Перспективные штаммы бактерий - продуценты микробиопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике

Асатурова, Анжела Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Перспективные штаммы бактерий - продуценты микробиопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Перспективные штаммы бактерий - продуценты микробиопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике"

На правах рукописи

АСАТУРОВА АНЖЕЛА МИХАИЛОВНА

0034 <

ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ШТАММЫ БАКТЕРИЙ -ПРОДУЦЕНТЫ МИКРОБИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ВРЕДОНОСНОСТИ ФУЗАРИОЗА НА ПОДСОЛНЕЧНИКЕ

06.01.11 - Защита растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 1М0Л 2303

Санкт-Петербург - 2009

003471445

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте масличных культур имени B.C. Пустовойта Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии)

Научный руководитель: доктор биологических наук

Маслиенко Любовь Васильевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Смирнов Олег Всеволодович

кандидат биологических наук Быкова Галина Александровна

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состои тся « 18 » июня 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.015.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 196608, Санкт-Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3, факс (812)470-51-10, e-mail: vizrspb@mail333.com

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений.

Автореферат разослан « 15» мая 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Г.А.Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фитосанитарная нестабильность агробиоценозов, а также ухудшение общей экологической ситуации в регионах России требуют новых подходов в развитии и использовании средств и способов биологической защиты (Павлюшин, 1995). Необходимо более широко использовать весь арсенал экологизированной защиты растений, в том числе и микробиометод. Микробиологические препараты могут и уже становятся альтернативой пестицидам (Кандыбин, 2006). Кроме защитного эффекта, действующие агенты биопрепаратов способны восстанавливать и активизировать природные регуляторные механизмы в агробиоценозах. К достоинствам микробиологических средств защиты растений можно отнести специфичность действия, высокую экологичность. возможность решения проблемы резистентности популяций фитопатогенов к пестицидам.

В нашей стране, наряду с такими вредоносными болезнями подсолнечника, как белая, серая, пепельная гнили, ложная мучнистая роса, альтернариоз, вертициллез и фомопсис, все большее распространение получает фузариоз, вызывая корневые гнили всходов, трахеомикозные увядания растений, а также загнивание корзинок и семян (Маслиенко, Мурадасилова, 2000; Саукова, 2001; Антонова, 2002; Бородин, Котлярова, Терещенко, 2006). Отмечается, что при проявлении болезни после цветения и формирования семян потери урожая составляют 30,0-40,0 % (Вьгарицкий, Плахотник, Выприцкая, 2006). Решение проблемы защиты подсолнечника от фузариоза связано с разработкой комплекса эффективных мероприятий, включающего также и микробиологический метод. В нашей стране зарегистрированы и рекомендованы для защиты сельскохозяйственных культур от фузариозной корневой гнили биопрепараты на основе штаммов бактерий: планриз, агат-25К, псевдобактерин-2, алирин-Б, гамаир, фитоспорин-М, Елена, бактрил, бактофит, бисолбисан, бинорам (Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2008). За рубежом также существует ряд коммерческих биопрепаратов на основе бактериальных штаммов для защиты зерновых, овощных, бобовых и декоративных культур от возбудителей фузариоза (McSpadden Gardener, Fravel, 2002). Анализ мировой литературы выявил отсутствие данных по микробиологической защите подсолнечника от возбудителей фузариоза.

Поэтому в настоящее время является актуальным поиск и выделение высокоактивных штаммов бактерий-антагонистов с целью создания на их основе эффективных биофунгицидов комплексного действия для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике.

Цель и задачи исследований.

Цель настоящей работы - осуществить поиск, выделение и изучение эффективных и экологически безопасных бактериальных биоагентов - продуцентов биопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике.

В задачу исследований входило:

1. Осуществить поиск и скрининг выделенных штаммов бактерий по антагонистической, ростостимулирующей активности и защитному эффекту от возбудителей фузариоза.

2. Изучить биологические особенности, спектр и механизм антагонистического действия перспективных штаммов бактерий.

3. Оптимизировать процессы роста и развития перспективных штаммов бактерий-антагонистов.

4. Разработать элементы технологии производства микробиопрепаратов.

5. Установить совместимость штаммов бактерий-антагонистов с пестицидами, рекомендуемыми на подсолнечнике.

6. Разработать элементы технологии применения лабораторных образцов микробиопрепаратов и их комбинаций для защиты семян и вегетирующих растений подсолнечника от возбудителей фузариоза.

Научная новизна.

1. Впервые создана коллекция штаммов бактерий-аитагоиистов возбудителей фузариоза подсолнечника, перспективных для создания новых полифункциональных микробиопрепаратов.

2. В результате ступенчатого скрининга отобраны и идентифицированы новые перспективные штаммы бактерий Fa 4-1 Bacillus subtilis, D 7-1 Bacillus subtilis, Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens, Oif 2-1 Pseudomonas sp. для создания микробиопрепаратов полифункционального типа действия.

3. Выявлен широкий спектр антагонистического действия новых перспективных штаммов бактерий против основных возбудителей фузариоза и других патогенов подсолнечника.

4. Изучены механизмы действия новых штаммов антагонистов в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium.

5. Оптимизированы условия культивирования штаммов - продуцентов новых микробиопрепаратов.

6. Впервые установлена эффективность новых микробиопрепаратов и их комбинаций против возбудителей фузариоза и сохранетше урожая подсолнечника.

7. Определена совместимость новых микробиопрепаратов с пестицидами с целью применения в интегрированной системе защиты подсолнечника.

Научно-практическая значимость работы.

1. Создана коллекция перспективных штаммов бактерий-антагонистов родов Bacillus и Pseudomonas — продуцентов новых полифункциональных биопрепаратов для использования в сельскохозяйственной практике.

2. Разработаны элементы технологии производства и применения лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе перспективных биоагентов для защиты семян и вегетирующих растений в интегрированной системе защиты подсолнечника.

3. Инкрустирование семян подсолнечника микробиопрепаратами и их комбинациями на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза в лабораторных условиях в почве обеспечивало биологическую эффективность до 77,3 %, а в полевых условиях в зависимости от состояния популяции патогена и складывающихся погодных условий до 48,7 %, при эффективности эталона виннера -до 18,1 %. Величина сохраненного урожая от применения лабораторных образцов микробиопрепаратов составляла до 0,47 т/га.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на ежегодных методических комиссиях ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии по аттестации аспирантов (2005-2008 гг.); Международной научно-практической конференции «Технологии создания биологических средств защиты растений на основе энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом и закрытом фунтах», ВНИИБЗР, Краснодар, 2006 г.; VIII региональной научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», КубГАУ, Краснодар, 2006 г.; IV Международной конференции молодых ученых и специалистов: «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур», Краснодар, 2007 г.; IV Всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов: «Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах», Анапа, 2007 г.; Международной научно-практической конференции: «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине», Ростов-на-Дону, 2007 г.; I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», КубГАУ, Краснодар, 2007 г.; VI международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2008 г.; конференции получателей грантов регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «ЮГ», п. Агой, 2008 г.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 08-04-99010-р_офи и программы У.М.Н.И.К. Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, государственный контракт № 7967.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них одна в издании, рекомендуемом ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста и состоит из введения, семи глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений, содержит 21 таблицу, 35 рисунков. Список библиографических источников включает 227 наименований, в том числе 114 на иностранных языках.

Место проведения работы. Научно-исследовательская работа проводилась на центральной экспериментальной базе (ЦЭБ) Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур имени B.C. Пустовойта Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Краснодар) в период 2005-2008 гг.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Обзор литературы

Представлены сведения о распространении и вредоносности фузариоза на подсолнечнике. Приведены данные по практическому применению штаммов-антагонистов различных таксономических групп в качестве средств подавления возбудителей фузариоза различных сельскохозяйственных культур.

Рассмотрены механизмы биологического контроля фитопатогенных грибов рода Fusarium бактериями антагонистами. Собраны и представлены данные о

существующих в нашей стране и в мире микробиопрепаратах на основе бактерий-антагонистов для защиты растений от возбудителей фузариоза.

2. Условия и методы исследований

Объектом исследований являлись: штаммы бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза, тест-культуры возбудителей болезней подсолнечника, лабораторные образцы микробиопрепаратов и сорта подсолнечника — Р-453 и Бузулук.

Использованные в работе патогенные штаммы представителей рода Fusarium {F. oxysporum var. orthoceras (App. et Wr.) Bilai, F. sporotrichiella Bilai var. poae (Pk.) Wr. emend Bilai, F. semitectum Berk. et Rav., F. gibbosum App. et Wr. emend Bilai, F. javanicum Koord, F. solani (Mart.) App. et Wr. и F. moniliforme Sheld.), а также ряда других фитопатогенов, распространенных на подсолнечнике: Sclerotinia scleroíiorum (Lib.) dBy, Sclerotium bataticola Taub., Alternaría sp. Nees, Phomopsis helianthi Munt.-Cvet., Mihal. et Petr. и Verticillium dahliae Kleb. были взяты из коллекции микроорганизмов лаборатории биометода ВНИИМК.

Для выделения бактерий, проявляющих антагонизм в отношении патогенных фузариозных грибов, послужили образцы почв из центральной и предгорной зон Краснодарского края, центральной зоны республики Адыгея, а также из ризосферы, корней, семян больных и здоровых растений, листьев и растительных остатков подсолнечника, пораженных фузариозом. Для этого использовали методы: ловушек, почвенного разведения, обрастания почвенных комочков, последовательного отмывания корней, листьев и семян, прямой инокуляции различных частей растений подсолнечника (Ваксман, 1947; Новогрудский, 1956; Егоров, 1957; Кураков, 2001; Теппер, Шильникова, Переверзева, 2004; Марфенина, 2005).

Ступенчатый скрининг выделенных микроорганизмов включал: выявление антагонистической активности выделенных штаммов in vitro методом встречных культур (Егоров, 1957) на картофельно-сахарозном агаре (КСА) и среде Кинга В; оценку биологической эффективности отобранных штаммов на фоне искусственного заражения семян во влажной камере в лабораторных условиях (Зайчук, 1983); определение колонизирующей активности и защитного эффекта корней проростков подсолнечника (Антонова, Саукова, 2006); оценку активных штаммов бактерий-антагонистов на фитотоксичность и ростостимулирующую активность, а также полевые испытания.

Морфолого-культуральные признаки и физиологические свойства перспективных штаммов бактерий-антагонистов изучали по общепринятым методам (Градова, Бабусенко, Горнова, 2004; Теппер, Шильникова, Переверзева, 2004; Нетрусов и др., 2005). Подбор оптимальных искусственных питательных сред и условий культивирования на них перспективных штаммов бактерий-антагонистов проводили на жидких питательных средах (мясо-пептонный бульон (МПБ), Кинга В, Чапека для бактерий, пептон-дрожжевая, Тайлона 3).

Идентификацию перспективных штаммов бактерий-антагонистов проводили в Центре «Биоинженерия» РАН (г. Москва).

Антибиотическую активность штаммов определяли методом разведений (Егоров, 2004). Ферментативную активность штаммов бактерий-антагонистов устанавливали с использованием различных тестов (Лысак, Добровольская,

Скворцова, 2003; Недорезков, 2003). Механизм взаимодействия штаммов бактерий-антагонистов с возбудителями фузариоза изучали с помощью светового микроскопа «Биолам». Фотографирование и видеосъемку проводили цифровым фотоаппаратом по оригинальному методу.

Лабораторные образцы микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий были наработаны в лаборатории биометода ВНИИМК. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в жидкой культуре (ЖК) микробиопрепаратов определяли методом Коха (Нетрусов и др., 2005).

Совместимость микробиопрепаратов на основе штаммов бактерий-антагонистов с перспективными пестицидами определяли, используя модифицированный метод диффузии в агар (Егоров, 1957; Маслиенко, 1999).

Оценку биологической эффективности микробиопрепаратов на основе штаммов бактерий-антагонистов и их комбинаций проводили в лабораторных условиях на фоне искусственного заражения К охухропап гаг. оНИосегаз, а также в полевых (площадь делянки 28 м2, повторность трехкратная) и производственном (площадь делянки 1,36 га) опытах на естественном фоне поражения болезнями на ЦЭБ ВНИИМК и в Щербиновском районе Краснодарского края. Эффективность защитных мероприятий определяли сравнением данных учетов в контроле и в вариантах опытов по поражению растений болезнями и урожаю. Экономическую эффективность применения лабораторных образцов микробиопрепарагов на основе штаммов бактерий-антагонистов рассчитывали в лаборатории экономики ВНИИМК.

Математическую обработку опытных данных проводили с использованием статистических расчетов (Лакин, 1980) и стандартных компьютерных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3. Поиск и отбор штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза подсолнечника

3.1 Выделение штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза подсолнечника из природных источников

В результате выполнения работы по поиску антагонистов возбудителей фузариоза подсолнечника из различных источников в 2005 г. было выделено 425 штаммов бактерий (таблица 1).

Таблица 1 - Количество штаммов бактерий, выделенных из различных природных источников

Краснодарский край, республика Адыгея, 2005 г.

Источник выделения Количество выделенных штаммов, шт.

Ризосфера 292

Ризоплана 70

Растительные остатки 39

Листья 13

Семена 11

Всего 425

Максимальное количество бактерий выделено из ризосферы — 292 штамма, минимальное — из семян и листьев - 11-13 штаммов.

3.2 Первичный скрининг выделенных штаммов бактерий

При испытании антагонистической активности штаммов бактерий in vitro в качестве тест-объекта на начальном этапе скрининга был выбран патогенный и токсичный изолят F. sporolrichiella var. poae.

В результате проведения скрининга выделено 16 перспективных штаммов, из них только 3 бактериальных изолята выделены из корней здоровых растений, а остальные 13 — из пораженных фузариозом растений и других образцов растительного происхождения.

Впоследствии, среди этих 16 штаммов был проведен повторный скрининг к патогенному изоляту F. oxysporum var. orthoceras как наиболее распространенному виду возбудителей фузариоза подсолнечника В результате исследованные штаммы по механизму антагонистического действия на патогены разделили на две группы:

- штаммы, образующие стерильную зону антагонистического действия (таблица 2);

- штаммы, ингибирующие развитие патогенов, занимая большую площадь питательной среды чашки Петри (таблица 3).

Таблица 2 - Активность бактериальных штаммов, образующих стерильную зону антагонистического действия, в отношении грибов рода Fusarium ____Краснодар, ВНИИМК, 2005 г.

Штамм Диаметр зоны ингибирования, мм

F. sporotrichiella var. poae F. oxysporum var. orthoceras

инкубация, сутки инкубация, сутки

T 13"e V 13"e

Lf-1-l 22.7 ± 0,7 18,0 ± 1,2 21,0 ±2,1 13,0 ±0,6

Osrf 4-3 29,0 ±1,0 27,7 ±0,3 19,0 ±0,6 12,3 ±0,3

Osif 3-2 22,7 ± 1,5 22,7 ± 1,5 17,3 ± 0,3 13,0 ±0,6

Oif 2-1 18,0 ± 1,2 12,3 ± 0,9 17,7 ±0,3 10,7 ±0,7

Sgc-2 16,3 ± 1,3 13,7 ±0,3 19,7 ±0,7 16,3 ± 1.2

Sgrc-1 11,0 ± 1,0 5,0 ±0 20,3 ± 0,9 9,0 ± 0,6

Far-1 11,7 ±0,3 10,3 ± 0,7 19,7 ±0,9 14,3 ± 1,2

Таблица 3 - Активность бактериальных штаммов, ингибирующих развитие грибов рода Fusarium

_______Краснодар, ВНИИМК, 2005 г.

Штамм Рост мицелия патогена от посевного блока, мм

F. sporotrichiella var. poae F. oxysporum var. orthoceras

инкубация, сутки инкубация, сутки

V 13"е Т 13"е

Контроль 75,0 ± 0 75.0 ±0 75,0 ±0 75,0 ±0

Orf 1 7,3 ± 0,3 11,0 ±0,6 10,7 ± 1,8 19,7 ±2,6

D 1-1 10,3 ± 1,9 11,3 ± 1,9 11,0 ± 1,0 19,3 ± 1,9

П 1-3 7,0 ±2,1 7,7 ± 1,8 19,3 ± 2,3 23,0 ±4,0

D 7-1 17,7 ±0,7 27,3 ± 1,2 18,7 ±0,7 26,7 ±0,9

D 10 17.7 ± 1,2 23,0 ± 1,2 22,0 ±0 34,7 ± 2,3

Fa 4-1 15,7 ±0,3 18,7 ±2,0 16,3 ± 1,9 22,7 ± 1,5

Fa 4-2 20,0 ± 1,2 23,3 ± 3,5 22,7 ± 2,7 27,0 ± 1,5

Far 8 19,7 ±0,7 24,3 ± 1.8 28,0 ±0 30,7 ± 0,7

Fz 9 18,7 ± 1,7 22,3 ± 1,3 19,3 ±0,7 30,0 ± 1,2

Исследование активных штаммов на возможное патогенное или токсичное действие на культуру подсолнечника проводили методом замачивания семян и проростков подсолнечника с подрезанной корневой системой в бактериальной суспензии. Анализ данных показал, что тестируемые штаммы не оказывали негативного влияния на энергию прорастания и всхожесть семян, а также не вызывали увядания проростков подсолнечника.

Известно, что успешный биоагент должен обеспечивать не только защитный эффект, но и стимулирующее действие на рост и развитие растения. Параметрами для анализа служили длина и масса корня и побега.

Существенное увеличение длины корня и побега было отмечено лишь в отдельных вариантах, но при этом практически все исследуемые штаммы увеличивали массу корня на 41,2-100 % и массу побега - на 31,6-55,3 %, за исключением штамма С^Г3-2 (таблица 4).

Таблица 4 - Влияние активных штаммов бактерий-антагонистов на рост и развитие проростков подсолнечника сорта Р-453

__ Краснодар, ВНИИМК, 2006 г

Вариант Масса корня Масса побега

г в % к контролю г в % к контролю

Контроль 0,17 - 0,38 -

Lf-1-l 0,28 64,7 0,52 36,8

Osrf 4-3 0,27 58,8 0,51 34,2

Osif 3-2 0,18 5.9 0,39 2.6

Oif 2-1 0.30 76.5 0,59 55,3

Sgc-2 0,27 58,8 0,58 52,6

Sgrc-1 0,26 52,9 0,55 44,7

Far-1 0,25 47,1 0,53 39,5

Orf 1 0,27 58,8 0,54 42,1

D 1-1 0.25 47,1 0,52 36.8

D 1-3 0,28 64,7 0,53 39,5

D 7-1 0,31 82,4 0,56 47,4

D 10 0,25 47,1 0,50 31,6

Fa 4-1 0.29 70,6 0,57 50,0

Fa 4-2 0,29 70,6 0,54 42,1

Far 8 0,34 100 0,58 52,6

Fz 9 0,24 41,2 0,50 31,6

HCP„5 0,06 0,07

Существенное увеличение массы корня проростков происходило за счет интенсивного развития боковых корней у основания и/или по всей длине главного корня.

3.3 Вторичный скрининг выделенных штаммов бактерий

Важным аспектом при отборе потенциальных биоагентов — продуцентов биопрепаратов является не только проявление антифунгальной активности in vitro, способности оказывать положительное влияние на рост и развитие культуры, но и обеспечивать эффективную защиту семян и растений в лабораторных и полевых условиях.

Вторичный скрининг был проведен на фоне искусственного заражения семян подсолнечника сорта Р-453 патогенным микромицетом F. sporotrichiella var. роае методом агаровых блоков в лабораторных условиях. При этом для каждого варианта апробировали различные нормы расхода ЖК: 2,0, 3,0 и 4,0 л/т. На фоне поражения фузариозом в контроле 92,3 % биологическая эффективность лучших вариантов (Osif 3-2, Sgrc-1, Oif 2-1, Fa 4-1, D 7-1 и Far-1) из шестнадцати испытанных, составила от 21,7 до 36,1 %. При этом максимальный защитный эффект был получен с нормой расхода 2,0-3,0 л/т.

Эффективность биологического агента во многом определяется не только его способностью обеспечивать защиту семян, но и колонизировать растущий корень, это особенно важно в случае биоконтроля почвенных патогенов, вызывающих корневые гнили.

Для выявления защитного эффекта проростков подсолнечника посредством колонизации активными штаммами корней, двухдневные проростки подсолнечника, полученные при проращивании семян, обработанных ЖК биопрепаратов, размещали в отверстиях перфорированной чашки Петри так, чтобы кончики корней касались колонии патогенного изолята. Высокая колонизирующая активность корня и одновременно защитный эффект на жестком фоне заражения F. sporotrichiella var. роае выявлена при обработке семян ЖК штаммов Osif 3-2, Oif 2-1, Sgrc-1, Fa 4-1 и D 7-1 (таблица 5).

Таблица 5 - Влияние обработки семян подсолнечника сорта Р-453 жидкой культурой бактериальных штаммов на степень поражения проростков, на фоне искусственного заражения F. sporotrichiella var. роае

Краснодар, ВНИИМК, 2006 г.

Вариант Поражено проростков, %

степень повреждения главного корня, баллы

0 1 2 3 4 5 6

Контроль без инфекции 100 - - - - - -

Контроль с инфекцией (F. sporotrichiella var. роае) 0,8 8,3 11,7 20,0 38,3 19,2 0,8

F. sporotrichiella var. роае + Osrf 4-3 5,0 30,0 25,0 25,0 15,0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Osif 3-2 0 40,0 25,0 25,0 0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Oif 2-1 0 45,0 45,0 10,0 0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Sgc-2 5,0 35,0 35,0 15,0 10,0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Sgrc-1 5,0 45,0 20,0 30,0 0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Far-1 5,0 10,0 20,0 65,0 0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Orf 1 5,0 25,0 10,0 50,0 10,0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + D 1-1 15,0 25,0 30,0 20,0 10,0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + D 1-3 15,0 30,0 25,0 0 30,0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + D 7-1 0 50,0 35,0 15,0 0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + D 10 0 40,0 25,0 15,0 20,0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Fa 4-1 0 45,0 20,0 20,0 15,0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Fa 4-2 5,0 20,0 15,0 25,0 35,0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Far 8 0 10,0 40,0 40,0 10,0 0 0

F. sporotrichiella var. poae + Fz 9 0 15,0 40,0 40,0 5,0 0 0

Примечание:

1-3 балла — жизнеспособные проростки; 4-6 балла - нежизнеспособные проростки.

В этих вариантах большая часть проростков оказалась жизнеспособна, тогда как в контроле до 58,3 % проростков были нежизнеспособны.

Принимая во внимание положение о том, что успешный биоагент должен обладать комплексом положительных свойств на растение (Воронин, 1998; Штерншис и др., 2003), мы объединили весь спектр полученных экспериментальных данных по скринингу активных штаммов бактерий-антагонистов (рис. 1).

*»/== I IlllllJnJl

ЯнМ.

У ///// S ^ ^ О W* ^ /

^ о о

Рисунок 1 - Защитный эффект и ростостимулирующее действие перспективных штаммов бактерий-антагонистов при обработке семян подсолнечника сорта Р-453 (2005-2006 гг.)

П - Защитный эффект бактериальных штаммов прорастающего семени на фоне искусственного заражения F. sporotrichiella var. роае (количество здоровых растений); И - Защитный эффект и колонизирующая активность штаммов бактерий проростков подсолнечника на фоне искусственного заражения F. sporotrichiella var. роае (количество жизнеспособных растений); □ - Ростостимулирующее действие (увеличение массы корня).

В результате анализа полученных данных для дальнейшей работы в качестве основы биопрепаратов нами были отобраны штаммы Oif 2-1 и Sgrc-1, относящиеся к флюоресцирующим представителям рода Pseudomonas, а также штаммы Fa 4-1 и D 7-1, относящиеся к роду Bacillus, обеспечивающие на жестком фоне искусственного заражения возбудителями фузариоза эффективную защиту семян и проростков подсолнечника, активно колонизирующие корень и оказывающие ростостимулирующее действие на культуру подсолнечника (увеличение массы корня на 52,9-82,4 %, массы побега - на 44,7-55,3 %).

Отобранные штаммы и их комбинации испытывались на фоне искусственного заражения F. oxysporum var. orthoceras в почве, так как способность обеспечивать защиту от патогенов на ранних этапах вегетации растений является важным критерием эффективности действия биоагентов против корневых гнилей (таблица 6).

Таблица 6 - Защитный эффект обработки семян подсолнечника сорта Р-453 микробиопрепаратами на основе штаммов бактерий-антагонистов на фоне искусственного заражения К охузрогит \аг. ог:Иосегах в лабораторных условиях в почве

Краснодар, ВНИИМК 2006-2007 гг

Вариант Всхожесть, % Поражено фуза-риозом, % Биологическая Средняя масса, г

эффективность, % побега корня

Контроль без инфекции 97,8 2,2 - 0,91 0,18

Контроль с инфекцией (F. oxysporum var. orthoceras) 66,7 55,0 - 1,00 0,07

F. oxysporum var. orthoceras + Fa 4-1, ЖК 87,8 24,9 54,7 1,20 0,12

F. oxysporum var. orthoceras + D 7-1, ЖК 71,1 46,1 16,2 1,12 0,08

F. oxysporum var. orthoceras + Sgrc-1, ЖК 77,8 33,6 38,9 1,13 0,10

F. oxysporum var. orthoceras + Oif 2-1, ЖК 90,0 12,5 77,3 1,35 0,16

F. oxysporum var. orthoceras + Fa 4-1 + D 7-1, ЖК 73,3 34,3 37,6 1,20 0,11

F. oxysporum var. orthoceras+Fa 4-1 + Sgrc-1, ЖК 71,1 47,7 13,3 0,11

F. oxysporum var. orthoceras + D 7-1 + Sgrc-1, ЖК 78,9 26,7 51,5 1,11 0,10

F. oxysporum var. orthoceras+Sgrc-1 + Oif 2-1, ЖК 71,1 39,8 27,6 1,13 0,13

HCPos 0,13 0,05

Анализ полученных данных выявил перспективный биоагент Oif 2-1, проявивший максимальную биологическую эффективность - 77,3 %. В этом варианте даже средняя масса корня растений подсолнечника на фоне заражения патогеном существенно не отличалась от массы корня в контроле без внесения инфекции: 0,16 и 0,18 г соответственно. Хорошая биологическая эффективность отмечена в вариантах со штаммами Fa 4-1 (54,7 %), Sgrc-1 (38,9 %) и сочетания штаммов D 7-1 + Sgrc-1 (51,5 %) и Fa 4-1 + D 7-1 (37,6 %).

4. Изучение новых штаммов бактерий-антагонистов

Основываясь на данных генетической идентификации, проведенной в центре «Биоинженерия» РАН Кузнецовым Б.Б., штаммы Fa 4-1 и D 7-1 отнесены к виду Bacillus subtilis, штамм Sgrc-1 - к Pseudomonas fluorescens, штамм Oif 2-1 - к Pseudomonas sp. Штаммы депонированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского института защиты растений (ВИЗР).

4.1 Морфолого-культуральная характеристика перспективных штаммов бактерий-антагонистов

Морфолого-культуральные признаки штаммов бактерий-антагонистов рода Bacillus

Клетки палочковидные с закругленными концами, подвижные, одиночные или соединены в цепочки. Размеры у штамма Fa 4-1 В. subtilis 0,8-1,0 х 2,2-3,0 мкм, у штамма D 7-1 В. subtilis - 0,5-0,8 х 1,8-2,8 мкм. Имеются споры, расположенные в клетке не строго центрально. Окраска по Граму положительная.

Культуральные признаки штаммов бацилл-антагонистов изучали на двух средах: мясо-пептонном агаре (МПА) и КСА. На МПА форма колоний круглая с фестончатым краем, поверхность гладкая, край волнистый. Колонии срастающиеся с агаром, блестящие в центре и бархатистые по краю, бесцветные. Структура колоний мелкозернистая, консистенция сухая. Диаметр колоний на вторые сутки инкубации 13 мм у штамма Fa 4-1 В. subtilis и 1-5 мм у штамма D 7-1 В. subtilis. На КСА у штамма Fa 4-1 В. subtilis формируются колонии ризоидной формы с лопастным или неправильным краем, тогда как у штамма D 7-1 В. subtilis колонии круглые с фестончатым краем или ризоидные, край колоний зубчато-лопастной. Колонии так же, как и на МПА, срастающиеся с агаром, блестящие в центре и бархатистые по краю, бесцветные. Структура колоний струйчатая, консистенция сухая. Диаметр колоний на вторые сутки инкубации у обоих штаммов 3-9 мм.

Морфолого-культуральные признаки штаммов бактерий-антагонистов рода Pseudomonas

Клетки палочковидные, подвижные, одиночные или соединены попарно. Размеры у штамма Sgrc-1 Р. fluorescens 0,4-0,7 х 1,4-3,1 мкм, у штамма Oif 2-1 Pseudomonas sp. - 0,4-0,7 х 1,7-3,0 мкм. Споры отсутствуют. Окраска по Граму отрицательная.

Культуральные признаки псевдомонад изучали на МПА и среде Кинга В. На этих средах форма колоний круглая, поверхность гладкая. Профиль колоний выпуклый, край на МПА гладкий, на среде Кинга В - гладкий, реже волнистый. Колонии блестящие, просвечивающиеся, пигментированные (желто-зеленый флюоресцирующий пигмент, диффундирующий в среду). Структура колоний однородная, консистенция слизистая. Диаметр колоний на вторые сутки инкубации у обоих штаммов на МПА 1-5 мм; на среде Кинга В - 2-6 мм.

4.2 Физиологические признаки перспективных штаммов бактерий-антагонистов

Разработка микробиопрепаратов комплексного действия предусматривает изучение основных параметров культивирования перспективных штаммов бактерий-антагонистов. Для этого были изучены физиологические признаки перспективных биоагентов: температура культивирования и реакция среды, источники углеродного и азотного питания.

Установлен температурный оптимум для культивирования перспективных штаммов: Fa 4-1 В. subtilis - 30,0-35,0 °С, D 7-1 В. subtilis - 30,0 °С, Sgrc-1 Р. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - 20,0-25,0 °С. Существенным достоинством псевдомонад по сравнению с бациллярными штаммами была способность к активному росту при более низких температурах. Несмотря на то, что титр клеток оставался высоким вне зависимости от температурного режима, повышение температуры культивирования до 30,0-35,0 °С приводило к появлению клеток с отсутствием желто-зеленого внеклеточного пигмента, что связано с потерей клетками антифунгальной активности (Свешникова, 2003).

Определен оптимум pH для выращивания перспективных штаммов: D 7-1 В. subtilis - 6,0-7,0, Fa 4-1 В. subtilis, Sgrc-1 Р. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. -6,0-8,0. Установлены оптимальные источники углерода: для всех исследуемых

штаммов - глюкоза, сахароза, меласса, а для представителей рода Pseudomonas еще и глицерин. Оптимальным источииком азота для всех перспективных биоагентов был азотнокислый натрий, для штамма Fa 4-1 В. subtilis также пептон и кукурузный экстракт, для D 7-1 В. subtilis - дрожжевой и кукурузный экстракты, а для штаммов Sgrc-1 Р. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - пептон и дрожжевой экстракт.

Полученные экспериментальные данные использованы для разработки элементов технологии производства микробиопрепаратов комплексного действия на основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов с высокой антифунгальной и ростостимулирующей активностью.

4.3 Спектр антагонистической активности перспективных штаммов бактерий в отношении основных фитопатогенных грибов, распространенных на подсолнечнике

Установлено, что штаммы бацилл-антагонистов активно подавляют in vitro развитие широкого круга фитопатогенных представителей рода Fusarium, в числе которых F. oxysporum var. orthoceras, F. sporotrichiella var. poae, F. semitectum, F. gibbosum, F. javanicum, F. solani и F. moniliforme. Тогда как бактериальные штаммы флюоресцирующих представителей рода Pseudomonas интенсивно подавляют рост F. oxysporum var. orthoceras, F. sporotrichiella var. poae и F. gibbosum, оказывая ингибирующее действие на развитие других видов фузариев, распространенных на подсолнечнике. Кроме того, все исследуемые штаммы бактерий оказывают антифунгалыюе действие на ряд других фитопатогенов, распространенных на подсолнечнике: Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium bataticola, Alternaria sp., Phomopsis helianthi и Verticillium dahliae.

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод о широком спектре действия исследуемых перспективных штаммов в отношении ряда фитопатогенов, распространенных на подсолнечнике.

5. Механизмы антагонистического действия перспективных бактерий на фитопатогепные грибы рода Fusarium

5.1 Антибиотическая активность перспективных штаммов бактерий-антагонистов

Механизмы антагонистических взаимодействий бактерий и грибных фитопатогенов весьма различны. Для выявления возможных механизмов антагонистических взаимодействий бактерий с грибами рода Fusarium была изучена их антибиотическая активность. Пробы для анализа ЖК брали через 8, 16, 24, 36, 48 и 72 ч от начала культивирования. В качестве тест-объекта был выбран изолят F. oxysporum var. orthoceras.

Установлено, что максимальное накопление антибиотических веществ для всех исследуемых штаммов происходит к 48-72 ч периодического культивирования. При этом отмечено не только замедление скорости роста тест-культуры микромицета, но и отсутствие формирования воздушного мицелия и специфической окраски, а также рост тонкого, паутинистого субстратного мицелия, тогда как в контроле без добавления стерильной культуральной жидкости наблюдался нормальный рост и развитие мицелия патогенного гриба.

5.2 Ферментативная активность перспективных штаммов бактерий-антагонистов С целью анализа возможных механизмов антифунгальной активности бактерий мы также изучили их способность продуцировать гидролитические ферменты, так как миколитическая активность является одним из важнейших типов антагонизма бактерий к почвенным микромицетам (таблица 7).

Таблица 7 - Продуцирование штаммами бактерий-антагонистов гидролитических ферментов

Краснодар, ВНИИМК. 2006 г.

Штаммы Ферменты

Протеаза Липаза Хитин аза

Fa 4-1 В. subtilis +++ ++ ++

D 7-1 В. subti!is +++ + ++

Sgrc-1 P.fluorescens + +++ -

Oif 2-1 Pseudomonas sp. ++ +++ -

Примечание:

- отсутствие активности; ++ средняя активность;

+ слабая активность; +++ сильная активность.

У штаммов бацилл-антагонистов обнаружена способность к синтезу всех трехгрупп ферментов, наиболее активными из которых оказались протеазы. Тогда как у бактерий рода Pseudomonas не выявлен синтез хитипаз, однако, обнаружен активный синтез липолитических ферментов. Важно отметить, что обязательным условием эффективного лизиса патогенных грибов и/или использования грибного мицелия как источника питания связано с комплексным действием различных гидролитических ферментов (Кравченко и др., 2002).

5.3 Взаимодействие перспективных штаммов бактерий-антагонистов с фитопатогенными грибами рода Fusarium

При изучении механизма взаимодействия перспективных штаммов бактерий-антагонистов с грибами рода Fusarium в качестве тест-объекта был выбран изолят F. oxysporum var. orthoceras.

Штаммы бацилл-алтагонистов при совместной инкубации проявляли положительный таксис в отношении F. oxysporum var. orthoceras. Уже на первые сутки совместной инкубации отмечалось образование сферопластов (шарообразных вздутий апикальных частей гиф) и в некоторых случаях их разрыв с выходом содержимого (рис. 2, А) Непосредственный контакт между антагонистом и патогеном зафиксирован нами на вторые сутки инкубации. При этом сорбция бактерий на поверхности гиф приводила к разрушению клеточных стенок in situ с последующим лизисом и растворением мицелия (рис. 2, В), а также индуцировала вакуолизацию и сжатие цитоплазмы. Уже к 48-60 ч инкубации отмечалось массовое формирование конидий фузария, что объясняется явными неблагоприятными условиями среды для патогена. При этом в контроле без антагониста наблюдался нормальный рост культуры гриба и начало спорообразования (рис. 2, D). К концу совместной инкубации отмечалось разрушение не только отдельных клеток гиф, но и полная деградация мицелия и конидий патогена, обнаруживались только следы субстратного и высохший воздушный мицелий фузария (рис. 2, С).

При совместной инкубации штаммов псевдомонад с F. oxysporum var. orthoceras уже на первые-вторые сутки культивирования была выявлена задержка удлинения апекса гиф и впоследствии массовое образование раздвоенных уродливых вздутий апекса (рис. 3, А). К третьим суткам культивирования отмечалась агрегация мицелия в тяжи, а в непосредственной близости к колонии бактерии происходил интенсивный лизис и деградация мицелия патогенного гриба (рис. 3, В). К седьмым суткам совместной инкубации наблюдалось формирование одиночных интеркалярных хламидоспор, многочисленных клеток хламидоспорового типа и клеток-гигантов. К концу совместного культивирования в зоне взаимодействия антагониста и патогена отмечено полное лизирование субстратного и высыхание воздушного мицелия фузария (рис. 3, С). В контроле без антагониста наблюдался нормальный рост и развитие культуры гриба (рис. 3, D).

Таким образом, механизмы действия для всех исследуемых штаммов-антагонистов в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium включают синтез антибиотических веществ и миколитических ферментов, а для бактерий рода Bacillus еще и конкуренцию за питательные вещества вследствие быстрой динамики роста. При этом у бациллярных антагонистов отмечена способность разрушать клеточную стенку патогенного гриба при непосредственном контакте. Гибель мицелия F. oxysporum var. orthoceras при совместном культивировании с бациллами-антагонистами наступала на пятые-седьмые, а с представителями рода Pseudomonas — на седьмые-девятые сутки.

6. Разработка элементов технологии производства лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов

6.1 Подбор оптимальных питательных сред для культивирования штаммов бактерий-антагонистов

Все штаммы получили хорошее развитие на МПБ, среде Чапека для бактерий и пептон-дрожжевой среде, тогда как представители рода Pseudomonas также на среде Кинга В, а бактерии рода Bacillus - на среде Тайлона 3. Таким образом, все указанные среды содержат необходимые для развития микроорганизмов элементы питания и в наиболее доступной для их утилизации форме, что и показал титр ЖК: 1,2-1,8x109 КОЕ/мл для бациллярных штаммов, 1,6-9,7x1012 КОЕ/мл для псевдомонад.

6.2 Кинетика роста штаммов бактерий-антагонистов при периодическом культивировании

Установлено, что исследуемые штаммы при периодическом культивировании претерпевают значительные изменения в течение всего периода роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среды и быстрой реакцией на них бактериальных клеток. Пробы для анализа ЖК брали через 8, 16, 24, 36, 48, 72 и 96 ч от начала культивирования. Изучение динамики роста перспективных штаммов бактерий-антагонистов показало, что оптимальными сроками культивирования как для бациллярных штаммов Fa 4-1 В. subtilis и D 7-1 В. subtilis (5,7x1010 -2,5x10й КОЕ/мл), так и для флюоресцирующих псевдомонад Sgrc-1 Р. fluorescens и Oif2-l Pseudomonas sp. (1,3 - 9,7х1012 КОЕ/мл) являются 36-48 ч.

Рисунок 2 - Мицелий возбудителя фузариоза К охузрогит уаг. опИосегаэ (ориг.)

А - разрыв сферопласта патогена с выходом содержимого (1) на первые сутки

инкубации с Б 7-1 В. $иЫШя\ В - сорбция бактерии Б 7-1 В. .чиЫШ.ч на поверхности гиф патогена (1) и их

разрушение (2) на вторые сутки инкубации; С - полная деградация субстратного мицелия (1) и высохший воздушный мицелий

патогена (2) на седьмые сутки инкубации с Б 7-1 В. эиЫШз', Б - контроль (без антагониста): нормальный рост и спорообразование (1) культуры гриба К охуврогит \аг. оПкосегая.

Рисунок 3 - Мицелий возбудителя фузариоза F. oxysporum var. orthoceras (ориг.)

А - нехарактерное ветвление гиф патогена (1) на вторые сутки инкубации с Oif 2-1 Pseudomonas sp.;

В - лизис и выход содержимого по всей длине гифы патогена (1) на третьи сутки инкубации с Oif 2-1 Pseudomonas sp.;

С - высохший воздушный мицелий F. oxysporum var. orthoceras (1) на десятые сутки инкубации с Oif 2-1 Pseudomonas sp.;

D - контроль (без антагониста): нормальный рост и спорообразование (1) культуры гриба F. oxysporum var. orthoceras.

6.3 Хранение лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов бактерий-антагонистов в препаративной форме ЖК

Чувствительность микроорганизмов к условиям хранения вызывает необходимость проведения исследований с целью изучения жизнеспособности и активности штаммов-антагонистов при различных способах поддержания культур в лабораторных условиях. Подобные исследования являются актуальными и с точки зрения разработки элементов технологии производства микробиопрепаратов на основе микробов-антагонистов, одним из недостатков которых является непродолжительный срок хранения (Недорезков, 2003; Свешникова, 2003; Маслиенко, 2005; Новикова, 2005; Коломбет, 2006; Шипиевская, 2006). Поэтому нами изучалась жизнеспособность перспективных штаммов бактерий-антагонистов в ЖК в качестве одной из возможных и наиболее технологичных препаративных форм биопрепаратов (Штерншис и др., 2003). При этом влияние срока хранения на жизнеспособность бактериальных клеток изучалось в условиях переменных и пониженных температур, с доступом и без доступа воздуха.

Анализ опытных данных показал, что лабораторные образцы микробиопрепаратов в препаративной форме ЖК на основе штаммов бацилл-антагонистов возможно хранить в течение девяти месяцев, а флюоресцирующих псевдомонад - шести месяцев как при переменных, так и при пониженных температурах без введения каких-либо питательных добавок и стабилизаторов. Следует подчеркнуть, что к концу периода хранения титр и активность ЖК снизились, но сохранялись на достаточно высоком уровне и к концу срока хранения титр составил 4,6х108- 3,ЗхЮ9КОЕ/мл для бацилл-антагонистов и 5,ОхЮ10-9,6x10 КОЕ/мл для псевдомонад, а это является дешевым и вполне технологичным способом с точки зрения использования препарата в течение одного полевого сезона.

7. Разработка элементов технологии применения лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов

7.1 Совместимость микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов с пестицидами, рекомендованными для применения на подсолнечнике

Установлено, что все штаммы-продуценты биопрепаратов совместимы с инсектицидами, рекомендуемыми в настоящее время для обработки семян подсолнечника против проволочников: круйзер, КС, (тиаметоксам, 350 г/л), семафор, ТПС, (бифентрин, 200 г/л) и командор, ВРК, (имидаклоприд, 200 г/л).

Биопрепараты на основе псевдомонад оказались совместимы со следующим рядом перспективных фунгицидов: апрон голд, ВЭ (мефеноксам, 350 г/л); ровраль, СП (ипродион, 500 г/кг); ТМТД, ТПС (тирам, 400 г/л); винцит, СК (тиабендазол + флутриафол, 25+25 г/л); альбит, ТПС (поли-бета-гидроксимасляная кислота + магний сернокислый + калий фосфорнокислый + калий азотнокислый + карбамид, 6,2+29,8+91,1+91,2+181,5 г/кг); максим, КС (флудиоксонил, 25 г/л); виннер, СК (тиабендазол+флутриафол, 25+25 г/л) и раксил, КС (тебуконазол, 60 г/л).

Микробиопрепараты на основе бациллярных штаммов были также совместимы с указанными фунгицидами, за исключением препаратов винцит, CK (тиабендазол + флутриафол, 25+25 г/л) и виннер, CK (тиабендазол + флутриафол, 25+25 г/л), которые существенно задерживали рост бацилл, что исключает их совместное применение. Препараты ровраль, СП (ипродион, 500 г/кг) и ТМТД, ТПС (тирам, 400 г/л) оказывали незначительное ингибирующее действие на бациллярные штаммы.

Таким образом, установлена совместимость новых микробиопрепаратов с рядом пестицидов, что позволяет применять их в сложных композиционных составах для протравливания семян и обработки вегетирующих растений подсолнечника с целью защиты их от комплекса вредителей и болезней.

7.2 Определение эффективности применения лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов на фоне естественного поражения фузариозом в полевых условиях

Полевые испытания лабораторных образцов биопрепаратов в центральной зоне Краснодарского края в 2006-2008 гг. показали зависимость биологической эффективности от величины запаса инфекционного начала болезни и от складывающихся погодных условий в период вегетации. Оценивалась эффективность композиций на основе не только одного штамма, но и смеси из двух, трех и четырех перспективных штаммов-антагонистов в различных комбинациях. Проводили как обработку семян, так и комплексную обработку семян и вегетирующих растений, титр микробиопрепаратов составлял 109"12 КОЕ/мл. Лучшие варианты опыта представлены в таблице 8.

Так, па низком фоне поражения фузариозом со степенью 3 балла в 2006 г. (15,2 %) и при достаточном запасе влаги в первой половине вегетации, но недостатке влаги к концу периода вегетации максимальная биологическая эффективность отмечена при обработке семян композицией на основе бацилл-антагонистов (Fa 4-1 В. subtilis и D 7-1 В. subtilis) — 25,7 и 48,7 %, при нулевой эффективности композиции на основе виннера и 17,1 % - на основе раксила.

На среднем фоне поражения фузариозом в 2007 г. (37,1 %) и при дефиците влаги на протяжении практически всего периода вегетации биологическая эффективность обработки семян биопрепаратами и их смесями лучших вариантов составила от 18,3 до 25,9 %, при эффективности эталона виннера 18,1 % и раксила - 22,9 %.

На низком фоне поражения фузариозом в 2008 г. (11,7 %) и при благоприятных условиях в вегетационный период, максимальная эффективность установлена при инкрустировании семян композицией на основе монокультуры бациллы D 7-1 В. subtilis (30,8 %) и смеси бациллы D 7-1 В. subtilis и псевдомонады Oif 2-1 Pseudomonas sp. (40,2 %), при нулевой эффективности эталона виннера и 28,2 % -раксила.

Существенный дополнительный урожай при обработке семян подсолнечника композициями на основе микробиопрепаратов был получен во все годы испытаний от 0,14 до 0,36 т/га. Дополнительный урожай при обработке эталоном виннером был получен лишь в 2006 г. - 0,13 т/га.

Таблица 8 - Эффективность обработки семян и вегетирующих растений подсолнечника сорта Р-453 композициями на основе микробиопрепаратов против возбудителей фузариоза в полевых условиях

Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2006-2008 гг

Вариант Биологическая эффективность, против фузариоза, %, по годам Урожайность, т/га, по годам Дополнительный урожай, т/га, по годам

2006 2007 2008 2006Н 2007 2008 2006 2007 2008

Контроль без обработки 15,2* 37,1* 11.7* 2,89 2,25 1,90 - - -

Виннер, КС , эталон 0 18,1 0 3,02 2.14 1,84 0,13 0 0

Раксил, КС 17,1 22.9 28.2 2.97 2.14 2.25 0,08 0 0,35

Oif 2-1 Pseudomonas sp., ЖК** 0 25.9 23,9 3,03 2,40 2,18 0,14 0,15 0,28

9.9 14.8 26.5 3.04 2.38 2,24 0,15 0,13 0,34

D7-1 Д. жМм,ЖК** 48,7 11.6 30,8 3,02 2,47 2,08 0,13 0,22 0,18

27,0 0 46.2 3,26 2,34 2,23 0,37 0,09 0,33

Fa4-1 А subtilis, ЖК** 25,7 1,9 18.8 2.97 2,44 2,17 0,08 0,19 0,27

0 4,9 29,9 3,11 2.50 2,25 0.22 0,25 0,35

D 7-1А subtilis + Oif 2-1 Pseudomonas sp., ЖК - 18.3 40,2 - 2.39 2,26 - 0,14 0,36

- 20.8 40,2 - 2,34 2,25 - 0,09 0,35

Oif 2-1 Pseudomonas sp.+ Sgrc-1 P.fluorescens, ЖК - 20,5 23,9 - 2,46 2,26 - 0,21 0,36

- 29.1 29,9 - 2,35 2,37 - 0,10 0,47

HCP05 0,14 0.08 0,21

Примечание:

* поражение в контроле фузариозом (3 балла);

**композиция для обработки семян включает микробиопрепарат на основе одного штамма или их смеси (3,0 л/т; 2,0+2,0 л/т) или химический фунгицид виннер, КС (2,0 л/т), или раксил, КС (0,5 л/т), препарат против ложной мучнистой росы апрон голд, ВЭ (3,0 л/т) и препарат против проволочников - круйзер, КС (8,0 л/т); ЖК - жидкая культура; КС — концентрат суспензии;

П - обработка семян; СИ - обработка семян + обработка вегетирующих растений.

Обработка вегетирующих растений подсолнечника биопрепаратами в 2006-2007 гг. повышала эффективность лишь в отдельных вариантах, тогда как в 2008 г. оказала существенное положительное влияние на эффективность и уроЖ'айность, что объясняется благоприятными условиями для приживаемости бактерий.

7.3 Производственные испытания лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов бактерий-антагонистов

Производственные испытания лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов бактерий-антагонистов проводились в ОАО «Лиманское» Щербиновского района Краснодарского края в 2007 г.

Несмотря на условия экстремальной засухи, обработка семян подсолнечника микробиопрепаратами повысила урожайность во всех вариантах опыта (таблица 9).

Максимальный дополнительный урожай получен в варианте с обработкой семян микробиопрепаратом на основе штамма Oif 2-1 Pseudomonas sp. — 0,34 т/га, а также с микробиопрепаратом на основе штамма D 7-1 В. subtilis - 0,27 т/га.

Таблица 9 - Влияние обработки семян подсолнечника сорта Бузулук композициями на основе микробиопрепаратов на урожайность

Производственные испытания, Щербиновский район Краснодарского края, ОАО «Лиманское», 2007 г.

Вариант Норма расхода, л/т Урожайность, т/га Дополнительный урожай, т/га

Контроль без обработки - 1.08 -

Раксил, КС* 0,5 1.01 0

Sgrc-1 P. fluorescens, ЖК* 3,0 1,16 0,08

Oif 2-1 Pseudomonas sp., ЖК* 3,0 1,42 0,34

Fa 4-1 В. subtilis, ЖК* 3,0 1,30 0,22

D 7-1 В. subtilis, ЖК* 3,0 1,35 0,27

Sgrc-1 P. fluorescens + D 7-1 B. subtilis, ЖК* 2,0+2,0 1,30 0,22

Примечание:

* композиция для обработки семян включает микробиопрепарат или химический препарат раксил, КС, препарат против ложной мучнистой росы апрон голд, ВЭ (3,0 л/т) и препарат против проволочников - круйзер, КС (8,0 л/т); ЖК - жидкая культура; КС - концентрат суспензии.

7.4 Экономическая эффективность применения лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов бактерий-антагонистов

Экономическую эффективность инкрустирования семян подсолнечника композицией на основе штаммов D 7-1 В. subtilis и Oif 2-1 Pseudomonas sp. определяли на ЦЭБ ВНИИМК в 2008 г.

При ориентировочной стоимости одного литра ЖК микробиопрепарата на основе штаммов D 7-1 В. subtilis и Oif 2-1 Pseudomonas sp. 100 рублей и норме расхода - 4,0 л/т (2,0+2,0 л/т), условный чистый доход на 1 га составил 2669,6 рублей, рентабельность обработки композицией - 753 %.

Выводы

1. В результате скрининга выделенных штаммов бактерий отобраны и идентифицированы четыре перспективных биоагента (Fa 4-1 В. subtilis, D 7-1 В. subtilis, Sgrc-1 Р. ßuorescens, Oif 2-1 Pseudomonas sp.) в качестве основы микробиопрепаратов, обеспечивающие эффективную защиту семян и проростков подсолнечника на жестком фоне искусственного заражения во влажной камере до 32,8 % и в почве до 77,3 %, а также активно колонизирующие корень, одновременно оказывающие стимулирующее действие на культуру подсолнечника.

2. Установлен температурный оптимум для культивирования перспективных штаммов бактерий: Fa 4-1 В. subtilis - 30,0-35,0 °С, D 7-1 В. subtilis - 30,0 °С, Sgrc-1 Р. ßuorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - 20.0-25,0 °С.

3. Определен оптимум pH для культивирования перспективных штаммов бактерий: D 7-1 В. subtilis — 6,0-7,0, Fa 4-1 В. subtilis, Sgrc-1 Р. ßuorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - 6,0-8,0.

4. Установлены оптимальные источники углерода: для всех исследуемых штаммов бактерий - глюкоза, сахароза, меласса, а для представителей рода Pseudomonas еще и глицерин. Оптимальным источником азота для всех перспективных биоагентов был азотнокислый натрий, для штамма Fa 4-1 В. subtilis также пептон и кукурузный экстракт, для D 7-1 В. subtilis — дрожжевой и кукурузный экстракты, а для штаммов Sgrc-1 Р. ßuorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - пептон и дрожжевой экстракт.

5. Выявлен широкий спектр антагонистического действия перспективных штаммов бактерий in vitro в отношении ряда фитопатогенных представителей рода Fusarium, а также к Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium bataticola, Alternaria sp., Phomopsis helianthi и Verticillium dahlia.

6. Изучены механизмы действия бактериальных штаммов антагонистов в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium: для всех штаммов синтез антибиотических веществ и миколитических ферментов, а для бактерий рода Bacillus еще и конкуренция за питательные вещества вследствие быстрой динамики роста. Гибель мицелия F. oxysporum var. orthoceras при совместном культивировании с бациллами-антагонистами наступала на пятые-седьмые, а с представителями рода Pseudomonas - на седьмые-девятые сутки.

7. Подобраны оптимальные питательные среды для культивирования штаммов бактерий. Все штаммы получили хорошее развитие на МПБ (1,3х109 -2,2х1012 КОЕ/мл), среде Чапека для бактерий (1,4х109 - 2,6х1012 КОЕ/мл) и пептон-дрожжевой среде (1,6х109 - 4,1х1012 КОЕ/мл). тогда как представители рода Pseudomonas также на среде Кинга В (6.7 - 9,7х1012 КОЕ/мл), а бактерии рода Bacillus еще и на среде Тайлона 3 (1,2 - 1,4x109 КОЕ/мл).

8. Определены оптимальные сроки культивирования для всех штаммов -продуцентов микробиопрепаратов - 36-48 ч с титром для представителей рода Bacillus 5,7x1010 - 2,5x10П КОЕ/мл, а для бактерий рода Pseudomonas - 1,3 - 9,7x1012 КОЕ/мл.

9. Установлены оптимальные сроки храпения лабораторных образцов микробиопрепаратов в препаративной форме ЖК. Срок хранения ЖК на основе бацилл-антагопистов девять месяцев (4,6x108 - 3,3x109 КОЕ/мл), а на основе псевдомонад -шесть месяцев (5,0x1010 - 9,6x10й КОЕ/мл) как при переменных, так и при пониженных температурах без введения каких-либо питательных добавок и стабилизаторов.

10. Установлена совместимость лабораторных образцов микробиоирепаратов с рядом перспективных пестицидов (круйзер, КС; семафор, ТПС; командор, ВРК; апрон голд, ВЭ; ровраль, СП; ТМТД, ТПС; винцит, CK; альбит, ТПС; максим, КС; виннер, CK и раксил, КС), обеспечивающая включение их в интегрированную систему защиты подсолнечника от вредителей и болезней.

11. Инкрустирование семян подсолнечника микробиопрепаратами и их комбинациями на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза в лабораторных условиях в почве обеспечивало биологическую эффективность до 77,3 %, в полевых условиях на фоне естественного поражения, в зависимости от состояния популяции патогенов и складывающихся погодных условий - до 48,7 %. Величина сохраненного урожая от применения лабораторных образцов микробиопрепаратов составляла до 0,47 т/га.

Практические рекомендации

1. Для создания микробиопрепаратов полифункционального типа действия использовать новые перспективные штаммы бактерий-антагонистов: Fa 4-1 Bacillus subtilis, D 7-1 Bacillus subtilis, Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens, Oif2-l Pseudomonas sp.

2. С целью снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике рекомендуется проводить инкрустирование семян смесью лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов D 7-1 В. subtilis и Oif 2-1 Pseudomonas sp. Норма расхода каждого микробиопрепарата — 2,0 л/т. Расход рабочей жидкости - 10-15 л/т. В композицию рекомендуется включать препарат против проволочника (круйзер, КС (тиаметоксам, 350 г/л) или семафор, ТПС (бифентрин, 200 г/л), или командор, ВРК (имидаклоприд, 200 г/л)) и препарат против ложной мучнистой росы (апрон годд, ВЭ (мефеноксам, 350 г/л)).

Список опубликованных работ

1. Асатурова, A.M. Изучение кинетики роста штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза при периодическом культивировании / A.M. Асатурова // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. - Краснодар, 2008. -Вып. 1 (138).-С. 79-82.

2. Асатурова, A.M. Поиск штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза подсолнечника / A.M. Асатурова // Фитосанитарное оздоровление экосистем: материалы второго всероссийского съезда по защите растений, (5-10 декабря, 2005 г.). - СПб, 2005.-Т.П.-С. 148-150.

3. Асатурова, A.M. Скрининг штаммов бактерий, проявляющих антагонизм к возбудителям фузариоза подсолнечника / A.M. Асатурова, JI.B. Маслиенко // Болезни и вредители масличных культур. - Краснодар, 2006. - С. 82-89.

4. Маслиенко, JI.B. Потенциальные биоагенты для защиты подсолнечника от возбудителей фузариоза / JI.B. Маслиенко, A.M. Асатурова // Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем: материалы межд. науч.-практ. конф., (20-22 сентября, 2006 г.). -Краснодар, 2006. -Вып. 4. - С. 246-248.

5. Асатурова, A.M. Спектр антагонистической активности перспективных штаммов бактерий в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium / A.M. Асатурова // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы VIII регион, конф. молодых ученых (7-8 декабря, 2006 г.). - Краснодар, 2006. - С. 100-101.

6. Асатурова, А.М. Отбор перспективных агентов биологического контроля для защиты подсолнечника от возбудителей фузариоза / А.М. Асатурова, Е.Ю. Шипиевская // Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур: Сб. материалов 4-й межд. конф. молодых ученых и специалистов (27-29 марта, 2007 г.). -Краснодар, 2007. - С. 8-12.

7. Асатурова, A.M. Антибиотическая и ферментативная активности перспективных штаммов бактерий-антагонистов / A.M. Асатурова // Современное состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах: труды IV Всероссийской науч. конф. молодых ученых и студентов (1-4 октября, 2007 г.). - Краснодар, 2007. - С. 66-68.

8. Маслиенко, JI.B. Штаммы бактерий-антагонистов перспективные для создания биофунгицидов против возбудителей фузариоза подсолнечника / JI.B. Маслиенко, A.M. Асатурова // Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине: материалы межд. науч.-практ. Конференции (10-12 октября, 2007 г.). - Ростов-на-Дону, 2007,-С. 148-149.

9. Асатурова, A.M. Взаимодействие бактерий-антагонистов с фитопатогенными грибами рода Fusarium / A.M. Асатурова // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы I Всероссийской конф. молодых ученых (14-16 ноября, 2007 г.). -Краснодар, 2007. - С. 81-82.

10. Маслиенко, JI.B. Ступенчатый скрининг штаммов бактерий-антагонистов - основа разработки биофунгицидов комплексного действия / JI.B. Маслиенко, A.M. Асатурова, Е.Ю. Шипиевская [и др.] // Современное состояние и перспективы развития миробиологии и биотехнологии: материалы IV межд. науч. конф. (2-6 июня, 2008). — Минск, 2008. - С. 299-301.

11. Маслиенко, JI.B. Разработка экологически безопасного метода защиты подсолнечника от возбудителей фузариоза / JI.B. Маслиенко, A.M. Асатурова, Е.Ю. Шипиевская [и др.] // Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края: материалы конференции получателей грантов регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «ЮГ». - Краснодар, 2008. -С. 146-147.

Подписано в печать 14.05.2009. Печать трафаретная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз.

Отпечатано ИП Калашников, г. Краснодар, б-р Платановый, 19/1, к. 180. Тел.: 8-960-48-52-159

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Асатурова, Анжела Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Распространение и вредоносность возбудителей фузариоза подсолнечника.

1.2 Биологический контроль фитопатогенных грибов рода Fusarium.

1.2.1 Механизмы биологического контроля фитопатогенных грибов ро,да Fusarium.

1.2.2 Механизмы прямой стимуляции роста растений ризобактериями и ее роль в биоконтроле фитопатогенных грибов рода Fusarium.

1.2.3 Колонизация корней ризобактериями и ее роль в биоконтроле фитопатогенных грибов рода Fusarium.

1.3 Микробиопрепараты на основе бактерий-антагонистов для защиты растений от возбудителей фузариоза.

2. УСЛОВИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Почвенно-климатические условия.

2.2 Материалы и методы исследований.

3. ПОИСК И ОТБОР ШТАММОВ БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФУЗАРИОЗА ПОДСОЛНЕЧНИКА.

3.1 Выделение штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза подсолнечника из природных источников.

3.2 Первичный скрининг выделенных штаммов бактерий.

3.3 Вторичный скрининг выделенных штаммов бактерий.

4. ИЗУЧЕНИЕ НОВЫХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ

ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФУЗАРИОЗА ПОДСОЛНЕЧНИКА.

4.1 Морфолого-культуральная характеристика перспективных штаммов бактерий-антагонистов.

4.2 Физиологические признаки перспективных штаммов бактерий-антагонистов

4.3 Спектр антагонистической активности перспективных штаммов бактерий в отношении основных фитопатогенных грибов, распространенных на подсолнечнике.

5. МЕХАНИЗМЫ АНТАГОНИСТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

ПЕРСПЕКТИВНЫХ БАКТЕРИЙ НА ФИТОПАТОГЕННЫЕ

ГРИБЫ РОДА FUSARIUM.

5.1 Антибиотическая активность перспективных штаммов бактерий-антагонистов

5.2 Ферментативная активность перспективных штаммов бактерий-антагонистов

5.3 Взаимодействие перспективных штаммов бактерий-антагонистов с фитопатогенными грибами рода Fusarium.

6. РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА

ЛАБОРАТОРНЫХ ОБРАЗЦОВ МИКРОБИОПРЕПАРАТОВ

НА ОСНОВЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ

БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ.

6.1 Подбор оптимальных питательных сред для культивирования штаммов бактерий-антагонистов.

6.2 Кинетика роста штаммов бактерий-антагонистов при периодическом культивировании.

6.3 Хранение лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов бактерий-антагонистов в препаративной форме жидкая культура.

7. РАЗРАБОТКА ЭЛЕМЕНТОВ ТЕХНОЛОГИИ ПРИМЕНЕНИЯ

ЛАБОРАТОРНЫХ ОБРАЗЦОВ МИКРОБИОПРЕПАРАТОВ

НА ОСНОВЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ШТАММОВ

БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ.

7.1 Совместимость микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов с пестицидами, рекомендованными для применения на подсолнечнике.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Перспективные штаммы бактерий - продуценты микробиопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике"

Фитосанитарная нестабильность агробиоценозов, а также ухудшение общей экологической ситуации в регионах России требуют новых подходов в развитии и использовании средств и способов биологической защиты (Павлюшин, 1995). Необходимо более широко использовать весь арсенал экологизированной защиты растений, в том числе и микробиометод. Микробиологические препараты могут и уже становятся альтернативой пестицидам (Кандыбин, 2006). Кроме защитного эффекта, действующие агенты биопрепаратов способны восстанавливать и активизировать природные регуляторные механизмы в агробиоценозах. К достоинствам микробиологических средств защиты растений можно отнести специфичность действия, высокую экологичность, возможность решения проблемы резистентности популяций фитопатогенов к пестицидам.

Поэтому в настоящее время является актуальным поиск и выделение высокоактивных штаммов бактерий-антагонистов с целью создания на их основе эффективных биофунгицидов. комплексного- действия^ для-* снижения» вредоносности фузариоза на подсолнечнике.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы — осуществить поиск, выделение и изучение эффективных и экологически безопасных бактериальных биоагентов — продуцентов биопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике.

В задачу исследований входило: ,

3. Оптимизировать процессы роста и развития перспективных штаммов бактерий-антагонистов.

4. Разработать элементы технологии производства микробиопрепаратов. i

5. Установить совместимость штаммов бактерий-антагонистов с пестицидами, рекомендуемыми на подсолнечнике.

Научная^ новизна.

1. Впервые создана коллекция* штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза подсолнечника, перспективных для создания новых полифункциональных микробиопрепаратов.

2. В результате ступенчатого скрининга отобраны и идентифицированы новые перспективные штаммы бактерий Fa 4-1 Bacillus subtilis, D 7-1 Bacillus subtilis, Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens, Oif 2-1 Pseudomonas sp. для создания микр о биопрепаратов полифункционального типа действия.

3. Выявлен широкий спектр антагонистического действия1 новых перспективных штаммов бактерий против основных возбудителей фузариоза и других патогенов подсолнечника.

4. Изучены механизмы действия новых штаммов антагонистов в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium.

5. Оптимизированы условия культивирования штаммов - продуцентов новых микробиопрепаратов.

6. Впервые установлена эффективность новых микробиопрепаратов и их комбинаций против возбудителей фузариоза и сохранение урожая подсолнечника.

Научно-практическая значимость работы.

1. Создана коллекция перспективных штаммов бактерий-антагонистов родов Bacillus и Pseudomonas - продуцентов новых полифункциональных биопрепаратов для использования в сельскохозяйственной практике.

3. Инкрустирование семян подсолнечника лабораторными образцами микробиопрепаратов и их комбинаций на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза в лабораторных условиях в почве обеспечивало биологическую эффективность до 77,3 %, а в полевых условиях в зависимости от состояния популяции патогена и складывающихся погодных условий до 48,7 %, при эффективности эталона виннера - до 18,1 %. Величина сохраненного урожая от применения лабораторных образцов микробиопрепаратов составляла до 0,47 т/га.

2007 г.; I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», КубГАУ, Краснодар, 2007 г.; VI международной научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск,

2008 г.; конференции получателей грантов регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и администрации Краснодарского края «ЮГ», п. Агой, 2008 г.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ № 08-04-99010-рофи и программы У.М.Н.И.К. Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, государственный контракт № 7967.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 1 в издании, рекомендуемом ВАК. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста и состоит из введения, семи глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложений, содержит 21 таблицу, 35 рисунков. Список библиографических источников включает 227 наименований, в том числе 114 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Защита растений", Асатурова, Анжела Михайловна

1. В результате скрининга выделенных штаммов бактерий отобраны и идентифицированы четыре перспективных биоагента (Fa 4-1 В. subtilis, D 7-1 В. subtilis, Sgrc-1 P. fluorescens, Oif 2-1 Pseudomonas sp.) в качестве основы микробиопрепаратов, обеспечивающие эффективную защиту семян и проростков подсолнечника на жестком фоне искусственного заралсения во влажной камере до 32,8 % и в почве до 77,3 %, а таюке активно колонизир>1ощие корень, одновременно оказывающие стимулирующее действие на культуру подсолнечника.2. Установлен температурный оптимум для культивирования

3. Определен оптимз^и рН для культивирования перспективных штаммов ба1сгерий: D 7-1 В. subtilis - 6,0-7,0, Fa 4-1 В. subtilis, Sgrc-l P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. - 6,0-8,0.4. Установлены оптимальные источники углерода: для всех исследуемых штаммов бактерий — глюкоза, сахароза, меласса, а для представителей рода Pseudomonas еще и глицерин. Оптимальным источником азота для всех перспективных биоагентов был азотнокислый натрий, для штамма Fa 4-1 В. subtilis также пептон и кукурузный экстракт, для D 7-1 В. subtilis — дрожжевой и кукурузный экстракты, а для штаммов Sgrc-l Р. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. — пептон и дрожжевой экстракт.5. Выявлен широкий спектр антагонистического действия перспективных штаммов бактерий in vitro в отношении ряда фитопатогенных представителей рода Fusarium, а такл^е к Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium bataticola, Alternaria sp., Phomopsis helianthi и Verticillium dahlia.6. Изз^ены механизмы действия бактериальных штаммов антагонистов в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium: для всех штаммов синтез антибиотических веществ и миколитических ферментов, а для бактерий рода Bacillus еще и конкуренция за питательные вещества вследствие быстрой динамики роста. Гибель мицелия F. oxysporum var. orthoceras при совместном культивировании с бациллами-антагонистами наступала на пятые-седьмые, а с представителями рода Pseiidomonas — на седьмые-девятые сутки.7. Подобраны оптимальные питательные среды для культивирования штаммов бактерий. Все штаммы получили хорошее развитие на МПБ (1,3x10^ • 2,2x10^" КОЕ/мл), среде Чапека для бактерий (1,4x10^ - 2,6x10^^ КОЕ/мл) и пептон-дрожжевой среде (1,6x10 - 4,1x10 "КОЕ/мл), тогда как представители рода Pseudomonas также на среде Кинга В (6,7 - 9,7x10 КОЕ/мл), а бактерии роц.а Bacillus еще и на среде Тайлона 3 (1,2 - 1,4x10^КОЕ/мл).8. Определены оптимальные сроки культивирования для всех штаммов — продуцентов микробиопрепаратов - 36-48 ч с титром для представителей рода Bacillus 5,7x10^" - 2,5x10^^ КОЕ/мл, а для бактерий рода Pseudomonas —

1,3-9,7х10^-КОЕ/мл.9. Установлены оптимальные сроки хранения лабораторных образцов ммфобиопрепаратов в препаративной форме ЖК. Срок хранения ЖК на основе бацилл-антагонистов девять месяцев (4,6x10^ - 3,3x10^ КОЕ/мл), а на переменных, так и при пониженных температурах без введения каких-либо питательных добавок и стабилизаторов.10. Установлена совместимость лабораторных образцов микробиопрепаратов с рядом перспективных пестицидов (круйзер, КС; семафор, ТПС; командор, ВРК; апрон голд, ВЭ; ровраль, СП; ТМТД, ТПС; винцит, СК; альбит, ТПС; максим, КС; виннер, СК и раксил, КС), обеспечивающая включение их в рштегрированную систему защиты подсолнечника от вредителей и болезней.11. Инкрустирование семян подсолнечника микробиопрепаратами и их комбинациями на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза в лабораторных условиях в почве обеспечивало биологическую эффективность ДО 77,3 %, в полевых условиях на фоне естественного поражения, в зависимости от состояния популяции патогенов и складывающихся погодных условий - до 48,7 %. Величина сохраненного урожая от применения лабораторных образцов микробиопрепаратов составляла до 0,47 т/га.ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для создания микробиопрепаратов полифункционального типа действия использовать новые перспективные штаммы бактерий антагонистов: Fa 4-1 Bacillus subtilis, D 7-1 Bacillus subtilis, Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens, Oif 2-1 Pseudomonas sp.2. С целью снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике рекомендуется проводить инкрустирование семян смесью лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов D 7-1 В. subtilis и Oif 2-1 Pseudomonas sp. Норма расхода каждого микробиопрепарата — 2,0 л/т. Расход рабочей жидкости - 10-15 л/т. В композицию рекомендуется включать препарат против проволочника (круйзер, КС (тиаметоксам, 350 г/л) или семафор, ТПС (бифентрин, 200 г/л), или командор, ВРК (имидаклоприд, 200 г/л)) и препарат против ложной мучнистой росы (апрон голд, ВЭ (мефеноксам, 350 г/л)).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Асатурова, Анжела Михайловна, Санкт-Петербург

1. Алексеева, Р.П. Влияние фосфатмобилизующих микроорганизмов на рост растений / Р.П. Алексеева // Использование микроорганизмов в сельском хозяйстве и промышленности. - Новосибирск. — 1982. - 4-6.

2. Амини, Д. Усовершенствование приемов заш;иты томата от фузариозного увядания: автореф. дис. ... канд. биол. наук. / Амини, Джаханшир - М., 2004. - 20 с.

3. Антонова, Т.С. Фузариоз и фомопсис подсолнечника: состояние и перспективы исследований / Т.С. Антонова // Науч.-технич. бюлл. / ВНИИ маслич. культур. - Краснодар, 2002. - Вып. 126. - 22-28.

4. Архипова, Т.Н. Исследование цитокининов, продуцируемых ризосферными микроорганизмами: автореферат дис. ... канд. биол. наз^с. / Архипова, Татьяна Николаевна. - Уфа, 1999. - 24 с.

5. Афанди, М.А. Гриб-антагонист в ризосфере яровой пшеницы / М.А. Афанди, В.А. Шкаликов, В.К. Шильникова и др.. // Защита растений. - 1995.-№ З . - С . 19.

6. Билай, В.И. Грибы рода Fusarium/ В.И. Билай. - Киев: Наук. Думка, 1977.-441 с.

7. Билай, В.И. Микроорганизмы - возбудители болезней растений / В.И. Билай, Р.И. Гвоздяк, И.Г. Скрипаль и др... - Киев: На}^. Думка, 1988. - 552 с.

8. Блажевич, О.В. Биосинтез флуоресцирз^ющего пигмента пиовердина Рм у ризосферных бактерий Pseudomonas putida М / О.В. Блажевич, Н.П. Максимова // Изв. РАН. Сер. биол. - 1994. - № 2. -С. 205-209.

9. Блажний, B.C. Почвы равнинной и предгорной степной части Краснодарского края / Е.С. Блажний // Тр. / КСХИ. - Краснодар, 1958. -Вып. 4 (32).-С. 7-35.

10. Бородин, Г. Специализация видов грибов рода Fusarium на подсолнечнике / Г Бородин, И.А. Котлярова, Г.А. Терещенко // Болезни и вредители масличных культур: Сб. науч. работ ВНИИ маслич. культур. -Краснодар, 2006. - 52-56.

11. Воронин, A.M. Биологические препараты на основе псевдомонад / A.M. Воронин, В.В. Кочетков // АГРО XXI. - 2000. - № з. - 3-5.

12. Воронин, A.M. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений / A.M. Воронин // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - № 10. - 25-31.

13. Ваксман, З.А. Антагонизм микробов и антибиотические вещества / З.А. Ваксман. - М . : Гос. изд-во иностр. лит., 1947. - 391 с.

14. Ван дер Планк, Я.Е. Устойчивость растений к болезням / Я.Е. Ван дер Плапк. - М.: «Колос», 1972. - 255 с.

16. Возняковская, Ю.М. Взаимодействие Helmintliosporium sativum - возбудителя корневой гнили культур с сапрофитными почвенными бактериями / Ю.М. Возняковская, А.К. Труфанова // Микология и фитопатология. - 1988. - Т. 22, № 2. - 157-161.

17. Градова, Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии / Н.Б. Градова, Е.С. Бабусенко, И.Б. Горнова. - М.: ДеЛи принт, 2004. - 144 с.

18. Груздев, Г.С. Практикум по химической защите / Г.С. Груздев. - М.: Колос, 1983.-230 с.

19. Гзчцина, Ю.А. Формальдегидрезистентные бактерии рода Pseudomonas как агенты биоконтроля и биостимуляции льна / Ю.А. Гущина, Е.В. Евдо1симов // Экология сегодня. - 2001. - № 1. - 65-67.

20. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов. - М.: Колос, 1968.-336 с.

21. Егоров, Н.С. Выделешю микробов-антагонистов и биологические методы здтета их антибиотической активности / Н.С. Егоров. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1957. - 78 с.

22. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров. - М.: Изд-во МГУ; Наука, 2004. - 528 с.

23. Ермакова, Н.И. Новый биопрепарат РИЦ против болезней растений / Н.И. Ермакова, М.В. Штерншис // Защита растений. - 1994, № 12. - 18.

24. Зайчук, В.Ф. Об устойчивости подсолнечника к гнилям / В.Ф. Зайчук // Маслич. культуры. - 1983. - № 1. - 16-17.

25. Заки, А.А. Грибы и бактерии-антагонисты возбудителей фузариоза томатов, перцов, огурцов / А.А. Заки // Раст. защита. — 1980. - Т. 28, № 2. — 18-21.

26. Иващенко, В.Г. Фузариоз колоса хлебных злаков / В.Г. Иващенко, Н.П. Шипилова, Л.А. Назаровская. - СПб., 2004. - 164 с.

27. Кальке, Г.В. Биологические обоснование создания биопрепаратов, эффективных в отношении фузариозных заболеваний сельскохозяйственных культур: автореф. дис. ... канд. биол. наук. / Калько, Галина Валентиновна. -СПб, 1996.-22 с.

28. Коломбет, Л.В. Научное обоснование и практиеская реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней: автореф. дис. ... док. биол. наук. / Коломбет, Любовь Васильевна. - М., 2006. -48 с.

29. КолоАШИкова, В.И. Влияние триходермина на численность возбудителей корневых гнилей в почве / В.И. Коломникова, М.М. Трушко, Н.И. Рыжова // Защита растений. - 1995. -ШЗ.-С. 19,

30. Котлярова, И.А. Влияние возбудителей болезней на качество семян подсолнечника / И.А. Котлярова, А.Б. Хатит, Н.Г. Михайлюченко // Науч.-технич. бюлл. / ВНИИ маслин, культур. - Краснодар, 2000. - Вып. 123. -С. 32-34.

31. Кравченко, Л.В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции микроорганизмов с растениями: автореф. дис. ... док. биол. наук. / Кравченко, Лев Витальевич - М., 2000. - 52 с.

33. Кузнецов, И.А. Обработка почвы / И.А. Кузнецов. - Краснодар, 1968. - 40-76.

34. KyicHH, В.Ф. Болезни подсолнечника и меры борьбы с ними / В.Ф. KyKim. - М.: Колос, 1982. - 80 с.

35. Кулаева, О. Н. Цитокинины. Их структура и функция / О.Н. Кулаева. - М.: Наука, 1973. - 215 с.

36. Кулдыбаев, М.М. Actinomyces roseoflavus Arai А-23/791 в борьбе с корневой гнилью огурцов в гидропонных условиях возделывания; автореф. дис. ... канд. биол. наук. /Кулдыбаев, Мэлс Мухатаевич. -Алма-Ата, 1974. -25 с.

37. Кулдыбаев, М.М. ТргЕХОдермин в борьбе с корневой гнилью / М.М. Кулдыбаев, Ш.С. Кульмухамедова, М.К. Акбердина и др.. // Защита растений. - 1983. - № з. - 25-26.

38. Кураков, А.В. Методы выделения и характеристики комплексов микроскопических грибов наземных экосистем / А.В. Кураков. - М.: МАКС Пресс, 2001.-92 с.

39. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высш. шк., 1980. - 293 с.

40. Лутова, Л.А. Генетика развития растений / Л.А. Лутова, Н.А. Нроворов, О.Н. Тиходеев и др... - СПб.; Наука, 2000. - 539 с.

41. Льтсак, Л.В. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий / Л.В. Лысак, Т.Г. Добровольская, И.Н. Скворцова. - М.: МАКС Пресс, 2003. - 120 с.

42. Манучарова, Н.А. Сукцессия хитинолитических микроорганизмов в черноземе / Н.А. Манучарова, Э.В. Белова, А.В. Воробьев и др.. // Микробиология. - 2005. - Т. 74, № 5. - 693-698.

43. Мартынова, Г.П. Влияние триходермина на поражение растений корневыми гнилямн и урожайность ячменя на северо-востоке Нечерноземья РФ: автореф. дне. ... канд. биол. наук. / Мартынова, Галина Петровна. - М., 1998.-18 с.

44. Марфенина, О.Е Антропогенная экология почвенных грибов / О.Е. Марфешша. - М.: Медицина для всех, 2005. - 196 с.

45. Маслиенко, Л.В. Бактерии-антагонисты возбудителей болезней подсолнечника / Л.В. Маслиенко, О.А. Лавриченко // Науч.-техн. бюл. / ВНРШ маслич. культур. - Краснодар, 1995. - Вып. 116. - 27-35.

46. Маслиенко, Л.В. Биологический метод борьбы с болезнями подсолнечника / Л.В. Маслиенко, О.А. Лавриченко // Биосфера и человек. -Майкоп, 1997. - 27-29.

47. Маслиенко, Л.В. Биологический метод защиты подсолнечника и других сельскохозяйственных культур от болезней / Л.В. Маслиенко //Агро XXI. - 1999. - № 8. - 9.

48. Маслиенко, Л.В. Видовой состав грибов рода Fusarium на подсолнечнике / Л.В. Маслиенко, Н.В. Мурадасилова // Науч.-технич. бюлл. / ВНИИ маслич. культур. - Краснодар, 2000. - Вып. 123. - 25-31.

49. Маслиенко, Л.В. Изыскание и первичный скрининг штаммов грибов-антагонистов возбудителей фузариоза / Л.В. Маслиенко, Н.В. Мурадасилова // Науч.-технич. бюлл. / ВНИИ маслич. культур. -Краснодар, 2002. - Вып. 126. - 29-35.

50. Маслиенко, Л.В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями подсолнечника: автореф. дне. ... док. биол. наук. / Маслиенко, Любовь Васильевна. - Краснодар, 2005. - 49 с,

51. Минеев, В.Г. Влияние бактерий рода Pseudomonas на некоторые физиолого-биохимические процессы в растениях столовой свеклы / В.Г. Минеев, О.С. Сафрина, В.П. Шабаев // Докл. ВАСХНИЛ. - 1992. -№ 1 . - С . 16-21.

52. Минеев, В.Г. Химический состав растений столовой свеклы, инокулированных бактерией рода Pseudomonas / В.Г. Минеев, О.С. Сафрина, В.П. Шабаев // Доюх. ВАСХХЖЛ. - 1991. - № 10. - 21-26.

53. Мордухова, Е.А. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными псевдомонадами: влияние плазмид биодеградации нафталина / Е.А. Мордухова, В.В. Кочетков, Ф.Я. Поликарпова и др.. // Прикл. биохимия и микробиология. - 1998. - Т. 34, № 3. - 287-292.

54. Морщацкий, А.А. Триходерма и поражаемость озимой пшеницы корневыАти гнилями / А.А. Морщацкий, О.С. Морщацкий // Защита растений. - 1975. - № 10. - 55.

55. Мосичев, М.С. Общая технология микробиологических производств / М.С. Мосичев, А.А. Складнев, В.Б. Котов, - М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982. - 264 с.

58. Наумова, H.A. Анализ семян на грибную и бактериальную инфекцию / Н.А. Наумова. - М.: Сельхозиздат., 1960. - 208 с.

59. Недорезков, В. Д. Биологическое обоснование применения эндофитных бактерии в защите пшеницы от болезней на Южном Урале: автореф. дис. ... док. биол. наук. / Недорезков, Владимир Дмитриевич -СПб.-Пушкин, 2003. - 42 с.

60. Нетрусов, Ф.И. Экология микроорганизмов / Ф.И. Нетрусов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В.М. Горленко и др... - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.

61. Нетрусов, Ф.И. Практикум по микробиологии / Ф.И. Нетрусов, М.А. Егорова, Л.М. Захарчук и др... - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.

62. Никонорова, А.К. Особенности взаимодействия Bacillus subtilis с Helminthosporium sativum Pam., King et Balcke / A.K. Б^конорова // Микология и фитопатология. - 1996. - Т. 30, вып. 5-6. - 69-73,

63. Новикова, И.И. Полифзшкциональные биопрепараты для защиты растений от болезней / И.И. Новикова // Защита и карантин растений. - 2005. - № 2. - 22-24.

64. Новогрудский, Д-М. Почвенная микробиолоп^ш / Д.М. Новогрудский. - Алма-Ата: Изд-во АН Каз. ССР, 1956. - 402 с.

65. Овдиенко, Р.В. Особенности микрофлоры почв Северо-Западного Кавказа: автореф. дис. ... канд. биол. наук. / Овдиенко, Руслан Владимирович. -Ростов-на-Дону, 2003. - 23 с.

66. Озерецковская, О.Л. Механизмы индуцирования элиситорами системной устойчивости растений к болезням / О.Л. Озерецковская, Л.И. Ильинская, Н.И. Васюкова // Физиол. раст. - 1994. - Т. 41, № 4. -С. 626-633.

67. Олюнина, Л.Н. Продуцирование индолил-3-уксусной тшслоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas в процессе роста / Л.Н. Олюнина, В.П. Шабаев // Микробиология. - 1996. - Т. 6, № 6. -С. 813-817.

68. Пантелеев, А.А. Применение микробов-антагонистов и продуктов их антагонизма в борьбе с вилтом хлопчатника / А.А. Пантелеев, З.С. Багирова // Мат. Всесоюзн. Закавк. Совещания по координации н.-и. работ по защите растений. - Кировобад, 1988. - 36-37.

69. Пересыпкин, В.Ф. Болезни технических культур / В.Ф. Пересыпкин, З.А. Пожар, А.С. Корниенко и др... - М.: Агропромиздат, 1986. - 317 с.

70. Петренко, М.Б. Производные феназина из Pseudomonas sp. штамм 2/3 / М.Б. Петренко А.В. Боровков // Химия природ, соединений. - 1970. -№ 6 . - С . 779.

71. Саттарова, Р.К. Бактерии-антагонисты и протравители против корневой гнили пшеницы / Р.К. Саттарова, Н.Т. Хакимова, Р.Н. Маннанов // Защита и карантин растений. - 2005. - № 7. - 28.

72. Саукова, Л. Виды грибов рода Fusariuin, встречающиеся на подсолнечнике, и поражение всходов при разной дозе инфекционной нагрузки / Л. Саукова // Науч.-технич. бюлл. / ВНИИ маслич. культур. -Краснодар, 2001.-Вып. 124.-С. 166-168.

73. Свешникова, Е.В. Новые бактерии рода Pseudomonas - антагонисты фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике: автореф. дис. ... канд. биол. наук./ Свешникова, Елена Витальевна. -Уфа, 2003.-22 с.

74. Симакин, А.Н. Агротехническая характеристика кубанских черноземов и удобрения / А.Н. Симакин. - Краснодар, 1966. - 40 с.

75. Скворцова, И.Н. Методы идентификации и выделения почвенных бактерий рода Pseudomonas / И.Н. Скворцова. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1981.-78 с.

76. Смирнов, В.В. Бактерии рода Pseudomonas / В.В. Смирнов, Е.А. Киприанова. -Киев: Наук, думка, 1990. - 264 с.

77. Смолин, В.Ю. Химический состав растений сои при применении клубеньковых бактерий с ризосферными псевдомонадами или эпдомикоризными грибами и локальном внесении азотного удобрения / В.Ю. Смолин, В.П. Шабаев // Агрохимия. - 1992. - № 11. - 73-79.

78. Соколов, А.И. Агрохимическая характеристика основных типов почв СССР / А.И. Соколов, В.М. Фридганд. - М.: Наука, 1984. - 144-152.

79. Соколов, М.С. Современная концепция биологической защиты растений / М.С. Соколов, В.И. Терехов // Агрохимия. - 1995. - № 4. - 90-97.

80. Соловова, Г.К. Анализ прикрепления агробактерий к корням пшеницы и риса / Г.К. Соловова, О.В. Калаптур, М.И. Чзшаков // Микробиология. - 1999. - Т. 68, № 1. - 76-82.

81. Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. - М.: ООО «Издательство Агрорус», 2008. -Вып. 12. - 560 с.

82. Теппер, Е.З. Практик}^! по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева. - М.: Дрофа, 2004 . - 256 с.

83. Титаренко, Л.Н. Применение ризоплана на Северном Кавказе / Л.Н. Титаренко, Г.Г. Вяткина, М.И. Алещенко // Защита растений. - 1995. -№ 8 . - С . 17.

84. Тихонович, И.А. Каталог культур микроорганизмов / И.А. Тихонович, Ю.С. Оследхсин. - СПб-Пушкин, 2005. - 88 с.

85. Тютерев, Л. Научные основы индзщированной болезнеустойчивости растений / Л. Тютерев. - СПб.: ВИЗР, 2002. - 328 с.

86. Феклистова, И.Н. Синтез антибиотиков ароматической природы у бактерий Pseudomonas aurantiaca В-162: автореф. дис. ... канд. биол. на}^. / Феклистова, Ирина Николаевна. - Минск, 2006. - 22 с.

87. Феофршова, Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. - 1992. - Т. 61, № 5. - 739-753.

88. Франк, Р.И. Перспективы нового бактофита / Р.И. Франк, Г. Удальева, В.И. Кищенко // Защита и карантин растений. - 2005. - № 4. -С. 37.

89. Шакирова, Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. - Уфа: Гилем, 2001. - 160 с.

90. Шевелуха, B.C. Рост растений и его регуляция в онтогенезе. - М.: Наука, 1994.-594 с.

91. ХПинкарев, В.П. Распространение болезней подсолнечника и борьба с ними за рубежом / В.П. Шинкарев, Т.П. Масленникова, Т.е. Дайнеко и др..; ВНИИТЭИ. - М.: Изд-во Агропром, 1990. - 72 с.

92. Широков, А.В. Миколитические ферменты бактерий Bacillus Cohii и их роль в антагонизме к почвенным микромицетам: автореф. дис. ... канд. биол. наук. / Широков, Алексей Валерьевич. - Уфа, 2004. - 22 с.

93. Штерншис, М.В. Биопрепараты в защите растений / М.В. Штерншис, Ф.С. Джалилов, И.В. Андреева и др... - Новосибирск: АгроЛит,2003.-140с.

94. Якуткин, В.И. Прогноз болезней подсолнечника / В.И. Якуткин // Защита и карантин растений. - 2005. - № 5. - 41.

95. Пат. 06599503 США, МКИ^ А 01 N 63/00 // Способ биоконтроля болезней растений, вызываемых видами Fusarium, с применением изолятов Bacillus megaterium / Luz Wilmar Corio D. - № 4798; заявл. 07.12.2001.; опубл. 29.07.2003.

96. Zhao, В. Ф}Т1гистазис Bacillus subtilis В 903 и возможности его использования для биологической защиты проростков риса от болезней / В. Zhao // Acta phytophylactica sin. - 1993. - Vol. 19, № 3. - P. 17-19.

97. Anthony, U. Pseudomonine, an isoxazolidone with siderophoric activity from Pseudomonas fluorescens AH2 isolated from lake Victoria Nile perch / U. Anthony, С Christophersen, P.H. Nielse et al.. // J. Nat. Prod. - 1995. -Vol. 58 .-P. 1786-1789.

98. Aldrich, J. Biological control of Fusarium roseum f. sp. dianthi by Bacillus subtilis / J. Aldrich, R. Baker // Plant Dis. Rep. - 1970. - Vol. 54. -P. 446-448.

99. Arima, K. Pyrrolnihin, a new antibiotic substans, produced by Pseudomonas П / K. Arima, H. Imanaka, M. Konsara et al.. //Agr. and Biol. Chem. - 1964. - Vol. 28, № 8. - P. 575-582.

100. Bashan, Y. Evidence for a weak active external adsorption of Azospirilium brasilense Cd to wheat roots / Y. Bashan, H. Levanony, E. Klein // J. Gen. Microbiol. - 1986. - Vol. 132. - P. 3069-3073.

101. Bekmakhanova, N.E. Biologicaly active substences from fungi of the suger belt rhizosphere / N.E. Bekmakhanova, A.K. Uspanov, L.M. Amikhanova et al.. // Actamicrobiol. hung. - 1988. - Vol. 35, № 2. - P. 166-167.

102. Bloemberg, G.V. Green fluorescent protein as a marker for Pseudomonas spp. / G.V. Bloemberg, G.A. O'Tool, B.J.J. Lugtenberg et al.. // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63. - P. 4543-4551.

103. Bochow, H. Ph3^osanitary effect of Bacillus subtilis as a biocontrol agent / H. Bochow // Meded. Jac. landbouwwetensch. / Univ. Gent. - 1992. -Vol. 57, №; 2B. - P. 387-393.

104. Bossier, P. Ecological significance of siderophores in soil / P. Bossier, M. Hofte, W. Verstraete // Adv. Microb. Ecol. - 1988. - Vol. 10. - P. 385-414.

105. Burkhead, K.D. Pyrrolnitrin production by biological control agent Pseudomonas cepacia B37w in culture and in colonized wounds of potatoes / K.D. Burkhead, D.A. Schisler, P.J. Slininger // Appl. Environ. Microbiol. - 1994. -Vol. 60 .-P. 2031-2039.

106. Chin-a-Woeng, T.F.C. Phenazines and their role in biocontrol by Pseudomonas bacteria / T.F.C. Chiii-a-Woeng, G.V. Bloemberg, B.G.G. Lugtenberg // New Phytologist. - 2003. - Vol. 157, № 3. - P. 503-523.

107. Cook, R.J. The nature and practice of biological control of plant pathogens / R.J. Cook, K.F. Baker // St. Paul (Minn.): Amer. Phytopathol. Soc. -1983.-P. 1-539.

108. Comish, A.S. Role of molybdate and other transition metals in the accumulation of protochelin by Azotobacter vinelandii II / A.S. Comish, W.J. Page //Appl. Env. Microbiol. - 2000. - Vol. 66, №4. - P. 1580-1586.

109. Cox, CD. Pyochelin: novel structure of an iron chelating growth promoter for Pseudomonas aeruginosa II / C D . Cox, K.L. Rinehart, M.L. Moore et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1981. - Vol. 78. - P. 4256-4260.

110. Crowley, D.E. Utilization of microbial siderophores in iron acquisition by oat / D.E. Crowley, CP.P. Reid, P.L Szaniszlo // Plant Physiol. -1988. - Vol. 87.-P. 680-685.

111. Di Pietro, A. Endochitinase from Gliocladium virens: isolation, characterization and synergistic antifungal activity in combination with gliotoxin / A. Di Pietro, M. Lorito, CK. Hayes et al.. // Phytopathology. - 1993. -Vol. 83.-P. 313-318.

112. Duffy, B.K. Combination of Trichoderma koningii with fluorescent Pseudomonads for control of take-all on wheat / B.K. Duffy, A. Simon, D.M. Weller//Phytopathology - 1996. -Vol. 86. - P . 188-194.

113. Dunlap, Biological control of Pythium ultimum by Stenotrophomonas maltophilia W81 is mediated by an extracellular proteolytic activity / C. Dunlap, J.J. Crowley, Y. Moenneloccoz et al.. // Microbiology Uk. -1997.-Vol. 143, Part 12 .-P. 3921-3931.

114. Dunne, C. Combining proteolytic and phloroglucinol-producing bacteria for improved biocontrol of Pythium-mediated damping-off of sugar beet / С Dunne, L.Y. Moenne, J. Mc Carthy et al.. // Plant pathology. - 1998. -Vol. 109.-P. 299-307.

115. Hebbar, P. Bacterial antagonists of Sunflower (Helianthus annus L.) fungal pathogens / P. Hebbar, O, Berge, T. Heulin et al.. // Plant and soil. -1991.-Vol. 133.-P. 131-140.

116. Homma, Y. Production of antibiotics by Pseudomonas cepacia as an agent for biological control of soilborne plant pathogens / Y. Homma, Z. Sato, F. Hirayama et al.. // Soil Biot. and Biochem. - 1989. - Vol. 21, № 5. -P. 723-728.

117. Howie, W.J. Factors affecting colonization of wheat roots and suppression of take-all by pseudomonas antagonistic to Gaeumannomyces graminis var. tritici / W.J. Howie // Ph.D. Dissertation. Wash. State Univ. -Pullman, 1985.

118. Howie, W.J. Directed enliancement of biocontrol in Pseudomonas by constitutive antibiotic biosynthesis / W.J. Howie, D. Matsubara, N. Gutterson etal.. //Phytopathology. - 1989. -Vol. 79. - P . 1160-1163.

119. Howie, W.J. Role of antibiotic biosynthesis in the inliibition of Pythium ultimum in the cotton spermosphere and rhizosphere by Pseudomonas fluorescens / W.J. Howie, T.V. Suslow // Mol. Plant-Microbe Interact, 1991. - Vol. 4. -P. 393-399.

120. Huber, J. Selection and biotechnical production of culture solutions of microbial antagonists for suppression of phytopathogenie soil fungi / J. Huber, H. Bochow, H. Junge // J. Basic Microbiology. - 1987. - Vol. 27, № 9. - P. 497-503.

121. Imanaka, H. Studies on pjnrolnitrin, a new antibiotic. Taxonomic studies on pyrrolnitrin-producing strains / H. Imanaka, M. Kousaka, G. Tamura et al.. // J. Antibiot. - 1965. - Vol. 18. - P. 205-206.

122. Jaeger, III C.H. Mapping of sugar and amino acid availability in soil around roots with bacterial sensors of sucrose and tryptophan / III C.H. Jaeger, S.E. Lindow, W. Miller et al.. // Appl. Ebnviron. Microbiol. - 1999. - Vol. 65. -P. 2685-2690.

123. James, D.W. Multiple antibiotics produced by Pseudomonas fluorescens Hv37a and their differential regulation by glucose / D.W. James, N.I. Gutterson // Appl. Environ. Microbiol. - 1986. - Vol. 27. - P. 1183-1189.

124. Jayaswal, R.K. Isolation and characterization of a Pseudomonas strain that restricts growth of various phytopathogenic fungi / R.K. Jayaswal, M.A. Femander, R.G. Schroeder // Appl. and Environ. Microbiol. - 1990. -Vol. 56, № 4 . - P . 1053-1058.

125. Kanner, D. Pattern of plienazine pigment production by strain of Pseudomonas aeruginosa II / D. Kanner, N.N. Gerber, R. Bartha // J. Bacteriol. -1978.-Vol. 134.-P. 690-692.

126. Kapiilnik, Y. Plant growth promotion by rhizosphere bacteria / Y. Kapulnik // Plant Root: the hidden half - New York, Basel, Hong Kong. -1996.-P. 769-780.

127. Kempf, H.-J. Erwinia herbicola as biocontrol agent of Fusarium culmorum and Puccinia recondita f sp. triciti on wheat / H.-J. Kempf, G. Wolf // Phytopathology. - 1989. - Vol. 79. - P. 990-994.

128. Khana, H.H. Toxicity of culture filtrates of aspergilli to some fungal pathogens causingfiuit rot / H.H. Khana, S. Chandra, A.P. Singh // Ind. J. Mycol. And Plant Pathol. - 1978. - Vol. 8, № 2. - P . 145-148.

129. Kloepper, J.W. Free-living bacterial inocula for enliancing crop productivity / J.W. Kloepper, R. Lifshitz, R.M. Zabolotowicz // Trends. Biotechnol. - 1989. -Vol. 7. - P . 39-43.

130. Kloepper, J.W. Plant growth-promoting rhizobacteria and plant growth under gnotobiotic conditions / J.W. Kloepper, M.N. Schroth // Phytopathology. -1981. - Vol. 71, № 6. - P.642-644.

131. King, E.O. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin / E.O. King, M.K. Ward, D.E. Raney // J. Lab. Clin. Med. - 1954. -Vol. 4 4 . - P . 301-307.

132. Knight, M. A new method of preparation of piocyanin and demonstration of an unusual bacterial sensivity / M. Knight, Ph. Hartman, Z. Hartman // An. Biochem. - 1979. - Vol. 95, K" 1. - P. 19-23.

133. Kommedahl, Т. Avaluation of biological seed treatment for controlling root diseases of pea / T. Kommedahl, С Windels // Phytopathology. - 1978. - Vol. 68, № 7 . - P . 1087-1095.

134. Kunitaka, S. Purification of antifungal substance produced by Pseudomonas avenae Manns / S. Kunitaka, N. Matsuyama //Aim. Phytopathol. Soc. Japan. - 1989. -Vol. 55, № 3. - P . 366-368.

135. Leeman, M. Biocontrol of Fusarium wilt of radish in commercial greenhouse trials by seed treatment with Pseudomonas fluorescens WCS374 / M. Leeman, J.A. van Pelt, M.J. Hendrickx et al.. // Phytopathology. - 1995. -Vol. 85, № 10. - P. 1301-1305.

136. Lively, D. Metabolism of tryptophans by Pseudomonas aureofaciens. L Biosinthesis of p5aTolnitrin / D. Lively, M. Gorman, M. Mabe // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - Philadelphia, 1966. - P. 462-469.

137. Loper, J.E. Population dynamics of soil pseudomonas in the rhizosphere of potato (Solarium tuberosum L.) / J.E. Loper, С Haack, M.N. Schroth // Appl. Environ. Microbiol. - 1985. - Vol. 49. - P. 416-422.

138. Loper, J.E. Role of fluorescent siderophore production in biological control of Pythium ultimum by Pseudomonas fluorescens strain / J.E. Loper // Phytopathology. - 1988. - Vol. 78. - P. 166-172.

139. Loper, J.E. Siderophores in microbial interactions on plant surfaces / J.E. Loper, J.S. Buyer // Molecular Plant-Microbe Interaction. - 1991. - Vol. 4. -P. 5-13.

140. Lorito, M. Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enz3mies and different antifungal compounds enhances inhibition of spore gennination / M. Lorito, C. Peterbauer, C.IC. Hayes // Microbiology. - 1994. -Vol. 140.-P. 623-629.

141. Maloney, P.E. Bacterial commimity structure in relation to the carbon environmemts in lettuce and tomato rhizospheres and a bulk soil / P.E. Maloney, A.H.C. van Bruggen, S. Hu // Microbial Ecology. - 1997. - Vol. 34. - P. 109-117.

142. McSpadden Gardener, B.B. Biological control of plant pathogens: research, commercialization, and application in the USA / B.B. McSpadden Gardener, D.R. Fravel. http://www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/review/biocontrol^ htail. 10.05.2002..

143. Meyer, J.-M. Cepabactin fi'om Pseudomonas cepacia, a new type of siderophore / J.-M. Meyer, D. Holmadel, F. Halle // J. Gen. Microbiol. - 1989. -Vol. 135, № 6. - P. 1479-1487.

144. Mitchell, R. The mycolytic phenomenon and biological control of Fusarium in soil / R. Mitchell, M. Alexander // Nature. - 1961. -Vol. 190. -P. 109-110.

145. Mitchell, R. Lysis of soil fungi by bacteria / R. Mitchell, M. Alexander // Can. J. Microb. - 1963. - Vol. 9. - P. 169-177.

146. Neilands, J.B. Siderophores in relation to plant grow1:h and disease / J.B. Neilands, S.A. Leong // Ann. Rev. Plant Physiol. - 1986. - Vol. 37. - P. 187-208.

147. Neilands, J.B. Comparative biochemistry of microbial iron assimilation Iron transport in microbes, plants and animals / J.B. Neilands, K. Konopka, B. Schw3m et al.. // Verlagsgesellschaft nibH, Weinheim, Germany, 1987. - P. 3-33.

148. Neilands, J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compoimds / J.B. Neilands // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. -P. 26723-26726.

149. Omoifo, С Inhibition of growth of some plant pathogens by antagonistic microorganisms / С Omoifo, T. Ikotun // Basic Microbiol. - 1987. -Vol. 27, № 9 . - P . 515-519.

150. Ordentlich, A. The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii / A. Ordentlich, Y. Elad, I. Chet // Phytopathology. -1988.-Vol. 78 .-P. 84-88.

151. Ouf, M.F. Effect of inoculation with antagonistic microorganisms on severity of Fusarium wilt on tomato and watermelon / M.F. Ouf, S.A.Z. Mahmoud, M. Abdel-Nasser et al.. // Zbl. bakt. II. Abt. - 1981. - Vol. 136, X2 4 - P . 341-343.

152. Parke, J.L. Root colonization by indigenous and introduced microorganisms / J.L. Parke // The Rhizosphere and Plant Growth. - 1991. - P. 33-42.

153. Pierson, III L.S.P. Phenazine antibiotic production in Pseudomonas aureofaciens: role in rhizosphere ecology and pathogen suppression / III L.S.P. Pierson, E.A. Pierson // FEMS Microbiology Letters. - 1996. -Vol. 136.-P. 101-108.

154. Pita, D. Rola mikroorganizmov antagonistycznych w zwalczaniu chorob roslin / D. Pita // Igolnopol. konf nauk. Ekol. aspekty prod, ogrod. - Poznan, 1998.-№27 - P . 221-227.

156. Polyanskay, L.M. The growth-promotion effect of Beijerinckia mobilis and Clostridium sp. Cultures on some agricultural crops / L.M. Polyanskay, O.T. Vedina, L.V. Lysak et al.. // Microbiology. - 2002. - Vol. 71, № 1. - P. 109-115.

157. Raaijmakers, J.M. Dose-response relationships in biological control of Fusarium wilt of radish by Pseudomonas spp. / J.M. Raaijmakers, M. Leeman, M.M.P. van Oorschot et al.. // Phytopathology. - 1995. - Vol. 85. - P. 1075-1081.

158. Raaijmakers, J.M. Antibiotic production by bacterial biocontrol agents / J.M. Raaijmakers, M. Vlami, J.T. de Souza // Antonie van Leeuwenhoek. - 2002. -Vol. 81, №1-4.-P. 537-547.

159. Rouatt, J.W. Initiation of rhizosphere effect / J.W. Rouatt // Can. J. Microbiol. - 1959. - Vol. 5. - P. 67-71.

160. Scher, F.M. Effect of Pseudomonas putida and a synthetic iron chelator on induction of soil supressivetess to Fusarium wilt pathogens / F.M. Scher, R. Baker // Phytopathology. - 1982. - Vol. 72. - P. 1567-1573.

161. Serino, L. Biosynthesis of pyochelin and dihydroaeruginoic acid requires the iron-regulated pchDCBA operon in Pseudomonas aeruginosa II / L. Serino, С Reimmann, P. Viscas // J. Bacteriol. - 1997. - Vol. 179, № 1. -P. 248-257.

162. Shapira, R. Control of plant diseases by chitinase expressed from cloned DNA in Escherichia coli II / R. Shapira, A. Ordentlich, I. Chet et al.. // Phytopathology. - 1989. - Vol. 79. - P. 1246-1249.

163. Sharma, P.K. Antagonistic effect of Azotobacter on some plant pathogenic fungi / P.K. Shanna, V.P.S. Chahal // J. Res. Punjab Agr. Univ. - 1987. -Vol. 24, № 4 . - P . 38-40.

164. Simeoni, L.A. Critical iron level associated with biological control of fusarium wilt/ L.A. Simeoni, W.L. Lindsay, R. Baker// Phytopathology. - 1987. -Vol. 77, № 7 . - P . 1057-1061.

165. Simons, M. Gnotobiotic system for studying rhizosphere colonization by plant growth-promoting Pseudomonas bacteria / M. Simons // Molecular Plant-Microbe Interactions. - 1996. - Vol. 9, Jfe 7. - P.600-607.

166. Sitrit, Y. Expression of a Serratia marcescens chitinase gene in Rhizobiiim meliloti during symbiosis on alfalfa roots / Y. Sitrit, Z. Barak,Y. Kapulnik et al. // Molecular Plant-Microbe Interactions. - 1993. - Vol. 6. -P. 293-298.

167. Smith, S.N. Comparison of germination of pathogenic Fusarium oxysporum chlamidospores in host rhizosphere soils conductive and supressive to wih / S.N. Smith // Phytopathology. - 1977. - Vol. 67, № 4. - P. 502-510.

168. Sundheim, L. Biocontrol of Fusarium oxysporum with a chitinase cloning gene from Senatia marcescens on a stable plasmid in Pseudomonas / L. Sundheim // J. Cell Biochem. - 1990. - Vol. 13A. - P. 171-176.

169. Sundheim, L. Effect of chitinase encoding genes in biocontrol Pseudomonas sp. II / L. Sundheim // Biological control of plant diseases: progress and challenges for the future. - New York, 1992. - P. 331-333.

170. Takeda, R. Pseudomonads pigments. IV. The structure of pyoluteorin / R. Takeda // Bull. Agr. and Chem Soc. Jap. - 1959. - Vol. 23, № 3. - P. 165-171.

172. Taraz, К. Pseudobactin and Pseudobactin A-Varianten: Neue Peptidsiderophore vom Pyoverdin - Тур as Pseudomonas fluorescens E2 / K. Taraz, D. Seinsche, H. Budzikiewicz // Z. Naturforsch. - 1991. - Vol. 46, № 7-8. - P. 522-526.

173. Tari, P.H. Fusarium wilt suppression and agglutinability of Pseudomonas putida / P.H. Tari, A.J. Anderson // Appl. And Env. Microbiol. -1988. - Vol. 54, № 8. - P. 2037-2041.

174. Teintze, M. Structure of pseudobactin A, a second siderophore from plant growth promoting Pseudomonas BIO / M. Teintze, J. Leong // Biochemistry. - 1981. - Vol. 20. - P. 6457-6462.

175. Thomashow, L.S. Role of a phenazine antibiotic from Pseudomonas fluorescens in biological control of Gaeumannomyces graminis var. triticilli / L.S. Thomashow, D.M. Weller // Bacterid. - 1988. - Vol. 170. - P. 3499-3508.

176. Thomashow, L.S. Current concepts in the use of introduced bacteria for biological disease control: mechanisms and antifungal metabolites / L.S. Thomashow, D.M. Weller // Plant Microbe Interactions. - New York, 1996.-Vol.1.-P. 187-235.

177. Uoti, J. Study of control of seed-borne Fusarium in cereals / J. Uoti // Ann. agr. fenn. - 1979 - Vol. 18, № 3. - P . 149-153.

178. Van de Broek, A. Bacterial chemotactic motility is important for the initiation of root colonization by Azospirillum brasilense II / A. Van de Broek, M. Lambrecht, J. Vanderleyden // Microbiology. - 1998. - Vol. 144. - P. 2599-2606.

179. Van Loon, L.C. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria / L.C. Van Loon, P.A.H.M. Bakker, C.M.J. Pieterse // Ann. Rev. Phytopathol. 1998. -Vol. 36. - P . 453-483.

180. Walker, R. Colonization of the developing rhizosphere of sugar beet seedlings by potential biocontrol agents applied as seed treatments / R. Walker, S. Rossall, M.J.С Asher // J. Appl. Microbiol. - 2002. - Vol. 92, № 2. - P. 228-237.

181. Wang, Y. Evidence for direct utilization of siderophore, ferroxamin B, in axenically grown cucumber / Y. Wang, H.N. Brown, D.E. Crowley et al.. // Plant Cell Environ. - 1993. - Vol. 16. - P. 579-585.

182. Watanabe, T. Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distiibution / T. Watanabe, R. Kanai, T. Kawase et. al.. //Microbiology. - 1999. -Vol. 145. - P . 3353-3363.

183. Weller, D.M. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens / D.M. Weller, J.M. Raaijmakers, B.B. McSpadden Gardener et al.. // Annu. Rev. Phytopathol. - 2002. - Vol. 40. -P. 309-348.

184. Weller, D.M. Supression of take-all of weat by seed ti'eatment'with fluorescent pseudomonads / D.M. Weller, R.J. Cook // Phytopathology. - 1983. -Vol. 73 .-P. 463-469.

185. Windels, C.E. Factors affectin Penicillium oxalicum as a seed protectant against seedling bhght of pea / C.E. Windels, T. Kommendahl // Phytopathology. - 1978. - Vol. 68, № 11 - P. 1656-1661.

Информация о работе

Асатурова, Анжела Михайловна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 06.01.11

Диссертация

Перспективные штаммы бактерий - продуценты микробиопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы