Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование процессов микробной деструкции неионогенных поверхностно-активных веществ для разработки технологии очистки сточных вод

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование процессов микробной деструкции неионогенных поверхностно-активных веществ для разработки технологии очистки сточных вод"

Федеральный Государственный санитарно-эпидемический надзор России Российский научно-исследовательский противочумный институт „МИКРОБ"

На правах рукописи Панченко Леонид Владимирович

УДК 577:614. 7[С4]

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ МИКРОБНОЙ ДЕСТРУКЦИИ НЕИОНОГЕННЫХ

ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ТЕХНОЛОГИИ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ вод

03.00.07—микробиология

Автореферат диссертации на соиснаиив ученой степени кандидата бислогичесних неук

Саратов 1994

ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ НАДЗОР

РОССИИ

РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ

"МИКРОБ"

На правах рукописи

11АНЧЕНК0 Леонид Владимирович

УЖ 577:614.7/04/

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ МИКРОБНОЙ ДЕСТРУКЦИИ НЕИОНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ТЕХНОЛОГИИ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1994

Работа выполнена в Саратовском филиале Всероссийского научно- исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и ь Саратовском государственном медицинском университете.

Научны* руководители:

член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор ГЕННАДИЙ МАРКОВИЧ ШУБ; .кандидат биологических наук, старший научный сотрулник ОЛЬГА ВИКТОРОВНА ТУРК013СКАЯ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник ТАТЬЯЧА МИХАЙЛОВНА ТАРАНЕНКО; доктор медицинских наук, профессор МАРИНА КОНСТАНТИНОВНА ЩИ'ЛОВА.

Ведущая организация:

Центральный институт усовершенствования врачей, г. Москва.

Автореферат разослан

1994 г.

Ядаита состоится

19:4 т.

часов на

ьасеяаиии специализированного. Ученого Совета Л 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (4.Ю971, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб".

Ученый секретарь специалиаироь&ннсто Ученого Совета, 'доктор биологических наук

КОРНЕЕВ.Г.А.

3 -

СОДЕРЖАНИИ РАТЮТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Загрязнение окружающей среди ксенобиотиками является одной из проблем, достигших глобальны* м;чсат.\боь. Oa>'CvJчитающая способность биосферы, • обусловленная хиачс-д^ят^ль-ностью микроорганизмов, испытывает значительный пер?грудки н;*-&а критических количеств синтетических нагрявнений иромнллсшюго про-исхоадения, поступающих в природную систему. Одними не нннйол-е распространенных загрязнителей являются поьерхностнс-актит- ьь-щества (ПАВ). Они широко используются более чем в ¡00 отраслях и подотраслях народного хозяйства и. их мирово* ороизиодстьо ■-•легодно увеличивается. Около SO X объема выпускаемых• в странах СНГ TJAВ непользуются в составе технических и Сытой« мшадл срздсдь и н производстве тканей и волокон (.Клименко H.A., Тимошенко W.U., 1Я93). Практически все сферы их применения связаны с юдоемккма яросгкха-ыи, что пряводит к попаданию большей части производил« ИЛЬ ь окружающую среду в составе сточных вод. Неудивительно, что ние ими природы, и н первую очередь водоемов, представляет серьезную проблему, которую сегодня по масштабам модно сравним- голыго с загрязнением почвы и воды нефтьы и пестицидами (Статл нл c.i.:., 1990). Наличие ПАВ в природных обхектач яначитгльяо ухудшяйт и.< санитарно-гигиеническое состояние и оказывает вредное ьдилик» как на человека, так и'на'биоценозы водоемов и почни.

Около 35 Z выпускаемых в мире ПАВ составляют неионогьнныс (ИПАВ). Последние представляют собой полигликолевые афиры лирных спиртов, кислот, дикилфенолов й других веществ, молекулы которых содержат подвижный водород. Одними из самых "жестких", о труден поддающихся биорачложению, НПАВ являются оксиэтилированнме алнил-фенолы, выпуск которых у нас в стране особенно велик, что связано с доступность» сырья и более низкой стоимостью производства (Поверхностно- активные вещества ..., 1989). Одними из наиболее вредных свойств ПАВ как загрязнителей окружающей среды являются: ценообразование, способность растворять другие малорастворимые н воде ксенобиотики, в частности пестициды и нефтепродукты, усиливать токсичность, канцерогенность и кумуляцию в живых организмах других загрязнителей, выраженный аллергенный эффект и другие. Б<кч-м& н-.;-приятной особенностью ПАВ является способность изолировать /¡pvi n ксенобиотики мицеллярной пленкой от контакта с водной микг-хч-лерой и тем самым значительно ухудшать их естественное раэлкжеки.*.

Существуют различные способы очистки ПАВ-содержащих сточных вод. объединяемые в два основных типа: физико-химическая и биологическая очистка. Основными критериями оценки различных способов являются эффективность, экологическая безопасность и экономичность. Наиболее распространенным недостатком различных физико-хи-мичнских методов является -образование шламог - концентратов извлеченных загрязнителей, что означает их недостаточную экологическую безопасность. Биологические методы очистки, основанные на использовании активного ила или биопленки, являются более экологичными, но они предусматривают подачу стоков с низкой концентрацией ПАВ -не Полее ю-20 мг/л - так как, более высокие концентрации являются токсичными для оиоценозо» очистных сооружений. Одним из наиболее перспективны* является метод локальной микробной очистки, удельный нес использования которого в настоящее время в очистке ПАВ-содер-яятих сточных вод достигает 13. Z как самостоятельно, так и ь комплексе с физико-химическими методами (Клименко H.A., Тимошенко М.Н., 1№3). Микробная деструкция I1AB отличается не только экологической безопасность», но и значительно более высокой экономичностью и эффективностью по сраьнениш с другими методами (Гвоздяк П.И., 1989). Швершенстьование биотехнологии микробной очистки от ПАВ, в частности иеиоьогекных, связано с получением высокоактивных штаммов-деструкторов, изучением и отработкой условий и приемов их наиболее снИ^ктинного использования. Поэтому выделение штаммов-деструкторов НПАВ, изучение микробиологических и биотехнологических яспе.лов их применения ь локальной очистке сточных вод являемся актуальной вадачей.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью nai тоящей работы явилось совершенствование методов локальной очистки сточных вод от НЛАВ на основе выделения и изучения высокоактивных штаммов-деструкторов, моделирования и отр&Лотки основных технологических параметров очистки.

Лля o.d достижения были решены следующие конкретный задачи:

1) расширение коллекции штаммов-деструкторов НПАВ, изучение и/ культуральио-морфологичеоких и Фи-то-того-Сиохимичеоких характеристик;

2) исследование рос га, -.деструктивной активности выделенных шчаммов, биохимических цутей разрушения ими различных представителей НПАВ; .

СЧ) отработка способов получения биомассы штаммов-деструкторов

- 5 - "

и создание биокяталиваторов на основе иммобилизованных клеток;

4) отработка основных технологических параметров процессов очистки модельных и реальных сточных вод;

5) моделирование и оптимизация процессов микробной очистки сточных вод от НПАВ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Выделены новые высокоактивные штаммы-деструкторы НПАВ: Pseudomonas puUda ТП-19 (валька N У3039И6 от 30.07.93) с широким субстратным спектром, включающим биологически "жесткие" вещества - оксиэтилированные алкилфенолы (03А1>); Pseudomonas fluorescens ОС-263 - деструктор оксиэтллированных спиртов и амидов (ОЗС и ОЭА); Pseudomonas species ОС-22 (ьанвка N 93039122 от 30.07.93) - деструктор оксиэтилированных спиртов. Научены ростовые и деструктивные характеристики нового штамма ТП-19, биохимические аспекты разрушения ОЭС и ОЭАФ этим штаммом, определены основные оптимальные параметры для моделирования очистки сточных вод конкретных производств.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Дана характеристика деструктивной активности выделенных штаммов по отношению к 28 препаратам не-ионогенных и 2 препаратам анионных ПАВ в концентрациях до 10 г/л. Наиболее активный ытамм Р. putida ТП-19 прошел лабораторные испытания на модельных и реальных сточных водах для использования н биотехнологии очистки от НПАВ. Отработаны приемы наработки биомассы штамма, подобраны оптимальные носители для иммобилизации клеток и получены активные биокатализаторы на их основе. Исследована очистка НПАВ-содержащих сточных вод полученными биокатачиааторами. Создана биотехнологическая модель очистки промышленных сточных вод, бесперебойно работающая в течение 3-х лет. Модель апробирована на реальных сточных водах.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзных и региональных съездах и конференциях (г.Шебекино, 1990; г.Пенза, 1990; г.Таллин, 1991; г.Оренбург, 1991; г.Полтава, 1992; г.Суздаль, 1992; г.Белгород, 1992; г.Пущина, 1992; г.Киев, 1903). Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедр микробиологии и общей гигиены СГМУ (март 1994 г.). Материалы диссертации внедрены в работу лабораторий СФ ВНИИ генетики, НИИ сельской гигиены, кафедры микробиологии СМГУ, а также в конструирование установки микробной очистки А/0 НИТИ ТЕСАР.

ПУБЛИКАЦИИ. Но теме исслеловадая опубликовано 10 работ, имеются 2 рационализаторских предложения, поданы заявки на 3 патента.

- е. - ' -

ОГК-'КГУРА И ОВЬЕМ: РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, 8 глав, ьакдгления, выводов, списка использованной литературы, включающего 120 работ отечественных я 70 ёарубелных авторов, . и содержит 215 страниц машинописного текста, включающего 34 рисунка и 45

таОли).!.'

:МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

F< работе иопольаоваш' /366 штаммов бактерий, ив которых 364 культуры ънделенн мъ объектен окружающей среды. Из коллекции С$> ВНИИ генетики были ■'подучены 4 штамма:, штаммгдеструктор НПАВ Pseu-' aow ,na? put Ida ТИ-18 (в-'¿¿50) у т-амм-деструктор акриловой кислоты и проиэводш« •Brevlbacl.erlUm species 13 ПА (В-4987) И два не-идентифицированных шг*«ммм- деструктора 'минеральных масел с лабора- : торными шифрами СЖ-i и Б-00.

Микроорганизмы хранили ;ри 4* С на столбиках с 0,6 X агаризо-• ванной U4 средой с регулярными пересевами черёа 5 месяцев.

•'В раОотв испольэованн следующие среды: а) полноценные питательные среды: мясо-пептонный агар (МПА), бульон Хоттингера, среда ¡.В; б) минеральная ерзд'а М9 (Миллер Л*., 1976). Кроме того, в экспериментах по шращиваним биомассы был испольэован.ряд сред, содержащих лргакдевой экстракт, мелассу и глюкозу в различных сочетаниях и; концентрация*. .

Среды с Ш!АВ,готовили на МЭ, куда они вносились■до стерилизации в 'кйнцентрация* О,«МО,0 г/л. При необходимости среды уплотня^ ли агар-агаром в концентрации 16"20 г/л.

. Модельные ряствбры сточных вод готовили на водопроводной воде, с добавлением технических моющих средств (ТМС) и дополнительных промышленных за17Л!ьяителей. Раствор не стерилизовали.

Микроорганизмы иа объектов внешней среды выделяли путем лря-Mt»'o ьнсгва к. методом накопительных культур. В первом случае 1 г (мл) проб почрн, воды или активного ила разводили в 10 мл стерильного физиологического раствора и после десятикратных разведений по 0,3 м наносили на поверхность плотной полноценной среди, равномерно '.распределяя нанесенный' объем, с. помощью стерильного шпателя. В случае применения метсда.накопительных' культур 10 г. (мл) пробы . сносили в 100. ил среды ш, 'содержащей НПАВ в качестве единственного источника углерода и энергии в,концентрации 0,5-1,0 г/л. Культуры. инкубировали S-4 м?дели при; комнатной температуре с периода-

- у -

ческими пересевами и анализом микрофлоры путем высевов на плотные селективные среды.

Штаммы-деструкторы выявляли с помощью метода Кука (Cook К.А., 1978), выключающегося в обработке селективных чашек с выросшими микроорганизмами реагентом Драгендорфа.

Идентификация выделенных культур проводилась общепринятыми методами на основании изучения совокупности морфолого- культураль-ных и физиолого-биохимических признаков (Bergey's, 1986).

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли методом бумажных дисков.

Динамику развития микробной популяции изучали путем измерения оптической плотности культуральной жидкости на фоточдектроколори-метре КФК-2 при 440 нм через определенные промежутки времени в зависимости от цели и продолжительности эксперимента.

Количественные характеристики процесса биодегрздации НПАВ получали с помощью колориметрического метода с фосфорно-молибденовой кислотой (Клименко H.A., Панченко H.H., 1971).

Деструктивная активность штаммов выракальсь в 7. убыли субстрата.

В качестве посевного материала использовали смыь суточной культуры штаммов с МПА физиологическим раствором или средой, ь которой проводилось дальнейшее культивирование. Посевная доза, то есть количество клеток в 1 мл среды, определялась по предварительно построенной калибровочной кривой, выражающей соотношение количества клеток с оптической плотностью, определяемой на Ш<~2 при 440 нм!

Культивирование проводили в колбах Эрленмейера при 28'С; посевная доза, кроме особо оговоренных случаев, составляла 0,7 П 440 (5-108 кл/мл).

Были вычислены следующие показатели роста и деструктивной активности культуры-деструктора: 1) абсолютная деструктивная активность (АДА) - убыль субстрата (г/л) за 24 ч; 2) удельная деструн тивная активность (УДА) - количество г вещества, разрушенного 1 г посевной дозы по сухому весу за 24 ч; 3) абсолютный прирост биомассы (АПБ) - максимальное количество биомассы в единицах оптической плотности при D 440, образовавшееся за 24 ч; 4) удельный прирост биомассы (УПБ) - отношение АПБ к посевной дозе (D 440).

Аэрация при культивировании осуществлялась в зависимости от задач путем кругового перемешивания на качалке УВМТ 12-250 при им,

- 8 -

об/мин или с помощью микрокомпрессора АЭН-3.

Для подачи растворов с заданной скоростью при непрерывном культийи{юкапии использовали перистальтический насос НП-1.

Пути микробной деструкции НПАВ исследовали методами УФ- и ИК-спектроскопии (Скипина И.М., 1987; Frazee. C.D., 1964) и 7СХ (За-купра В. А.. 1977; PatterSöri S. J. et. al, 1967, 1970). Для записи ■зЧК- спектров использовали спектрофотометр "Specord IR-75" и кюветы с окнами из монокристалла NaCl с толщиной поглощающего слоя 1,0 мм. Запись спектров проводили в. диапазоне 4000 - 800 см"1.

Разрушение ароматического . кольца в молекуле ОЭАФ исследовалось методами ИК- и УФ- спектроскопии. В последнем случае оценивали изменение поглощения хлорсформенного экстракта культуральной жидкости при ?.М-290 нм на спектрофотометре "Specord М40".

Исследования по наработке биомассы штамма-деструктора НПАВ проьодили на ферментере АК-203 при автоматическом поддержании заданных параметров культивирования и их записи на самопишущем потенциометре КСП-4. ' В течение ферменгирования прирост биомассы определяли но оптической плотности культуральной жидкости, а после окончания процесса по сырому весу.

Иммобилизацию клеток штаммов-деструкторов НПАВ включением в 4 поли-чкриламидный (ЛАА) гель проводили общепринятым методом (Иммобилизованные клетки .... 1988), в агаровый и фурцелларановый гели способами, разработанными специально для клеток микроорганизмов -деструкторов ксенобиотиков (A.c. 1705345; A.c. 1742330). Биоката-лизауор на основе криогеля поливинилового спирта (ПВС) был получен в институте пищевых веществ АН СССР (г.Москва) по методу Е.И.Рай-тщой (1987). Приемы иммобилизации клеток »л волокнистых носителях и природном цеолите разрабатывались в процессе работы. В качестве годокнистых носителей использовали ацетатное волокно и нетканое -имготическое полотно, а такде специальную волокнистую насадку "Ri'Sf (• • рг^рабстанну» в ИКХХВ АН УССР (ТУ 995990).

Моделирование процессов микробной очистки проводилось на ла-'г.[',н'!црних очи<лнда уотаноьках оригинальной конструкции,

'••1-ваультатн ак'.'пкриме-ито,ч .обработаны.,о-татис.ч-цче<зки о поимене-чп-.и шч'н^рия- Отьс-й'чнга ('»'орлов. А.-,•-4.орц • Р., \1в76).....

- 9 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании более 50 проС из объектов окружающей с[»-ды, преимущественно из мест, загрязненных НПАВ, изолировано 364 культур*, среди которых обнаружено 3 активных штамма-деструктора НПАВ, в том числе один деструктор ОЭЛФ. Два штаммы были идентифицироьаны как Рэеискотюпаз ри(лс)а ТП-19 И Рзеискчюпаз Ииогегсепз ОС-283, третий также отнесен к роду РэеисЗотопаз и обозначен как Рз. зрес!-еэ 0С-22. Эти культуры депонированы в ВКПМ ВНИИ Генетики, г.Москва: ТП-19 под N В 6582 как деструктор неионогенных и анионных ПАВ, ОС-283 под N В 6565 как деструктор ОЭС и ОЗА, 00-22 под N В 6{".бо как деструктор ОЭС.

Был исследован субстратный спектр выделенных штаммов в диапазоне концентраций НПАВ 0,2-1,0 г/л. Наиболее детально изучен штамм ТП-19. Он ь различной степени разрушал НПАВ, относящиеся к пяти типам (28 препаратов) -и оксиэтилироьанные АПАВ (2 препарата). Наибольшую деструктивную активность (величина указана в таблице) штамм проявлял к ОЭС, ОЭА и ОЗАФ.

Изучение влияния на деструкцию ОЭС и ОЭАФ различных факторов позволило установить, что штамм ТП-19 проявлял свою деструктивную активность в широком диапазоне концентраций НПАВ (0,5-10,0 г/л), рН среды (5,5-9,5) и 1' (20" - 35°С ). Большое значение для роста штамма на среде с НПАВ имела интенсивность аэрации. Разрушение последних не требовало присутствия в среде каких-либо дополнительных источников углерода и энергии. Наибольшее влияние на скорость процесса оказывала посевная доза штамма. Исследование разрушения ОЭАФ тритона Х-100 в концентрациях от 0,5 до 10,0 г/л штаммом ТП-19 в диапазоне посевных доз 0,03-10,0 0 440 позволило установить временные и количественные характеристики процессов роста и деструкции. Установлено, что при малых исходных микробных нагрузках наблюдался двухфазный рост, при котором первый пик приходился на 6-е ч, а второй - на 20-24 ч инкубации, . тогда как при посевных дозах более 1,0 0 440 прироста биомассы на среде с тритоном не наблюдалось. В то же время на полноценной среде (бульон Хоттингера) прирост биомассы независимо от посевной дозы достигал 10-12 0 440.

Исследование зависимости количества разрушенного тритона и времени разрушения от его концентрации и посевной дозы шгам-ма-деструктора позволило сделать вывод, что тритон способе! подвергаться деструкции и при очень высоких концентрациях (до 10

г/л), но чем внше концентрация субстрата, тем большей должна быть посевная доза. Как показано на рис. 1, при оптимальных условиях культивирования (солевая среда М9, I* 30'С, рН 7,6) и посевной доае ю 0 440 тритон в концентрации от 1 до 7 г/л разрушался на 95-100 7. за 4-24 ч, а при концентрации 10 г/л - на 90 7. за 48 ч.

Установлено, что зависимость УДА и УПБ от посевной дозы имеет > :Лратно пропорциональный характер, а зависимость АЛА и АПБ - экспоненциальный.

' . Таблица

Спектр деструктивной активности штаммов-деструкторов НПАВ

Концен- Деструктивная активность,%

ПАВ трация ,

г/л ТП-19 ОС-22 ОС-283

ОЭС:

СИНТаНОЛ АЛМ-Я 0,5 98±3,7 9814,0 92±3,7

ОКСаНОЛ КЛ-б 0.5 78*3,1 9014,2 8013,4

синтанол ДС-10 0,5 86*2,8 8812,9 8313,3

оксанол-18 0,5 65l¡?.,8 7613,4 5112,3

окианол ВС-81 0,5 70i3,3 5512,2 5512,3

ОЭА:

синтамид-5 0,6 90*3,1 8612,8 82±2,6

OPAS':

ОН-4 0,5 48*1,8 0 0

неонол AW-6 0.5 911:3,8 0 0

НОонол АИ-9 0,5 80*3,1 1010,6 810,5

неонол АМ-10 0,5 92*3,5 1210,6 9Ю.5

0П-10 0,6 64*1,9 0 0

тритон Х-100 0,5 69*3,2 1510,9 1010,9

неонол ATO-12 0,5 89*3,4 810,5 510,3

неонол A<J/d-ü2 0,5 85*3,9 0 0

неонол АМ-бО 0,5 70*2,9 0 0 . .

Те же закономерности наблюдались и при изучении деструкции о;к;: синтанола ЛС-10, эа исключением характера роста, который был шнсФааиым,

Исследование биохимических аспе.чтов деструкции НПАВ позволило, установить следующее.

Стелет и пути биодеградации зависели как от химического

Рис. 1. Время деструкции тритона X—100 (не менее, чем на 90%) в зависимости от посевной дозы (0,03-10,0 П 440)

отроения субстрата, так и от условий культиьирования.

Как показали исследования методами ИК-спектроскопии и ТСХ тритон К-100 при периодическом культивировании подвергался деструкции только со стороны оксиэтильной цепочки, которая разрушалась весьма эффективно. Наблюдалось постепенное отщепление оксиэтияьных групп с укорочением ПЭГ-цепи до 1-2 единиц уже к 8 ч культивирования. Позже происходил и гидролиз ароматической эфирной связи, при котором отщеплялась последняя оксиэтильная группа. Таким образом, продуктами деградации тритона являлись его короткоцепочечные дериваты с 1-2 оксиэтильнши группами и алкилфенсл. Биологическая "жесткость" алкильного. радикала тритона определялась, вероятно, тем, что все метильные группы его молекулы присоединены к четвертичным углеродным атомам, что делает карбоксилирование и дальнейшее окисление практически невозможным.

Неонолы подвергались сходным процессам биодеградации, но наблюдалось еще и карбоксилирование их менее разветвленного, чем у тритона, алкильного радикала. Об этом свидетельствовало появление в ИК-области ликов, соответствующих поглощению валентных колебаний связи 00 в карбоксильных группах (1720, 1770 см-1). Дальнейшего окисления и укорочения радикала не наблюдали, что подтверждалось практически неизменившейся интенсивностью поглощения асимметричных валентных колебаний его СНг- и СНз-групп. Ароматическач часть-молекулы тритона и неонолов также оставалась без изменений, о чем свидетельствовала интенсивность поглощения в УФ- (278 им) и ИК-об-ластях (1600 см-1). ■

Представитель ОУС синтанол ДО 10 в тех же условиях подвергался более значительным деструктивным изменениям (рис. 2). Его молекула окислялась и расщеплялась с обоих концов - алкильного и окси-этильного. Последний, как и в случае ОЭАФ, разрушался путем поэтапного укорочении этиленоксидной цепи. Алкильнан часть молекулы карбоксилировалас.ь и претерпевала постепенное укорочение, о чем свидетельствовали как значительное уменьшение поглощений в области СИ*;-групп радикала (£910 см-1), так и увеличение удельного веса ОНа-групп (2940 см~Ъ, заметное после 12 ч культивирования.

■ Для повышения информативности ИК-спектроскопии использовалось раздельное экстрагирование основного вещества четыреххлористым углеродом и некоторых не извлекаемых им более полярных фракций, в частности свободных ПЭГ' и карбоксилированных продуктов деструкции, хлороформом. Такой прием позволил установить следующее.

вРЕСОКО

*»00ст'

Рис. Я, ик-спектры синтанола ДС-10 и продуктов его деструкции при периодическом культивиповании штамма ■ ТИ-19 (зкетрагент ССЦ):

1 - синтанол ЛС-10, 2-6 г продукты его деструкции:

2 - 4 Ч, 3 ->. Ч, 4 - 12 Ч, -5 - 18 Ч, б - 120 ч

Поскольку в хлороформенном экстракте не обнаруживалось свободных ПЭГ, можно считать, что не происходило расщепления молекулы НПА8 на алкшьную и ПЗГ части. КарСоксилированию подвергалась алифатическая, но не оксиэтильная часть молекулы и, таким образом, поэтапное отщепление эткденоксидных групп происходило гидролитическим путем, поскольку в процессе культивирования возрастал удельный вес концевых ОН-групп ПЭГ-цепи (1040 см"1) на фоне укорочения именно этой части молекулы.

В случае неонолов и синтанола при периодическом культивировании не происходило утилизации длинноцепочечных гомологов и свободных ПЭГ, которые в небольших количествах присутствовали в препарате.

В условиях непрерывного культивирования, проводившегося в модельных очистных установках, описанных ниже, наблюдалось более-полное разрушение неонола АФ9-12 и синтанола ДС-Ю. Колориметрический метод покавал разрушение вещества на 99-99,5 % (при периодическом культивировании эти значения составляли 86 для синтанола и 89 X - для неонола). При деструкции неонола наблюдалась не только утилизация ПЭГ части молекулы, но и карбоксилирование и укорочение алкильного радикала. Происходило уменьшение поглощения СН2-и СНз~групп радикала на 89 и 86 7. соответственно (рис. 3). Снижение поглощения в ИК- (1600 см""1) и УФ-областях {278 нм), соответствующих ароматическому кольцу, на ?0 X, а также появление в хлороформенном экстракте поглощения в области алкенильных групп и ненасыщенных кетонов (ЗОЮ и 1685-1665 см""1) позволило предположить, что деструктивные процессы затронули и ароматическую структуру неонола, разрушая его, таким образом, практически полностью.

Синтанол при непрерывном культивировании разрушался так же, как и при периодическом, но более полно в количественном отношении.

Кроме того, как в случае неонола, так и в случае синтанола происходила деградация длинноцепочечных гомологов и свободных ПЭГ.

Обосновав принципиальную возможность испольэования выделенных штаммов-деструкторов для локальной очистки ПАВ-содержащих сточных вод, мы исследовали биотехналогические аспекты этого процесса. Были отработаны условия наработки необходимых количеств биомассы деструктора и определены наиболее функциональные носители для иммобилизации клеток и получения на их основе биокатализаторов. Использование лоеледних позволило поддерживать в биореакторе ста-

БРЕССЖР

Рис. 3. ИК-спектры неонода АФ9-12 (1) и продуктов его микробной деструкции (2) в колонной установке. Экстрагенг - четыреххлористый углерод

■ - 16 -

Сильно высокую концентрацию микроорганизмов. Оптимальными средами для выращивания биомассы штамма ТП-19 были бульон Хоттингера, а также солевая среда М9, содержащая мелассу (10 г/л) и дрожжевой экстракт (2 г/л), дававшие прирост биомассы 10,1 и 6,3 г/л по сырому весу соответственно. Среди исследованным носителей наиболее перспективными оказались специальная волокнистая насадка "ВИЯ" и нетканое полотно, а также синтетические гели (П8С и ПАА).

Были проведены исследования по деструкции НПАВ в 4-х образцах модельных и 15-ти - реальных сточных вод свободными и иммобилизованными клетками, а также изучены возможности оптимизации этого процесса, что является необходимым этапом в разработке биотехнологии микробной очистки. С этой целью было исследовано влияние на деструктивную активность сопутствующих загрязнителей ПАВ-содержащих стоков, а именно; минеральных масел, акриловых соединений, ионов металлов и механических загрязнителей, а также колебаний рН среды в сильнощелочных сточных водах. Было констатировано следующее :

Деструкция НПАВ изученными штаммами затруднялась в присутствии масел и других органических загрязнителей. В этих условиях комплексное использование различных штаммов-деструкторов существенно повышает эффективность очистки.

Наличие механических загрязнителей, присутствующих в отработанных моющих растворах, отрицательно влияло на микробную деструкцию НПАВ. В этой связи представляется необходимым предварительное освобождение сточных вод от подобных примесей какими-либо фильтрующими устройствами.

Содержащиеся в сточных водах гальванических производств и отработанных моющих растворах ионы Си"*,и А13* значительно угнетали деструктивную активность исследованных штаммов. Снижение высокой токсичности подобных стоков возможно путем их разбавления водой или добавлением минеральных солей, в честности фосфатов. Однако оптимальным явилась бы лредочистка от металлов физико-химическими или иными методами.

Коррекция рН среды ь течение всего периода очистки существенно повышала ее эффективность.

Получевиые результаты позволили создать модель технологии микг)о0ной очистки ПАВ-содержащих сточных вод. Были сконструированы лабораторные установки; для очистки в режиме периодического культивирования - роторная установка, и для непрерывного процесса -

колонная установка. Осуществлен подбор оптимаиьного для каждой установки биокатализатора; таковыми оказались клетки, иммобилизованные включением в синтетические гели (для роторной установки) и клетки, иммобилизованные на "ВИЙ" (для колонной); определены оптимальные условия их функционирования.

Работа колонных установок была апробирована на 10 различных образцах модельных сточных вод и на реальных стоках металлообрабатывающего производства. Полученные результаты свидетельствовали о жизнеспособности биокатализаторов в условиях длительной работы устройства. Эффективность очистки от НПАВ составляла 89-99,5 X в модельных и 82 Z в реальных стоках. Время наблюдения за работой колонных установок составило от 11 до 32 месяцев. В условиях высококонцентрированных модельных и реальных сточных вод при использовании установок эффективность деструкции НПАВ повышалась в 1,5-1,6 раз по сравнению со свободными клетками.

Полученные результаты экспериментально обосновывают возможность использования данной модели ^ для создания биотехнологии очистки сточных вод, содержав«« НПАВ.

ВЫВОДЫ

1. Из объектов окружающей среды выделены штаммы-деструкторы с широким субстратным спектром: деструктор неионогенных и анионных ПАВ Pseudomonas putida ТО-19 (В 6582), деструктор оксиэтилирован-ных спиртов и амидов Pseudomonas fluorescens ОС-283 (В 6565) и деструктор оксиэтилированных спиртов" Pseudomonas species ОС-22 (в 6563). •

2. Максимальная деструктивная активность штамма P. putida ТП-19 проявлялась на солевой среде при t'30'C и pH 7,5. В этих условиях ОЭАФ тритон Х-100 в качестве единственного источника углерода и энергии в диапазоне концентраций 0,5-10 г/л разрушался за 24 ч на 88-100 %. Штамм проявлял дестр. ктивную активность по отношению к 30 исследованным ПАВ, наиболее активно разрушая оксиэтшш-рованные спирты, амиды и алкилфенолы.

3. Штамм P. putida ТП-19 разрушал НПАВ путем поэтапного укорочения оксиэтильной цепочки с одновременным карбскгшированием и частичным разрушением углеводородного радикала у ОЭАФ неонолов и его полным разрушением у синтанола ДС-10.

4. Клетки штамма ТП-19 как в свободном,, так и в иммобилкео-

ванном состоянии разрушали НПАВ в составе ТМС, модельных и реальных сточных вод. Оптимальными носителями для иммобилизации клеток штамма явились "ВИЯ", криогель ПВО и ЛАА гель.

б. Наибольшая эффективность очистки сточных вод штаммом ТП-10 достигалась при непрерывном культивировании его клеток, иммобилизованных на "ВИИ" в многосекционном биореакторе. В этих условиях ОЭС синтанол ДС-10 и ОЭАФ неонол АФ9-12 разрушались на 99,5-100 % при скорости протока жидкости 0,04 ч"1.

6. Соаданная модель биотехнологии очистки ПАВ-содержащих сточных ВОД. апробированная на различных образцах модельных и реальных стоков, обеспечивает высокую эффективность их очистки.

- 19 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Штамм бактерий, способный осуществлять очистку сточных вод от оксизтилированных алкилфенолов// Опыт использования неонолов АИ-п - оксизтилированных алкилфенолов в народном хозяйстве: Сб. науч. тр. Всесоюзн. совещ., ¿Оебекино. - Белгород, 1990. С. 27-28 (в. соавторстве с О.В.Турковской).

2. Очистка сточных вод, содержащих НПАВ, с использованием штаммов-деструкторов// Обезвреживание и регенерация твердых отходов и растворителей: Тез. докл. зональн. конф. - Пенза, 1990. С. 54-55 (в соавторстве с О.В.Турковской).

3. Деструкция синтанола ДС-10 иммобилизованными клетками бактерий// Новые направления биотехнологии: Тез. докл. Всесоюзн. конф. -Пущино, 1990. С. 40 (в соавторстве с О.В.Игнатовым, О.В.Турковской, КЗ. В. Шалу новой).

4. Использование селекционированных микроорганизмов для борьбы с загрязнением окружающей среды 'поверхностно-активными веществами// Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и.Северного Прикаспия: Тез. докл. Всесоюзн. симп. -Оренбург, 1991. С. 122-123 (в соавторстве с О.В.Турковской).

5. Биотехнология утилизации ПАВ и минеральных масел в сточных водах металлообрабатывающей промышленности// Проблемы экологии в металлургии, машиностроении и пути их решения: Тез. докл. конф. НТЦ Информтехника. -Суздаль; 1992. С. 56-57 (в соавторстве с О.В.Турковской, Е.В.Плешаковой, А.В.Ашуровым, С.П.Бородиным, Л.А.Толтиновой, Л.Г.Купцовым).

6. Микробная утилизации смазочно-охлаждающих жидкостей группы эмульсолов// Новые направления биотехнологии: Тез. докл. V конф.

.РФ. - Пущино, 1992. С. 170 (в соавторстве с О.В.Турковской, Е.В.Плешаковой, А.В.Ашуровым).

7. Очистка отработанных моющих растворов от основных органических загрязнителей// Там же. С. 181 (л соавторстве с О.В.Турковской, Е.В.Плешаковой, А.В.Ашуровым, А.В.Тамбовцевым).

8. Микробиологический способ утилизации смазочно-охлаждающих жидкостей и отработанных моющих растворов// Поверхностно-активные ■вещества и сырье для их производства: Тез. докл. VIм. конф. ~ Белгород, 1992. С. 229-230 (в соавторстве с О.В.Турковской, Е.В.Плешаковой, А.В.Ашуровым).

9. Микробная очистка сточных вод от.ПАВ и эмульгированных мине-

ральных масел// Биология и биотехнология очистки воды: Тез. докл. конф. - Полтава, 1992. С.51-52 (в соавторстве с О.В.Турковской, Е.В.Плешаковой, А.».Муратовой).

10. Microbial purification of nonionlc surfactant sewage// Effluent treatment and waste minimisation: Simp. - Rugby, England, ,1993 (в соавторстве с О.В.Турковской. Г.М.Шубом).

т»п. и в здк. ££4/ тир. /еа