Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробная деструкция минеральных масел

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробная деструкция минеральных масел"

На правах рукописи

МУРАТОВА Анна Юрьевна

МИКРОБНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ МИНЕРАЛЬНЫХ МАСЕЛ 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1997

Работа выполнена в Саратовском научно-исследовательском институте биокатализа и в Саратовском государственном ордена Трудового Красного Знамени медицинском университете.

Научный руководитель

Научный консультант

- академик РАЕН,

доктор медицинских наук, профессор Геннадий Маркович Шуб ■ кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Ольга Викторовна Турковская

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, профессор

Владимир Федорович Спирин

- доктор биологических наук, старший научный сотрудник Татьяна Михайловна Таранеико

Ведущая организация - Волгоградская медицинская академия

Защита диссертации состоится 'у^Л 1997 г.

в/^часов на заседании специализированного Ученого Совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г.Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб".

Автореферат разослан Се/За^МЯ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, .

профессор Г.А.Корнеев

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Обеспечение экологической безопасности и охрана окружающей среды являются наиболее актуальными проблемами современности. Антропогенное воздействие на природу настолько возросло, что экологические нарушения стали нормой и приобрели угрожающие размеры. Среди многочисленных загрязнителей, непрерывно поступающих в окружающую среду, нефть и нефтепродукты по-прежнему остаются самыми глобальными. Наряду с авариями при добыче и транспортировке нефти и продуктов ее переработки крупномасштабным источником загрязнения природных объектов являются индустриальные сточные воды. Низкая культура производства, а также использование устаревших технологий и оборудования, в том числе в нашей стране, приводит к тому, что все большее и большее количество сырья. промежуточных и конечных продуктов промышленной переработки нефти попадает в сточные воды, а с ними - в природные объекты, в частности, концентрация нефтепродуктов в р. Волге в районе Саратова в 1,5-2 раза превышает ПДК (Доклад о состоянии окружающей природной среды Саратовской области в 1996 году, 1997).

Минеральные масла - широко используемая в промышленности группа нефтепродуктов, основной вид смазочных материалов, предназначенных для снижения трения и износа трущихся поверхностей. Масляные отходы, зачастую в качестве основного компонента, присутствуют в стоках предприятий различного профиля, в частности, связанных с металлообработкой. Как продукт переработки мазута, нефтяные масла представляют собой сложную смесь высокомолекулярных углеводородов. Являясь крайне инертными и опасными загрязнителями сточных вод, масла оказывают вредное воздействие на биосферу, что требует разработки современных, надежных способов обезвреживания подобных отходов. Эффективность существующих очистных сооружений невелика, например, в отношении нефтепродуктов, поверхностно-активных веществ (ПАВ), пестицидов' она составляет лишь 30-60% (Доклад о состоянии окружающей природной среды Саратовской области в 1994 году, 1995).

Одним из важнейших направлений для обеспечения экологической безопасности и экономии водных ресурсов является освоение передовых технологий и новых конструкций очистных сооружений. Широкое применение оборотного и повторного использования воды промышленными предприятиями позволяет значительно сократить забор воды из водоемов. В настоящее время 70% потребности предприятий в воде на производственные нужды уже удовлетворяется за счет оборотной и повторно используемой воды (Изжеурова В.В., Павленко Н.И., 1995).

Наиболее эффективное удаление загрязнителей из стоков для обеспечения оборотного водоснабжения достигается путем создания локальных узлов очистки. Смешение производственных потоков приводит к их взаимному разбавлению, часто сопровождающемуся взаимодействием загрязнителей, ухудшению извлечения последних, а также увеличению объемов стоков и затрат на их очистку. Создание локальной системы очистки позволяет перерабатывать такие высококонцентрированные специфические масляные отходы, как отработанные моющие растворы (ОМР) и смазочно-охлаждающ'ие жидкости (СОЖ), тем самым уменьшая нагрузку на биологические очистные сооружения в случае их дальнейшей очистки либо обеспечивая оборотное водоснабжение.

Для удаления масла из сточных вод в настоящее время используют механические, физико-химические и биологические методы. Биологический метод занимает доминирующее положение в современной технологии очистки. Возможность удаления из сточных вод различных химических соединений, простота аппаратурного оформления сделали ее самой крупнотоннажной биотехнологией. Современным достижением в развитии биологической очистки явилось создание микробиологического способа переработки отходов. Основу его составляет использование селекционированных высокоактивных культур микроорганизмов-деструкторов тех или иных загрязнителей, создание проточной системы очистки воды и иммобилизация биомассы на инертных, нерастворимых в воде носителях. Использование микробиологического метода в узлах локальной очистки маслосодержащих сточных вод позволит эффективно утилизировать масляные отходы. Кроме того, к достоинствам этого способа следует отнести значительное сокращение финансовых затрат на очистку, за счет самовоспроизводства биокатализатора (иммобилизованных на носителе клеток микроорганизмов-деструкторов), а также отсутствие больших количеств шламов.

Для создания очистных устройств, работающих по этому принципу, необходимо наличие специализированных высокоактивных штаммов-деструкторов, разработка и совершенствование технологии их применения.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явились разработка способа очистки маслосодержащих сточных вод и изучение микробиологических основ этого процесса.

Для достижения поставленной цели были определены следующие конкретные задачи исследований:

1. Селекция микробных консорциумов, разрушающих минеральное масло. Создание на их основе активных бнокатализаюров -комплексных систем .тля оиолефадашш многокомпонентного субстрата.

2. Избиение деструктивно;; активности селекционированных биокатализаторов.

3. Изучение видового состанл микробных консорциумов и субстратной специфичности изолированных культур.

4. Моделирование и отработка основных технологических параметров процесса очистки маслосодержащих сточных под.

5. Исследование возможности использования селекционированных штаммов дчя восстановления нефтезагрязненных объектов окружающей среды.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Получен ряд микробных консорциумов, способных очищать сточные воды, содержащие минеральные масла. Изучены биологические и деструктивные характеристики селекционированных биокаталшаторов. Выделены новые штаммы-деструкторы нефтепродуктов. Определены основные технологические параметры процессов с использованием полученных микроорганизмов.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Микробные консорциумы, подвергающие деградации минеральное масло.

2. Микробная деградация различных типов минеральных масел, их фракций и некоторых индивидуальных углеводородов.

3. Основные технологические параметры процесса очистки маслосодержащих стоков.

4. Возможности использования селекционированных штаммов-деструкторов для восстановления нефтезагрязненных объектов окружающей среды.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработан способ локальной очистки маслосодержащих сточных вод на основе селекционированных микроорганизмов. Создана пилотная очистная установка (заявка на патент № 96100951 с приоритетом от 16.01.96). Штаммы ЛсшеЮЬасгег са1соасеисш ТМ-31 (В-7141) и МусоЬааегшт эр. (8-1541), разрушающие 'минеральные масла, депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов. Показана возможность использования микроорганизмов, выделенных из состава

биокатализатора очистной установки для бпорекультнвацип нефтезагрязненных земель.

АПРОБАЦИЯ ¡'АБС)i'lil. Материалы диссертации и ее основные положения обсуждались на конференциях: "'Биология и биотехнология очистки воды" (Полтава, 1992): "Биология и биотехнология очистки воды" (Киев. 1993): International Symposium: Workshop on Environmental Biotechnology (Waterloo, 1994); "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994). "Малоотходные и энергосберегающие технологии в системе водного хозяйства" (Пенза. 1995); "Процессы и оборудование экологических производств"' (Волгоград. 1995): International Seminar: Biosorption and biore-mediation (Prague. 1995): World Environmental Congress (World'95) (London, Ont., Canada, 1995): "Микробное разнообразие: состояние, стратегия, экология, проблемы" (Пермь, 1996); "Вода, экология и технология" (Москва, 1996); "Проблемы изучения биосферы" (Саратов, 1996).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 в зарубежных изданиях, 1 принята к опубликованию.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертационная работа изложена на 186 страницах машиношюного текста; содержит 24 таблицы, 22 рисунка; состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 213 источников, в том числе 88 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы 356 культур, выделенных из объектов окружающей среды, а также 5 штаммов из коллекции СНИИ Биокатализа: штаммы-деструкторы НПАВ Pseudomonas putida ТП-19 (В-6582) и Pseudomonas sp. ОС-22 (В-6563)', штаммы-деструкторы нитрилов и амидов карболовых кислот Rhodococcus rhodochious М-8 (S-926), Pseudomonas pseu-doalcaligenes 6-п (B-4418) и Alcaligenes sp. IB-3 (B-6707)2.

' Выражаем глубокую благодарность сотруднику СНИИ Биокатализа к.б.н. Панченко Л.В. за предоставленные штаммы-деструкторы ПАВ.

2 Выражаем глубокую благодарность сотруднику СНИИ Биокатализа к.б.н. Козулиной Т.Н. за предоставленные штаммы-деструкторы нитрилов и амидов карбоновых кислот.

Микроорганизмы хранили при 4°С на столбиках с 0,6 % агаризованной ЬВ средой с пересевами через 6 месяцев.

; В работе 'были использованы следующие среды: а) полноценные питательные среды: мясо-пептонный агар (МПА), бульон Хоттингера, среда ЬВ (Миллер Дж., 1976) и б) минеральные солевые среды: для изучения деструктивной активности селекционированных культур по отношению к минеральному маслу и другим углеводородным субстратам -среда М9 (Миллер Дж., 1976), для определения способности культур подвергать деградации полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) - среда МБМ ^еШег М. е1 а1., 1994) и для выявления способности выделенных штаммов продуцировать эмульгирующий агент - среда 5 (Ра1:. N2172898 ЦК).

Нефтепродукты в концентрациях 0,1-1,0 г/л добавляли асептически в минеральную среду после ее стерилизации при 1 атм. в автоклаве. При необходимости среды уплотняли агар-агаром в концентрации 15-20 г/л.

В работе были использованы следующие нефтепродукты: 8 марок минеральных масел; 2 марки эмульсолов, дизельное топливо, керосин, твердый парафин, сырая нефть и 19 индивидуальных углеводородов, представленных алканами, аренами и нафтеном.

Микроорганизмы из объектов окружающей среды выделяли путем прямого высева и методом накопительных культур. В первом случае 1г (мл) пробы почвы, воды или активного ила вносили в 10 мл стерильного физиологического раствора и после десятикратных разведений по 0,2 мл суспензии равномерно распределяли по поверхности плотной полноценной среды с помощью стерильного шпателя. В случае применения метода накопительных культур 5 -10 г (мл) той или иной пробы вносили в 100 мл среды М9. При выделении почвенной микрофлоры колбу с навеской встряхивали на качалке в течение 5 мин, затем, после оседания частиц почвы, 10 мл суспензии переносили в чистую колбу со 100 мл среды М9. Накопительное культивирование проводили в 0,3-л колбах Эрленмейера, в каждую из которых был помещен волокнистый носитель "ВИЯ" (ТУ 995990) весом 2 г. В качестве единственного источника углерода и энергии добавляли нефтепродукт в концентрации 0,1-1,0 г/л.

Выделение чистых культур микроорганизмов из состава биокатализаторов проводили следующим образом. Кусочки носителя с иммобилизованными клетками, взятые из колонок модельной установки или из колб с биокататазаторами, помещали в биологические пробирки с 10 мл стерильного физиологического раствора и интенсивно встряхивали в течение 20 мин. Из полученной таким образом суспензии микробных

клеток готовили серии десятикратных разведений. По 0,2 мл суспензии из разведений КГ1, 10"5,10'6 высевали на чашки Петри с МПА, равномерно распределяя инокулят по поверхности среды с помощью шпателя. Чашки с посевами инкубировали в термостате при 28°С. Учет выросших колоний производили на четвертые сутки.

Идентификация микроорганизмов проводилась общепринятыми методами на основании изучения совокупности культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков (Bergey's Manual..., 1986). Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли методом бумажных дисков.

Способность микроорганизмов использовать для роста минеральное масло, его фракции, сырую нефть, дизельное топливо и твердый парафин определяли с помощью чашечного метода Мак-Кланга (Теппер Е.З. и др., 1993), согласно которому отмечалось наличие или отсутствие роста культуры вокруг или внутри капель субстрата на поверхности плотной минеральной среды.

Способность штаммов подвергать биодеградации жидкие индивидуальные углеводороды определяли с помощью метода лунок (Егоров Н.С., 1976). Для этого в центре застывшей агаризованной среды М9 пробочным сверлом вырезали лунку диаметром 8 мм, в которую добавляли 2-3 капли субстрата, затем производили посев суспензий исследуемых культур штрихом по радиусу от центра. О деструкции углеводорода судили по наличию или отсутствию роста культур на 1-7 сут. инкубирования в термостате при 28°С.

Биодеградацию ПАУ - нафталина и антрацена - изучали с использованием методики (Steiber М. et al., 1994), выращивая микроорганизмы в микропланшете, в минеральной среде с добавлением в качестве единственного источника углерода и энергии ПАУ. О деструкции субстратов судили по появлению коричневатого окрашивания среды культивирования, обусловленного образованием продуктов биодеградации. Продолжительность инкубации посевов составляла 10-30 сут. при температуре 28°С.

Изучение биодеградации минерального масла, его фракций и индивидуальных углеводородов отдельными штаммами проводили, культивируя микроорганизмы в биологических пробирках или 0,3-л колбах Эрленмейера в 5 или 50 мл минеральной среды М9 соответственно, с добавлением 0,4 г/л углеводородного субстрата в качестве единственного источника углерода и энергии. Посевным материалом служила суточная агаровая культура штамма, суспендированная в физиологическом растворе. Оптическая плотность микробной суспензии

при посеве, определяемая на фотоэлектроколоримегре КФК-2 при 440 нм, составляла 1,0 ед. Продолжительность периодического культивирования составляла 14 сут. при температуре 28°С.

Аэрация осуществлялась в зависимости от задач путем кругового перемешивания на качалке УВМТ 12-250 при 160 об/мин или подачей в культуральную среду воздуха микрокомпрессором АЭН-3. В последнем случае расход воздуха составлял V/V в мин.

Моделирование процессов микробной очистки сточных вод проводили с помощью лабораторных очистных установок собственной оригинальной конструкции (рац. предложение № 8/11, СФ ВНИИ Генетики; положительное решение от 26.09.94 на полезную модель по заявке № 94000579).

Подача растворов с заданной скоростью при непрерывном культивировании осуществлялась перистальтическим насосом НП-1.

Модельные ОМР готовили с добавлением ПАВ или технических моющих средств (ТМС). В случае ПАВ растворы готовили на основе среды М9, в случае ТМС - на водопроводной воде без добавления каких-либо минеральных солей. Значение pH всех растворов ТМС корректировалось до 7,5. Растворы не стерилизовали. В экспериментах использовали 13 модельных ОМР различных составов. Модельные СОЖ готовили на основе минеральной среды М9 с добавлением эмульсолов в концентрации 0,5-2,0 г/л.

Определение химического потребления кислорода (ХГТК) проводили по стандартной методике (Лурье Ю.Ю., 1984).

Количественные характеристики процесса биодеградации минерального масла и других углеводородных субстратов изучали с помощью методов РЖ- и УФ-спектроскопии (Лурье Ю.Ю. и др., 1974, ОСТ 38.01378-85, Осипов М.В., 1968), экстрагируя нефтепродукты из культуральной жидкости тетрахлоридом углерода или хлороформом. В работе использовали спектрофотометры "Specord 75IR" и "Specord М40" (ГДР). Для определения содержания нефтепродуктов в исследуемых образцах методом ИК-спектроскопии использовали полосы поглощения в области 2700-3100 см"1, которые соответствовали асимметричным и симметричным валентным колебаниям СН2- и СН3-групп. Применение метода УФ-спектрофотометрии позволило оценить биодеградацию ароматических структур в составе минерального масла, сырой нефти и других нефтепродуктов. Запись спектров проводили в диапазоне 250-300 нм.

Способность штаммов разрушать пирокатехин исследовали в биологических пробирках в 5 мл минеральной среды М9 с добавлением

субстрата в концентрации 0,2 г/л. Культивирование проводили при интенсивной аэрации в течение 3 сут. По окончании культивирования микробные клетки отделяли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин. Супернатант разбавляли в пять раз и анализировали спектрофотометрически на приборе "Specord М40" в диапазоне 220-300 нм. О присутствии пирокатехина в среде судили по наличию максимума поглощения раствора в области 275 нм. Изменение УФ-спектра и появление максимума поглощения в области 257 нм свидетельствовало о присутствии в среде цис, цис-муконовой кислоты - продукта орто-расщепления пирокатехина.

Для изучения микробной деградации индивидуальных ачканов (гсксадекана и гептадекана), а также качественной оценки процесса микробной деструкции фракции н-алканов минерального масла И-20 применяли метод газовой хроматографии. Углеводороды из среды извлекали путем экстракции тетрахлоридом углерода. Подготовленные пробы анализировали на газовом хроматографе "Кристалл 2000" с пламенно-ионизационным детектором и капиллярным модулем. Использовали кварцевую капиллярную колонку длиной 25 м и внутренним диаметром 0,32 мм. Анализ проводили в режиме программирования температуры 130 и 200°С. Используемый газ носитель - азот.

Для определения эмульгирующей активности культуры выращивапи в 0,3-л колбах Эрленмейера с 50 мл стерильной среды 5 и с добавлением 0,6 ли глицерина. Микроорганизмы культивировали на качалке в течение 5 сут. Клетки осаждали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин. О присутствии эмульгатора в среде судили по наличию эмульгирующей активности культуральной жидкости. Супернатант перемешивали на встряхивателе с равным объемом керосина (или минерального масла) в течение 20 мин. Полученную эмульсию оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Эмульгирующую активность (Эа) определяли как отношение объема эмульсии (Уэ) к общему объему жидкости (V) по формуле:

Уэ

Эа = — х100% V

Показателем стабильности полученной эмульсии служило время ее расслоения (Абрамзон A.A. и др., 1988).

Наработку биомассы углеводородокисляющих микроорганизмов для внесения в нефтезагрязненную почву проводили в достаточном количестве колб Эрленмейера с бульоном Хоттингера на качалке при 29°С в течение суток. Биомассу, предварительно отделенную центрифугированием, либо (в большинстве случаев) вместе с

культуральной жидкостью, ресуспендировали в 10 л водопроводной воды. Нефелометрнчески определяли оптическую плотность полученной суспензии и. по результатам измерений приблизительно рассчитывали посевную; дозу интродуцируемых микроорганизмов, которая в среднем составляла 1,2х10чкл/мл.

Для анализа нефтезагрязненной почвы пробы отбирали с трех горизонтов (0, 10 и 20 см) методом конверта (в пяти точках). Затем готовили смешанную пробу для каждого горизонта, которую и использовали для анализа (ГОСТ 17.1.4.01-80, ГОСТ 17.4.3.01-83, ГОСТ 17.4.4.02-84).

Определение содержания нефти в почве проводили также с использованием методов ИК- и УФ-спектроскопии. Нефть из почвенных навесок извлекали четырехкратной экстракцией тетрахлоридом углерода в 0,2 5-л колбах на встряхивателе. Экстракты пропускали через бумажный фильтр, который затем промывали 10 мл растворителя, и объединяли до общего объема 30 мл. Из полученных экстрактов отбирали аликвоты, разбавляя их в 5 и 160 раз соответственно для РЖ- и УФ-анализов, в последнем случае образцы экстрактов перерастворяли в хлороформе. Концентрацию загрязнителя в почве определяли по предварительно построенным калибровочным кривым.

Результаты экспериментов статистически обработаны (Варфоломеев С.Д., Калюжный C.B., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Селекция биокатализаторов н изучение их деструктивной активности. В результате проведенной селекции был получен ряд биокатализаторов, представляющих собой иммобилизованные на волокнистом носителе клетки специализированных микроорганизмов-деструкторов, разрушающих различные марки минеральных масел, эмульоолы и сырую нефть в условиях периодического и непрерывного культивирования.

Исследования показали, что процесс формирования биокатализаторов при использовании различных природных источников микроорганизмов как в условиях периодического (в колбах), так и в условиях непрерывного (в лабораторных установках) культивирования продолжается 3-5 месяцев. Внесение селекционированных штаммов, утилизирующих минеральное масло, позволило сократить этот период до 2 месяцев. Сформированные биокатализаторы обладали стабильной деструктивной активностью по отношению к исследованным

нефтепродуктам в течение 5 лет и в настоящее время продолжают работать.

Для моделирования процесса микробной очистки ОМР и СОЖ были сконструированы лабораторные установки: для очистки в режиме периодического культивирования - роторная установка и для непрерывного процесса - установки колоночного типа (рис.1).

Была изучена деструкция минерального масла в 13 образцах модельных и 5 образцах реальных ОМР. Моделирование очистки СОЖ проводили с использованием эмульсола (технологического масляного концентрата, на основе которого приготавливают промышленные СОЖ). В исследованиях использовали 5 образцов модельных и 3 образца реальных отработанных СОЖ.

Установлено, что биодеградация минеральных масел и эмульсолов в условиях непрерывной очистки модельных стоков проходила значительно эффективнее, чем в условиях периодического культивирования и составляла 81-95%. При этом деструкция масла в у становках проточного типа как в составе модельных ОМР, так и в составе

модельных СОЖ (на основе эмульсолов) существенно не различалась. Снижение показателя ХГЖ в результате очистки ОМР составляло 84%, СОЖ - 87%.

Сравнивая деструктивную активность биокатализаторов, селекционированных в условиях периодического культивирования, по отношению к различным нефтепродуктам, было установлено, что в ряду исследованных субстратов легче подвергалась микробной деградации сырая нефть (77-83%), труднее - эмульсол (61-69%). Деструкция минеральных масел составляла от 67 до 82%. Исследования показали, что подверженность минеральных масел различных типов биодеградации зависит от содержания в них ароматических фракций, а также присадок. Наличие последних делало масла более устойчивыми к микробному разрушению.

Повышение концентрации минерального масла в ряду 0,1-1,0 г/л увеличивало деструктивную активность разрушающих его микробных консорциумов. При этом, низкие концентрации субстрата (0,05 г/л) подвергались биодеградации заметно хуже. ■

Присутствие в сточных водах типа ОМР поверхностно-активных веществ, эмульгирующих минеральные масла, делало необходимым изучение влияния этих компонентов на деструктивную активность исследуемых биокатализаторов. Известно, что наличие ПАВ в среде облегчает процесс микробной деградации углеводородного субстрата (11ая1ап V. ег а1., 1993). В наших исследования было обнаружено, что увеличение концентрации ПАВ от 0,1 до 0,3 г/л действительно способствовало микробному разрушению масла. Однако применение в качестве эмульгатора ТМС вместо чистого ПАВ несколько ухудшало биодеструкцию нефтепродукта.

Сравнение микробной деградации минерального масла в составе модельных стоков в аэробных и анаэробных условиях показало, что анаэробная очистка маслосодержащих сточных вод является недостаточно эффективной. Деструкция масла при анаэробной очистке модельной СОЖ происходила лишь на 40%. Подобные выводы подтверждаются и некоторыми литературными данными (Симакова Т.Л. и др., 1968).

Очистка реальных сточных вод и ее оптимизация. Деградация минерального масла в реальных сточных водах так же, как и в модельных, проходила более интенсивно в условиях проточного, а не периодического культивирования. При замене модельных сточных вод на реальные отмечено некоторое снижение деструктивной активности биокатализаторов (рис. 2 и 3). В условиях периодического культивирования в колбе оно было более значительно, чем при проточном

в установке. Очистка реальных ОМР от минерального масла в условиях периодического культивирования проходила на 38-52%, тогда как в режиме протока - на 65-88% (рис. 2). Эффективность проточной очистки реальных ОМР по ХПК составила 76%.

Очистку высококонцентрированных маслосодержащих сточных вод целесообразно проводить после их разбавления (в случае отработанных СОЖ, не подлежащих регенерации) или декантации, что позволяет снизить концентрацию нефтепродукта и уменьшить нагрузку на очистную установку. При концентрации масла 2,0-3,0 г/л в условиях периодического культивирования его микробная деструкция достигала 76%, а в режиме непрерывной очистки - 89,5% (рис. 3). Снижение ХПК после очистки реальной СОЖ в колоночной установке составило 78%.

Наличие в сточных водах механических и токсичных примесей, затрудняло процесс деструкции минерального масла в составе отработанных моющих растворов и СОЖ. В этой связи, комплексное использование штаммов, разрушающих сопутствующие загрязнители, в частности ПАВ и аминонитрил, способствовало повышению эффективности очистки.

Таким образом, было показано, что непрерывная система аэробной очистки является достаточно эффективной и устойчивой к изменениям состава подаваемых стоков. Об этом также свидетельствовало появление на последних этапах очистки простейших типа инфузорий, одноклеточных и нитчатых водорослей, завершающих собой сукцессию организмов в очистной установка.

Описанная система модельных очистных установок реализует в себе одновременно несколько условий, оптимизирующих процесс очистки сточных вод. Во-первых, иммобилизация микроорганизмов позволяет создать высокую концентрацию клеток штаммов-деструкторов в зоне биореактора и уменьшает их вымывание из системы. Во-вторых, комплексность биокатализатора, которая обеспечивается сложным составом формирующего его микробного консорциума, содержащего высокоактивные штаммы-деструкторы компонентов сточных вод, делает систем)' устойчивой к залповым выбросам и изменению состава подаваемых сточных вод. В-третьих, многосекционность установки колоночного типа препятствует смешению загрязненной и очищенной воды, а также обеспечивает адаптацию клеток к определенному составу среды, меняющемуся по секциям установки в ходе очистки. В-четвертых, реализуется непрерывный процесс очистки и самовоспроизводимость системы.

и я

а >>

р, и, и и

□ ОМР б

□ ОД.2

НКВ

биокатализаторы

Рис. 2. Деструкция минерального масла в составе модельных (ОМР6) и реальных (ОД.2) сточных вод биокатализаторами в периодических (НКВ) и непрерывных (У2) условиях

с.

н и и

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

К Р У

биокатализаторы

□ эгт

□ К А .1

□ ЭМ .1

Рис. 3. Деструкция эмульсола ЭГТ в составе модельных (ЭГТ) и реальных (КАЛ, ЭМ.1) отработанных СОЖ биокатализаторами в периодических (КР) и непрерывных (У1) условиях

Стабильная работа модельных установок на протяжении пяти лет позволила отработать процесс микробной очистки маслосодержащих стоков, таких как ОМР и СОЖ, до концентраций нефтепродуктов, соответствующих требованиям, предъявляемым к качеству оборотных сточных вод (0,01-0,015 г/л) (Общесоюзные нормы технологического проектирования предприятий автомобильного транспорта, 1990).

Полученные результаты обосновывают возможность использования созданной .модели в крупномасштабной биотехнологии очистки сточных вод, содержащих минеральные масла.

Разработка способа локальной очистки маслосодержащих сточных вод доведена до стадии создания пилотной установки объемом 200 л, которая снабжена всеми необходимыми узлами для поддержания жизнедеятельности микроорганизмов, мобильна и может служить для отработки процесса очистки непосредственно на производстве с целью его дальнейшего масштабирования.

Микробный состав биокатализаторов, разрушающих минеральное масло. Поскольку в литературе практически отсутствуют сведения по изучению роли отдельных микроорганизмов, формирующих биокатализатор очистной установки, полученные нами результаты по этому вопросу представляют особый интерес.

Изученные микробные консорциумы биокатализаторов лабораторных установок представляли собой сообщества из 10-13 видов микроорганизмов, преимущественно грамотрицательных палочек с аэробным или факультативно-анаэробным типами метаболизма. Они относились к следующим родам: Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Acinctobactcr, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Aeromonas, Azomonas, Moraxella, Micrococcus, Bacillus и Mycobacterium. Наибольшим видовым разнообразием характеризовался род Pseudomonas.

Установлено, что по ходу движения очищаемой жидкости происходило постепенное изменение микробного состава биокатализаторов, что свидетельствовало о наличии пространственной сукцессии микроорганизмов. Количественное соотношение микроорганизмов различных видов так же изменялось от секции к секции. В то же время, среди культур, составляющих тот или иной консорциум, можно было выделить доминирующие виды, присутствующие на всех ступенях очистки в значительном количестве и образующие, "ядро" данного сообщества.

Количественные и качественные характеристики биокатализаторов установок изменялись с течением времени под влиянием смены композиции подаваемых на очистку стоков. Однако полной замены видового

состава консорциума не происходило: около 50% видов микроорганизмов оставались прежними.

В процессе изучения деструктивной активности выделенных культур по отношению к минеральному маслу было установлено, что способность расти на нативном масле проявляли не более 1-2 микроорганизмов одного консорциума, удельный вес которых зачастую был невелик. Как правило, такие культуры, по данным ИК-спектроскопии, хорошо утилизировали СН:- и СН3- содержащие компоненты минерального масла, к числу которых могут относиться алканы, нафтены, а также соединения, имеющие в своей структуре алкильные радикалы.

Большинство микроорганизмов - членов одного консорциума -подвергало биодеградации преимущественно либо ароматические соединения, либо вещества указанной выше структуры, регистрируемые ИК-спектроскопией. Установлено, что первые разрушаются не более, чем на 34%, а последние - не более, чем на 47%. В то же время, отдельные культуры разрушали и те и другие компоненты масла.

Как показали полученные результать1, деструктивная активность изолированных чистых культур по отношению к минеральному маслу значительно ниже эффективности биодеградации этого субстрата биокатализаторами (микробными консорциумами) установок. Очевидно, что в ходе выделения чистых культур микроорганизмов была нарушена функциональная структура биокатализатора, активно разрушающего данный нефтепродукт. Т.е., в условиях протока идет селекция не отдельных видов, а специфических микробных сообществ, формирующихся в ходе утилизации многокомпонентного углеводородного субстрата.

Удельный вес того или иного вида в сообществе не всегда коррелировал с его деструктивной активностью, а о роли некоторых культур в консорциуме трудно было судить по их численности и способности к биодеградации масла. Изучение эмульгирующей активности микроорганизмов одного из консорциумов позволило определить значение для сообщества таких культур. Их функция заключалась, вероятно, в синтезе специфического биосурфактанта, позволяющего предварительно эмульгировать гидрофобный субстрат.

Организация микроорганизмов, способных эффективно эмульгировать и подвергать деградации различные компоненты смеси, в консорциум создает структуру, наиболее полно обеспеченную всеми необходимыми ферментными системами и потому более совершенную по сравнению с чистыми культурами. Кроме того, количественные и качественные перестройки микробного сообщества позволяют ему сравнительно легко адаптироваться к новым условиям (качественным

изменениям состава сточных вод и/или повышению концентраций загрязнителей).

Биодеградация углеводородных фракций минерального масла.

В результате исследований по биодеградации фракций минерального масла И-20 на примере микроорганизмов, входящих в состав биокатализатора очистной установки У2, было доказано, что исследуемый микробный консорциум обладает деструктивным потенциалом по отношению ко всем основным углеводородным фракциям минерального масла: алкановой, нафтеновой и ароматической. Были обнаружены штаммы, предпочтительно разрушающие ту или иную фракцию.

Большинство микроорганизмов, относящихся к исследуемому консорциуму, оказалось способными подвергать деградации алканы и алкилсодержащие субстраты.

Была изучена деструктивная активность штаммов Ac. calcoaceticus ТМ-31, Mycobacterium sp. SL-5 и Mycobacterium sp. SL-22 по отношению к фракции н-алканов, а также чистым веществам - гексадекану и гептадекану. Установлено, что штаммы ТМ-31 и SL-5 в течение суток разрушали более 90% индивидуальных углеводородов. Анализ деструкции фракции алканов показал, что исследуемые штаммы способны были в течение 14 сут. утилизировать как парафиновые так и изопарафиновые углеводороды с длиной углеродной цепи до С25-

При исследовании микробной деструкции ароматических структур было установлено, что ни один из исследованных штаммов - членов консорциума - не подвергал биодеградации молекулы аренов более чем на 50%. В то же время, некоторые из них оказались способными к утилизации пирокатехина - промежуточного метаболита соединений, содержащих в своей структуре ароматическое кольцо.

Среди микроорганизмов сообщества лишь один штамм AI. faecalis 111-15 проявлял способность использовать декалин в качестве субстрата для роста, что показало принципиальную возможность разрушения нафтеновых структур в очистной установке.

Ни одна из исследованных чистых культур, выделенных из состава консорциума установки не обладала способностью к деградации полициклических ароматических углеводородов. Было показано, что деструкцию последних осуществляет лишь микробное сообщество в целом.

Как специфические деструкторы выделенные штаммы могут быть использованы для инициации процесса биодеградации исследуемых субстратов и обогащения естественно формирующихся, конеорщгумов.

Очистка нефтезагрщнснной почвы с использованием селекционированных микроорганизмов в условиях чнкроколевого эксперимента. Для определения возможности использования культур, входящих в состав бнокатализатора установки, для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, был проведен микрополевой экспер.имент по рекультивации нефтезагрязненной почвы. В результате исследования была определена степень деградации сырой нефти под действием физико-химических факторов окружающей среды, агротехнических мероприятий и внесения специфических микроорганизмов. В эксперименте использовались наиболее активные штаммы-деструкторы минерального масла Ac. calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5, выделенные го состава биокатализаторов очистных установок.

Эксперимент проводили на 4 изолированных участках площадью 1 м2 каждый. Три из них были загрязнены сырой нефтью (5 л/м2). В качестве контрольных были выбраны следующие участки:

К1 - незагрязненный взрыхленный участок. Использовался для контроля за восстановлением растительности после рыхления.

К2 - участок, загрязненный нефтью и не подвергавшийся ни агротехнической, mi микробиологической обработке.

КЗ - участок, загрязненный нефтью и обрабатываемый агротехнически. Использовался для оценки биоремедиации почвы, т.е. самовосстановления без внесения дополнительной биомассы специализированных микроорганизмов-деструкторов.

На загрязненных участках почвы под влиянием физико-химических факторов окружающей среды уже через полтора месяца происходило разрушение нефти на 43%, при этом ароматические углеводороды разрушались на 18% (рис.4). Проведение дополнительного рыхления в этот период позволило интенсифицировать процесс деградации загрязшггеля: содержание нефти уменьшилось на 64%, в том числе доля ароматических соединений - на 48%.

За 4,5 месяца на контрольном участке, где не проводились никакие восстановительные мероприятия (участок К2 на рис.4), содержание нефти снизилось на 62%, в том числе ароматических углеводородов - на 43%.

Применение агротехнических мероприятий способствовало интенсификации процесса рггру:гс!п:я нефти под действием факторов внешней среды и акткшнронало деятельность аборигенной леводородокисляющей микрофлоры. В ->:мх условиях деградация нефти за весь период эксперимента спасала 71%. при этом ароматические углеводороды были разрушены на 68% (участок КЗ. на рис. 4).

Рис. 4. Изменение содержания нефти в загрязненной почве:

К2 - необрабатываемый участок;

КЗ - участок, обрабатываемый агротехнически;

О - опытный участок, обрабатываемый микробиологически;

О - определение содержания нефти в почве методом ИК - спектроскопии;

И определение содержания нефти в почве

методом УФ - спектроскопии

Использование для очистки загрязненной 'почвы биомассы уг-леводородокисляющих микробных штаммов Ac. calcoaceticus ТМ-31 и .Mycobacterium sp. SL-5 в комплексе с проводимыми агротехническими мероприятиями позволило снизить содержание нефти в грунте почти в девять раз. Согласно данным, полученным с помощью ИК-слектроскопического анализа, деградация нефти составила 88%. При этом, ароматические соединения разрушались на 85%.

Таким образом, результаты проведенных исследований экспериментально обосновали возможность использования штаммов, выделенных из состава микробного консорциума, составляющего основу биокатализатора очистной установки, в биотехнологии рекультивации нефтезагрязненной почвы.

ВЫВОДЫ

1. Получено 18 микробных консорциумов, разрушающих различные марки минеральных масел, эмульсолы и сырую нефть в условиях периодического и непрерывного культивирования. Их формирование как в периодических, так и в непрерывных условиях культивирования продолжается 3-5 месяцев и может быть сокращено до 2 месяцев внесением активных штаммов-деструкторов.

2. Микробные консорциумы, разрушающие минеральные масла, представляют собой сообщества из 10-13 видов преимущественно грамотрицательных аэробных или факультативно анаэробных микроорганизмов различных таксономических групп. Их количественные и качественные характеристики изменялись с течением времени и определялись, главным образом, характером подаваемых на очистку стоков. Деструктивная активность по отношению к минеральному маслу у изолированных чистых культур значительно ниже активности консорциума в целом.

-1. Биодеградация минеральных масел и эмульсолов в условиях проточного культивирования происходит более эффективно, чем в периодическом режиме и составляет 81-95% и 61-83% соответственно. Низкие концентрации минеральных масел (0,05 г/л) подвергаются биодеградации хуже, чем более высокие (0,1-1,0 г/л).

4. Биокатализатор на основе микробного консорциума обладает деструктивным потенциалом в отношении всех основных углеводородных фракций масла: алкановой, нафтеновой и ароматической. В то же время отдельные штаммы, входящие в него, предпочтительно разрушают ту или иную фракцию.

С использованием модельных маслосодержащих отработанных моющих растворов и смазочно-охлаждающих жидкостей определены основные параметры технологии их микробной очистки. Создана мобильная пилотная установка объемом 200 л, которая может быть использована для локальной очистки маслосодержащих сточных вод, а также для отработки этого процесса непосредственно на производстве с целью его дальнейшего масштабирования. В микрополевом эксперименте по рекультивации нефтезагрязненной почвы с использованием комплекса агротехнических мероприятий и селекционированных нами штаммов-деструкторов разрушение нефти составило 88%, в том числе ее ароматических компонентов - 85%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Турковская О.В., Панченко Л.В., Плешакова Е.В. Муратова А.Ю. Микробная очистка сточных вод от ПАВ и эмульгированных минеральных масел. // Биология и биотехнология очистки воды: Тез. докл. конф. 17-19 ноября 1992, Полтава. - Киев, 1992. - С.51-52.

2. Turkovskaya O.V., Panchenko L.V., Muratova A.Yu., Dubrovskaya E.V. Microbial degradation of surfactant and mineral oils and biotechnology of waste water purification. // Workshop on Environmental biotechnology: Abstr. books of Int. Simp. 4-8 July 1994. - Waterloo, 1994. WP-14.

3. Муратова А.Ю., Корчагина И.Н., Турковская O.B. Биодеградация минерального масла и его углеводородных фракций. //Новые направления биотехнологии: Тез. докл. IV конф. РФ. - Пущино, 1994. С.ЗЗ.

4. Шуб Г.М., Шендеров Б.А., Барковский А.Л., Горелик Э.В., Игнатов О.В., Корженевич В.И., Турковская О.В., Федоров А.Ю., Волченко Е.В., Муратова А.Ю., Панченко Л.В., Сингирцев И.Н. Экологическая микробиология (Итоги и перспективы). // Совр. проблемы мед. науки: Мат. научно-практич. конф. по законченным научным исследованиям. Ч.Ш. -Саратов: Изд-во СГМУ, 1994.

5. Муратова А.Ю., Турковская О.В. Изучение микробного консорциума, осуществляющего деструкцию минерального масла. // Прикл. биохим. и микробиол. -1994. -Т.30, N 6. -С.836-841.

6. Воронин СП., Волченко Е.В., Дубровская Е.В., Козулин C.B., Козулина Т.Н., Муратова А.Ю., Панченко Л.В., Романова Т.А., Сингирцев И.Н., Турковская О.В., Федоров А.Ю. Перспективы применения селекционированных микроорганизмов в экологической биотехнологии. // Мат. Чувашской респ. конф. по охране природы 31

6.

7.

января 1994 - 2 февраля 1995. -Чебоксары: Экологический вестник Чувашии, 1995. -Вып.5. -С.99-100.

7. Туманов В.Е., Муратова А.Ю., Турковская О.В. Способ очистки смазочно-охлаждающих жидкостей от органических компонентов. // Малоотходные и энергосберегающие технологии в системе водного хозяйства: Тез. докл. конф. 21-22 марта 1995. -Пенза, 1995. С.48-49.

8. Воронин СП., Волченко Е.В., Дубровская Е.В., Козулин C.B., Козулина Т.Н., Муратова А.Ю., Панченко Л.В., Романова Т.А., Сингирцев И.Н., Турковская О.В., Федоров А.Ю. Основные тенденции современной экологической биотехнологии и их реализация. // Процессы и оборудования экологических производств: Тез. докл. III межресп. научн.-техн. конф. 5-6 декабря 1995. -Волгоград, 1995. - С.146-147.

9. Turkovskaya О., Panchenko L., Muratova A., Dubrovskaya Е., Shub G. Biodégradation of surfactant and minerai oils. // World Environ. Congr. (World'95): Abstr. books. -London, Ont., Canada, 1995. P.363.

Ю.Турковская O.B., Муратова А.Ю., Плешакова E.B., Панченко JT.B. Утилизация отработанных моющих растворов с помощью микроорганизмов. // Химия и технология воды. -1996. -Т. 18, N 2. -С.212-216.

11.Турковская О.В., Панченко JI.B., Дубровская Е.В., Дмитриева Т.В., Плешакова Е.В., Муратова А.Ю., Шуб Г.М. Очистка стоков, содержащих ПАВ и нефтепродукты с помощью микроорганизмов. // Вода, экология и технология: Тез. докл. Второго междунар. конгр. 17-21 сентября 1996. -М., 1996. С.385.

12.Плешакова Е.В., Муратова А.Ю., Турковская О.В. Изучение генетического детерминирования признака биодеградации минеральных масел. //Микробное разнообразие: состояние, экология, проблемы: Тез. докл. междунар. конф. 8-11 октября 1996. -Пермь, 1996. С.84-85.

13.Муратова А.Ю., Плешакова Е.В. Микробиологическая очистка в защите окружающей среды от нефтяных загрязнений. П Проблемы изучения биосферы: Тез. докл. Всерос. конф. 3-4 декабря 1996. -Саратов, 1996. С.107-108.

14.Turkovskaya O.V., Muratova A.Yu., Panchenko L.V., Pleshakova E.V. Utilization of spent detergent solution and lubricating cooling liquids. / Global Environmental Biotechnology. Ed. D.L.Wise. -Amsterdam: Elsevier Science B.V. 1997. (в печати).