Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биодеградация ПАВ и минеральных масел и ее генетическая природа

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Плешакова, Екатерина Владимировна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Минеральные масла и ПАВ как загрязнители окружающей среды.

1.1.1. Физико-химическая и токсикологическая характеристика минеральных масел и ПАВ.

1.1.2. Методы очистки сточных вод от ПАВ и минеральных масел.

1.2. Биодеградация минеральных масел и ПАВ.

1.2.1. Микроорганизмы-деструкторы минеральных масел и пути микробного окисления. .7.

1.2.2. Микроорганизмы-деструкторы ПАВ и пути микробного окисления.

1.2.3. Использование микробных консорциумов для деградации загрязнителей.

1.3. Плазмиды био деградации.

1.3.1. Плазмидный контроль деградации широкого спектра ксенобиотиков.

1.3.2. Структурно-функциональная организация плазмид био деградации.

1.3.3. Трансмиссивность и стабильность Д-плазмид.

1.4. Роль плазмид в процессах микробной очистки.

1.4.1. Создание промышленных штаммов микроорганизмов.

1.4.2. Проблемы и перспективы использования плазмидосодержащих бактерий, способных к деструкции, в биотехнологических процессах очистки.

Собственные исследования.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Генетическая природа свойства биодеградации минеральных масел.

3.1. Селекция биокатализаторов для деструкции минеральных масел.

3.2. Изучение плазмидного спектра штаммов, выделенных из консорциумов лабораторной установки, моделирующей процесс очистки стоков от минеральных масел.

3.3. Стабильность свойства биодеградации минерального масла у штамма А.са1соасейсиз ТМ-31 в условиях культивирования на неселективных питательных средах и при действии элиминирующих агентов.

3.4. Трансформационный перенос плазмид деградации рАс, рАс1 и рАс2 штамма А.сакоасейсиБ ТМ-31.

3.5. Плазмидный анализ микробных консорциумов биокатализаторов.

Глава 4. Изучение природы детерминирования свойства микробной деструкции НПАВ.

Глава 5. Исследование генетических механизмов микробной деструкции АПАВ при разработке технологии очистки сточных вод.

5.1. Плазмидный скрининг консорциумов и составляющих их штаммов из модельной установки для очистки сульфонолосодержащих сточных вод.

5.2. Изучение стабильности признака деструкции сульфонола у консорциумов модельной установки и выделенных из них чистых культур.

5.3. Исследование эффективности деструкции сульфонола консорциумами модельной установки в различных условиях.

5.4. Генетический перенос плазмид деградации сульфонола.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биодеградация ПАВ и минеральных масел и ее генетическая природа"

К концу второго тысячелетия экологические проблемы резко обострились. На сегодняшний день число загрязняющих веществ антропогенного происхождения в водоемах и почве превысило миллион наименований и будет увеличиваться, поскольку ежегодно синтезируется свыше четверти миллиона новых химических веществ.

Поступление ксенобиотиков в окружающую среду происходит при авариях, в связи с несовершенством производственных технологий, слабой природоохранной базой предприятий и низкой экологической культурой населения. Крупномасштабным источником загрязнений природных объектов являются индустриальные сточные воды. Попадание в биосферу минеральных масел и поверхностно-активных веществ (ПАВ), присутствующих в стоках предприятий различного профиля, значительно ухудшает санитарно-гигиеническое состояние природных объектов и оказывает вредное влияние как на человека, так и на биоценозы водоемов и почвы.

Одним из способов решения проблемы охраны окружающей среды от загрязнений является очистка бытовых и производственных сточных вод. В настоящее время наряду с механическими и физико-химическими методами широко применяется биологическая очистка с использованием активного ила, а также микробиологическая, которая отличается экологической безопасностью и более высокой экономичностью по сравнению с другими методами [26,51,130]. Широкое распространение получают способы биоремедиации загрязненных земель путем интродукции активных селекционированных микроорганизмов.

Для наиболее эффективной реализации микробиологической очистки сточных вод и почвы большое значение имеет не только поиск и создание микроорганизмов с повышенной деструктивной активностью, но и всестороннее их изучение, в частности, исследование генетических механизмов процесса деструкции ксенобиотиков. Эти знания позволят создать фундаментальные научные основы приемов экологической биотехнологии, моделировать эти процессы и управлять ими.

Современным достижением в развитии биологической очистки сточных вод является метод локальной микробной очистки. Основу его составляет биокатализатор - селекционированные высокоактивные культуры микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованные на инертных носителях [49,52,112]. Биокатализаторы очистных установок представляют собой сложные микробные консорциумы, изучение которых представляет большой научный и практический интерес. Повышение уровня знаний о процессах микробной деструкции ксенобиотиков, в том числе их генетической регуляции, позволит находить грамотные технологические решения при совершенствовании технологий микробной очистки.

Процесс деструкции ксенобиотиков, в частности, ПАВ и нефтепродуктов, во многих случаях осуществляется за счет экспрессии плазмидных генов [42,143,148,149]. Изучение подобных явлений представляет интерес как в плане получения новых знаний о плазмидах деградации, так и создает возможность улучшения качественных характеристик штаммов-деструкторов и консорциумов с помощью генно-инженерных манипуляций; расширяет возможность использования генетических методов для оценки структуры и динамики микробных сообществ.

Целью данной работы явилось изучение природы генетического детерминирования процессов биодеградации минеральных масел и поверхностно-активных веществ.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследований:

1. Провести плазмидный скрининг среди изолированных из микробных консорциумов штаммов-деструкторов минеральных масел.

2. Доказать участие плазмид, выявленных у штамма Acinetobacter calcoaceticus ТМ-31, в деградации минерального масла, исследовать их стабильность и трансмиссивность.

3. Изучить локализацию генетических детерминант признака деградации неионогенных поверхностно-активных веществ у штаммов-деструкторов.

4. Отработать приемы плазмидного анализа консорциумов модельных очистных установок.

5. Провести плазмидный скрининг среди составляющих консорциумы штаммов-деструкторов сульфонола, изучить генетическую стабильность и возможные механизмы переноса плазмид деградации в другие микроорганизмы.

6. Оценить эффективность процесса деструкции сульфонола консорциумами модельной установки и составляющими их штаммами.

Научная новизна проведенных иследований

Впервые выявлены плазмиды деградации минерального масла и гексадекана размерами 120; 9 и 8 kb у штамма Acinetobacter calcoaceticus ТМ-31, изолированного из консорциума установки, моделирующей очистку стоков от минеральных масел. Показано, что в его утилизации участвуют все три обнаруженные плазмиды: плазмида рАс (120 kb) ответственна за деструкцию гексадекана, плазмида рАс2 (8 kb) - за деструкцию нафтено-парафиновой фракции масла. Показана возможность передачи этих плазмид в бесплазмидные дериваты исходного штамма и в штамм Pseudomonas aeruginosa PU-21 трансформацией, а также в штаммы других псевдомонад путем мобилизационного конъюгационного переноса.

Установлена хромосомная локализация генов деградации неионогенных поверхностно-активных веществ (НПАВ) у ряда коллекционных и выделенных из окружающей среды штаммовдеструкторов. Выявлены новые плазмиды биодеградации сульфонола -анионного поверхностно-активного вещества (АПАВ) в штаммах P.cepacia и Р. aeruginosa, изолированных из консорциумов модельной очистной установки. Обнаруженные плазмиды pSfl (54 kb) и pSf2 (4,3 kb) детерминируют первый этап биодеградации сульфонола -десульфонирование и способны к конъюгационному переносу в клетки представителей рода Pseudomonas. Показано, что изменения генетической структуры консорциума, осуществляющего деструкцию АПАВ сульфонола, полностью отражают колебания численности и видового состава составляющих его микроорганизмов.

Научно-практическая значимость Материалы диссертационных исследований нашли применение на биологическом и химическом факультетах Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского в учебном процессе, при подготовке курсовых и дипломных работ. Научные исследования, связанные с разработкой методических рекомендаций по эксплуатации очистных сульфонолразрушающих установок колоночного типа в режиме непрерывного процесса используются на кафедре промышленной теплотехники в Саратовском государственном техническом университете в курсе "Технология очистки и обезвреживания промышленных выбросов". Разработанный способ мониторинга микробных консорциумов на основе анализа их плазмидных профилей используется в Саратовском региональном отделении Российской экологической академии при создании и внедрении микробиологических способов очистки от загрязняющих веществ. Материалы диссертации предполагается использовать при разработке очистных сооружений сланцеперерабатывающего комбината в Саратовской области. 9 I

Апробация работы Материалы диссертации обсуждались на конференциях: "Проблемы экологии в металлургии, машиностроении и пути их решения" (Суздаль, 1992), "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1992), "Поверхностно-активные вещества и сырье для их производства" (Белгород, 1992), "Биология и биотехнология очистки воды "-^Полтава, 1992), "Микробное разнообразие: состояние, стратегия, экология, перспективы" (Пермь, 1996), "Вода, экология, технология" (Москва, 1996), "Проблемы изучения биосферы" (Саратов, 1996), "2-nd International Symposium Biosorption and Bioremediation" (Prague, 1998), "Химия для медицины и ветеринарии" (Саратов, 1998).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 2 - в зарубежных изданиях.

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 166 страницах машинописного текста; содержит 22 таблицы и 18 рисунков; состоит из введения, 5 глав, заключения^ выводов и списка литературы, включающего 156 источников, в том числе 56 - зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Плешакова, Екатерина Владимировна

Выводы

1. В результате плазмидного скрининга одиннадцати штаммов-деструкторов, выделенных из микробного консорциума лабораторной установки, моделирующей процесс очистки стоков от минеральных масел, плазмиды обнаружены у четырех штаммов: Acinetobacter calcoaceticus ТМ-31 (120; 9 и 8 kb), P.putida IV3 (180 kb), Pseudomonas sp.IV4 (54 kb) и P.alcaligenes III2 (80 kb).

2. Плазмиды pAc, pAcl и pAc2 (размерами: 120; 9 и 8 kb соответственно), выявленные у штамма-деструктора Acinetobacter calcoaceticus ТМ-31, входящего в состав микробного консорциума модельной установки, участвуют в утилизации минерального масла; плазмида рАс (120 kb) ответственна за деструкцию гексадекана, на плазмиде рАс2 (8kb) находятся гены, кодирующие ферменты, осуществляющие деструкцию нафтено-парафиновой фракции минерального масла. Плазмиды стабильно наследуются в процессе хранения и при пассажах данного штамма на искусственных питательных средах.

3. Показана передача плазмид рАс, pAcl и рАс2 с помощью трансформации в бесплазмидные клетки того же штамма и в штамм л

P.aeruginosa PU-21 с эффективностью 3-10 и 10 трансфомантов/мкг соответственно, а также с использованием мобилизующей плазмиды RP4 -конъюгацией в некоторые штаммы рода Pseudomonas с частотой 1бб.

4. Изучено генетическое детерминирование свойства биодеградации у выделенных из почвы штаммов-деструкторов стеарокса-6 P.fluorescens А26 и Р. palleroni N50. Отсутствие спонтанной и индуцированной элиминации, невысокая частота конъюгационного переноса, отсутствие плазмид свидетельствуют о том, что свойство деструкции стеарокса-6 в этих микроорганизмах детерминировано хромосомными генами.

5. Изменения плазмидного профиля консорциума, осуществляющего деструкцию сульфонола (АПАВ) отражают колебания численности и соотношения составляющих микробное сообщество бактериальных видов.

Заключение

В результате антропогенной деятельности в окружающую среду ежегодно поступает огромное количество синтетических соединений. Среди множества ксенобиотиков минеральные масла и ПАВ являются широко распространенными загрязнителями, оказывающими многофакторное отрицательное воздействие на биосферу [18,39,61].

Возрастающее применение ПАВ и минеральных масел, ведущее к увеличению их содержания в сточных водах промышленных предприятий и в природных объектах, требует разработки и внедрения высокоэффективных методов очистки.

Вследствие попадания ПАВ и минеральных масел в природу, в естественных субстратах появились микроорганизмы с повышенной устойчивостью к этим соединениям, многие из которых способны к их деструкции. В некоторых случаях селекция таких микроорганизмов осуществляется благодаря катаболическим плазмидам, которые кодируют ферменты, необходимые для деградации чужеродных соединений и часто способны к быстрому распространению в бактериальном сообществе.

В связи с этим, использование микроорганизмов, обладающих свойствами биодеградации различных вредных веществ, в современной технологии очистки сточных вод и загрязненных объектов окружающей среды от ксенобиотиков считается наиболее перспективным и экологически безопасным способом детоксикации отходов.

Современным достижением в развитии биологической очистки сточных вод является метод локальной микробной очистки, который более эффективен и экономичен по сравнению с другими методами за счет малых объемов концентрированных стоков и относительно небольших размеров установки для их обезвреживания.

Для успешного использования метода локальной микробной очистки в производстве необходимо создание проточной системы культивирования, селекция высокоактивных штаммов микроорганизмов-деструкторов, закрепленных на инертных нерастворимых в воде носителях, представляющих собой биокатализаторы.

На основании результатов многочисленных исследований, свидетельствующих о том, что деградация большого спектра ксенобиотиков -это плазмидообусловленный процесс, выявление плазмид деградации минерального масла и ПАВ в консорциумах и составляющих их штаммах-деструкторах предполагает расширение научной информации о процессах микробного окисления этих веществ. Кроме того, плазмидный скрининг микроорганизмов-деструкторов в качестве генотипической характеристики микробных сообществ в установках для очистки сточных вод, содержащих минеральные масла и ПАВ, может дать оценку динамики сообществ биокатализаторов и их работы.

Знания генетической регуляции процесса деградации минеральных масел и ПАВ, как в чистой культуре, так и в составе консорциумов, необходимы для улучшения основных параметров биотехнологического процесса микробной очистки, в том числе, путем направленных генетических модификаций.

Проведенная работа по созданию биокатализаторов, представляющих собой иммобилизованные на волокнистом носителе консорциумы микроорганизмов-деструкторов, позволила создать коллекцию подобных биокатализаторов - активной основы микробиологического способа локальной очистки сточных вод, содержащих нефтяные масла. Путем направенной селекции в течение двух месяцев были получены 22 консорциума микрорганизмов, активно использующих в качестве единственного источника углерода и энергии индустриальное масло И-20 в концентрации 0,1-1, г/л. На основе этих биокатализаторов смоделирована опытная очистная установка, работающая в непрерывном режиме. Адаптационный период биокализатора установки продолжался несколько месяцев, после чего эффективность очистки составила 98% за сутки и сохраняется неизменной в течение семи лет наблюдений.

В результате плазмидного скрининга одиннадцати штаммов, изолированных из консорциума лабораторной установки У1, моделирующей процесс очистки стоков от минеральных масел, обнаружены плазмиды у четырех штаммов-деструкторов: Acinetobacter calcoaceticus ТМ-31 (120; 9 и 8 kb), Pseudomonas putida IV3 (180 kb), Pseudomonas sp. IV4 (54 kb) и Pseudomonas alcaligenes III2 (80 kb). Обнаружение плазмид у всех трех штаммов рода Pseudomonas, входящих в состав консорциума биокатализатора опытной установки, еще раз подтверждает известные данные о доминировании псевдомонад среди бактерий-деструкторов, их огромном метаболическом потенциале, определяемом в том числе плазмидами.

Для выяснения возможности локализации на плазмидах, выявленных у штамма Acinetobacter calcoaceticus ТМ-31 - наиболее активного деструктора, генетических детерминант, обозначенных как рАс (120 kb), pAcl (9 kb) и рАс2 (8 kb), контролирующих биодеградацию минеральных масел, были проведены эксперименты с применением стандартных приемов и критериев.

Было показано, что плазмиды стабильно наследовались в изучаемом штамме. Культивирование штамма в неселективных условиях (до 5 пассажей на МПА) не приводило к появлению в популяции бесплазмидных вариантов. В результате инкубации клеток в присутствии бромистого этидия (25 мкг/мл) получены клоны, утратившие способность расти на средах, содержащих минеральное масло Т-22 или гексадекан с частотой 30%, 1/3 из которых не растет на нафтено-парафиновой фракции минерального масла. Электрофоретический анализ предполагаемых элиминантных клонов показал утрату либо всех трех плазмид (рАс; pAcl и рАс2), либо двух из них: рАс и pAcl, либо одной - рАс.

Высокая частота элиминации признака деструкции минерального масла Т-22 при обработке элиминирующим агентом позволила предположить плазмидный контроль деградации изученных углеводородов.

Для установления корреляции между присутствием одной или нескольких плазмид и способностью микроорганизма к деградации углеводородов различных классов, входящих в состав минерального масла, были проведены исследования по переносу плазмид путем трансформации в бесплазмидные варианты штамма А. сакоасейсиБ ТМ-31, а также из трансформантов - в элиминанты.

Результаты ИК-анализа процесса деструкции гексадекана штаммами, участвующими в трансформации в качестве доноров плазмид и реципиентов, позволили получить качественные и количественные характеристики этого процесса. Культивирование осуществляли в течение трех суток в колбах на качалке при исходной концентрации гексадекана 0,4 г/л.

Разрушение гексадекана у элиминантного производного штамма ТМ-31 (П-46), содержащего плазмиду рАс2, происходило на 0,2% от исходной концентрации, у бесплазмидного элиминанта ТМ-31 (II-19) - на 0,1 %.

С высокой частотой (3x106 колоний/мкг) получены трансформанты, способные активно разрушать минеральное масло, его нафтено-парафиновую фракцию и гексадекан, при введении трех плазмид из исходного штамма А.сакоасейсиБ ТМ-31 в элиминант ТМ-31 (П-46), несущий рАс2 плазмиду и в бесплазмидный элиминант ТМ-31 (II-19). На электрофореграмме у этих трансформантов выявлены три плазмиды: рАс, рАс1 и рАс2. При культивировании на гексадекане штаммов с тремя плазмидами (рАс, рАс1, рАс2) наблюдалось карбоксилирование и укорочение алкильной цепи. Происходило уменьшение поглощения в областях СН2-и СН3-групп цепи (2910 см'1 и 2940 см ^соответственно) на 75% у исходного штама А. сакоасейсш ТМ-31 и трансформантов с тремя плазмидами ТМ-31 (Т1) и ТМ-31 (Т2).

В одном из повторных экспериментов по трансформации штамма ТМ-31(11-46) тремя плазмидами А.са1соасе1;юш ТМ-31, был получен трансформант А.са1соасейсш ТМ-31 (Т46) (рАс1; рАс2), способный к утилизации гексадекана, но отличался более слабой (35%) активностью по отношению к нему. Одно из возможных объяснений этого феномена таково: ключевой фермент деструкции гексадекана находится в плазмиде рАс, которая при переносе встроилась в хромосому, в результате чего копийность генов, ответственных за деструкцию гексадекана, уменьшилась. Этот результат предполагает локализацию генов деградации гексадекана на плазмиде рАс.

При передаче трех плазмид из исходного штамма Ахакоасейсш ТМ-31 в трансформант ТМ-31 (Т46) с уменьшенной способностью к утилизации гексадекана произошло усиление деструктивной функции при переносе плазмиды рАс; это можно интерпретировать как еще одно (косвенное) доказательство местонахождения генов деструкции гексадекана на плазмиде рАс.

Окончательное заключение, которое было сделано при анализе результатов исследований по трансформации и индуцированной элиминации свойств деградации минерального масла и гексадекана у штамма А. сакоасейсш ТМ-31: плазмида рАс ответственна за деструкцию гексадекана, на плазмиде рАс2 находятся гены, кодирующие ферменты, осуществляющие деструкцию нафтено-парафиновой фракции минерального масла, а в утилизации минерального масла участвуют продукты экспрессии всех трех обнаруженных плазмид: рАс, рАс1 и рАс2.

Культивирование элиминанта ТМ-31 (II-19), у которого отсутствовали все три плазмиды, после его хранения на селективной среде с минеральным маслом Т-22 в течение четырех месяцев с регулярными пересевами, привело к снижению исходной концентрации гексадекана на 50%, что может быть связано с особенностями утраты плазмид клеткой в результате элиминации. Если гены деструкции гексадекана, находящиеся в плазмиде рАс встроились в хромосому в результате интеграции, то после длительного хранения и ряда пассажей на селективной среде могла произойти дерепрессия плазмидных генов и реверсия свойства деструктивной активности.

Разрушение гексадекана трансформантом ТМ-31 (TN2), который был получен при введении трех плазмид из A.calcoaceticus ТМ-31 в бесплазмидный вариант штамма ТМ-31 (II-19), оказалось более высоким -93%. Этот результат может также свидетельствовать в пользу встраивания плазмиды рАс в хромосому и дальнейшей реверсией признака у штамма ТМ-31 (II-19), у которого в совокупности с переданными плазмидами рАс, pAcl и рАс2 экспрессия генов деструкции выражена сильнее, в связи с чем наблюдали более высокую деструктивную активность.

В ходе экспериментов по трансформации обнаруженных плазмид исследуемого штамма в бесплазмидные штаммы псевдомонад частота передачи трех плазмидных ДНК из штамма A.calcoaceticus ТМ-31 в штамм

Г)

Р. aeruginosa PU-21 составила 10 трансформантов/мкг. Гены утилизации гексадекана и минерального масла, локализованные на трех плазмидных репликонах, не передавались реципиентным культурам P.putida АС340 и P.putida BS394 посредством конъюгации, несмотря на использованные в этой серии экспериментов различные модификации техники переноса.

В связи с этим, были поставлены эксперименты по мобилизации к переносу плазмидных генов деградации гексадекана и минерального масла из штамма A.calcoaceticus ТМ-31 с использованием мобилизующей плазмиды RP4 группы несовместимости Р-1. Эффективность передачи генов деградации гексадекана в штамм P.putida BS394 составила 10"6. Используя выявленные у A.calcoaceticus ТМ-31 способности к генетическому обмену можно получать модифицированные штаммы, перспективные в биотехнологии очистки окружающей среды от загрязнений.

При изучении генетического детерминирования признака деградации одного из НПАВ - стеарокса-6 у выделенных из почвы штаммов P.fluorescens А26 и P.palleroni N50 были получены результаты, свидетельствующие в пользу хромосомной локализации этого признака: отсутствие а) спонтанной и индуцированной элиминации свойства деструкции стеарокса-6, б) плазмидных репликонов при электрофоретическом скрининге ДНК. Частота передачи свойства биодеградации в случае конъюгативного процесса составила Ю^-Ю5, которая предполагает возможность его переноса в составе как плазмидных, так и хромосомных генов.

Электрофоретическое изучение препаратов ДНК, полученных из семи штаммов, относящихся к роду Pseudomonas: P.putida ТШ-18; P.putida ТР-19; P.fluorescens ОС-283; Pseudomonas sp. ОС-22; P.putida АТ-31; Pseudomonas sp. U-31 и Р. putida 2.7, деструкторов различных типов НПАВ, не выявило в них плазмидных ДНК. Эти результаты полностью соотносятся с известными данными о том, что деструкция НПАВ клетками Pseudomonas контролируется хромосомными генами.

Плазмидный скрининг микробных консорциумов биокатализаторов модельной установки Sf для очистки сульфонолсодержащих сточных вод позволил представить закономерности выделения плазмидных молекул в зависимости от меняющегося видового состава консорциумов, который, в свою очередь, обусловлен изменениями физико-химических факторов в опытных установках и окружающей среде. Изученные микробные консорциумы Sfl и Sf2 образованы пятью видами бактерий. Как показали наши исследования, в отличие от ранее проанализированных консорциумов, осуществляющих деградацию минеральных масел, чрезвычайно разнообразных по своему видовому составу, у сульфонолдеградирующих консорциумов можно изучать плазмидный спектр с помощью разных методов выделения ДНК, не применяя для этого изоляцию чистых культур.

У консорциумов установки Sf было выявлено два типа плазмидных молекул размером 54 и 4,3 kb.

Исследования по обнаружению плазмид у чистых культур, изолированных из консорциума Sfl в различные периоды работы установки при повышении концентрации сульфонола от 0,2 до 0,75 г/л, показали наличие плазмид у представителей штаммов Р.сераша - р8П (54 кЬ), Р.аешдтоза - р8£2 (4,3 кЬ). Эти штаммы преобладают в консорциумах, составляя доминантное ядро. Данные этих экспериментов положительно коррелировали с результатами плазмидного скрининга консорциумов установки

Проведенные исследования также показали, что обнаружение плазмид в консорциуме зависит от частоты встречаемости штамма в сообществе, которая зависит от многих факторов: температуры, концентрации основного субстрата, скорости протока, рН среды и др. Если доля штамма с плазмидными генами деструкции уменьшается до низкого уровня ( порядка 20% и менее) по сравнению с бесплазмидными штаммами, то плазмида может не выявляться. Так, период 3, при котором микрорганизмы консорциума находились некоторое время в неблагоприятных условиях: при пониженной температуре и отсутствии аэрации. Видовой состав существенно изменился в сторону вытеснения плазмидных штаммов.

В связи с тем, что результаты плазмидного скрининга полностью отразили динамику видового состава микробных сообществ данного сульфонолутилизирующего биокатализатора с доминантными плазмидосодержащими штаммами, нам представляется реальным применение электрофоретического анализа ДНК микробных консорциумов в качестве контрольного теста при периодическом наблюдении за технологией и режимом работы очистных установок. Этот подход позволяет намного сократить время и затраты по сравнению с изучением отдельных микроорганизмов, формирующих основу биокатализатора. Кроме того, плазмидный скрининг микробных консорциумов можно рассматривать в качестве своеобразного генетического мониторинга, определяющего метаболический потенциал консорциума и возможности его эффективного использования в биотехнологических процессах очистки сточных вод.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что в популяциях штаммов Р.сераЫа 3.1 и Р.сераЫа 3.2 с плазмидой рБП (54 кЬ), существует вариабельность деструктивной активности по отношению к сульфонолу. В неселективных условиях с частотой 5% встречаются клоны с пониженной деструктивной активностью. Обработка культур ингибитором репликации акридиновым оранжевым приводит к увеличению числа клонов, не способных к утилизации сульфонола. Частота возникновения таких вариантов составляла 8-12 %. Визуализация плазмидных ДНК клонов P.cepacia 3.1/40; 3.1/32 и 3.2/16, полученных в результате индуцированной элиминации, показала утрату репликона pSfl, что позволило предположить плазмидную природу признака деструкции сульфонола у штаммов P.cepacia 3.1 и 3.2.

Частота спонтанной элиминации признака деструкции сульфонола у штаммов Р.aeruginosa составила, %: P.aeruginosa 1.3 - 23,5; P.aeruginosa 5.2 -25,5; индуцированной - 27 и 29, соответственно. Эти результаты и данные электрофоретического анализа ДНК, которые свидетельствовали об отсутствии автономных репликонов при полной потере способности к деструкции сульфонола, определенной количественным методом, явились доказательствами детерминирования плазмидой pSf2 признака утилизации сульфонола у штаммов P.aeruginosa.

На основании количественной оценки содержания сульфонола в среде после культивирования сделан вывод о том, что первоначальной реакцией деструкции сульфонола штаммами видов P.cepacia (pSfl) и P.aeruginosa (pSf2) является десульфонирование. Вероятно, эта реакция контролируется генами плазмид pSfl и pSf2, т.к. элиминанты, утратившие упомянутые плазмиды, эту реакцию не осуществляют.

В связи с тем, что была отмечена нестабильность признака деструкции сульфонола, связанная с утратой плазмид в штаммах, составляющих консорциумы, изучали деструкцию сульфонола консорциумами в различных условиях. Результаты анализа деструктивной активности консорциумов в условиях периодического культивирования показали, что клетки консорциумов в свободном состоянии в условиях периодического культивирования не проявляли значительной деструктивной активности (от 6,8 до 21,7% за сутки).

Консорциумы из сулфонолокисляющих установок практически полностью теряли исходный фенотип в результате ряда пассажей (8-10) на неселективной агаризованной среде.

При хранении консорциумов 8П и Б£2 на твердой селективной среде, т.е. в отсутствии непрерывной подачи аэрируемых стоков, деструктивная активность снижалась по сравнению с исходной соответственно на 65 и 50 %.

Было установлено, что данные консорциумы сохраняли способность утилизировать сульфонол (Сисх=0,15 г/л) на 52-55% в условиях периодического культивирования в установках в течение четырех месяцев. Процесс восстановления максимальной деструктивной активности биокатализатора (до 95-98%) в условиях непрерывного культивирования при постепенном повышении концентрации сульфонола от 0,2 до 0,75 г/л и стабилизация деструкции составляли 2,5 месяца. Таким образом, селекционированные консорциумы установки обладают значительным метаболическим потенциалом, который не утрачивается при продолжительном отсутствии протока.

Итак, мы убедились в экспериментах, что у чистых культур утрата свойства деструкции сульфонола происходит вследствие элиминации кодирующей его плазмиды. Потеря ферментативного пути деградации сульфонола консорциумом, связанная с отсутствием необходимого селективного давления, является также следствием потери плазмид из части клеток, нарушения равновесия плазмидосодержащих и бесплазмидных штаммов в популяции, их взаимосвязей при реализации метаболических возможностей, отсутствием условий для генетического обмена и рядом других причин.

Перечисленные выше причины нестабильности признака деструкции сульфонола не свойственны селекционированным нами биокатализаторам в условиях постоянного присутствия ксенобиотика и прямоточной системы очистки, в связи с чем наблюдается высокая стабильность и эффективность работы установки (98-100% разрушения загрязнителя) в течение шести лет наблюдений.

В ходе экспериментов по выяснению трансмиссивности обнаруженных плазмид у штаммов, изолированных из консорциума БП, было установлено, что плазмида деградации рБН штамма Р.сераша 3.1 способна к мобилизационому переносу с помощью плазмиды КР4:Тп1 в бесплазмидный штамм Р.ргШёа В8394, эффективность переноса составила 104-10"5. Электрофоретический анализ показал наличие в трансконъюгантах плазмидной ДНК, идентичной по массе с плазмидой рЭА донорного штамма Р.сераЫа 3.1.

Частота конъюгационной передачи признака утилизации сульфонола в составе плазмиды рБ£2 из штамма Р.аеп^тоБа 5.2 в бесплазмидный штамм Р.рийёа АС340 составила кгЧо-4.

Результаты совместного культивирования плазмидосодержащих штаммов Р.серааа 3.1. (рБН) и P.aeruginosa 5.2 (рБ12) с бесплазмидным штаммом Р.сераша 1.4, моделирующего систему генетического обмена между штаммами-деструкторами, входящими в состав микробных сообществ, и последующего электрофоретического анализа, позволили предположить, что плазмида р8£2 способна мобилизовать к переносу плазмиду рБН.

Таким образом, обнаруженные у штаммов консорциумов биокатализатора лабораторной установки трансмиссивные плазмиды биодеградации сульфонола позволяют рассматривать их в очистных системах как источник распространения генетических элементов, ответственных за процессы разрушения ксенобиотиков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плешакова, Екатерина Владимировна, Саратов

1. A.c. N 1648088 СССР, МКИ С12 N 1/20, С 12 0 1/18. Штамм бактерий Bacillus stearothermophilus, используемый в качестве тест-культуры для определения бактериостойкости технических смазочных материалов/ Матюша Г.В., Сашунина A.A., Герасименко A.A. и др.

2. Абрамзон A.A., Зайченко Л.П., Файнгольд С.И. Поверхностно-активные вещества. Синтез, анализ, свойства, применение: Учебное пособие для ВУЗов. Л.: Химия, 1988. - 200 с.

3. Андреева А.Л., Селифонов С.А., Старовойтов И.И. Плазмида деградации бифенила, хлорбифенилов, мета-толуилата Pseudomonas putida// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1989. - N11. - С.32-37.

4. Балашов C.B., Воронин A.M. Плазмиды биодеградации бензолсульфоновой и п-толуолсульфоновой кислот бактерий вида Comamonas testosteroni//Генетика. 1997. - Т.ЗЗ, N 5. - С.604-610.

5. Балашов C.B., Воронин A.M. Бактерии-деструкторы сульфоароматических соединений из активного ила// Микробиология. 1996. - Т.65, N 5. - С.627-631.

6. Воронин A.M. Состояние и перспективы генетических исследований бактерий рода Pseudomonas// Генетика и физиология микроорганизмов -перспективных объектов генной инженерии/ Пущино, 1985. С.25-37.

7. Воронин A.M., Филонов А.Е., Балакшина В.В. Стабильность плазмид биодеградации нафталина NPL-1; NPL-41 в популяциях Pseudomonas putida вусловиях непрерывного культивирования// Микробиология. 1985. - Т. 54, вып. 4. - С.610-615.

8. Воронин A.M., Цой Т.В. Генетические системы биодеградации: организация и регуляция экспрессии// Генетика. 1989. - Т. 25, N4. - С.581-595.

9. Брода П. Плазмиды. М.: Мир, 1982. - 224 с.

10. Бельков В.В. Нестабильность рекомбинантных молекул// Генетика. -1983. Т.19, N10. - С.1573-1581.

11. Вербина Н.М. Деградация микроорганизмами неприродных органических соединений в окружающей среде// Микробиология. ВИНИТИ. 1978.-Т.7.-С.65-107.

12. Волков В.А. Поверхностно-активные вещества в моющих средствах и усилителях химической очистки. М.: Легпромбытиздат, 1985. - 200 с.

13. Гвоздяк П.И. Микробиологи и биотехнология очистки воды: Qvo vadis?// Химия и технология воды. 1989. - Т.11, N9. - С.854-858.

14. Головлева Л.А., Алиева P.M., Рустемов С.А. Изучение стабильности штамма Pseudomonas aeruginosa DC 13 в условиях биологической очистки промышленных сточных вод от -метилстирола// Микробиология,- 1988. -Т.57, вып.6. С. 1044-1046.

15. Градова Н.Б., Диканская Э.М., Михайлова В.В. Использование углеводородов дрожжами. М.: наука, 1971. - 120 с.

16. Григорьева Л.В., Корчак Г.И., Бей Т.В. Влияние поверхностно-активных веществ на выживаемость в воде кишечных бактерий, фагов и бделловибрионов// Кишечные инфекции. 1979. - N11. - С. 104-107.

17. Грищенко Н.Ф., Грищенко Р.И., Сакаль H.H. и др. Действие некоторых поверхностно-активных веществ на санитарно-показательную ипатогенную микрофлору в речной воде// Гигиена насел, мест. 1980. - Т. 19, N7. - С.26-29.

18. Грищенков В.Г., Аминов Р.И., Воронин A.M. Конкурентные взаимодействия в смешаных культурах изогенных штаммов Pseudomonas putida BS394, несущих четыре разные природные плазмиды утилизации капролактама// Микробиология. 1993. - Т.62, вып.З. - С.428-436.

19. Грушко Я.М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах. Л.: Химия, 1982. - 216 с.

20. Домарадский И.В. Роль плазмид в эволюции и систематике// Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1983. - Т.19, N1. - С.3-9.

21. Дубейковский А.И., Гафаров А.Б., Наумов Р.Я. Плазмидный контроль деградации сульфоароматических соединений штаммом Pseudomonas sp. BS 1304// Генетика,-1992,- Т.28, N11. С.34-39.

22. Есикова Т.З., Грищенков В.Г., Боронин A.M. Характер утилизации капролактама штаммами Pseudomonas sp. в зависимости от САР-плазмид и бактерий-хозяев// Прикл. биохим. и микроб. 1993. - Т.29, вып.2. - С.259-266.

23. Залевский B.C. Закономерности микробиологической очистки воды от нефтепродуктов// Химия и технология воды. 1985. - Т.7, N2. - С.67-69.

24. Изжеурова В.В. Павленко Н.И. Биологические аспекты очистки нефтесодержащих сточных вод// Химия и технология воды. 1995. - Т.17, N2. - С.181-197.

25. Изжеурова В.В., Павленко Н.И., Раилко З.А. Направленная селекция биоценоза активного ила, разрушающего нефтепродукты// Химия и технология воды. -1991. Т. 13, N1. - С.76-79.

26. Казакова Л.П., Крейн С.Э. Физико-химические основы производства нефтяных масел. М.: Химия, 1978. - 320 с.

27. Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н. Биологическая деструкция нефти и нефтепродуктов, загрязняющих почву и воду// Биотехнология. 1998. - N1. -С.85-92.

28. Картавцева З.М., Коваль Э.З., Калаганов В.А. и др. Микроорганизмы-деструкторы моторных обкаточных масел// Микробиологи ческий журнал. 1992. - Т.54, N3. - С.54-58.

29. Квасников Е.И., Айзенман Б.Е., Куприянова Е.А. и др. Рост и образование антибиотиков бактериями рода Pseudomonas на средах с низкомолекулярными н-алканами//Микробиология. 1975. - Т.44, N1. - С. 55.

30. Квасников Е.И., Исакова Д.М. Физиология термотолерантных микроорганизмов. М.: Наука, 1978. - 165 с.

31. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы-деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев: Наукова думка, 1981. -131 с.

32. Квасников Е.И., Соломко Э.Ф., Нестеренко O.A. Усвоение бактериями легколетучих н-алканов (Q-C ю)// Микробиология. 1972. -T.41,N 4. - С.586.

33. Керстен Д.К. Отношение микобактерий, окисляющих углеводороды, к различным источникам углерода// Микробиология. 1964. - Т.33, N1. -С.37.

34. Клонирование ДНК Методы: Пер. с англ./ Под ред. Д.Гловера. М.: Мир, 1988 - 538 с.

35. Коронелли Т.В., Комарова Т.И. Игнатченко A.B. Взаимодействие бактерий в культуре, содержащей Pseudomonas и Mycobacterium в связи с окислением углеводородов// Микробиология. 1984. - Т.53, N2. - С.213-217.

36. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Денисов Ю.В. Липиды парафиноокисляющего штамма Pseudomonas aeruginosa// Микробиология. -1982. Т.51, N4. - С.673-676.

37. Коскова JI.A., Козловская В.И. Токсичность синтетических поверхностно-активных веществ и моющих средств для водных животных// Гидробиол. журн. 1979. - Т.15, N1. - С.77-84.

38. Кошелева И.А., Соколов С.Л., Балашова Н.В. и др. Генетический контроль биодеградации нафталина штаммом Pseudomonas sp. 8909N// Генетика. 1997. - Т.ЗЗ, N6. - С.762-769.

39. Крейн С.Э., Бессмертных К.И., Работнова И.А. и др. Изменение некоторых свойств нефтяных масел под действием микобактерий// Прикл. биохим. и микроб. 1967. - Т.З, вып.6. - С.647-652.

40. Кривиский A.C. Всесоюзная научная конференция, посвященная метаболическим плазмидам микроорганизмов, 19-23 октября 1982г., Таллин// Микробиология. 1983. - Т.52. - С.683-688.

41. Литвиненко JI.A., Петрикевич С.Б., Кравчук A.B. и др. Катаболизм капролактама и его интермедиатов производными штамма Pseudomonas putida BS394, содержащими различные САР-плазмиды// Микробиология. -1993. Т.62, вып.З. - С.447-453.

42. Литвиненко С.Н. Защита нефтепродуктов от действия микроорганизмов. М.: Химия, 1977. - 144 с.

43. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. -М.:Химия, 1984.-448 с.

44. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М. - 1984.

45. Методы молекулярной генетики и генной инжененрии/ Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. Новосибирск: Наука, 1990. - 248 с.

46. Методы общей бактериологии: в Зт./ Под ред. Ф. Герхардта. -М.:мир.-1976.-Зт.

47. Микробиологическая очистка воды от поверхностно-активных веществ / Ставская С.С., Удод В.М., Таранова Л.А., Кривец И.А. Киев: Наук, думка, 1988. - 181 с.

48. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976.-440 с.

49. Михеев A.B., Галушин В.М. и др. Охрана природы. М.: Просвещение, 1987. - 256 с.

50. Могилевич Н.Ф. Иммобилизованные микроорганизмы в очистке воды. Преимущества и перспективы// Микробиология охраны биосферы врегионах Урала и Северного Прикаспия: Тез. докл. Всесоюзн. симп. -Оренбург, 1991. С.78.

51. Муратова А.Ю. Микробная деструкция минеральных масел: Дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1997. - с. 186.

52. Муратова А.Ю., Турковская О.В. Изучение микробного консорциума осуществляющего деструкцию минерального масла//Прикл. биохим. и микроб. 1994. - Т.ЗО, N6. - С.836-841.

53. Никовская Г.Н., Гвоздяк П.И., Шамолина И.И. и др. Иммобилизация Pseudomonas alcaligenes TR деструктора алкилбензолсульфонатов на полимерных волокнах // Биотехнология. - 1990. - N2. - С.53-56.

54. Овчаров Л.Ф., Ротмистров М.Н. Плазмидная детерминация разрушения некоторых анионных поверхностно-активных веществ// Химия и технология воды. 1987. - 9,N2. - С. 165-167.

55. Овчаров Л.Ф., Таранова Л.А. Плазмиды биодеградации некоторых ионогенных ПАВ// Микробиол. методы защиты окружающей среды (Пущино, 5-7 апреля, 1988): Тез. докл. ЦНБИ, 1988. - С.48.

56. Овчаров Л.Ф., Таранова Л.А., Гвоздяк П.И. Генетическая детерминация разрушения амфолитных ПАВ// Микробиология. 1989. - Т.58, N6. - С.1043-1045.

57. Осипов В.М., Белова Т.Д. Спектрофотометрический метод определения содержания нефтепродуктов в сточной воде// Хим. и техн. топлив и масел. 1968, N1. - С.56-59.

58. Остроумов С.А. Биологическая активность вод, содержащих ПАВ// Химия и технология воды. -1991. Т. 13, N3. - С.270-283.

59. Павленко Н.И., Бега З.Т., Изжеурова В.В. и др. Интенсификация биологической очистки сточных вод нефтеперерабатывающих заводов// Химия и технология воды. 1989. -Т.11, N6. - С.541-544.

60. Таранова JI.А. Бактериальная деструкция ионогенных ПАВ// Химия и технология воды. 1995. - Т.17, N5. - С. 538-544.

61. Таранова Л.А., Грачевский В.В., Делеменчук Н.В. и др. Бактериальная деструкция катионных ПАВ // Биотехнология. 1996. - N9. -С.32-37.

62. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологи. М.: Колос, 1993. - 175 с.

63. Торопова Е.Г., Матюша Г.В., Белоусова A.A. Бактерии, разрушающие технические масла// Микробиология. 1986. - Т.55, вып.З. -С.526-527.

64. Удод В.М., Подорван Н.И., Венгжен Г.С. Микроорганизмы-деструкторы ряда НПАВ// Микробиология. 1983. - Т.52, вып. 3. - С. 370-374.

65. Учебно-методическое пособие по генетике бактерий/ Саратов: СГУ. 1979. - 17 с.

66. Филонов А.Е., Воронин A.M. Стабильность плазмид и конкуренция плазмидосодержащих и бесплазмидных штаммов в условиях непрерывного культивирования// Антибиотики и химиотерапия. 1990. - Т.35, N5. - С.46-50.

67. Фримантл М. Химия в действии, в 2-х т. М.: Мир, 1991, 2 т.

68. Холловей Б.В. Генетика Pseudomonas. Молекулярные основы генетических процессов. М.: Мир, 1981. - С.269-278.

69. Шевченко Т.Н., Рой A.B., Мирюба А.Ю., Клименко H.A. Скрининг плазмидной ДНК в штаммах микроорганизмов, использующихся для очистки сточных вод промышленных предприятий// Биополимеры и клетка. 1992. -Т.8, N5. - С.54-56.

70. Яковлев B.C. Хранение нефтепродуктов. Проблемы защиты окружающей среды. -М.: Химия, 1987. 152 с.

71. Яковлев C.B., Скирдов И.В., Швецов В.Н. и др. Биологическая очистка производственных сточных вод. М.: Стройиздат, 1985. - 208 с.

72. Янышева Н.И., Волошенко О.И., Черниченко И.А. и др. О бластомогенном действии некоторых поверхностно-активных соединений -компонентов CMC для населения // Гигиена и санитария. 1982. - N7. - С.96-98.

73. Adriaens P., Kohler Н-РЕ., Kohler Staub D., Focht DD. Bacterial dehalogenaton of chlorobenzoates and coculture biodégradation of 4,4-dichlorobiphenyl// Appl. Environ. Microbiol. 1989. - Vol.55. - P.887-892.

74. Barr M., Tice L. The preservation of aquers preparation containing nonionic surfactant. 1. Growth of microorganisms in solutions and dispersions of nonionic surfactants// J. Amer. Pharm. Assoc. Scient. Ed. 1957. - Vol.154, N 1. -P.163-169.

75. Bergey' s manual systematic bacteriology. Baltimore, London: Williams, Wiskins, 1984-1986. - 1599 p.

76. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alcaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA// Nucl. Acids Res. 1979. - Vol.7. -P.11513-1523.

77. Breen A., Jimenes L., Sayler G., et. al. Plasmid incidence and linear alkylbenzenesulfonate biodégradation in wastewater and pristine pond ecosestems// J. Ind. Microbiol. 1992. - Vol.9, N1. - P.37-43.

78. Chakrabarty A.M. Genetic engineering applied aspects// Jnd. I.Microbiol. - 1980. - Vol.20, N1. - P.103-108.

79. Chakrabarty A.M., Chou G., Gunsalis J. Genetic regulation of octane dissimilation plasmid in Pseudomonas// PNAS. Vol.70. - P.l 137-1140.

80. Cook A.M. Biodégradation of s-triazine xenobiotics// FEMS Microbiol. Rev. 1987. - Vol.46. - P.93-116.

81. Cook A.M., Grossenbacher Isolation and cultivation of microbes with biodegradative potential//Experintia. 1983. - Vol.39. - P.l 191-1198.

82. Cook K. A rapid method for the detection of nonionic surfactant-degrading microorganisms // J. Appl. Bacteriol. 1978. - Vol.44, N2. - P.299-304.

83. Dani L., Hawer B. Increased mutagenesis by cloned plasmid CAM-OCT genes potential for expanding substrate ranges of Pseudomonas spp.// Appl.and Environ. Microbiol. 1996. - Vol.62, N9. - P.3538-3540.

84. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonycleic acid in bacteria// Plasmid. 1978. - Vol.1. - P.584-588.

85. Evans P., Mang D., Kim K., Yong L. Anaerobic degradation of toluene by a denitrifying bacterium// Appl. and Environm. Microb. 1991. -Vol.57, N4. -P.1139-1145.

86. Finnerty W.R., Kallio R.E. Origin of palmitic acid carbon in palmitates formed from hexadecan-l-Cn and tetradecane-l-Cn by Micrococcus cerificans// J. Bacteriol. 1964. - Vol.87, N 6. - P.1261.

87. Focht D., Searles D., Koh S-Ch. Genetic exchange in soil introduced chlorobenzoate degraders and indigenous biphenyl degraders// Appl. and Environ. Microb. 1996. - Vol.62, N10. - P.3910-3913.

88. Foght J.M., Westlake D.W.S. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and aromatic heterocycles by a Pseudomonas species// Can. J. Microbiol. 1988. - Vol.34. - P.l 135-1141.

89. Foster J.W. Hydrocarbons as substrates for microorganisms// Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol, and Serol. 1962. - V.28, N 3. - P.24.

90. Fulthorpe R., Wyhdham R. Transfer and expression of the catabolic plasmid pBRC60 in wild bacterial recipients in a freshwater ecosystem// Appl. and Environ. Microb. 1991. - Vol.57, N5. -P.1546-1553.

91. Garland J.L., Mills A.L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization// Appl. and Eviron. Microbiol. 1991. - Vol.57. -P.2351-2359.

92. Gilleland H.E.Jr., Farley L.B. Adaptive resist polymixin in Pseudomonas aeruginosa due to an outer membrane impermeability mechanisms// Can. J. Microbiol. 1982. - Vol.28, N 7. - P.830-840.

93. Goodmann A.E., Hild E., Marshaal K.C. Conjugative plasmid transfer between bacteria under simulated marine oligotrophic conditions// Appl. and Environ. Microbiol. 1993. - Vol.59. -P.1035-1040.

94. Harayma S., Rekik M. The meta cleavage operon of TOL dergadative plasmid pWWO comprises 13 genes// Mol.and Gen Genet. 1990. - Vol.221, N1. -P.113-120.

95. Hartman J., Reineke W., Knackmuss H-J. Metabolism of 3-chloro, 4-chloro and 3,5-dichlorobenzoate by a pseudomonad// Appl. Environ. Microbiol. -1986.-Vol.37.-P.421-428.

96. Iain R., Sayler G., Wilson J. Maintaince and stability of introduced genotypes in groundwater aquifer material// Appl. and Environm. Microb. -1987. -Vol.53, N5.-P.996-1002.

97. Jimenez L., Breen A., Thomas N., Thomas W., Sayler G.S. Mineralization of linear alkylbenzene sulfonate by a four-member aerobic bacterial consortium// Appl. and Environ. Microbiol. 1994. - Vol.57, N 5. - P.1566-1569.

98. Juni E. Interspecies transformation of Acinetobacter: genetic evidence for a ubiquitous genus// J. Bacteriol. 1972. - Vol.112. - P.917-931.

99. Kado C.J., Liu S.T. Rapid procedure for the detection and isolation of large and small plasmid// J. Bacteriol. 1981. - Vol.145. - P.1365-1373.

100. Kimira B., Masatada M, Airoaki F. Heavy oil degradation by bacteria isolated from the seawater in oil-polluted bisan seto// Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. -1989. Vol.55, N12. - P.2173-2177.

101. Kiyohara H., Sugiyama M. Plasmid involvement in the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a Beijerinckia species// Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1983. - Vol.111, N 3. - P.939-945.

102. Kostal J., Demnerova K. A new-alkane degradation plasmid from Pseudomonas C12B// Proc. of the two Intern. Symp. Biosorption and Bioremediation, the Prague, 12-17 july 1998. Prague, 1998. - P. 13.

103. Kravetz L. Biodégradation of nonionic ethoxylates// J. Amer. Oil Chem. Soc. -1981. Vol.58, N 1. - P.58-65.

104. Leidner H., Gloor R., Wuest D., Wuhrmann K. The influence of the sulfonic group on the biodegradability of n-alkanabenzenesulfonates// Xenobiotica.- 1980. -Vol.10. -P.47-54.

105. Levy S.B., Miller R.V. Gene transfer in the environment / McGraw-Hiil, New York, 1989. P.234-245.

106. Locher H.H., Leisinger T., Cook A.M. Degradation of p-toluensulphonic acid via sidechain oxidation, desulphonation and meta ring cleavade in Pseudomonas (Comamonas) testosteroni T-2// J. Gen. Microbiol. -1989.-Vol.135.-P.1969-1974.

107. Marques S., Ramos J., Timmis K. Transcriptional control of the Pseudomonas putida TOL plasmid catabolite pathway//Mol. Microbiol. 1993. -N9. -P.923-929.

108. Nielsen K., Bones A., Elsas J. Induced natural transformation of Acinetobacter calcoaceticus in soil microcosms// Appl. and Environm. Microbiol.- 1997. Vol.63, N10. - P.3972-3977.

109. Ramos J.L., Waserfallen A., Rose K., Timmis K. Redesigning metabolic rontes: Manipulation of the TOL plasmid pathway for catabolism of alkylbenzoates// Science. 1987. - Vol. 235. - P.593-596.

110. Ripin M.J., Noon K.A., Cook T.M. Bacterial metabolism of arylsulphonates: role of meta-cleavage in benzene sulphonate oxidation by Pseudomonas testosteroni// Appl. Microbiol. 1975. - Vol.29, N 3. - P.382-385.

111. Rusansky S., Avigal R., Michaeli S., Gutnick D. Involvement of a plasmid in growth and dispersion pf crude oil by Acinetobacter calcoaceticus RA57//Appl. and Environ. 1987. - Vol. 53,N8. -P.1918-1923.

112. Rzechowska E. Studies on the biodégradation of nonionic surfactants applied in the polyestre fibre industry// Acta microbiol. pol. 1976.- Vol.25, N3. -P.211-217.

113. Sayler G.S., Hooper S. Catabolic plasmids of environmental and ecological significance// Microb. Ecol. 1990,- Vol.19, N1. - P.l-20.

114. Schmidt E., Hellwig M., Knackmuss H-J. Degradation of chlorophenols by a defined mixed microbial community// Appl. Environ. Microbiol. 1983. - Vol.46. - P.1038-1044.

115. Singer J. T., Finnerty W. R. Microbial metabolism of straight-chain and branched alkanes //Petroleum microbiology/ R. M. Atlas. New york, 1984. -P.l-59.

116. Singer J.T., Finnerty W.R. Genetics of hydrocarbon-utilizing microorganisms//Petroleum microbiology/ R.M. Atlas. New York, 1984. - P.299-354.

117. Stater J.H., Lovatt D. Biodégradation and the significance of microbial communities// Microbial degradation of organic compounds/ Marsel Dekker. New York, 1993. - P.439-485.

118. Swisher R.D. Ethoxylate nonionics// Surfactant scince series. 1970. - Vol.3. - P.245-254.

119. Swisher R.D. Linear alkylbenzene sulfonate (LAS) benzene rings: Biodégradation and acclimation studies// Yukagaku. 1972. - Vol.21, N3. - P. 130142.

120. Trevors J.T., Elsas I.D., Starodub M.E., Overbeek L.S. Survival of and plasmid stability in Pseudomonas and Klebsiella spp.introduced into agriculture drainage water// Can. Journ. Microb. 1989. - Vol.35, N7. - P.675-681.

121. Wallace W.H., Sayler G.S. Catabolic plasmids in the environment// Encyclopedia of Microbiology. 1992. - Vol.1. - P.417-430.

122. Wheelis M.L. The genetic of dissimilatory pathways in Pseudomonas// Ann. Rev.Micro. 1975. - Vol.29. - P.505-524.

123. Willets A. J., Cain R.B. Microbial metabolism of alkylbenzenesulfonates // Biohem.J. 1970. - Vol.120, N 4. - P.28-39.

124. Willetts A.J. Microbial aspects of the biodégradation of synthetic detergents: A reviewII Unt. Biodeterior. Bull. 1973. - Vol.9, N 1/2. - P.3-10.167

125. Williams P.A., Worsey M.J. Ubiquit of plasmids in coding for toluene and xylene metabolism in soil bacteria: Evidence for the existence of new TOL plasmids// J. Bacteriol. 1976. - Vol.120. - P.818-828.

126. Zuniga M.C., Durham D.R., Welch R.A. Plasmid and chromo-some-mediated dissimilation of naphtalene and salicylate in Pseudomonas putida PMD-1 // J. Bacteriol. -1981. Vql.l47,N 2. - P.836-849.

127. Zak J.C., Willing M.R. Functional diversity of microbial communities: a quantitative approach// Soil Biology and Biochemistry. 1994. - Vol. 54. - P. 1101-1108.

128. Zuckerberg A., Diver A., Peeri Z., Gutnick M. Emulsifier of Arthrobacter RAG-1: chemical and physical properties // Appl. and Environ. Microbiol. 1979. - Vol. 37. - P.414-420.

129. Zylstra G. J., Gibson D.T., Finette B. Toluene degradation by Pseudomonas putida Fl: genetic organization of the tod operon // Appl. and Environ. Microbiol. 1988. - Vol. 54. - P. 1498-1503.

130. САРАТОВСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ410600, Россия, г.Саратов, ул.Дзержинского, 41/2 Тел. (845-2) 72-10-34

131. ИНН 6455015668, Саратовское региональное отделение Российской Экологической Академии Р/с № 000467294 Октябрьское отделение №6977 АКСБ РФ в г.Саратове, Кор.сч. № 600164740 БИК 04631164041/2, ul.Dzerzhinskogo Saratov 410600 Russia Tel. (845-2) 72-10-34

132. Settlement ac.N 000467294 AKSB 6977 RKC GU CB RF for Saratov region Correspond.ac N 600164740 MFO 011, ' For intertown MFO 251008

133. Об использовании научных разработок Плешаковой Е.В.

134. Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

135. Данный подход позволяет интесифицировать процессы поиска и создания консорциумов, являющихся основой ми!фобиологического способа локальной очистки маслосодержащих сточных вод.

136. Новый методический подход расширяет сведения о биогехнологическом потенциале консорциумов и способствует эффективному применению их при микробиологической очистке промышленных сточных вод.*

137. Использование данного метода в нашей организации позволяет более полно моделировать и управлять биогехнологическими процессами очистки и при внедрении получать серьезный окологоэкономический эффект.1. Президент

138. Саратовского регионального отделения Российской экологической академии доктор технических наук-профессор, академик РЭА/^/1. А.И.ПОПОВ

139. Министерство общего и профессионального образования Российской Федерации

140. Саратовский государственный технический университет410054, г. Саратов, Политехническая, 77 Телеграфный адрес: Саратов-54. Телефоны : 50-7,5-40, 25-73-01, 50-77-40, 25-73-02г п

141. Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН1. На №.от