Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы регуляции экспрессии генов сериновых протеиназ Bacillus pumilus 7P

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы регуляции экспрессии генов сериновых протеиназ Bacillus pumilus 7P"

ЧЕРЁМИН АНДРЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИН A3 BACILLUS PUMILUS 7Р

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 Д^К 2014

Казань-2014

005556727

005556727

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук, профессор

Фаизов Тагир Хадиевич

главный научный консультант научно-инновационного центра Федерального центра токсикологической, радиационной и

биологической безопасности, г. Казань

Кандидат биологических наук, Кипенская Лариса Викторовна доцент кафедры микробиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, г. Казань

Ведущая организация: Федеральное бюджетное учреждение науки

«Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора, г. Казань

Защита диссертации состоится «29» декабря 2014 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: г. Казань, ул. К. Маркса, д. 74, Институт фундаментальной медицины и биологии в зале заседания ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: г. Казань, ул. Кремлевская, д. 35.

Автореферат разослан « » ноября 2014г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Ъ'У,—3. И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Сериновые протеиназы обнаружены у животных, растений, грибов, архей, бактерий и вирусов и представляют интерес, как с точки зрения физиологии микроорганизмов, так и их практического применения. Потребность в таких белках у эу- и прокариот, а также широкий спектр выполняемых функций, характеризуют сериновые протеиназы как эволюционно древние ферменты. В процессе эволюции, адаптация на молекулярном и физиологическом уровнях прокариотических организмов позволила им выживать в любой экологической нише. Определенную роль в этом сыграли сериновые протеазы. Участие в регуляторном протеолизе, патологических состояниях, споруляции и образовании других покоящихся форм, делают протеазы незаменимыми в решении разных проблем современной биологии и медицины. Обладая широкой субстратной специфичностью, стабильностью в широком диапазоне температур, высокой каталитической активностью, сериновые протеиназы представляют интерес в биотехнологии. Микроорганизмы являются предпочтительным источником этих ферментов из-за быстрого роста, доступности и перспективности генно-модифицированных штаммов продуцентов. Выяснение механизмов регуляции генной активности соответствующих генов позволит контролировать синтез этих белков и получать новые перспективные генетически модифицированные штаммы бактерий.

Именно поэтому, изучение организации генов сериновых протеиназ и регуляции их транскрипционной активности необходимо для понимания физиологических процессов клетки, находящихся под контролем протеиназ, и создания биотехнологических штаммов-продуцентов.

Степень разработанности темы исследования. Разработка диссертационной темы начата на основе предварительных экспериментальных данных, полученных в Казанском государственном университете (Leschinskaya et al., 1997; Балабан с соавт., 1993). В настоящее время ферменты субтилизиноподобная протеиназа и глутамилэндопептидаза выделены и очищены из культуральной жидкости, изучены их основные свойства (Михайлова с соавт., 2009; Балабан с соавт., 2003). Изучено действие стрессовых факторов на биосинтез ферментов и выявлены особенности экспрессии генов (Каюмов, 2006; Частухина с соает. 2004, 2005). Показано наличие тромболитической и фибринолитической активностей сериновых протеиназ (Данилова с соавт., 2012). Гены белков изолированы и установлена их нуклеотидная последовательность (Rebrikov et al., 1999; Sharipova, 2008). Определены оптимальные длины промоторов генов субтилизиноподобной протеиназы и глугамилэндопептидазы (Тойменцева, 2012). Однако остается малоизученным устройство генов ферментов, а также механизмы активации генов в сети сигнальной трансдукции. Эта задача решалась в ходе работы.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось выяснение механизмов взаимодействия промоторов генов сериновых протеиназ Bacillus pumilus 7Р с регуляторными факторами стационарной фазы роста бактерий.

В соответствии с поставленной целью работы решались следующие задачи:

1. Исследовать экспрессию генов сериновых протеиназ В. pumilus в мутантах по транскрипционным факторам стационарной фазы роста

2. Определить направление и стартовые точки транскрипции генов сериновых протеиназ В. pumilus в системе in vitro

3. Установить взаимодействие транскрипционных факторов (SpoOA и DegU~P) с промоторами генов сериновых протеиназ в системе in vitro

4. Модифицировать потенциальные регуляторные сайты связывания с белком DegU~P в промоторе гена сериновой протеиназы и изучить экспрессию модифицированного гена

Научная новизна. Все результаты, изложенные в диссертационной работе, получены впервые. Впервые установлено in vitro, что фосфорилированная форма транскрипционного фактора DegU~P взаимодействует с промотором гена субтилизиноподобной протеиназы и не связывается с промотором глутамилэндопегггидазы. Транскрипционный фактор SpoOA взаимодействует с промоторами обоих генов. Определены стартовые точки транскрипции генов сериновых протеиназ. Модификация одного из потенциальных регуляторных сайтов для связывания с белком DegU-Р гена субтилизиноподобной протеиназы позволила увеличить экспрессию гена.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые в системе in vitro получены данные о взаимодействии промоторов генов сериновых протеиназ В. pumilus с транскрипционными факторами стационарной фазы роста. Выявлены разные способы контроля генов протеиназ с различной специфичностью. Установлен сегмент промотора — сайт регуляции, модификация которого привела к увеличению транскрипционной и трансляционной активности гена субтилизиноподобной протеиназы. Впервые получен модифицированный промотор гена субтилизиноподобной протеиназы, повышающий уровень транскрипции в 53 раза. Такой подход может быть применен при создании штаммов-продуцентов целевых белков, экспрессия которых происходит без изменения первичной структуры.

Положения, выносимые на защиту:

1. Промотор гена субтилизиноподобной протеиназы В. pumilus in vitro взаимодействует с транскрипционными факторами SpoOA и DegU~P

2. Промотор гена глутамилэндопептидазы В. pumilus in vitro взаимодействует с транскрипционным фактором SpoOA и не связывается с транскрипционным фактором DegU~P

3. Модификация сайта взаимодействия с регуляторным белком DegU~P в промоторе гена субтилизиноподобной протеиназы привела к увеличению экспрессии.

Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждается большим объемом многократных лабораторных экспериментов, выполненных и анализированных на современных высокоточных приборах; опубликованием полученных данных в отечественных журналах, с рецензированием ведущими учеными в данной области.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на следующих конференциях: «Конгресс русского сообщества биохимиков и молекулярных биологов» (Новосибирск, 2008), «XLVI международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008); 13th annual Symposium for Biology Students of Europe «Symbiose 2009» (Kazan, 2009); XIV international conference "Microbial en2ymes in biotechnology and medicine" devoted to the 20th anniversary of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen University. (Kazan, 2009); 14 international conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine". (Kazan, 2009); IV Russian symposium called "Protein and Peptides". (Kazan, 2009); «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии», (Минск, 2010); V российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); международная конференция «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012); IV Международная 3D интернет-конференция «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий» (Казань, 2013); Всероссийская конференция «Протеолитические ферменты: Структура, функции, эволюция» (Петрозаводск, 2014).

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности «Казанского (Приволжского) федерального университета» среди ведущих мировых научно-исследовательских центров, а также, частично, за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Исследования выполнены при поддержке грантов: РФФИ 09-04-99044-р-офи, 14-34-50792 - мол_нр; Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»: ГК № П323, № П344, № П406, № П1053, № 14.132.21.1766, № 16.740.11.0741, № 14.А18.21.0849.

Личный вклад автора заключается в разработке основной проблемы исследования, планировании, организации и реализации её экспериментального решения, интерпретации полученных результатов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 5 статей в Российских изданиях, включенных в список Высшей аттестационной комиссии (ВАК), 11 материалов международных и Всероссийских конференций.

Общая структура диссертации. Общий объем диссертации 112 страниц. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа содержит 7 таблиц и 32 рисунка. Список литературы включает 155 источников, в том числе 136 работ зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю - д.б.н., профессору, Шариповой Маргарите Рашидовне за внимательное отношение к работе, плодотворное обсуждение полученных результатов, помощь в подготовке материалов для публикаций и постоянную поддержку на всех этапах работы. Автор благодарит: к.б.н., М.В. Захарову за возможность проведения экспериментов с радиоактивной меткой на базе

лаборатории молекулярной микробиологии ИБФМ РАН, г.Пущино, а также за ценные рекомендации по исследованиям; к.б.н., А.Ю. Горбачева, за помощь в проведении части экспериментов в лаборатории протеомного анализа НИИ ФХМ, г. Москва; Е.Е. Черенкову, аспиранта кафедры генетики КФУ, за помощь в освоении методики «ПЦР в режиме реального времени». Также автор благодарит всех сотрудников лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов КФУ, всех сотрудников кафедры микробиологии, за помощь в организации экспериментов и доброжелательную рабочую атмосферу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий, плазмидные векторы и условия культивировання. В работе использовали штаммы из музея лаборатории Биосинтеза и Биоинженерии Ферментов КФУ - В. pumilus 7Р, штамм В. subtilis 168 WT (дикий тип). Штамм Bacillus subtilis 8G5 AdegSAdegU (degS, degU; Km% мутантный по генам degS и degU предоставлен для работы доктором Jan Maarten van Dijl, университет Гронингена, Голландия; штамм В. subtilis WM90 (AspoOA; Krrf), дефектный по регуляторному белку SpoOA предоставлен проф. Вилфридом Мейером, Мадрид, Испания. Протеазодефицитный штамм В. subtilis BG2036 предоставлен для работы проф. C.B. Костровым, Институт молекулярной генетики РАН, Москва.

Плазмида pCS9 с клонированным полным геном субтилизиноподобной протеиназы (аргВр) и вектор Д58.21 содержащий полный ген глутамилэндопептидазы (gseBp), предоставлены для работы проф. C.B. Костровым. Плазмида pMF14, несущая С-концевой домен белка SpoOA с олигопептидом (His)6 на N-конце, предоставлена для работы проф. Ричардом Лозиком (Гарвардский Университет, Кэмбридж, Англия); плазмида рАСб предоставлена для работы проф. Й.Штульке (Университет Фридрих-Александер, Эрланген, Германия). Экспрессионные векторы рЕТЗО-degU и pET-degS несущие гены белков DegU и DegS, соответственно, предоставлены для работы профессором К.Цукахара (Институт океанических исследований и развития, Токио, Япония). В качестве штамма-реципиента экспрессионных векторов использовали штамм EL coli BL21, предоставленный для работы проф. К.Форшхаммером (Университет г. Тюбинген, Германия).

Культивирование штаммов осуществляли на среде Луриа Бертани (LB) (%): триптон - 1.0, дрожжевой экстракт - 0.5, NaCI - 0.5; pH 8.5 (Sambrook et al., 1989). Агаризованная среда содержала дополнительно 2% агара. Среды для трансформации штаммов В. subtilis включали солевую основу среды Спицизена (Anagnostopolous, Spizizen, 1961). Среды стерилизовали при 1 атм. в течение 30 мин, pH доводили перед стерилизацией среды 40%-ным раствором NaOH до значения 8.5. При выращивании рекомбинантных штаммов в среду вносили соответствующие антибиотики в конечной концентрации (мкг/мл): ампициллин — 100, хлорамфеникол - 25, канамицин - 50.

Определение протеолитнческой активности. Специфическую

протеолитическую активность субтилизиноподобной протеиназы и глутам илэ ндо пептидазы определяли по расщеплению специфических хромогенных субстратов Z-Ala-Ala-Leu-pNa и Z-Glu-pNa соответственно (Люблинская с соавт., 1987).

Методы анализа с применением радиоактивной метки. Транскрипцию in vitro проводили с амплифицированных участков ДНК, содержащих регулярную и структурную области генов аргВр и gseBp. К реакционной смеси, содержащей ДНК, РНК-полимеразу и 4 рибонуклеотидтрифосфата добавляли 0.5мкКи [ P]UTP и 20 мкг гепарина и инкубировали 10 мин. Реакцию останавливали стоп-буфером (раствор формамида с бромфеноловым синим). Полученные транскрипты мРНК анализировали в денатурирующем 7% ПААГ с последующей радиоавтографией.

Для реакции удлинения праймера выделяли тотальную РНК из клеток В. pumilus, обратно-транскрибировали с 100 ед. «Super Script III enzyme» (Invitrogen, США) в присутствии 1пмоль [32Р] меченного праймера, комплементарного последовательности нуклеотидов в позициях 96-120 гена аргВр и 111-134 гена gseBp. Реакцию удлинения праймера проводили в течение 50 мин при 50°С и останавливали инкубацией при 85°С в течении 5 мин. РНК удаляли при обработке РНКазой Н. Продукты реакции обрабатывали хлороформом, осаждали с помощью этанола и ресуспендировали в буфере для нанесения. Для секвенирующей реакции использовали тот же меченый праймер. Реакцию секвенирования проводили, используя коммерческий набор «/то/ DNA Cycle Sequencing System» (Promega, США). Продукты реакции анализировали в 6% денатурирующем ПААГ

с последующей радиоавтографией.

ДНК-белковое взаимодействие. Для реакции взаимодействия использовали белки DegU, DegS и SpoOA, очищенные методом афиннои хроматографии на колонке с Ni-NTA и амплификаты регуляторных областей генов аргВр и gseBp с соответствующими контрольными последовательностями. Для амплификации ДНК использовали FAM-меченные праймеры. Очистку амплифицированной ДНК проводили с помощью наборов реактивов фирмы «Fermentas» (Латвия). Фосфорилирование белка DegU проводили, как описано в работе (Gueriri et al., 2008). Для реакции связывания, смешивали 500 нг ДНК с соответствующим белком в концентрации от 0 (свободная ДНК) до 1000 нг. В каждую пробу в качестве неспецифической ДНК добавляли I мкг тотальной ДНК спермы лосося. Пробы инкубировали в течение 20 мин при 37°С и наносили на 6% ПААГ. Гели визуализировали с помощью флуорометра «Typhoon 8600»

(Amersham Biosciences, США).

Получение рекомбинантных конструкций. Процедуры по получению рекомбинантной плазмидной ДНК проводили в клетках Е. coli, как описано в (Sambrook et al., 1989). Праймеры конструировали с помощью программного обеспечения SnapGene (GSL Biotech LLC, США) на основании последовательностей промотора аргВр (AN AY754946.2). Синтез праймеров и секвенирование ДНК проводили в фирме «Сингол» (Москва).

Для получения рекомбинантных конструкций оптимизировали потенциальные участки связывания с белком DegU~P в промоторе гена аргВр (сайт 1 и сайт 2). Оптимизированные промоторы, полученные с помощью ПЦР-реакции, а также исходный промотор, клонировали в вектор рАСб с образованием плазмид рАМ4 (контроль), рАМ41 (сайт 1) и рАМ42 (сайт 2). Экспрессию репортерного белка под контролем модифицированных промоторов оценивали методом Миллера, по расщеплению Р-галактозидазой хромогенного субстрата ONPG (Miller, 1972). Активность модифицированных промоторов на уровне транскрипции определяли методом ПЦР «в режиме реального времени». Уровень мРНК определяли методом Ливака (Livak, 2001) по значениям порогового цикла с учетом того, что концентрация целевых фрагментов ДНК увеличивалась как 2N, где N - количество циклов.

Секвенирование и геноинформатика. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программного пакета Vector NTI 8.0 (Life Technologies, США). Выравнивание последовательностей проводили с помощью online программного обеспечения NCBI/BLAST.

Математическая обработка результатов. Для статистического анализа данных использовали программу Microsoft Excel (Microsoft, США). Для описания и сравнения признаков использовали построения 95%-ных доверительных интервалов для средних значений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Динамика роста и накопления протеолитической активности сериновых протеиназ в регуляторных мутантах

Бактерии секретируют в среду различные протеолитические ферменты, преимущественно в стационарной фазе роста при недостатке питательных веществ. В большинстве случаев такие ферменты выполняют трофическую функцию для клетки, превращая труднодоступные субстраты в легко утилизируемые соединения.

Исследовали динамику роста и накопления сериновых протеиназ В. pumilus — субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы в культурапьной жидкости рекомбинантного штамма. Плазмиды с клонированными генами ферментов трансформировали в реципиентные протеазодефицитные штаммы В. subtilis. На рисунке 1А представлены данные для субтилизиноподобной протеиназы. Максимальное накопление фермента в среде наблюдали на 30-32 и 48-50 ч роста, соответственно. Данные по динамике роста и накоплению глутамилэндопептидазы в культурапьной жидкости рекомбинантного штамма показали максимальную активность фермента на 22 и 46 ч роста (рисунок 1Б).

Экспрессия поздних генов бацилл характеризуется множественной регуляцией, т.е. контроль экспрессии осуществляют различные регуляторные белки, формируя сигнальную сеть для интегрированного ответа на изменения в среде. В этот период роста у бацилл активируются системы регуляции SpoOA-фосфопередачи и двухкомпонентная система DegS-DegU, которые запускают

транскрипцию генов многих белков, включая гены сериновых протеиназ (Veening et al,

Рисунок 1 -Рост (/) и уровень активности (2) субтшшзиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы рекомбинантных штаммов, несущих плазмиды pCS9 с полным геном субтилизиноподобной протеиназы (А) и Д58.21 с полным геном глутамилэндопептидазы (Б).

Для оценки влияния ш vivo регуляторных белков SpoOA и DegU на экспрессию генов субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы, исследовали изменение накопления ферментов в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов с полноценными генами регуляторных белков и тех же штаммов с инактивированными генами регуляторных белков. Плазмиды, несущие ген субтилизиноподобной протеиназы (pCS9), либо глутамилэндопептидазы (Д58.21) под собственным промотором, были трансформированы в регуляторные мутанты и соответствующие исходные штаммы.

Сравнительное определение активности субтилизиноподобной протеиназы проводили в культуральной жидкости исходных и мутантных штаммов на 30 и 48 ч роста, соответственно. На 30 ч роста удельная активность субтилизиноподобнои протеиназы в диком штамме в 3.2 раза превышала уровень протеолитическои активности в мутантном штамме, дефектном по системе регуляции DegS-DegU (Таблица 1) На 48 ч роста активность в исходном штамме в 3.9 раз превышала таковую в мутантном штамме. Полученные данные свидетельствуют о влиянии системы DegS-DegU на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы.

Исследовали экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы в штамме, дефектном по SpoOA-системе фосфопередачи (Таблица 2). На 30 ч роста удельная активность субтилизиноподобной протеиназы в контрольном штамме была в 4.1 раза выше, чем в мутантном штамме. На 48 ч роста активность в контрольном

штамме в 15 раз превышала активность в мутантном штамме. Полученные данные свидетельствовали о влиянии регуляторного белка SpoOA на экспрессию гена субтилизиноподобной протеиназы.

Далее исследовали влияние DegU- и SpoOA- систем регуляции на экспрессию гена глутамилэндопептидазы в системе in vivo с использованием регуляторных мутантов. Определение активности глутамилэндопептидазы В. pumilus в рекомбинантных штаммах проводили, исходя из данных, полученных при анализе накопления фермента во внеклеточной среде в диком штамме, на 22 и 46 ч роста культуры, соответственно. На 22 ч роста удельная активность глутамилэндопептидазы в штамме с полноценной регуляторной системой DegS/U была в 1.5 раза выше, чем в мутантном штамме (Таблица 1). На 46 ч роста удельная активность в полноценном штамме и в регуляторном мутанте практически не отличалась. Полученные данные указывали на частичное подавление активности фермента в отсутствие функционально-активной системы DegS-DegU.

Исследовали экспрессию гена глутамилэндопептидазы В. pumilus в рекомбинантном штамме с делегированным геном регуляторного фактора SpoOA. На 22 ч роста удельная активность глутамилэндопептидазы контрольного штамма с полноценной системой регуляции была выше в 1.2 раза, а на 46 ч активность в исходном штамме была в 2 раза выше активности в регуляторном мутанте, что указывало на позитивное влияние транкрипционного фактора SpoOA на экспрессию гена глутамилэндопептидазы.

Таблица 1 - Удельная активность сериновых протеиназ в исходном и мутантном штаммах с делегированной системой DegS-DegU.

Штаммы Субтилизиноподобная протеиназа Глутамилэндопептидаза

30 ч 48 ч 22 ч 46 ч

Исходный штамм 37.5±0.8 у .е. 42.5±0.9 у.е. 6.3±0.2 у.е. 5.9±0.2 у.е.

ADegS/U 11.5±0.4 у.е. 10.75±0.4 у.е. 4.0±0.2 у.е. 5.8±0.2 у.е.

Таблица 2 - Удельная активность сериновых протеиназ в исходном и мутантном штаммах с делегированным регуляторным белком ЗроОА

Штаммы Субтилизиноподобная протеиназа Глутамилэндопептидаза

30 ч 48 ч 22 ч 46 ч

Исходный штамм 29±0.8 у.е. 60±1 у.е. 7.1±0.3 у.е. 6.3±0.2 у.е.

ASpoOA 7±0.3 у.е. 4±0.2 у.е. 5.9±0.2 у.е. 3.2±0.3 у.е.

Таким образом, полученные данные показали, что регуляторные системы DegS-DegU и 8роОА-фосфопередачи влияют на экспрессию генов сериновых протеиназ - субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы.

2. Аннотация промоторных участков генов субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы

Проводили аннотацию промоторных участков генов сериновых протеиназ В. pumilus с целью поиска сайтов взаимодействия промоторов этих генов с регуляторными белками SpoOA и DegU~P. Знания о локализации потенциальных регуляторных сайтов в промоторах необходимы для проведения гель-шифт экспериментов с промоторами генов.

По данным литературы, нуклеотидная последовательность, распознаваемая белком SpoOA в промоторах - TGNCGAA (Molle et al., 2003; Liu et al., 2003). Для фосфорилированной формы белка DegU~P такой последовательностью является тандем из прямых повторов GNCАТТТAn(nKiNCАТТТA (Ogurajsukahara, 2010). Нефосфорилированная форма белка DegU узнает другую последовательность GTCATTTA-N7-TAAATATC (Ogura,Tsukahara, 2010). В результате анализа промоторной области гена субтилизиноподобной протеиназы идентифицировали 3 потенциальных сайта связывания с белком SpoOA и два потенциальных сайта связывания с фосфорилированным белком DegU~P (рисунок 2А). Степень гомологии к консенсусной последовательности: составила 80% для сайтов связывания с белком SpoOA и 71% для сайтов связывания с белком DegU~P.

В промоторной области гена глутамилэндопептидазы идентифицировали 2 потенциальных сайта для взаимодействия со SpoOA фактором транскрипции и один сайт для взаимодействия с DegU~P фактором транскрипции (рисунок 2Б) и определили степень их гомологии с консенсусными последовательностями, которая составила 65 и 72%, соответственно.

Г GAATGGAAGGTC^^

i АЛАЛССТОТГАТТСТААС AG<iTTOTTTTT7WVyS*C AAAVVV^ AAAAAAATA^mrTTTTT^

j T AT r> •'■,c * iff

TATTTGTCC

ÏGATCATAAGAAAAAAA/G.C AC АСГТТССГ I I » « IAATAGATAA

-3S -IO

ГС^ТАТАС/^ААТАЛ.ТСА^^ОААТСАТТОТАГАйАСТАСйАЛ.ТСАТГАГТСГ<1АЛАТ

ReS «PrBP

AASAAAAAACSCATGTCCATTGTGCCTCAAAAAG

.35 -to КВЪ gscBp

JJJ^JCCAATATGAAACAATCGl&KêlT^

Б.

Рисунок 2 - Нуклеотидная последовательность промоторных областей генов субтилизиноподобной протеиназы (А) и глугамилэндопегггидазы (Б) В. ритПиз. ХроОА-сашы выделены рамкой и отмечены символом «5», Оеёи~Р сайты выделены рамкой и обозначены символом <Ю» и цифрами «1» и «2», гипотетические -10, -35 области и последовательность Шайна-Дальгарно (ЯВв) подчеркнуты, старт-кодон выделен полужирным.

Данные геноинформационного анализа указывали на влияние регуляторных белков SpoOA и DegU~P на экспрессию генов субтилизиноподобной протеиназы и глутам илэ н допептидазы.

3. Определение направления и стартовых точек транскрипции генов сериновых протеиназ В. pumilus в системе in vitro

Для картирования промоторов субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы in vitro, провели эксперименты по определению направления транскрипции и точки начала транскрипции генов субтилизиноподобной протеиназы (аргВр) и глутамилэндопептидазы (gseBp). Картирование промоторных областей in vitro необходимо для выяснения структуры промотора, расположения его основных элементов и понимания процесса запуска транскрипции гена.

Для инициации транскрипции ДНК, РНК-полимераза накрывает область гена протяженностью до 60 нуклеотидов, от -40 до +20 (Cooper, 2000). Для проведения транскрипции in vitro гена субтилизиноподобной протеиназы амплифицировали участки ДНК от -145 до +290, и от -145 до +200, и гена глутамилэндопептидазы участки ДНК от -132 до +134, и от -132 до +224. Амплификаты проинкубировали с РНК-полимеразой, которая при синтезе мРНК включала в цепь меченый уридинтрифосфат. Полученные транскрипты мРНК экспонировали с помощью рентгеновской пленки (рисунок 3).

1 2. 3 4 М

ФШ 290а.о.

20du ШШ ЯК 234 и.о. 4P

fit 134 и.о.

Щ

Рисунок 3 - Авторадиография транскрибированных in vitro мРНК генов субтилизиноподобной протеиназы (дорожки 1-2) и глутамилэндопептидазы (дорожки 3-4). М -маркер молекулярного веса

На дорожках 1 и 2 изображены мРНК, синтезированные с фрагментов гена аргВр. Размер транскриптов соответствовал предполагаемому размеру в 290 и 200 п.о. соответственно. На дорожках 3 и 4 изображены фрагменты мРНК гена gseBp размером 134 п.о. и 224 п.о., что также соответствовало предполагаемым размерам транскриптов. Таким образом, было установлено, что транскрипция

идет в смысловом направлении (5'->3'), предсказанном методами

биоинформационного анализа ДНК.

Далее идентифицировали стартовые точки транскрипции обоих генов аргВр

и gseBp in vitro методом удлинения праймера.

Была выделена тотальная РНК культуры В. pumilus. С помощью отжига меченого праймера на 5' конец мРНК и добавлением обратной тракскриптазы получили целевую кДНК. Реакцию разделения кДНК в геле проводили одновременно с секвенирующей реакцией по Сэнгеру (Sanger, 1975). Размер кДНК соответствовал на геле определенному нуклесггиду, с которого начиналась транскрипция. Этот нуклеотид представлял +1 область в промоторе гена (рисунок

4).

Рисунок 4 - Авторадиография фрагментов кДНК промоторов генов субтилизиноподобной протеиназы (А) и глугамилэндопетидазы (Б) Стрелкой указаны целевые фрагменты кДНК, соответствующие +1 точке.

У гена субтилизиноподобной протеиназы был выявлен единственный продукт реакции элонгации, которому соответствует нуклеотид тимин в реакции секвенирования. Тимин являлся точкой старта транскрипции гена субтилизиноподобной протеиназы. У гена глутамилэндопептидазы был выявлен также единственный продукт транскрипции. Его размер соответствовал нуклеотиду тимину по цепи в 3'-5' направлении, следовательно, стартовой точкой транскрипции являлся комплементарный ему нуклеотид аденин.

По данным литературы, транскрипционная активность генов бактерий осуществляется как транс-элементами (регуляторными факторами), так и цис-. Такой способ регуляции осуществляется посредством транскрипционной интерференции. Под термином «транскрипционная интерференция» понимается прямое негативное влияние одной транскрипционной активности на другую. Транскрипционная интерференция является результатом сосуществования двух промоторов: сильный (агрессивный) промотор снижает экспрессию слабого (чувствительного) промотора (Callen et al., 2004). На рисунке 4 продемонстрированы транскрипты в виде одной полосы, что указывало на инициацию транскрипции с единственного промотора для генов обоих ферментов и свидетельствовало о цис-регуляции генов. Таким образом, локализовали основные промоторные элементы генов аргВр и gseBp.

4. Взаимодейсвтие промоторных ДНК генов аргВр и gseBp с транскрипционными факторами DegU~P и SpoOA

Факторы транскрипции SpoOA и DegU~P являются регуляторами, которые активируются в постэкспоненциальной фазе роста бактерий. Обнаружение потенциальных сайтов связывания с факторами SpoOA и DegU~P в промоторах позволило предположить их участие в контроле экспрессии генов субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы, которые секретируются в среду в стационарной фазе.

Гель-шифт анализ (EMSA) позволяет определить взаимодействие между ДНК генов и белковыми факторами транскрипции. Для осуществления гель-шифт анализа получали ГЩР-фрагменты ДНК промоторов генов бактериальных протеиназ, а также генов, используемых в качестве положительного и отрицательного контролей при постановке эксперимента, для которых установлено взаимодействие с этими факторами транскрипции (Molle, 2003; Shimane and Ogura, 2004) (рисунок 5).

M 1 2 3 4 5 6

500

100

Рисунок 5 - ПЦР-амшшфикация промоторных участков ДНК для постановки гель-шифт-анализа. 1- ген аЬгВ («+» контроль для ЭроОА), 2 - ген ЫЮ («-» контроль для ЭроОА), 3 -ген сотК («-» контроль для DegU--P), 4 - ген аргЕ («+» контроль для Ое§и~Р), 5 - ген аргВр (ген субтилизиноподобной протеиназы), 6 - ген ¿зеВр (ген глутамилэндопептидазы).

Получали очищенные факторы транскрипции DegU, DegS и SpoOA. Для этого использовали соответствующие штаммы-продуценты. Экспрессионными векторами pET-DegU, pET-DegS и pMF14, несущими гены degU и degS и клонированный ген С-концевого домена белка SpoOA, трансформировали штамм Е. coli BL21. Для белка SpoOA показано, что его редуцированная форма, состоящая только из ДНК-связывающего С-концевого домена способна связывать ДНК, вне зависимости от состояния фосфорилирования (Molle et al., 2003).

Получили рекомбинантные штаммы, способные обеспечить гиперэкспрессию рекомбинантных белков DegS, DegU и SpoOA, несущих His-tag на N-конце, что позволило провести очистку белков с помощью металл-хелатной

афинной хроматографии.

Очистку регуляторных белков проводили на Ni-NTA колонке (Sigma, США). Для элюции белка использовали имидазол, т.к. он является конкурентом гистидина за взаимодействие с ионами Ni и способен вытеснять его из хелатных комплексов.

Элюат собирали фракциями и анализировали с помощью электрофореза в SDS-ПААГ (рисунок 6). Белковые фракции объединяли и концентрировали с помощью полупроницаемой мембраны и полиэтиленгликоля (ПЭГ) и определяли концентрацию белка спектрофотометрически.

Как видно из данных на рисунке 6, молекулярная масса регуляторных белков на электрофорезе соответствовала их действительной массе и составила 26 кДа (DegU), 43 кДа (DegS) и 14 кДа (SpoOA).

Рисунок 6 - SDS-ПААГ электрофорез очищенных регуляторных белков. А - белки DegU и DegS. Б - белок SpoOA.

Таким образом, в результате очистки клеточных экстрактов Е. coli BL21 с соответствующими плазмидами, получили регуляторные белки DegU, DegS и SpoOA, в количестве, достаточном для проведения гель-шифт экспериментов.

На следующем этапе проводили реакцию фосфорилирования белка DegU при помощи гистидинкиназы DegS и ATP in vitro, т.к. нефосфорилированная форма DegU белка участвует в контроле состояния компетентности.

Для постановки эксперимента использовали [32Р]АТР. Для установления автофосфорилирования белка DegS инкубировали белок в буфере с добавлением [32Р]АТР. Для фосфорилирования DegU, белок DegS добавляли к смеси и инкубировали в течение 2, 10 и 30 мин (рисунок 7).

" * ***

Рисунок 7 - Авторадиография фосфорилирования белка Ек^и с помощью гистидинкиназы Г^Э и [32Р]АТР. 1 - автофосфорилирование DegS. Инкубация с [32Р]АТР 30 мин, 2 - фосфорилирование Ое§и. Инкубация DegS и DegU - 2 мин, 3 - Инкубация DegS и DegU - 10 мин, 4 - Инкубация DegS и Эе§и -30 мин.

Как видно из рисунка, гистидинкиназа автофосфорилируется с течением времени и передает фосфатную группу на белок регулятор - DegU, который переходит в фосфорилированную форму.

Таким образом, получили фосфорилированную форму белка DegU, необходимую для проведения гель-шифт анализов с промоторами генов сериновых протеиназ В. ритйш.

Для определения взаимодействия факторов транскрипции 5ро0А и DegU~P с промоторными областями генов аргВр и gseBp и для определения условий эксперимента проводили гель-шифт анализ с контрольными промоторами.

Концентрация меченой ДНК составляла 500 нг на реакцию, концентрация белков БроОА и DegU~P - от 0 до 1000 нг на реакцию. Результаты представлены на рисунке 8.

По данным на рисунке 8, при взаимодействии с положительными контрольными промоторами, наблюдали образование ДНК-белковых комплексов, которые движутся в геле медленнее, чем свободная ДНК. В реакционной смеси с отрицательными контрольными участками ДНК, таких взаимодействий между белками и контрольной ДНК не наблюдали.

А.

(+)аЬгВ (-)скС БроОА ЗроОА

.у

(-)сотК 0<^и~Р М

-¿ТООп.о.

(+)аргЕ Оееи~Р

МуУ

V-!

О 50 2001000

0 50 200 1000

%

0 50 МО 200 1000«

1( 0п.о.

о 50 100 200 1000 "Г

Рисунок 8 - ДНК-белковое взаимодействие контрольных промоторов с белками ЯроОА и Оееи~Р А - взаимодействие белка БроОА с положительным контролем аЬгВ и отрицательным контролем аЮ и взаимодействие белка Эе8и-Р со своим отрицательным контролем сотК Ь -взаимодействие белка ЭеЕи-Р с положительным контролем аргЕ.

Данные гель-шифт анализа с контрольными фрагментами ДНК позволили определить условия для проведения аншшза ДНК-белковых взаимодействии с промоторами генов су&тилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы (рисунки 9-10).

аргВр

пг

gseBp

50

I—<

100 200 1000 Цм4 ^

О 100 200 ! ООО кг

Рисунок 9 - ДНК-белковое взаимодействие белка Ое8и~Р с промоторами су&гилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы. Стрелкой показано образование ДНК-белковых комплексов.

Как следует из данных рисунка 9, образование ДНК-белковых комплексов наблюдали в случае взаимодействия с геном аргВр. Эксперимент с промотором гена ё8еВр не показал дополнительных полос задержки в геле. Сделали заключение, что белок Ое8и~Р связывался с промотором гена субтилизиноподобной протеиназы и не взаимодействовал с промотором гена

глутамилэндопептидазы.

Проводили эксперименты по формированию ДНК-белковых комплексов между теми же участками ДНК и белком БроОА. Как следует из данных рисунка 10 белковый фактор БроОА связывался с промоторами генов обоих сериновых

протеиназ, что указывало на регуляцию экспрессии этих генов со стороны данного фактора транскрипции.

Рисунок 10 - ДНК-белковое взаимодействие белка SpoOA с промоторами субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы. Стрелкой показано образование ДНК-белковых комплексов.

Полученные нами данные in vitro по связыванию SpoOA-фактора транскрипции подтвердили данные экспериментов на регуляторных мутантах В. subtilis об участии системы SpoOA-фосфопередачи в регуляции экспресии генов обоих ферментов. Эти результаты позволили отнести гены сериновых протеиназ В. pumilus к членам SpoOA-регулона.

К членам DegU-регулона можно отнести только ген субтилизиноподобной протеиназы В. pumilus, т.к. фосфорилированная форма транскрипционного фактора не взаимодействовала с gsefi/т-промотором. Тем не менее, экспрессия gseBp в ADegS/U мутантах привела к частичному снижению экспрессии гена gseBp. Эти данные свидетельствовали об опосредованном влиянии транскрипционного фактора DegU на экспрессию гена глутамилэндопептидазы.

По совокупности полученных данных мы установили различия в организации промоторов и молекулярных механизмах регуляции генов аргВр и gseBp, что отражалось на уровне экспрессии. Ген аргВр дает больше продукта, который доминирует в пуле внеклеточных протеиназ, тогда как продукт гена gseBp от тотальной внеклеточной протеолитической активности составляет в максимально индуцируемых условиях не более 10% (Балабан с соавт., 2013).

Таким образом, на основе ДНК-белковых взаимодействий между промоторами генов сериновых протеиназ В. pumilus и факторами транскрипции показано, что обе протеиназы (АргВр и GseBp) различаются по механизму контроля. Промотор гена доминирующей протеиназы АргВр имеет большее количество ДНК-связывающих сайтов для регуляторных белков по сравнению с промотором гена минорной протеазы GseBp. Такая структура промоторов соответствует функциям этих ферментов в клетках В. pumilus. В условиях лимитации питательных веществ, клетка секретирует глутамилэндопептидазу (максимум активности приходится на 22 ч роста), которая гидролизует в субстратах связи, образованные остатками глутаминовой и аспарагиновой аминокислот. По мере роста бактерий активность глутамилэндопептидазы

аргВр

gseBp

/

о

SO IOO 200 I ООО HI

снижается, и нарастает активность доминирующей субтилизиноподобнои протеиназы (30 ч роста), которая неспецифически расщепляет белковые субстраты, в том числе и олигопептиды, образованные при гидролизе глутамилэндопептидазой. Оба фермента при гидролизе дополняют друг друга, что ведет к более глубокому гидролизу субстратов. По-видимому, такой механизм последовательной секреции ферментов (последовательной экспрессии генов) в зависимости от стадии развития культуры отражает разную, но регуляторно координированную организацию промоторных регионов генов протеиназ.

5. Модификация сайта взаимодействия с регуляторным белком DegU~P в промоторе гена субтилизиноподобнои протеиназы

Сайты взаимодействия с транскрипционным фактором Ое§и~Р в промоторе гена аргВр модифицировали до полной гомологии с консенсуснои последовательностью СЫСАТТТАппСЫСАТТТА. Изменения в ДНК вносили методом двухстадийной ПЦР (рисунок 11).

О , ©

и

ПЦР-2

Ф

конечный продукт

Рисунок 11 - Схема модификации промотора гена субтилизиноподобнои протеиназы с помощью двухстадийной ПЦР (описание в тексте).

Мутации вводили в частично комплементарные друг другу праймеры В и С. Первые реакции осуществляли с двух пар праймеров А + В и С + О, полученные амплификаты АВ и СО очищали и использовали в качестве матрицы для постановки второй реакции амплификации. Вторую реакцию проводили с использованием концевых праймеров А + Э. Промоторы с неизмененной последовательностью получали одностадийной ПЦР с использованием праймеров А + О. В итоге по этой схеме мы получили три варианта промоторнои области ДНК гена аргВр В. ритИш - контрольный исходный промотор, промотор с измененным первым сайтом взаимодействия с фактором транскрипции и промотор с измененным вторым сайтом взаимодействия с Веёи~Р в гене субтилизиноподобной протеиназы В ритИш.

Все три фрагмента промоторной ДНК клонировали в плазмидный шаттл-вектор рАСб (БиЛке е1 а1., 1997) (рисунок 12), предназначенный для трансформации в бациллы. Выбор вектора определялся содержанием в нем репортерного белка гена с сайтом для гетерологичной вставки различных промоторных конструкций для изучения экспрессии под их управлением.

V

контрольный промотор яргЗр

промотор'жргВр с ЕзисзсвЕьж промот&р'аргЗр с взмсвсввым скётохМ! / слМтоыШ

ащ>€' Стге$ к2 I'егт 'отуС

рАСб

б-р-

/

Г сои оп Атрге*

»

\

к*

р.4А«1 10325 Ь.р.

/ят 1кГ ю

рЛМ42 10323 Ь.р.

1саг.

ш*

клонирования промоторных областей аргВр в вектор рАСб

рАМ4 10325 Ь р.

Рисунок 12 - Схема (описание в тексте).

Получили три рекомбинантные векторные молекулы, различающиеся по структуре сайтов взаимодействия с фосфорилированным белком DegU~P: рАМ4 (контрольный промотор без модификаций), рАМ41 (промотор с модифицированным сайтом 1) и рАМ42 (промотор с модифицированным сайтом 2). Присутствие модификаций в промоторе подтверждали секвенированием.

Наличие вставок в векторах устанавливали с помощью ПЦР с колоний рекомбинантных штаммов Е. сой (рисунок 13). Прямой праймер был комплементарен векторной молекуле, обратный праймер - промоторной области. Размер ПЦР-продукта соответствовал 725 п.о.

Рисунок 13 - ПЦР с колоний рекомбинантных штаммов Е. coli, трансформированных тремя конструкциями: К- штамм с плазмидой рАМ4; 1-2 - штаммы с плазмидой рАМ41; 3-4 штаммы с плазмидой рАМ42.

На следующем этапе рекомбинантные плазмиды трансформировали в дикий штамм В. subtilis 168. Изучали динамику роста (рисунок 14А) и накопление ß-галактозидазной активности в клетках рекомбинантных штаммов (рисунок 14Б).

Рисунок 14 - Рост (А) и |}-галактозидазная активность (Б) рекомбинантных штаммов В. шЫШз. Штаммы с плазмидами рАМ4 с ^модифицированной промоторной областью гена субтилизиноподобной протеиназы (1), рАМ41 с модифицированным сайтом I (2); рАМ42 с модифицированным сайтом 2 (3) промотора аргВр для связывания с фосфорилированным белком 1^и~Р.

10 15 20 24 25 26 2S 32 46 47

Время роста, ч

0.80

— 0.70 э

Щ. 0°0

го

С.. 50 №

| 0.40

S с, м

л

Э" 0.20

| 010 ш

ООО

4 5 * 7 ä 9 10 15 20 24 25 26 23 32 46 47

Время роста, ч

р-галактозидазная активность в среде у всех рекомбинантных штаммов появлялась к 6-му ч роста. Максимальная активность фермента достигалась на 24 ч роста у штамма с модифицированным сайтом 2 в стационарной фазе роста культуры. Уровень активности репортерного белка, экспрессия которого происходила под контролем промотора с измененным сайтом 2 оказалась выше в 4.8 раза активности репортерного белка, синтезированного под управлением контрольного промотора. Изменение сайта 1 не приводило к повышению активности, а наоборот, подавляло экспрессию в 2.5 раза. Таким образом, модификация промоторной области гена в области сайта 2 субтилизиноподобной протеиназы В. ритИш привела к увеличению экспрессии белка в 5 раз.

Исследовали экспрессию репортерных генов по уровню накопления мРНК в клетках методом ПЦР в режиме реального времени (рисунок 15).

Рисунок 15 - Динамика изменения уровня мРНК в рекомбинантных штаммах В. эиЫШз 168 с трансформированными векторами рАМ4 (А), рАМ41 (Б) и рАМ42 (В).

Максимальную транскрипционную активность обнаружили у штамма с модифицированным сайтом 2 в промоторе гена субтилизиноподобной протеиназы на 25 ч роста. Уровень мРНК был выше контроля в 53 раза.

Мутация в сайте 1 промотора аргВр, наоборот, на 25 ч роста снизила уровень экспрессии репортерного гена по сравнению с штаммом без мутаций, в 2.5 раза. На 28 ч роста разница в экспрессии снизилась в 29 раз.

Таким образом, модификация сайта 2 в промоторе гена субтилизиноподобной протеиназы привела к увеличению транскрипционной активности гена в 53 раза и трансляционной активности в 5 раз. Эти данные указывают, что этот фрагмент промотора гена аргВр влияет на взаимодействие с транскрипционным фактором DegU~P и может быть определен как регуляторный сайт этого белка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В системе in vitro мы установили, что двухкомпонентная система сигнальной трансдукции DegS-DegU принимает участие в активации экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы В. pumilus. Система SpoOA-фосфопередачи активирует гены субтилизиноподобной протеиназы и глутамилэндопептидазы. Определили направление и стартовые точки транскрипции генов сериновых протеиназ: нуклеотид «Т» в промоторе гена субтилизиноподобной протеиназы, нуклеотид «А» в промоторе гена глутамилэндопептидазы. Получили модифицированный промотор гена субтилизиноподобной протеиназы с консенсусным сайтом регуляции для узнавания фактором DegU~P, увеличивающий транскрипционную активность гена аргВр в 53 раза, уровень активности белка в культуральной жидкости в 5 раз. Полученный метод с модификацией промоторной области гена может бьггь применен при создании штаммов с повышенной экспрессией целевого белка, не сопровождаемой изменением его первичной структуры.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что мутации в регуляторных системах SpoOA-фосфопередачи и DegS/U снижают экспрессию генов сериновых протеиназ В.

pumilus в 1.5 - 20 раз.

2. Установлено направление и стартовые точки транскрипции (+1) генов сериновых протеиназ В. pumilus: нуклеотид «Т» в промоторе гена субтилизиноподобной протеиназы, нуклеотид «А» в промоторе гена

глутам илэ ндо пептидазы

3. Установлено in vitro взаимодействие промотора гена субтилизиноподобной протеиназы с транскрипционными факторами SpoOA и DegU-P, промотора гена глутамилэндопептидазы с транскрипционным фактором

SpoOA _

4. Получен модифицированный промотор гена субтилизиноподобнои протеиназы с консенсусным сайтом регуляции для узнавания фактором DegU-P, увеличивающий транскрипционную активность гена аргВр в 53 раза, трансляционную активность в 5 раз.

Публикации по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Черёмин, А.М. Оптимизация экспрессии субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus / A.M. Черёмин, Ч. Нямсурен, A.A. Тойменцева, М.Р. Шарипова // Биоорганическая химия, - 2014. - Т.40. - №6. - С. 752-757. (перечень

ВАК), автора - 0,312 пл.

2. Балабан, Н. П. Свойства глутамилэндопептидазы Bacillus pumilus на разных фазах роста рекомбинантного штамма / Н.П. Балабан, Ю.В. Данилова, Т.Р.

Шамсутдинов, A.M. Марданова, А.М.Черёмин, Г.Н. Руденская, М.Р. Шарипова // Биоорг. химия. - 2013. - Т. 39. - №1. - С. 40-47. (перечень ВАК), автора -0,187 пл.

3. Тойменцева, А.А. Характеристика промоторов протеиназ Bacillus pumilus / А.А. Тойменцева, А.М. Черёмин, Е.О. Михайлова, М.Р. Шарипова // Вестник казанского технологического университета. - 2013. — Т.16. - №.20. — С. 191-194. (перечень ВАК), автора-0,187 пл.

4. Данилова, Ю.В. Тромболитическая и фибринолитическая активность бактериальных протеаз / Ю.В. Данилова, А.М. Черёмин, А.И. Замалеева, А.М. Марданова, Н.М. Замалютдинова, М.Р. Шарипова // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. -2012. -Т.7. - С. 49-51. (перечень ВАК), автора-0,187 пл.

5. Черёмин, А.М. Выделение регуляторных белков, активирующихся в условиях ограниченного роста бацилл / A.M. Черёмин, А.А. Тойменцева, А.Р. Сабирова, А.Р. Каюмов, А.Б. Маргулис, М.Р.Шарипова // Ученые записки Казанского государственного университета. — 2010. - Т. 152. - Вып.4. - С. 156-158. (перечень ВАК), автора - 0,68 пл.

Другие публикации по теме диссертации

1. Черёмин, А.М. Идентификация in vitro регуляторных элементов генов сериновых протеиназ Bacillus pumilus / A.M. Черёмин, М.В. Захарова, М.Р. Шарипова // Всероссийская конференция «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция». Петрозаводск. — 2014. - С. 117.

2. Черёмин, А.М. Повышение экспрессии гена бактериальной протеиназы путем модификации его промотора / A.M. Черёмин, Тихонова А.О., Шарипова М.Р. // IV международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань. — 2014. — С. 281.

3. Черёмин, А.М. Картирование промоторных областей генов сериновых протеиназ Bacillus pumilus / А.М. Черёмин, М.В. Захарова, М.Р. Шарипова // IV Международная 3D интернет-конференция «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий». Казань, —2013. —С. 132.

4. Черёмин, A.M. Система экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы Bacillus pumilus / A.M. Черёмин, Б.Клотое, О.Н.Игонина, М.В. Захарова, М.Р. Шарипова // Международная конференция «Биология — наука XXI века». Москва.-2012.-С. 1019-1020.

5. Черёмин, A.M. ДНК-белковое взаимодействие промотора гена металлопротеиназы Bacillus intermedins с факторами транскрипции / A.M. Черёмин, А.Р.Сабирова, А.А. Тойменцева, М.Р. Шарипова // Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии. Минск. - 2010. - С. 67.

6. Cheryomin, A.M. The purification of Bacillus subtilis DegU and SpoOA regulatory proteins from the Escherichia coli recombinant strains / A.M.Cheryomin, A.R. Kayumov, A.A. Toymentseva, N. Pina, M.R. Sharipova // 13th annual Symposium for Biology Students of Europe "Symbiose 2009" Kazan. - 2009. - P.44.

7 Cheryomin, A.M. The purification of Bacillus subtilis DegU and SpoOA regulatory proteins from the Escherichia coli recombinant strains / A.M. Cheryomin A R. Kayumov, A.A. Toymentseva, N. Pina, M.R. Sharipova // XIV international conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine" devoted to the 20th anniversary of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen

University. Kazan.-2009.-P. 12.

8 Cheryomin, A.M. The purification of Bacillus subtilis DegU and SpoOA regulatory proteins from the Escherichia coli recombinant strains / A.M.Cheryomin A R. Kayumov, A.A. Toymentseva, N. Pina, M.R. Sharipova // 14th international conference «Microbial enzymes in biotechnology and medicine». Kazan. - 2009. - P.72.

9 Cheryomin, A.M. The purification of Bacillus subtilis DegU and SpoOA regulatory proteins from cells lysate of the Escherichia coli / A.M. Cheryomin, A.R. Kayumov, A.A. Toymentseva, N. Pina, M.R. Sharipova // Materials of IV Russian symposium called "Protein and Peptides". Kazan. - 2009. - P.310.

10. Шамсутдинов, T.P. Физико-химические свойства

глутамилэндопептидазы В. intermedius, продуцируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis / T.P. Шамсутдинов, A.A. Тойменцева, Ю.В. Данилова, А.М. Черёмин, Н.П. Балабан, A.M. Марданова, М.Р. Шарипова // Материалы IV конгресса русского сообщества биохимиков и молекулярных биологов,

Новосибирск.-2008. - С.381.

11 Данилова, Ю.В. Характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, секретируемой на разных фазах роста рекомбинантного штамма Bacillus subtilis t Ю.В. Данилова, А.М. Черёмин, Т. Р. Шамсутдинов, М.Р. Шарипова // Материалы XL VI международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск. - 2008. -С. 35.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДНК Дезоксирибо нуклеиновая кислота

РНК Рибонуклеиновая кислота

кДНК Комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК Матричная рибонуклеиновая кислота

ЦТР Уридинтрифосфат

ОЫРО О-нитрофенил-О-галактопиранозид 2-А1а-А1а-Ьеи-рНа Бензилоксикарбонил Ь-аланил-Ь-аланил-Ь-р-нитроанилид лейцин г-С1и-рЫА Пара-нитроанилид карбобензокси-Ь-глутаминовой кислоты

ПЦР Полимеразная цепная реакция

ПААГ Полиакриламидный гель

ЯАМ Карбоксифлуоресцеин

кДа Килодальтон

мкКи Микрокюри

Ми Единица Миллера

у.е. Условная единица

E-mail автора: andrey4eremin@mail.ru

Отзывы на автореферат просим высылать по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание Казанского федерального университета, отдел аттестации научно-педагогических кадров, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне, факс: (843) 238-76-01.Email: ziabramova@mail.ru.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналиста«, 2А, оф. 022

Тел: 295-30-36, 564-77-41,564-77-51 Лицензия ЦЦ №7-0215 от 01.11.2001г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ Подписано в печать 21.11.2014 г. Печл. 1 75 Заказ МК-7436. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.