Разработка биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов для определения экотоксикантов в проточных водных системах

Холстов, Александр Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов для определения экотоксикантов в проточных водных системах
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов для определения экотоксикантов в проточных водных системах"

На правах рукописи

(у^о.ц

Холстов Александр Викторович

РАЗРАБОТКА БИОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ВИДЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКОТОКСИКАНТОВ В ПРОТОЧНЫХ водных СИСТЕМАХ

03.01.02 - биофизика 03.01.06 - биотехнология (в том числе, бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ЯНВ 2013

Москва-2012

005048458

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануля Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ефременко Елена Николаевна,

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Твердислов Всеволод Александрович,

Заведующий кафедрой биофизики Физического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова

доктор биологических наук, профессор Яненко Александр Степанович, заместитель директора ГНЦ РФ ФГУП "ГосНИИгенетика"

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н. Н. Семенова Российской академии наук

Защита состоится «30» января 2013 года в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 по химическим и биологическим наукам при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануля Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. И. И. Семенова Российской академии наук

Автореферат разослан » декабря 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 002.039.01, к.х.н.

Мазалецкая Л. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие промышленного производства усиливает воздействие на окружающую среду, и это, в первую очередь, отражается на состоянии водоемов и почв. Одновременно с интенсификацией того или иного производства увеличиваются и объёмы жидких промышленных и бытовых отходов. Хорошо известно экотоксичное воздействие хлор- и фосфорорганических пестицидов, нефтепродуктов, производных тяжелых металлов на природные биологические объекты. Разработка эффективных методов анализа состояния объектов окружающей среды, включая проведение постоянного мониторинга качества воды и состояния почв, становится особенно актуальной.

Получение информации о наличии экотоксикантов в режиме реального времени прежде всего в воде позволяет своевременно выявлять загрязнения и принимать меры по их ликвидации. В этой связи разработка подходов к созданию технологий экспресс-определения токсичности водных образцов в проточных аналитических системах является особенно актуальной. Также важной является возможность проведения экомониторинга состояния почв без проведения сложной пробоподготовки.

В настоящее время для проведения анализа состава природных сред на наличие экотоксикантов используются разнообразные физико-химические и биологические методы. Первая группа методов дает оценку концентрации загрязнителей с высокой точностью и чувствительностью, однако вследствие проведения многоэтапной пробоподготовки и применения специального оборудования получение информации о наличии токсичных веществ в режиме реального времени с помощью данных методов является проблематичным. Устранение указанных недостатков представляется возможным при использовании биологических методов индикации экотоксикантов, основанных на применении биоиндикаторов (БИ) — живых организмов, способных давать специфический ответ на присутствие в среде экотоксикантов. Значительным преимуществом БИ является их способность реагировать на широкий спектр экотоксикантов различных классов, в то время, как физико-химические методы анализа узкоспецифичны, и при наличии сложной анализируемой матрицы требуется применение более чем одной методики анализа.

Среди широкого спектра БИ эффективными для использования признаны клетки микроорганизмов - микроводорослей и фотобактерий. В основе функционирования данных БИ лежат изменения параметров флуоресценции хлорофилла (для клеток микроводорослей) или параметров биолюминесценции бактериальной люциферазной системы (для клеток

фотобактерий) в результате воздействия экотоксикантов на клетки микроорганизмов.

Стабилизация характеристик клеток микроорганизмов при их применении в аналитических целях с обеспечением их удержания и эффективным функционированием в течение длительного времени в проточных системах достигается иммобилизацией клеток БИ с использованием разнообразных носителей.

Вместе с тем, пока нет четких критериев выбора характеристик и состава носителя для иммобилизации биоиндикаторов, метода и условий иммобилизации клеток, включая подготовку клеток к иммобилизации -накопление биомассы, подлежащей иммобилизации, в которой максимально сохранена целостность и метаболическая активность клеток.

Разработка новых биочувствительных элементов (БЭ) в виде иммобилизованных клеток микроводорослей или фотобактерий, подбор носителей для иммобилизации с целью достижения высокой эффективности функционирования клеток микроорганизмов, особенно в проточной среде, являются актуальными как для биотехнологии получения таких БЭ, так и для экологической биофизики, устанавливающей общие закономерности влияния физико-химических условий проведения анализа на аналитические и кинетические характеристики иммобилизованных клеток при определении экотоксикантов. Кроме того, разработка новых БЭ необходима для того, чтобы заполнить ниши фундаментальных знаний о свойствах иммобилизованных клеток, а также получить представление о возможности оптимизации условий получения такого рода систем, позволяющих повысить их чувствительность (порог определения) по отношению к соответствующим загрязнителям.

Основной целью данной работы являлась разработка биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроводорослей (MB) и фотобактерий, позволяющих определять в проточных системах присутствие экотоксикантов в концентрациях ниже предельно допустимых (ПДК), и исследование операционных характеристик БЭ при их использовании в различных условиях. В работе решались следующие основные задачи: - разработка биотехнологических подходов к получению БЭ в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта (ПВС) клеток микроорганизмов на основе клеток микроводорослей Chlorella species, Thalassiosira weissßogii, а также фотобактерий Photobacterium phosphoreunr,

- исследование биофизических параметров и операционных характеристик БЭ в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов (интенсивность и стабильность аналитического сигнала иммобилизованных клеток при хранения и мониторинге экотоксикантов; температурные диапазоны применения иммобилизованных клеток);

- оценка кинетических параметров взаимодействия клеток микроорганизмов с экотоксикантами и нижних пределов обнаружения экотоксикантов, обоснование возможности повышения чувствительности БЭ для детекции соответствующих загрязнителей.

Научная новизна работы.

На основе применения методов кибернетики предложено для описания биохимической реакции взаимодействия клеток фотобактерий с экотоксикантами использовать модель изотермического реактора идеального вытеснения. Получено кинетическое уравнение изменения концентрации активных клеток фотобактерий в ячейке в ходе биохимической реакции с экотоксикантом.

Впервые установлено удельное количество активных молей различных классов экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции клетки фотобактерий. Показано, что повышение чувствительности клеток фотобактерий к экотоксикантам достигается уменьшением удельного количества активных молей экотоксикантов.

В биофизических исследованиях клеток фотобактерий родов Photobacterium и Vibrio, иммобилизованных в криогель ПВС впервые обнаружено явление смещения в сторону более коротких длин волн пика интенсивности биолюминесценции клеток фотобактерий.

Установлено, что иммобилизация малых концентраций (до 10%) клеток микроводорослей Chlorella sp. и Т. weissflogii в криогель ПВС путем включения клеток в матрицы носителя при ее формировании в условиях отрицательных температур приводит к повреждению фотосинтетического аппарата (ФСА) клеток микроводорослей.

Предложен новый метод иммобилизации клеток микроводорослей Chlorella sp. и Thalassiosira weissflogii введением клеток микроорганизмов в сформированную матрицу носителя, позволяющий избежать повреждения ФСА клеток микроводорослей, наблюдаемого при формировании матрицы носителя в условиях отрицательных температур.

Практическая значимость работы.

Впервые для достижения наилучших условий формирования БЭ обоснованы биотехнологические параметры получения БЭ на основе клеток фотобактерий и микроводорослей, иммобилизованных в криогель ПВС, для определения присутствия экотоксикантов в природных средах.

Предложен новый метод иммобилизации клеток микроводорослей, введением клеток микроорганизмов в сформированную матрицу носителя - криогель ПВС, под действием центробежных сил при центрифугировании.

Предложены конкретные составы БЭ на основе клеток микроорганизмов (микроводорослей Chlorella sp. и Т. weissflogii и фотобактерий Р. phosphoreum) для определения в природных средах присутствия экотоксикантов в концентрациях ниже ПДК.

Обоснованы оптимальные условия хранения БЭ, позволяющие стабилизировать высокий уровень аналитического сигнала иммобилизованных клеток:

- хранение БЭ на основе клеток фотобактерий свыше 50 недель при температуре -80°С не приводит к значительной потере аналитических характеристик;

- хранение БЭ на основе клеток микроводорослей свыше 30 суток в оптимизированных условиях освещения (интенсивность и соотношения длительности фаз «свет : темнота») не приводит к значительному снижению величины аналитического сигнала.

Обоснованы оптимальные условия функционирования разработанных БЭ при определении присутствия экотоксикантов (температурные режимы, скорости протока среды, для клеток микроводорослей - режимы внешнего освещения).

Личный вклад автора. В ходе исследования автором лично производилось планирование экспериментов, статистическая обработка экспериментальных данных, оформление результатов работы, а также подготовка научных публикаций по результатам работы и участие с докладами на научных конференциях.

Автором самостоятельно разработан подход к моделированию биохимической реакции взаимодействия иммобилизованных клеток фотобактерий с экотоксикантами в ячейке и предложена математическая модель, описывающая данный процесс в условиях проточной водной среды.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийских и Международных конференциях: II и III Международных конференциях «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, Россия, 2008, 2009); VIII, XIX, X, XI ежегодных международных молодежных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, Россия, 2008, 2009, 2010, 2011); Итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2008 и 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы»

ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 - 2012 годы», (Москва, Россия, 2008, 2009); Международных конференциях «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, Украина, 2009, 2011); Международной конференции «Biocatalysis-2009: Fundamentals & applications» (Архангельск, Россия, 2009); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, Россия, 2009); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, Россия, 2010); 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, Россия, 2010); Международной научно-практической конференции «Юность за экологический прогресс» (Баку, Азербайджан, 2010); Ш-й Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи — путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, Россия, 2011).

Положения, выносимые на защиту.

1. Биочувствительные элементы в виде иммобилизованных клеток фотобактерий или MB для определения различных классов экотоксикантов в водных проточных средах. Способы получения и составы БЭ.

2. Кинетические и операционные характеристики взаимодействия БЭ с экотоксикантами.

3. Математическая модель, описывающая биохимическую реакцию иммобилизованных клеток фотобактерий с экотоксикантами в ячейке в условиях проточной водной среды.

Публикации. По материалам диссертации представлено 20 публикаций, из них: 2 статьи в международных журналах, входящих в списки цитирования ВАК, 2 Патента РФ на изобретение, 16 тезисов докладов в материалах Международных и Всероссийских конференций, симпозиумов и конгрессов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 177 ссылок. Работа изложена на 153 страницах, содержит 41 рисунок и 39 таблиц.

Автор выражает благодарность соавторам совместных публикаций, директору ИБХФ РАН им. Н. М. Эмануэля Варфоломееву С. Д., научному руководителю Ефременко Е. Н. и отдельно профессорам Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова Исмаилову А. Д. (Кафедра микробиологии), Рубину А. Б. и Погосяну С. И. (Кафедра биофизики) за

содействие в разработке БЭ на основе клеток фотобактерий и микроводорослей, соответственно.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть

Объекты исследования. Для создания БЭ присутствия экотоксикантов в природных средах в работе использовались штаммы пресноводных микроводорослей Chlorella species и морских микроводорослей Thalassiosira weissflogii, а также штаммы фотобактерий Photobacterium phosphoreum и Vibrio harveyi, полученные из Коллекции микроорганизмов МГУ (Россия) и American Type Culture Collection (США).

Методы исследования. Культивирование свободных клеток микроорганизмов проводилось в качалочных колбах объемом 750 мл при температуре 12°С для клеток фотобактерий и 21°С для микроводорослей в жидкой питательной среде. Для клеток микроводорослей Т. weissflogii использовалась питательная среда ill medium, для клеток Chlorella sp. -питательная среда Прата, для клеток фотобактерий - питательная среда Фаргали с добавлением дрожжевого экстракта и пептона. Культуры клеток микроводорослей выращивались в условиях искусственного освещения.

Накопление биомассы определялось по изменению оптической плотности суспензии клеток. Жизнеспособность иммобилизованных клеток контролировалась по концентрации внутриклеточного АТФ люциферин-люциферазным методом с использованием реагента фирмы Люмтек (Россия) и люминометра Microluminometr 3560 (New Horizons Diagnostics Co, США).

Раствор ПВС (марка 16/1, SinopecCorp., Китай) в заданной концентрации (7 - 15%) готовился путем смешения навески полимера с питательной средой, соответствующей определенной культуре микроорганизмов, стерилизовался (0,5 ати., 108°С, 30 мин), затем охлаждался до комнатной температуры. Нужное количество биомассы клеток смешивалось с раствором ПВС до получения однородной массы.

Полученной смесью при помощи стерильного шприца заполнялись ячейки 96-луночных планшетов, которые выдерживались в морозильных камерах при различных температурах (-80°С ^ -10°С) для формирования гранул криогеля ПВС. После выдерживания БЭ в морозильной камере в течение 12-24 ч его помещали в холодильник для размораживания при 4 -8°С. Через 12-20 ч (для каждой индивидуальной культуры) получался полностью сформированный образец иммобилизованных в криогель ПВС клеток.

Все полученные образцы БЭ хранились в минимальной питательной среде, соответствующей микроорганизмам, использованным для получения БЭ.

Биолюминесценция свободных и иммобилизованных клеток фотобактерий анализировалась на люминометре 1250 LKB-Wallac (Швеция) с оценкой относительной интенсивности биолюминесценции (в процентах от величины исходного сигнала) и спектрофлуориметре Vanan Сагу Eclipse (США). Биолюминесцентная активность клеток определялась в 1 мл 2% NaCl или непрерывном потоке того же раствора через ячейку прибора после 1-2 мин термостатирования.

Для определения флуоресцентных характеристик хлорофилла ФСА клеток MB полученные гранулы с иммобилизованными клетками MB помещались в виалу и заливались соответствующей питательной средой до объема 3 мл. В виалах проводились измерения значения Fv / Fm. Для измерения флуоресценции хлорофилла использовался прибор (типа флуориметра РАМ-2000, Германия), разработанный на Кафедре биофизики Биологического факультета МГУ. Нормальными значениями относительной переменной флуоресценции Fv / Fm для клеток Chlorella sp. и Т. weissflogii являлись 0,70-0,75 и 0,60±0,65 ед. соответственно.

Для дискретного анализа водного раствора экотоксиканта одна гранула с иммобилизованными клетками микроорганизмов помещалась в кювету прибора и к грануле добавлялось 900 мкл среды (2% NaCl для морских микроорганизмов и 0,5% NaCl для пресноводных). После 1-2 минут термостатирования перед проведением анализа экотоксиканта снимались показания аналитического сигнала (10). Затем в среду вносилась анализируемая проба в объеме 100 мкл. После экспонирования пробы в течение 30 минут снова регистрировалась величина аналитического сигнала (I). На основе полученных данных для клеток фотобактерий рассчитывалась относительная остаточная интенсивность биолюминесценции:

Ioct (%) =I/I„-100%

Для непрерывного мониторинга экотоксикантов аналитическая ячейка приборов заменялась специально сконструированной камерой с проточной кюветой. Аппаратурное обеспечение включало также систему протока среды (термостат, перистальтический насос). Скорость протока среды: 0,5 - 6,0 мл/мин, объем реактора— 1,5 мл.

В качестве модельного образца почвы использовалась смесь, состоящая из стерильного чернозема и песка в массовом соотношении 1:1. Для создания образца загрязненной почвы к почве добавляли раствор экотоксиканта известной концентрации из расчета 1 мл раствора на 1 г

почвы и оставляли полученную смесь до полного высыхания почвы. Концентрация экотоксиканта рассчитывалась с учетом изменения массы почвы при высушивании. Экстракция экотоксиканта из почвы проводилась в растворе 2% NaCl + 3% этилового спирта из расчета 15 мл экстрагента на 1,0 г почвы при температуре 22±1°С в течение 30 минут на шейкере-инкубаторе при скорости 120 об/мин.

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывалось среднее значение и значение стандартного отклонения не менее чем для трех измерений.

Результаты и обсуждение

1. Разработка и исследование операционных свойств образцов биочувствительных элементов в виде клеток микроводорослей, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта

В ходе разработки БЭ на основе клеток MB было установлено, что в результате иммобилизации клеток MB в криогель ПВС через процедуру «замораживания-оттаивания» суспензии клеток в растворе ПВС происходят необратимые повреждения ФСА клеток микроводорослей, что выражается в снижении величины относительной переменной флуоресценции Fv / Fm в 3,7 раза и более относительно величины, характерной для исходной суспензии клеток MB.

В связи с этим, введение клеток микроводорослей в криогель ПВС осуществлялось разработанным оригинальным способом, который заключается в нанесении клеточной суспензии на поверхность сформированного носителя (криогеля ПВС) с последующим принудительным введением клеток в макропоры полимерного носителя в центрифуге под действием центробежных сил (5000-14000g) в течение 1-10 мин. Использование данного способа позволило оптимизировать процесс приготовления высокоэффективного БЭ в виде иммобилизованных клеток MB (таблица 1).

Установлено, что максимальное значение параметра Fv/Fm -аналитического сигнала клеток MB, достигается при получении БЭ на основе иммобилизованных клеток микроводорослей с применением 11% криогеля ПВС - для иммобилизации клеток пресноводных зеленых микроводорослей Chlorella sp. и 9% криогеля ПВС - для иммобилизации клеток морских диатомовых микроводорослей Т. weissflogii. Вводимые концентрации биомассы клеток MB составляют 1% для клеток Chlorella sp. и 0,03% для клеток Т. weissflogii, соответственно.

Таблица 1 - Характеристики образцов БЭ, полученных при иммобилизации клеток микроводорослей Chlorella sp. и Т. weissflogii

методом принудительного введения клеток в поры криогеля ПВС, содержащие разные концентрации полимера._

Концентрация ПВС, % F0 Fv/Fm [АТФ], моль/г образца БЭ

Chlorella sp.

1 0,86 0,56 (8±0,4)х10""

9 1,12 0,62 (13±5,0)х10"п

11 1,85 0,71 (20±4,0)хЮ"и

13 1,32 0,57 (15±0,7)х10"

Т. weissflogii

1 1,16 0,57 (9,8±0,6)х10"у

9 1,78 0,63 (14±3)х10"у

11 1,02 0,60 (8,2±0,7)х Ю"9

13 0,72 0,48 (6,5±0,4)хЮ"у

При исследовании зависимости величины относительной переменной флуоресценции (Ру/Рп|) от режима освещения клеток МВ установлено (рисунок 1), что допустимыми режимами освещения для сохранения исходного уровня флуоресценции иммобилизованных клеток обоих видов МВ в составе БЭ являются циклы "свет : темнота" с соотношением длительности фаз от 4 : 20 до 16:8 часов.

0,80,70,60,5

^ 0,3 0,2 0,10,0

Т. weissflogii

Chlorella sp.

Режим освещения Соотношение длительности фаз «свет: темнота», ч

1 4:20

2 8 : 16

3 12 : 12

4 16 : 8

5 20 :4

6 24 :0

Режим освещения

Рисунок 1 — Зависимость величины относительной переменной флуоресценции иммобилизованных клеток МВ от режима их освещения при разной длительности фаз «свет : темнота». Исследования проводились

при экспонировании БЭ в среде 0,5% NaCl (Chlorella sp.) или 2% NaCl (Г. weissflogii) при температуре 16°С и интенсивности освещения 20 Вт/м2.

Отклонение от допустимых режимов освещения с увеличением продолжительности световой фазы приводило к быстрому падению значений относительной переменной флуоресценции в 1,5-3,0 раза. Эти данные показали возможность использования полученных БЭ в целях экомониторинга in situ в течение длительного времени в природных условиях с естественным циклом солнечного освещения.

При этом установлено, что интенсивность освещения для сохранения флуоресцентных характеристик иммобилизованных клеток микроводорослей не должна превышать 30 Вт/м2 для клеток Chlorella sp. и 10 Вт/м2 - для Т. weissflogii (рисунок 2).

Рисунок 2 - Зависимость величины относительной переменной флуоресценции иммобилизованных клеток MB от интенсивности внешнего освещения при цикле освещения «12 : 12» (температура 16°С, среда - 0,5% NaCl для клеток Chlorella sp. и 2% NaCl для клеток Т. weissflogii).

Показано, что в условиях проточной системы разработанные БЭ на основе клеток MB могут сохранять свои параметры флуоресценции в течение, как минимум, 10 суток на исходном уровне в отсутствии экотоксикантов и скорости протока не выше 360 мл/ч.

Для разработанных образцов БЭ в виде иммобилизованных клеток MB были установлены нижние пределы обнаружения двух классов различных экотоксикантов: ионов тяжелых металлов и азотсодержащих гербицидов, широко применяемых в сельском хозяйстве в условиях дискретного анализа. Временной интервал взаимодействия БЭ с каждым исследованным экотоксикантом для расчета относительной переменной флуоресценции составлял 30 минут (общепринятый стандарт проведения анализа экотоксикантов с применением клеток микроорганизмов в

0,8-,

0,0-1-.-,-.-,-.-,-.-,-.-,-■

0 20 40 60 80 100

Интенсивность внешнего освещения, Вт/м2

дискретном анализе). Иммобилизованные клетки MB позволяли определить присутствие экотоксикантов в довольно широких интервалах концентраций. Так, для большинства исследованных соединений (как при определении гербицидов, так и при определении ионов тяжелых металлов) в условиях дискретного анализа диапазон определяемых концентраций составил 1 х 10"5 ^ 1 * 10"2 г/л.

В водной среде с помощью разработанных образцов БЭ также были установлены также нижние пределы обнаружения ионов тяжелых металлов и гербицидов при анализе в проточной аналитической системе в условиях постоянной концентрации экотоксиканта (таблица 2).

Таблица 2 — Нижние пределы обнаружения экотоксикантов при использовании БЭ в виде иммобилизованных клеток MB в проточной системе. Анализ проводился в водном солевом растворе (Т. weissflogii - в 2% NaCl, Chlorella sp. - в 0,5% NaCl) при температуре

Экотокси -кант Нижний передел обнаружения, г/л ПДК, г/л

БЭ на основе клеток Chlorella sp. БЭ на основе клеток Т. weissflogii

Zn2+ (6,5±0,2)х Ю"5 (5,2±0,3)х Ю"6 5,0хЮ"5

Hg2+ (1,4±0,1)хЮ5 (1,0±0,1)хЮ"5 3,4x10"5

Cu2+ (6,4±0,1)хЮб (1,3±0,1)х10-5 1,9х 10"3

атразин (6,5±0,2)хЮ-5 (1,3±0,1)хЮ"5 1,0x1 о-4

диурон (7,0±0,3)х 10~б (7,0±0,3)х Ю"6 1,0x10"3

паракват (7,7±0,4)хЮ-5 (7,7±0,2)хЮ_б 1,0x10"4

Результаты показали, что предложенные БЭ позволяют также определять присутствие ионов тяжёлых металлов и гербицидов в весьма широком диапазоне концентраций в условиях протока. Для большинства исследованных соединений этот диапазон составил 1x10"6 ^ 1хЮ"3 г/л, причем предел обнаружения оказался в большинстве случаев на 1,0 - 2,5 порядка ниже величины ПДК, известной для данных соединений. Таким образом, разработанные БЭ на основе клеток МВ полностью отвечали целям данной работы.

Следует отметить, что с помощью полученных для БЭ характеристик линейных зависимостей «концентрация экотоксиканта - аналитический сигнал» может быть определена концентрация того или иного

экотоксиканта в водной среде, если известно, что в ней присутствует один вид загрязнителя, влияющего на уровень флуоресценции клеток МВ.

2. Разработка и исследование операционных свойств образцов биочувствительных элементов в виде клеток фотобактерий, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта

Были получены образцы БЭ в виде гранул с иммобилизованными клетками фотобактерий с различным содержанием влажной биомассы клеток (в интервале 0,01-10%) в составе носителя (средняя масса гранулы 0,30±0,001 г, концентрация раствора ПВС, взятого для приготовления гранул - 13%). Величина концентрации внутриклеточного АТФ в клетках фотобактерий свидетельствует о высоком уровне жизнеспособности клеток в образцах гранул криогеля ПВС с содержанием биомассы в диапазоне 0,110% (таблица 3).

Таблица 3 — Влияние исходной концентрации иммобилизованной в криогель ПВС биомассы фотобактерий Р. ркоэрИогеит на удельную концентрацию их внутриклеточного АТФ. ___

Содержание биомассы, масс % 10 5 1 0,1 0,01

[АТФ], моль/г гран, с иммоб. клетками (3,0±0,2) Х10"9 (1,4±0,1) хЮ"9 (2,9±0,2) хЮ"10 (2,9±0,3) хЮ'11 (1,7±0,2) хЮ"12

Было исследовано влияние концентрации биомассы клеток в составе разрабатываемого БЭ на его чувствительность. Для этого образцы с разной концентрацией иммобилизованных клеток (0,01 — 10 масс. %) подвергались воздействию заведомо избыточных концентраций экотоксикантов (ионов меди и малатиона). Чувствительность иммобилизованных клеток фотобактерий к наличию экотоксикантов оценивалась по уровню их остаточной интенсивности биолюминесценции после инкубирования в течение 30 минут (рисунок 3).

Результаты исследований показали, что присутствие в среде высоких концентраций (10"3 М) ионов меди или малатиона приводит к значительному снижению уровня биолюминесценции только в случае образцов, содержащих в своем составе биомассу клеток в низких концентрациях: 0,01 и 0,1%. Образец БЭ с концентрацией биомассы 0,01% характеризовался пониженным удельным содержанием АТФ в клетках иммобилизованных фотобактерий, что говорило о наличии в БЭ менее жизнеспособных клеток. На основании исследований был сделан вывод о том, что для БЭ в виде иммобилизованных клеток фотобактерий

предпочтительным является введение в криогель ПВС клеток фотобактерий в концентрации 0,1%. Таким образом, была подобрана эффективная концентрация биомассы в гранулах криогеля ПВС разрабатываемого БЭ.

Рисунок 3 - Зависимость остаточной интенсивности биолюминесценции иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий от концентрации биомассы в составе БЭ при их взаимодействии с экотокси-кантами в концентрации 10"3М (среда - 2% №С1, температура 10±ГС).

В ходе исследований была проведена оценка влияния питательных сред различного состава, взятых как для приготовления раствора ПВС, так и для инкубации полученных препаратов иммобилизованных клеток, на конечные характеристики БЭ — относительный уровень их биолюминесценции (таблица 4). Условия иммобилизации клеток: состав гранул: 13% раствор ПВС, 0,1% биомассы клеток. Температура формирования криогеля -80°С. Средняя масса гранулы 0,10±0,001 г. За 100% принималась максимальная интенсивность биолюминесценции, полученная в рамках данного эксперимента.

Таблица 4 - Зависимость уровня относительной биолюминесценции иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий от состава среды формирования БЭ и среды инкубации иммобилизованных клеток._

Раствор полимера на основе: Среда инкубации Уровень относительной биолюминесценции, %.

Буферного раствора* Полная среда Фаргали 3±3

Буферный раствор 3+3

Среды Фаргали без пептона Полная среда Фаргали 15±3

Буферный раствор 15+3

Полной среды Фаргали Полная среда Фаргали 97±3

Буферный раствор 97±3

'Буферный раствор: 0,1М Ыа-фосфатный буфер, 2% №С1 рН 7,8

-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 ^ [конц-я иммобилизованных клеток, %]

Согласно полученным результатам, ключевое влияние на уровень биолюминесценции разрабатываемого БЭ оказывала среда, использованная для приготовления раствора полимера. Установлено, что формирование БЭ на основе клеток фотобактерий Р. рИозркогеит в полной среде Фаргали с добавлением дрожжевого экстракта и пептона наиболее предпочтительно, поскольку уровень сигнала биолюминесценции по сравнению с другими использованными средами был в 6,5 - 32,3 раза выше. Инкубация гранул криогеля ПВС с иммобилизованными клетками фотобактерий, сформированных в одинаковых условиях, в питательных средах различного состава не приводила к изменению уровня биолюминесценции сформированного БЭ.

Исследование стабильности биолюминесценции иммобилизованных клеток фотобактерий при различных температурах формирования и хранения криогеля ПВС (-20°С и -80°С) позволило установить, что температура хранения -80°С является наиболее предпочтительной, так именно в этих условиях сохраняется более 80% биолюминесцентной активности БЭ при длительном хранении (более 60 недель). При температуре хранения -20°С БЭ сохраняется уровень биолюминесценции не менее 80% от исходного уровня всего в течение 35 суток.

Таким образом, были обоснованы биотехнологические параметры для формирования БЭ на основе клеток фотобактерий: исходная концентрация биомассы - 0,1%, концентрация раствора ПВС - 13%, среда формирования БЭ - полная среда Фаргали. Показана возможность длительного хранения такого БЭ без потери эффективности при температуре -80°С.

Важной характеристикой БЭ является зависимость уровня остаточной биолюминесценции после 30-минутной инкубации свободных и иммобилизованных клеток фотобактерий от температуры среды (рисунок 4). Было установлено, что при низких температурах (до 12 °С) клетки, как в свободной, так и в иммобилизованной форме, демонстрируют одинаковую интенсивность биолюминесценции. При высоких температурах (более 15°С) остаточная интенсивность свечения иммобилизованных клеток выше. Уровень биолюминесценции свободных клеток снижался практически на 25% по сравнению с их исходным уровнем свечения после 30-минутной инкубации при температуре 21°С, в то время как иммобилизованные клетки сохраняли исходный уровень интенсивности биолюминесценции. Иммобилизация клеток явно повышала стабильность биолюминесцентного сигнала, поэтому увеличение температуры сказывалось сильнее на активности суспензионных клеток.

Рисунок 4 -

Интенсивность биолюминесценции клеток фотобактерий в зависимости от температуры среды экспонирования (время экспонирования — 30 минут, среда - 2% р-р ЫаС1).

100-

60-

40-

20-

§ ю

свободные клетки (3-10 кл/мл) - иммобилизованные клетки (0,1%)

12 15 18 Температура, °С

21 24

Для разработанного БЭ на основе иммобилизованных клеток фотобактерий был изучен спектр биолюминесценции (рисунок 5). В качестве объекта сравнения использовались свободные клетки того же штамма микроорганизма, взятые в виде суспензии в 2% водном растворе №С1.

Рисунок 5 - Спектры биолюминесценции свободных и иммобилизованных клеток

фотобактерий Р. р/юярИогеит (среда - 2% ЫаС1, температура 15±1°С, концентрация клеток фотобактерий в суспензии -Зх10б кл/мл, приведенная концентрация клеток в криогеле ПВС - ЗхЮ6 кл/мл (0,1% биомассы)).

-Иммобилизованные ------Суспензия клеток

А, нм

Благодаря проведенным исследованиям впервые было зафиксировано смещение пика интенсивности биолюминесценции иммобилизованных в криогель ПВС исследованных клеток фотобактерий Р. рЬоьрЬогеит и V. Испл'еуч по сравнению со свободными в сторону более коротких длин волн на 5 - 7 нм. Наиболее вероятно, что такое смещение было вызвано изменениями в структуре клеточной мембраны, возникающими в процессе иммобилизации клеток фотобактерий в криогель ПВС на стадии «замораживания-оттаивания». При этом могли образовываться новые водородные связи между липидами самой

мембраны, которые фиксируют измененную под воздействием микрокристаллов льда конформацию мембраны и связанных с ней белков/

Установлено, что положение пика интенсивности биолюминесценции для клеток фотобактерий не зависит от их концентрации, а зависит только от формы (иммобилизованной или свободной) присутствия клеток в исследуемом образце.

Показано, что разработанный БЭ в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий сохраняет свою исходную интенсивность биолюминесценции в проточной среде в течение, как минимум, 10 суток. При этом предельная скорость протока для данной системы составляет 270 мл/ч.

Были изучены характерные отклики тушения биолюминесценции иммобилизованных клеток фотобактерий на присутствие различных экотоксикантов (ионы тяжелых металлов, производные фенола, фосфорорганические пестициды) в проточной аналитической системе при постоянной концентрации поступающего экотоксиканта. При этом наблюдался интегральный ответ БЭ, заключающийся в постоянном снижении уровня биолюминесценции под воздействием поступающего в аналитическую ячейку с протоком экотоксиканта. На примере взаимодействия клеток фотобактерий с ионами Си + показано, что тушение биолюминесценции связано с уменьшением концентрации активных клеток фотобактерий вследствие биохимической реакции с экотоксикантом (рисунок 6).

С применением методов кибернетики было проведено математическое моделирование процесса, протекающего в проточной ячейке, при следующих начальных допущениях:

1. Каждая клетка фотобактерий имеет одинаковое число активных центров, определяющих проявление эффекта биолюминесценции.

2. Клетка фотобактерий перестает быть источником биолюминесценции, когда все ее активные центры угнетены экотоксикантами.

3. Соотношение количества молей экотоксиканта на клетку фотобактерий, приводящее к заданному тушению биолюминесценции клетки одинаково и постоянно в течение всего процесса биохимической реакции для одной и той же системы «клетки фотобактерий-экотоксикант».

4. Снижение интенсивности биолюминесценции клеток в ячейке пропорционально количеству клеток фотобактерий, угнетенных экотоксикантами. Явление биолюминесценции клеток прекращается (интенсивность биолюминесценции стремится к нулю), если все клетки

фотобактерий, иммобилизованные в криогель ПВС, угнетены экотоксикантами.

5. Скорость протока водной среды не влияет на скорость протекания процесса биохимической реакции в иммобилизованных клетках фотобактерий.

Рисунок 6 — Зависимость концентрации активных клеток и интенсивности биолюминесценции иммобилизованных клеток | 2-°"

¿5

1 3,0-

^2,5-

1,5-

0,5-

фотобактерий от

времени биохимической реакции | '>° (проточная система (2% №С1, 90 мл/ч, 10±1°С) с постоянной концентрацией поступающего экотокси-канта (10~5 М Си2+)).

5 0,0-

Время, мин

С учетом начальных допущений для описания биохимической реакции взаимодействия клеток фотобактерий с экотоксикантами в ячейке предложено использовать модель изотермического реактора идеального вытеснения. На основе обработки массива данных получено кинетическое уравнение, описывающее изменение концентрации активных клеток фотобактерий в ячейке при протекании такой реакции:

Е0 - исходная концентрация клеток, кл/мл (3-106 кл/мл в данной работе); Е- текущая концентрация активных клеток, кл/мл;

А: - константа скорости реакции тушения биолюминесценции, (кл/млУ'с"1; ? - время, с.

Показано, что все исследованные системы «клетки фотобактерий-экотоксикант» описываются данным уравнением с коэффициентом корреляции Я2 не менее 0,993.

Для разработанного БЭ были определены константы скорости биохимической реакции экотоксикантов с клетками фотобактерий, удельные количества экотоксикантов, вызывающие снижение

интенсивности биолюминесценции, и нижние пределы обнаружения при проведении анализа в проточном режиме для трех классов экотоксикантов: ионов тяжелых металлов, производных фенола, фосфорорганических пестицидов, а также удельные концентрации этих экотоксикантов, вызывающие снижение интенсивности биолюминесценции на 15%, то есть, минимально определяемые удельные концентрации экотоксикантов (таблица 5).

Таблица 5 - Кинетические параметры взаимодействия БЭ с экотоксикантами в условиях проточной системы (2% №С1, 90 мл/ч, 10±2°С) при постоянной концентрации экотоксикантов._

Экотоксикант Нижний предел обнаружения, г/л ПДК, г/л Константа скорости к ((кл/мл)"'с"') биохимической реакции иммобилизованных клеток с экотоксикантами Удельное количество активных молей экотоксиканта, приводящее к угнетению клетки, моль/имм. кл.

7п2" (3,3±0,2)х106 5,0х10"5 8,70x10"" 7,5хЮ"'6

Со2+ О.ЬЗДхЮ"4 1,0* Ю"5 1,61хЮ"п 3,0х10"'4

Си2+ (1,9±0,2)х10"6 2,0x10"3 1,78x10-'° 4,5хЮ"16

2,6- диметилфенол (3,7±0,2)х10"6 2,1 х 10"3 1,71x10"'° 4,5хЮ"16

пентахлорфенол (1,6±0,1)х10_6 3,5х10"6 3,44x10"'° 9,0хЮ"'7

2,4-Д (4,4±0,2)х105 9,9x10"4 8,32x10"" З.ОхЮ"15

кумафос (1,8±0,2)х10"5 1,0x10"3 1,14x10"'° 7,5хЮ"16

хлорпирифос (1,1±0,1)хЮ5 1,1 хЮ"5 2,78x10"'° 4,5хЮ"'6

малатион (3,3±0,2)хЮ6 4,9x10"5 2,36x10"'° 1,5х10"'6

Показано, что методика определения экотоксикантов в проточной водной среде более чувствительна по сравнению с дискретным методом анализа присутствия экотоксикантов. Было установлено, что с помощью разработанного БЭ в виде иммобилизованных клеток фотобактерий возможно определение присутствия в проточной среде различных типов экотоксикантов в весьма широком диапазоне их концентраций. Наиболее широкий диапазон определяемых концентраций (1-Ю"8 -ь 1 • 10"4 М) был установлен при определении ионов тяжелых металлов.

Нижние пределы обнаружения экотоксикантов в условиях проточной среды, зафиксированные для иммобилизованных клеток, оказались в большинстве случаев на 1 - 2 порядка чувствительнее, чем аналогичные

диапазоны, установленные для иммобилизованных клеток фотобактерий при проведении дискретного анализа. Это свидетельствует о значительном повышении эффективности предложенной методики анализа.

Установлено также, что разные представители экотоксикантов характеризуются своим удельным количеством молей, которые вызывают одинаковое снижение интенсивности биолюминесценции на 15% от исходной величины. Именно этим объясняются разные пределы обнаружения разных экотоксикантов. Показано, что скорость протока в интервале 45 — 180 мл/ч не влияет на удельное количество активных молей экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции клеток фотобактерий. Показано, что повышение чувствительности клеток фотобактерий к экотоксикантам достигается за счет уменьшения удельного количества активных молей экотоксикантов, вызывающих одну и ту же степень тушения биолюминесценции.

Для проведения анализа почв на основе использования метода определения «биодоступных» экотоксикантов был использован быстрый (30 минут) одностадийный метод пробоподготовки путем экстракции экотоксикантов из почвы с помощью 3% раствора этанола в 2% растворе №С1. При проведении анализа содержания ионов тяжелых металлов и пестицидов в таком почвенном экстракте в проточном режиме анализа нижние пределы обнаружения оказались существенно ниже, чем в случае дискретного режима (таблица 6).

Таблица 6 — Нижние пределы обнаружения ионов тяжелых металлов и пестицидов в почве и величины ПДК, установленные для этих экотоксикантов.

Экотоксикант Нижний предел обнаружения, мг/кг ПДК в почве, мг/кг

Дискретный анализ Анализ в проточном режиме

РЪг+ 0,03 8±0,007 0,012±0,002 0,038

Со2+ 0,0071±0,0005 0,00025±0,0002 0,005

Си2+ 0,0062±0,0004 0,00019±0,00001 0,003

метил-паратион 0,012±0,003 0,00045±0,00005 0,1

малатион 0,32±0,02 0,012±0,003 2

диметон-8-метил 0,029±0,007 0,0014±0,0003 н/н*

кумафос 0,32±0,02 0,011±0,002 н/н*

*н/н - не нормирована

В обоих режимах проведениия анализа с использованием разработанного БЭ нижние пределы обнаружения экотоксикантов были

меньше (в количественном выражении на 1-2 порядка) по сравнению с известными величинами ПДК, установленными для некоторых из этих соединений в почве. При этом достигнутые пределы обнаружения в проточном режиме оказались значительно ниже соответствующих величин ПДК, установленных для содержания этих ионов в почве (таблица 6).

Возможность практического применения разработанного БЭ была исследована при анализе проб воды из Каспийского моря и реки Куры, а также проб почвы Московского региона. В случаях, когда в исследуемых пробах содержались экотоксиканты, БЭ на основе клеток фотобактерий также демонстрировал значительное снижение интенсивности биолюминесценции.

Разработанный БЭ на основе клеток фотобактерий был использован для определения цитотоксичности органических веществ — производных ионола. На основе данной оценки были даны рекомендации оп использованию разработанных препаратов в качестве антимикробных агентов.

Для предложенного БЭ была также построена калибровочная кривая зависимости аналитического сигнала от концентрации в среде метилфосфоновой кислоты, продукта разложения фосфорорганических отравляющих веществ. Экспериментально показано, что с помощью разработанного БЭ возможно проводить контроль процесса деградации реакционных масс, получаемых при уничтожении боевых отравляющих веществ, по степени экотоксичности сточных вод, получаемых в результате процесса.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый способ получения биочувствительных элементов (БЭ) в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта (ПВС) клеток микроводорослей Chlorella sp. и Thalassiosira weissflogii для анализа присутствия экотоксикантов в проточных водных системах.

Полученные образцы БЭ обладают стабильностью операционных характеристик, в том числе при высоких скоростях протока (до 360 мл/ч) при детекции ионов тяжелых металлов (Zn2+, Hg2+, Cu2+) и гербицидов (атразина, диурона, параквата) как в пресноводных, так и в морских водных проточных средах.

детекции представительных образцов экотоксикантов в количествах ниже величины ПДК.

2. Разработан способ получения нового биочувствительного элемента в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий Photobacterium phosphoreum для определения присутствия экотоксикантов в стационарных и проточных системах, а также для скрининга и оценки токсичности новых органических веществ. Полученный БЭ обладает расширенным диапазоном температур эффективного функционирования (6-21°С) в сравнении с суспензионными клетками (6-15 °С), длительно сохраняет свои основные операционные характеристики в протоке без экотоксикантов и обеспечивает определение экотоксикантов (ионов тяжелых металлов (Zn2+, Со2+, Си2+), фосфорорганических соединений (кумафоса, хлорпирифоса, малатиона, метилфосфоновой кислоты) и производных фенола (2,6-диметилфенола, пентахлорфенола, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты)) в водных проточных средах в концентрациях значительно ниже величин ПДК этих соединений.

3. Впервые установлен факт смещения пика интенсивности биолюминесценции иммобилизованных в криогель ПВС исследованных штаммов клеток фотобактерий в концентрациях 0,1 - 10% на 5 - 7 нм в сторону более коротких длин волн по сравнению со свободными клетками.

4. Впервые при использовании иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий для детекции экотоксикантов определены кинетические параметры (константы скорости биохимической реакции клеток фотобактерий с экотоксикантами, удельное количество активных молей различных классов экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции одной клетки в условиях проточной системы). Показано, что скорость протока в интервале 45 — 180 мл/ч не влияет на удельное количество активных молей экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции клеток фотобактерий.

5. На основе применения методов кибернетики предложено для описания биохимической реакции взаимодействия клеток фотобактерий с экотоксикантами использовать модель изотермического реактора идеального вытеснения. Получено кинетическое уравнение изменения концентрации активных клеток фотобактерий в ячейке в ходе биохимической реакции с экотоксикантом.

6. На основе разработанного БЭ в виде иммобилизованных клеток фотобактерий был предложен оригинальный подход к определению экотоксикантов в почвах методом экстракции «биодоступных» экотоксикантов из почвы с последующим анализом экотоксичности экстракта. Показано, что переход от проведения анализа экотоксичности

экстракта в дискретном режиме к анализу в условиях проточной системы позволяет повысить чувствительность метода.

7. Показана эффективность использования БЭ на основе клеток фотобактерий для экомониторинга образцов проб воды, отобранных из реки Кура и прибрежных зон Каспийского моря, образцов почвы, отобранных в Московском регионе. Показана возможность определения присутствия в водной среде метилфосфоновой кислоты, являющейся продуктом разложения реакционных масс боевых отравляющих веществ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ефременко E.H., Завьялова Н.В., Гудков Д.А., Лягин И.В., Сенько О.В., Гладченко М.А., Сироткина М.С., Холстов A.B., Варфоломеев С.Д., Холстов В.И. Экологически безопасная биодеградация реакционных масс, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ // Рос. Хим. Журн. 2010. Т. LIV (4), с. 19-24.

2. Никольская А.Б., Холстов A.B., Лягин И.В., Мамедова Ф.Т., Ефременко E.H., Варфоломеев С.Д. Иммобилизованные клетки Chlorella vulgaris для решения задач альтернативной энергетики и экологии // Междунар. Журн. «Альтернативная энергетика и экология». 2010. №4, с. 95-100.

3. Ефременко E.H., Сенько О.В., Куц В.В., Исмаилов А.Д., Холстов A.B., Аленина К.А. Люминесцентный биокатализатор для определения экотоксикантов // Патент РФ на изобретение №2394910, Бюл. 20 (20.07.2010).

4. Ефременко E.H., Холстов A.B., Воронова E.H., Конюхов И.В., Погосян С.И., Рубин А.Б. Биосенсор на основе клеток микроводорослей для определения тяжелых металлов и гербицидов в водных системах // Патент РФ на изобретение №2426779, Бюл. 23 (20.08.2011).

5. Сенько О. В., Холстов А. В., Ефременко Е. Н. Биосенсор на основе иммобилизованных диатомовых водорослей для определения различных токсикантов // II Международная конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 28 — 30 октября 2008 г., Ростов-на-Дону, Южный федеральный университет, с. 142-143.

6. Холстов А. В., Сенько О. В., Воронова Е. Н., Погосян С. И., Ефременко Е. Н., Рубин А. Б. Разработка биосенсорного элемента для индикации экотоксикантов в природных водах // VIII ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика», 11 - 13 ноября 2008 г., Москва, с. 234.

7. Конюхов И. В., Погосян С. И., Яковлева О. В., Рубин А. Б., Ефременко Е. Н., Сенько О. В., Холстов А. В. Разработка биосенсорного метода и создание измерительного комплекса для биоиндикации состояния

природных вод // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», 8-10 декабря 2008 г., Москва, с. 103-104.

8. Холстов А. В., Сенько О. В., Исмаилов А. Д., Ефременко Е. Н. Разработка биосенсора на основе иммобилизованных клеток для обнаружения экотоксикантов в водных средах // 6-я Международная конференция «Сотрудничество для решения проблемы отходов», 8 — 9 апреля 2009 г., Харьков, с. 237-239.

9. Kholstov A.V., Senko O.V., Efremenko E.N., Ismailov A.D. Development of biosensor, based on immobilized cells of Photobacterium phosphoreum for detection of ecotoxic agents in water sources // International conference Biocatalysis-2009: Fundamentals & applications, 19-24 June 2009, Arkhangelsk, p. 117-118.

10. Холстов А. В., Ефременко E. H., Погосян С. И., Воронова Е. Н., Рубин А. Б. Криотропные гели как носители для иммобилизованных клеток микроводорослей // III Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 1—4 октября 2009 г., Ростов-на-Дону, Южный федеральный университет, с. 31-32.

11. Конюхов И. В., Воронова Е. Н., Погосян С. И., Рубин А. Б., Ефременко Е. Н., Сенько О. В., Холстов А. В. Разработка биосенсорного метода и создание измерительного комплекса для биоиндикации состояния природных вод // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007 - 2012 годы», 25 - 27 ноября 2009 г., Москва, с. 20-21.

12. Холстов А. В., Исмаилов А. Д., Куц В. В., Сенько О. В., Ефременко Е. Н. Биологическая система на основе иммобилизованных клеток фотобактерий для обнаружения пестицидов в проточных водных средах // IX ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН -ВУЗы «Биохимическая физика», 9-11 ноября 2009 г., Москва, с. 257-258.

13. Холстов A.B., Ефременко E.H., Исмаилов А.Д., Куц В.В., Погосян С.И., Воронова E.H., Конюхов И.В. Биосенсоры на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов для детекции экотоксикантов в водных системах // Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов», посвященный двум юбилейным датам: 120-летию со дня рождения

основателя кафедры микробиологии и её первого заведующего профессора Е.Е. Успенского и 125-летию со дня рождения заведующего кафедрой (1938-1967) академика В.Н. Шапошникова, 24 - 27 декабря 2009 г., Москва, с. 143.

14. Холстов A.B., Ефременко E.H. Микробиологические системы мониторинга состояния водных объектов на наличие экотоксикантов // Московская международная научно-практическая конференция "Биотехнология: экология крупных городов", 15 - 17 марта 2010 г., Москва, с. 430-431.

15. Холстов A.B., Исмаилов А.Д., Ефременко E.H. Определение фосфорорганических соединений различных классов в водных средах с использованием иммобилизованных клеток фотобактерий // 14-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, 19-23 апреля 2010 г, с. 295-296.

16. Холстов A.B., Молотилин Т.Ю., Мустафаев P.M., Ефременко E.H. Биологическая система на основе иммобилизованных клеток фотобактерий для обнаружения пестицидов в проточных водных средах // X ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», 8-10 ноября 2010 г., Москва, с. 252-254.

17. Холстов A.B., Ефременко E.H. Определение различных классов пестицидов в водных средах с использованием иммобилизованных клеток фотоабктерий в качестве биорецепторов // Международная научно-практическая конференция «Юность за экологический прогресс», 11 — 12 ноября 2010 г., Баку, с. 45-47.

18. Холстов A.B., Молотилин Т.Ю., Мустафаев P.M., Ефременко E.H. Мониторинг присутствия ионов тяжелых металлов в проточных водных средах с помощью биосенсора на основе иммобилизованных клеток фотобактерий // Международная выставка и конференция «Сотрудничество для решения проблемы отходов», 23 — 25 февраля 2011 г., Харьков, с. 134-135.

19. Мамедов Ф.Т., Холстов A.B., Ефременко E.H. Биолюминесцентный экспресс-детектор загрязненности вод в проточных системах // III Международная научно-практическая конференция «Научно-техническое творчество молодежи — путь к обществу, основанному на знаниях», 28 июня - 1 июля 2011 г., Москва, с. 109-111.

20. Холстов A.B., Ефременко E.H. Экомониторинг присутствия экотоксикантов в почвах с использованием иммобилизованных клеток фотобактерий // XI ежегодная международная молодежная конференция ИБХФ РАН - ВУЗы «Биохимическая физика», 9-11 ноября 2011 г., Москва, с. 252-254.

Список сокращений, использованных в работе:

АТФ — аденозинтрифосфат;

БИ — биоиндикатор;

БЭ — биочувствительный элемент;

МВ - микроводоросли;

ПВС — поливиниловый спирт;

ПДК - предельно допустимая концентрация;

ФСА - фотосинтетический аппарат;

2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.

Подписано в печать 14.11.2012. Формат А4 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 150экз. Заказ № 153 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.2 8 Тел. 8(495)782-88-39

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Холстов, Александр Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Основные аспекты экомониторинга состояния природных объектов

1.1.1 Особо важные объекты мониторинга: водные системы и почвы

1.1.2 Спектр экотоксикантов, мониторинг наличия которых необходим в 14 природных средах

1.2 Известные биосенсорные системы на основе клеток микроорганизмов, 16 используемые для определения присутствия экотоксикантов в природных средах

1.2.1 Клетки микроводорослей - как биочувствительные элементы 17 биоиндикаторов

1.2.1.1 Флуоресценция хлорофилла микроводорослей, как источник 18 аналитического сигнала

1.2.1.2 Биочувствительные элементы на основе иммобилизованных клеток 21 микроводорослей, используемые для определения наличия экотоксикантов в природных системах

1.2.2 Фотобактерии - основа микробных биоиндикаторов

1.2.2.1 Принципы функционирования биочувствительных элементов на 25 основе клеток фотобактерий

1.2.2.2 Биочувствительные элементы на основе иммобилизованных клеток 27 фотобактерий, используемые для определения наличия экотоксикантов в водных проточных системах

1.2.2.3 Клетки фотобактерий в мониторинге экотоксикантов в почвах

1.3 Требования, предъявляемые к характеристикам биочувствительных элементов, получаемых на основе клеток микроорганизмов, для анализа экотоксикантов

1.4 Использование криотропных гелей для иммобилизации клеток микроорганизмов

1.4.1 Криогель поливинилового спирта

1.4.2 Криогель полиакриламида 43 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46 2.1 Материалы 46 2.1.1 Микроорганизмы

2.1.2 Реактивы

2.2.Методы

2.2.1 Выращивание биомассы клеток микроорганизмов

2.2.2 Иммобилизация клеток фотобактерий и микроводорослей в криогель 48 поливинилового спирта

2.2.3 Иммобилизация клеток микроводорослей в криогель полиакриламида

2.2.4 Методики исследования влияния процесса иммобилизации на 49 состояние клеток микроорганизмов

2.2.5 Изучение ответа биоиндикаторов на присутствие в среде токсикантов в водных системах

2.2.6 Определение содержания влажной биомассы в образцах 53 биочувствительного элемента, полученных при введении клеток микроводорослей в криогель поливинилового спирта под действием центробежных сил

2.3 Подготовка модельных образцов почвы, загрязненной пестицидами, и 53 экстракция пестицидов из почвы

2.4 Расчет погрешностей и нижнего предела обнаружения

2.5 Приборы и программное обеспечение 54 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 55 3.1 Биочувствительный элемент в виде иммобилизованных клеток микроводорослей для определения присутствия экотоксикантов в проточных системах

3.1.1 Разработка биочувствительного элемента на основе клеток 56 микроводорослей, иммобилизованных путем включения их в криогели

3.1.1.1 Исследование влияния концентрации биомассы клеток 56 микроводорослей и поливинилового спирта в составе биочувствительного элемента на его характеристики

3.1.1.2 Исследование влияния присутствия криопротекторов на 60 характеристики клеток микроводорослей Thala.ssio.sira \veissflogii после их иммобилизации в криогель поливинилового спирта

3.1.1.3 Исследование влияния состава питательной среды, используемой для 62 накопления биомассы клеток микроводорослей с целью ее последующей иммобилизации в криогель поливинилового спирта, на свойства биочувствительного элемента

3.1.1.4 Влияние режима культивирования клеток микроводорослей

Ткаїаььіо.їіга \veissflogii на характеристики получаемых биочувствительных элементов

3.1.1.5 Исследование влияния температуры формирования криогеля 70 поливинилового спирта на характеристики получаемого биочувствительного элемента в виде иммобилизованных клеток микроводорослей

3.1.1.6 Исследование влияния условий формирования криогеля 72 полиакриламида для использования его в качестве носителя для иммобилизованных клеток микроводорослей

3.1.1.7 Сравнение характеристик образцов иммобилизованных клеток 76 микроводорослей, полученных при разных приемах их введения в поры носителя криогеля полиакриламида

3.1.1.8 Исследование эффективности удержания иммобилизованных клеток 77 микроводорослей в различных носителях в проточных условиях

3.1.2 Исследование операционных характеристик биочувствительного 78 элемента в виде иммобилизованных клеток микроводорослей в стационарных водных системах

3.1.2.1 Влияние температуры среды экспонирования на операционные 79 характеристики биочувствительного элемента в виде клеток микроводорослей в условиях дискретного анализа

3.1.2.2 Влияние режима и интенсивности внешнего освещения на 80 операционные характеристики биочувствительного элемента в виде иммобилизованных клеток микроводорослей в условиях дискретного анализа

3.1.2.3 Определение пределов обнаружения экотоксикантов с 82 использованием разработанных биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроводорослей в дискретном режиме анализа

3.1.3 Исследование операционных характеристик биочувствительных 84 элементов в виде иммобилизованных клеток микроводорослей в проточных аналитических системах

3.1.3.1 Исследование стабильности операционных характеристик 85 разработанных биочувствительных элементов при их длительном экспонировании в проточной системе в условиях отсутствия токсикантов

3.1.3 Исследование операционных характеристик биочувствительного 86 элемента в виде иммобилизованных клеток микроводорослей в проточных аналитических системах

3.2 Биочувствительный элемент на основе иммобилизованных клеток 88 фотобактерий

3.2.1 Разработка биочувствительного элемента в виде иммобилизованных в 89 криогель поливинилового спирта клеток фотобактерий

3.2.1.1 Оценка влияния концентрации биомассы клеток в гранулах 89 биочувствительного элемента на характеристики иммобилизованных клеток фотобактерий

3.2.1.2 Влияние концентрации полимера в гранулах биочувствительного 92 элемента на характеристики иммобилизованных клеток

3.2.1.3 Влияние температурных условий формирования и хранения 93 биочувствительного элемента на биолюминесцентную активность иммобилизованных клеток

3.2.1.4 Влияние состава среды, используемой на стадии формирования и 94 экспонирования биочувствительного элемента в виде иммобилизованных клеток фотобактерий, на его биолюминесценцию

3.2.1.5 Оценка влияния процесса иммобилизации клеток фотобактерий в 96 криогель поливинилового спирта на спектр их биолюминесценции

3.2.2 Исследование операционных характеристик биочувствительного 102 элемента на основе иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток фотобактерий в стационарных водных системах

3.2.2.1. Исследование влияния температурных условий на интенсивность 102 биолюминесценции иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток фотобактерий

3.2.2.2 Исследование основных аналитических характеристик 105 биочувствительного элемента на основе клеток фотобактерий, используемого при обнаружении экотоксикантов в режиме дискретного анализа

3.2.2.3 Определение цитотоксичности новых фосфорорганических 109 соединений (потенциальных антимикробных препаратов) с помощью разработанного биочувствительного элемента на основе клеток фотобактерий, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта

3.2.3 Исследование операционных характеристик биочувствительного 112 элемента на основе иммобилизованных клеток фотобактерий в проточных водных системах

3.2.3.1 Исследование стабильности сигнала полученного биочувствительного элемента биосенсора на основе иммобилизованных клеток в проточной системе при отсутствии экотоксикантов в среде

3.2.3.2 Исследование характера отклика биочувствительного элемента на 115 присутствие в проточной среде экотоксикантов

3.2.3.3 Исследование пределов обнаружения экотоксикантов при 121 использовании биочувствительного элемента в виде иммобилизованных клеток фотобактерий в проточной системе

3.2.3.4 Оценка влияния скорости протока на показатели количественного 124 эффекта взаимодействия экотоксикантов с иммобилизованными клетками фотобактерий Р. phosphoreum

3.2.3.5 Оценка токсичности реальных водных проб с помощью полученного 128 БЭ в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток фотобактерий

3.2.3.6 Исследование возможности определения токсичности 130 фосфорорганических пестицидов и ионов тяжелых металлов, содержащихся в почве, с помощью полученного биочувствительного элемента в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта клеток фотобактерий

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов для определения экотоксикантов в проточных водных системах"

Производственная деятельность человека и его воздействие на окружающую среду, в первую очередь, отражаются на состоянии водоемов и почв. Одновременно с интенсификацией того или иного производства увеличиваются и объёмы жидких промышленных и бытовых отходов. При этом, наибольшее внимание уделяется экотоксическому воздействию хлорорганических соединений, нефтепродуктов, производных тяжелых металлов на все природные биологические объекты [1-12]. Загрязнение окружающей среды увеличивается. Так в 2011 году только на водных объектах Московского региона было зафиксировано 323 случая высокого загрязнения различными веществами, что на 47% больше, чем в 2010 году и на 68% больше, чем в 2009 году. [13]. Вследствие постоянно возрастающей антропогенной нагрузки на окружающую среду разработка эффективных методов анализа состояния объектов окружающей среды становится особенно актуальной.

Проблемой первостепенной важности является необходимость проведения постоянного мониторинга качества воды. При этом требуется получение информации в режиме реального времени для экстренного выявления и принятия мер по ликвидации загрязнений. Своевременное получение информации возможно при использовании методов, позволяющих определять наличие в воде экотоксикантов оперативно и дистанционно, поэтому актуальной является разработка технологий экспресс-анализа экотоксикантов в проточных системах.

Почвенный покров играет роль универсального биологического сорбента и нейтрализатора загрязнений. Бесконтрольное применение пестицидов и сброс экотоксикантов на почву могут быть причиной экологических катастроф. Поэтому важным является проведение мероприятий, позволяющих своевременно зафиксировать и свести к минимуму или совершенно исключить загрязнения почвенного покрова. В настоящее время все известные методики анализа почвогрунта включают в себя стадию пробоподготовки, что, в свою очередь, неизбежно и значительно увеличивает время проведения анализа. В связи с этим актуальным является исследование и поиск новых подходов, связанных с возможностью проведения экомониторинга состояния почв в режиме реального времени без проведения пробоподготовки.

На сегодняшний день для проведения анализа состава разных образцов водных сред на наличие экотоксикантов используются разнообразные физико-химические, биофизические и биологические методы [1-27]. Первые дают оценку концентрации загрязнителей с высокой точностью и чувствительностью, но часто для проведения такого анализа требуется транспортировка образца в лабораторию, проведение многоэтапной 8 пробоподготовки и использование специального стационарного оборудования, что затрудняет получение информации о наличии вредных веществ в режиме реального времени и непосредственно "на месте" отбора проб (in situ). Кроме того, физико-химические методы не позволяют оценить именно негативное воздействие экотоксикантов на компоненты природных систем. В этой связи мониторинг состояния водных объектов с применением биологических методов, основанных на использовании биоиндикаторов (БИ) - живых организмов, позволяет давать быстрый специфический ответ на присутствие в среде экотоксикантов. Значительным преимуществом биоиндикаторов является также их способность реагировать на широкий спектр экотоксикантов различных классов, в то время как физико-химические методы анализа узкоспецифичны, и при наличии анализируемой системы сложного состава может потребоваться применение более, чем одной методики анализа. Среди широкого спектра биоиндикаторов эффективными для использования признаны клетки микроорганизмов -микроводорослей и фотобактерий [10, 14-17].

Фотосинтетический аппарат (ФСА) микроводорослей и сопряженные ферментативные системы чрезвычайно чувствительны к наличию в воде экотоксикантов. Изменения в состоянии ФСА определяются флуориметрически (по изменению квантового выхода флуоресценции хлорофилла) или амперометрически (по изменению содержания кислорода, образующегося при фотосинтезе в клетках) [10, 17, 28-35]. Использование БЭ на основе клеток фотобактерий основано на изменении интенсивности их биолюминесценции в присутствии экотоксикантов [36-47].

Основными ограничениями при использовании биочувствительных элементов (БЭ) на основе клеток микроорганизмов в аналитических целях являются: невысокая стабильность во времени аналитического сигнала, обеспечиваемого ими вследствие естественных метаболических процессов и невозможность применения свободных клеток для проведения анализа in situ в проточных системах. Подходом к преодолению этих ограничений является иммобилизация клеток микроорганизмов с использованием разнообразных носителей. Применение клеток в иммобилизованной форме позволяет организовать их использование в проточных системах и повысить стабильность аналитических характеристик клеток во времени [33, 41-47].

При этом, определяющими критериями эффективного функционирования разрабатываемых БЭ на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов считаются: уровень выживаемости клеток в процессе иммобилизации, определяемый численностью жизнеспособных клеток в составе получаемого образца БЭ; уровень аналитического сигнала, обеспечиваемого иммобилизованными клетками (биолюминесцентного сигнала - у фотобактерий; фотосинтетического сигнала -у клеток микроводорослей).

Наилучших значений этих критериев можно достичь путем подбора носителя, метода и условий иммобилизации клеток, а также оптимизации условий подготовки клеток к иммобилизации, включая накопление биомассы, подлежащей иммобилизации, в которой максимально сохранена целостность и метаболическая активность клеток.

Существует ряд носителей, применение которых возможно для разработки иммобилизованных форм микроводорослей и фотобактерий [36, 41-47], однако, все они имеют те или иные недостатки. Так, в результате иммобилизации в некоторых микроводорослях ФСА претерпевает необратимые изменения, также отдельные клетки не способны функционировать при их обездвиживании в матрице носителя [47]. В этой связи носитель, должен сохранять для клетки определенную степень свободы перемещения, например, в объеме макропор матрицы, применяемой для иммобилизации. Кроме того, очевидно, что носитель должен быть механически стабилен в условиях водной проточной среды и не должен подвергаться химической или биохимической деградации, а также оказывать негативные эффекты на аналитический сигнал самих клеток при проведении анализа экотоксикантов.

Разработка новых БЭ, подбор носителей для иммобилизации с целью достижения высокой эффективности функционирования клеток микроорганизмов являются актуальными как для биотехнологии получения оптимальных составов БЭ, так и для экологической биофизики, устанавливающей общие закономерности влияния физико-химических условий протекания процесса на аналитические и кинетические характеристики иммобилизованных клеток при определении экотоксикантов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Холстов, Александр Викторович

выводы

1. Разработан новый способ получения биочувствительных элементов (БЭ) в виде иммобилизованных в криогель поливинилового спирта (Г1ВС) клеток микроводорослей Chlorella sp. и Thalassiosira weissflogii для анализа присутствия экотоксикантов в проточных водных системах.

Полученные образцы БЭ обладают стабильностью получаемых операционных характеристик, в том числе при высоких скоростях протока (до 360 мл/ч) при детекции ионов тяжелых металлов (Zn2+, Hg2+, Cu2+) и гербицидов (атразина, диурона, параквата) как в пресноводных, так и в морских водных проточных средах.

Установлено, что в сравнении с известными аналогами разработанные БЭ в виде иммобилизованных клеток микроводорослей характеризуются высокими аналитическими характеристиками для детекции представительных образцов экотоксикантов в количествах ниже величины ПДК.

2. Разработан способ получения нового биочувствительного элемента в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий Photobacterium phosphoreum для определения присутствия экотоксикантов в стационарных и проточных системах, а также для скрининга и оценки токсичности новых органических веществ. Полученный БЭ обладает расширенным диапазоном температур эффективного функционирования (621°С) в сравнении с суспензионными клетками (6-15 °С), длительно сохраняющие свои основные операционные характеристики в протоке без экотоксикантов и обеспечивает определение экотоксикантов (ионов тяжелых металлов (Zn2+, Со2+, Си2+), фосфорорганических соединений (кумафоса, хлорпирифоса, малатиона, метилфосфоновой кислоты) и производных фенола (2,6-диметилфенола, пентахлорфенола, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты)) в водных проточных средах в концентрациях значительно ниже величин ПДК этих соединений.

4. Впервые при использовании иммобилизованных в криогель ПВС клеток фотобактерий для детекции экотоксикантов определены кинетические параметры (константы скорости биохимической реакции клеток фотобактерий с экотоксикантами, удельное количество активных единиц различных классов экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции одной клетки в условиях проточной системы). Показано, что скорость протока в интервале 45 - 180 мл/ч не влияет на удельное количество активных единиц экотоксикантов, приводящее к тушению биолюминесценции клеток фотобактерий.

6. На основе разработанного БЭ в виде иммобилизованных клеток фотобактерий был предложен оригинальный подход к определению экотоксикантов в почвах, экстракцией «биодоступных» экотоксикантов из почвы с последующим анализом экотоксичности экстракта. Показано, что переход от проведения анализа экотоксичности экстракта в дискретном режиме к анализу в условиях проточной системы позволяет повысить чувствительность метода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Холстов, Александр Викторович, Москва

1. Степаньян О. В., Воскобойников Г. М. Влияние нефти и нефтепродуктов на морфофункциональные особенности морских макроводорослей // Биол. Моря. 2006. Т. 32 (4), с. 241-248.

2. Шеннон С. Питание в атомном веке: Как уберечь себя от малых доз радиации // Минск : Из-во "Беларусь". 1991. 302 с.

3. Богдевич О. П. Измайлова Д. Н. Болотин O.A. Использование модифицированных сорбентов для удаления трех и пятивалентных ионов мышьяка из водных растворов // Bul.Inst. Geoßzicä ?i Geologie al A§M. 2006. № 1, с. 118-126.

4. Алыкова T.B. Химический мониторинг окружающей среды. Монография // Астрахань : Изд-во Астрах, гос. пед. ун-та. 2002. 210с.

5. Майстренко В. Н., Хамитов Р. 3., Будников Г. К. Эколого-аналитический мониторинг суперэкотоксикантов // Москва : Химия. 1996. 320 с.

6. Другов Ю. С. Экологическая аналитическая химия // Москва : М. 2000. 432 с.

7. Крючихин Е. М., Николаев А. Н., Жильникова Н. А. Очистка сточных вод от биогенных элементов // Экология производства. 2008. №4, с. 6-9.

8. Крючихин Е. М., Николаев А. Н., Жильникова Н. А., Большаков Н. Ю. Методы очистки городских сточных вод от биогенных элементов // Сантехника, отопление, кондиционирование, 2006, №8 (электронная версия журнала).

9. Баринова С. С., Медведева J1. А., Анисимова О. В. Экологические и географические характеристики водорослей-индикаторов. Водоросли-индикаторы в оценке качества окружающей среды // Москва : ВНИИ Природы. 2000. Ч. 2, 150 с.

10. Шкундина Ф. Б., Захарова Е. А. Водоросли как индикатор загрязненности территории предприятия // Экология и промышленность России. 2002. №6, с. 26-28.

11. Александров М., Воробьев А., Пашков Е., Филатов М., Мищенко И., Багранова Г. Лазерная флуоресцентная диагностика в медицине, пищевой промышленности, экологии // Электроника: наука, технология, бизнес. 2003. №3, с. 54-60.

12. Sherma J. Pesticide residue analysis (1999-2000): a review // J. Anal. Chem. Int. 2001. V. 8(5), p. 1303-1312.

13. Бюллетень состояния загрязнения окружающей среды московского региона за 2011 г // URL: http://ecomos.ru/kadr22/sostoianieZagrOSgod.asp (дата обращения 15.05.2012).

14. Zhirnov V. V., Cavin III R. К. Chapter 4 Sensors at the micro-scale. Microsystems for Bioelectronics // UK : Oxford. 2011. p. 91-121.

15. Ron E. Z. Biosensing environmental pollution // Cur. Opin. Biotechnol. 2007. V. 18, p. 252-256.

16. Rodriguez-Mozaz S., Lopez de Aida M. J., Barcelô D. Biosensors as useful tools for environmental analysis and monitoring II Anal. Bioanal. Chem. 2006. V. 386, p. 1025-1041.

17. Рубин А. Б. Биофизические методы в экологическом мониторинге // Соросовский обр. журн. 2000. Т. 6 (4), с.7-13.

18. Файзуллаев О., Файзуллаев О.О. Определение ионов тяжелых металлов в объектах окружающей среды // Горный вестник Узбекистана. 2005. №3, с. 109-110.

19. Вирюс Э. Д., Ревельский И. А., Ревельский А. И. Идентификация фенола и его производных методом ГХ-МС-МС // Вестн. Мое. Ун. Сер. 2. Химия. 2005. Т. 46 (6), с. 388-391.

20. Orellana G., Cano-Raya С., Lôpez-Gejo J., Santos A.R. 3.10 Online Monitoring Sensors// Treatise on Water Science. 2011. V. 3, p. 221-261.

21. Xu T., Close D. M., Sayler G. S., Ripp S. Genetically modified whole-cell bioreporters for environmental assessment // Ecol. Indicat. 2012. D01:10.1016/j.ecolind.2012.01.020.

22. Su L., Jia W., Houb C., Lei Y. Microbial biosensors: A review // Biosens. Bioelectron. 2011. V. 26, (5), p. 1788-1799.

23. Durrieu C., Guedri H., Fremion F., Volatier L. Unicellular algae used as biosensors for chemical detection in Mediterranean lagoon and coastal waters // Res. Microbiol. 2011. V. 162 (9), p. 908-914.

24. Brayner R., Coûté A., Livage J., Perrette C., Sicard C. Micro-algal biosensors // Anal. Bioanal. Chem. 2011. V. 401 (2), p. 581-597.

25. Trojanowicz M. Main Concepts of Chemical and Biological Sensing // Comb. Meth. Chemi. Biol. 5era.,DOI: 10.1007/978-0-387-73713-3 2.

26. Farre' M., Kantiani L., Perez S., Barcelo D. Sensors and biosensors in support of EU Directives // Trends Anal. Chem. 2009. V. 28 (2), p. 170 185.

27. Nakamura H., Shimomura-Shimizu M., Karube I. Development of Microbial Sensors and Their Application II Adv. Biochem. Engin. Biotechnol. 2008. V. 109, p. 351-394.

28. Schreiber U., Mueller R., Escher В. I., Bengtson Nash S. M., Mueller J. F. Rapid exposure assessement of PSII herbicides in surface water using a novel chlorophyll a fluorescence imaging assay // Sci. Total Environ. 2008. V.401, p. 51-59.

29. Ling Shing W., Surif S., Heng L. Y. Toxicity Biosensor for the evaluation of cadmium toxicity based on photosynthetic behavior of cyanobacteria Anabena torulosa II Asian J. Biochem. 2008. V.3(3), p. 162-168.

30. Measuring indigenous photosynthetic organisms to detect chemical warfare agents in water//Патент США №6954857, заявл. 17.06.2002, опубл. 11.10.2005.

31. Singh J., Mittal S. K. Chlorella sp. based biosensor for selective determination of mercury in presence of silver ions // Sens, and Act. B: Chemical. 2012. V. 165 (1), p. 48-52.

32. Abdel-Raoufa N., Al-Homaidanb A. A., Ibraheem I.B.M. Microalgae and wastewater treatment // Saudi J. Biol. Sci. 2012. V. 19 (3), p. 257-275.

33. Girotti S., Ferri E. N., Fumo M. G., Maiolini E. Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria // Anal. Chim. Acta. 2008. V. 608, p.2-29.

34. Ma J., Lin F., Zhang R., Yu W., Lu N. Differential sensitivity of two green algae, Scenedesmus quadricauda and Chlorella vulgaris, to 14 pesticide adjuvants // Ecotoxicol. Environ. Saf. 2004. V. 58, p. 61-67.

35. Chun U-H., Simonova N., Chen Y., Britz M. L. Continuous pollution monitoring using Photobacterium phosphoreum II Res. Conserv. Recycl. 1996. V. 18, p. 25-40.

36. Kim S. K. Lee B. S., Lee J. G., Seo H. G., Kim E. K. Continuous water toxicity monitoring using immobilized Photobacterium phosphoreum II Biotechnol. Bioproc. Eng. 2003. 8, p. 147-150.

37. Kuncova G., Pazlarov J., Hlavata A., Ripp S., Sayler G. S. Bioluminescent bioreporter Pseudomonas putida TVA8 as a detector of water pollution. Operational conditions and selectivity of free cells sensor // Ecol. Indicat. 2011. V. 11 (3), p. 882-887.

38. Parvez S., Venkataraman C., Mukherji S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals // Environ. Int. 2006. V. 32, p. 265 268.

39. Kudryasheva N. S. Bioluminescence and exogenous compounds: Physico-chemical basis for bioluminescent assay II J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 2006. V. 83, p. 77-86.

40. Yin J., Xiao-zhou L. I., Zhou C., Zhang Y. Luminescent bacterial sensors made from immobilized films of Photobacterium phosphoreum II Chem. Res. Chinese U. 2005. V.21(l), p. 44-47.

41. Toxicity assay using PVA-immobilized luminescent bacteria // Междунар. патент WO/2001/032911, заявл. 1.11.2000, опубл. 10.05.2001.

42. Nedovic V., Willaert R. Applications of cell immobilization biotechnology // Foe. biotechnol. 2005. V.8B, 573p.

43. Nedovic V., Willaert R. Fundamentals of cell immobilisation biotechnology // Foe. Biotechnol. 2004. V.8A, 550p.

44. Mallick N. Immobilization of Microalgae Immobilization of Enzymes and Cells // Methods Biothechnol. 2006. V.22, p. 373-391.

45. Moreno-Garrido I. Microalgae immobilization: Current techniques and uses // Biores. Technol. 2008. V. 99, p. 3949-3964.

46. Mohammed A. S., Kapri A., Goel R. Heavy metal pollution: source, impact, and remedies // Environ. Pollut. 2011. V. 20, p. 1-28.

47. Tsybulskii I. E., Sazykina M. A. New biosensors for assessment of environmental toxicity based on marine luminescent bacteria // Appl. Biochem. Microbiol. 2010. V. 46 (5), p. 505-510.

48. Gonécalves C., Alpendurada M. F. Assessment of pesticide contamination in soil samples from an intensive horticulture area, using ultrasonic extraction and gas chromatography-mass spectrometry // Talanta 2005. V. 65, p. 1179-1189.

49. Lambropoulou D. A., Albanis T. A. Liquid-phase micro-extraction techniques in pesticide residue analysis // J. Biochem. Biophys. Meth. 2007. V. 70, p. 195-228.

50. Chen W., Li L., Gan N., Song L. Optimization of an effective extraction procedure for the analysis of microcystins in soils and lake sediments // Environ. Pollut. 2006. V. 143, p. 241-246.

51. Turner B. L., Cade-Menun B. J., Condron L. M., Newman S. Extraction of soil organic phosphorus // Talanta. 2005 V. 66, p. 294-306.

52. Andy Hong P. K., Nakra S. Rapid extraction of sediment contaminants by pressure cycles // Chemosph. 2009. V. 74, p. 1360-1366.

53. Kaasalainen M, Yli-Halla M. Use of sequential extraction to assess metal partitioning in soils II Environ. Pollut. 2003. V. 126, p. 225-233.

54. Petanen T., Romantschuk M. Toxicity and bioavailability to bacteria of particle-associated arsenite and mercury // Chemosph. 2003. V. 50, p. 409-^113.

55. Frische T., Hoper H. Soil microbial parameters and luminescent bacteria assays as indicators for in situ bioremediation of TNT-contaminated soils // Chemosph. 2003. V. 50, p. 415^127.

56. Ivask A., Virta M., Kahru A. Construction and use of specific luminescent recombinant bacterial sensors for the assessment of bioavailable fraction of cadmium, zinc, mercury and chromium in the soil // Soil Biol. Biochem. 2002. V. 34, p. 1439-1447.

57. Skrbic В., Durisicr-Mladenovic N. Principal component analysis for soil contamination with organochlorine compounds // Chemosph. 2007. V. 68, p. 2144-2152.

58. Hynninen A., Virta M. Whole-cell bioreporters for the detection of bioavailable metals // Adv Biochem Engin/Biotechnol, DOI: 10.1007/1020099.

59. Охрана природы. Почвы. Классификация химических веществ для контроля загрязнения : ГОСТ 17.4.1.02-83. Введен 01.01.1985.

60. Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в почве. Гигиенические нормативы : ГН 2.1.7.2041-6. Введен 1.04.2006.

61. Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества : ГОСТ Р 51232-98. Введен 1.07.1999.

62. Вода питьевая. Методы определения содержания свинца, цинка, серебра : ГОСТ 18293-72. Введен 01.01.1974.

63. Вода питьевая. Методы определения массовой концентрации меди : ГОСТ 4388-72. Введен 01.01.1974.

64. Мака К. W., Yanaseb H., Renneberga R. Cyanide fishing and cyanide detection in coral reef fish using chemical tests and biosensors // Biosens. Bioelectron. 2005. V. 20, p. 25812593.

65. Нефть. Определение углеводородов C1-C6 методом газовой хроматографии : ГОСТ 13379-82. Введен 01.07.1983.

66. Vedrine С., Leclerc J-C., Durrieu С., Tran-Minh С. Optical whole-cell biosensor using Chlorella vulgaris designed for monitoring herbicides // Biosens. Bioelectron. 2008 V. 181, p. 457-463.

67. Ivanova I., Groudeva V. Use of Selenastrum capricornutum growth inhibition test for testing toxicity of metal ions in soil and water // Biotechnol. Equipm. 2006. V. 20 (1), p. 179183.

68. Durrieu C., Tran-Minh J., Chovelon M., Barthet L., Chouteau C., Vedrine C., Algal biosensors for aquatic ecosystems monitoring II J. Appl. Phys. 2006. V.36 (11), p.205-209.

69. Nguyen-Ngoc H., Tran-Minh С. Fluorescent biosensor using whole cells in an inorganic translucent matrix II Anal ChimActa. 2007. V. 583,1. 1, p. 161-165.

70. Senger, H., Frickel-Faulstich, B. The regulation of electron flow in synchronized cultures of green algae // In: Avron, M. (Ed.), Proceedings of the Third International Congress on Photosynthesis.Elsevier, Rehovot, Israel. 1974. p. 715- 727.

71. Naessens M., Leclerc J. C., Tran-Minh C. Fiber optic biosensor using Chlorella vulgaris for determination of toxic compounds // Ecotoxicol. Environ. Safe. 2000. V. 46, p. 181

72. Method of detecting photosynthesis inhibition // Патент США №7333195, заявл. 25.06.2002, опубл. 18.02.2008.

73. Perrona М-С., Qiub В., Boucherc N., Bellemarec F., Juneau P. Use of chlorophyll a fluorescence to detect the effect of microcystins on photosynthesis and photosystem II energy fluxes of green algae // Toxicon. 2012. V. 59 (5), p. 567-577.

74. Rashkova G. D., Dobrikovaa A. G., Pounevab I. D., Misrac A. N., Apostolova E. L. Sensitivity of Chlorella vulgaris to herbicides. Possibility of using it as a biological receptor in biosensors // Sens, and Act. B: Chemical. 2012. V.161 (1), p. 151-155.

75. Krejci J., Ondruch V., Maly J., Stofik M., Krejcova D., Vranova H. High sensitivity biosensor measurement based on synchronous detection // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 2011. V. 102 (3), p. 192-199.

76. Кольман Я., Рём К.-Г. Наглядная биохимия // Москва : Мир. 2000, 469 е.

77. Rocchetta I., Ktipper Н. Chromium- and copper-induced inhibition of photosynthesis in Euglena gracilis analysed on the single-cell level by fluorescence kinetic microscopy // New Phytolog. 2009. V. 181, p. 405^120.

78. Faller P., Kienzler K., Krieger-Liszkay A. Mechanism of Cd2+ toxicity: Cd2+ inhibits photoactivation of Photosystem II by competitive binding to the essential Ca2+ site // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1706, p. 158- 164.

79. Baumann H. A., Morrison L., Stengel D. B. Metal accumulation and toxicity measured by РАМ—Chlorophyll fluorescence in seven species of marine macroalgae // Ecotoxicol. Environ. Safe. 2009. V. 72, p. 1063-1075.

80. Способ флуориметрического определения параметров фотосинтеза фотоавтотрофных организмов, устройство для его осуществления и измерительная камера // Патент РФ №2354958, заявл. 13.09.2006, опубл. 20.03.2008.

81. Burdin, К. S., Bird, К. Т., Heavy metal accumulation by carrageenan and agar producing algae // Bot. Mar. 1994. V. 37, p. 467-470.

82. Chen Y.-H. Immobilization of twelve bentic diatom species for long-term storage and feed for post-larval abalone Haliotis diversicolor II Aquacul. 2007. V. 263, p. 97-106.

83. Gaudin P., Lebeau Т., Robert J.-M. Microbial cell immobilization for long-term storage of marine diatom Haslea ostreariall J. Appl. Phycol. 2006. V.18, p. 175-184.

84. Gautier C., Livage J., Coadin Т., Lopes P. J., Sol-gel encapsulation extends diatom viability and reveals their silica dissolution capability // Chem. Comm. 2006.1. 44, p. 4611-4613.

85. Podola В., Nowack E. С. M., Melkonian M. The use of multiple-strain algal sensor chips for the detection and identification of volatile organic compounds // Biosens. Bioelectron. 2004. V.19, p. 1253-1260.

86. Nguen-Ngoc H., Durrieu C., Tran-Minh C. Synchronous-scan fluorescence of algal cells for toxicity assessment of heavy metals and herbicides // Ecotoxicol. Environmen. Saf. 2008. V.24, p. 199-129.

87. Pena-Vazques E., Maneiro E., Perez-Conde C., Moreno-Bondi M. C., Costas E. Microalgae fiber optic biosensors for herbicide monitoring using sol-gel technology // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 24, p. 3538-3543.

88. Tissue-based standoff biosensors for detecting chemical warfare agents // Патент США №6649417, заявл. 27.03.2001, опубл. 17.11.2003.

89. Rouillon R., Tocabens M., Carpentier R. A photoelectrochemical cell for detecting pollutant-induced effects on the activity of immobilized cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7942 II Enz. Microb. Technol. 1999. V.25(3-5), p. 230-235.

90. Avramescu A., Rouillon R., Carpentier R. Potential for use of a cyanobacterium Synechocystis sp. immobilized in poly(vinylalcohol): application to the detection of pollulants IIBiotechnol. Techniq. 1999. V.13,p. 559-562.

91. Ionescu R. E., Abu-Rabeah К., Cosnier S., Durrieu C., Chovelon J.-V., Marks R. S., Amperometric algal Chlorella vulgaris cell biosensors based on alginate and polypyrrole-alginate gels // Electroanal. 2006. N11, p. 1041-1046.

92. Frense D, Muller A. Beckmann D. Detection of environmental pollutants using optical biosensor with immobilized algae cells // Sens. Act. B-Chem. 1998. V. 51, p. 256-260.

93. Куц В.В., Аленина К.А., Сенько О.В., Ефременко Е.Н., Исмаилов А.Д. Биолюминесцентный мониторинг экотоксикантов (экологическая люминометрия) // Вода: химия и экология. 2011. № 10, с. 47-53.

94. Lopez-Roldan R., Kazlauskaite L., Ribo J., Riva M. С., González S., Cortina J. S. Evaluation of an automated luminescent bacteria assay for in situ aquatic toxicity determination // Sci. Total Environ. 2012. DOI: 10.1016/j.scitotenv.2012.05.043.

95. Gu M. B. Environmental Chemistry. Part VII. Environmental biosensors using bioluminescent bacteria // Springer Berlin Heidelberg. 2005. p. 691-698.

96. Badr С. E., Tannous B. A. Bioluminescence imaging: progress and applications // Trends in Biotech. 2011. V.29 (12), p. 624-633.

97. Karatani H., Konaka Т., Katsukawa Ch. Properties of the bimodal fluorescent protein produced by Photobacterium phosphoreum II Photochem. Photobiol. 2000. V. 71(2), p. 230-236.

98. Waters С. M., Bassler B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria И Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2005. V. 21. p. 319-346.

99. Куц В.В., Исмаилов А.Д. Физиологические и эмиссионные характеристики светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum из белого моря // Микробиол. 2009 Т. 78 (5), с. 612-617.

100. Nakamura Т., Matsuda К. Studies on Luciferase from Photobacterium phosphoreum I. Purification and physicochemical properties.//,/ Biochem. 1971. V. 70, p. 35-44.

101. Chatwell L., Illarionova V., Illarionov B. Eisenreich W., Huber R., Skerra A., Bache A., Fischer M. Structure of lumazine protein, an optical transponder of luminescent bacteria II J. Mol. Biol. 2008. V. 382 (1), p. 44-55.

102. Исмаилов А. Д. Светящиеся бактерии белого моря (физиологические и энергетические характеристики // Конференция, посвященная 70-летию Беломорской биологической станции им. Н. А. Перцова. 9-10 августа 2008. Доклад.

103. Ismailov A. D., Pogosyan S. I., Mitrofanova Т. I., Egorov N. S., and Netrusov A. I. Bacterial Bioluminescence Inhibition by Chlorophenols // Appl. Biochem. Micrbiol. 1999. V. 36 (4), p. 469-473.

104. Kudryasheva N. S. Mechanisms of the effect of xenobiotics on bacterial bioluminescence // Luminesc. 1999. V. 14, p. 199-200.

105. Kouts V. V., Il'ina Yu. M., Ismailov A. D., Netrusov A. I. Inhibitory Effects of Phenolic Ecotoxicants on Photobacteria at Various pH Values // Appl. Biochem. Micrbiol. 2005. V. 41 (6), p. 640-646.

106. Данилов В. С., Егоров Н. С. Мультиферментная модель бактериальной люциферазы // Биоорг. Хим. 1981. т. 7, № 11, с. 1605 1626.

107. Rani L., Basnet В., Kumar A. Mercury toxicity // Encyclopedia of Environ. Heal.2011. V. 3, p. 705-712.

108. Ren S., Frymier P. D. Kinetics of the toxicity of metals to luminescent bacteria // Adv. Environ. Res. 2003. V. 7, p. 537-547.

109. Kahru A., Tomson K., Pall Т., Kulm I. Study of toxicity of pesticides using luminescent bacteria Photobacterium phosphoreum II Wat. Sci. Tec. 1996. V. 33 (6), p. 147-154.

110. BRENDA The Comprehensive Enzyme Information System. EC 1.14.14.3 -alkanal monooxygenase (FMN) // URL: http://www.brenda-enzymes.info/php/resultflat.php4?ecno=l. 14.14.3 (дата обращения 07.04.2010)

111. Кацев A. M., Абдурманова Э. Р., Черный П. В. Использование иммобилизованных люминесцентных бактерий при биотестировании // Экспериментально-теоретические вопросы. 2007. Т.10 (3), с.153-156.

112. Makiguchi N., Arita М., Asai Y. Immobilization of a luminous bacterium and light intensity of luminous materials // J. Ferment. Technol. 1980. V.58 (1), p. 17-21.

113. Makiguchi N., Akita M., Asai Y. Optimal conditions for frozen storage of immobilized luminous bacteria// J. Ferment. Technol. 1980. V.58 (4), p. 333-337.

114. Sakaguchi Т., Morioka Y., Yamasaki M., Iwanaga J., Beppu K., Maeda H., Morita Y., Tamiya E. Rapid and onsite sensing system using luminous bacterial cells-immobilized chip II Biosens. Bioelectron. 2007. V.22, p. 1345-1350.

115. Chun U-H., Kim J-I., Yoo S-O, Lee H-J., Immobilization of Photobacterium phosphoreum for monitoring of toxic substances // Biotechnol. Bioproc. 1997. V. 2, p. 141-149.

116. Lee H. J., Villaume J., Cullen D. C., Kim В. C., Gu M. B. Monitoring and classification of PAH toxicity using an immobilized bioluminescent bacteria // Biosens. Bioelectron. 2003. V. 18, p. 571- 577.

117. Gu M.B., Chang S.T. Soil biosensor for the detection of PAH toxicity using an immobilized recombinant bacterium and a biosurfactant // Biosen. Bioelectron. 2001. V. 16, p. 667-674.

118. Ertesva, H., Valla, S. Biosynthesis and applications of alginates // Polym. Degrad. Stabil. 1998. V. 59, p. 85-91.

119. Senko О. V., Spiricheva О. V., Lozinsky V. I., Efremenko E. N. Immobilized biocatalyst for the treatment of fat-containing wastewaters of food industry enterprises // Catal. in Industry. 2007. №1, p.55-61.

120. Moreira S. M., Guilhermino, L., Ribeiro, R. Immobilization of the marine microalga Phaeodactylum tricornutum in alginate for in situ experiments: bead stability and suitability // Enz. Microb. Technol. 2006. V. 38, p. 135-141.

121. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // Москва : Изд-во Моск. Ун-та. 1994. 288 с.

122. Nguyen-Ngoc Н., Tran-Minh С. Sol-gel process for vegetal cell encapsulation // Mat. Sci. Eng. : C. 2007. V. 27 (4), p. 607-611.

123. Hashimoto S., Furukawa K., Hama H. Immobilization of activated sludge and its treatment capability II J. Jap. Sew. Works Ass. 1986. V. 23 (1), p. 16 22.

124. Евтюгин В.Г., Маргулис А.Б., Дамшкалн Л.Г., Лозинский В.И., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Сорбция микроорганизмов крупнопористыми агарозными криогелями, содержащими привитые алифатические цепи различной длины. // Микробиол. 2009. № 78 (5), с. 667-673.

125. Buenger D., Topuz F., Groll J. Hydrogels in sensing applications // Progr. in Polymer Sci. 2012, D01:10.1016/j.progpolymsci.2012.09.001.

126. Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Yen. Химии. 2002. Т 71 (6), с. 559-585.

127. Лозинский В.И. Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения полимерные криогели. // Изв. РАН, Сер. хим. 2008. №5, с. 996-1013.

128. Kokufuta E., Jinbo E. A hydrogel capable of facilitating polymer diffusion through the gel porosity and its application in enzyme immobilization // Macromol. 1992. V.25, p. 3549 -3552.

129. Urushizaki F., Yamaguchi Н., Nakamura К., Numajiri S. Swelling and mechanical properties of poly(vinyl alcohol) hydrogels // Int. J. Pharm. 1990. V. 58 (2), p. 135 142.

130. Trieu H. H., Qutubuddin S. Poly(vinyl alcohol) hydrogels. 1 .Microscopic structure by freeze-etching and critical point drying techniques // Colloid Pol. Sci. 1994. V. 272, p. 301 -309.

131. Lozinsky V. I., Plieva F. M. Poly(vinyl alcohol) cryogels employed as matrices for cell immobilization. 3. Overview of recent research and developments // Enzyme Microb. Technol. 1998. V. 23 (3 4), p. 227 - 242.

132. Plieva F. M., Galaev I. Yu., Noppe W., Mattiasson В., Cryogel applications in microbiology // Trends Microbiol. 2008. V.16 (11), p. 543-551.

133. Способ получения биокатализатора и биокатализатор для детоксикации фосфорорганических нейротоксичных соединений в проточных системах // Патент РФ №2315103, заявл. 21.06.2006, опубл. 20.01.2008.

134. Efremenko Е., Lyagin I., Gudkov D., Varfolomeyev S. Immobilized biocatalysts for detoxification of neurotoxic organophosphorus compounds // Biocatal. Biotrans. 2007. V. 25(2-4), p. 359-364.

135. Savina I. N., Mattiasson В., Galaev I. Yu. Graft polymerization of acrylic acid onto macroporous polyacrylamide gel (cryogel) initiated by potassium diperiodatocuprate // Polymer. 2005. V. 46, p. 9596-9603.

136. Guillard R. R. L., Ryther J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve II Can. J. Microbiol. 1962. V.8, p. 229-239

137. Prat S. Algarum, Hepaticarum, Muscorumque in culturis collectio // Prague, Preslia. 1948. XXII-XXIII, p.1-12.

138. Красовский Г. И., Филаретов Г. Ф. Планирование эксперимента // Минск : изд-воБГУ. 1982. 302 с.

139. Hubalek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms // Cryobiol. 2003. V. 46, p. 205-229.

140. Ефременко E. H., Татаринова H. Ю. Влияние длительного хранения клеток микроорганизмов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, на их выживаемость и биосинтез целевых метаболитов // Микробиол. 2007. Т. 76 (3), с.383-389.

141. Mortain-Bertrand A., Etchart F., Boucaud M.-Th. A method for the cryoconservation of Dunaliella salina (CHLOROPHYCEAE): effect of glycerol and cold adaptation // J. Phycol. 1996. V. 32, p.346-352.

142. Цоглин Jl. H., Габель Б. В., Фалькович Т. Н., Семененко В. Е. Фотобиореакторы закрытого типа для культивирования микроводорослей // Физиол. раст. 1996. Т. 43(1), с. 149- 155.

143. Mouget J.-L., Dakhama A., Lavoie М. С., de la Noue J. Algal growth enhancement by bacteria: is consumption of photosynthetic oxygen involved? // FEMS Microb. Ecol. 1995. V. 18 (1), p. 35-44.

144. Jones A. K., Bull А. Т., Slater J. K. Microbial interaction and communities. Vol. 1. The interaction of algae and bacteria // New York : Academic Press. 1982, p. 189-247.

145. Quinn P. J. The fluidity of cell membranes and its regulation. // Porg. Biophys. Mol. Biol. 1981. V. 38, p. 1-104.

146. Quinn, P.J. Effects of temperature on cell membranes // Symp. Soc. Exp. Biol. 1988. 42, p. 237-258.

147. Costello J. C. Chisholm S. W. The influence of cell size on the growth rate of Thalassiosira weissflogii II J. Plankt. Res. 1981. V. 3 (3), p. 415-419.

148. Ribo J. M., Kaiser K. L. E. Photobacterium phosphoreum toxicity bioassay. I. Test procedures and applications // Environ. Toxicol. 1987. V. 2 (3), p. 305-323.

149. Биосенсор на основе клеток микроводорослей для определения тяжелых металлов и гербицидов в водных системах // Патент РФ на изобретение №2426779, заявл. 13.11.2009, опубл. 20.08.2011.

150. Mosquito Control Mosquito Control US EPA // URL: http://www.epa.gov/mosquitocontrol/ (дата обращения 13.03.2011)

151. Edwards J. W., Lee S. G., Heath L. M., Pisaniello D. L. Worker exposure and a risk assessment of malathion and fenthion used in the control of Mediterranean fruit fly in South Australia // Environ. Res. 2007. V. 103 (1). p. 38^45.

152. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия: Учебник // М.: Медицина. 1990. 528 с.

153. Дьяконов И. А. Влияние иммобилизации в полисахаридные гранулы на функциональные свойства клеток животных. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук // Санкт-Петербург. 1993,18 с.

154. Рудковская Е. Е. Индуцированные полисахаридами изменения ионного транспорта через плазмалемму иммобилизованных растительных клеток. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук // Минск. 1998, 92 с.

155. Кафаров В. В. Методы кибернетики в химии и химической технологии // Москва : Москва. 1971. 492 с.

156. Кафаров В. В., Перлов В. Л., Мешалкин В. П. Принципы математического моделирования химико-технологических систем // Москва : Химия. 1974. 344 с.

157. Кафаров В. В., Дорохов И. Н., Липатов Л. Н. Системный анализ процессов химической технологии. Статистические методы идентификации процессов химической технологии // Москва : Наука. 1982. 334с.

158. Кнорре Д. Г., Эмануэль Н. М. Курс химической кинетики. 4-е издание // Москва : Высшая школа. 1984. 463 с.

159. Яблонский Г. С., Быков В. И., Горбань А. Н. Кинетические модели каталитических реакций // Новосибирск : Наука. 1983. 255 с.

160. День X. Экологическая катастрофа в Московской области // URL: http://the-day-x.i'u/ekologicheskaya-katastrofa-v-moskovskoi-oblasti.html (дата обращения 06.07.2012)

Информация о работе

Холстов, Александр Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.02

Диссертация

Разработка биочувствительных элементов в виде иммобилизованных клеток микроорганизмов для определения экотоксикантов в проточных водных системах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы