-вектор рСВ22 (BamHl) (Sorokin et al., 1990) фрагментов рестрикции хромосомы B.intermedius 3-19 по сайту Sau3A. Плазмиды рКА, рКТ, pKG, pKTG получены в работе на основе вектора рСВ22 (Sorokin et al., 1990) и содержат модифицированные гены субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius, несущие мутации в одном из потенциальных стартовых кодонов (табл. 2).

Питательные среды. Культивирование штаммов B.subtilis проводили на следующих средах:

Среда LB (Sambrook et al., 1989) (%): триптон - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,5; NaCl - 0,5; рН 8.5. Агаризованная среда LBA включает дополнительно 2% агара.

Табл. 2. Плазмиды, полученные в работе.

Плазмида Маркер Нуклеотидная замена в предполагаемых стартовых кодонах Аминокислотная замена рКА Em ATG -> СТА met -> leu pKG Em GTG -> GCT val -> ala рКТ Em TTG ->ТСС leu -> ser pKTG Em Двойная замена: GTG -> GCT, TTG -> ТСС val -> ala leu -> ser

Для создания условий солевого стресса в среду LB дополнительно вносили хлорид натрия и цитрат натрия до конечных концентраций 1М и 0,25М соответственно.

Солевая основа среды Спицайзена (%) (Anagnostopolous et al., 1961): К2НРО4Х 3H20 - 18,34; КН2Р04 (безводный) - 6,0; (NH4)2S04- 2,0; цитрат Na

- 1,2. Отдельно готовили растворы: глюкоза - 40%; казаминовые кислоты -200 мг/10мл; MgS04 - 2 г/10 мл.

Среда Спицайзена I: на 100 мл Н20: глюкоза - 2 мл; казаминовые кислоты - 2 мл; дрожжевой экстракт - 2 мл; Mg S04 - 0,1 мл; солевая основа

- 10 мл.

Среда Спицайзена И: на 100 мл Н2О: глюкоза - 2 мл; казаминовые кислоты - 1 мл; MgS04 - 8 мкл; солевая основа - 10 мл. Среды для трансформации протопластов: АВМ - антибиотическая среда фирмы Difco 17,5 г/л ("Difco"). 2XSMM (г/л): сахароза - 171,2; малеиновая кислота - 23,2; MgCl2x6H20 -40,6.

SMMP: 2XSMM + 4ХАВМ.

Регенерационный агар (г/л): сукцинат Na - 59; казаминовые кислоты -5; дрожжевой экстракт - 5; К2НР04- 3,5; КН2Р04 - 1,5; глюкоза - 5; MgCl2x6H20 - 4,06; агар - 8.

Молочный агар для отбора клонов, способных секретировать протеиназу включает 30% обезжиренного молока и 2% агара.

Среда SMM (Saxild et al., 1987):

Солевая основа (%): К2НР04 х ЗН20 - 18,34; КН2Р04 (безводный) - 6,0; MgS04 х 7Н20 - 0,2; цитрат Na х ЗН20 - 6. Отдельно готовили растворы: L-триптофан - 5 мг/мл; NaN03 - 170 г\л; (NH4)2S04 - 152 г\л.

Микроэлементы (г/л): СаС12 - 0,55; FeCl2 х 6Н20 - 1,35; МпС12 х 4Н20 -0,1; ZnCl2 - 0,17; CuCl2 х 2Н20 - 0,043; СоС12 х 6Н20 - 0,06; Na2Mn04 х 2Н20 -0,06.

Среда SMM: на 100 мл среды: L-триптофан - 1 мл; микроэлементы - 1 мл; солевая основа 10 мл; NaN03 или NH4C1 в зависимости от цели эксперимента - 1 мл; Н20 - 85 мл.

Среды стерилизовали при 1 атм. в течение 30 мин. рН доводили перед стерилизацией среды 40%-ным раствором NaOH до значения 8,5.

При выращивании рекомбинантных штаммов в среду вносили соответствующие антибиотики (конечная концентрация в среде): для штаммов B.subtilis с плазмидами pCS9, рКА, рКТ, pKG, pKTG -эритромицин (20 мкг/мл); для рекомбинантов E.coli - ампициллин (100 мкг/мл). В среду для культивирования B.intermedius 3-19 добавляли стрептомицин (500 мкг/мл). При культивировании штаммов B.subtilis мутантных по белкам NrgA и NrgB в среду дополнительно вносили хлорамфеникол (20 мкг/мл), для штаммов B.subtilis мутантных по белкам DegS и DegU - канамицин (20 мкг/мл).

Культивирование бактерий проводили в колбах объёмом 100 мл при соотношении объёма среды к объёму колбы 1:7,5 на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об/мин. Клетки бацилл выращивали при температуре 30°С, E.coli - при температуре 37°С. В качестве инокулята использовали 18 ч культуру, выращенную на среде LB. В экспериментах по влиянию источников азота на синтез протеиназы инокулят выращивали в течение 48 ч на среде SMM с 20 мМ NaN03.

Прирост биомассы определяли нефелометрически на ФЭК-56М с красным светофильтром (590 нм), разводя при необходимости культуральную жидкость таким образом, чтобы оптическая плотность составляла 0,25-0,35. За единицу биомассы принимали поглощение в 1 см кювете, равное единице. Количество биомассы выражали в единицах оптической плотности.

Продуктивность культуры (удельную активность) определяли как отношение активности фермента в культуральной жидкости к количеству биомассы и выражали в условных единицах (у.е.). Удельную скорость роста (ji) и удельную скорость накопления фермента (г) в культуральной жидкости рассчитывали по следующей формуле (Перт, 1980): ц = (ln(N1)-ln(No))/(TrTo), где Ni и No - значения оптической плотности в конечный (Tj) и начальный (То) момент времени, соответственно.

Для выявления эндоспор мазок окрашивали по Граму (Гусев, Минеева, 1985). Подсчет клеток со спорами проводили в режиме фазово-контрастной микроскопии (микроскоп Carl Zeiss Jena, Германия) при увеличении в 1600 раз не менее, чем в 5 полях зрения.

Определение активности субтилизиноподобной протеиназы проводили на синтетическом хромогенном субстрате Z-Ala-Ala-Leu-pNA. Реакционная смесь содержит 0,5 мл раствора субстрата в концентрации 0,5 мг на 1 мл диметилформамида, 2 мл 0,05 М трис-HCl- буфера, рН 8,5 и 50 мкл раствора фермента. Смесь инкубировали при 37°С до появления слабо-желтого окрашивания, после чего реакцию останавливали добавлением 200 мкл 50%-ной уксусной кислоты и измеряли поглощение опытной пробы против контрольной при 410 нм в 1см кювете. Контрольная проба содержала 0,5 мл раствора субстрата, 2 мл 0,05 М трис-HCl- буфера, рН 8,5, и 200 мкл 50%-ной уксусной кислоты; после инкубации при 37°С вносили 50 мкл фермента. За единицу активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:

ПА=Д-Р-*'2 в-т где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мл раствора фермента;

D - поглощение раствора при 410 нм;

Р - пересчет на 1 мл раствора фермента;

К - 0,37 - коэффициент молярной экстинкции паранитроанилида;

В - объем пробы фермента;

Т - время инкубации, мин.

Определение нуклеотидной последовательности гена aprBi проводили методом терминации цепи дидеоксинуклеотидами с использованием Thermo Sequenase™, Amersham Pharmacia Biotech. Синтетические олигонуклеотиды были подобраны с интервалом около 300 пар оснований. Последовательность занесена в базу данных ГенБанка AN AY754946.

Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ (грант №00-0455000).

Анализ последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius проводили с использованием алгоритма BLAST: пакета программ, представленных на сервере NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) (Altschul et al., 1997) и программы Vector NTI Suite 8.0. Поиск открытой рамки считывания и инициирующих кодонов проводили с помощью программы ORF Finder (www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf). Потенциальный старт-кодон трансляции определяли с использованием алгоритма SignalP http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/). который дает возможность определить вероятность функционирования олигопептида в качестве сигнальной последовательности белка (Bendtsen et al., 2004). Потенциальные -10 и -35 области для узнавания сА фактором транскрипции идентифицировали в промоторной области гена глутамилэндопептидазы В. intermedius при использовании сервера Softberry BPROM network (Helmann, 1995). Потенциальные участки связывания с а-факторами транскрипции и с белками-регуляторами DegU, SpoOA, СсрА и AbrB в регуляторной области гена aprBi были выявлены с использованием пакета программ Vector NTI Suite 8.0.

В работе использованы для сравнительного анализа последовательности генов субтилизиноподобных протеиназ бацилл, имеющиеся в свободном доступе на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov): ген сериновой протеиназы из Bacillus pumilus TYO-67 (AN AB029082), ген щелочной протеиназы А (аргА) из Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (AN AF170567), ген щелочной термостабильной протеиназы из Bacillus sp (AN D13158, S50880), ген протеиназы Карлсберг из Bacillus licheniformis Х91261 strain 14353 (ANX91261).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с помощью термоциклера «Терцик» производства фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием Pfu-полимеразы фирмы «Сибэнзим» (Россия), как описано (Sambrook et al., 1989). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 0,030,04 мкг плазмидной ДНК, 10 пикамоль каждого праймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 20 mM Tris-HCl (рН 8,8 ), 10 mM КС1, 10 mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0.1% Triton Х-100 и 2,0 ед. Pfu-полимеразы ("Сибэнзим"). Режим ПЦР: денатурация ДНК при 95°С в течение 4 минут, затем: 94°С - 40 сек, отжиг олигонуклеотидов - 1 мин., 72°С - время из расчета 500 нуклеотидов в мин, всего - 30 циклов, с заключительным синтезом при 72°С в течение 7 мин. При проведении ПЦР с использованием мегапраймера время отжига праймеров увеличивали до 2 мин. Температуру отжига праймеров считали по формуле Т = 2(A+T)+3(G+C), где А, Т, G, С количество соответствующих нуклеотидов в синтетическом олигонуклеотиде.

Рестрикцию ДНК проводили рестриктазами фирмы «Сибэнзим» в течение 2 ч при 37°С в условиях, рекомендованных производителем. 25 мкл реакционной смеси включало: буфера для рестриктазы - 2,5 мкл, плазмидной ДНК - 5 мкг, фермента - 10 ед.

Картирование фрагмента хромосомы B.intermedius, клонированного на плазмиде pCS9, проводили с использованием рестриктаз фирмы «Сибэнзим». Плазмиду pCS9 и вектор рСВ22 рестрицировали по отдельности ферментами Bglll, BamHl, EcoRl, EcoRV, HindiII, Ncol, Pstl, а также их комбинациями. Затем проводили электрофорез образовавшихся фрагментов в агарозном геле с маркерами молекулярного веса. Результаты анализировали с помощью средств пакета программ Vector NTI Suite 8.0.

Лигирование ДНК проводили при температуре 4°С в течение ночи в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 3 мкл лигазного буфера и 5 ед.акт. лигазы Т4 («Сибэнзим») на 1 мкг ДНК.

Конструирование плазмид рКА, рКТ, pKG, pKTG, несущих ген субтилизиноподобной протеиназы B.intermedius с мутациями в потенциальных сайтах инициации транскрипции.

Схема конструирования плазмид с мутациями в гене aprBi представлена на рис. 6. Получение амплификата ДНК гена протеиназы B.intermedius с мутацией в предполагаемом сайте инициации трансляции проводили в 2 этапа с предварительным синтезом мегапраймера как описано в (Sambrook et al., 1989). Использованные синтетические олигонуклеотиды (праймеры) представлены в таблице 3.

На первом этапе проводили амплификацию 5'- области гена aprBi. Правый праймер имел замену нуклеотидов, ведущую к мутации одного из предполагаемых инициирующих кодонов: ATG->CTA (Met->Leu), GTG->GCT (Val->Ala), TTG ->TCC (Leu->Ser).

Табл. 3. Синтетические олигонуклеотиды, использованные в работе.

Название праймера Последовательность праймера

Pml 5' GAATGGGGATCCCTTGATTACAACGTGGTCAG 3'

Sub TTG 5' CTTTTTCACGCAGGATCCACATCCC 3'

Sub GTG 5' CTTTTTAGCGCACAATCCACATCCC 3'

Sub TTG GTG 5' CTTTTTAGCGCAGGATCCACATCCC 3'

Sub ATG 5' CAGCCAATAAAACACTTGTTAGCAC 3'

Sub term 5' AGAGAGGGATCCGAGAGGCAGGGGTGACGTCTTTTC 3' Нуклеотиды, ведущие к образованию мутаций выделены жирным. Сайт узнавания рестриктазой ВатН 1 подчеркнут.

Синтезированный полинуклеотид уже нес замену нуклеотидов в одном из потенциальных сайтов инициации трансляции и служил левым праймером на втором этапе ПЦР, который проводился в этой же реакционной смеси после дополнительного внесения высокотемпературного правого праймера, дезоксинуклеотидов и ДНК-полимеразы. У полученных линейных ДНК фосфорилировали 5'-конец киназой фага Т4 и лигировали с вектором рСВ22, который был предварительно линеаризирован рестриктазой EcoRV с образованием тупых концов. Лигазную смесь снова рестрицировали ферментом EcoRV, чтобы отобрать те плазмиды, у которых имеется вставка по этому сайту. Клоны отбирали рестрикционным анализом: выделенные плазмиды рестрицировали по BamHl и отбирали те, при расщеплении которых образовывались фрагменты величиной 1,8 kb в случае плазмид рКА и pKG и величиной 1,4 и 0,4 kb в случае плазмид рКТ и pKGT.

Bam HI pmi aprBi Sub TTG

Мутация в одном из ' §ub qjq потенциальных I §иЬ Ajq старт-кодонов * Sub TTG QTG

BamHI

Мегапраймеры

M TTG ТСС) MGTG (-*GCT) М ATG СТА) M TTG GTG (-*TCC GCT)

BamHI Мегапраймер aprBi

BamHI i

BamHI aprBi-NTG

1утация в стартовом кодоне

4 модифицированых гена протеиназы с мутациями в предполагаемых стартовых кодонах: A(C)TG(A), TT(C)G(C), GT(C)G(T), а также TT(C)G(C) и GT(C)G(T) одновременно

Ар res

Sub term

BamHI

Lac OP

AprBi-NTG

Em res

I этап: амплификация 5' области гена aprBi.

Синтез четырех мегапраймеров, несущих замену нуклеотидов в одном из потенциальных стартовых кодонов

II этап: амплификация кодирующей области гена aprBi.

III этап:

Полученные модифицированные гены были лигированы в шаттл-вектор рСВ22 по сайту EcoRV. Клоны отбирали рестрикционным анализом по сайту BamHI

Рис. 6. Схема конструирования плазмид рКТ pKG рКА и pKGT на основе вектора рСВ22.

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989): 1,5 мл ночной культуры центрифугировали в течение 5 мин на центрифуге Эппендорф при 4 тыс.об/мин. Осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора I (50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-HCl, рН 8,0 и 10 мг/мл лизоцима в случае бацилл). Суспензию инкубировали в течение 1 ч при качании 200 об/мин и температуре 37°С. К смеси добавляли 400 мкл свежеприготовленного раствора II (0,2 н NaOH и 1% SDS). Содержимое перемешивали и выдерживали в ледяной бане 2 мин. Добавляли 300 мкл охлажденного раствора 3 М ацетата калия (рН 4) и инкубировали при температуре -20°С в течение 20-30 мин. Смесь центрифугировали на холоду при 13 тыс. об/мин в течение 15 мин. К супернатанту добавляли 0,6 V (540 мкл) изопропанола и инкубировали в течение 15-20 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугировали в течение 15 мин при 11 тыс. об/ мин. Осадок промывали 70% этанолом, высушивали при 65°С и ресуспендировали в 200 мкл дистиллированной воды. К раствору добавляли 100 мкл ацетата аммония и инкубировали в морозильнике в течение 40-60 мин. Смесь центрифугировали в течение 15 мин при 13 тыс. об/ мин. К супернатанту добавляли 0,6 V изопропанола (200 мкл) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугировали в течение 15 мин при 10 тыс. об/ мин. Осадок промывали 2-3 раза 70% этанолом и один раз 96% этанолом, просушивали и ресуспендировали в 20 мкл дистиллированной воды.

Электрофорез проводили в горизонтальном агарозном геле (7х 4,5 х0,5 см). Концентрация агарозы в геле составляла 1%. В качестве электродного буфера использовали 0,04М трис-ацетатный буфер (рН 7,5-7,8), содержащий 0,002М ЭДТА, рН 8,0. Буфер для нанесения проб: 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина в воде (температура хранения 4°С). Пробу с краской смешивали в соотношении 3:1(6 мкл пробы и 2 мкл краски). Электрофорез проводили при силе тока 50 мА. По окончании гель в течение 15 мин выдерживали в растворе бромистого этидия в концентрации

0,5 мкг/мл. Окрашенный гель просматривался в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.

Трансформация клеток В. subtilis плазмидными ДНК (Anagnostopolous et al., 1961).

Получение компетентных клеток: 1 колонию с чашки переносили в 2 мл L-бульона и инкубировали в течение ночи при 37°С на качалке со скоростью 200 об/мин 0,5 мл ночной культуры переносили в 4,5 мл среды Спицайзена I, выращивали 4,5 ч при 37°С на качалке со скоростью 200 об./мин. Отбирали 1,5 мл культуры и засевали 10 мл среды Спицайзена II, в которую вносили 80 мкл MgS04. Выращивали 1,5 ч при 37°С.

Трансформация: к 500 мкл компетентных клеток добавляли ДНК (1 мкг) и инкубировали 1 ч при 37°С. Инкубировали на качалке со скоростью 200 об/мин при 37°С в течение 1 ч, затем рассевали на L-arap с соответствующим антибиотиком.

Трансформация протопластов B.subtilis плазмидной ДНК (Chang et al., 1979).

Получение протопластов:

1 колонию с чашки переносили в 2 мл среды АВМ и инкубировали в течение ночи при 37°С на качалке со скоростью 200 об/мин. 2% инокулята засевали 10 мл среды АВМ, инкубировали 2-2,5 ч до концентрации клеток 10-20 млн/мл. Клетки собирали центрифугированием в течение 10 мин при 4000 об/мин. Клетки ресуспендировали в 1 мл среды SMMP и добавляли раствор лизоцима в SMMP до конечной концентрации 2 мг/мл. Клетки инкубировали в течение 30-90 мин при 37°С при качании со скоростью 50 об/мин. Образование протопластов контролировали микроскопированием. Протопласты собирали центрифугированием в течение 10 мин при 7000 об/мин, отмывали средой SMMP и ресуспендировали в 0,5 мл среды SMMP.

Трансформация протопластов B.subtilis :

К 0,5 мл суспензии протопластов добавляли раствор ДНК, предварительно смешанный с равным объемом среды 2xSMM и 1,5 мл 40% раствора полиэтиленгликоля в среде lxSMM. Смесь осторожно перемешивали и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. К смеси добавляли 5 мл среды SMMP и инкубировали в течение 90 мин при 37°С при скорости качания 50 об/мин. Рассевали на регенерационный агар с соответствующим антибиотиком и выращивали 2 суток при 37°С. Отбор клонов трансформантов с протеолитической активностью проводился на молочном агаре с антибиотиком.

Математическую обработку результатов проводили с помощью программы SPSS 12.0 путем расчета среднеквадратичного отклонения (а). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении а<10%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стыодента, принимая Р<0.05 за достоверный уровень значимости.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каюмов, Айрат Рашитович, Казань

1. Балабан Н. П. Щелочная внеклеточная протеиназа Bacillus intermedius. Выделение, очистка и некоторые свойства фермента / Н. П. Балабан, М. Р. Шарипова, А. М. Усманова, Е. А. Ицкович, И. Б. Лещинская // Биохимия. - 1993. - Т. 58. - №. 12.-С. 1923-1928.

2. Балабан Н. П. Секретируемая сериновая протеиназа спорообразующих бактерий Bacillus intermedius 3-19 / Н.П. Балабан, М. Р. Шарипова, Е. Л. Ицкович, И. Б. Лещинская, Г. Н. Руденская // Биохимия. 1994. - Т. 59. - №9. - С. 1393-1400.

3. Головлев Е. Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы / Е. Л. Головлев // Микробиология. 1999. - Т. 68. -№5.-С. 623-631.

4. Гусев М.В. Микробиология. / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. -М.: Изд. Московского университета, 1985. 376с.

5. Ицкович Е. Л. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы B.intermedius 3-19 / Е. Л. Ицкович, Л. В. Знаменская, Н. П. Балабан, Т. А. Ершова, И. Б. Лещинская // Микробиология. 1995. - Т. 64. - №5. - С. 623-629.

6. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Перт. -М.: Мир, 1980.-331 с.

7. Смирнова Г.В. Роль глутатиона в ответе Escherichia coli на осмотический стресс / Г.В. Смирнова, Т.А. Красных, О.Н. Октябрьский // Биохимия. -2001. -Т.66. № 9. -С.973-978.

8. Шарипова М. Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках B.intermedius / М. Р. Шарипова, Е. В. Шакиров, Н. П. Балабан, JI. А. Габдрахманова, М. А. Шилова, Г. Н. Руденская, И. Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. - №5. - С. 680-697.

9. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedins / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2002. -Т.71. - №4. - С. 494-499.

10. Altschul S. F. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs / S. F. Altschul, T. L. Madden, A. A. Schaumluffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller, D. J. Lipman // Nucleic. Acids Research. 1997. - V. 25. - P. 3389-3402.

11. Amati G. DegU-P represses expression of the motility fla-che operon in Bacillus subtilis / G. Amati, P. Bisicchia, A. Galizzi. // J Bacterid. -2004. -V.186. -P.6003-6014.

12. Anagnostopolous, C. and Spizizen, J., 1961. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 81, 741-746

13. Anderson E.T. The pro-sequence domain of streptopain directs the folding of the mature enzyme / E.T. Anderson, L.A. Winter, P. Fernsten, S.B. Olmsted, Y.V. Matsuka // Arch Biochem Biophys. -2005. -V.436. -P.297-306.

14. Aoyama M. Sequence of the gene encoding serine proteinase of Bacillus pumilus /

15. C.Toma, M. Yasuda, M.Iwanaga // Microbial Immunology. 2000. V.4. - 1.5. -P.389-393.

16. Arnorsdottir J. Crystal structure of a subtilisin-like serine proteinase from a psychrotrophic Vibrio species reveals structural aspects of cold adaptation / J. Arnorsdottir, M.M. Kristjansson, R.Ficner// FEBS J. -2005. -V.272. -P.832-845.

17. Bendtsen J. D. Improved prediction of signal peptides: SignalP3.0 / J. D. Bendtsen, H. Nielsen, G. von Heijne, S. Brunak // Molecular Biology. -2004. -V.340. -P. 783-795.

18. Barrett J. F. Two-Component Signal Transduction as a Target for Microbial Anti-Infective Therapy / J. F. Barrett, J. A. Hoch // Antimicrob Agents and Chemotherapy. -1998.-V.42. -P.1529-1536.

19. Belitsky B. R. Role of TnrA in nitrogen source-dependent repression of Bacillus subtilis glutamate synthase gene expression / B. R. Belitsky, L. V. Wray, S. H. Fisher,

20. D. E. Bohannon, A.L. Sonenshein //J. Bact. -2000. -V.182. -P.5939-5947.

21. Bergara F. CodY is a nutritional repressor of flagellar gene expression in Bacillus subtilis // F. Bergara, C. Ibarra, J. Iwamasa, J. C. Patarroyo, R. Aguilera, L. M. Marquez-Magana // J. Bacteriol. -2003. -V.185. -P.3118-3126.

22. Bignell D.R. The putative anti-anti-sigma factor BldG is post-translationally modified by phosphorylation in Streptomyces coelicolor / D.R. Bignell, L.H. Lau, K.R. Colvin, B.K. Leskiw // FEMS Microbiol Lett. -2003. -V.225. -P.93-99.

23. Blencke H. Transcriptional profiling of gene expression in response to glucose in Bacillus subtilis: regulation of the central metabolic pathways / H.M. Blencke, G. Homuth, H.Ludwig, U.Mader, M. Hecker, J. Stulke // Metab Eng. -2003. -V.5.-P. 133-149.

24. Brandenburg J.L. Roles of PucR, GlnR, and TnrA in regulating expression of the Bacillus subtilis ure P3 promoter / J.L. Brandenburg, L.V. Wray, L. Beier, H. Jarmer, H.H. Saxild, S.H. Fisher. //J Bacteriol. -2002. -V.184. -P.6060-6064.

25. Bruckner R. Carbon catabolite repression in bacteria: choice of the carbon source and autoregulatory limitation of sugar utilization / R. Bruckner, F. Titgemeyer // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V. 209. - P. 141-148.

26. Bryan P. Energetics of folding subtilisin BPN' / P. Bryan, P. Alexander, S. Strausberg, F. Schwarz, W. Lan, G. Gilliland, D.T. Gallagher. // Biochemistry. -1992. -V.31. -P.4937-4945.

27. Burbulys D. The initiation of sporulation in Bacillus subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay / D. Burbulys, K. A. Trach, J. A. Hoch // Cell. 1991. -V. 64.-P. 545-552.

28. Cervin, M. A. The Bacillus subtilis regulator SinR inhibits spoIIG promoter transcription in vitro without displacing RNA polymerase / M. A. Cervin, R. J. Lewis, J. Brannigan, G. Spiegelman//Nucleic Acids Res. -1998. -V.26. -P.3806-3812.

29. Chang S. High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA/S.Chang, S.N. Cohen//Mol. Gen. Genet. -1979. -V.168. -P.llll-1115.

30. Chang B.Y. The response of a Bacillus subtilis temperature-sensitive sigA mutant to heat stress / B.Y. Chang, K.Y. Chen, Y.D. Wen, C.T. Liao // J Bacterid. -1994. -V.176. -P.3102-3110.

31. Chang Y.S. Mutational analysis of the autoprocessing site of subtilisin YaB-G124A / Y.S. Chang, S.H. Liaw, H.C. Mei, C.C. Hsu, C.Y. Wu, Y.C. Tsai. // Biochem Biophys Res Commun. -2002. -V.291. -P.165-169.

32. Clarkson J. Efficient regulation of sigmaF, the first sporulation-specific sigma factor in B.subtilis / J. Clarkson, I.D. Campbell, M.D. Yudkin. // J Mol Biol. -2004. -V.342. -P. 1187-95.

33. Commichau F.M. Regulatory link between carbon and nitrogen metabilism / F.M. Commichau, K. Forchhammer, J. Stulke // Curr Opin Microbiol. -2006. in press.

34. Cutting S A forespore checkpoint for mother cell gene expression during development in B. subtilis / S. Cutting, V.Oke, A. Driks, R.Losick, S. Lu, L. Kroos // Cell. -1990. -V.62. -P. 239-250.

35. Cutting S. Forespore-specific transcription of a gene in the signal transduction pathway that governs Pro-sigma К processing in Bacillus subtilis / S. Cutting, A. Driks, R. Schmidt, B. Kunkel, R. Losick. // Genes Dev. -1991. -V.5. -P.456-466.

36. Dartois V. Characterization of a novel member of the DegS-DegU regulon affected by salt stress in Bacillus subtilis / V. Dartois, M. Debarbouille, F. Kunst, G. Rapoport // J. Bacteriol. 1998. - V.180. -№7. - P. 1855-1861.

37. Debarbouille M. The Bacillus subtilis sigL gene encodes an equivalent of sigma 54 from gram-negative bacteria / M. Debarbouille, I. Martin-Verstraete, F. Kunst, G. Rapoport. // Proc Natl Acad Sci U S A. -1991. -V.88. -P.9092-9096.

38. Debarbouille M. Role of BkdR, a transcriptional activator of the SigL-dependent isoleucine and valine degradation pathway in Bacillus subtilis / M. Debarbouille, R. Gardan, M. Arnaud, G. Rapoport//. J. Bacteriol. -1999. -181. -P.2059-2066.

39. Detsch C. Ammonium utilization in Bacillus subtilis: transport and regulatory functions of NrgA and NrgB / C. Detsch, J. Stulke // Microbiology. -2003. -V.149. -P.3289-3297.

40. Dodd I. B. Improved detection of helix-turn-helix DNA-binding motifs in protein sequences /1. B. Dodd, J. B. Egan // Nucleic Acids Res. -1990. -V.18. -P.5019-5026.

41. Doi R.H. Multiple prokaryotic ribonucleic acid polymerase sigma factors / R.H. Doi // Microbiol. Rev. -1986-V.50. -P.227-324.

42. Driks A. Compartmentalized expression of a gene under the control of sporulation transcription factor sigma E in Bacillus subtilis / A. Driks, R. Losick. // Proc Natl Acad Sci USA. -1991. -V.88. -P.9934-9938.

43. Dubnau D. Genetic competence in Bacillus subtilis / D. Dubnau // Microbiol. Rev. -1991. V. 55. - №3. - P. 395-424.

44. Dubnau, D. DNA uptake in bacteria / D. Dubnau // Annu. Rev. Microbiol. 1999. -V.53. -P.217-244.

45. Duncan L. SpoIIAB is an anti-sigma factor that binds to and inhibits transcription by regulatory protein sigma F from Bacillus subtilis / L. Duncan, R. Losick. // Proc Natl Acad Sci USA. -1993. -V.90. -P.2325-2329.

46. Eder S. Mutational analysis of the phoD promoter in Bacillus subtilis: implications for PhoP binding and promoter activation of Pho regulon promoters / S. Eder, W. Liu, F.M. Hulett. // J Bacteriol. -1999. -V.181. -P.2017-2025.

47. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. - №1. - P. 1-33.

48. Errington J. Establishment of cell-specific transcription during sporulation in Bacillus subtilis / J. Errington, N. Illing // Mol. Microbiol. 1993. - V. 6. - №6. - P. 689-695.

49. Evans L. Genetic analysis of the Bacillus subtilis sigG promoter, which controls the sporulation-specific transcription factor G / L. Evans, A. Feucht J. Errington // Microbiology. -2004. -V.150. -P.2277-2287.

50. Fabret C. Two-component signal transduction in Bacillus subtilis: how one organism sees its world / C. Fabret, V. A. Feher, J. A. Hoch // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. -P. 1975-1983.

51. Faires N. The catabolite control protein CcpA controls ammonium assimilation in Bacillus subtilis / N. Faires, S. Tobisch, S. Bachem, I. Martin-Verstraete, M. Hecker, J. Stiilke//J Mol Microbiol Biotechnol. 1999. -V.l. -P.141-148.

52. Fawcett P. The transcriptional profile of early to middle sporulation in Bacillus subtilis / P. Fawcett, P. Eichenberger, R. Losick, P. Youngman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 8063-8068.

53. Ferrari E. Trascription of Bacillus subtilis subtilisin and expression of subtilisin in sporulation mutants / E. Ferrari, D. J.Henner, M. Perego, J. A. Hoch // J. Bacteriolog. 1988. - V. 170.-P. 289-295.

54. Ferson A.E. Expression of the Bacillus subtilis gabP gene is regulated independently in response to nitrogen and amino acid availability / A.E. Ferson, L.V. Wray, S.H. Fisher. // Mol Microbiol. -1996. -V.22. -P.693-701.

55. Feucht A. Identification of sporulation genes by genome-wide analysis of the sigma E regulon of Bacillus subtilis / A. Feucht, L. Evans, J. Errington // Microbiology. -2003. -V.149. -P.3023-3034.

56. Fillinger S. Two glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases with opposite physiological roles in a nonphotosynthetic bacterium / S. Fillinger, S. Boschi-Muller, S.Azza, E. Dervyn, G. Branlant, S. Aymerich //. J Biol Chem -2000. -V.275. -P. 14031-14037.

57. Fisher S. H. Role of CodY in regulation of the Bacillus subtilis hut operon / S. H. Fisher, K. Rohrer, A. E. Ferson. //J. Bacterid. -1996. -V.178. -P.3779-3784.

58. Fisher S.H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la difference! / S.H .Fisher // Mol Microbiol. -1999. -V.32. -P223-232.

59. Fisher S H. Mutations in Bacillus subtilis glutamine synthetase that block its interaction with transcription factor TnrA / S.H. Fisher, J.L. Brandenburg, L.V. Wray // Mol Microbiol. -V.2002. -V.45. -P.627-35.

60. Fisher S.H. Mutations in the Bacillus subtilis glnRA Operon That Cause Nitrogen Source-Dependent Defects in Regulation of TnrA Activity / S.H. Fisher, L.V. Wray. // J Bacterid. -2002. -V184. -P.4636-4639.

61. Fredrick K. FlgM is a primary regulator of sigD activity, and its absence restores motility to a sinR mutant / K. Fredrick, J. D. Helmann. // J. Bacterid. -1996. -V.178. -P.7010-7013.

62. Fujita M. High- and low-threshold genes in the SpoOA regulon of Bacillus subtilis / M. Fujita, J.E. Gonzalez-Pastor, R. Losick. // J Bacterid. -2005. -V.187. -P. 13571368.

63. Galinier A. The Bacillus subtilis crh gene encodes a HPr-like protein involved in carbon catabolite repression / A. Galinier, J. Haiech, M. C. Kilhoffer, M. Jaquinod, J.

64. Stiilke, J. Deutscher, I. Martin-Verstraete. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 8439-8444.

65. Gaur N. K. The Bacillus subtilis sin gene, a regulator of alternate developmental processes, codes for a DNA-binding protein / N. K. Gaur, J. Oppenheim, I. Smith. // J. Bacteriol. -1991. -V.173. -P.678-686.

66. Gottesman S. Proteases and their targets in Escherichia coli / S. Gottesman // Annu Rev Genet. -1996. -V.30. -P.465-506.

67. Graves L.M. Aspartokinase II from Bacillus subtilis is degraded in response to nutrient limitation / L.M. Graves, R.L. Switzer // J Biol Chem. -1990. -V.265. -P. 14947-14955.

68. Grimaud R. Enzymatic and structural similarities between the Escherichia coli ATP-dependent proteases ClpXP and ClpAP / R.Grimaud, M. Kessel, F. Beuron, A. C. Steven, M. R. Maurizi//J. Biol. Chem. -1998. -V.273. -P. 12476-12481.

69. Grossman A. D. Genetic networks controlling the initiation of sporulation and the development of genetic competence in Bacillus subtilis / A. D. Grossman // Annu. Rev. Genet. -1995. -V.29. -P.477-508.

70. Hamoen L. W. The pleiotropic response regulator DegU functions as a priming protein in competence development in Bacillus subtilis / L. W. Hamoen, A.F. Van Werkhoven, G.Venema, D. Dubnau // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. -V.97. -P.9246-9251.

71. Haldenwang W. G. The sigma factors of Bacillus subtilis / W. G. Haldenwang // Microb. Rev. 1995. - V. 59. - №1. - P. 1-30.

72. Haldenwang W.G. A modified RNA polymerase transcribes a cloned gene under sporulation control in Bacillus subtilis / W.G. Haldenwang, R. Losick // Nature. -1979. -V.282. -P.256-260.

73. Haldenwang W.G. Novel RNA polymerase sigma factor from Bacillus subtilis / W.G. Haldenwang, R. Losick // Proc Natl Acad Sci USA. -1980. -V.77. -P.7000-7004.

74. Hartley B.S. Proteolytic enzymes / B.S. Hartley // Ann. Rev. Biochem. 1960. - V.29. - P. 45-72.

75. Helmann J.D. Cloning, sequencing, and disruption of the Bacillus subtilis sigma 28 gene / J.D. Helmann, L.M. Marquez, M.J. Chamberlin. // J Bacterid. -1988. -V.170. -P. 1568-1574.

76. Helmann J.D. Compilation and analysis of Bacillus subtilis стА-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA / J.D. Helmann // Nucleic Acids Res. 1995. - V.23. - P. 2351-2360.

77. Hambraeus G. The aprE leader is a determinant of extreme mRNA stability in Bacillus subtilis / G. Hambraeus, M. Persson, B. Rutberg. // Microbiology. -2000. -V. 146.-P.3051-3059.

78. Hambraeus G. A 5' stem-loop and ribosome binding but not translation are important for the stability of Bacillus subtilis aprE leader mRNA / G. Hambraeus, K. Karhumaa, B. Rutberg.// Microbiology. -2002. -V.148. -P.1795-1803.

79. Hengge-Aronis R. The general stress response in Escherichia coli / Hengge-Aronis R. // G. Storz, R. Hengge-Aronis, Bacterial stress responses (ed). -Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 2000. -P.161-178.

80. Henner D. J. Location of targets of the hpr-91, sacU32 (Ну), and sacQ36 (Ну) mutations in upstream region of the subtilisin promoter / D. J. Henner, E. Ferrari, M. Perego, J. A. Hoch // J. Bacterid. 1988. - V. 170. - №1. - P. 296-300.

81. Herman C. Degradation of sigma 32, the heat shock regulator in Escherichia coli, is governed by HflB / C. Herman, D. Thevenet, R. D'Ari, P. Bouloc // Proc Natl Acad Sci USA. -1995. -V.92. -P.3516-3520.

82. Higerd T.B. Hyperprotease-producing mutants of Bacillus subtilis / T.B. Higerd, J.A. Hoch, J. Spizizen// J Bacterid. -1972. -V.112. -P.1026-1028.

83. Hilbert D.W. Contrasting effects of sigmaE on compartmentalization of sigmaF activity during sporulation of Bacillus subtilis / D.W. Hilbert, V.K. Chary, P.J. Piggot // J Bacteriol. -2004. -V.186. -P. 1983-90.

84. Ho M.S. Evidence in support of a docking model for the release of the transcription factor sigma F from the antisigma factor SpoIIAB in Bacillus subtilis / M.S. Ho, K. Carniol, R. Losick. //J. Biol. Chem. -2003. -V.278. -P.20898-20905

85. Hullet F. M. Sequential action of two-component genetic switches regulates the PHO regulon in Bacillus subtilis / F. M. Hulett, J. Lee, L. Shi, G. Sun, R. Chesnut, E. Sharkova, M.F. Duggan, N. Kapp // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - №5. - P. 13481358.

86. Hulett F.M. The signal-transduction network for Pho regulation in Bacillus subtilis / F.M. Hulett // Mol. Microbiol. 1996. - V.19. - №5. - P. 933-939.

87. Inaoka T. RelA protein is involved in induction of genetic competence in certain Bacillus subtilis strains by moderating the level of intracellular GTP / T.Inaoka, K. Ochi. // J. Bacteriol. -2002. -V.184. -P.3923-3930.

88. Jacobs et al., 1985 Субтилизин Карлсберг

89. Jan J. Characterization of the 5P subtilisin (aprE) regulatory region from Bacillus subtilis / J. Jan, F. Valle, F. Bolivar, E. Merino // FEMS Microbiol. Letters. -2000. -V.183. -P. 9-14.

90. Jiang M. Multiple histidine kinases regulate entry into stationary phase and sporulation in Bacillus subtilis / M. Jiang, W. Shao, M. Perego, J. A. Hoch. // Mol. Microbiol. -2000. -V.38. -P.535-542.

91. Jiang X. Engulfment-regulated proteolysis of SpoIIQ. -P. evidence that dual checkpoints control sigma activity / X. Jiang, A. Rubio, S. Chiba, K. Pogliano // Mol Microbiol. -2005. -V.58. -P. 102-115.

92. Johnson W.C. Two RNA polymerase sigma factors from Bacillus subtilis discriminate between overlapping promoters for a developmentally regulated gene / W.C. Johnson, C.P. Moran, R. Losick // Nature. -1983. -V.302. -P.800-804.

93. Joseph P. A region of Bacillus subtilis CodY protein required for interaction with DNA / P. Joseph, M. Ratnayake-Lecamwasam, A.L. Sonenshein // J Bacteriol.-2005. -V.187. -P.4127-4139.

94. Karatas A.Y. The effects of insertional mutations in comQ, comP, srfA, spoOH, spoOA and abrB genes on bacilysin biosynthesis in Bacillus subtilis / A.Y. Karatas, S. Cetin, G. Ozcengiz. // Biochim Biophys Acta. -2003. -V.1626. -P.51-66.

95. Kim H. J. Complex regulation of the Bacillus subtilis aconitase gene / H. J. Kim, S. I. Kim, M. Ratnayake-Lecamwasam, K. Tachikawa, A. L. Sonenshein, M. Strauch. // J. Bacteriol. -2003. -V.185. -P.1672-1680.

96. Kobayashi K. Comprehensive DNA microarray analysis of Bacillus subtilis two-component regulatory systems / K. Kobayashi, M. Ogura, H. Yamaguchi, K. Yoshida, N. Ogasawara, T. Tanaka, Y. Fujita. //J. Bacteriol., 2001. -V.183. -P.7365-7370.

97. Коек H . The ClpP peptidase is the major determinant of bulk protein turnover in Bacillus subtilis / H. Kock, U. Gerth, M. Hecker // J Bacteriol. -2004. -V.186. -P.5856-5864.

98. Kojima S. Inhibitor-assisted refolding of protease: a protease inhibitor as an intramolecular chaperone / S. Kojima, A. Iwahara, H. Yanai // FEBS Lett. -2005. -V.579. -P.4430-4436.

99. Kunst F. Salt stress is an enviromental signal affecting degradative enzyme synthesis in Bacillus subtilis / F. Kunst, G. Rapoport. //J. Bacteriol. -1995. V.177. - N9. -P.2403-2407.

100. LaBell T.L. Sporulation-specific sigma factor sigma 29 of Bacillus subtilis is synthesized from a precursor protein, P31 / T.L. LaBell, J.E. Trempy, W.G. Haldenwang. // Proc Natl Acad Sci USA. -1987. -V.84. -P. 1784-1788.

101. Lange R. The cellular concentration of the os subunit of RNA polymerase in Escherichia coli is controlled at the levels of transcription, translation, and protein stability / R. Lange, R. Hengge-Aronis // Genes & Dev. -1994. -V.8. -P. 1600-1612

102. Lazazzera B. A. An exported peptide functions intracellularly to contribute to cell density signaling in B. subtilis / B. A. Lazazzera, J. M. Solomon, A. D. Grossman // Cell -1997. -V.89. -P.917-925.

103. Lazazzera B. A. The ins and outs of peptide signaling / B. A. Lazazzera, A. D. Grossman. // Trends Microbiol. -1998. -V.6. -P.288-294.

104. Lesage G. Mechanism of Kex2p inhibition by its proregion / G. Lesage, M. Tremblay, J. Guimond, G. Boileau. // FEBS Lett. -2001. -V.508. -P.332-336.

105. Lindner C. Regulation of xylanolytic enzymes in Bacillus subtilis / C. Lindner, J. Stiilke, M. Hecker// Microbiology. -1994. -V.140. -P.753-757.

106. Liu W. Bacillus subtilis PhoP binds to the phoB tandem promoter exclusively within the phosphate starvation-inducible promoter / W. Liu, F.M. Hulett. // J Bacteriol.1997. -V.179. -P.6302-6310.

107. Liu W. Comparison of PhoP binding to the tuaA promoter with PhoP binding to other Pho-regulon promoters establishes a Bacillus subtilis Pho core binding site / W. Liu, F.M. Hulett. // Microbiology. -1998. -V.144. -P. 1443-1450.

108. Liu W. Analysis of Bacillus subtilis tagAB and tagDEF expression during phosphate starvation identifies a repressor role for PhoP-P / W. Liu, S. Eder, F.M. Hulett. // J Bacteriol. -1998. -V.180. -P.753-758.

109. Liu W. Sites internal to the coding regions of pho A and pstS bind PhoP and are required for full promoter activity / W. Liu, Y. Qi, F.M. Hulett. // Mol Microbiol.1998. -V.28.-P.119-130.

110. Liu J. Computational identification of the SpoOA-phosphate regulon that is essential for the cellular differentiation and development in Gram-positive spore-forming bacteria/ J. Liu, K.Tan, G. D. Stormo//Nucl Acids Res. -2003. -V.31. -P.6891-6903.

111. Loh J. The Bradyrhizobium japonicum nolA gene encodes three functionally distinct proteins / J. Loh, M.G. Stacey, M.J. Sadowsky, G. Stacey // J Bacteriol. -1999. -V. 181.-P. 1544-1554.

112. Lonetto M. The sigma 70 family: sequence conservation and evolutionary relationships / M. Lonetto, M. Gribskov, C.A. Gross. // J Bacteriol. 1992. -V.174. -P.3843-3849.

113. Lu S. Processing of the mother-cell sigma factor, sigma K, may depend on events occurring in the forespore during Bacillus subtilis development / S. Lu, R. Halberg, L. Kroos // Proc Natl Acad Sci USA. -1990. -V.87. -P.9722-9726.

114. Ludwig H. The Bacillus subtilis catabolite control protein CcpA exerts all its regulatory functions by DNA-binding / H. Ludwig, J. Stiilke // FEMS Microbiol. Lett. -2001a. -V.203. -P.125-129.

115. McLaggan D. Involvement of gamma-glutamyl peptides in osmoadaptation of Escherichia coli / D. McLaggan, T.M. Logan, D.G. Lynn, W. Epstein // J. Bacteriol. -1990. -V.172. № 7. -P.3631-3636.

116. Mader U. Bacillus subtilis functional genomics: genome-wide analysis of the DegS-DegU regulon by transcriptomics and proteomics / U. Mader, H. Antelmann, T. Buder, M.K. Dahl, M. Hecker, G. Homuth // Mol Genet Genomics. -2002. -V268. -P.455-67.

117. Magnuson R. Biochemical and genetic characterization of a competence pheromone / R. Magnuson, J. Solomon, A. D. Grossman. // Cell -1994. -V.77. -P.207-216.

118. Mandic-Mulec I. Sin, a stage-II specific repressor of cellular differentiation / I. Mandic-Mulec, N. Gaur, U. Bai, and I. Smith. // J. Bacteriol. -1992. -V.174. -P.3561-3569.

119. Mandic-Mulec I. The Bacillus subtilis SinR protein is a repressor of the key sporulation gene spoOA. / I. Mandic-Mulec, L. Doukhan, I. Smith. // J. Bacteriol. -1995.-V.177 -P.4619-4627.

120. Martin-Verstraete I. Two different mechanisms mediate catabolite repression of the Bacillus subtilis levanase operon / I. Martin-Verstraete, J. Stulke, A. Klier, G. Rapoport // J. Bacterid. 1995. - V. 177. - P. 6919-6927.

121. Maurizi M.R. Degradation of L-glutamate dehydrogenase from Escherichia coli: allosteric regulation of enzyme stability / M.R. Maurizi, F.Rasulova. // Arch Biochem Biophys. -2002. -V.397. -P.206-216.

122. McPhalen C.A. Structural comparison of two serine proteinase-protein inhibitor complexes: eglin-c-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo / C.A. McPhalen, M.N. James. // Biochemistry. -1988. -V.27. -P.6582-6598.

123. Mirel D. B. Environmental regulation of Bacillus subtilis sigmaD dependent gene expression / D. B. Mirel, W. F. Estacio, M. Mathieu, E. Olmsted, J. Ramirez, L. M. Marquez-Magana//J. Bacterid. -2000. -V.182. -P.3055-3062.

124. Mironov A.A. Computer analysis of transcription regulatory patterns in completely sequenced bacterial genomes / A.A. Mironov, E.V. Koonin, M.A. Roytberg, M.S. Gelfand. // Nucleic Acids Res. -1999. -V.27. -P.2981-2989.

125. Molle V. The SpoOA regulon of Bacillus subtilis / V. Molle, M. Fujita, S. T. Jensen, P. Eichenberger, J. E. Gonzalez-Pastor, J. S. Liu, R. Losick // Mol. Microbiol. -2003a. V. 50. - P. 1683-1701.

126. Msadek Т. DegS-DegU and ComP-ComA modulator-effector pairs control expression of the Bacillus subtilis pleiotropic regulatory gene degQ / T. Msadek, F.Kunst, A. Klier. G. Rapoport // J. Bacteriol. -1991. V.173. - P.2366-2377.

127. Msadek T. When the going gets tough: survival strategies and environmental signaling networks in Bacillus subtilis / T. Msadek // Trends Microbiol. -1999. -V.7. -P.201-207.

128. Nakano M.M. Nitrogen regulation of nasA and the nasB operon, which encode genes required for nitrate assimilation in Bacillus subtilis / M.M. Nakano, F. Yang, P. Hardin, P. Zuber. //J Bacteriol. -1995. -V.177. -P.573-579.

129. Nakano M. M. Nitrogen and oxygen regulation of Bacillus subtilis nasDEF encoding NADH-dependent nitrite reductase by TnrA and ResDE / M. M. Nakano, T. Hoffmann, Y. Zhu, D. Jahn. // J. Bacteriol. -1998. -V.180. -P.5344-5350.

130. Nakano M. M. Interaction of ResD with regulatory regions of anaerobically induced genes in Bacillus subtilis / M. M. Nakano, Y. Zhu, M. LaCelle, X. Zhang, F. M. Hulett // Mol. Microbiol. -2000. -V.37. -P. 1198-1207.

131. Nakano M. M. Involvement of the ResE phosphatase activity in down-regulation of ResD-controlled genes in Bacillus subtilis during aerobic growth / M. M. Nakano, Y. Zhu //J. Bacteriol. -2001. -V.183. -P.1938-1944.

132. Nakano M. M. Induction of ResDE-dependent gene expression in Bacillus subtilis in response to nitric oxide and nitrosative stress / M. M. Nakano // J. Bacteriol. -2002. -V.184. -P.1783-1787.

133. Nygaard P. Bacillus subtilis guanine deaminase is encoded by the yknA gene and is induced during growth with purines as the nitrogen source / P. Nygaard, S.M. Bested, K.A. Andersen, H.H. Saxild // Microbiology. -2000. -V.146. -P.3061-3069.

134. Ogura M. Multiple copies of the proB gene enhance degS dependent extracellular protease production in Bacillus subtilis / M. Ogura, M. Konvata-Mukai, M. Itaya, K. Takio, T. Tanaka. // J. Bacteriol. -1994. - V.176, N18. - P.5673-5680.

135. Ogura M. Bacillus subtilis DegU acts as a positive regulator for comK expression / M. Ogura, T. Tanaka // FEBS Lett. -1996. -V.397. -P.173-176.

136. Olmos, J. Effects of the sinR and degU32 (Ну) mutations on the regulation of the aprE gene in Bacillus subtilis / J. Olmos, R. De Anda, E. Ferrari, F. Bolivar, F. Valle. // Mol. Gen. Genet. -1997. -V.253. -P.562-567.

137. Opdyke J.A. Expression of the Secondary Sigma Factor X in Streptococcus pyogenes Is Restricted at Two Levels / J.A. Opdyke, J. R. Scott, C. P. Moran // J Bacterid. -2003. -V.185. -P.4291-4297.

138. Pan Q. Self-reinforcing activation of a cell-specific transcription factor by proteolysis of an anti-sigma factor in B. subtilis / Q. Pan, D. A.Garsin, R. Losick. // Mol. Cell. -2001. -V.8. -P.873-883.

139. Park S.S. Bacillus subtilis subtilisin gene (aprE) is expressed from a sigma A (sigma 43) promoter in vitro and in vivo / S.S. Park, S.L. Wong, L.F. Wang, R.H. Doi. // J Bacterid. -1989. -V.171. -P.2657-65.

140. Perego M. Negative regulation of Bacillus subtilis sporulation by the spoOE gene product / M. Perego, J. A. Hoch. //J. Bacteriol. -1991. -V.173. -P.2514-2520.

141. Perego M. Self-signaling by Phr peptides modulates Bacillus subtilis development/ M. Perego // Cell-cell signaling in bacteria, G. M. Dunny, and S. C. Winans (ed.). -Washington, D. C.: American Society for Microbiology, 1999. -P. 243-258.

142. Piggot P. J, Hilbert D. W. Sporulation of Bacillus subtilis / P. J. Piggot, D. W. Hilbert // Curr. Opin. Microbiol. 2004. - V.12. - №7 (6). - P. 579-586.

143. Predich M. Bacillus subtilis early sporulation genes kinA, spoF, and spoOA are transcribed by the RNA polymerase containing oH / M. Predich, G. Nair, I. Smith // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 2771-2778.

144. Prince H. Substrate requirements for regulated intramembrane proteolysis of Bacillus subtilis pro-sigmaK / H. Prince, R. Zhou, L. Kroos. // J Bacteriol. -2005. -V.187. -P.961-971.

145. Ratnayake-Lecamwasam M. Bacillus subtilis CodY represses early-stationary-phase genes by sensing GTP levels / M. Ratnayake-Lecamwasam, P. Serror, K. W. Wong, A. L. Sonenshein // Genes Dev. 2001. - V. 15. - P. 1093-1103.

146. Resnekov O. Changes in the stability of specific mRNA species in response to growth stage in Bacillus subtilis / O. Resnekov, L. Rutberg, A. von Gabain // Proc Natl Acad Sci USA. -1990. -V.87. -P.8355-8359.

147. Rocha E.P. Translation in Bacillus subtilis: roles and trends of initiation and termination, insights from a genome analysis / E.P. Rocha, A. Danchin, A. Viari. // Nucleic Acids Res. -1999. -V.27. -P.3567-3576.

148. Rudner D. Z. A sporulation membrane protein tethers the pro-K processing enzyme to its inhibitor and dictates its subcellular localization / D. Z. Rudner, R. Losick // Genes & Dev. -2002. -V.16, No. 8. -P.1007-1018.

149. Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

150. Satola S.W. Binding of SpoOA stimulates spoIIG promoter activity in Bacillus subtilis / S.W. Satola, J.M. Baldus, C.P. Moran // J Bacteriol. -1992. -V.174. -P.1448-1453.

151. Schweder T. Regulation of Escherichia coli starvation sigma factor (sigma s) by ClpXP protease / T. Schweder, K.H. Lee, O. Lomovskaya, A. Matin. // J Bacteriol. -1996. -V.178. -P.470-476.

152. Seredick S. D. The Bacillus subtilis Response Regulator SpoOA Stimulates sigma A-Dependent Transcription Prior to the Major Energetic Barrier / S. D. Seredick, G. B. Spiegelman //J. Biol. Chem. -2004. -V.279. -P. 17397-17403.

153. Serrano M. Serrano M. Role of the anti-sigma factor SpoIIAB in regulation of sigmaG during Bacillus subtilis sporulation / M. Serrano, A. Neves, C.M. Soares, C.P. Moran, A.O. Henriques. // J Bacteriol. -2004. -V.186. -P.4000-4013.

154. Setlow J.K. Transformation of Haemophilus influenzae by plasmid RSF0885 containing a cloned segment of chromosomal deoxyribonucleic acid / J.K. Setlow, N.K. Notani, D. McCarthy, N.L. Clayton//J Bacteriol. -1981. -V.148. -P.804-811.

155. Schobel S. The Bacillus subtilis sigmaW anti-sigma factor RsiW is degraded by intramembrane proteolysis through YluC / S. Schobel, S. Zellmeier, W. Schumann, T. Wiegert. // Mol Microbiol. -2004. -V.52. -P.1091-1105.

156. Schreier H.J. Regulation of Bacillus subtilis glutamine synthetase gene expression by the product of the glnR gene / H.J. Schreier, S.W. Brown, K.D. Hirschi, J.F. Nomellini, A.L. Sonenshein. //J Mol Biol. -1989. -V.210. -P.51-63.

157. Schweder T. Regulation of Escherichia coli starvation factor (os) by ClpXP protease / T. Schweder, K.H. Lee, O. Lomovskaya, A. Matin // J. Bacteriol. -1996. -V.178. -P. 470-476

158. Shafikhani S.H. Postexponential regulation of sin operon expression in Bacillus subtilis / S.H. Shafikhani, I. Mandic-Mulec, M.A. Strauch, I. Smith, T. Leighton. // J. Bacteriol., -2002. -V.184. -P.564-571.

159. Shin B.S. Analysis of tnrA alleles which result in a glucose-resistant sporulation phenotype in Bacillus subtilis / B.S. Shin, S.K. Choi, I. Smith, S.H. Park // J Bacteriol. -2000. -V.182. -P.5009-5012.

160. Shinde U.P. Protein memory through altered folding mediated by intramolecular chaperones / U.P. Shinde, J.J. Liu, M. Inouye // Nature. -1997. -V.389. -P.520-522.

161. Shivers R. P. Activation of the Bacillus subtilis global regulator CodY by direct interaction with branched-chain amino acids / R. P. Shivers, A. L. Sonenshein // Mol. Microbiol. -2004. -V.53. -P.599-611.

162. Shu J.C. Studies of SpoIIAB mutant proteins elucidate the mechanisms that regulate the developmental transcription factor sigmaF in Bacillus subtilis / J.C. Shu, J. Clarkson, M.D. Yudkin. // Biochem J. -2004. -V.384. -P. 169-78.

163. Siezen R. J. Homology modeling and protein engeneering strategy of subtilases, the family of subtilisin-like serine proteinases / R. J. Siezen, W. M. de Vos, J. A. M. Leunissen, B. W Dijkstra // Protein engineering. 1991. - V. 4. - P. 719-737.

164. Siezen R. J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like serine proteinases / R. J. Siezen, A. M. Leunissen // Protein science. 1997. - V. 6. - P. 501-523.

165. Singh S. K. Unfolding and internalization of proteins by the ATP-dependent proteases ClpXP and ClpAP / S. K. Singh, R. Grimaud, J. R. Hoskins, S. Wickner, M. R. Maurizi. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. -V.97. -P.8898-8903.

166. Sleator R.D. Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial stress and virulence / R.D. Sleator, C. Hill // FEMS Microbiol. Rev. -2002. -V.26. -P.49-71.

167. Solomon J. M. Purification and characterization of an extracellular peptide factor that affects two developmental pathways in Bacillus subtilis / J. M.Solomon, B. A. Lazazzera, A. D. Grossman. // Genes Dev. -1996. -V.10. -P.2014-2024.

168. Sorokin A.V. Expression unit from the replication region of the Streptococcal plasmid pSM19035 / A.V. Sorokin, V.E. Khazak // Molecular Biology. -1990. -V.24. -P.993-1000.

169. Stahl M. L. Replecement of the Bacillus subtilis structural Gene with an in vitro -Derived Deletion Mutation / M. L. Stahl, T. R. Ferreri // Bacteriol. 1994. - P. 411418.

170. Steil L. Genome-wide transcriptional profiling analysis of adaptation of Bacillus subtilis to high salinity / L. Steil, T. Hoffmann, I. Budde, U. Volker, E. Bremer. // J Bacteriol. -2003. -V.185. -P.6358-70.

171. Stragier P. Cascades of sigma factors revisited / P. Stragier, R. Losick // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 1804-1806.

172. Strauch M. A. The transition state transcription regulator abrB of Bacillus subtilis is a DNA-binding protein / M. A. Strauch, G. B. Spiegelman, M. Perego, W. C. Johnson, D. Burbulys, J. A. Hoch. // EMBO J. -1989. -V.8. -P.1615-1621.

173. Strauch M. A. The SpoOA protein of Bacillus subtilis is a repressor of the abrB gene / M. A. Strauch, V. Webb, G. Spiegelman, J. A. Hoch // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. V. 85. - №5. - P. 1801-1805.

174. Strauch M. A. Regulation of Bacillus subtilis gene expression during the transition from exponential growth to stationary phase / M. A. Strauch // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. -1993. -V.46. -P.121-153.

175. Strauch M. A. Transition-state regulators and sentinels of Bacillus subtilis post-exponential gene expression / M. A. Strauch, J. A. Hoch. // 1993. Mol. Microbiol. -V.7. -P.337-342.

176. Strauch M. A. AbrB modulates expression and catabolite repression of a Bacillus subtilis ribose transport operon / M. A. Strauch // J. Bacterid. 1995a. - V. 177. - P. 6727-6731.

177. Strauch M. A. Bent DNA is found in some, but not all, regions recognized by the Bacillus subtilis AbrB protein // M. A. Strauch, M. Ayazifar // Mol. Gen. Genet. -1995b. -V.246. -P.756-760.

178. Stulke J. Carbon catabolite repression in bacteria / J. Stulke, W. Hillen // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - V. 2. - P. 195-201.

179. Subbian E. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. -P. intrinsically unstructured propeptide modulates stochastic activation of subtilisin / E. Subbian, Y. Yabuta, U.P. Shinde. //J Mol Biol. -2005. -V.347. -P.367-383.

180. Sun D. Control of transcription of the Bacillus subtilis spoIIIG gene, which codes for the forespore-specific transcription factor aG / D. Sun, R. M. Cabrera-Martinez, P. Setlow // J. Bacteriol. 1991. - V. 173- P. 2977-2984.

181. Takagi H. Functional analysis of the propeptides of subtilisin E and aqualysin I as intramolecular chaperones / H. Takagi, M. Koga, S. Katsurada, Y. Yabuta, U. Shinde, M. Inouye, S. Nakamori. // FEBS Lett. -2001. -V.508 №2. -P.210-214.

182. Takeuchi Y. Refined crystal structure of the complex of subtilisin BPN1 and Streptomyces subtilisin inhibitor at 1.8 A resolution / Y. Takeuchi, Y. Satow, K.T. Nakamura, Y. Mitsui. // J Mol Biol. -1991. -V.221. -P.309-325.

183. Tjalsma H. Bacillus subtilis contains four closely related type I signal peptidases with overlapping substrate specificities / H. Tjalsma, M. A. Noback, S. Bron, G. Venema, K. Yamane, J. M. van Dijl. //J. Biol. Chem. -1997. -V.272. -P.25983-25992.

184. Tobisch S. Role of CcpA in regulation of the central pathways of carbon catabolism in Bacillus subtilis / S. Tobisch, D. Ziihlke, J. Bernhardt, J. Stiilke, M. Hecker // J Bacteriol. -1999. -V.181. -P.6996-7004.

185. Tojo S. Organization and expression of the Bacillus subtilis sigY operon / S. Tojo, M. Matsunaga, T. Matsumoto, C.M. Kang, H. Yamaguchi, K. Asai, Y. Sadaie, K. Yoshida, Fujita Y. // J Biochem (Tokyo). -2003. -V.134. -P.935-946.

186. Trach K. A. Multisensory activation of the phosphorelay initiating sporulation in Bacillus subtilis: identification and sequence of the protein kinase of the alternative pathway / K. A. Trach, J. A. Hoch // Mol. Microbiol. 1993. - V. 8. - P. 67-79.

187. Turgay K. Competence in Bacillus subtilis is controlled by regulated proteolysis of a transcription factor / K. Turgay, J. Hahn, J. Burghoorn, D. Dubnau. // EMBO J. -1998. -V.17. -P.6730-6738.

188. Vaughn J. L. Novel DNA recognition topology and gene regulation model for transition-state regulators / J. L. Vaughn, N. Skelton, V. Feher, S. Naylor, M. A. Strauch, J. Cavanagh. // Nat. Struct. Biol. -2000. -V.7. -P. 1139-1146.

189. Veening J.W. Phosphatases modulate the bistable sporulation gene expression pattern in Bacillus subtilis / J.W. Veening, L.W. Hamoen, O.P. Kuipers // Mol. Microbiol. -2005. -V.56. -№(6). -P. 1481-94.

190. Volker U. Analysis of the induction of general stress proteins of Bacillus subtilis / U. Volker, S. Engelmann, B. Maul, S. Riethdorf, A. Volker, R. Schmid, H. Mach, M. Hecker. // Microbiology. -1994. -V.140. -P.741-752.

191. Wang L. A novel histidine kinase inhibitor regulating development in Bacillus subtilis / L. Wang, R. Grau, M. Perego, J.A. Hoch. // Genes Dev. -1997. -V.l 1. -P.2569-2579.

192. Weir J. Regulation of SpoOH, a gene coding for the Bacillus subtilis aH factor / J. Weir, M. Predich, E. Dubnau, G. Nair, I. Smith // J. Bacterid. 1991. - V. 173. -P.521-529.

193. Wells J.A. Cloning, sequensing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis / J.A. Wells, E. Ferrari, G.J. Henner, D.A. Estell, E.Y. Chen // Nucl. Acids. Res. 1983. - V.ll. - P. 7911-7925.

194. Wiegert T. Alkaline shock induces the Bacillus subtilis sigma (W) regulon / T. Wiegert, G. Homuth, S. Versteeg, W. Schumann // Mol. Microbiol. 2001. - V.41. -№1. - P. 59-71.

195. Wong S.L. Use of the Bacillus subtilis subtilisin signal peptide for efficient secretion of ТЕМ beta-lactamase during growth / S.L. Wong, F. Kawamura, R.H. Doi // J Bacterid. -1986. -V.168. -P.1005-1009.

196. Wray L. V. Catabolite repression of the Bacillus subtilis hut operon requires a cis-acting site located downstream of the transcription initiation site / L. V. Wray, F. K. Pettengill, S. H. Fisher // J Bacterid. -1994. -V.176. -P.1894-1902.

197. Wray L.V. TnrA, a transcription factor required for global nitrogen regulation in Bacillus subtilis / L.V. Wray, A. E. Ferson, K. Rohrer, S.H. Fisher // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. -V.93. -P.8841-8845.

198. Wray L.V. Expression of the Bacillus subtilis ureABC operon is controlled by multiple regulatory factors including CodY, GlnR, TnrA, and SpoOH / L.V. Wray, A.E. Ferson, S.H. Fisher. //J Bacterid. -1997. -V.179. -P.5494-5501.

199. Wray L.V. Purification and in vitro activities of the Bacillus subtilis TnrA transcription factor / L. V. Wray, J. M. Zalieckas, S. H. Fisher // J.MoI.BioI. -2000. -V.300. -P.29-40.

200. Wray L.V. Bacillus subtilis glutamine synthetase controls gene expression through a protein-protein interaction with transcription factor TnrA // L. V. Wray, J. M. Zalieckas, S. H. Fisher//Cell. -2001. -V.107. -P.427-435.

201. Yabuta Y. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. A functional peptide chaperone designed using sequence databases / Y. Yabuta, E. Subbian, C. Oiry, U. Shinde //J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. P. 15246-15251.

202. Yabuta Y. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone: propeptide release modulates activation precision of pro-subtilisin / Y. Yabuta, H. Takagi, M. Inouye, U. Shinde // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. P. 44427^4434.

203. York K. SpoOA controls the cA- dependent activation of Bacillus subtilis sporulation specific transcription unit spoIIE / K. York, T. J. Kenney, S. Satola, C. P. Moran, H. Poth, P. Youngman // J. Bacteriol. - 1992. - V. 174. - P. 2648-2658.

204. Yoshida K.I. Combined transcriptome and proteome analysis as a powerful approach to study genes under glucose repression in Bacillus subtilis / K.I.Yoshida, K. Kobayashi, Y. Miwa. // Nucleic Acids Res. -2001. -V.29. -P.6683-6692.

205. Yoshida K. Identification of additional TnrA-regulated genes of Bacillus subtilis associated with a TnrA box / K. Yoshida, H. Yamaguchi, M. Kinehara, Y.H. Ohki, Y. Nakaura, Y. Fujita // Mol Microbiol. -2003. -V.49. -P. 157-165.

206. Yura T. Regulation of the heat-shock response / T. Yura, K. Nakahigashi // Curr. Opin. Microbiol. -1999. -V.2. -P. 153-158.

207. Zalieckas J. M. Expression of the Bacillus subtilis acsA gene: position and sequence context affect cre-mediated carbon catabolite repression / J. M. Zalieckas, L. V. Jr Wray, S. H. Fisher // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P.6649-6654.

208. Zellmeier S. Identification of sigma(V)-dependent genes of Bacillus subtilis / S. Zellmeier, C. Hofmann, S. Thomas, T. Wiegert, W. Schumann. // FEMS Microbiol Lett. -2005. -V.253. -P.221-229.

209. Zhou Y.N. The RssB response regulator directly targets S for degradation by ClpXP / Y.N. Zhou, S. Gottesman, J.R. Hoskins, M. R. Maurizi, S. Wickner // Genes & Dev. -2001. -V.15. -P.627-637.

210. Zhou R. Serine proteases from two cell types target different components of a complex that governs regulated intramembrane proteolysis of pro-sigmaK during Bacillus subtilis development / R. Zhou, L. Kroos // Mol Microbiol. -2005. -V.58. -P.835-46.

Информация о работе

Каюмов, Айрат Рашитович
кандидата биологических наук
Казань, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Структура гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius и регуляция его экспрессии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы