Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюционный и молекулярно-генетический анализ пилей первого типа Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эволюционный и молекулярно-генетический анализ пилей первого типа Escherichia coli"

На правах рукописи

Бесхлебная Виктория Александровна

Эволюционный и молекулярно-генетический анализ пилей первого типа Escherichia coli

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

--

Москва 2007

003161467

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов", Москва и на кафедре микробиологии Университета штата Вашингтон, Сиэтл

Научный руководитель

кандидат медицинских наук Кравцов Эдуард Георгиевич

Научный консультант

кандидат медицинских наук Сокуренко Евгений Вениаминович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Щипков Валерий Петрович

доктор биологических наук Осипова Ирина Григорьевна

Ведущая организация

Федеральное государственное учреждение науки "Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им ГН Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится //Щ 2007 г в/У^часов т заседании диссертационного совета Д 21220305 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов", по адресу

117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 8, к 1

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов", по адресу

117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

ОБ Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Инфекция мочевыводящих путей (ИМП) - это одно из наиболее распространенных урологических заболеваний На сегодняшний день кишечная палочка определена как один из основных этиологических факторов заболеваний мочевыводящего тракта В 70-90% случаев Escherichia coh является причиной цистита, уретрита и пиелонефрита

Колонизация слизистой хозяина патогенными микроорганизмами является обязательным этапом для возникновения и развития заболевания Определяющим фактором успешной колонизации, первым этапом в возникновении инфекционного процесса считается прикрепление бактерий к эпителиальной поверхности, те адгезия патогенных микроорганизмов к клегкам-мишеням

Адгезия кишечной палочки осуществляется в первую очередь благодаря пилям первого типа, или фимбриям, несущим специфический белок, адгезии FimH, способный узнавать структуру маннозных рецепторов эпителиальной ткани и осуществлять с ними взаимодействие

Способность адгезинов избирательно взаимодействовать с теми, или иными рецепторами, определяет тканевой тропизм патогенных вариантов кишечной палочки Разные структурные варианты FimH демонстрируют сходный высокий уровень тропизма к триманнозным (ЗМ), но различный тропизм к мономаннозным (1М) рецепторам Высокий уровень сродства к 1М-рецепторам ассоциируется с уропатогенными штаммами Е colt Изменение адгезивного фенотипа связано с возникновением точечных мутаций в различных участках fimH, это так называемые патоадаптивные мутации Было замечено, что в fimH имеются определенные нуклеотидные позиции, в которых вышеуказанные мутации происходят чаще, чем в других участках, подобный феномен был назван "горячие точки" (hot spot) Изучение эволюционной динамики Е coh с высокоадгезивным 1М фенотипом, закономерностей их адаптации к той или иной экологической нише (кишечник или мочевой тракт) очень важно для понимания путей энтеробактериальной патогенной диссеминации, и поисков путей к ее предотвращению

Для обеспечения адгезии к клеткам-мишеням пили должны быть функционально полноценными и представлены на поверхности бактерии в достаточном количестве В данной работе изучалось влияние изменения уровня экспрессии различных генов /ш-кластера на способность бактерии формировать функционально полноценные фимбрии, а также проверялась гипотеза о возможной роли субъединиц FimH пилинового (ПД) и лектинового (ДЦ) доменов в процессе биогенеза фимбрий

E coh имеет и другие факторы адгезии, кроме фимбрий первого типа, способствующие колонизации бактерией мочевыводящего тракта Среди них Dr фимбрии, взаимодействующие с DAF (decay-accelerating factor), присутствующим на поверхности ряда эпителиальных клеток (Medof, 1987), и коллагеном IV типа В связи с этим представляется интересным проследить возможные патоадаптивные изменения, происходящие параллельно в двух различных адгезивных органеллах, способствующих развитию заболеваний мочевыводящего тракта (Connell, 1996 Servm, 2005)

Цель и задачи исследования.

Целью настоящих исследований являлось изучение биогенеза пилей первого типа, изучение популяционной динамики Е. coh внутри пациента в течение заболевания в различных экологических нишах, изучение патоадагггивной эволюции Е coh под влиянием направленного отбора, конверсии комменсальных штаммов кишечной палочки в потенциально патогенные путем набора точечных мутаций, меняющих адгезивный фенотип штаммов

Для достижения вышеуказанных целей последовательно решались следующие задачи определить влияние уровня экспрессии белков firn-оперона на формирование пилей первого типа, определить минимальную структурную единицу FimH, необходимую для биогенеза пилей первого типа, провести филогенетические исследования в выборке E.coh, изолированных от пациентов с инфекцией мочевыводящего тракта, а также генетический и функциональный анализ адгезина FimH, на примере пациента ТОР 17 проанализировать роль патоадаптивных мутаций в развитии инфекций мочевых путей, в группе штаммов Е coh, имеющих Dr фимбрии и пили первого типа, проследить патоадаптивную эволюцию обоих адгезинов

Научная новизна.

Впервые изучено влияние уровня экспрессии отдельных компонентов fim-оперона на количество функциональных пилей на поверхности бактерии, для чего были созданы конструкты, содержащие fimR или весь jí/я-оперон в различных экспрессионных системах Было показано, что значительное увеличение количества функциональных пилей на поверхности клетки достигается только при увеличении экспрессии всех компонентов fim-оперона, селективное увеличение продукции FimH не существенно влияло на экспрессию функциональных фимбрий

Впервые проверялась гипотеза о роли лектинового домена (ЛД) в инициации сборки пилей Было показано, что для биогенеза пилей не достаточно только ПД, являющегося связующим звеном между адгезином и собственно фимбрией, необходимы обе субъединицы FimH - ЛД и ПД

Впервые был найден пример патоадаптивной эволюции адгезина FimH в

пределах одного пациента и прослежена популяционная динамика Е coli на протяжении развития мочевой инфекции от острого цистита, асимптоматической бакгериурии, к хроническому циститу, в различных экологических нишах (мочевой тракт и кишечник) Подтвердилась гипотеза о том, что патоадаптивные мутации, дающие преимущество колонизации мутантному штамму относительно исходного варианта в новой экологической нише, в то же самое время способствуют элиминации мутантного штамма из первичного, естественного биоценоза Было показано, что чем более выражен новый признак у мутанта, тем меньше у него возможность удержаться в организме хозяина

Впервые была прослежена патоадаптивная эволюция, происходящая параллельно в двух адгезивных органеллах - пилях первого типа и Dr фимбриях

Практическая значимость.

Понимание механизмов патоадаптации бактерий к условиям новой экологической ниши помогает отличать потенциально патогенных Е coli от комменсальных вариантов и дает ключ к созданию медицинстких препаратов, селективно направленных против патогенных штаммов бактерий

Изучение популяционной динамики бактерий в различных экологических нишах в течение заболевания даст возможность выявить источник потогенных бактерий, оценить вероятность их персистенции в очаге инфекции или повторного заражения, и прогнозировать переход заболевания в хроническую форму

Известно, что механизм сборки фимбрий с участием шаперона и ушера, посредством которого осуществляется биогенез пилей первого типа Е coli, используется большим количеством патогенных бактерий для формирования более тридцати видов различных адгезивных органелл (Soto, 1999) Пили первого типа являются типовой моделью для изучения данного механизма

Положения, выносимые на защиту.

1 Селективное увеличение продукции FimH не приводит к значимому увеличению уровня экспрессии функциональных пилей, для увеличения количества функциональных пилей на поверхности клетки необходим высокий уровень экспрессии всех генов^»ч-оперока

2 ЛД необходим для инициации биогенеза пилей

3 Штаммы Е coli с высоко адгезивным 1М фенотипом могут селектироваться в ходе колонизации одного пациента и быстро элиминироваться из циркуляции, что определяется особенностями взаимодействия FimH с рецепторами в условиях потока жидкости

4 Большинство штаммов, имеющих DrE фимбрии, принадлежат к

одной клональной группе, внутри которой наблюдается очень быстрая патоадаптация адгезина

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на семинарах кафедры микробиологии Ун-та шт Вашингтон (Сиэтл, 2004 - 2006 гг) и кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (Москва, 2005 г)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи Объем и структура работы. Диссертация изложена на 9/ стр машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего/ источника Работа иллюстрирована г? рисунками и ^ таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штаммы Е coli VB## (Beskhlebnaya, 2006), ELT###, KB 18, КБС235 (Klemm, 1985 Blomfield, 1991 Sokurenko, 1994), дикие штаммы, полученных из коллекции Е Сокуренко (Seattle, WA, USA), а также клинические изоляты, предоставленные M Сох (Seattle, WA, USA) Использованы мультикопийные плазмиды (15-20 копий на клетку) pGBШ, pFU, pPKL9, pPKL114 (Sokurenko, 1994), pACYC177, pACYC184, и монокопийная плазмвда pBeloBAC## (1 копия на клетку) (коллекция Е Сокуренко, Seattle, WA, USA)

Исследование адгезивной активности бактерий осуществляли с помощью методов агрегации дрожжей, агглютинации эритроцитов морской свинки в статических и динамических условиях, радионуклеотидного метода оценки адгезии в статических условиях, исследования адгезии к уроэпителиальным клеткам (Sokurenko, 1992,1994, 1995), метода исследования адгезии в камере непрерывного потока (Finger , 1996, Márchese , 1999), модели инфекции мочевого тракта m vivo (на мышах) (Mobley , 1993)

Филогенетический анализ штаммов и генотипирование осуществлялись с помощью MJICT (Multi Locus Sequence Typing) и ПФГЭ (Pulsed Field Gel Electrophoresis)

Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора mini-QíA-GENE (Германия-США), рестрикцию, лигирование, трансформацию ДНК проводили по стандартным методикам (Sambrook J, Е F Friísch and T Maniatis, 1989), очистку плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора GENECLEAN Kit II (США) Электропорацию ДНК производили с использованием прибора Gene Pulser (BioRAD, США)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование факторов, влияющих на биогенез пилей первого типа.

1 1 Влияние уровня экспрессии белков /ня-оперона на формирование пилей первого типа

Изучалась зависимость встраивания FimH в расположенные на поверхности бактерии пили как от уровня цитоплазматической экспрессии одного FimH, так и в совокупности с другими структурными генами Степень связывания лигандов штаммами BV20 (рВе1оВАС//шН) и ELT246 (рВе1оВАС//ия-оперон) были одинаковы (Рис 1), что предполагает одинаковое количество у них FimH, инкорпорированного в пили У штамма ELT246 весь ,/г/и-оперон экспрессируется только с монокопийной плазмиды, что имитирует его экспрессию с хромосомы, тогда как сами fimH является последним геном оперона размером 7 тысяч пар нуклеотидов и имеет самый низкий уровень транскрипции У штамма BV20 экспрессия fimH также осуществляется с монокопийной плазмиды, но отдельно (те m trans) от fim-кластера, который расположен на хромосоме (с инактивированным fimH) Таким образом FimH экспрессируется с промотора, находящегося на плазмиде, который обеспечивает более высокий уровень экспрессии, относительно штамма ELT246 Соответственно, количество встроенного в пили FimH не зависит от уровня его экспрессии в клетке Чтобы подтвердить это, мы определяли связывание с маннаном штамма BV21, в котором транскрипция FimH происходит также параллельно хромосомально расположенному ^шг-кластеру, но уже с многокопийной плазмиды, а уровень экспрессии FimH в цитоплазме значительно выше, чем у штамма ELT246, или даже у штамма BV20 Оказалось, что уровень связывания с маннаном у штамма BV21 лишь немного выше, чем у двух других (рис 1), что еще раз подтверждает наше наблюдение,

ELT246

BV20 __¡«им+«-*м|

8V21 Ъ&ЩтЩ ^..........Ж

ELT235 .....................

шгтлы

15 12

Съжъъъяж 6вет«|ЖЙ (коеЬ^а, 10*)

Рис 1 Связывание различных штаммов с маннаном в отсутствие (бесцветные столбики) и в присутствии (серые столбики) ингибитора а-мМ

согласно которому даже значительное увеличение экспрессии РппН в цитоплазме не ведет к существенному увеличению его количества на поверхности клетки в качестве адгезивного компонента пилей

При исследовании 1М связывающей способности штамма ЕЬТ235 (рРи//?»1-оперон), экспрессирующего весь йт-оперон с многокопийной плазмиды, те тогда, когда экспрессия всех генов (кроме ЯтН), необходимых, для синтеза пилей 1 типа, происходит на уровне, значи-тельно превышающем таковой у других штаммов, было установлено, что связывание с маннаном штамма ЕЬТ235 увеличилось в несколько раз по сравнению со штаммами ВУ20, ВУ21 и ЕЬТ24б, откуда следует, что в этом случае имеет место более высокий уровень инкорпорации Р1тН в пили Таким образом, для увеличения количества РппН, встроенного в пили на по-верхности бактерии, необходимо увеличение цитоплазматической экспрессии всех фимбриальных генов, в дополнение к РппН Очевидно, для инкорпорации РппН лимитирующим фактором является количество других минорных структурных субъединиц фимбрии, РтР и БплО, необходимых для формирования кончика пилей, а также достаточный уровень необходимых для сборки пилей шаперона, РшэС, и регуляторнош компонента РптЮ

1 2 Выявление минимальной структурной единицы РтН. необходимой для биогенеза пилей первого типа

Согласно недавним исследованиям (ВапЛаП, 2003), пилиновый домен (ПД), субъединица РтН, за счет которой он соединен с фимбрией, экспрессированный без лектинового домена (ЛД), может транспортироваться в периплазму и существовать там в стабильной форме в комплексе с периплазматическим шапероном Б'шС Было показано, что ПД-Р1шС комплекс вступает во взаимодействие с ушером РшзГ), расположенным в наружной мембране бактерии и обеспечивающим объединение отдельных компонентов пилей в функциональную органеллу, и образует стойкий ПД-Р1тС-р1тВ комплекс В нашей работе мы выясняли, будет ли происходить биогенез пилей, в которых БплН представлен только ПД

Мы создали штамм ВУ60, в котором с плазмиды рвВ экспрессируется синтез только ПД с сигнальной последовательностью, но одновременно этот штамм содержит плазмиду рРК1_ 114, с которой экспрессируется вся остальная информация йш-кластера Для определения наличия ПД в фимбриях между СП и ПД на месте линкера был вставлен маркер, содержащий шесть гистидиков, имеющий высокое сродство к никелю Как и ожидалось, ВУ60 не связывался с маннаном, поскольку у него отсутствует ЛД (рис 2) Однако не было также связывания с анти-р1шН антителами, антифимбриальными антителами и №-ПХ, что свидетельствует не только об отсутствии встраивания ПД в фимбрии, но и об отсутствии самих пилей В то же время штамм ЕЬТЗЮ, в котором последовательность из шести гистидинов была

встроена между 1^-концевой аминокислотой ЛД целого Р^тН и СП, демонстрировал высокий уровень связывания как с антифимбркальн ым и антителами, так и аити-РттН антителами, и с №-ПХ. Таким образом, вставка из шести гистидинов не препятствовала транспорту РшН на поверхность клетки и его инкорпорации в фимбрию Из этого очевидно, что неспособность ПД встроится в фимбрию скорее всего связана с невозможностью его транспортировки через наружную мембрану посредством и, таким

образом, невозможностью инициировать синтез пилей в отсутствие ЛД,

Многие авторы указывают на то, что рецептор-связывающая функция FimH зависит от конформации его N-терминального участка. Это подтверждается кристаллографическими исследованиями, согласно которым N-концевой фенилаланин (позиция 1) участвует во взаимодействии с маннозным рецептором (Coudhury, 1999. Hung, 2002) Наши данные показывают, что несмотря на наличие у штамма ELT310 фимбрий содержащих FimH с гистидиновым маркером, связывания этих бактерий с маннаном не наблюдалось. По всей видимости, это обусловлено либо маскированием пакета связывания, либо изменением конформации, предопределенной наличием N-концевых гистидиной,

2. Патоадаптивнан эволюция FimH Е. coli у больного с хроническим циститом-

2.1. Мутация в fimH. выявленная в популяции у пациента с острым циститом.

Для изучения популяционной динамики Е. coli у больных с инфекцией мочевыводящего тракта было создана коллекция из 61 штамма Е. coli, взятых у 19 пациентов в различные периоды болезни - во время острого цистита (ОЦ), ас им птомати ческой бактериурии (АБУ), или хронического цистита (ХЦ), также были взяты ректальные мазки (Р). У всех, выделенных из вышеуказанных образцов, штаммов Е. coli была определена нуклеотидная

'Дикий" urttx<M

ШтаммЕЬТЗЮ FimH-Kritc

ПД+бГж

Рис. 2. Связывание штаммов с маннаном и антителами.

последовательность гена адгезина FimH и проведено генотипирование штаммов методом гель-электрофореза с переменным вектором электрического поля (Pulsed Field Gel Electrophoresis, далее ПФГЭ) Чтобы выявить возможную мутационную динамику в гене fimH во время нахождения бактерий в организме хозяина на протяжении нескольких эпизодов заболевания, мы проверяли нуклеотидную последовательность fimH, как минимум, у восьми изолятов Е. coli из каждого образца

По результатам исследования для дальнейшей работы были отобраны штаммы, взятые в разные периоды заболевания у шести пациентов У всех пациентов, за исключением одного (ТОР 17), в каждом отдельном образце присутствовали Е coli с одинаковыми аллелями fimH, у большинства пациентов один и тот же аллель fimH выявлялся у К coli, выделенных в различные периоды болезни, и, как правило, обнаруживался в кишечнике У одного пациента (ТОР 17), в образце мочи и в ректальном мазке, взятых во время ОЦ, было выявлено два аллеля fimH Выявленная точечная мутация приводила к замене одной аминокислоты в белке FimH - в позиции 66 находился либо аргинин (R66) либо глицин (G66)

Штаммы, экспрессирующие FimH-G66 и FimH-R66 (ТОР 17-Oü,-G66 и ТОР17-ОЦ-Л66 соответственно), имеют идентичные нуклеотидные последовательность в семи генах, выбранных из категории наименее подверженных рекомбинациям (house keeping genes) (использования методика носит название Multi Locus Sequence Typing, далее MJ1CT), и одинаковые ПФГЭ профили (рис 3) Это указывает на то, что штаммы близкородственные (возможно отличаются друг от друга только одной мутацией в fimH), и мутация в FimH произошла относительно недавно, вероятнее всего в течение пребывания бактерии в пределах одного организма

Было выяснено, что гаутамин в позиции 269 и, соответственно, глицин в 66 позиции присутствует у подавляющего большинства штаммов (более 600 штаммов Е coli из базы данных Е В Сокуренко (Сиэтл, США)), в том числе у НЕ coli с известной нуклеотидной последовательностью всего генома Из этого следует, что G66 представляет собой дикий вариант, a R66 -производный от него мутант

В добавление к вышесказанному, среди исследованных штаммов из коллекции не было найдено ни одного с мутацией R66, но обнаружено 16 штаммов имеющих замены глицина в 66 позиции на серин или цистеин (Рис 3) Из них семь штаммов представляют собой уникальные аллели (три аллеля с цистеином и четыре с серином), различающиеся между собой в основном молчащими мутациям (замены нуклеотидов в последовательности ДНК, не приводящие к замене аминокислоты в соответствующем белке, благодаря вырожденности генетического кода), а в некоторых случаях и мутациями, приводящими к аминокислотным заменам Вышеуказанные штаммы не связаны между собой филогенетически, что говорит о том, что

Фтюгекическая дистанция

ПФГЭ

Штамм FimH ST Дата взятия образца

ТОР17-ОЦ-С-68 GSS 73 МШ33

R66 73 жчяоаэ

ТОР17.0Ц-Е1 R68 73 29ЙШ)3

Т0Р17-ОЦ-К2 ©66 73 27Jifl2003

Т0Р17-А6У oee 73 ЖЯССЭ

ТОР17-ХЦ oee 73 12/Ы3003

ЁС«54 S66b 73 До 1384

VA1010 S66b ГЗ )9Эе-99

Ес<#$5 S66b 74 До 1984

TOPS-ХЦ C66b ss гооз

PUMA1t»7-Oq сееь 95 1ээе

Ecof 26 566a Ю Д01984

HH36-P1 see» 10 1ЭЙ7

ЕсогЮ se&a 43 До1Ш4

U1 S№s 410 ДО 1987

TOP41-RC 366a 41Q 2004

tcar41 C6B8 ta

С66» 62 До 1Э&7

ЕсогЗв Сбба 62 До 1934

Рис. 3. Филогенетическое родство и ПФГЭ профили штаммов. Слева расположено филогенетическое дерево, построенное по результатам анализа нуклеотидных последовательностей семи генов {"housekeeping genes"), цифрами обозначено число нуклеотидных замен, соответствующее каждой ветви. Далее правее представлены ПФГЭ профили, полученные путем гидролиза ДНК ферментом ХЬа\ ST - sequence type, клональная группа по результатам МЛСТ.

мутации в 66 позиции FimH происходили независимо друг от друга множество раз, и позиция 66 является мутацинной "hoi spot" в белке FimH Отсюда делается предположение о том, что мутация аргинин 66 закрепилась под влиянием направленного отбора.

2.2. Аргинин в позиции 66 как патоадаптивная мутация Чтобы выяснить, имеет ли мутация Аргбб функциональный эффект, мы сравнили адгезивную способность штаммов TOP17-OU-G66 или TOP17-OU-R66 Для того чтобы штаммы начали экспрессировать FimH, они трижды пересевались на жидкую питательную среду, прежде чем производить исследование адгезии. Оба штамма показали примерно одинаковый уровень связывания с РНКзой Б (трехманнозный субстрат, далее ЗМ) - модельный

гаикО протеи к, имеющий на своей поверхности олигос&хариды с пятью маннозными субъединицами, из которых три участвуют во взаимодействии с ИтН (рис. 4А). В то же время штамм ТОР!7-ОЦ-К66 связывался в четыре раза лучше, чем штамм с ТОР 17-ОЦ-С66, с маннозшжрованным бычьим альбумином, который является моделью для мономаннозного связывания (одномашинный субстрат, далее 1М). Связывание с 1М субстратом у штаммов с разными вариантами Р1тН может отличаться более чем в 10 раз Для характеристики 1М связывания используется величина, равная отношению 1М/ЗМ, которая относительно независима от уровня экспрессии пилей. Эта величина для штамма ТОРП-ОЦ-Ябб составила 0.96, а для ТОР17-ОЦ-Оёб -0,29,

Аналогичные результаты были получены при сравнении Р¡тН с К66 и вбб в рекомбинантных изогенных штаммах (Рис. 4Б). Таким образом, мутация И66 относится к группе мутаций, усиливающих 1М связывание, которые, в свою очередь, обеспечивают лучшее связывание Е.соН с уроэпителиальными клетками, что дает преимущества такому варианту кишечной палочки при колонизации мочевого тракта. Действительно, штамм ТОР17-ОЦТ166 в три * ?1 .........2: ' 1 ......* "V * 1

•\Ш......1 1.1. ■ ! « ^! Л 1

Иамрмд* <396

А Ь

if il

I

1 ■ I ■ I к

<т rWfc «ш ш

Рис 4. (А) Связывание "диких штаммов" TOPi7-OU-R66 и TOP17-OU-R66 с 1М (темные колонки) и ЗМ (светлые колонки) субстратами в статических

условиях. (Е) Связывание изогенных штаммов с 1М (темные колонки) и ЗМ (светлые колонки) субстратами в статических условиях: (i) FimH-G66 и PimH-R66 варианты штамма ТОР17; (ii) FimH-C66 и его исходный вариант FimH-G66; (lit) FimH-S66 и его исходный вариант FimH-G66. (В) Связывание

изогенных вариантов FimK-G66 и FirnH-R66 штамма ТОР17 с клетками мочевого пузыря Т24. (Г) Колонизация "дикими штаммами" TOPI 7-OLI.-R66 и ТОР17-ОЦ-Р66 мочевого пузыря мышей через сутки после заражения. (Д) Концентрация а-мети л ма ноз и да, вызывающая 50% ингибирование связывания (ИК.Ю) изогенных пар штаммов.

раза лучше связывался с клетками мочевого пузыря и примерно в двадцать раз лучше колонизировал мочевой пузырь при моделировании инфекции мочевого тракта на мышах (Рис 4С и 4Д)

2 3 Штамм с мутацией в позиции 66 быстро элиминируется из обшей популяции

То, что изоляты Е. coli у пациента ТОР 17, выделенные из мочи, полученной при ОЦ, АБУ и ХЦ, имеют одинаковые MJICT и ПФГЭ профили (Рис 3), указывает на последовательное инфицирование одним и тем же штаммом (или персстенцию), и на генотипическую стабильность в течение времени Штаммы с аналогичным генотипическим профилем были выявлены и в ректальной популяции (ТОР17-Р1 и ТОР17-Р2)

Как уже говорилось раньше, смешанная популяция штаммов ТОР17-ОЦ-G66/TOP17-ОЦ-1166 была выявлена в образце мочи и в ректальном мазке, взятых в период ОЦ Однако соотношение аллелей в кишечнике было иным, чем в моче в образце из прямой кишки R66 составляет 12 из 45 проанализированных колоний, в то время как в моче - 17 из 34 (р< 05) В связи с тем, что штамм с мутацией R66 был найден среди кишечной популяции, вопрос о месте возникновения мутации оставался не вполне ясным Возможно, что штамм ТОР17-ОЦ-К.66 первоначально возник вне мочевого тракта, и потом был занесен в мочевой пузырь в виде смешанной популяции ТОР 17-ОЦ-Обб/ТОР17-ОЦ-1166, ще происходила дальнейшая его селекция Не исключено, что клон с R66 возник в процессе мочевой инфекции и затем попал в область промежности и кишечник

Среди генетически родственных Е colt выделенных из мочи при АБУ ХЦ и в образце из rectum, соответствующем АБУ (ТОР17-Р2), были выявлены только аллели fimH с G66 Разница в количестве Е coli, содержащих FimH R66, в образцах взятых при ОЦ по сравнению с ХЦ и АБУ, является статистически значимой как в образцах мочи (р < 0 01), так и в кишечнике (р < 0 05) Это указывает на значительное уменьшение аллелей с R66, или его полную элиминацию из организма хозяина, после эпизода ОЦ Таким образом, мутация R66 нестабильна в популяции Е coli

Мутация FimH R66 была уникальной в использованной в исследовании коллекции Е coli (более 600 штаммов, треть из которых выделена из мочевого тракта), в то время как другие аллели, имеющие серин (S66) или цисгеин в позиции 66 (С66), встречаются более, чем в одном штамме Штаммы с аллелями С66 и S66 были выделены от разных пациентов, в разное время и в разных географических областях Не смотря на то, что штаммы с С66а принадлежат к одной MLST группе, они имеют разные PFGE профили, что указывает на накопление генетических различий в течение времени То -же можно отметить и в отношении аллеля S66a, причем некоторые штаммы с данным аллелем принадлежат разным MLST группам, что указывает на

горизонтальный обмен мутантными аллелями, между различными бактериальными клонами Генетическое разнообразие среди штаммов, содержащих аллели С66 и Б66, указывает на то, что они эпидемиологически не связаны, и относительно стабильны в организме хозяина Аллель 1166, напротив, исчез из бактериальной циркуляции, появившись только один раз, в течение острой инфекции, в пределах организма одного хозяина

Сложно сказать, является ли исчезновение Кб 6 результатом стохастического процесса, или негативной селекции, и, если верно последнее, то какая из экологических ниш имела критическое значение для элиминации клона 1166 Одним из аргументов в пользу того, что мутация Л66 давала штамму преимущество при отборе во время острого цистита, а не являлась случайно возникшей (и, соответственно, случайно исчезнувшей), является то, что возникающие в РппН мутации, не являются результатом высокого уровня мутагенеза по всему геному РппН, скорее всего, является специфической мишенью для мутаций Чтобы прояснить этот вопрос, мы провели скрининг участка ДНК, размером около одного миллиона пар нуклеогадов, с целью выявления точечных и другого вида мутаций, у ТОР17-ОЦ-К66 и ТОР17-ХЦ, выделенного спустя 40 дней после эпизода ОЦ В случае если бы БштН был случайной мишенью для мутаций, мы смогли бы выявить и другие мутации, аккумулированные в течение времени в различных местах генома Анализу, с использованием технологии №тЫе§епе, подверглись как более стабильные гены, так и участки ДНК, относительно часто подверженные рекомбинациям Мутация в РппН оказалась единственным различием между двумя штаммами, что свидетельствует против гипермутационного фенотипа, и соответственно против предположения, что мутация Я66 возникла случайно Соответственно, йшН является специфической мишенью для мутаций, которые происходят под влиянием позитивного отбора, и, вероятнее всего, исчезают, когда селективный признак становится помехой для существования бактерии

2 4 Роль изменений функциональной активности Р1шН в элиминации штамма с аргинином в позиции 66 из обшей популяции Б соЬ

Для выявления причины разницы в стабильности штаммов с мутациями С66/Б66 уб 1166, мы сравнили функциональные эффекты этих мутаций в даогенных штаммах Подобно 1166, мутанты С66 и 866 усиливали связывание с 1М субстратами, но абсолютное отношение 1М/ЗМ было значительно выше у мутанта 1166 (Рис 4Б) 1М фенотип, ассоциированный с мутациеи к.66, так же оказался сильнее, чем таковой у ранее исследованных десяти других вариантов РппН природного происхождения с мутациями, усиливающими сродство к 1М, и встречающихся неоднократно в различных эпидемиологически не связанных штаммах (1МУЗМ соотношение у них было в пределах 0 25-0 65) Нами найден только один природный вариант РппН, дающий столь же высокий 1М фенотип, что и РгтН-Ябб - это РшН-А56,

выделенный от пациента с пиелонефритом, и имеющий 1М/ЗМ соотношение 0 95

Таким образом, можно предположить, что сильное связывание с 1М субстратами, ассоциированно с РтЩ-Ябб и дает штамму преимущество при колонизации мочевого пузыря В других условиях такая мутация будет помехой для штамма в большей степени, чем БтН-Сбб/Збб или другие мутации с более умеренным функциональным эффектом

Было показано, что увеличение сродства к 1М субстратам, обусловленное структурными мутациями, так же ассоциируется с повышенной чувствительностью к ингибированию связывания, как растворенной маннозой, так и другими веществами, содержащие маннозные эпитопы Мы проверили чувствительность к ингибированию у штаммов с различными аминокислотными заменами в 66 позиции БшН (Рис 4Е) Все мутантные штаммы демонстрировали повышенную чувствительность к ингибированию маннозой, по сравнению с исходными штаммами Это может помешать штамму связаться с эпителиальными клетками кишечника или орофарингеальной области, где имеется большое количеств растворенных гликопротеинов и других маннозосодержащих веществ Однако уровни ингибирования у штаммов с 1166, С66 и Б66 отличались незначительно, что говорит о наличии других факторов, уменьшающих иопуляционную стабильность у штамма с 1166

2 5 Эффект мутации в 66 позиции на связывание Е соЬ с 1М субстратами в условиях непрерывного потока

Показано, что связывание с маннозой у штаммов со слабым 1М связывающим фенотипом может быть усилено в условиях пел ока жидкости С помощью управляемого компьютерного моделирования и экспериментов с использованием сайт-направленного мутагенеза было предсказано, что приложение силы растяжения между линкерной цепью, соединяющей пилиновый (ПД) и лектиновый (ЛД) домены, и манноэашм лигандом, связанным с рецепторным карманом, вызовет удлинение междоменной линкерной цепи за счет "вытягивания" ее из ЛД Было сделано предположение, что подобное изменение положения линкерной цепи повышает сродство сайта связывания к маннозе за счет конформацинооых изменений молекулы Большинство мутаций в БилН, возникших природным путем и усиливающих сродство к маннозе, в том числе и мутации в позиции 66, расположены в области ЛД, обращенной в сторону ПД, и, соответственно, могут тем или иным путем облегчать "вытягивание" линкерной цепи из ЛД при приложении силы растяжения, усиливая 1М связывающую способность при низкой силе отрыва или в статических условиях

Нами исследовано влияние мутаций в 66 позиции БтН на связывание с 1М субстратами в условиях непрерывного потока Для эксперимента

использовались изогенные штаммы с G, С, S или R в 66 позиции FimH, 1М субстрат иммобилизировался на неподвижной поверхности Как и ожидалось, при низком давлении потока (0 013 Па) демонстрировался уровень связывания, сходный со статическими условиями, штамм с FimH-R66 связывался с субстратом в 2-60 раз лучше, чем остальные штаммы (рис 5А) С увеличением силы отрыва все штаммы, за исключением FimH-R66, демонстрировали в разной степени увеличение уровня связывания У штамма с FimH-R66 ÎM связывание, напротив, ингибировалось при увеличении силы отрыва, и на следующем уровне (0 069 Па) стало ниже, чем у FimH-C66 и FimH-S66 вариантов, а с дальнейшим увеличением силы отрыва стало ниже, чем у FimH-G66 Это, вероятно, связано с более компактной конформацией кармана рецепторнош связывания, характерного для FimH с более высоким сродством к маннозе

Ранее также показывалось, что в условиях непрерывного потока бактерии, экспрессирующие фимбрии первого типа, могут связываться с поверхностью либо не прочно, и тоща они как бы перекатываются по поверхности под действием потока, или же, наоборот, прочно, стационарно (Thomas, 2006) Для всех вариантов FimH количество перекатывающихся бактерий было существенно больше при низкой силе отрыва (рис 5Б) Однако бактерии с FimH-R66 демонстрировали наименьшую способность к перекатыванию по поверхности, и даже при самой низкой силе отрыва процент перекатывающихся бактерий был не более 20% Это также подтверждает, что

«¡в.. ■„ _ ... s™., I8g

Рис 5 (А) Связывание изогенных пар штаммов, имеющих аминокислотные

замены в позиции 66 РппН, с 1М субстратом, иммобилизованным на неподвижной поверхности, в условиях потока жидкости при изменяемом давлении потока (Б) Процент перекатывающихся бактерий по отношению к общему числу бактерий (перекатывающихся и прочно связанных с поверхностью) для пар изогенных штаммов в условиях изменяемого

давления потока

в FimH-R66 высокоадгезивная конформация преобладает, в то время как у FimH-G66, а так же у С66 и S66, низкоадгезивная конформация преобладает при низкой силе отрыва, и переходит в высокоадгезивную при ее увеличении

Мы полагаем, что спектр скоростей, представленный в данном исследовании, близок к физиологическому (Malek, 1999) Возможно, что способность к эффективному связыванию с 1М рецепторами при низкой силе отрыва дает преимущества бактериям при колонизации почечных канальцев и мочевого пузыря (в периоды между мочеиспусканиями) на ранней стадии заболевания, когда количество инфицирующих бактерий невелико Однако, такое выраженное связывание с эпителием может инициировать в эпителиальных клетках апоптоз и/или привлечь значительное количество иммунокомпетентных клеток (Mulvey, 1998 Schilling, 2003), что будет способствовать элиминации бактерий в развернутой стадии заболевания, когда количество их в очаге велико Ингибируемый силой отрыва фенотип R66 не даст возможность свободно плавающим бактериям адгезироваться к эпителию мочевого пузыря во время мочеиспускания Более того, недавно было показано, что способность к перекатыванию по поверхности под воздействием силы отрыва соответствует лучшему образованию и росту бактериальной биопленки в условиях потока, в то время как неподвижно фиксированные к поверхности бактерии хуже образуют ее, по крайней мере на ранних стадиях формирования последней (Thomas, 2007)

3. Внутриклональная эволюция Dr адгезииов К coli.

Исследуя FimH аллели в клональной группе ST73, можно предположить, что эволюция FimH происходила под влиянием направленного отбора У штаммов группы ST73, TOP17-AC-R66, Есог54 и VA1010, fimH имеет идентичный аминокислотный бэкграунд (одинаковые молчащие мутации и две несинонимичные мутации S70/N78), и на этом фоне появляются новые мутации, приводящие к аминокислотным заменам - R66 (+А163) и S66, и дающие штаммам новый адгезивный фенотип (резко возросшую способность связываться с 1М субстратами), и, соответственно, преимущества при колонизации мочевой системы По мнению Weissman (2006 г), такое накопление в популяции мутаций, приводящих к аминокислотным заменам, и преобладание их количественно над молчащими мутациями, свидетельствует о том, что данный признак находится под влиянием направленного отбора

В связи с этим представлялось целесообразным проанализировать влияние направленного отбора на другие адгезивные органеллы Е coli - Dr фимбрии, предположительно играющие роль в развитии диарейных и урогенитальных заболеваний, и сравнить параллельно происходящие молекулярно-функциональные изменения в белке FimH у соответствующих штаммов Е coh Для исследования было отобрано 26 штаммов Е coh с Dr фимбриями, относящимися к группе DraE (рис 6) Среди них 14 штаммов ассоциируются

с инфекцией мочевыводящих путей, десять являются кишечными диарейными изолятами, и два кишечных штамма выделены у здоровых сексуальных партнеров женщин с инфекцией мочевыводящих путей Нами была определена нуклеотидная последовательность генов fimH и draE, кодирующих адгезивные субъединицы пилей первого типа и DrE (в случае DrE адгезивный и структурный компоненты представлены одним и тем же белком), изучены функциональные особенности адгезинов, а также определена принадлежность штаммов к той или иной клональной группе (ST, sequence type) в зависимости от нуклеотидной последовательности двух генов - adk и fum

Рис 6 Полиграмма, отражающая разнообразие протеинов в группе адгезинов DraE Каждый круг соответствует определенному варианту белка, внутри кругов названия штаммов, которые этот белок содержат Секция в центральном круге, выделяющая штамм 298, обозначает синонимичную

мутацию в белке данного штамма Вне кругов подчеркнутые цифры обозначают позиции мутационных "hot spot" Различия шрифта в названиях штаммов определяют их принадлежность к одной клональной группе (ST) 16

Оказалось, что большинство штаммов (21 из 26) принадлежат к одной клональной группе - ST14 При этом в Dr адгезине отмечается выраженное преобладание несинонимичных мутаций, вызывающих аминокислотные замены (отношение несинонимичных к синонимичным мутациям равно 16 1), а также общая тенденция к уменьшению чувствительности к ингибированию хлорамфениколом связывания с DAF (decay acceleration factor) рецепторами И в то же время большинство этих штаммов (20 из 26) имеют одинаковый FimH аллель - HI 66, демонстрирующий повышенное сродство к 1М субстратам Из этого можно предположить, что Dr адгезин находится под сильным влиянием направленною отбора, и что, вероятно, уменьшение чувствительности к ингибированию адгезии (хлорамфениколом или, сходной молекулой естественного происхождения) к эпителиальным клеткам мочевого пузыря (имеющими DAF эпитопы) дает преимущества при колонизации мочевыводящей системы Адгезин FimH, вероятно, представлен аллелем, уже селектированным под действием отбора

ВЫВОДЫ

1 Уровень экспрессии функциональных пилей не зависит от селективного увеличения уровня продукции РппН, а определяется уровнем экспрессии всех генов Бт-оперона

2 При биогенезе пилей первого типа ЛД необходим для инициации сборки пилей

3 Популяционная стабильность штамма обратно пропорциональна выраженности функционального эффекта мутации, которую имеет данный штамм

4 Большинство штаммов, имеющих ВгЕ адгезины, принадлежат к одной клональной группе, внутри которой наблюдается быстрая патоадаптация штаммов через набор точечных мутаций, изменяющих адгезивный фенотип штамма

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Бесхлебная В А, Тринчина Е В , Априкян П, Чеснокова В, Сокуренко Е В Молекулярно-генетический анализ адгезинов первого типа Escherichia coli Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006 Маг, 141(3) 339-42

2 N Korotkova, S Chattopadhyay, Т A Tabata, V Beskhlebnaya, V Vigdorovich, В К Kaiser, R К Strong, D E Dykhuizen, E V Sokurenko, and S L Moseley Selection for Functional Diversity Drives Accumulation of Point Mutations in Dr Adhesms of Escherichia coh. Molecular Microbiology 2007 Apr, 64 180-194

3 S J Weissman, V Beskhlebnaya, V Chesnokova, S Chattopadhyay, W E Stamm, T M Hooton and E V Sokurenko Differential Stability and Trade-off Effects of Pathoadaptive Mutations in the E. coh FimH adhesin Infection and Immunity 2007 Jul, 75(7) 3548-55

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бесхлебная, Виктория Александровна

СОКРАЩЕННЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В РАБОТЕ 6 ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Уропатогенные Escherichia coli

1.1.1 Общая характеристика УПКП

1.1.2 Адгезины как факторы патогенности УПКП

1.2 Роль пилей первого типа в экологии микроорганизмов

1.2.1 Пили первого типа в историческом аспекте

1.2.2 Адгезии FimH как представитель класса лектинов

1.2.3 Роль пилей первого типа в адаптации микроорганизмов

1.3 Современные представления о пилях первого типа Е. coli

1.3.1 Морфология и структура пилей первого типа

1.3.2 Структурные компоненты пилей первого типа

1.3.3 Генетическая структура Jim кластера. Строение, функция отдельных генов в функционировании кластера

1.3.4 Регуляция экспрессии пилей первого типа

1.3.5 Биогенез фимбрии: секреция и процессинг субъединиц, сборка органеллы

1.4 Структурно-функциональные свойства пилей первого типа

1.4.1 История исследования рецепторной специфичности FimH

1.4.2 Современные представления о взаимодействии FimH с рецепторами

1.4.3 Взаимодействие FimH с гликопротеинами, не являющимися структурными белками клеточных мембран

1.4.4 Фенотипическая гетерогенность кишечных палочек по способности связываться с маннозосодержащими рецепторами

1.4.5 Три варианта адгезивного фенотипа FimH

1.4.6 Количественные разновидности в пределах М-фенотипа

1.4.7 Количественные различия, возникающие за счет вариабельной способности связываться с одиночными маннозильными остатками

1.5 Роль вариантов FimH в тканевом тропизме

1.5.1 Прочность фиксации на Ман-БСА коррелирует с результатами модельных опытов на уроэпителиальных клетках

1.5.2 Варианты FimH и количественные различия в связывании с ассиметричными участками мембран уроэпителия in situ

1.5.3 Варианты FimH отличаются по способности колонизировать мочевой пузырь мыши in vivo

1.5.4 Мутации FimH, повышающие уровирулентность, препятствуют адгезии к клеткам орофарингеального эпителия

1.6 Варианты FimH и эволюция вирулентности

1.6.1 Филогенетический анализ аллелей FimH •

1.6.2 Основы структурного и функционального разнообразия адгезинов. Патоадаптивные мутации.

1.6.3 Значение и перспективы дальнейшего изучения адгезина FimH пилей первого типа

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Штаммы микроорганизмов, плазмиды и конструкции гибридов

2.1.2 Среды, антибиотики и реактивы, используемые в работе

2.1.2.1 Среды

2.1.2.2 Антибиотики

2.1.2.3 Реактивы

2.1.3 Животные

2.1.4 Культуры клеток

2.2 Методы

2.2.1 Исследование агрегации дрожжей х

2.2.2 Исследование агглютинации эритроцитов

2.2.3 "Исследование роста" (Growth assay, ИР)

2.2.4 Обогащение культуры микроорганизмов

2.2.5 Радионуклеотидное исследование адгезии

2.2.6 Исследование адгезии в условиях непрерывного потока

2.2.7 Исследование адгезии к уроэпителиальным клеткам

2.2.8 Изучение процесса колонизации мочевого пузыря in vivo

2.2.9 Взаимодействие FimH антител и неимунной сыворотки со штаммами Е. coli, экспрессирующими FimH

2.2.10 Выделение плазмидной ДНК

2.2.11 Обработка ДНК

2.2.12 Классическая (кальциевая) трансформация клеток Е. coli ДНК

2.2.13 Электропорация 66 2.3 Математическая и статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Исследование факторов, влияющих на биогенез пилей первого типа

3.2 Влияние уровня экспрессии белков fim-оперона на формирование пилей первого типа 71 3.2.1 Выявление минимальной структурной единицы FimH, необходимой для биогенеза пилей первого типа

3.3 Пато-адаптивная эволюция FimH Е. coli у больного с хроническим циститом

3.3.1 Мутация в fimH, выявленная в популяции у пациента с острым циститом

3.3.2 Аргинин в позиции 66 как патоадаптивная мутация

3.3.3 Штамм с мутацией в позиции 66 быстро элиминируется из общей популяции.

3.3.4 Роль изменений функциональной активности FimH в элиминации штамма с аргинином в позиции 66 из общей популяции E.coli

3.3.5 Эффект мутации в 66 позиции на связывание Е. coli с 1М субстратами в условиях непрерывного потока

3.4 Внутриклональная эволюция Dr адгезинов Е. coli

3.4.1 Влияние факторов отбора на структурное разнообразие поверхностных антигенов

3.4.2 Внутриклональная эволюция в группе ST

3.4.3 Патоадаптивная эволюция DraE адгезинов 87 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 90 ВЫВОДЫ 92 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 93 ПРИЛОЖЕНИЕ

Сокращенные обозначения, используемые в работе

АЕМ, AUMs - асимметричные единицы мембран (уроэпителия) а. к. - аминокислота а-ммп - а-метил-О-маннопиранозид

БК - клетки буккального эпителия

ИМП - инфекция мочевыводящих путей

ИР - тест "исследование роста", Growth assay

ИИА — тест "инвертированное исследование адгезии "

КОЕ - колониеобразующая единица

КОЕ/лунка - кое на 1 лунку

ЛД — лектиновый домен

MLST, MJ1CT - multiple locus sequence typing

MH, MN, 1M - маннан, мономаннозный рецептор

МЧ — маннозочувствительная (адгезия) н. п. - нуклеотидных пар

ПД - пилиновый домен

ПДбГис - ПД с присоединенным отрезком из шести гистидинов п. о. - пар оснований

PFGE, ПФГЭ - pulsed-field gel electrophoresis ПЦР, PCR - полимеразная цепная реакция RNAseB, ЗМ - РНКазаБ, трехманнозный рецептор СГ - сигнальный пептид

ST, СТ, КГ - sequence type, клональная группа УП, UP - уроплакины

УПКП - уропатогенные кишечные палочки

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эволюционный и молекулярно-генетический анализ пилей первого типа Escherichia coli"

Инфекция мочевыводящих путей (ИМП) - это одно из наиболее распространенных урологических заболеваний. На сегодняшний день кишечная палочка определена как один из основных этиологических факторов заболеваний мочевыводящего тракта. В 70-90% случаев Escherichia coli является причиной цистита, уретрита и пиелонефрита.

Колонизация слизистой хозяина патогенными микроорганизмами является обязательным этапом для возникновения и развития заболевания. Определяющим фактором успешной колонизации, первым этапом в возникновении инфекционного процесса считается прикрепление бактерий к эпителиальной поверхности, т.е. адгезия патогенных микроорганизмов к клеткам-мишеням.

Адгезия кишечной палочки осуществляется в первую очередь благодаря пилям первого типа, или фимбриям, несущим специфический белок, адгезии FimH, способный узнавать структуру маннозных рецепторов эпителиальной ткани и осуществлять с ними взаимодействие.

Способность адгезинов избирательно взаимодействовать с теми, или иными рецепторами, определяет тканевой тропизм патогенных вариантов кишечной палочки. Разные структурные варианты FimH демонстрируют сходный высокий уровень тропизма к триманнозным (ЗМ), но различный тропизм к мономаннозным (1М) рецепторам. Высокий уровень сродства к 1 М-рецепторам ассоциируется с уропатогенными штаммами Е. coli. Изменение адгезивного фенотипа связано с возникновением точечных мутаций в различных участках fimH, это так называемые патоадаптивные мутации. Было замечено, что в fimH имеются определенные нуклеотидные позиции, в которых вышеуказанные мутации происходят чаще, чем в других участках, подобный феномен был назван «горячие точки» (hot spot). Изучение эволюционной динамики Е. coli с высокоадгезивным 1М фенотипом, закономерностей их адаптации к той или иной экологической нише (кишечник или мочевой тракт) очень важно для понимания путей энтеробактериальной патогенной диссеминации, и поисков путей к ее предотвращению.

Для обеспечения адгезии к клеткам-мишеням пили должны быть функционально полноценными и представлены на поверхности бактерии в достаточном количестве. В данной работе изучалось влияние изменения уровня экспрессии различных генов /zw-кластера на способность бактерии формировать функционально полноценные фимбрии, а также проверялась гипотеза о возможной роли субъединиц FimH пилинового (ПД) и лектинового (ЛД) доменов в процессе биогенеза фимбрий.

Е. coli имеет и другие факторы адгезии, кроме фимбрий первого типа, способствующие колонизации бактерией мочевыводящего тракта. Среди них DraE фимбрии, взаимодействующие с DAF (decay-accelerating factor), присутствующим на поверхности ряда эпителиальных клеток [2], и коллагеном IV типа. В связи с этим представляется интересным проследить возможные па-тоадаптивные изменения, происходящие параллельно в двух различных адгезивных органеллах, способствующих развитию заболеваний мочевыводящего тракта [3,4].

Цели и задачи исследования

Целью настоящих исследований являлось изучение биогенеза пилей первого типа; изучение популяционной динамики Е. coli у пациентов с заболеваниями мочевого тракта в различных экологических нишах; изучение па-тоадаптивной эволюции Е. coli под влиянием направленного отбора, конверсии комменсальных штаммов кишечной палочки в потенциально патогенные путем набора точечных мутаций, меняющих адгезивный фенотип штаммов.

Для достижения вышеуказанных целей последовательно решались следующие задачи:

Определить влияние уровня экспрессии белков fim-оперона на формирование пилей первого типа;

Определить минимальную структурную единицу FimH, необходимую для биогенеза пилей первого типа;

Провести филогенетические исследования в выборке E.coli, изолированных от пациентов с инфекцией мочевыводящего тракта, а также генетический и функциональный анализ адгезина FimH;

На примере пациента ТОР17 проанализировать роль патоадаптивных мутаций в развитии инфекций мочевых путей;

В группе штаммов E.coli, миеющих Dr фимбрии и пили первого типа, проследить патоадаптивную эволюцию обоих адгезинов.

Научная новизна

Впервые изучено влияние уровня экспрессии отдельных компонентов /?га-оперона на количество функциональных пилей на поверхности бактерии, для чего были созданы конструкты, содержащие fimH или весь fim-оперон в различных экспрессионных системах. Было показано, что значительное увеличение количества функциональных пилей на поверхности клетки достигается только при увеличении экспрессии всех компонентов /?га-оперона; селективное увеличение продукции FimH не существенно влияло на экспрессию функциональных фимбрий.

Впервые проверялась гипотеза о роли лектинового домена (ЛД) в инициации сборки пилей. Было показано, что для биогенеза пилей не достаточно только ПД, являющегося связующим звеном между адгезином и собственно фимбрией, необходимы обе субъединицы FimH - ЛД и ПД.

Впервые был найден пример патоадаптивной эволюции адгезина FimH в пределах одного пациента и прослежена популяционная динамика E.coli на протяжении развития мочевой инфекции от острого цистита, асимптоматиче-ской бактериурии, к хроническому циститу, в различных экологических нишах (мочевой тракт и кишечник). Подтвердилась гипотеза о том, что патоа-даптивные мутации, дающие преимущество колонизации мутантному штамму относительно исходного варианта в новой экологической нише, в то же самое время способствуют элиминации мутантного штамма из первичного, естественного биоценоза. Было показано, что чем более выражен новый признак у мутанта, тем меньше у него возможность удержаться в организме хозяина.

Впервые была прослежена патоадаптивная эволюция, происходящая параллельно в двух адгезивных органеллах - пилях первого типа и DraE фимбриях.

Практическая значимость

Понимание механизмов патоадаптации бактерий к условиям новой экологической ниши помогает отличать потенциально патогенных Е. coli от комменсальных вариантов и дает ключ к созданию медицинстких препаратов, селективно направленных против патогенных штаммов бактерий.

Изучение популяционной динамики бактерий в различных экологических нишах в течение заболевания даст возможность выявить источник пото-генных бактерий, оценить вероятность их персистенции в очаге инфекции или повторного заражения, и прогнозировать переход заболевания в хроническую форму.

Известно, что механизм сборки фимбрий с участием шаперона и ушера, посредством которого осуществляется биогенез пилей первого типа Е. coli, используется большим количеством патогенных бактерий для формирования более тридцати видов различных адгезивных органелл [5]. Пили первого типа являются типовой моделью для изучения данного механизма.

Положения, выносимые на защиту

1. Селективное увеличение продукции FimH не приводит к значимому увеличению уровня экспрессии функциональных пилей; для увеличения количества функциональных пилей на поверхности клетки необходим высокий уровень экспрессии всех генов/?га-оперона.

2. ЛД необходим для инициации биогенеза пилей.

3. Штаммы E.coli с высоко адгезивным 1М фенотипом могут селектироваться в ходе колонизации одного пациента и быстро элиминироваться из циркуляции, что определяется особенностями взаимодействия FimH с рецепторами в условиях потока жидкости.

4. Большинство штаммов, имеющих DraE фимбрии, принадлежат к одной клональной группе, внутри которой наблюдается очень быстрая патоадап-тация адгезина.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Бесхлебная, Виктория Александровна

ВЫВОДЫ

1. Уровень экспрессии функциональных пилей не зависит от селективного увеличения уровня продукции FimH, а определяется уровнем экспрессии всех генов/гт-оперона.

2. При биогенезе пилей первого типа ЛД необходим для инициации сборки пилей.

3. Популяционная стабильность штамма обратно пропорциональна выраженности функционального эффекта мутации, которую имеет данный штамм.

4. Большинство штаммов, имеющих DrE адгезины, принадлежат к одной клональной группе, внутри которой наблюдается быстрая патоадаптация штаммов через набор точечных мутаций, изменяющих адгезивный фенотип штамма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обсуждая полученные результаты, можно заключить, что мутации в генах, кодирующих адгезины Е. coli, и последующий направленный отбор определенных фенотипов по функциональной активности, занимают существенное место в патогенезе уроинфекции.

Вероятно, основным источником уроинфекции следует считать кишечную микрофлору, где из популяции Е. coli вычленяются варианты, способные колонизировать новую экологическую нишу — урогенитальный тракт. Уропатогенные кишечные палочки (УПКП) отличаются от остальных Е. coli наличием ряда факторов патогенности, среди которых адгезины играют первостепенную роль. Пили первого типа большинства УПКП отличаются от таковых у коммепсальных Е. coli способностью активно взаимодействовать с 1М рецепторами, которые широко представлены на поверхности эпителия мочевого пузыря в составе гликопротеина уроплакина 1а. Высокая степень сродства FimH УПКП к 1М определяется особенностями в структуре белковой молекулы FimH в связи с появлением точечных мутаций, получивших название патоадаптивпых. В нашей работе мы показываем, что популяционная стабильность штамма обратно пропорциональна выраженности функционального эффекта мутации, которую имеет данный штамм. Штаммы с наиболее высоким сродством к 1М имеют преимущество при колонизации мочевого пузыря в период острой инфекции, и в то же время, в долгосрочной перспективе, они не способны закрепиться ни в первичной (кишечной) нише, ни в мочевой системе. Это может быть следствием (i) повышенной чувствительности к ингибированию связывания растворенной маннозой, в изобилии имеющейся в ротовой полости и в кишечнике; (ii) недостаточной способностью удерживаться на поверхности эпителия в условиях потока жидкости; (iii) отсутствием способности к перекатыванию по поверхности эпителия, играющей важную роль для формирования бактериальной биопленки. Штаммы Е. coli с умеренно повышенным сродством к 1М циркулируют в природе в течение долгого времени, достаточного для накопления определенного количества генетических различий, и часто ассоциируются с хронической инфекцией. Однако, из результатов данной работы в том числе, видно, что, не смотря на корреляцию ИМП со штаммами Е. coli с повышенным сродством к 1М, ИМП может быть вызвана Е. coli с HimH, фенотипически идентичным таковому у комменсальных кишечных изолятов.

В свете имеющихся на сегодняшний день данных, ИМП представляется многофакторным процессом, возникновение и развитие которого зависит как от особенностей возбудителя, так и от состояния организма хозяина. И все же нельзя исключить возможности формирования вариантов Е. coli, обладающих высокой адаптацией к существованию в мочевых путях. Если допустить, что в результате патоадаптации возникнут подобные штаммы, то их можно рассматривать, как «профессиональные» патогены, а вызванную ими инфекцию, как экзогенную. Решение этого вопроса требует углубленных эпидемиологических исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бесхлебная, Виктория Александровна, Москва

1. Sokurenko, E.V., et al., Pathogenic adaptation of Escherichia coli by natural variation of the FimH adhesin. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(15): p. 8922-6.

2. Medof, M.E., et al., Identification of the complement decay-accelerating factor (DAF) on epithelium and glandular cells and in body fluids. J Exp Med, 1987. 165(3): p. 848-64.

3. Connell, 1., et al., Type 1 fimbrial expression enhances Escherichia coli virulence for the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(18): p. 982732.

4. Servin, A.L., Pathogenesis of Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli. Clin Microbiol Rev, 2005. 18(2): p. 264-92.

5. Soto, G.E. and S.J. Hultgren, Bacterial adhesins: common themes and variations in architecture and assembly. J Bacteriol, 1999. 181(4): p. 1059-71.

6. Caugant, D.A., et al., Genetic diversity and relationships among strains of Escherichia coli in the intestine and those causing urinary tract infections. Prog Allergy, 1983. 33: p. 203-27.

7. Johnson, J.R., Virulence factors in Escherichia coli urinary tract infection. Clin Microbiol Rev, 1991. 4(1): p. 80-128.

8. Marrs, C.F., et al., Variations in 10 putative uropathogen virulence genes among urinary, faecal and peri-urethral Escherichia coli. J Med Microbiol, 2002. 51(2): p. 138-42.

9. Johnson, J.R., et al., Clonal relationships and extended virulence genotypes among Escherichia coli isolates from women with a first or recurrent episode of cystitis. J Infect Dis, 2001. 183(10): p. 1508-17.

10. Johnson, J.R. and T.A. Russo, Extraintestinal pathogenic Escherichia coli: "the other badE coli". J Lab Clin Med, 2002. 139(3): p. 155-62.

11. Berglund, J. and S.D. Knight, Structural basis for bacterial adhesion in the urinary tract. Adv Exp Med Biol, 2003. 535: p. 33-52.

12. Schilling, J.D., et al., Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. J Immunol, 2001. 166(2): p. 1148-55.

13. Mulvey, M.A., Adhesion and entry of uropathogenic Escherichia coli. Cell Microbiol, 2002. 4(5): p. 257-71.

14. Xia, Y., et al., Regulatory cross-talk between adhesin operons in Escherichia coli: inhibition of type 1 fimbriae expression by the PapB protein. EMBO J, 2000. 19(7): p. 1450-7.

15. Zhou, G., et al., Uroplakin la is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci, 2001. 114(Pt 22): p. 4095-103.

16. Dodson, K.W., et al., Structural basis of the interaction of the pyelo-nephritic E. coli adhesin to its human kidney receptor. Cell, 2001. 105(6): p. 73343.

17. Leffler, H. and C. Svanborg-Eden, Chemical identification of a gly-cosfingolipid receptor for Escherichia coli attaching to human urinary tract epithelial cells and agglutinating human erythrocytes. FEMS Microbiol Lett, 1980. 8: p. 127-132.

18. Justice, S.S., et al., Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(5): p. 1333-8.

19. Mulvey, M.A., et al., Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science, 1998. 282(5393): p. 1494-7.

20. Pratt, L.A. and R. Kolter, Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol Microbiol, 1998. 30(2): p. 285-93.

21. Orndorff, P.E., et al., Immunoglobulin-mediated agglutination of and biofilm formation by Escherichia coli K-12 require the type 1 pilus fiber. Infect Immun, 2004. 72(4): p. 1929-38.

22. Nowicki, В., R. Selvarangan, and S. Nowicki, Family of Escherichia coli Dr adhesins: decay-accelerating factor receptor recognition and invasiveness. J Infect Dis, 2001. 183 Suppl 1: p. S24-7.

23. Selvarangan, R., et al., Interaction of Dr adhesin with collagen type IV is a critical step in Escherichia coli renal persistence. Infect Immun, 2004. 72(8): p. 4827-35.

24. Guyot, G., Uber die bakterielle haemagglutination. Zbl. Bakt. Abt. I. Orig., 1908.47: p. 640-653.

25. Rosenthal, L., Agglutinating properties of Escherichia coli. Agglutination of erythrocytes, leucocytes, thrombochtes, speermatozoa, spores of molds, and pollen by strains ofE. coli. J Bacteriol, 1943. 45: p. 545-550.

26. Howink, A.L., and van Iterson, W, Electron microscopical observations on bacterial cytology. II. A study on flagellation. Biochim. Biophys. Acta, 1950. 5: p. 10-44.

27. Collier, W.A., and de Miranda, J.C., Bacterien- haemagglutination. III. Die hemmung der Coli-haemagglutination durch mannose. Antonie van Leeu-wenhoek, 1955. 21: p. 133-140.

28. Brinton С. C., J., The structure, function, synthesis and genetic control of bacterial pili and a molecular model for DNA and RNA transport in gram negative bacteria. Trans N Y Acad Sci, 1965. 27(8): p. 1003-54.

29. Brinton С. C., J., Non-flagellar appendages of bacteria. Nature, 1959. 183: p. 782-786.

30. Duguid J.P., S.I.W., Dempster G., Edunds P. N., Non-flagellar filamentous appendages ("fimbriae") and haemagglutinating activity in Bacterium coli. J. Pathol. Bact., 1955. 70: p. 335-348.

31. Duguid, J.P., and Old, D.C., Introduction: A historical persperctive, in Fimbriae: Adhesion, Genetics, Biogenesis, and Vaccines, P. Klemm, Editor. 1994, CRC Press: Boca Raton, FL. p. 1-7.

32. Costerton, J.W., et al., Microbial biofdms. Annu Rev Microbiol, 1995. 49: p. 711-45.33. de Graaf F. K., M.F.R., The fimbrial adhesins of Escherichia coli. Adv. Microb. Physiol., 1986. 28: p. 65-143.

33. Jann K., J.B., Bacterial Adhesins. 1990, Berlin: Springer- Verlag.

34. Klemm, Fimbriae. Adhesion, Genetics, and Vaccines. 1994, Boca Raton, FL: CRC Press, Inc.

35. Ofek, I. and R.J. Doyle, Bacterial adhesion to Cells and Tissues. 1994, London: Chapman and Hall.

36. Lund, В., et al., The PapG protein is the a-D-galactopyranosyl-( 1-4)-B-D-galactopyranose-binding adhesin of uropathogenic Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84: p. 5898-5892.

37. Moch, Т., et al., Isolation and characterization of the a-sialyl-B-2,3-galactosyi-spesific adhesin from fimbriated Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987. 84(3462-3465).

38. Tarkkanen, A.-M., et al., Type V collagen as the target for type 3 fimbrial gene products. Infect Immun, 1992. 60: p. 1577-1581.

39. Sharon, N. and H. Lis, Lectins as cell recognition molecules. Science, 1989. 246(4927): p. 227-34.

40. Abraham, S.N., et al., Conservation of the D-mannose-adhesion protein among type 1 fimbriated members of the family Enterobacteriaceae. Nature, 1988.336(6200): p. 682-4.

41. Hanson, M.S. and C.C. Brinton, Jr., Identification and characterization of E. coli type-1 pilus tip adhesion protein. Nature, 1988. 332(6161): p. 265-8.

42. McCormick, B.A., et al., Type I pili are not necessary for colonization of the streptomycin- treated mouse large intestine by type 1-piliated Escherichia coli F-l 8 and E. coli K-12. Infect Immun, 1989. 57(10): p. 3022-9.

43. McCormick, В.A., et al., Escherichia coli F-18 phase locked 'on' for expression of type 1 fimbriae is a poor colonizer of the streptomycin-treated mouse large intestine. Microb Pathog, 1993. 14(1): p. 33-43.

44. Krogfelt, K.A., et al., Expression of Escherichia coli F-18 type 1 fimbriae in the streptomycin-treated mouse large intestine. Infect Immun, 1991. 59(4): p. 1567-8.

45. Bloch, C.A., B.A. Stocker, and P.E. Orndorff, A key role for type 1 pi-li in enterobacterial communicability. Mol Microbiol, 1992. 6(6): p. 697-701.

46. Guerina, N.G., et al., The role of pili and capsule in the pathogenesis of neonatal infection with Escherichia coli Kl. J Infect Dis, 1983. 148(3): p. 395405.

47. Langermann, S., et al., Prevention of mucosal Escherichia coli infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science, 1997. 276(5312): p. 607-11.

48. Sokurenko, E.V., et al., Diversity of the Escherichia coli type 1 fim-brial lectin. Differential binding to mannosides and uroepithelial cells. J Biol Chem, 1997. 272(28): p. 17880-6.

49. Sokurenko, E.V., et al., Functional heterogeneity of type 1 fimbriae of Escherichia coli. Infect Immun, 1992. 60(11): p. 4709-19.

50. Sokurenko, E.V., et al., Quantitative differences in adhesiveness of type 1 fimbriated Escherichia coli due to structural differences in fimH genes. J Bacteriol, 1995. 177(13): p. 3680-6.

51. Sokurenko, E.V., et al., FimH family of type 1 fimbrial adhesins: functional heterogeneity due to minor sequence variations among fimH genes. J Bacteriol, 1994. 176(3): p. 748-55.

52. Mitsui, Y., F.P. Dyer, and R. Langridge, X-ray diffraction studies of bacterial pili. J Mol Biol, 1973. 79(1): p. 57-64.

53. Bullitt, E. and L. Makowski, Structural polymorphism of bacterial adhesion pili. Nature, 1995. 373(6510): p. 164-7.

54. Klemm, P. and K.A. Krogfelt, Type 1 fimbriae of Escherichia coli, in Fimbriae: Adhesion, Genetics, Biogenesis, and Vaccines, P. Klemm, Editor. 1994, CRC Press: Boca Raton, FL. p. 9-26.

55. Hanson, M.S., J. Hempel, and C.C. Brinton, Jr., Purification of the Escherichia coli type 1 pilin and minor pilus proteins and partial characterization of the adhesin protein. J Bacteriol, 1988. 170(8): p. 3350-8.

56. Klemm, P., The fimA gene encoding the type-1 fimbrial subunit of Escherichia coli. Nucleotide sequence and primary structure of the protein. Eur J Biochem, 1984. 143(2): p. 395-9.

57. Eshdat, Y., F.J. Silverblatt, and N. Sharon, Dissociation and reassembly of Escherichia coli type 1 pill J Bacteriol, 1981. 148(1): p. 308-14.

58. Krogfelt, K.A. and P. Klemm, Investigation of minor components of Escherichia coli type 1 fimbriae: protein chemical and immunological aspects. Mi-crob Pathog, 1988. 4(3): p. 231-8.

59. Klemm, P. and G. Christiansen, Three fim genes required for the regulation of length and mediation of adhesion of Escherichia coli type 1 fimbriae. Mol Gen Genet, 1987. 208(3): p. 439-45.

60. Krogfelt, K.A., H. Bergmans, and P. Klemm, Direct evidence that the FimH protein is the mannose specific adhesin of Escherichia coli type 1 fimbriae. Infect Immun, 1990. 58: p. 1995-2000.

61. Valenski, M.L., et al., The Product of the fiml gene is necessary for Escherichia coli type 1 pilus biosynthesis. J Bacteriol, 2003. 185(16): p. 5007-11.

62. Klemm, P., Two regulatory fim genes, fimB and fimE, control the phase variation of type 1 fimbriae in Escherichia coli. Embo J, 1986. 5(6): p. 138993.

63. Dorman, C.J. and C.F. Higgins, Fimbrial phase variation in Escherichia coli: dependence on integration host factor and homologies with other site-specific recombinases. J Bacteriol, 1987. 169(8): p. 3840-3.

64. Abraham, S.N., et al., Identification of two ancillary subunits of Escherichia coli type 1 fimbriae by using antibodies against synthetic oligopeptides of fim gene products. J Bacteriol, 1987. 169(12): p. 5530-6.

65. Orndorff, P.E. and S. Falkow, Identification and characterization of a gene product that regulates type 1 piliation in Escherichia coli. J Bacteriol, 1984. 160(1): p. 61-6.

66. Orndorff, P.E. and S. Falkow, Organization and expression of genes responsible for type 1 piliation in Escherichia coli. J Bacteriol, 1984. 159(2): p. 736-44.

67. Klemm, P., et al., The fim genes responsible for synthesis of type 1 fimbriae in Escherichia coli, cloning and genetic organization. Mol Gen Genet, 1985. 199(3): p. 410-4.

68. Krallmann-Wenzel, U., et al., Chromosomal mapping of genes encoding mannose-sensitive (type I) and mannose-resistant F8 (P) fimbriae of Escherichia coli 018:K5:H5. FEMS Microbiol Lett, 1989. 49(2-3): p. 315-21.

69. Blattner, F.R., et al., The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science, 1997. 277(5331): p. 1453-74.

70. Maurer, L. and P.E. Orndorff, A new locus, pilE, required for the binding of type 1 piliated Escherichia coli to erythrocytes. FEMS Microbiol Lett, 1985. 30: p. 59-66.

71. Minion, F.C., et al., The genetic determinant of adhesive function in type 1 fimbriae of Escherichia coli is distinct from the gene encoding the fimbrial subunit. J Bacteriol, 1986. 165(3): p. 1033-6.

72. Maurer, L. and P.E. Orndorff, Identification and characterization of genes determining receptor binding and pilus length of Escherichia coli type 1 pili. J Bacteriol, 1987. 169(2): p. 640-5.

73. Ofek, I. and N. Sharon, Lectinophagocytosis: a molecular mechanism of recognition between cell surface sugars and lectins in the phagocytosis of bacteria. Infect Immun, 1988. 56(3): p. 539-47.

74. May, A.K., et al., Enhanced virulence of Escherichia coli bearing a site-targeted mutation in the major structural subunit of type 1 fimbriae. Infect Immun, 1993. 61(5): p. 1667-73.

75. Abraham, S.N., et al., Protection against Escherichia coli-induced urinary tract infections with hybridoma antibodies directed against type 1 fimbriae or complementary D-mannose receptors. Infect Immun, 1985. 48(3): p. 625-8.

76. McClain, M.S., I.C. Blomfield, and B.I. Eisenstein, Roles of fimB and fimE in site-specific DNA inversion associated with phase variation of type 1 fimbriae in Escherichia coli. J Bacteriol, 1991. 173(17): p. 5308-14.

77. Gaily, D.L., J. Leathart, and I.C. Blomfield, Interaction of FimB and FimE with the fim switch that controls the phase variation of type 1 fimbriae in Escherichia coli K-12. Mol Microbiol, 1996. 21(4): p. 725-38.

78. Eisenstein, B.I., et al., Integration host factor is required for the DNA inversion that controls phase variation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A, 1987. 84(18): p. 6506-10.

79. Blomfield, I.C., M.S. McClain, and B.I. Eisenstein, Type 1 fimbriae mutants of Escherichia coli К12: characterization of recognized afimbriate strains and construction of new fim deletion mutants. Mol Microbiol, 1991. 5(6): p. 143945.

80. Blomfield, I.C., et al., Lrp stimulates phase variation of type 1 fimbri-ation in Escherichia coli K-12. J Bacteriol, 1993. 175(1): p. 27-36.

81. Gaily, D.L., T.J. Rucker, and I.C. Blomfield, The leucine-responsive regulatory protein binds to the fim switch to control phase variation of type 1 fim-brial expression in Escherichia coli K-12. J Bacteriol, 1994. 176(18): p. 5665-72.

82. Kawula, Т.Н. and P.E. Orndorff, Rapid site-specific DNA inversion in Escherichia coli mutants lacking the histonelike protein H-NS. J Bacteriol, 1991. 173(13): p. 4116-23.

83. Olsen, P.B. and P. Klemm, Localization of promoters in the fim gene cluster and the effect of H- NS on the transcription of fimB and fimE. FEMS Microbiol Lett, 1994. 116(1): p. 95-100.

84. Leathart, J.B. and D.L. Gaily, Regulation of type 1 fimbrial expression in uropathogenic Escherichia coli: heterogeneity of expression through sequence changes in the fim switch region. Mol Microbiol, 1998. 28(2): p. 371-81.

85. Hacker, J., et al., Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution. Mol Microbiol, 1997. 23(6): p. 108997.

86. Newman, J.V., et al., Stimulation of Escherichia coli F-I8C0I- type-1 fimbriae synthesis by leuX. FEMS Microbiol Lett, 1994. 122(3): p. 281-7.

87. Ritter, A., et al., The Pai-associated leuX specific tRNA5(Leu) affects type 1 fimbriation in pathogenic Escherichia coli by control of FimB recombinase expression. Mol Microbiol, 1997. 25(5): p. 871-82.

88. Schwan, W.R., et al., Osmolarity and pH growth conditions regulate fim gene transcription and type 1 pilus expression in uropathogenic Escherichia coli. Infect Immun, 2002. 70(3): p. 1391-402.

89. Lowe, M.A., S.C. Holt, and B.I. Eisenstein, Immunoelectron microscopic analysis of elongation of type 1 fimbriae in Escherichia coli. J Bacteriol, 1987. 169(1): p. 157-63.

90. Jacob-Dubuisson, F., et al., Initiation of assembly and association of the structural elements of a bacterial pilus depend on two specialized tip proteins. Embo J, 1993. 12(3): p. 837-47.

91. Jones, C.H., et al., FimH adhesin of type 1 pili is assembled into a fibrillar tip structure in the Enterobacteriaceae. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(6): p. 2081-5.

92. Jones, C.H., et al., The chaperone-assisted membrane release and folding pathway is sensed by two signal transduction systems. EMBO J, 1997. 16(21): p. 6394-406.

93. Lindberg, F., et al., PapD, a periplasmic transport protein in P-pilus biogenesis. J Bacteriol, 1989. 171(11): p. 6052-8.

94. Choudhury, D., et al., X-ray structure of the FimC-FimH chaperone-adhesin complex from uropathogenic Escherichia coli. Science, 1999. 285(5430): p. 1061-6.

95. Sauer, F.G., et al., Structural basis of chaperone function and pilus biogenesis. Science, 1999. 285(5430): p. 1058-61.

96. Saulino, E.T., et al., Ramifications of kinetic partitioning on usher-mediated pilus biogenesis. EMBO J, 1998.17(8): p. 2177-85.

97. Saulino, E.T., E. Bullitt, and S.J. Hultgren, Snapshots of usher-mediated protein secretion and ordered pilus assembly. Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(16): p. 9240-5.

98. Ofek, I., D. Mirelman, and N. Sharon, Adherence of Escherichia coli to human mucosal cells mediated by mannose receptors. Nature, 1977. 265(5595): p. 623-5.

99. Ofek, I. and E.H. Beachey, Mannose binding and epithelial cell adherence of Escherichia coli. Infect Immun, 1978. 22(1): p. 247-54.

100. Firon, N., et al., Aromatic alpha-glycosides of mannose are powerful inhibitors of the adherence of type 1 fimbriated Escherichia coli to yeast and intestinal epithelial cells. Infect Immun, 1987. 55(2): p. 472-6.

101. Firon, N., I. Ofek, and N. Sharon, Carbohydrate specificity of the surface lectins of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Salmonella typhimu-rium. Carbohydr Res, 1983. 120: p. 235-49.

102. Firon, N., I. Ofek, and N. Sharon, Carbohydrate-binding sites of the mannose-specific fimbrial lectins of enterobacteria. Infect Immun, 1984. 43(3): p. 1088-90.

103. Ofek, I. and N. Sharon, Mannose specific bacterial surface lectins, in Microbial Lectins and Agglutinins. Properties and Biological Activity, D. Mirel-man, Editor. 1986, John Wiley & Sons: New York. p. 55-81.

104. Neeser, J.R., B. Koellreutter, and P. Wuersch, Oligomannoside-type glycopeptides inhibiting adhesion of Escherichia coli strains mediated by type 1 pili: preparation of potent inhibitors from plant glycoproteins. Infect Immun, 1986. 52(2): p. 428-36.

105. Schaeffer, A.J., S.K. Amundsen, and L.N. Schmidt, Adherence of Escherichia coli to human mucosal cells mediated by mannose receptors. Nature, 1979. 265: p. 623-629.

106. Fujita, K., et al., In vitro adherence of type 1-fimbriated uropathogenic E. coli to human ureteral mucosa. Infect Immun, 1989. 57: p. 2574-2578.

107. Bouckaert, J., et al., Receptor binding studies disclose a novel class of high-affinity inhibitors of the Escherichia coli FimH adhesin. Mol Microbiol, 2005. 55(2): p. 441-55.

108. Hung, C.S., et al., Structural basis of tropism of Escherichia coli to the bladder during urinary tract infection. Mol Microbiol, 2002. 44(4): p. 903-15.

109. Sperling, O., A. Fuchs, and Т.К. Lindhorst, Evaluation of the carbohydrate recognition domain of the bacterial adhesin FimH: Design, synthesis and binding properties of mannoside ligands. Org Biomol Chem, 2006. 4(21): p. 391322.

110. Xie, В., et al., Distinct glycan structures of uroplakins la and lb: structural basis for the selective binding of FimH adhesin to uroplakin la. J Biol Chem, 2006. 281(21): p. 14644-53.

111. Wu, X.R., T.T. Sun, and J.J. Medina, In vitro binding of type 1-fimbriated Escherichia coli to uroplakins la and lb: relation to urinary tract infections. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(18): p. 9630-5.

112. Fontan, E., et al., Purification of a 92 kDa human immunostimulating glycoprotein obtained from the Tamm-Horsfall glycoprotein. J Immunol Methods, 1995. 187(1): p. 81-4.

113. Dulawa, J., et al., Tamm Horsfall glycoprotein interferes with bacterial adherence to human kidney cells. Eur J Clin Invest, 1988. 18(1): p. 87-91.

114. Hasty, D.L., et al., Interaction between fibronectin and bacteria, in Fibronectin in health and desease, S. Carsons, Editor. 1990, CRC press: Boca Raton, FL. p. 89-110.

115. Fu, D., L. Chen, and R.A. O'Neill, A detailed structural characterization of ribonuclease В oligosaccharides by 1H NMR spectroscopy and mass spectrometry. Carbohydr Res, 1994. 261(2): p. 173-86.

116. Wu, X.R., et al., Mammalian uroplakins. A group of highly conserved urothelial differentiation-related membrane proteins. J Biol Chem, 1994. 269(18): p. 13716-24.

117. Schembri, M.A., et al., Linker insertion analysis of the FimH adhesin of type 1 fimbriae in an Escherichia coli fimH-null background. FEMS Microbiol Lett, 1996. 137(2-3): p. 257-63.

118. Bloch, C.A. and P.E. Orndorff, Impaired colonization by and full invasiveness of Escherichia coli K1 bearing a site-directed mutation in the type 1 pi-lin gene. Infect Immun, 1990. 58(1): p. 275-8.

119. Hedrick, P.W., Genetic polymorphism in heterogeheous environments a decade later. Annu. Rev. Ecol. Syst., 1986. 17: p. 535-566.

120. Boyd, E.F. and D.L. Hartl, Diversifying selection governs sequence polymorphism in the major adhesin proteins fimA, papA, and sfaA of Escherichia coli. J Mol Evol, 1998. 47(3): p. 258-67.

121. Zhu, P., et al., Fit genotypes and escape variants of subgroup III Neisseria meningitidis during three pandemics of epidemic meningitis. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(9): p. 5234-9.

122. Peek, A.S., et al., The interaction of protein structure, selection, and recombination on the evolution of the type-1 fimbrial major subunit (fimA) from Escherichia coli. J Mol Evol, 2001. 52(2): p. 193-204.

123. Boyd, E.F. and M.K. Waldor, Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio chole-rae non-Ol/non-0139 serogroup isolates. Microbiology, 2002. 148(Pt 6): p. 165566.

124. Sokurenko, E.V., D.L. Ilasty, and D.E. Dykhuizen, Pathoadaptive mutations: gene loss and variation in bacterial pathogens. Trends Microbiol, 1999. 7(5): p. 191-5.

125. Covacci, A., et al., Did the inheritance of a pathogenicity island modify the virulence of Helicobacter pylori? Trends Microbiol, 1997. 5(5): p. 205-8.

126. Salyers, A.A. and D.D. Whitt, Bacterial pathogenesis. A molecular approach. 1994, Washington DC: ASM Press.

127. Kimura, M., The neutral theory of molecular evolution. 1983, Cambridge, United Kingdom: Cambridge University Press.

128. Thomas, W.E., et al., Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell, 2002. 109(7): p. 913-23.

129. Nilsson, L.M., et al., Elevated shear stress protects Escherichia coli cells adhering to surfaces via catch bonds from detachment by soluble inhibitors. Appl Environ Microbiol, 2006. 72(4): p. 3005-10.

130. Mobley, H.L., et al., Isogenic P-fimbrial deletion mutants of pyelo-nephritogenic Escherichia coli: the role of alpha Gal(l-4) beta Gal binding in virulence of a wild-type strain. Mol Microbiol, 1993. 10(1): p. 143-55.

131. Tenover, F.C., et al., Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 1995. 33(9): p. 2233-9.

132. Weissman, S.J., et al., Clonal analysis reveals high rate of structural mutations in fimbrial adhesins of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Mol Microbiol, 2006. 59(3): p. 975-88.

133. Wirth, Т., et al., Sex and virulence in Escherichia coli: an evolutionary perspective. Mol Microbiol, 2006. 60(5): p. 1136-51.

134. Barnhart, M.M., et al., Chaperone-subunit-usher interactions required for donor strand exchange during bacterial pilus assembly. J Bacteriol, 2003. 185(9): p. 2723-30.