Система рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC: структура оперона и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз

Тарасова, Маргарита Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Система рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC: структура оперона и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Система рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC: структура оперона и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз"

На правах рукописи

Тарасова Маргарита Владимировна

СИСТЕМА РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ BspACI ИЗ BACILLUS PSYCHRODURANS АС: СТРУКТУРА ОПЕРОНА И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 С OiiT 2077

Кольцово - 2011

4857813

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Новосибирский государственный университет и ООО «СибЭнзайм», г. Новосибирск

Научный руководитель

кандидат биологических наук Гончар Данила Александрович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Ильичев Александр Алексеевич

кандидат биологических наук Филипенко Максим Леонидович

Ведущая организация Учреждение Российской академии

наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

Защита состоится «11» ноября 2011 г. в 13.30 часов на заседании диссертациоииого совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел: +7 (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан « » Ск/п^А^^- 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Бактериальные системы рестрикции-модификации (РМ системы) являются одними из интереснейших объектов, изучаемых в молекулярной биологии. Данные системы состоят из ферментов двух типов: первые, эндоиуклеазы рестрикции, (ЭР) проявляют рестрикционную (гидролитическую) активность, вторые, ДНК-метил грансферазы (МТазы), -модифицирующую. ЭР узнают определенные короткие последовательности и расщепляют по ним ДНК, в то время как М Газы метилируют одно из оснований того же сайта, защищая таким образом хозяйскую ДНК от гидролиза собственной ЭР. Изучение все большего числа ферментов РМ систем приводит к выводу, что роль данных белков в прокариотических клетках не ограничивается лишь защитной функцией, и биологическое значение этих систем не выяснено до конца.

Среди существующих РМ систем большой интерес представляют те из них, ферменты которых узнают непалиндромные последовательности ДНК. В этих системах содержится две или более МТаз, каждая из которых модифицирует свою цепь ДНК, а ЭР функционируют либо как мономеры, либо как гетеродимеры. Структурная организация таких РМ систем по сравнению с РМ системами, узнающими симметричные сайты, является заведомо более сложной. При этом, как генетическая организация «несимметричных» РМ систем, гак и свойства составляющих их ферментов исследованы явно недостаточно. Вследствие этого актуальным представляется изучение, как структуры, так и свойств отдельных компонентов РМ систем с непалиндромными сайтами узнавания.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось изучение системы рестрикции-модификации II типа BspACl из бактериального штамма Bacillus psychrodurans АС. В задачи настоящего исследования входило:

установление субстратной специфичности и места расщепления ДНК новой ЭР

BspACl;

исследование чувствительности ЭР BspACl к mSC-метилированию сайта узнавания на различных ДНК-субстратах;

получение рекомбинантной плазмиды, несущей ген(ы) МТазы(аз) BspACI; клонирование гена(ов) МТазы(аз) в составе экспрессируюшего(их) вектора(ов);

выделение гомогснного(ых) препарата(ов) рекомбинантной(ых) МТазы(аз) BspACI и определение оптимальных условий функционирования ферменга(ов);

определение основания(ий), метилируемого МТазой(ами) BspACI; проведение сравнительного анализа кинетических параметров реакции(й) метилирования, катализируемой(ых) МТазой(азами) BspACI;

определение организации оперона РМ системы BspACI.

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате выполнения данной работы найден бактериальный штамм Bacillus psycliroditrans АС, являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции II типа BspACI. Фермент узнаёт последовательность ДНК 5'-CJ.CGC-3'/3'-GGCTG-5' и расщепляет ее как указано стрелками. Детальное изучение чувствительности ЭР BspACI к ш5С-метилированию сайта узнавания позволяет использовать данный фермент в молекулярно-биологических и генно-инженерных экспериментах с ДНК млекопитающих.

Путем клонирования получена рекомбинантная плазмида pBspACI, несущая гены двух ш5С-ДНК-метилтрансфераз BspACI. Показано, что данная плазмида может быть использована для поиска новых метидзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз. Гены обеих МТаз субклонированы в составе экспрессируюших векторов и выделены гомогенные препараты рекомбинантных белков. Каталитические параметры, измеренные для данных ферментов, использовались в сравнительном анализе, который показал, что константы Михаэлиса в целом для ДНК-метилтрансфераз с палиндромными сайгами узнавания более чем на порядок выше таковых для МТаз с непалиндомиыми сайтами узнавания.

Установлено, что ген второй ДНК-метилтрансферазы BspACI имеет на N-коице домен, гомологичный Хге-регуляторам транскрипции, в том числе нескольким контрольным белкам РМ систем, из чего можно сделать вывод об участии данной МТазы в регуляции транскрипции своего гена. Анализ первичных структур ш5С-ДНК-мстилтрансфераз НА и IIS типа показал, что M2.BspACI является единственным ферментом, имеющим предполагаемый регуляторный домен.

Установлена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК Bacillus psychrodurans АС, следующего за генами МТаз, содержащая третью открытую рамку трансляции (ОРТ 3). Методом масс-спектрометрии было показано соответствие данной ОРТ эндонуклеазе рестрикции BspACI. Таким образом, установлен порядок расположения всех генов, входящих в оперон системы рестрикции-модификации BspACI, и определены предполагаемые цис-регуляторные элементы их экспрессии.

ДНК-метилтрансферазы, охарактеризованные в данной работе, были использованы при создании специальных мегилированных субстратных ДНК для осуществления поиска новых метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, способных расщеплять CG-метилированную ДНК человека в рамках проекта Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-гехнологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме: «Разработка способов получения высокоэффективных продуцентов метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, способных расщеплять CG-мстилированную ДНК человека, для нужд эпигенетической диагностики онкозаболеваний» (государственный контракт на выполнение научно-исследовательских работ № 16.512.11.2167).

Апробация работы и публикации

Материалы исследований по теме диссертации представлены на следующих российских и международных конференциях: «XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых» (Москва, 2009); «XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых» (Москва, 2010); «Конференция лауреатов Всероссийского конкурса «Студенты, аспиранты и молодые ученые - малому наукоемкому бизнесу - «Ползуновские гранты» (Барнаул, 2009), "Nucleic Acid Enzymes & Enzymes in Human Disease" (Гяпьцзинь, Китай, 2011). Ho материалам диссертации опубликованы четыре печатные работы.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из семи разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена па 129 станицах машинописного текста и включает 38 рисунков, 6 таблиц и 1 приложение. Список цитируемой литературы содержит 220 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Характеризация эндонуклеазы рестрикции BspACI

Микроорганизм-продуцент нового фермента был выделен нами из почвенных изолягов и депонирован в Коллекции культур микроорганизмов НПО «СибЭнзим» под номером 6М92. Идентификация по определителю Берги, а также рестрикциониый анализ фрагментов гена 16S рРНК позволили отнести изучаемый штамм к виду Bacillus psychrodurans. Новый фермент был назван R.BspACl в соответствии с общепринятой номенклатурой РМ систем. В результате наработки культуры клеток штамма В. psychrodurans АС было получено 50 г биомассы с активностью 5000 ед/г. После хроматографической очистки из данного количества биомассы было получено 4 мл препарата

эндонуклеазы рестрикции ВврАСТ с концентрацией 3000 ед/мл. Оптимальными условиями для работы фермента оказались БЕ-буфер 4 (10 шМ Тш-НС! (рН 8.5 при 25°С); 10 шМ MgCl2; 100 шМ №С1; 1 тМ ОТТ.) и температура 30°С.

Для определения последовательности узнавания фермента проводили гидролиз ДНК фагов Т7 и лямбда, а также плазмиды риС19, Я-ВэрАСГ и сравнивали полученные электрофореграммы с теоретически рассчитанными картинами расщепления ДНК по сайтам узнавания более чем 260 известных ЭР. Сравнение показало, что экспериментально полученные электрофореграммы продуктов гидролиза всех трех ДНК соответствуют картинам их расщепления по последовательности нуклеотидов 5'-ССОС-3' (рис. 1).

Для подтверждения установленной последовательности узнавания и определения места гидролиза ДНК Я-ВэрАС! проводили гидролиз олигонуклеотидного дуплекса 4М/ЗМ, содержащего последовательность 5'-ССОС-3" (подчеркнута), а также сайты узнавания ЭР Ара! (5'-СООССС-3') и АссВ$1 (5'-ОАОСОО-3'), расщепляющих данный дуплекс как показано стелками:

ЗМ 5'-СС.ТСААТТСАСС.АССССС1ССтСТССТСОАТССОТ-3' 4М 5'-ЛС(;(;ЛЧГ(ЗЛ(}САС. ;ССС(,СССТСОТСЛЛТ'ГСАСС-3',

Рис. 1. Расщепление

эндонуклеазой рестрикции В5рАС1 различных ДИК. А - ДИК фага лямбда; В - ДНК фага Т7; В -р1)С 19; 1 интактная ДНК; 2 ДНК, обработанная рестриктазой ВярАСР, 3 - теоретическая картина гидролиза ДНК рестриктазой ВзрАС!.

На рис. 2 представлены результаты проведенного эксперимента, из которых следует, что ВврАС! расщепляет олигонуклиотидный дуплекс в тех же позициях, что и Ара1 и АссВвГ. Таким образом, эндонуклеаза рестрикции ВврАС! узнает последовательность ДНК 5' С|СОС 373' СОСТО 5' и расщепляет ее как указано стрелками, являясь истинным изошизомером рестриктазы АсП.

2. Изучение чувствительности К.В8рАС! к ш5С-метилированию сайта узнавания

Для исследования зависимости активности Я-ВэрАС! от наличия 5-метшщитозинов в сайте узнавания проводили гидролиз дуплексов, составленных из олигонуклеотидов ЗМ и

4M и четырех олигонуклеотидов, отличающихся от них наличием ш5С-метилирования

одного из цитозинов в сайте узнавания R.BspACI (подчеркнут):

4МС-0 5'- ACGGATCGAGGAG(m50GGGCCCTCGTGAATTCACG-3'

ЗМС-1 5'- CGTGAATTCACGAGGGC(m5C)CGCTCCTCGATCCGT-3'

ЗМС-2 5'- CGTGAATTCACGAGGGCC(m5ÖGCTCCTCGATCCGT-3'

ЗМС-З 5'- CGTGAATTCACGAGGGCCCG(m5C)TCCTCGATC'CGT-3'

Рис. 2. Определение позиции гидролиза эядонуклеазой рестрикции BspACI.

Электрофореграмма 20%-ного ПААГ с 7 М мочевиной. Дорожки: 1 - олигонукяеотидный дуплекс 4М*/ЗМ; 2 - дуплекс 4М*/ЗМ, обработанный BspACI; 4 - дуплекс 4М*/ЗМ, обработанный Ара!; 5 - дуплекс 4М/ЗМ*; 6 -дуплекс 4М/ЗМ*, обработанный BspACI; 8 -дуплекс 4М/ЗМ*, обработанный AccBS!; дорожки 3 и 7 - маркеры, полученные частичным гидролизом экзонуклеазой III из E.coli олигонуклеотидных дуплексов 4М*/ЗМ и 4М/ЗМ* соответственно. Меченые

олигонуклеогиды отмечены знаком *.

Для каждого дуплекса были отдельно помечены верхняя и нижняя цепь и проведен гидролиз ЮЗврАС]. Как видно из рис. 3, наличие 5-метилцитозина в первом положении сайта узнавания (5'-(гп5С)СОС-3') или в комплементарной цепи (5'-С(ш5С)00-3') полностью исключает гидролиз ДНК (рис. 3, дорожки 3, 9, 6 и 12). В тоже время модификация второго или третьего цитозинов в сайте узнавания не препятствует гидролизу нижней цепи ДНК (рис. 3, дорожки 10 и 11) и частично (для второго) или полностью (для третьего) блокирует расщепление верхней цепи ДНК (рис. 3, дорожки 4 и 5). Таким образом, модификация первого цитозина в верхней цепи и единственного цитозина в нижней цепи, вероятно, соответствует каноническому метилированию сайта узнавания изучаемой РМ системы ВврАС!.

Для подтверждения полученных данных и их сравнения с результатами расщепления протяженных молекул ДНК проводили гидролиз гошзмидных ДНК, содержащих частично метилированные сайты узнавания Я.ВхрАС!. В работе использовали плазмиды рГзр4Н11 и рНэрАП. Первая является гглазмидой рМТЬ22 со встроенным геном метилазы М.Рзр4Н1, модифицирующей второй цитозин в последовательности 5'-ОСЫОС-3\

_ЗМ* 4M*

к BspAC М Ара '11 BspAC М AccBS 1

ese в wmm

Вторая представляет собой плазмиду р11С19 со встроенным геном мети лазы М.НврА!, модифицирующей первый цитозин в последовательности 5'-ОССС-3*.

В случае плззмиды рНэрАИ возможен единственный вариант перекрывания сайтов узнавания К.ВзрАО и М.НзрА!, когда метилированный цитозин оказывается в сайге узнавания ВярАСЛ: 5'-ССО(т5С)ОС-373'-ООСО(т5СЮ-5' (здесь и далее сайт узнавания ВврАС! подчеркнут). В соответствии с полученными результатами по гидролизу олигонуклеотидов, расщепление такой последовательности ДНК должно происходить только по нижней цепи с образованием одноцепочного разрыва. На рис. 4А представлены теоретические картины полного гидролиза плазмиды рНэрАП (рис. 4А-1) и с учетом блокирования растепления вышеуказанной последовательности (рис. 4А-2).

Рис. 3. Результат расщепления олигоиуклеотидиых дуплеков рестриктазой ВврАС!. Дорожки 2-6, 8-12 -олигонукяеотиды, обработанные рестриктазой ВэрАО. Дорожки: 1 - ЗМ*, 2 - ЗМ4/4М; 3 - ЗМС-1 */4М; 4 -ЗМС-2*/4М; 5 - ЗМС-3*/4М; 6 - ЗМ*/4МС-0; 7 - 4М+, 8 - ЗМ/4М*; 9 -ЗМС-1/4М*; 10 - ЗМС-2/4М*; 11 - ЗМС-ЗММ*; 12 - ЗМ/4МС-0*. Меченая цепь отмечена знаком *.

На рис. 4Б-1 приведены экспериментально полученные результаты гидролиза плазмиды рНзрАП К.ВзрАСЛ. Как видно из рисунка, действительно не происходит образование фрагментов 174 и 47 п.и., но появляется фрагмент ДНК длиной 221 п.н. Аналогично вместо пары фрагментов 77 и 44, наблюдается появление фрагмента 121 п.н.. Единственное отличие экспериментального гидролиза плазмиды рНзрАП от соответствующей теоретической картины заключается в отсутствии на электрофореграмме фрагмента длиной 66 п.н.. Внутри этого фрагмента на расстоянии 10 п.н. от его края находится описанная выше последовательность 5'-ССО(т5СК}С-373'-ОССО(т5СЮ-5', при расщеплении которой изучаемый фермент выступает в роли никазы, гидролизу я лишь нижнюю цепь. Вносимый в этот фрагмент ник, обуславливает отщепление одноцепочечного олигонуклеотида длиной 10 п., что приводит к образованию гибридного фрагмента ДНК 56

Н./66.Н.

М !

Б М

4 М

ШштШ* ^^

^ к I

Рис. 4. Гидролиз плаз,«ид рНярАП и рРяр4Ж1 ЭР ВярАО. А -теоретическая картина гидролиза плазмид рНзрАП (1) и рНзрАШСЗ (2) К.ВхрАС!; Б - расщепление плазмид р№рА(1 (1) и рКкр41Ш (2) КЛ^рАСЛ; В - теоретическая картина гидролиза плазмид рр5р4НШС1-С0-СЗ (1), рРкр4Н11 (2) К.ВярАС!. М -маркер молекулярного веса рЦС/Мвр!.

Для плазмиды рРзр4Н11 существует два варианта пересечения сайтов узнавания Я-ВзрАС! и р5р4Н1. когда метилированный цитозин оказывается в сайте узнавания ВзрАСЛ. В первом случае, как и в плазмиде рНврАП. метилированным оказывается третий цитозин сайта узнавания ВврАС[: З'-ССОГтЗСШОС-ЗУЗ'-СОСОЫтЗСЮо'. Второй вариант перекрывания - 5'-С( т5С)ССгС-3 73 '-СОСУ т5С10-5' соответствует предполагаемому каноническому метилированию и в этом случае гидролиз должен блокироваться по обеим цепям. На рис. 4В представлены теоретические картины полного расщепления плазмиды р1'Чр4Н11 по сайту узнавания к.ВэрАО (рис. 4В-2) и с учетом блокирования гидролиза (рис. 4В-1).

На рис. 4Б-2 приведены результаты гидролиза плазмиды рР$р4НП ЭР ВзрАО. Как видно из рисунка, в результате блокирования гидролиза происходит образование фрагментов

ДНК 231, 211, 208, 146, 119 и 50 п.н., из следующих комбинаций мелких фрагментов: 121 и 110, 121 и 44(*2), 109 и 99, 127 и 19, 91 и 28,43 и 7 п.н., соответственно.

Таким образом, эидонуклеазная активность R.BspACl блокируется метилированием любого из цитозинов в узнаваемой последовательности ДНК 5'-C|CGC-3V5'-GtCGG-3', кроме второго цитозина, при метилировании которого гидролиз блокируется лишь частично. Соответственно, ДНК млекопитающих, содержащая метилированный CG-динуклеотид внутри сайта узнавания или перекрывающийся с ним в последовательности 5'-CCG(m5C)G-373'-GGCG(m5C)-5\ не будет гидролизоваться с образованием фрагментов ДНК, однако в последнем случае будет происходить образование пиков в нижней цепи сайга узнавания. Полученные нами данные надо также учитывать при гидролизе рестриктазой BspACl препаратов ДНК, обработанных метилазами M.HspAl, M.Fsp4Hl, M.SssI, M.FauIA, M.FauIB и другими ДНК-метилтрансферазами, которые модифицируют цитозины, входящие в сайт узнавания R.BspACl.

3. Клонирование генов и анализ первичной структуры ДНК-метилтрансфераз

BspACl

IIa первом этапе клонирования М'Газ РМ системы BspACl геномную ДНК из штамма Bacillus psychrodurans АС гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Pstl и Zsp21, после чего оба гидролизата смешивати и лигировали с вектором pUC19, линеаризованным R.Pstl. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli ER 2267. После инкубации на селективной среде с ампициллином было получено около 1200 клонов, из которых была выделена суммарная плазмидная ДНК, содержавшая набор фрагментов ДНК Bacillus psychrodurans АС различной длины в векторе pUC19 (геномная библиотека). Данная "библиотека" обрабатывалась R.BspACl и снова трансформировалась в клетки ER 2267. В результате было получено 8 клонов, каждый из которых содержал плазмиду, названную pMBspACl, со встроенным фрагментом ДНК Bacillus psychrodurans АС длиной около 4 т.п.н. Все они несли плазмиды, устойчивые к действию R.BspACI, а значит, содержащие ген как минимум одной функционально активной МТазы данной РМ системы.

Рекомбииантная плазмида pMBspACl была использована для определения нуклеотидной последовательности встроенного фрагмента. После расшифровки последовательности нуклеотидов и выведенной аминокислотной последовательности вставки было выявлено две одинакого направленные открытые рамки трансляции (ОРТ), достаточно протяженные для того, чтобы кодировать гены РМ системы (ОРТ 1, район 3139-4101, и ОРТ 2, район 1771-3138). Соответствующие нуклеотидиые и аминокислотные последовательности депонированы в базе данных GenBank (ID1404365, ID1404395). Анализ аминокислотных последовательностей потенциальных белковых продуктов этих двух ОРТ показал их принадлежность к классу mSC-метилтрансфераз (рис. 5).

¡И-йрвек-РЕ! [га геЕи-рэ

КЕ КЩЕ-Ы Е| ррЫНЫЬН

р> ррыниЫ СМ VI

----М1Е1КЗК0®ТСЬЙРХ0

------------утн-3р|в

------------МКЫРКРЙ

ЮУЗЕУРУОЕЖУСКЬКХУЗ ЬРЗЗЬРОМККТСБКЗУКУУЗ ЙРРОТРРУРШ! с

РРРЕ1АРЕЕЫИ >47 В

_ СИ IV

¿КБЕЕ1 С ОЖйШКгР

ЮАКОУ N : :Я; хивдп о ршибвВЯод КЕКОХ О ЕхЯусЯЗЯм ХОЕКО! О Р1ИуДЯпА

[рКЬйвЕЗ--СЙЁСЙ ГКХДЬЕК—мсстсы frxm.ee--ыееос« ЕЕАаЬЕЕЗЫУБЙКХ'Л ¡РЕМЬКУЗЗЬЗЗНУИ

Ьюлгаот-шк

}ГРЬЕРН0Т-ЕКУКЗу1 СМ V

¡КККЛЗ ¡А2ХУ£ !. . кшга

I- ■ -

¡КАРП КАРЫ

КУУР]

нШ| КАРЫ

СИ УИ„„

зрнакушахоу

ГРЕЯКХМНАКВ! ЕРЕИКЬМЫАКУУ

гуитигизвА

ГУВРЙИНЗЫЕА ГУУУМРААКОР ЕУНТАЬРКАКОР

ЕУУОТМН] отаэКИЕ! отгитаэ!

ЮТ1ИШ НУХЬКГШ БИЮТЬЕ! КТЮТЬЕ!

|и1ога—N—одадоддосртм---------

¡СВЗХЫЬГОЬ'ЗУУЗТЗМЫЗЕГЕРЕКЕЕ-----------

рЯЗУ—ЕАЗОРЗКХОХ шапка»-----------

Х'УСХКаРРТЕКРЕЕ'ЖЕЗККХЗСЬККЕЬНЕЬЕРНЙР

дюн»—к-мягююгаиЩгЦк-----------

[Т-Убго—Е-КЗХЗЫУБОЕОМРТРЬО-----------

М.НЪаХ М.АсП-С М1.ВзрАС1 М2. ВзрАСХ М. АсИ-Н М.5зсХ1 М.вогП

М.НЬаХ М.АсП-С М1.ВярАСХ М2.ВэрАСХ М.АсШ) М.Ззо11 МХ.ЭсгРХ

¡1! (1) (X) {X; (1) • (1) ' (1)

(1) (X) (X) (71) (7) (57) (64)

МЗГЗУТРЬККТМКМКЮСЗКТЕЬКЕЕУ61ТТТТЬЗКЬЗКНЕУУРМС110КЬСЗЗЪ0СЕ13аУ1ТН130га)

----------------------------------------------------------------мтхкж;

--------------МТОШААТХКЕКРЕРЬНМТОКЕРАОАЬСЬЗКУООЕТ11ЖИЕКСЕТКРТеАЕ1,КАУ1

-------МТТ15КЫТ5ТЕ131М1КЕК^ЕЬКМТдКЕШОАтеМ3ККССКТ1ТОИЕНСЕТСр50ЬЕ13д1ъ

(64) (56) (56)

М.НЬаХ М.АсП-С ИХ . ВэрАСХ М2.ВгрАС1(1411 М.АсИ-Ы (77) М.ЗэоИ (125) М1.3огЕ1(132)

М.ШчаХ (134 М.АсИ-С(Х26) МХ.ВгрАСХ(12 6) М2.ВгрАСХ(211) М. АоИ-Н (147 М.ЗзоИ (195 МХ.ЭсгРХ(202)

И.НЬаХ(190) М.АсИ-С(Х85) МХ.ВгрАСХ(183) И2.ВзрАСХ(28)) М.АсИ-М(217) М.ЗзсХХ(251) М1.3сгРХ(258)

М.НЬаХ(239) М.Асх1-С(239) М1.ВэрАСХ(237) М2. ВзрАСХ(350) Н.АсИ-Ы (287) М.ЗзоП (302) М1.ЗСГР1(309)

М.Щ>а1 (304) М.АсП-С (302) М1. ВзрАСХ(300) М2.ВэрАС1(4X9) М.Ас11-М(356) М.ЭзсН ¡359) М1.3СГР1(366)

------------1РЖШЛЬРЭЗЁУЕНЬУ1ВККЕ>1,УМТЖ2Е110ТТ-------РГХУКЬоХУЙКССЦ—!3

----------ЬТТРГЭЗР3;ЕТТР1РТ^ЕЯ5Е1Д2КШ!5ДР1ЕЕГКК------Э РКУЫРЫНХЛ1АШЗ ГКРЗ

----------ЬЕ1РХЬЗУ1ЁИ<1УЗОПУОмак1АКЕ«МЕЬН1нМрУЗ------308рГ!ЭЕ0НЁ11А|Н1М,3

НРРЗВ1.УРОСУК^1Е0У1ЕОЭУВ!КУРРККЕ1УТОР1.,СЫТ31СРУ-ЕРООК1УШ,РПУРЙЕУ1|^ЕЕО МРРЫЫУ«РУНЕЗа1ХЗОХЙ01УбкКУУР?13ЕКМККРЬЗТХК1ОЕ«ШРУЗК1У)Л'ЬЗЬРКЕТн|0КЕР0

----------тктятсэгьЕкзувмкутъзсАьшсндквкютАА------ДОЙЗРС;УЗ§ет^Е|ЗР—

----------1Ж1в»выпл5тмси1»жыихшошс«рпж-------ЫСКСРСУТЬРЫОБЗЕ---

СМ IX СМ X

ЕК1УЗТКС1АХ1Ь: КУвЕззтахзрск ¡кудаЗЗШШРСХ," ккутеькоьзрту!. Ьеуузуыохзртх

—:----утих

--------УУЫТЙ

КМ5Т5СШУР\1У0ЕЗ--[

¡ЗОБ-ткхгуккоокькх/

¡ЕБ Й -ТК ХХУМК0-ЗЕХ.А1| «УКЯСЗИЫЕОКбЗК! (УУКО&ЕХЬХЕОКМКН!

^уикваянки--

УЕЩ,1К£АК1-----

ЗНЫЬУКУЬРЕ-----

шнйкуреоукут-

»ШШЗЕУЁЗОЬЕЕКК

№кивт%03-----

АЕКШ,ЕУЪЕКЗКК--

|£нд

^ЫЕКдсьКХИ

|рТРлв«,Е?У0

¡ИРРЯАЗВЬС |хтгаЩ?.лкьо

АШ-©С РЬЗ уку НРЗ-----т

РРОЗУКСКЕЫ-----У,

рретук£ем-----у

. : ■ !. -гмузВ рокеетотёкнас I ее:

РбвОРХГРУЗ-----#

РРЕЫРХХРУЗ-----О'

Рис. 5. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей ш5С-МТаз из различных РМ систем, имеющих наибольшую гомологию с М1.В$рАС1 и М2В$рАС1. Десять консервативных мотивов (СМ) отмечены горизонтальными линиями.

Обе М'Газы ВзрАО имеют все десять консервативных мотивов, характерных для т5С-МТаз. Наиболее высокую гомологию с МТазами ВярЛС! по аминокислотной последовательности проявила, как и ожидалось, МТаза Ас11

(http://rebase.neb.com/rebase/index.btmS), узнающая сходную последовательность - 5'-CCGC-3' и представляющая собой тандемный белок (рис. 5). N-концевая его часть гомологична M2.BspACI, в то время как С-концевая - Ml .BspACI.

Необходимо отметить наличие у M2.BspACI N-концевого участка, предшествующего СМ 1, имеющего сходство с Хге-регуляторами транскрипции HTF1-суперсемейства белков. Наивысшую гомологию, N-концевой участок имеет с регуляторными белками бактерий видов Bacillus coagulons Desulfitobacterium hafniense Lachnospiraceae bacterium Laclococcus lactis (рис. 6), контрольными белками из РМ систем CcelP и Liai, а также N-концевому участку предполагаемой МТазы M.RtoL20RF14860P.

M. Rtob20Rni 8 &OP_RC® M2.BspACI_RD Ж Xre-TR В. coagula.is®

■ :et

Xre-TR L. bactérie®

si m i шшж

Xre-TR_D. hafniensë e-TR_L. bacteriuüj Xre-TR L. lacti \

J1 .111 i:

LEKNGND ijssvai sfluiiov

pIplagk EfKKEEC IEEKKK-

Рис. 6. Выравнивание N-концевых доменов М'Газ, С-белков РМ систем и Хге-регуляторов транскрипции, имеющих наибольшее сходство с N-концевым регуляторным участком M2.BspACI. TR -транскрипционный фактор, RD - регуляториый домен.

4. Получение рекомбинантных ДНК-метилтрансфераз BspACI

Плазмида pMBspACl была использована для дальнейшего субклонироваиия МТаз BspACI в составе экспрессирующих векторов.

С помощью ГИДР был амплифицирован участок ДНК В. psychrodwans АС, содержащий ОРТ 1 для последующего клонирования в составе экспрессируюшего вектора pJW2 по сайтам FauNDI и Bamlil. После трансформации лигазной смесыо штамма E.coll RRI и отбора выросших при 30°С клонов была получена рекомбинантная плазмида рМ1 BspACI, несущая функционально активный ген bspAClMl. Ml.BspACI выделяли из экстракта клеток £. coli, несущих рекомбинантную плазмиду рМ1 BspACI с геном bspACMl, путем колоночной хроматографии. Из 4.5 г сырой биомассы получено 4,5 мл гомогенного препарата фермента с концентрацией 0,35 мкг/мкл (рис. 7).

В результате амплификации хромосомной ДНК В. psychrodwans АС с парой праймеров М2АСир и M2AClow был амплифицирован участок ДНК В. psychrodwans АС, содержащий ОРТ 2. Данный фрагмент подвергли лигазной сшивке с экспрессирующим вектором pJW2 по сайтам рестрикции Sali и Bglll. После трансформации лигазной смесью штамма E.coli ER2267 и отбора выросших при 30°С клонов, была получена рекомбинантная плазмида, названная pM2BspACl. После проведения термоиндукции на электрофореграмме лизатов клеткок, несуших полученную рекомбинантную плазмиду, наблюдалось появление белковых полос на уровне около 50 кДа (рис. 8), что соответствует теоретически

предсказанной молекулярной массе М2.ВзрАС1. Плазмида рМгВэрАСЛ после проведения термоиндукции приобретала устойчивость к действию К.В5рАС1 (рис. 9).

1164)

45,0-

23,0-

-6СЛ

Рис. 7. Электрофореграмма высокоочищениого препарата фермента МЬВврАО. Дорожки: I -маркеры молекулярных масс (цифры слева указывают их молекулярные массы, кДа), 2 — 20 мкл препарата МI .ВэрАС!.

Рис. 8. Электрофореграмма термоиндукции синтеза рекомбинаитного фермента М2.ВзрАС1. Дорожки 1 - лизат клеток Е.соП ЕЯ2267, несущих шшзмиду рМ2В$рАС[ без проведения термоиндукции; 2 - то же после проведения термоиндукции, М - маркер молекулярной массы.

ШШШШ&ШМ'й

1 2 М

Рис. 9. Электрофореграмма плазмиды рМ2ВврАС1, обработанной Я.ВзрАС1. Дорожки 1 - без проведения термоиндукции, дорожка 2 - после проведения термоиндукции, М-ДНК-маркер 1 кЬ

M2.BspACI выделяли из экстракта клеток Е. coli, несущих рекомбинантную плазмиду pM2BspACI, путем колоночной хроматографии. Было получено 1,4 мл гомогенного препарата фермента с концентрацией 0,0125 мкг/мкл.

5. Определение оптимальных условий работы ДНК-метилтраисфераз BspACl

На рис. 10 и 11 приведены кривые зависимости активности Ml.BspACl и M2.BspACl, соответственно, от температуры, значения pH и концентрации солей NaCl и KCl в реакционной среде.

0 30 60 90 120 150 Концентрация солей. мМ

Рис. 10. Зависимость скорости метилирования ДНК фага X ферментом МЛ.ВярАС! (концентрации: фермента -50 нМ, ДНК фага л. в пересчете на сайты 5'-ССОС-3'- 1 мкМ, [3Н]5АМ -10 мкМ) от температуры (а), уровня рН

(б) и концентрации солей №С1 и КС1

(в).

Видно, что максимальная активность М1.ВзрАС1 проявляется при 30°С, что соответствует оптимальным температурам роста штамма-продуцента и гидролиза ДНК ЭР ВзрАС!, в то время как М2.ВхрАС1 - при 37°С. Значение рН, соответствующее наибольшей активности ферментов, равно 8, что соответствует обычному рН-оптимуму для ДНК-метилгрансфераз. Что касается зависимости активности фермента от концентрации солей

КаС1 и КС1 в реакционной среде, максимальная активность МТаз ВэрАС! проявляется при полном их отсутствии.

30 40 50 60 Температура, °С

7,0 7.5 8,0 8,5 9,0

рн

Рис. 11. Зависимость скорости метилирования ДНК фага X ферментом М2.В5рАС1 (концентрации: фермента - 50 нМ, ДНК фага X в пересчете на сайты 5'-ССОС-3'- 1 мкМ, [/Н^АМ - 10 мкМ) от температуры (а), уровня рН (б) и концентрации солей ЫаС1 (кривая 1) и КС1 (кривая 2) (в).

0 30 60 90 120 150 Концентрация солей, мМ

6. Определение оснований, метилируемых ДНК-метилтрансферазами BspACI

В качестве субстрата для определения метилируемого основания в сайте узнавания МТаз BspACI использовали олигонуклеотидный дуплекс MAC (рис. 12). Дуплекс метилировали MI.BspACI (M2.BspACI) с использованием меченого тритием SAM, затем делили на две равные части и расщепляли рестриктазами Fokl и A!wl, продукты расщепления разделяли в полиакриламидпом геле, элюировали из геля и подсчитывали количество включенной метки.

После расщепления Немеченого дуплекса отдельно ЭР Fokl и AcIWI было получено по восемь одноцепочечных фрагментов ДНК для каждой из МТаз BspACI. Результаты определения количества радиоактивной метки в каждом фрагменте приведены в табл. 1. Видно, что в случае Ml.BspACI метка включается преимущественно во фрагменты длиной 21 и 20 нуклеотидов, что соответствует метилированию первого цитозина в последовательности 5'-CCGC-3'. В случае же М2. BspACI метка включается преимущественно во фрагменты длиной 28 и 30 нуклеотидов. Такая картина может наблюдаться только в том случае, если M2.BspACI модифицирует цитозин нижней цепи с образованием 5'-G(m5C)GG-3'.

Gp AT С AlACCGC AACGT AC G 3' QCTAGTJTGGCGTTGC5'

! t

Рис. 12. Структура синтетического олигонуклеотидного дуплекса MAC, используемого при определении метилируемого нуклеотидного остатка. Жирным шрифтом выделен сайт узнавания МТаз BspACI, в сплошной рамке сайт узнавания R.Fokl, в пунктирной - R.Ahvl, места расщепления ДНК указанными ферментами обозначены соответственно сплошными и пунктирными стрелками.

Табл. I.

Включение тритиевой метки в рестрикциоиные фрагменты, полученные после расщепления олигонуклеотидного дуплекса Fokl и AcIWI

GG.

5'GCATAA 3' TCGTATCGTATTq

ATGT ЮТАСД

ЭР, используемыс аля гидролиза Рестрикциоиные фрагменты* Длина, н Число импульсов в минуту, ерш

Ml.BspACI M2.BspACl

AcIWI Верхняя цепь

5'-GCATAAGGATGTGGATCAACC-3' 21 1184,5 241

5'-GCAACGTACG-3' 10 75,0 124

Нижняя цепь

S'-CGGITGATCCACATCCTTA ТОСТА TCGT-3' 28 90,0 1427

5'-CGTTG-3' 5 55,5 66

Fokl Верхняя цепь

5'-GCATAAGGATGTGGATCAAC-3' 20 784,0 200

5 '-CGCAACG TACG-3' И 157,0 138

Нижняя цепь

5 '-TGCGGITGATCCACATCCTr ATGCTATCGT-3' 30 223,0 820

5'-CGT-3' 3 143,0 98

*сайт узнавания МТаз BspACI выделен жирным шрифтом

Учитывая тот факт, что среди МТаз встречаются ферменты с вырожденным сайтом узнавания, было решено проверить наличие неканонического метилирования у МТаз Г^рЛС1. На рис. 13 представлены результаты таких экспериментов, из которого видно, что ферменты полностью метилируют ДНК фага 1ис течением времени нет тенденции к метилированию других сайтов, кроме 5'-ССОС-3\

а б

Время, мин Время, мин

Рис. 13. Уровень метилирования ДНК фага к в зависимости от времени инкубации с Ml.l3spACl (а) и M2.BspACI (б) (концентрация сайтов S'-CCGC-З' фага А -100 нМ, ферментов М1 .BspACI (M2.BspACI) -100 iiM и ['HJSAM - 10 мкМ).

7. Определение каталитических параметров реакции метилирования ДНК МТазами BspACI и их сравнительный анализ

В соответствие с условиями определения кинетических констант согласно уравнению Михаэлиса-Ментен измерение зависимости скорости метилирования от концентрации одного из субстратов проводили при насыщении по другому субстрату. На рис. 14 изображена зависимость скорости метилирования МТазой Ml.BspACI от концентрации ДНК фага А. (а) и SAM (б). Значение констант Михаэлиса, вычисленное регрессионным анализом, составило 0,053 ± 0,007 мкМ для ДНК и 5,1 ± 0,3 мкМ для SAM. Значение каталитической константы составило 0,095 ± 0,002 мин'1. Для M2.BspACl соответствующие параметры оказались равны 0,35 ± 0,09 мкМ (Кт днк), 0,5 ± 0,03 мин"' (А:са), 3,98 ± 0,64 мкМ (Кт SAM) (рис. 15).

С учетом полученных данных был проведен сравнительный анализ известных на сегодняшний день каталитических параметров бактериальных МТаз. В табл. 2 приведены значения каталитических параметров для различных бактериальных МТаз, измеренных на протяженных молекулах ДНК.

Рис. 14. Зависимость скорости метилирования ДНК фага X ферментом MI.BspACl (время реакции 30 мин, концентрация фермента - 5 нМ): а - от концентрации ДНК (концентрация [JH]SAM - 40 мкМ), б -от концентрации SAM (концентрация ДНК фага X в пересчете на сайты 5'-ССОС-3' - 2,15 мкМ).

[ДНК >.], мкМ [SAMJ, мкМ

Рис. 15. Зависимость скорости метилирования ДНК фата X ферментом М2.ВкрЛС1 (время реакции 30 мин. концентрация фермента - 5 нМ): а - от концентрации ДНК (концентрация [3Н]ЯЛМ - 40 мкМ), б -от концентрации БАМ (концентрация ДНК фата X в пересчете на сайты 5'-ССОС-3' - 2,15 мкМ).

Как видно из таблицы, значения каталитических констант для МТаз, узнающих палиндромные последовательности варьируют в пределах от 0,043 до 19,02 мин"1 со средним значением около 6,6 мин"1 в то время как у МТаз с непалиидромными сайгами узнавания лежат в пределах от 0,095 до 2,6 мин'1 со средним значением около 1,2 мин"1.

Табл. 2.

Каталитические параметры реакции метилирования для различных МТаз

Фермент (сайт узнавания) Субстрат мин'1 Кп ЛИК, нМ Кт ХАМ, мкМ

МТазы с палиндромным сайтом узнавания

Т20ат 0(т6А)ТС ДНК фага Т4 (Д'<1ат" 16,2 0,0011 10

Т-Шат С(т6А)ТС ДНК фага Т4 ¡>Гс1ат" 8,4 0,0011 10

ВатН! СОАТ(т4С)С рВ1Ш2 3,36 3.2

ЕсоРаш С(т6А)ТС Со1Е1 19,02 3.6 12,2

1ха1 ОС1>1(т6А)СС ДНК фага X 1.14 170 1,75

рУВ40 0,14 23 1,75

ЕсоШ ОА(т6А)ТСС рВ1*322 8,4 0,35 21

ЕсоКН С(т5С)и'ОС ДНК фага X 2,52 0,22

М5р! (ш5С)ССС ДНК фага X 10,2 1,8 130

Крп! ССТ(т6А)СС риС 18 0,043 90

ЯсоНКЗП УСС(т5С)СЯ плазмида р\УМ2372 3,0 2 58

МТазы с непалиндромным сайтом узнавания

М1 .ВвИ 91 (}С(т6А)ТС ДНК фага л, 1,8 680 2,02

Мг.ВйНо! С(т6А)ТСС ДНК фага X 2,6 720 67

М4.В51Р51 С(ш6А)ГСС ДНК фага л 0,99 1290 94

\1I.IislF5I СО(ш6А)ТО ДНК фага). 0,98 110 1,47

МЗ.Вя11?51 СС(т6Л)Т() ДНК фага X 0,24 110 3.3

\1.FokI СС(т6А)ТС С(т6А)ТСС ДНК фага X 1,2 60

Мг^БЕ! 0(т6А)0ТС ДНК фага Т7 2,2 9,8 5.8

М1.В5рАС1 (ш5С)ССС ДНК фага л. 0,095 53 5,1

МЗ.ВярАС! С(т5С)СС ДНК фага X 0,5 350 3,98

Таким образом, достоверных различий в значениях каталитической константы между МТазами, узнающими симметричные асимметричные сайты не наблюдается, оба подтипа ферментов являются относительно «медленными». При сравнении же констант

Михаэлиса для ДНК можно заметить, что таковые для МТаз IIP подтипа варьируют в пределах от 0,0011 до 170 нМ со средним значением 26,65 нМ, у IIS(A) - 1,2 до 1290 со средним значением 369 нМ, что более, чем на порядок выше среднего значения Кт дш< для МТаз с палиндромным сайтом узнавания. Таким образом, можно сделать вывод об относительно иизкой степени сродства к ДНК-субстрату МТаз IIS и НА подтипа Относительно имеющихся данных, МТазы BspACI имеют самые низкие значения каталитической константы и средние значения констант Михаэлиса для ДНК.

8. Определение полной последовательности опероиа РМ системы BspACI

Полную нуклсотидную последовательность оперона BspACI проводили с помощью шести раундов «прогулки по хромосоме», основанной на селективной супрессии ПЦР. После определения нуклеотидной последовательности шести полученных фрагментов, общая длина известного участка хромосомной ДНК В. psychrodurcms АС составила 7155 п.н. В результате была получена полная последовательность третьей рамки трансляции длиной 2337 п.н., располагающейся дистально от генов МТаз. Анализ аминокислотной последовательности ОРТ 3 показал ее гомологию с несколькими ЭР. На рис. 16 представлено множественное выравнивание ОРТ 3 и двух ЭР, Acil и предполагаемой ЭР А1а511720RF1334P, узнающих последовательность 5'-CCGC-3\ ОРТ 3 разбита на два фрагмента (на рис. 16 обозначены R.BspACI-N и R.BspACl-C), т.к. они оба имеют гомологию с указанными изошизомерами. Ввиду достаточно низкой гомологии эндонуклеаз рестрикции между собой, а также существования нескольких возможных старт-кодоиов в ОРТ 3, для однозначного установления соответствия ОРТ 3 и bspACIR препарат R.BspACl подвергли спектрометрическому анализу. Полученный в результате трипсиновой обработки и последующего MALDI-TOF-аиализа спектр показал набор пептидов, соответствующий набору, рассчитанному по аминокислотной последовательности ОРТ 3. Кроме того, секвенирование одного из пептидов длиной 12 аминокислотных остатков показало полное соответствие с участком 38-49 а.о. ОРТ 3.

Таким образом, была установлена структура всего оперона РМ системы BspACI, включающего три гена, расположенных в одном направлении (рис. 17).

Анализ последовательности начала оперона выявил присутствие предположительного промотора в позиции 1670-1702, расположенного на расстоянии 100 п.н. от старт-кодона гена M2.BspACI:

1670 5' TTGAT1TOTTATAACAAATACGA ITOTIAirrr 3' 1702 Как можно видеть из приведенной последовательности, расстояние между предполагаемыми -10 и -35 боксами (подчеркнуты) равняется 21 п.н., что в сочетании с достаточно высоким отклонением от консенсусной последовательности самих боксов (4 замены) говорит о слабости данного промотора. Но, учитывая, что M2.BspACI содержит указанную выше N-концевую область, гомологичную Хге-регуляторам транскрипции, можно

предполагать, что старт транскрипции в данном случае определяется не этим промотором, а участком узнавания регуляторного домена.

AJ.a5U72.ORFl334Р (!) ---------MKKEIÏT : : |Г Д ~ Лв-Ч л BljTH|KRilgCiCF.DYSTSi

R.Acil ¡1! ----------«KÏKSS^SîAAlimlFDœr/KDWTNÏKwM'fî^NDiiIKI

R.BspACI-N il) ---------------MVAVNSBÎpTStiMI^NRKFKElEiKHbOLfSKKMFPDITtti

R.BspACI-C il) MWSVRLYSH]*KVFSIl«#1№ETlieeoittMENLK#/GDlf^®k

Ala511720RF1334P ¡52) |MTlKAYIA|RaVDPXTNKKIMVBpDftIEIGJlaOFCjliT|ea^rasVDSBsSi

R.Acil (51) I-------ÎJDSKLFArafv'SmîK-LpmvSr )ЕМИПДЫУ&ДШМрТ«гВ1.|.-у

R.BspACI-N (46) IQVRCSQADKSEIIINSRKatIWploBIIIS&,-pr ' J: В EjfJHSaîBPLSTplg

2. BspAci-c (61) T-----------18тсеК1ДктеВэз8Ж:ВюткЖДзШйЯ^Шяг1!Вуп8

Ala 511720RF1334P (112) -------l"f#1TJB'fBr|g|i||tf-1 Г^1Т ГГПГШг

R.Acil (103) ÉNTN---YEV^fqp&iMafla--------ЮЯИШИЮМШ

R.BspACI-N (106) ftrEÉjfc---* I I IfW l»HHlB#»l--------SAPVAfRLKGiEi'TKSFSSlfiE

R2 -BspACI (110) 1|КЕ®1---ТР13{ЩЁЗГ^кИ(®8--------||Г5К|ИМ*1 AD:Î«3|FSTOYl,

Ala511720RF1334P (172) ---JW№|sHlg|§|| "S-B-S. «/„'ЬВЙИЛ. g

R.Acil (152) ELL3FfE®--KVEUKHPMF^S---KHI)S«t!|l^ïrSt»*4STKQIIDÏHXQNQI

R.BspACI-N (155) —Î^^^L^I^IKffiAyTELESi^l^Fre^lVE^^^II^EiVXOIIÏ^SEN

R.BspACI-C (159)

Ala511720RF1334P (22 7) NS|-----ÎFNVi ' S "НИМ® -в' -Е'в' <--- ЭДМвИ

R.Acil ¡207) ($|kG№ f.»» 1 ^J^ffijHrolfejWfo^^

R. BspACI—N (213) EKK-----PÎfjgLÉN ЛсЩнтT№PKKiEAs||»SiK3lifDKH---------

R.BspACI—С (218) ---

Ala511720RF1334P (282) ï s'ii- "Ч^^^КШЗГ^ЙЗТК^^КК—YG||Y|£Ï1KÏÏEGHÏ<1Î3 '"АКЬТУИ

R.Acil (267)

R.BspACI-N (259) ----------------------------------------~-----------™ГГГ*

R.BspAci-c (273) -ecS^MV^VK----DKEWrAFGM^c----РДОИРвФВДпй!

Ala511720RFl334Р (340) СДОыЯИКТК) I ' *■»" ■ 38Г.". l.|

R.Acil (327) BfgD^ÎRao- " E -i :,SBM!fcvGi:Ma£VG " . <

R.BspACI-N (259) -------------------------------------------—________________

R.BspACI-C (324) ^SOMbISVNETaDENlfYE|^vfN|E|p;EfeHeFÎ-(^V|I^Q^SS£yi^r

R.Acil (384) ïmSffiKCItlEPSIKKlIAG-iLLÏsœrDHÏÎÎMLEÏtanQIbBLILÏKÏTBRFlVDK

R.BspACI-N (259) ------------------------------------------------------------

R.BspACI-C (383) SKtflHNMP---|tFlFl|EfVKpEEllBEÎ^SilVûLRi:ï:SH|LGIPllED

Ala511720RF1334P (460) liftillïESLKlLffiSTKSLXXKTIBSMFnKOabFTSKWFDOWrMFIÏMaesfrtJÈ

R.Acil (443) IlÉ-^Kt^l^ilstMcjRTRT^KeEn » _ ■ ". «ÏKigNi

R.BspACI-N ¡259) -------------------------------------------------- -------- -----

R.BspACI-C (440) KpMÏSQMimi-----Ь£1Ш *0Ю1ЛНК|

Ala511720RF1334P (520) YYP—Pl-7 •

R.Acil ¡503) v|s—E| . ... - . ■ ■

R.BspACI-N ¡259) ---------------------------

R.BspACI-C (495) QMKNIQE ~ ' " <

Рис. 16, Множественное выравнивание двух фрагментов ОРТ 3 (R.BspACI-N и R.BspACI-C) и изошизомеров.

Поскольку Хге-регуляторы транскрипции, обнаруженные в РМ системах, взаимодействуют с ДНК в форме димеров, их сайты узнавания часто представляют собой инвертированные последовательности. Перед геном ЬзрАС1М2 на расстоянии 33 п.н. от его

старт-кодона также обнаружена такая последовательность, содержащая длинным инвертированный повтор (подчеркнут):

1747 5' TTAATTATCCACAAACGTGGATAATTAA 3' 1774.

На сегодняшний день известно несколько РМ систем, для М'Газ которых была экспериментально показана их роль в качестве регуляторов транскрипции: EcoRIl, Mspl, Ssoll, ScrFI и LlaJl. И для всех них было продемонстрировано, что МТаза, благодаря своему N-коицево.му ДНК-связывшошему домену, выступает в роли репрессора транскрипции собственного гена. Все известные на сегодняшний день МТазы-регуляторы транскрипции относятся к гп5С-МТазам. Нами были проверены все известные на сегодняшний день ш5С-МТазы с непалиндромными сайтами узнавания, последовательности которых представлены в базе данных REBASE и M2.BspACl - оказалась единственной МТазой, для которой показано наличие предположительного регуляторного домена. МТаза Acil лишена регуляториого домена, и роль регулятора транскрипции в этой РМ системе, по-видимому, выполняет предположительный контрольный белок из РМ системы Acil, гомологичный С-белкам систем PvulT и Bcnl.

bspA CIM2 (1804-3138)

Резол ва за

Регуляторный домен

Рис. 17. Схема строения участка хромосомной ДНК В. рцусЬ-осЫгат АС, включающего оперон РМ системы ВэрАО.

Таким образом, представляется достаточно очевидным, что регуляция генной активности в опероне системы РМ ВзрАСI осуществляется с помощью К-коннового домена мг.ВэрАС!. Интересно отметить, что между генами ЬярАСШ! и ЬхрАСШ также располагается предположительный слабый промоторный участок в позиции 4137-4166: 4137 5' ТТСТ1ТТСТСАА'ГГА'ГТОТТ'АСААТАААТТ 3' 4166. Ему предшествует участок, содержащий палиндромный повтор: 4105 5' ОААТ ГСАО ГС'ГС'ГО ГГ ! ААСАОАООС ГСТПТТТ 3' 4138. Эта структура вместе с Т-богатой областью, прилегающей к ней, напоминает гНо-независимый терминатор транскрипции. Таким образом, можно предполагать, что ген ЭР транскрибируется независимо от двух метилаз. Возможно также, что описываемая шпилечная структура служит для регуляции активности гена ЭР путем его аттешоации.

После гена ЭР Ао-независимый терминатор не обнаружен. Возможно, терминация на этом участке осуществляется при участии гЬо-фактора.

bspACMl (3139-4101)

pspACIR (4196-6535)

выводы

1. Выделена новая эндонуклеаза рестрикции II типа BspACI из Bacillus psychrodurans АС. BspACI узнает последовательность ДНК 5'-CJ.CGC-373'-GGCJ.G-5'.

2. Показано, что гидролиз ДНК эндонуклеазой рестрикции BspACI полностью блокируется при метилировании сайта узнавания по цитозину нижней цепи ДНК и первому цитозину верхней; частично блокируется при метилировании второго цитозина; в то время как при модификации третьего цигозина фермент расщепляет только нижнюю цепь.

3. Из геномной библиотеки Bacillus psychrodurans ЛС выделена рекомбинантная плазмида pMBspACI. содержащая гены двух ДНК-метилтрапсфераз. Гены bspAClMl и bspACIW субклоннрованы в составе экспрессирующих векторов.

4. Выделены гомогенные препараты рекомбинантных ДНК-метилтрансфераз BspACI и определены оптимальные условия функционирования ферментов: температура 30°С (Ml.BspACI), 37°С (М2.BspACI); pH 8,0; отсутствие солей NaC! и KCl в реакционной среде. Установлено, что MI.BspACI и M2.BspACI модифицируют ДНК с образованием 5'-(m5C)CGC-3' и 5'-C.(m5C)GG-3', еоответствеиио.

5. Проведено сравнительное изучение кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами РМ системы BspACI. Константы Михаэлиса для ДНК фага X оказались равными 0,053 ± 0,007 и 0,35 ± 0,09 мкМ, катапитические константы - 0,095 ± 0,002 мин' и 0,5 ± 0,03 мин"1 для Ml.BspACI и M2.BspACI, соответственно.

6. Методом прогулки по хромосоме определена полная последовательность ОРТ 3, расположенной после генов ДНК-метилтрансфераз. Масс-спектрадьный анализ гомогенного препарата пативной элдонуклеазы рестрикции BspACI показал ее идентичность аминокислотной последовательности ОРТ 3.

7. Определена организация всего оперона системы рестрикции-модификации BspACI, включающего три гена, расположенных однонаправлено в порядке: bspAClM2-bspA CIMl-bspA CIR.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Тарасова М.В.. Кузнецов В.В., Нетесова H.A., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. 2011. Вестник Московского государственного университета, биология, № 2, с. 38-40.

2. Тарасова М.В.. Кузнецов В.В., Нетесова H.A., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. 2010. Рекомбинантная ДНК-метилтрансфераза из Bacillus psychrodurans АС получение и изучение свойств.Биохимия,т. 75, № 12, с. 1712- 1719.

3. Тарасова М.В.. Джанобилова З.К., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. 2010. Новая сайт-специфическая эндонуклеаза BspACl из Bacillus psychrodurans АС узнает последовательность 5'-CCGC-373'-GGCG-5\ Вестник биотехнологии и физико-химической биологии, т. 5, с. 16-24.

4. Тарасова М.В. 2009. Получение рекомбинантных белков системы рестрикции-модификации BspACl. Полчуновский альманах, т. 2, № 3, с. 70-72.

ТЕЗИСЫ МАТЕРИАЛОВ КОНФЕРЕНЦИЙ

1. Тарасова М.В., Джанобилова З.К., Томилова Ю.Э. 2009. Ломоносов-2009: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых; сскцчя «Биология», Москва, МГУ имени Ломоносова, биологический факультет: Тезисы доводов, с. 192-193.

2. Тарасова М.В., Джанобилова З.К., Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. 2009. Материалы XL VII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология, Новосибирск, с. 146-147.

3. Тарасова М.В. 2009. Материалы XIV Международной экологической студенческой конференции "Экология России и сопредельных территорий". Новосибирск, с. 189-190.

4. Тарасова М.В., Кузнецов В.В. 2010. Материалы XLVIII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс": Биология, Новосибирск, е. 205.

5. Тарасова М.В., Кузнецов В.В. 2010. Ломоносов-2010: XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых; секция «Биология»; Москва, МГУ имени Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов, с. 65-66.

6. Tarasova М„ Kuznetsov V., Netesova N., Gonehar D„ Degtyarev S. Recombinant DNA-methyltransferases Ml.BspACI and M2.BspACI from Bacillus psychrodurans AC: purification and properties. "Nucleic Acid Enzymes & Enzymes in Human Desease", 2011, Tianjin, China, p. 66-67.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам ООО «СибЭнзайм» к.б.н.

Чернухину В.А. за помощь в экспериментальной работе и цепные замечания, к.б.н.

Абдурашитову М.А. за помощь в компьютерном анализе аминокислотных и нуклеотидных

последовательностей, д.б.н., инженеру Джанобиловой З.К. за помощь в выделении

ферментов, проф. Дегтяреву С. X. за ценные замечания. Заведующему отделом химии и биологии НИЧ ИГУ д.б.н., проф. Загребельному С.Н. за помошь в организационных вопросах и ценные советы. Сотруднице МТЦ СО РАН к.б.н. Дужак Т.Г. за помощь в проведении масс-спектрометрических исследований. Глубокую признательность автор выражает своему научному руководителю сотруднику ООО «СибЭнзайм» к.б.н. Гончару Д.А. за всестороннюю помощь в работе.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭР

МТаза РМ система ОРТ

SD-последователыюсть т5С-МТаза

эндонуклеаза рестрикции, R.

ДНК-метилтрансфераза, М.

система рестрикции-модификации

открытая рамка трансляции

последовательность Шайна-Дальгарно

ДНК[С5-цитозин]- метилтрансфераза

Б-аденозил-Ь-метионин

полимеразная цепная реакция

домен, ответственный за узнавание

специфического сайта (target recognition

domain)

консервативный мотив (conserved motif)

SAM ПЦР TRD

Тарасова Маргарита Владимировна

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биолог ических наук

Подписано в печать 07.09.2011. Заказ № 90. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии Института катализа СО РАН 630090 Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тарасова, Маргарита Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МО ДИФИКАЦИ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

2.1. РАСПРОСТРАНЕНИЕ СИСТЕМ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ В ПРИРОДЕ.

2.2. КЛАССИФИКАЦИЯ РМ СИСТЕМ.

2.2.1. РМ системы I типа.

2.2.2. РМ системы II типа.

2.2.3. Сайт-специфические никазы.

2.2.4. РМ системы III типа.

2.2.5. РМ системы IV типа.

2.3. РОЛЬ ФЕРМЕНТОВ РМ СИСТЕМ В БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ.

2.4. ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ.

2.4.1. Общая характеристика ДНК-метилтрансфераз.

2.4.2. Особенности первичной структуры и классификация ДНК-метилтрансфераз.

2.4.3. Вторичная и третичная структура ДНК-метилтрансфераз.

2.4.4. Метилирование одноцепочечных и неканонических субстратов.

2.4.6. Изменение специфичности ДНК-метилтрансфераз.

2.4.6. Кинетические свойства ДНК-метилтрансфераз.

2.5. ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ.

2.5.1. Общая характеристика эндонуклеаз рестрикции.

2.5.2. Строение эндонуклеаз рестрикции.

2.5.3. Особенности эндонуклеаз рестрикции, узнающих палиндромные последовательности ДНК.

2.5.4. Особенности эндонуклеаз рестрикции, узнающих непалиндромные последовательности ДНК.

2.5.6. Механизм расщепления субстрата эндонуклеазами рестрикции.

- ' 3 2.5.7. Особенности специфичности эндонуклеаз рестрикции.

2.6. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОВ РМ СИСТЕМ.

2.7. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РМ СИСТЕМ.

2.7.1. Регуляция экспрессии генов РМ систем ДНК-метилтрансферазами

2.7.2. Регуляция экспрессии генов РМ систем С-белками.

2.7.3. Другие способы регуляции экспрессии генов РМ систем.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

3.1.1. Реактивы.

3.1.2. Приборы.

3.2. МЕТОДЫ.

3.2.1. Выращивание штамма-продуцента.

3.2.2. Выделение эндонуклеазы рестрикции В$рАС1.

3.2.3. Определения оптимальных условий работы КВярАС!.

3.2.4. Определение специфичности эндонуклеазы рестрикции ВярАа.

3.2.5. Определение чувствительности Я.ВзрАС1 к метилированию сайта узнавания.

3.2.6. Клонирование генов ДНК-метилтрансфераз РМ системы ВярАа.

3.2.7. Клонирование и экспрессия гена ЬярАаМ!.

3.2.8. Выделение рекомбинантной М1 .ВярАС1.

3.2.9. Определение концентрации белков.

3.2.10. Определение оптимальных для работы ДНК-метилтрансфераз температуры, рН и концентрации солей МяС/ и КС1.

3.2.11. Определение метилируемого основания в сайте узнавания ДНК-мет илтрансфераз ВярА С1.

3.2.12. Определение стационарных кинетических параметров реакции метилирования ДНКметилтрансферазами ВБрАС!.

3.2.13. Клонирование и экспрессия гена ЪБрАС1М2.

3.2.14. Выделение рекомбинантной М2.ВзрАС1.

3.2.15. Определение нуклеотидной последовательности оперона ВярАС!

3.2.16. Другие методы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. ОПИСАНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ BSPACI.

4.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ BSPACI.

4.2.1. Выделение эндонуклеазы рестрикции BspACI и определение оптимальных условий работы фермента.

4.2.2. Определение специфичности эндонуклеазы рестрикции BspACI.

4.2.3. Определение места гидролиза ДНК эндонуклеазой рестрикции BspACI.

4.2.4. Исследование чувствительности эндонуклеазы рестрикции BspACI к т5С-метилированию сайта узнавания.

4.3. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ ДНК-МЕТИЛ ТРАНСФЕР A3 РМ СИСТЕМЫ BSPACI.

4.4. АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ BSPACI.1.

4.5. СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ Ml.BSPACI.

4.5.1. Получениерекомбинантной Ml.BspACL.

4.5.2. Определение оптимальных условий работы Ml.BspACL.

4.5.3. Определение основания, метилируемого Ml.BspACL.

4.5.4. Определение наличия неканонического метилирования.

4.5.5. Определение стационарных кинетических параметров реакции метилирования ДНК.

4.6. СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ M2.BSPACI.

4.6.1. Субклонирование гена bspACM2.

4.6.2. Выделение М2. BspACI и определение оптимальных условий работы фермента.

4.6.3. Определение основания, метилируемого М2.BspACI.

4.6.4. Определение стационарных кинетических параметров реакции метилирования ДНК.

4.7. СРАВНЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ РЕАКЦИИ МЕТИЛИРОВАНИЯ У РАЗЛИЧНЫХ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ.

4.8. ПРЕДПОЛОЖИТЕЛЬНАЯ ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА МТАЗ В8РАС

4.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОПЕРОНА РМ СИСТЕМЫ В8РАС1.

4.10. СТРУКТУРА И ПРЕДПОЛОЖИТЕЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ОПЕРОНА РМ СИСТЕМЫ В8РАС1.;.

4.11. ПРИМЕНЕНИЕ ПЛАЗМИДЫ РМВ8РАС1 ДЛЯ ПОИСКА НОВЫХ МЕТИЛЗАВИСИМЫХ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДНК-ЭНДОНУКЛЕАЗ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Система рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC: структура оперона и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз"

Бактериальные системы рестрикции-модификации (РМ системы) состоят из ферментов двух типов: первые, эндонуклеазы рестрикции, (ЭР) проявляют рестрикционную (гидролитическую) активность, вторые, ДНК-метилтрансферазы (МТазы), — модифицирующую. ЭР узнают определенные короткие последовательности и расщепляют по ним чужеродную ДНК, в то время как МТазы метилируют одно из основаниний такого же сайта, защищая таким образом хозяйскую ДНК от гидролиза собственной ЭР. Большинство РМ систем имеют палиндромный сайт узнавания, т.е. узнаваемая последовательность ДНК имеет вращательную симметрию 2-го порядка. Изучение все большего числа ферментов РМ систем приводит к выводу, что роль данных белков в прокариотических клетках не ограничивается лишь защитной функцией, они играют важную роль в процессах межклеточного взаимодействия и репарации ДНК.

В связи с небольшим молекулярным весом, относительной простотой организации, высокой субстратной специфичностью, а также огромным разнообразием узнаваемых последовательностей, ферменты РМ систем являются привлекательными модельными объектами для изучения ДНК-белковых взаимодействий. С другой стороны, ЭР представляют собой незаменимые инструменты для различных манипуляций с ДНК во всех областях молекулярной биологии. На сегодняшний день границы использования ЭР значительно расширились и далеко выходят за рамки рутинного клонирования. Примеры использования различных ЭР можно найти в детекции полиморфизма ДНК [Chang et al., 2006; Chen et al., 2010], определения профиля CpG-метилирования [Zilberman and Henikoff, 2007; Гончар и др., 2010], анализа генной экспрессии в SAGE (serial analysis of gene expression) [Nielsen, 2008], при подготовке проб для высоко-эффективного секвенирования ДНК (high-throughput DNA sequencing) [Sorber et al., 2008].

Среди существующих РМ систем большой интерес представляют те из них, ферменты которых узнают непалиндромные последовательности ДНК. В этих системах содержится две или более МТаз, каждая из которых модифицирует свою цепь ДНК (встречаются и тандемные белки, состоящие из двух доменов, метилирующих «свою» цепь ДНК), а ЭР функционируют либо как мономеры, либо как гетеродимеры. Структурная организация таких РМ систем по сравнению с РМ системами, узнающими симметричные сайты, является заведомо более сложной. При этом, как строение «несимметричных» РМ систем, так и свойства составляющих их ферментов исследованы явно недостаточно. Вследствие этого актуальным представляется изучение, как структуры, так и свойств отдельных компонентов РМ систем с непалиндромными сайтами узнавания.

Целью данной работы явилось изучение системы рестрикции-модификации II типа BspACI из бактериального штамма Bacillus psychrodurans АС. В задачи настоящего исследования входило:

1. Установление субстратной специфичности и места расщепления ДНК новой ЭР BspACI.

2. Исследование чувствительности ЭР BspACI к ш5С-метилированию сайта узнавания на различных ДНК-субстратах.

3. Получение рекоминантной плазмиды, несущей ген(ы) МТазы(аз) BspACI. Клонирование гена(ов) МТазы(аз) в составе экспрессирующего(их) вектора(ов).

4. Выделение гомогенного(ых) препарата(ов) рекомбинантной(ых) МТазы(аз) BspACI и определение оптимальных условий функционирования фермента(ов).

5. Определение основания(ий), метилируемого МТазой(ами) BspACI.

6. Проведение сравнительного анализа кинетических параметров реакции(й) метилирования, катализируемой(ых) МТазой(азами) BspACI.

7. Определение организации оперона РМ системы BspACI.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тарасова, Маргарита Владимировна

выводы

1. Выделена новая эндонуклеаза рестрикции II типа BspACI из Bacillus psychrodurans АС. BspACI узнает последовательность ДНК 5'-Cj,CGC-373'-GGCjG-5'.

2. Показано, что гидролиз ДНК эндонуклеазой рестрикции BspACI полностью блокируется при метилировании сайта узнавания по цитозину нижней цепи ДНК и первому цитозину верхней; частично блокируется при метилировании второго цитозина; в то время как при модификации третьего цитозина фермент расщепляет только нижнюю цепь.

3. Из геномной библиотеки Bacillus psychrodurans АС выделена рекомбинантная плазмида pMBspACI, содержащая гены двух ДНК-метилтрансфераз. Гены bspACIMl и bspACIM2 субклонированы в составе экспрессирующих векторов.

4. Выделены гомогенные препараты рекомбинантных ДНК-метилтрансфераз BspACI и определены оптимальные условия функционирования ферментов: температура 30°С (Ml.BspACI), 37°С (M2.BspÄCI); pH 8,0; отсутствие солей NaCl и KCl в реакционной среде. Установлено, что Ml .BspACI и M2.BspACI модифицируют ДНК с образованием 5'-(m5C)CGC-3' и 5'-G(m5C)GG-3', соответственно.

5. Проведено сравнительное изучение кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами РМ системы BspACI. Константы Михаэлиса для ДНК фага X оказались равными 0,053 ± 0,007 и 0,35 ± 0,09 мкМ, каталитические константы - 0,095 ± 0,002 мин*1 и 0,5 ± 0,03 мин"1 для M1.BspACI и М2.BspACI, соответственно.

6. Методом прогулки по хромосоме определена полная последовательность ОРТ 3, расположенной после генов ДНК-метилтрансфераз. Масс-спектральный анализ гомогенного препарата нативной эндонуклеазы рестрикции BspACI показал ее идентичность аминокислотной последовательности ОРТ 3.

7. Определена организация всего оперона системы рестрикции-модификации BspACI, включающего три гена, расположенных однонаправлено в порядке: bspA CIM2-bspA CIMl-bspA CIR.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предметом настоящего исследования явилась новая система рестрикции-модификации BspACI из бактериального штамма Bacillus psychrodurans АС. В ходе работы была охарактеризована эндонуклеаза рестрикции, узнающая непалиндромную последовательность ДНК 5'-CCGC-3'. Благодаря асимметричному сайту узнавания образующих ее ферментов, данная РМ система интересна своей относительно усложненной структурой, что распростаняется как на структуру отдельных ферментов и их генов, так и оперона в целом.

Детальное изучение чувствительности эндонуклеазы рестрикции BspACI к наличию гп5С-метилированию сайта узнавания показало уникальный характер ее поведения: в зависимости от С5-метилированных оснований фермент либо блокируется, либо проявляет никазную, либо рестриктазную активности. Данная информация является ценной не только в применении к использованию данной эндонуклеазы рестрикции при работе с т5С-метилированной ДНК, но также в качестве звена в создании общей картины функционирования эндонуклеаз рестрикции, как ДНК-связывающих белков. Кроме того, в данной работе гены двух ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BspACI были клонированы и экспрессированы в клетках E.coli, после чего были изучены биохимические и кинетические свойства рекомбинантных ферментов. С учетом полученных экспериментальных данных, было показано, что константа Михаэлиса для протяженных ДНК у ферментов, узнающих палиндромные и непалиндромные последовательности различаются более чем на порядок, что может отражать различающуюся степень сродства к ДНК-субстрату у ДНК-метилтрансфераз различных подтипов.

Интересными представляются результаты, полученные при анализе нуклеотидной и аминокислотной последовательностей второй ДНК-метилтрансфразы BspACI. Имея на своем N-конце домен, гомологичный Хгерегуляторам транскрипции, данная ДНК-метилтрансфераза, скорее всего, принимает участие в регуляции транскрипции собственного гена. Из всех извесных на сегодняшний день ДНК-метилтрансфераз, узнающих непалидромную последовательность нуклеотидов, М2.В8рАС1 — единственный фермент, обладающий подобным доменом. Различное строение трех регулонов РМ систем, узнающих последовательность 5'-СССС-3' может свидетельствовать о большом промежутке времени, прошедшим с момента расхождения данных сцепленных генов, в течение которого совершились наблюдаемые хромосомные перестройки.

Данная работа проводилась в рамках проекта Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме: «Разработка способов получения высокоэффективных продуцентов метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, способных расщеплять СО-метилированную ДНК человека, для нужд эпигенетической диагностики онкозаболеваний» (гос. контракт на выполнение научно-исследовательских работ № 16.512.11.2167).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тарасова, Маргарита Владимировна, Кольцово

1. Абдурашитов М.А., Беличенко O.A., Шевченко A.B., Дегтярев С.Х. 1996. N.BstSE — сайт-специфическая никаза из Bacillus stearothermophilus SE-589. Молекулярная биология. 30, 1261-1267.

2. Белавин П.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. 1988. Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий. Прикладная биохимия и микробиология, 24, 121-124.

3. Железная Л.А., Качалова Г.С., Артюх Р.И., Юнусова А.К., Перевязова Т.А., Матвиенко Н.И. 2009. Никующие эндонуклеазы. Успехи биологической химии, 49, 107-128.

4. Гончар Д.А., Акишев А.Г., Дегтярев С.Х. 2010. Bis- и GlaI-ПЦР анализ -новый метод исследования метилированных участков ДНК. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии. 6, 5-12.

5. Громова Е.С. и Хорошаев A.B. 2003. Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК. Молекулярная биология, 37, 300-314.

6. Дедков В. С. 2004. Определение содержания G+C в ДНК бактерий при помощи эндонуклеаз рестрикции. Биотехнология. 4, 77-82.

7. Дедков В. С., Дегтярев С. X. 1992. Определение эндонуклеаз рестрикции в колониях микроорганизмов Streptomyces и Nocardia. Прикл. биохимия и микробиология. 28, 309—313

8. Зернов Ю. П. Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. 2005. Использование рестрикционного анализа амплифицированного гена 16S РНК для идентификации микроорганизмов на примере бактериальных продуцентов термолабильной щелочной фосфатазы. Биотехнология. 6, 3-11.

9. Краткий определитель бактерий Берги. Под ред. Дж. Хоулта. М., 1980.

10. Нагорных М.О., Богданова Е.С., Проценко A.C., Захарова М,В„ Солонин A.C., Северинов К.В. 2008. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-моификации второго типа. Генетика, 44, 606-615.

11. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред. Н. С. Егорова. М., 1995.

12. Чернухин В:А., Кузнецов В.В., Гончар Д.А., Каширина Ю.Г., Нетесова H.A., Дегтярев С.Х. 2010. Субстратная специфичность и биохимические свойства ДНК-метилтрансферазы BstF5I-3 из системы рестрикции-модификации BstF5I. Биохимия. 75, 78-87.

13. Чернухин В.А., Seggewiss J., Каширина Ю.Г., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. 2009. Рекомбинантная ДНК-метилтрансфераза M2.BstSEI из никазно-метилазной системы NM.BstSEI: получение и свойства. Молекуляр. биология. 43,10-18.

14. Щелкунов С.Н. 1994. Генетическая инженерия: Учеб. пособие в 2 ч. Ч. 1.

15. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та. 1-304: 23: Янулайтис А. 1989. Ферменты рестрикции модификации и их применение. Итоги науки и техники. Биотехнология. ВИНИТИ. 17, 1-203.

16. Advani S., Mishra P., Dubey S., Thakur S. 2010. Categoric prediction of metal ion mechanisms in the active sites of 17 select type II restriction endonucleases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 177-179.

17. Aelst K., Tóth J., Ramanathan S.P., Schwarz F.W., Seidel R., and Szczelkun M.D. 2010. Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interactionbetween sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat. PNAS. 107, 9123-9128.

18. Anton,B.P., Heiter,D.F., Benner,J.S., Hess,E.J., Greenough,L., Moran,L.S., Slatko,B.E. and Brooks,J.E. 1997. Cloning and characterization of the Bglll restriction-modification system reveals a possible evolutionary footprint. Gene, 187,19-27.

19. Armalyte, E., Bujnicki, J.M., Gledriene, J., Gasiunas, J., Lubys, A. 2005. Mval269I: a monomeric type IIS restriction endonuclease from Micrococcus varians with two EcoRI- and Fokl-like catalytic domains. J Biol Chem., 280, 41584-41594.

20. Bair, C.L., Black L.W. 2007. A Type IV modification dependent restriction nuclease that targets glucosylaled hydroxymethyl cytosine modified DNAs. J Mol Biol., 366, 768-778.

21. Bandaru B., Gopal J., Bhagwat A.S. 1996. Overproduction of DNA cytosine methyltransferases causes methylation and C —> T mutations at non-canonical sites. J. Biol. Chem., 271, 7851-7859.

22. Barbeyron T, Kean K and Forterre P. 1984. DNA adenine methylation of GATC sequences appeared recently in the Escherichia coli lineage. J Bacteriol; 160, 586-590.

23. Beletskaya I.V., Zakharova M.V., Shlyapnikov M.G. et al. 2000. DNA methylation at the CfrBI site is involved in expression control in the CfrBI restriction-modification system. Nucl. Acids Res., 28, 3817-3822.

24. Bellamy,S.R., Milsom,S.E., Scott,D.J., Daniels,L.E., Wilson, G.G. and Halford,S.E. 2005. Cleavage of individual DNA strands by the different subunits of the heterodimeric restriction endonuclease BbvCI. J. Mol. Biol., 348, 641-653.

25. Besnier, C.E. and Kong,H. 2001. Converting Mlyl endonuclease into a nicking enzyme by changing its oligomerization state. EMBO Rep., 2, 782-786.

26. Bhattacharya S.K., Dubey A.K. 1999. Kinetic mechanism of cytosine DNA methyltransferase Mspl. J. Biol. Chem. 274, 14743-14749.

27. Bogdanova, E., Djordjevic, M., Papapanagiotou, I. et al. 2008. Transcription regulation of type II restriction-modification system Ahdl. Nucleic Acids Res. 36, 1429-1442.

28. Bogdanova, E., Zakharova M., Streeter S., Taylor J., Heyduk T., Kneale G, Severinov K. 2009. Transcription regulation of restriction-modification system Espl396I. Nucl. Acids Res. 37, 3354-3366.

29. Brassard, S., Paquet, H. and Roy, P.H. 1995. A transposon-like sequence adjacent to the AccI restriction-modification operon. Gene, 157, 69-72.

30. Bujnicki JM. 2000. Homology modelling of the DNA 5mC methyltransferase M.BssHII. is permutation of functional subdomains common to all subfamilies of DNA methyltransferases? Int. J. Biol. Macromol, 27, 195-204.

31. Bujnicki, J.M. 2002., Sequence permutations in the molecular evolution of DNA methyltransferases. BMC Evol. Biol., 2:3.

32. Bujnicki JM and Radlinska M. 1999. Molecular evolution of DNA-(cytosine-N4) methyltransferases: evidence for their polyphyletic origin. Nucleic Acids Res, 27, 4501-4509.

33. Bujnicki JM, Radlinska M. 2001. Cloning and characterization of M.LmoA118I, a novel DNA:m4C methyltransferase from the Listeria monocytogenes phage All8, a close homolog of M.NgoMXV. Ada Microbiol. Pol,, 50,151-156.

34. Bujnicki,J.M., Radlinska,M. and Rychlewski,L. 2001. Polyphyletic evolution of type II restriction enzymes revisited: two independent sources of second-hand folds revealed. Trends Biochem. Sci. 26, 9—11.

35. Bujnicki,J.M. and Rychlewski,L. 2001. Grouping together highly diverged PD-(D/E)XK nucleases and identification of novel superfamily members using structure-guided alignment of sequence profiles. J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 3, 69-72.

36. Butler D. and Fitzgerald G.F. 2001. Transcriptional analysis and regulation of expression of the ScrFI restriction-modification system of Lactococcus lactis subs, cremoris UC503. J. Bacteriol. 183, 4668-4673.

37. Carvin C.D., Parr R.D., Kladde M.P. 2003. Site-selective in vivo targeting of cytosine-5 DNA methylatuin by zink-finger proteins. Nucl. Acids Res., 31, 64936501.

38. Cerritelli S., Springhorn S.S., Lacks S.A. 1989. DpnA, a methylase for singlestrand DNA in the DpnII restriction system, and its biological function. Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 9223-9227.

39. Chahar« S, Elsawy H, Ragozin S, Jeltsch A. 2010. Changing the DNA recognition specificity- of the EcoDam DNA-(adenine-N6)-methyltransferase by directed evolution. J Mol Biol., 395, 79-88.

40. Chan S., Opitz L., Higgins L., O'loane D., Xu S. 2010. Cofactor requirement of HpyAV restriction endonuclaese. PLoS ONE. 5, e9071.

41. Chan S., Stoddard B.L., Xu S. 2011. Natural and engineered nicking endonucleases from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucl. Acids Res., 39,1-18.

42. Chang,H.W., Yang,C.H., Chang,P.L., Cheng,Y.H. and Chuang,L.Y. 2006. SNP-RFLPing: restriction enzyme mining for SNPs in genomes. BMC Genomics, 7, 30.

43. Chen K., Roberts G.A., Stephanou A.S., Cooper L.P., White J.H., Dryden D.T.F. 2010. Fusion of GFP to the M.EcoKI DNA methyltransferase produces anew probe of Type I DNA restriction and modification enzymes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 398, 254-259.

44. Chen J, Zhang J, Yang H, Fu F, Chen G. 2010. A strategy for development of electrochemical DNA biosensor based on site-specific DNA cleavage of restriction endonuclease. Biosens Bioelectron, 26, 144-8

45. Cheng X. 1995. Structure and function of DNA methyltransferases. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 24, 293-318.

46. Cheng X, Roberts RJ. 2001. AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. Nucl. Acids Res., 29, 3784-3795.

47. Christensen-L.L., Josephsen J. 2004. The methyltransferase from the LlaDII restriction-modification system influences the level of expression of its own gene. J. Bacteriol., 186,'287-295.

48. Cohen H.M., Tawfik D:S., Griffiths A.D. 2002. Promiscuous methylation of non-canonical DNA sites by HaeIII methyltransferase. Nucl. Acids Res., 30, 38803885.

49. Davies, G. P., Martin, L., Sturrock, S. S., Cronshaw, A., Murray,N. E. & Dryden, D. T. 1999. On the structure and operation of type I DNA restriction enzymes. J Mol Biol 290, 565-579.

50. Dempsey,R.M., Carroll,D., Kong,HI, Higgins,L., Keane,C.T. and Coleman,D.C. 2005. Sau42I, a Bcgl-like restriction-modification system encoded by the Staphylococcus aureus quadruple-converting phage Phi42. Microbiol., 151, 1301-1311.

51. Dryden, D. T. F., Murray, N. E. and Rao, D. N. 2001. Nucleosidetriphosphate-dependent restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 29, 3728-3741.

52. Dubey A.K., Roberts R.J. 1992. Sequence specific DNA binding by the Mspl DNA methyltransferase. Nucl. Acids Res. 20, 3167-3173.

53. Edelh och, H. 1967. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry. 6, 1948-1954.

54. Fauman EB, Blumenthal RM, Cheng X. 1999. Structure and evolution of AdoMet-dependent MTases. In S-Adenosylmethionine-dependent methyltransferases: structures and functions, 1-38.

55. Fraser C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., Clayton R.A. et al. 1995. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science, 270, 397-403.

56. Friedrich T., Fatemi M., Gowhar H., Leismann O., Jeltsch A. 2000 Specificity of DNA binding and methylation by the M.Fokl DNA methyltransferase. Biochem. Biophys. Acta. 1480, 145-159.

57. Fuller-Pace, F.V. and Murray, N.E. 1986. Two DNA recognition domains of the specificity polypeptides of a family of type I restriction enzymes. Proc. Natl Acad. Set USA, 83, 9367-9372.

58. Furuta Y., Abe K., Kobayashi I. 2010. Genome comparison and context analysis reveals putative mobile forms of restriction-modification systems and related rearrangements. Nucl. Acids Res., 38, 2428-2443.

59. Galburt E.A., Stoddart B.L. 2002. Catalytic mechanisms of restriction and homing endonucleases. Biochemistry. 41, 13851-13860.

60. Gill, S.C., von Hippel, P.H. 1989. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem. 182, 319-326.

61. Gong W., O'Gara M., Blumenthal R.M., Cheng X. 1997. Structure of Pvull DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment. Nucleic Acids Res. 25, 2702-2715.

62. Gopal J., Yebra M.J., Bhagwat A.S. 1994. DsaV methyltransferase and its isoshizomers contein a conserved segment that is similar to segment in Hhal methyltransferase that is in contact with DNA bases. Nucl. Acids Res. 22, 44824488.

63. Guan,S., Blanchard A., Zhang P., Zhu Z. 2010. Alteration of sequence specificity of the type IIS restriction endonuclease Btsl. PLoS ONE. 5, ell787.

64. Guan,C. and Kumar,S. 2005. A single catalytic domain of the junction-resolving enzyme T7 endonuclease I is a non-specific nicking endonuclease. Nucleic Acids Res., 33, 6225-6234.

65. Heitman J., Model P. 1987. Site-specific methylases induce the SOS DNA repair response in Escherichia coli. J. Bacteriol., 169, 3243-3250.

66. Hennecke F., Kolmar H., Brudl K., Fritz H.J. 1991. The vsr gene product of E. coli K-12 is a strand- and sequence-specific DNA mismatch endonuclease. Nature, 353, 776-778.

67. Herman J.G., Modrich P. 1982. Escherichia coli dam methylase. Physical and catalytic properties of the homogeneous enzyme. J. Biol. Chem., 257, 2605-2612.

68. Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li B.C., Herrmann R. et al. 1996. Complete sequence analysis of the genome- of the bacterium Mycoplasma pneumoniae. Nucleic Acids Res., 24, 4420-4449.

69. Ishikawa,K., Handa,N. and Kobayashi,I. 2009. Cleavage of a model DNA replication fork by a Type I restriction endonuclease. Nucleic Acids Res., 37, 3531-3544.

70. Ives,C.L., Sohail,A. and Brooks,J.E. 1995. The regulatory C proteins from different restriction-modification systems can cross-complement. J. Bacteriol., 177, 6313-6315.

71. Jeltsch A.J. 1999. Circular permutations in the molecular evolution of DNA methyltransferases. Mol Evol., 49, 161-164.

72. Jeltsch A. 2002. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. ChemBioChem, 3, 274 -293.

73. Jeltsch A., Friedrich T., Roth M. 1998. Kinetics of methylation and binding of DNA by the EcoRV adenine-N6 methytransferase. J. Mol. Biol. 275, 747-758.

74. Jeltsch,A., Kroger,M. and Pingoud,A. 1995. Evidence for an evolutionary relationship among type II. restriction endonucleases. Gene, 160, 7-16.

75. Karyagina A.S., Lunin V.G., Levtchenko I.Ya., Labbe D., Brousseau R., Lau P.C., Nikolskaya I.I. 1995. The SsoII and NlaX DNA methyltransferases: overproduction and functional analysis. Gene. 157, 93-96.

76. Karyagina A., Shilov I., Tashlitskii V. et al. 1997. Specific binding of SsoII DNA methyltransferase to its promoter region provides the regulation of SsoII restriction-modification gene expression. Nucl. Acids Res. 25, 2114-2120.

77. Kaszubska W., Webb H.K., Gumport R.I. 1992. Purification and characterization of the M.ifarl DNA methyltransferase from Escherichia coli. Gene. 118, 5-11.

78. Kelleher J. and Raleigh E.A. 1991. A normal activity in Escherichia coli K12 that directs restriction of DNA modified at CG dinucleotides. J. Bacteriol. 173, 5220-5223.

79. Kerr A.L., Jeon Y.J., Svenson Ch. J., Rogers P.L., Neilan B.A. 2011. DNA restriction-modification systems in the ethanologen, Zymomonas mobilis ZM4 Appl Microbiol Biothechnol. 89, 761-769.

80. Klimasauskas S., Kumar S., Roberts RJ. and Cheng X. 1994. Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix. Cell. 76, 357-369.

81. Knowle, D., Lintner, R., Tourna, Y.M., and Blumenthal, R.M. 2005. Nature of promoter activated by C. PvuII, an unusual regulatory protein conserved among restrictionmodification systems. J Bacteriol 187, 488-497.

82. Kobayashi I. 2001. Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. Nucleic Acid Research. 29, 3742-3756.

83. Kong, H., Lin, L.-F., Porter, N., Stickel, S., Byrd, D., Posfai, J. &Roberts, R. J. 2000. Functional analysis of putative restriction-modification system genes in the Helicobacter pylori J99 genome. Nucleic. Acids Res. 28, 3216-3223.

84. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S.M. 1995a. Phage T4 DNA N6-adeninej-methyltransferase. Overexpression, purification, and characterization. J. Biol. Chem. 270, 14389-14393.

85. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. 1995b. Function of Pro-185 in the ProCys of conserved motif IV in the EcoRII cytosine-C5.-DNA methyltransferase. FEBS Lett. 370, 75-77.

86. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. 1997. Comparative studies of the phage T2 and T4 DNA (N6- adenine)methyltransferases: amino acid changes that affect catalytic activity. J. Bacteriol. 179, 3239-3243.

87. Kriukiene, E. 2006. Domain organization and metal ion requirement of the Type IIS restriction endonuclease Mnll. FEBS Lett. 580, 6115-6122.

88. Kulakauskas, S., Lubys, A. & Ehrlich, S. D. 1995. DNA restriction-modification systems mediate plasmid maintenance. J. Bacteriol. 177, 3451-3454.

89. Kumar S, Cheng X, Klimasauskas S, Mi S, Posfai J, Roberts RJ and Wilson GG. 1994. The DNA (cytosine-5) methy transferases. Nucleic Acids Res. 22, 1-10.

90. Lagunavicius, A., Sasnauskas, G., Halford, S.E. and Siksnys, V. 2003. The metal-independent type IIS restriction enzyme Bfil is a dimer that binds two DNA sites but has only one catalytic centre. J. Mol. Biol. 326,1051—1064.

91. Lee K.F., Liaw Y., and Shaw P.C. 1996. Overproduction, purification and characterization of M.EcoHK31I, a bacterial methyltransferase with two polypeptides. Biochem. J., 314, 321-326.

92. Li F., Papworth M., Minczuk M., Rohde C., Zhang Y., Ragozin S., Jeltsch A. 2007. Chimeric DNA methyltransferases target DNA methylation to specific DNA sequences and repress expression of target genes. Nucl. Acids Res., 35, 100-112.

93. Lin, L.F., Posfai, J., Roberts, R.J. and Kong, H.M. 2001. Comparativegenomics of the restriction-modification systems in Helicobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98, 2740-2745.

94. Lindstrom W.M., Flynn J., Reich N.O. 2000. Reconciling structure and function in Hhal DNA cytosine-C-5 methyltransferase. J. Biol. Chem. 275, 49124919.

95. Liu G., Ou H-Y, Wang T., Li L., Tan H., Zhou X., Rajakumar K., Deng Z., He X. 2010. Cleavage of Phosphorothioated DNA and Methylated DNA by the Type IV Restriction Endonuclease ScoMcrA. Plos Genetics, 6,1-13.

96. Lubys A., Menkevictus S., Timinskas A. et al. 1994. Cloning and analysis of transcriptional control for genes encoding the Cfr9I restriction-modification system. Gene, 141, 85-89.

97. Lukacs C.M. and Aggarwal A.K. 2001. Bglll and Muni: what a difference a base makes. Curr. Opin. Struct. Biol. 11,14-18.

98. Madhusoodanan U.K. and Rao D.N. 2010 Diversity of DNA methyltransferases that recognize asymmetric target sequences. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 45,125-145.

99. Madsen A. and Josephsen J. 1998. Cloning and characterization of the lactococcal plasmid-encoded type II restriction/modification system, LlaDII. Appl. Environ. Microbiol 64, 2424-2431.

100. Malone T., Blumenthal R.M., Cheng X. 1995. Structure, guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyl-transferases and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. J. Mol. Biol. 253, 618-632.

101. Marshall, J.J.T., Halford S.E. The type IIB restriction endonucleases. 2010. Biochemical Society Transactions. 38, part 2, 410-416.

102. McClelland, S.E. and Szczelkun, M.D. 2004. The type I and III restriction endonucleases: structural elements in the molecular motors that process DNA. Nucleic Acids Mol. Biol. 14, 111-135.

103. McGeehan J.E., Streeter S.D., Papapanagiotou I., Fox G.C., Kneale G.G. 2005. High-resolution crystal structure of the restriction-modification controller protein C.Ahdl from Aeromonas hydrophila. J. Mol. Biol. 346, 689-701.

104. McNamara A.R., Hurd P.J., Smith A.E.F., Ford K.G. 2002. Characterisation of site-biased DNA methyltransferases: specificity, affinity and subsite relationships. Nucl. Acids Res., 30, 3818-3830.

105. Meisel A., Mackeldanz P., Bickle T.A., Kruger D.H:, Schroeder C. 1995. Type III restriction endonucleases translocate DNA in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis. EMBOJ. 14, 2958-2966.

106. Merkiene E., Vilkaitis G., Klimasauskas S. 1998. A pair of single-strand and double-strand DNA cytosine-N4 methyltransferases from Bacillus centrosporus. Biol. Chem., 379, 569-571.

107. Miyazono,K., Watanabe,M., Kosinski,J., Ishikawa,K., Kamo,M., Sawasaki,T., Nagata,K., Bujnicki,J.M., Endo,Y., Tanokura,M. et al. 2007. Novel protein fold discovered in the PabI family of restriction enzymes. Nucleic Acids Res., 35,19081918.

108. Miner Z., Hattman S. 1988. Molecular cloning, sequencing, and mapping of the bacteriophage T2 dam gene. J. Bacteriol. 170, 5177-5184.

109. Morgan R.D., Bhatia T.K., Lovasco L, Davis T.B. 2008. Mmel: a minimal Type II restriction-modification system that only modifies one DNA strand for host protection. Nucl. Acids Res. 36, 6558-6570.

110. Morgan R.D., Dwinell E.A., Bhatia T.K., Lang E.M., Luyten Y.A. 2009. The Mmel family: type II restriction-modification enzymes that employ single-strand modification for host protection. Nucl. Acids Res. 37, 5208-5221.

111. Morgan RD, Luyten YA. 2009. Rational engineering of type II restriction endonuclease DNA binding and cleavage specificity. Nucl. Acids Res. 37, 52225233.

112. Murray N.E. 2000. Type I restriction systems. Sophisticated molecular machines (a legacy of Bertani and Weigle). Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64. p. 412s

113. Murray, N.E. 2002. Immigration control of DNA in bacteria: self versus non-self. Microbiology 148, 3-20

114. Murray I.A., Stickel S.K., Roberts R.J. 2010. Sequence-specific cleavage of RNA by Type II restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 38, 8257-8268.

115. Mruk I. and Blumenthal R. M. 2008 Real-time kinetics of restriction-modification gene expression after entry into a new host cell Nucleic Acids Res. 36, 2581-93

116. Mruk I. and Blumenthal R. M. 2009. Tuning the relative affinities for activating and repressing operators of a temporally regulated restriction-modification system. Nucleic Acids Research, 37, 983-998.

117. Neidle S., Neidle S. 1994. DNA structure and recognition. IRL Press, New York.

118. Nielsen, K.L. 2008. DeepSAGE: higher sensitivity and multiplexing of samples using a simpler experimental protocol. Methods Mol. Biol., 387, 81-94.

119. Niv, M.Y., Ripoll,D.R., Vila,J .A., Liwo,A., Vanamee,E.S., Aggarwal,A.K., Weinstein,H. and Scheraga,H.A. 2007. Topology of Type II REases revisited; structural classes and the common conserved core. Nucleic Acids Res., 35, 2227— 2237.

120. Nobusato,A., Uchiyama,I., Ohashi,S. and Kobayashi,I. 2000. Insertion with long target duplication: a mechanism for gene mobility suggested from comparison of two related bacterial genomes. Gene, 259, 99-108.

121. O'Driscoll J., Fitzerald G.F., van Sinderen D. 2005. A dichotomous epigenetic mechanism governs expression of the LlaJI restriction/modification system. Mol. Microbiol, 57,1532-1544.

122. O'Sullivan,D.J. and Klaenhammer,T.R. 1998. Control of expression of Liai restriction in Lactococcus lactis. Mol. Microbiol., 27, 1009-1020.

123. Palmer B.R., Marinus M.G. 1994. The dam and dcm strains of Escherichia coli. Gene, 143,1-12.

124. Pingoud A., Jeltsch A. 2001. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29, 3705-3727.

125. Pingoud A., Fuxreiter M., Pingoud V., Wende W. 2005. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cell. Mol. Life Sci. 62, 685-707.

126. Polisson C. and Morgan R. 1990. Acil, a unic restriction endonuclease from Arthrobacter citreus which recognizes 5' CCGC 3'. Nucl. Acid Res. 18, 5911.

127. Radlinska M, Bujnicki JM. 2001. Cloning of enterohemorrhagic Escherichia coli phage VT-2 Dam methyltransferase. Ada Microbiol. Pol., 50, 157-163.

128. Ramalingam R., Prasad R., Shivapriya R., Dharmalingam K. 1992. Molecular cloning and sequencing of mcrA locus and identification of McrA protein in Escherichia coli. J. Biosci. 17, 217-232.

129. Ramanathan S. P., Aelst K., Sears A., Peakman L.J., Diffin F.M., Szczelkun M.D. and Seidel R. 2009:'Type III restriction enzymes communicate in ID without looping between their target sites PNAS. 106, 1748-1753.

130. Rao, D.N., Saha. S., Krishnamurthy, V. 2000. The ATP dependent restriction enzymes. Prog. Nucleic Acid Research Mol. Biol. 64,1-63.

131. Reddy Y.V., Rao D.N. 2000. Binding of £coP15I DNA methyltransferase to DNA reveals a large structural distortion within thie recognition sequence. J. Mol. Biol., 298, 597-610.

132. Reich N.O., Olsen C., Osti F., Murphy J. 1992. In vitro specificity of EcoRl DNA methyltransferase. J. Biol. Chem., 267, 15802-15807.

133. Rimseliene R, Maneliene Z, Lubys A, Janulaitis A. 2003. Engineering of restriction endonucleases: using methylation activity of the bifunctional endonuclease Eco57I to select the mutant with a novel sequence specificity. J Mol Biol. 327, 383-391.

134. Roberts R.J., Belfort M., Bestor T. et al. 2003. A nomenclature for restriction enzymes, DNA-methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 31, 1805-1812.

135. Roberts, R.J. 2005. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 102, 5905-5908.

136. Roberts,R.J., Vincze,T., Posfai,J. and Macelis,D. 2005. REBASE restriction enzymes and DNA methyltransferases. Nucleic Acids Res., 33, D230-D232.

137. Roberts, R.J., Vincze, T., Posfai, J. and Macelis, D. 2007. REBASE: enzymes and genes for DNA restriction and modification. Nucleic Acids Res. 35, D269-D270.

138. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J. Macelis D. 2010. REBASE a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes. Nucl. Acids Res. 38, D234-D236.

139. Ryazanova AY, Kubareva EA, Grman I, Lavrova NV, Ryazanova EM, Oretskaya TS, Hianik T. 2011. The study of the interaction of (cytosine-5)-DNA methyltransferase SsoII with DNA by acoustic method. Analyst. 136, 1227-1233.

140. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. 1989. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

141. Samuelson J.C., Zhu Z., Xu S.Y. 2004. The isolation of strand-specific nicking endonucleases from a randomized Sapl expression library. Nucleic Acids Res., 32, 3661-3671.

142. Sanders, K.L., Catto, L.E., Bellamy, S.R. and Halford, S.E. 2009. Targeting individual subunits of the Fokl restriction endonuclease to specific DNA strands. Nucleic Acids Res., 37, 2105-2115.

143. Saravanan,M., Bujnicki,J.M., Cymerman,I.A., Rao,D.N. and Nagaraja,V. 2004. Type II restriction endonuclease R.Kpnl is a member of the HNH nuclease superfamily. Nucleic Acids Res., 32, 6129-6135.

144. Saravanan, M., Vasu, K., Kanakaraj, R., Rao, D.N. and Nagaraja, V. (2007) R.Kpnl, an HNH superfamily REase, exhibits differential discrimination at noncanonical sequences in the presence of Ca2+ and Mg2+. Nucleic Acids Res. 35, 2777-2786.

145. Sasnauskas,G., Connolly,B.A., Halford,S.E. and Siksnys,V. 2007. Site-specific DNA. transesterification catalyzed by a restriction enzyme. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 104, 2115-2120.

146. Sawaya, M.R., Zhu, Z., Mersha, F. et al. 2005. Crystal structure of the restriction modification system control element C.Bcll and mapping of its binding site. Structure. 13,1837-1847.

147. Sears A., Peakman L.J., Wilson G.G., Szczelkun M.D. 2005. Characterization of the Type III' restriction endonuclease Pstll from Providencia stuartii. Nucleic Acids Res. 33, 4775-4787.

148. Semenova E., Minakhin L., Bogdanova E. et al. 2005. Trancriptional regulation of the EcoRV restriction-modification system. Nucl. Acids Res., 33, 6942-6951. ■

149. Shevchenko A., Tomas H., Havlis J., Olsen J.V., Mann M. 2006. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1, 2856-2860.

150. Shields S.L., Burbank D.E., Grabherr R., Van Etten J.L. 1990. Cloning and sequencing the cytosine methyltransferase gene M.CviJI from Chlorella virus IL-3A. Virology. 176, 16-24.

151. Siebert P.D., Chenchik A., Kellogg D.E., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. 1995. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucl. Acids Res. 23, 1087-1088.

152. Som S. and Friedman S. 1994. Regulation of EcoRII methyltransferase: Effect of mutations on gene expression and in vitro binding to the promoter region. Nucl. Acids Res. 22, 5347-5353.

153. Som S. and Friedman S. 1997. Characterization of the intergenic region which regulates the Mspl restriction-modification system. J. Bacteriol. 179, 964-967.

154. Sorber,K., Chiu,C., Webster,D., Dimon,M., Ruby,J.G., Hekele,A. and DeRisi,J.L. 2008. The long march: a sample preparation technique that enhances contig length and coverage by high-throughput short-read sequencing. PLoS One, 3, e3495.

155. Sorokin V., Severinov K.,Gelfand M.S. 2009. Systematic prediction of control proteins and their DNA binding sites. Nucleic Acids Research, 37, 441-451.

156. Stefan C., Xia Y., Van Etten J.L. 1991. Molecular cloning and characterization of the gene encoding the adenine methyltransferase M.CviRI from Chlorella virus XZ-6E. Nucleic Acids Res. 19, 307-311.

157. Stewart F.J., Panne D., Bickle T.A. and Raleigh E.A. 2000. Methyl-specific DNA binding by McrBC, a modification-dependent restriction enzyme. J. Mol. Biol. 298, 611-622.

158. Stier I., Kiss A. 2010. The type II restriction endonuclease Mval has dual specificity. Nucl. Acids Res. 38, 8231-8238.

159. Sturrock, S.S and Dryden, D.T.F. 1997. A prediction of the amino acids and structures involved in DNA recognition by the type I DNA restriction and modification enzymes. Nucl. Acids Res. 25, 3408-3414.

160. Szczelkun M.D., Connolly B.A. 1995. Sequence-specific binding of DNA by the EcoRV restriction and modification enzymes with nucleic acid and cofactor analogues. Biochemistry, 34,10724-10733.

161. Tao T., Bourne J.C., Blumenthal R.M. 1991. A family of regulatory genes associated with type II restriction- modification systems. J. Bacteriol. 173, 13671375.

162. Taylor J.E., Callow Ph., Swiderska a., Kneale G.G. 2010. Structural and functional analysis of the engineered type I dna methyltransferase EcoR124Int j Mol. Biol. 398, 391-399.

163. Timar E., Groma G., Kiss A., Venetianer P. 2004. Changing the recognition specificity of a DNA-methyltransferase by in vitro evolution. Nucl. Acids Res., 32, 3898-3903.

164. Tock M.R. and Dryden D.T.F. 2005. The biology of restriction and antirestriction. Current Opinion in Microbiology. 8. 466-472.

165. Too, P.H., Zhu,Z., Chan,S.H. and Xu,S.Y. 2010. Engineering Nt.BtsCI and Nb.BlsCI nicking enzymes and applications in generating long overhangs. Nucleic Acids Res., 38, 1294-1303.

166. Van Etten J.L., Xia Y., Burbank D.E. 1989. Viruses infecting a eukaryotic green alga are a new source of DNA methyltransferases and DNA, site-specific endonucleases. J. Cell Biochem. Suppl. 0, 199.

167. Vasu K., Saravanan M., Rajendra B.V., Nagaradja V. 2010. Generation of a manganese specific restriction endonuclease with nicking activity. Biochem. 49, 8425-8433.

168. Vilkaitis G., Dong A., Weinhold E., Cheng X., Klimasauskas S. 2000. Functional roles of the conserved threonine 250 in the target recognition domain of Hhal DNA methyltrasferase. J.Biol. Chem., 275, 38722-38730.

169. Vilkaitis G., Merkiene E., Serva S., Weinhold E., Klimasauskas S. 2001. The mechanism of DNA cytosine-5 methylation. Kinetic and mutational dissectional of Hhal methytransferase. J. Biol. Chem. 276, 20924-20934.

170. Wah, D.A., Bitinaite, J., Schildkraut, I. and Aggarwal, A.K. 1998. Structure of Fokl has implications for DNA cleavage. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 1056410569.

171. Wang, H., McConnell, D. J., and O'Mahony, D. J. 1990. An efficient temperature-inducible vector incorporating the T7 gene 10 translation initiation leader region. Nucl. Acids Res., 18,1070.

172. Wang L., Chen S., Xu T., Taghizadeh K., Wishnok J.S., Zhou X., You D., Deng Z., Dedon P.C. 2007. Phosphorothioation of DNA in bacteria by dud genes. Nat Chem Biol. 3, 709-710.

173. Wilson, G.G. and Murray, N.E. 1991. Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet. 25, 585-627.

174. Wilson G.G. 1991. Organization of restriction-modification systems. Nucl. Acids Res., 19, 2539-2566.

175. Wion D., Casadeus J. 2006. N6-methyl-adenine: an epigenetic signal for DNAprotein interactions. Nat Rev Microbiol., 4, 183-192.

176. Woodbury C.P., Jr., Downey R.L., von Hippel P.H. 1980. DNA site recognition and overmethylation by the EcoRl methylase. J. Biol. Chem., 255, 11526-11533.

177. Wu J.C., Santi D.V. 1987. Kinetic and catalytic mechanism of Hhal methyltransferase. J. Biol. Chem. 262, 4778-4786.

178. Xu Q.S., Kucera R.B., Roberts R.J., Guo H.C. 2004. An asymmetric complex of restriction endonuclease Mspl on its palindromic DNA recognition site. Structure, 12,1741-1747.

179. Xu T., Yao F., Zhou X., Deng Z. and You D. 2010. A novel host-specific restriction system associated with DNA backbone S-modification in Salmonella. Nucl. Acids Res. 38, 7133-7141.

180. Xu,Y., Lunnen,K.D. and Kong,H. 2001. Engineering a nicking endonuclease N.AlwI by domain swapping. Proc. Natl Acad. Sei. USA. 98, 12990-12995.

181. Zhang B., Tao T., Wilson G.G., Blumenthal R.M. 1993. The M.AluI DNA-(cytosine C5)-methyltransferase has an unusually large, partially dispensable^ variable region. Nucl. Acids Res. 21, 905-11.

182. Zhang Y., Nelson M., Nietfeldt J., Xia Y., Burbank D., Ropp S., Van Elten J.L. 1998. Chlorella virus NY-2A encodes at least 12 DNA endonuclease/methyltransferase genes. Virology. 240, 366-375

183. Zheleznaya L.A., Kachalova G.S., Artyukh R.I., Yunusova A.K., Perevyazova T.A., Matvienko. 2009. Nicking Endonucleases. Biochemistry (Moscow). 74, 1457-1466.

184. Zhu Z., Samuelson J.C., Zhou J., Dore A., Xu S-Y. 2004. Engineering strand-specific DNA nicking enzymes from the type IIS restriction endonucleases Bsal, BsmBI, and BsmAI. J. Mol. Biol. 337, 573-583.

185. Zilberman,D. and Henikoff,S. 2007. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns. Development, 134, 3959-3965.

Информация о работе

Тарасова, Маргарита Владимировна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Система рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC: структура оперона и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Система рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC: структура оперона и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы