Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Система рестрикции-модификации Sse91: клонирование, организация генов и сравнительный анализ структуры белков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Система рестрикции-модификации Sse91: клонирование, организация генов и сравнительный анализ структуры белков"

На правах рукописи

Гончар Данила Александрович

СИСТЕМА РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ ввеЭ!:

КЛОНИРОВАНИЕ, ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОВ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ

03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Колыдово - 2007

003160887

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологи и биофизики СО РАМН, Новосибирск

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Дегтярев Сергей Харитонович Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Загребельный Станислав Николаевич доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович

Ведущая организация

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РА Новосибирск

Защита состоится « М» OK^xhfA 2007 г в часов на заседани диссертационного совета Д 208 020 0Í при ФГУН Государственный научный цент вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора Минздравсоцразвити России по адресу ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 63055 тел (383)336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор»

Автореферат разослан » СЛнЛ'ЯЬ^-Я 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Э Г Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Бактериальные системы рестрикции-модификации (системы РМ) являются одним из интереснейших объектов, изучаемых в молекулярной биологии Несмотря на большое число обнаруженных и охарактеризованных систем РМ микроорганизмов и установление их роли в защите бактериальной клетки от вторжения чужеродной ДНК, биологическое значение этих систем не выяснено до конца Система рестрикции-модификации включает в себя как минимум два фермента сайт-специфические эндонуклеазу рестрикции и ДНК-метилтрансферазу, узнающих одну и ту же короткую последовательность ДНК

Одной из фундаментальных проблем современной молекулярной биологии является проблема белок-нуклеинового взаимодействия Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-метилтрансферазы входят в ряд наиболее удобных объектов для иссчедования этой проблемы Это обусловлено целым рядом уникальных свойств данных ферментов, таких как высокая субстратная специфичность, огромное разнообразие узнаваемых последовательностей (более 250), а также небольшой молекулярный вес и относительная простота организации На сегодняшний день значительное количество генов, относящихся к системам РМ, клонировано, выделены рекомбинантные белки и получены кристаллы ферментов Это позволило достигнуть существенного прогресса в понимании той роли, которую играют процессы специфического метилирования и расщепления ДНК в жизнедеятельности клетки В то же время успешное развитие многих направлений молекулярной биологии и генетической инженерии немыслимо без расширения ассортимента эндонуклеаз рестрикции, которые являются одними из ключевых инструментов в этих областях науки

Поэтому особенную актуальность сегодня приобретает решение таких задач, как открытие новых систем рестрикции-модификации, изучение структуры и механизмов регуляции оперонов систем РМ, получение суперпродуцентов ферментов рестрикции-модификации, выявление ключевых аминокислотных последовательностей, отвечающих за связывание с сайтом узнавания на ДНК и катализ, а также поиск доказательств наличия эволюционных связей у различных групп ферментов

Целью данной работы являлось изучение системы рестрикции-модификации II типа ББеМ

Цель и задачи исследования

из бактериального штамма Sporosarcma species 9D В задачи настоящего исследования входило

установление субстратной специфичности и места расщепления ДНК новой эндонукпеазой рестрикции Sse9I,

получение геномной библиотеки штамма Sporosarcma species 9D в Е coli с целью обнаружения плазмиды, несущей ген ДНК-метилгрансферазы Sse9I,

- определение основания, модифицируемого метилтрансферазой Sse9I, клонирование гена sse9IM в экспрессирующий вектор и получение гомогенного препарата рекомбинантной M Sse9I,

- определение нуклеотидной последовательности и порядка расположения генов в опероне системы рестрикции-модификации Sse9I,

сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков системы рестрикции-модификации Sse9I с последовательностями близкородственных полипептидов

- клонирование гена эндонуклеазы рестрикции Sse9I в экспрессирующий вектор и получение препарата рекомбинантного фермента,

Научная новизна и практическая ценность работы

В результате выполнения данной работы найден бактериальный штамм Sporosarcma species 9D, являющийся продуцентом новой эндонуклеазы рестрикции Я типа Sse9I Фермент узнает последовательность ДНК 5'-ААТТ-3' и расщепляет ее перед первым остатком аденина В отличие от термофильного прототипа, Tsp509I, работающего только при 65 °С, рестриктаза Sse9I проявляет максимальную активность при 55 °С и сохраняет 75% активности при 37 °С Способность образовывать в результате реакции фрагменты ДНК с 5'-выступающими концами, комплементарными концам, образованным при гидролизе рестриктазами EcoRI (5'-G|AATTC-3'), Muni (5'-CJ.AATTG-3') и Apol (5'-RjAATTY-3') позволяет широко применять новый фермент в молекулярно-биологических и генно-инженерных экспериментах

Путем клонирования получена рекомбинантная плазмида pSse9/l, несущая ген ДНК-метилтранеферазы Sse9I Впервые определена специфичность метилтрансферазы, узнающей последовательность ДНК 5'-ААТТ-3' Анализ аминокислотной последовательности M Sse9I позволил сделать вывод, что новый фермент относится к классу Di2 ДНК-метилтрансфераз Ген sse9IM клонирован в экспрессирующий вектор, и выделен гомогенный препарат рекомбинантной M Sse9I из Е colt

Установлена нуклеотидная последовательность и порядок расположения всех генов, входящих в оперон системы рестрикции-модификации Sse9I Анализ аминокислотной последовательности С Sse9I показал наличие НТН-мотива, характерного для белков - регуляторов транскрипции Непосредственно перед геном sse91C выявлена последовательность ДНК (С-бокс), перекрывающаяся с областью промотора и гомологичная участкам связывания С-белков ряда систем рестрикции-модификации

Показано, что аминокислотная последовательность R Sse9I проявляет сходство с эндонуклеазами рестрикции Muni (5'-CAATTG-3') и EcoRI (5'-GAATTC-3'), главным образом за счет консервативных мотивов PD/E ВХК и GNAXER, ответственных за катализ и узнавание общей внутренней тетрануклеотидной последовательности ДНК ААТТ Такая гомология может свидетельствовать об эволюционном родстве упомянутых эндонуклеаз рестрикции и подтверждает наличие общего механизма специфичного узнавания у данной группы ферментов На основе сходства ключевых структурных элементов нового фермента с RMunI и R EcoRI предложена модель пространственной структуры эндонуклеазы рестрикции Sse9I Два варианта гена sseÇIR клонированы в экспрессирующий вектор С использованием конструкции, содержащей короткий варианг гена, получен препарат рекомбинантной эндонуклеазы рестрикции Sse9I

Апробация работы

Материалы исследований по теме диссертации представлены на следующих российских и международных конференциях "4th New England Biolabs Workshop on biological DNA modification" (Инсбрук, Австрия, 1997), "2nd International symposium Separations m the Biosciences" (Прага, Чехия, 2001), "III Съезд Биохимического Общества" (Санкт-Петербург, Россия, 2002), "5th New England Biolabs Meeting on restriction/modification" (Бристоль, Великобритания, 2004)

Публикации

По материалам диссертации были опубликованы три печатные работы Структура и объем работы

Диссертация состоит из семи разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы» Работа изложена на 141 станице машинописного текста и включает 24 рисунка, 7 таблиц и список литературы, содержащий 202 ссылки

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Характеризацня эндонуклеазы рестрикции Sse9I

В ходе проведения работ по проекту "Сравнительное изучение экосистем крупнейших древних рифтовых озер мира как основа изучения глобальных и антропогенных изменений окружающей среды и климата на континентах", входящего в международные проекты "Global Changes" и "Байкал-бурение", в нашей лаборатории в течение ряда лет исследовались пробы воды и донных отложений из озера Байкал Из данных проб в результате был выделен бактериальный штамм, определенный как Sporosarcina species 9D, который являлся продуцентом эндонуклеазы рестрикции Sse9I, названной согласно общепринятой номенклатуре (Roberts R J, Beifort М, 2003)

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой новой эндонуклеазой рестрикции, проводили сравнение картин гидролиза ДНК фага X, фага Т7 и ДНК плазмиды pBR 322 ферментом R Sse9I с теоретически предсказанными с помощью программы Vector NTI картинами расщепления данных субстратов известными к настоящему времени рестриктазами (http //www rebase neb com) Результаты сравнительного анализа позволили сделать вывод, что картина гидролиза названных ДНК соответствует набору фрагментов, образующихся при расщеплении этих субстратов эндонуклеазой рестрикции, узнающей последовательность 5'-ААТТ-3' (рис 1)

В результате экспериментов для эндонуклеазы рестрикции Sse9I были выбраны следующие оптимальные условия реакции SE-буфер "В" 10 мМ Трис-HCl, pH 7 6, 10 мМ MgCl2> 1 мМ ДТТ, и температура 55 °С В случае проведения реакции при температуре 37 °С активность фермента проявлялась на уровне 50-75% от максимальной Фермент инактивировапся после прогревания реакционной смеси при 65 °С в течение 20 мин Для подтверждения последовательности узнавания и определения места расщепления ДНК эндонуклеазой рестрикции Sse9I использовали PvuII-BamHI [ct-32P]-dATP -меченый фрагмент ДНК pUC19, длиной 111 п н (с 306 позиции - PvuII до 417 позиции - BamHI) содержащий сайт для R Sse9I (позиция - 397) Фрагмент расщепляли рестриктазами Sse9I, EcoRI (5'-GjAATTC-3') и HaelII (5'-GGJ.CC-3') Продукты гидролиза разделяли электрофорезом в 20%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (7 М мочевина) На радиоавтографе, приведенном на рисунке 2, видно, что подвижность продукта гидролиза ДНК R Sse9I совпадает с подвижностью продукта расщепления этого фрагмента R EcoRI, а также продукта совместного гидролиза Sse9I и EcoRI Следовательно, R Sse9I расщепляет ДНК перед первым остатком аденина симметрично по обеим цепям, образуя при этом 5'- выступающие четырехнуклеотидные концы 5'- |ААТТ -373'- ТТАА| -5'

Рис. 1. Определение специфичное™ чндонуклеачы рестрикции 8зе9], А) Электрофорегическая картина расщепления различных ДНК эвдояуклеаэой рестрикции Зге?] в ]%-ном агароэном геле. Дорожки; 2 - ДНК рВРШЗ + 3 - ДНК

фага Т7 + Я.8ке91; 4 - ДНК фага лямбда + КЛкеУ!; ! и 5 - маркеры: ДНК рВЫ22 + Упе1 и ДНК фага лямбда + Вте181, соответственно. Б) Теоретически рассчитанные картины расщепления тех же ДНК по последовательностям 5'-ААТТ-3' (лор. 2-4). Дорожки 1 и 5 -соответствующие маркеры (рВК322/Упе1 и Шли: 181).

4 5

■

к

_

Гс

/ с

1 Л

т

о

1— : л / Л 1

т [

т ■Л

С'

О ли

МШш-'-К!

Рис.2. Радиоавтограф разделения в 20%-ном ЙПЗ-ПАЛГ продуктов ферментативного гидролиза |а- ГР]-меченого Руц11-ВатН| фрагмента ДНК риСЩ Дорожки: I - гидролиз ; 2 - НсоШ; 3 - 5зе9!+НсЫ<1. 4 - НаеШ: 5 -исходный 1Чи11-ВатН1 фрагмент.

Таким образом, новая эндонуклеаза рестрикции Sse9I является истинным изошизомером рестриктазы Tsp509I, выделяемой из штамма Thermus species 509, но в отличие от термофильного прототипа, работающего только при 65 "С, рестриктаза Sse9I проявляет максимальную активность при 55 °С и сохраняет 75% активности при 37 °С Стоит отметить, что R Sse9I входит в подгруппу EcoRI-подобных ферментов, которая включает рестриктазы, узнающие наиболее близкие по нуклеотидному составу симметричные последовательности ДНК Это такие эндонуклеазы рестрикции как EcoRI и RsrI (5 '-GJ ААТТС-3'), Muni и Mfel (5'-ClAATTG-3'), Apol и Acsl (5'-RlAATTY-3'), а также Sse9I и Tsp509I (5'-|ААТТ-3') Объединяющим признаком ферментов является наличие внутренней "коровой" последовательности ААТТ в сайтах узнавания, а также способность образовывать в результате расщепления ДНК одинаковые 5'-выступающие концы Среди EcoRI-подобных рестриктаз самыми изученными, безусловно, являются EcoRI и Muni, поскольку для них не только определена первичная структура генов и известно строение оперонов, в которые входят эти гены, но также получены кристаллы ферментов и исследованы механизмы узнавания, связывания и катализа Все остальные ферменты из группы практически не изучены В этом контексте исследование эндонуклеазы рестрикции и всей системы рестрикции-модификации Sse9I, узнающей именно эту четырехнуклеотидную последовательность, приобретает особую актуальность

2. Клонирование гена ДНК-метилтрансферазы Sse9I и определение метилируемого основания

На первом этапе клонирования генов системы рестрикции-модификации Sse9I геномную ДНК из штамма Sporosarcma sp 9D гидролизовали эцдонуклеазами рестрикции BamHI (5 '-G1GATCC-3 '), BglII (5'-A|GATCT-3'), Ksp22I (5'-T|GATCA-3') и осуществляли частичную достройку 5'-выступающих концов с помощью фрагмента Кленова с добавлением dGTP и dATP После чего все три гидролизата смешивали и лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы с вектором pUC19, линеаризованным рестриктазой Sali (5'-G|TCGAC-3') и также частично достроенным фрагментом Кленова в присутствии dCTP и dTTP Метод частичной достройки 5'-выступающих концов позволяет избежать самолигирования вектора и фрагментов бактериальной ДНК, что значительно увеличивает выход рекомбинантных молекул

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Ecoli RRI После инкубации на селективной среде с ампициллином было получено около 4000 клонов, из которых выделялась суммарная ппазмидная ДНК содержавшая набор фрагментов ДНК

Sporosaicina sp 9D различной длины в векторе pUC19 (геномная библиотека) Данная "библиотека" обрабатывалась RSse9I и снова трансформировалась в клетки RRI В конечном счёте было получено 19 клонов, каждый из которых содержал плазмиду (pSse9/l-19) со встроенным фрагментом ДНК Sporosarcina sp 9D длиной около 2,5 т п н Причём все плазмиды оказались устойчивыми к действию эндонуклеаз рестрикции Sse9I и EcoRI Мы определили нуклеотидную последовательность встроенного фрагмента плазмиды pSse9/l и выявили одну протяженную открытую рамку трансляции (ОРТ) длиной 1089 пн, соответствующую белку из 362 аминокислотных остатков Поиск гомологичных последовательностей в базе данных GenBank для выявленного белка показал наличие консервативных мотивов, присущих ДНК-метилтрансферазам

Для выяснения специфичности М Sse9I автором была использована плазмида pMTL-MSse2, представляющая собой плазмиду pMTL22, в которую были встроены по сайту SphI две копии Sphl-фрагмента (1400 пн длиной) из исходной pSse9/l (рис 3) Каждый из этих Sphl-фрагментов включал ген sse9IM, причём направление считывания двух копий гена совпадало с направлением рамки считывания гена lacZ Данная плазмидная ДНК была устойчива к действию ЭР Sse9I (рис 4) Полилинкер pMTL22 в районе 217-225 содержит последовательность

Sse9I-XbaI 5'-AATTCTAGA-3'

3'-TTAAGATCT-5'

Этот участок представляет собой область перекрывания сайтов Sse9I (5'-ААТТ-3') и Xbal (5'-TCTAGA-3') и в случае pMTL-MSse2 содержит метальную группу либо в третьей, либо в четвёртой Т-А паре в зависимости от того, какой из остатков аденина, внутренний или наружный, модифицируется метилазой Sse9I Подчеркнутый остаток аденина является общим для сайтов обоих ферментов Ранее было показано (Nelson М, 1984), что R Xbal не расщепляет свою полуметилированную последовательность узнавания

5'- TCTAGA-3' 3'-m6AGATCT-5'

Это означает, что R Xbal не будет расщеплять последовательность, включающую перекрывающиеся сайты Sse9I и Xbal, в том случае, если метилтрансфераза Sse9I модифицирует остаток аденина в четвертой Т-А паре Поскольку ген sse9IM также содержит сайт узнавания Xbal (в позиции 499 от начала гена), то помимо района полилинкера плазмида pMTL-MSse2 имеет два дополнительных сайта узнавания Xbal, расположенных в двух копиях гена sse9IM (рис 3) Поэтому расщепление плазмиды pMTL-MSse2 эндонуклеазой рестрикции Xbal должно приводить к появлению либо двух

Sail 429

Sphi1554

pSse9/l 5192 ns

Sphi192 Sse<31-Xba£2l7

Sphi | / Sphi

Sse9I-Xbal

Sphi \ EjjparMeHT Xbal 1393 ri»i

Sse9I-XbaI Sphi /■

Phc. 3 Cxenia noJiyHetnw iuia3mhaw pMTL-MSse2

(JjparMeHT Xbal 603 n if

(в случае мстил провал ¡¡к остатка аденина в четвертой Г-А парс), либо трёх (если метилируется остаток аденина н третьей Т-А паре) фрагментов Данные электрофореза продуктов гидролиза рМ'П -М5$е2 реетриктазой ХЬа1, приведенные на рисунке 4, Указывают, что обработка этим ферментом приводит к образованию трех фрагментов Го есть, метилирование ДИК \lSse9! не препятствуег действию К ХЬа! в районе перекрывания последовательностей узнавания данных ферментов Из этого можно сделать однозначный вывод, что М8е<;91 модифицирует внутренние остатки аденина с образованием: 5'-АгабАТТ-3 Щ*- ТТт6АА~5'.

Рис. 4 Электрофоре грамма результатов расщепления ДНК плазмиды pMTL.-M.Sse2 эадонуклеазами рестрикции $5е91 и ХЬа! Дорожки: 1 - исходная Д1 [К рМТ1,-М$5с2; 2 - гидролиз 5$е91; 3 - гидролиз ХЬа1; 4 - маркер: ДНК фага лямбда + Вше 18], Продукты разделены и !%-ном агарочном геле.

3. Анализ аминокислотой поел едо вателъяоети M.Ssc91

Проведенный сравнительный анализ аминокислотной последовательности M.Sse9i выявил наличие ксеч консервативных мотивов (Conserved Motifs), присущих m6A-метилтрансферазам (рис. it. Мри этом, поскольку два основных мотива последовательности М Sse91 следуют в порядке CMi—>CMI V(I1), а в вмеокохонсерватизном участке XPPY, входящем в состав мотива CM IV на нервом месте находится остаток аспарагиновой кислоты (D), то на основании этих признаков МТ Sse91 должна быть отнесена к классу D]2, или классу а согласно альтернативной классификации. К этому же классу относятся такие ферменты, как (МАИ, Dpnll. Ecodain, UcoRV, Fokl, i IpyAI, Ual, Mbol, Nlalll, Sspf. Sis I, T4dam н другие. Интересен тот факт, что метилазы систем рестрикции-модификации, узнающих последовательности, включающие сайг A A'IT, являются представителями других классов: М Muni (5'-СААТГО-3') и M.Rsrl р'-GAATTC-3') - класса Djr, а M.EcoRI н M.Ssol (5'-GAATTC-3') - N,3.

Подсчет уровня гомологии аминокислотной последовательности M.Sse9] с последовательностями других метил аз класса Diz с помощью программы BLAST выявил

CM X

CM I

Н.SSH9I

M.CviAII

M.HpyAI

M.Hpyl

M.Nlalll

M.Fokl(N)

M3.BstFSI

M.StsI(N)

M.Sse9I 51

H,CviAII 56

M HpyAI 55

M Hpyl 55

M.Nlalll 55

M.Fokl(N) sa

Ю.BstFSI 51

M.StsIIN) 52

M.SseSI 97

M.СviAII 101

M.HpyAI 90

M.Hpyl 90

м. NISI11 эа

H,Fokl(N) 105

M3.SstF5I 108

M.StSKN) 105

M.Sse9I 146

M.CviAII 1S4

M. HpyAI 154

M.Hpyl 154

M.Nlaill 155

Vi . Foï-I W> 162

M3.BStF5I 165

M.StsUN) 160

M. Sse9I 201

M.CviAII Э08

M. HpyAI 210

M•Hpyl 210

M.Mlalll 211

M.FOkl(N) 218

M3.BstF5I 221

M.StsIIN) 216

M. Sae9I 258

M.CviAII 259

M, SIpyAI 262

M.Hpyl 262

M.Nlalll 263

M.Fokl (V> 272

M3.BstFSI 275

M. StsIIN) 270

ÏVPVLGDIASASGAT-----

iKRTDDT—УТ HAWGDNLSGT UAWGKDLSi SNVAGHSL EÉKrtíKDD--.

EENVDN---AE

iKHTDGS—EE'

Ï0A rNG - QE VDRH ALE AALAELN AL P3E

¡IMNaLKCPFSDKLQMIIETIDDLDTKDMVIPG---

В----1QEIPNQEELINE IN SVA Г, К

!----IQEIPNQEELIDRLW SV AL R

'----CQ S ILKAGËLLQRLE QLPPR'

NSI Ph'FS ELKK IG IKËPLH YI,E NE----E EE I SHE FFlTH 104

3CYPTFÜGLKKVDIYDPFSYLNNFPIDSYVFDENNSFI¥R 107

SJSKPSÍ'SKLI QAGIS S PMTYLQNL----EVNDETIGÏYSV 104

TRD

PSYFTE 96 FVTL 100 KGFIYS 97

----KGFIHS 97

----EKCTQ 97

ËDVRLIAFDY KRYVGAQIGIYN

is------

SLMTXT YMRFKADNK------

.YS LMTXTYMRFKASNK------

iLVQTE YRKFKADKTEN----

,PE T YRI YKMPy KKÏKSK-----

T YAVAD SVKVYKYPYRP-YKGK-----

iFSVDGI VDIKKIPYRKÏQEK-----

T'lic.S. Выравнивание ам'инэкисяотных последовательностей MS sc 91 п наиболее г омологичных ей Д H К-мепиггрансфераз.

сходство лишь с отдельными представителями этого класса (табл 1) Недостаточно высокий уровень сходства первичной структуры исследуемого фермента с другими ферментами класса 012 согласуется с данными о значительной гетерогенности группы Ы-метилаз Интересно, что последовательности узнавания большинства метилтрансфераз, гомологичных М ЗэеУ!, включают триплет АТС (табл 1)

Таблица 1. Количество идентичных и сходных аминокислотных остатков (в процентах) в последовательностях М 8зе91 и некоторых метилтрансфераз класса 0|2 Метилируемое основание выделено жирным шрифтом

Фермент Послед-ть Процент идентичности Процент сходства

узнавания с М-ввеЭТ с М 8ве91

МНруА1 САТС 32 49

М МаШ САТв 30 46

М 81з1(Ы) СвАТв 29 46

М Рок1(Ы) ООАТС 27 47

МЗ Бэта йОАТС 27 42

М Ыа1 26 45

МБвр! ААТАТТ 26 42

М СУ1АП САОТС 23 37

Ранее были предприняты попытки связать сходство аминокислотных последовательностей метилтрансфераз со структурой их сайтов узнавания Так, полагали, что сходство последовательностей метилтрансфераз МаШ и Ы-концевых доменов 8й1 и Рок1 является следствием присутствия в их сайтах узнавания триплета АШ Однако сайг узнавания М 8зе91 - ААТТ, сильно отличается от последовательностей вышеупомянутых ферментов, поскольку не содержит АТС и не имеет О/С оснований, фланкирующих сайт (так же, как и последовательность узнавания М Явр!) И этот факт заставляет усомниться в универсальном характере взаимосвязи между аминокислотными последовательностями метилаз и их сайтами узнавания

4 Получение препарата рекомбинантной метнлтрансферазы $$е91

С помощью полимеразнои цепной реакции ген ¡хе91М был амплифицирован и клонирован в экспрессирующий вектор рЛ\У2 Этот вектор содержит тандем термоиндуцибельных промоторов Ря/Рь фага лямбда, белок-репрессор с 1857 и сайт связывания рибосом (ЯВ8) гена 10 фага Т7 После трансформации лигазной смеси в клетки Е сок ЯМ и отбора выросших при 30 °С клонов была получена рекомбинантная

плаэмида р.1\У-М55С, содержавшая ген встроенный по саотам рестрикхши

РаиЫШ - ВатН1. Клетки, несущие подвергали терм о индукции нагреванием

Культуры до 42 °С и течение 4ч и наблюдали появлений полосы в районе 41 кДа я 10% ЧП>8-ПААГ, что соответствовало теоретически рассчитанной молекулярной массе МЯкеМ, предсказанной на основе первичной структуры открытой рамки считывания (4045 5 Да) (рис. 6).

i а з J

Рис. б Электрофореграмнатермонндукцни синтеза рекомбинангной M.Ssc91. Дорожки: 2 - лизат клеток E.coli RR1 + pJW-MSse без термоиндукции; 3 - лизагг после проведения термоиндукции; 1 и 4 - маркеры молекулярного веса.

Из целевого клона затем нарабатывали биомассу и проводили очистку реком бннантиого белка с использованием пяти хроматографии ее ких стадий: фосфоцеллюлозы Р-11, гвдроксиапатита, гепарин-сефаргаы, гель-фильтрации на сефахриле S-200 и С1юва гидрокс иапатите В результате был получен гомогенный (по данным электрофореза в SDS-ПААГ) препарат рехомбинантной метилтрансферазы Sse9I (рис 7). Концентрация оелка с учетом молярного коэффициента экстипции для M,Sse9I (53250 см "'М"') составила 0.9 мг/мл. Специфическая активность фермента составила 4 ед/мкл, а удельная активность, соответственно, - 4.4 тыс ед/мг. За одну единицу активности М .Sse9! принимали минимальное количество фермента, необходимое для защиты Д] [К фага лямбда (за 1 час при j7 "С в 20 мкл реакционной смсси) от гидролиза эндонуклеазой рестрикции Sse9I.

12 3 4 5

' i' - ' .

Рис, 7. Препарат рекомбинактной М.5зе91 I. 10% ЗОК-ПААГ Дорожки: 3-4 - препарат фермента М5зе91 (15 мкл И 30 мкл), 2 -маркер молекулярного веса (36 кДА), 1 и 5 - маркеры молекулярного веса (21.5, 45, 66 и 94.5 кДа)

45.0 кДа — M.SstíH 36,0 кДа

Для препарата рекомбинантной метилтрансферазы Sse9I были выбраны следующие оптимальные условия реакции: буфер, содержащий 20 мМ Tp¡ic-HCl, рН 7.0, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ 2-меркаптозтанол, КО мкМ SAM и температура 37 "С. Интересно, что в случае системы рестрикции-модификации Sse9I оказалось, что эндонуклеаза рестрикции и Д11К-метклтрансфераза имеют разные оптимумы температуры реакции: 55 °С - для R Sse91 и 37 ''(' - для М.5зе91. 11одо6ныс различия встречаются тройне редко и могут свидетельствовать к пользу независимого происхождения экдонуклеазы рестрикции и мен[лтрансферазы, относящихся к одной системе I'M. Помимо этого, разница н температурах, при которых проявляется максим ал ыш активность мстшггрансферазы и эвдонуклеазы рестрикции, может играть определенную роль в регуляции баланса активности этих ферментов в живой клетке

5. Установление структуры онерона системы ргстрикции-модификации Ssc91

Как уже было упомянуто выше, на первом этапе клонирования была получена плачмида pSseQ-1. содержавшая фрагмент хромосомной ДНК species 91J длиной около 2500 н н , который включал ген sse'JÍM, а также прилегающие участки: 50 п.н. до старт-кодона гена и 1400 п.н. после стоп-кодона. Так как на участке ДНК, следующим за геном метил азы, Не было обнаружено ОРТ, которая могла бы являться геном ЭР, мы определили первичную структуру участка ДНК, предшествующего гену sse9IM с помощью метола

■Ш "Щ*

Ф

■X ■■ ■

. ; . _ > i

■i- Щ ■ tit

т

«прогулки» по хромосоме, основанного на селективной супрессии ПЦР (Siebert Р D , 1995) Схема поэтапного определения структуры оперона системы РМ Sse9I представлена на рис 8 Хромосомную ДНК S species 9D обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Egel (5'-GGC|GCC-3') - на первом этапе «прогулки», и SmiMI (5'-CAYNN|NNRTG-3') -на втором этапе К полученным фрагментам "пришивался" с помощью Т4 ДНК-лигазы специальный псевдодвуцепочечный (супрессионный) адаптер (Ad) Полученная лигазная смесь использовалась в качестве матрицы для ПЦР с праймерами адапторным (А), соответствующим внешней части адаптера и специфичными (S1 или S2) Специфичные праймеры комплементарны известной последовательности ДНК в начале гена sse')lM в направлении, противоположном направлению рамки считывания гена (S1 - на первом этапе), и участку, расположенному на расстоянии около 500 п н от начала гена (S2 - на втором этапе) (рис 8) Супрессия ПЦР достигалась за счёт особенностей структуры адаптера и адагггорного праймера, которая позволяла селективно амплифицироваться только тем молекулам, которые содержали сайт для "отжига" специфичного праймера Адаптор Egel 2506 п н.

A SI sse9IM J + 518 пн

Адаптор SmiMI Egel 3024 п.н.

A S2 sse9IM

| + 1021 пн

ОРТ1 ОРТ2 ОРТЗ (279 п и ) (531 п.н.) (1089 п.н.)

SmiMI Egel 4045 п.н.

sse9IC sse9IR sse9IM

Рис 8. Схема поэтапного определения структуры оперона системы рестрикции-модификации Sse9I Относительное положение генов показано большими стрелками Специфичные и адапторный праймеры обозначены маленькими стрелками Жирной линией показана часть ДНК с известной последовательностью

В результате были последовательно получены два ПЦР-фрагмента - 518 п н (после первого этапа) и 1021 п н (после второго этапа), включающих участки ДНК S species 9D, расположенные друг за другом перед началом гена sse9IM (рис 8) Нуклеотидная

последовательность этих фрагментов была определена, благодаря чему к фрагменту

длиной 2506 пн, известному ранее, удалось добавить участок ДНК Sspecies 9D общей

протяженностью 1539 п н Этот участок, как было обнаружено, содержал две рамки

считывания ОРТ 1, длиной 279 пни ОРТ 2 длиной 531 п н, соответствующие белкам,

состоящим из 92 и 176 аминокислотных остатков, соответственно (EMBL Асс No

Х96789) Мы предположили, что одна из этих рамок считывания должна быть геном

эндонуклеазы рестрикции Нуклеотидная и, соответствующая ей аминокислотная,

последовательности ОРТ 1 (sse9IC) и начала ОРТ 2 (sse9IR) приведены на рисунке 9

1 60 GGTTATCGGCj^^^CGGftCCATCGTGCTACT^^MCTGTggaCTCGTAGGTeGCGC -35 С) -10 С-Ьозс

sse9IC V А

61 120 CCgagCACCCTGGCAAGGTGACTGACGGCCACCTGCAACGAACGTTTGGGCAGAACCTGC

РЕН PGKVTDGHLQRTFGQNL

121 180 GCGACCTTAGGGTGGCGCGTGGGTTGAGCCAAGAAGCTCTCGCCGAACTTATCGGCGTAC

RDLRVARGLSQEALAELIGV

181 240

ACOGTACCTACATGGGTGGGCTGGAGCGGGGCGAGCGGAATCCAACCCTTAAGAG1GTCG

241 300

АААСббТСОСТССТСАТСТССАСетССАСССТСТСАСССТССТААСТСССОАОАСТТСТА

ЕЯУААНЬОУОРЬЗЬЬТАЕЗС

301 360

А6ТСАТССССвСССССвС6ТСТСССдадСТААТ<ЗООААТ(ЗААСТСТСвССТССТСАйТСА

вверта мыэнььзо НЗБАРвСУАЗ*

Рис.9 Нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности в районе гена и начала гена лте9/7? Подчёркнуты участки, входящие в состав С-бокса. Альтернативные стартовые кодоны для жгеР/С и ые9/К выделены жирным шрифтом Последовательности Шайна-Дальгарно (ЗО-сайты) отмечены строчными буквами, а участки, предположительно входящие в структуру промотора, выделены серым

Как видно из рисунка 8, все три ОРТ ориентированы одинаково, то есть транскрибируются в одном направлении Логично предположить, что в этом случае все три гена объединены в один оперон, а на некотором расстоянии перед началом ОРТ1 должна располагаться последовательность ДНК, включающая участок связывания РНК-полимеразы - промотор Промоторы многих прокариотических генов включают два

консервативных участка район -10 — ТАТААТ и район -35 - TTGACA Большинство реальных последовательностей промоторов отличается от канонической на небольшое число замен - например, на 1 или 2 В исследованных промоторах расстояние между положениями -35 и -10, как правило, составляет от 16 до 19 п н Стоит отметить, что ряд промоторов не имеют специальной последовательности в положении -35 Обычно такие промоторы содержат расположенный рядом участок, который узнается регуляторным белком, способствующим инициации транскрипции Этот участок заменяет функцию положения -35 По-видимому, в случае исследуемого оперона присутствует именно такой вариант промотора Поскольку, если район-10 определяется довольно четко (см рис 9), и отличается от канонического всего на одно основание (TATAGT), то локализация района -35 представляется достаточно проблематичной В то же время обнаруженный поблизости участок, включающий короткие инвертированные повторы, может являться местом связывания регуляторного белка (см ниже)

На расстоянии 80 п н от стоп-кодона гена sse9IM (ОРТЗ) обнаружена последовательность, включающая инвертированный повтор из пяти G-C пар GGGGCATCCAGCCCC Такая последовательность формирует структуру типа шпильки, и таким образом, может являться терминатором транскрипции

6. Анализ аминокислотной последовательности C.Sse9I

Поиск гомологичных последовательностей в базе данных GenBank для белка, кодируемого ОРТ 1, показал наличие сходства с контрольными С-белками, присутствующими в некоторых системах РМ, и выполняющими функцию регуляции экспрессии генов эндонуклеаз рестрикции В опероне системы рестрикции-модификации Sse9I наличие гена такого контрольного белка, по-видимому, является необходимостью, поскольку ген ДНК-метилтрансферазы в данном счучае расположен последним, тогда как модификация хозяйской ДНК должна осуществляться прежде, чем она подвергнется действию эндонуклеазы рестрикции Согласно принятой номенклатуре обнаруженный белок был назван С Sse9I Выравнивание его аминокислотной последовательности (рис 10а) показало, что наибольшая степень гомологии наблюдалась с последовательностями С PvuII (46% идентичности и 74 % сходства), С Smal (40% идентичности и 59% сходства) и С BarnHI (37% идентичности и 62% сходства)

Сравнение последовательностей известных С-белков позволяет говорить об их значительном родстве, поскольку все они обладают гомологией на уровне ключевых структурных аминокислотных остатков Эти ключевые остатки формируют структуру

,LI 40 FfftQÏ- 31

m 36

|ГЕС 53 ■%H 29 IS 37

l ------------VAPEH ÉTjKVTDGHjiJRTBQNgjD^-VAE1

i -----------------------м-Щк!

1-------------------MSMTNPLSARLTLAKN|KK*(-GELI

1 PJ Vï'LILSf"(iL«î.';<gLLSGti,rl4rWMïKi.;.(JiKpiv>I§LSî.'S.

! ----------------------^t^gERgKTfSSjJ-RKQt

l ---------------MPDABICfvBKEnAEN|R::Y|-NIbf;

1 ----HPKj<PI LÇÏPILGCII YKKN§GgSMSVRE| IKKNRVI СК^Н^ЕЩКА), 43

1ЛК FG VR IR LSQE LAJÎIJ 41 f B9B £ ' 'ЯШИ ; дл ; i|l;V ' : PI /, s ; с К S -A PGUVAS 92

32 : t ДД- s : Hf К- Я—- Et ЩЩ, f-<# д1т iiSEirsp I к кв'---------H

37 liB^Bfl1!'1 И!^®1.'.' Г;: ; I»i! tt44PSSK----Й4

54 гЯ^:; a— ИШ11 t :UsкВifopкпМрF-TT:ghceqkk— 102

30 K|o|^B^vBBgBtBl|T|r<LSNHQHEI^i;VFRLMEGÏ|TV<NED----11

36 i-LAKH^'-^V^B-RKI.KNF.OS-----84

50 IK POKJP • » : -: : Î^CFB£G$dpint§KEÎI>$KKHESSF— 59

GLHRTYÎG IERGERNVSL NIERIA AL ï 1 Ll E

A)

C.SseSI C.MunI C,PvuII C.BamfiX С.BglII С. Smal с. ecorv Консенсус C.SseSI C.MuriI C,PvuII С .BamBI С . Bgl 11 С Smal с.eeorv Консенсус

e)

Симметрия Sse9I BgXii

BamHI Muni Smal PvuII Консенсус

Рис. 10. (Л) Множестве! гное вы рак ни ванне аминокислотных последовательностей наиболее известных контрольных белков систем рестрикции-модификации. Остаток валина, с которого, предположительно, начинается C.Sseffl, выделен жирным шрифтом. (К) Сравнение С-бокей системы рестрикции-модификации Sse9I с пятью подобными последовательностями В скобках внизу справа указано расстояние до предположительного старт-колона С-гсна, стрелками показано направление симметрии

g ta cffiW jt a tfcW J*it о tafct;.T»i»bat^^gagog (16) GTG

t aa a ji ^fii (t a t>;TSi Weq Г.стНШса tr-.я (41) ATS

g ta тЗЯЗД t a tfcTtfr fltg tafrEMi-a tWnwl tant- (50) ATG

gtgtj^Etat3SEc'3tt5iEtaa^^catt (ЗЭ) AT G

atgrffiffiîîcatSSCBtqtcf<&T»lijtatf^fEflSa t:r;a (38) ATG

ttafjCTnoat^tP^tQЪаГДМЭДсааЯЕИЯаte» (20) ATG -tG-Я1Ыи1-АтШиЫ-G T-ЯНН-A-- с -

спираль-поворот-спираль (НсМх-Тит-МсНх), а сами белки относятся к НТН-семейству регуляторов транскрипции НТН-мотнв обнаружен во многих изученных ДНК-связывающих белках, таких как репрессор фага X - С го-белок и 434-репрессор из бактериофага 434, 5тК-бепок из ВасШШ зиЬШкь Наличие в С.8м91 последовательности 1.5<51:х1.АхххОх11КТУМОх1.ККх1;К (рис. 1.0а), которая формирует структуру сппраль-

поворот-спираль позволяет сделать вывод о том, что продукт гена sse9IC также является ДНК-связывакяцим белком-регулятором НТН-семейства

Инициирующим кодоном гена sse9IC, по-видимому, является один из двух альтернативных кодонов GTG (рис 9) Анализ нуклеотидной последовательности предшествующей гену sse9IC выявил участок ДНК, содержащий короткие обратные повторы (подчеркнуты на рис 9) Причём этот участок пересекается с -10 районом предположительного промотора и проявляет значительное сходство с канонической последовательностью так называемого С-бокса (С-box) (рис 106) Все известные С-боксы обладают выраженной симметрией внутренней базовой последовательности, включающей короткие палиндромы, что соответствует гомодимерной НТН-структуре, присущей С-белкам На примере системы РМ PvuII было экспериментально показано, что С-бокс служит местом связывания С-белка, и таким образом, играет важную роль в процессе регуляции транскрипции оперона Интересно, что в случае системы PvuII С-бокс также перекрывается с -10 районом промотора

Потенциальная последовательность Шайна-Дальгарно (SD-сайт) перед геном sse9IC выражена слабо GGA - для первого инициирующего кодона и GAG - для второго Такие SD-последовательности предполагают достаточно низкий уровень трансляции продукта гена sse9IC Тем не менее, второй, «короткий» вариант рамки считывания, по-видимому, является более предпочтительным, тк в этом случае расстояние от С-бокса до старт-кодона составляет 18 п н, а первый кодон GTG перекрывается с С-боксом (рис 9) Стоит отметить, что во всех вышеупомянутых системах РМ (рис 106) последовательность С-бокса предшествует гену С-белка на 20-50 п н

7 Анализ аминокислотной последовательности R.Sse9I

Выравнивание последовательности белка, кодируемого ОРТ 2, приведенное на рисунке 11, показало наличие некоторой (менее 30 % идентичных ао) гомологии с эндонуклеазами рестрикции Muni (5'-СаААГГО-3') и EcoRl, RsrI (5'-GlAATTC-3') Известно, что аминокислотные последовательности эвдонуклеаз рестрикции, даже узнающих одинаковые или сходные последовательности ДНК, как правило, обнаруживают очень низкую степень гомологии Поэтому логично полагать, что ОРТ 2 кодирует эндонуклеазу рестрикции Sse9I, а гомология с R EcoRI, R Rsrl и R Muni связана с тем, что эти рестриктазы узнают сайты, включающие общую внутреннюю тетрануклеотидную последовательность ААТТ

В аминокислотных последовательностях большинства эндонуклеаз рестрикции II типа, для которых была определена кристаллическая структура, был найден

консервативный мотив PD..D/ШСК, входящий в каталитический цешр. Этот мопгв является общим для цс.шго ряда нуклеаз и. по-пндимому, обеспечивает сходный механизм гидролиза Д11К у данных ферментов Ранее были установлены пространственные структуры для EcoRI в комплексе с одноцепочечяой ДНК (PDB Л» 1ER!) и Muni в комплексе с двуцепочечной ДНК (PDB № ID02). Несмотря на существенные различия аминокислотных последовательностей оба фермента проявляют сходство трёхмерных структур, в частности содержат сходное ядро (кор), образован:юс гитнзвенной ¡З-складкой и двумя а-спиралями, Консервативные аминокислотные остатки мотива PD.liXK у EcoRl и Мин! локализованы на складках (Î2 и (53, находясь, таким образом, в центре каталитического ядра. 1 !рн угом остатки пролила, аспарагиновой кислоты и лизина у R.EcoRl и R.Munl занимают одинаковое положение относительно молекулы ДНК и непосредственно вовлечены в катализ расщепления фосфоди>фирной связи.

R_Sse9I 1 R.EcoRl 1 R.Rsri 1 R.SsoI 1 R.Munl 1

R.Sse9I <12 R.EcoRl 58 R.Rsrl 64 R.SsoI 58 R.Munl 57

------мбмЯКВ

magevsfkgIgà ------ustAJ

-------mg|s|

r dsskkt pd

rtsvrl kai л k№s t'dpr rîisxkkt еьлщкшо pd

- - v£*p ddvbkb iшщ-1 с

R.Sae9I 82 -

R.EcoRI 122 Г

ft.Rsjrl 128 I

R.SsoI 122 :.r(NlLP

R .Muni 104---*

R.Sse9I 127 ÏTVKHl

R.EcoRl 119 15|BRDi

R.Rsrl 185 ■■■Д"

R.SsoI 179 I£

R.Munl 156

|rarqïfl-----------

IGIFGDY. |PLSIFGAAA IGIfGDYA -|AG LKAS CAE QN1ÏNV1

IRYG-----

iTiSvsNesî

ialfveeasl _ ;tl§vsnss|l

'ttq|g---

IMlLDPPïïkeV 41

~ (y б7

JL 63

|ï 57 ¡V 56

■ Ïhtvíjfï keihalfgy- - -[ igeian vlklrny.

iSEÏANFI^-------

ptpgllkayrtiggthflei

fyËeeIhy------------------E

яiln r ld r ltaanygm р1нзы1 kjfr/h d sn i2 jridkvt as s l5rf, 1 hqh y| ■nse 8h s| r l к r ldr ltaanïgm p i nsn l_ efrfwïdhto-----------------dnyrawrpnesgek|v

|rg----162

D 242 - 246 'ËjGD 24 2 [EKLSKY 199

R.SseBI 163------------Й4Э PTAE P PflftgPQ--------- 176

R.EcoKI 243 GREWDSKIMFEiHeBISTTSLtfvfjGRDLFEQLTSК 277

R.RscI 247 AAPWTAGEMAEAHLAVAKTS LeilAD DLDQN----211

R.SsoI 243 grewdskimfeitjedtsitsl^vbgrdlfeoltsk 277 R.Munl 200 r.d---------------------------------202

Рис.II. Сравнение аминокислотой последовательности R.SseSl с последовательностями четырех родственных экдонуклеаз рестрикции. Знаком «=» отмечены консервативные аминокислотные остатки, входящие в каталитический центр, а знаком «~» отмечены аминокислотные остатки, ответственные за узнавание последовательности ДНК АЛТТ.

У R.EcoRi остатки G140, N141, А142 и К145, входящие в состав N-концевой части Спирали «4, ответственны за формирование специфических контактов с в [(утренней последовательностью ААТТ сайта узнавания 5'-GAA1TC-3\ Подобный мотив.

GU6NAHER121, присутствует и у RMunI (рис 11) Причем последовательность GNAXER у эндонуклеаз рестрикции EcoRI и Muni входит в состав второго консервативного блока, который нараду с каталитическим включает элементы первичной структуры, имеющие максимальную (до 78%) гомологию у этих двух ферментов В то время как, если сравнивать полные аминокислотные последовательности ЭР EcoRI и Muni, уровень гомологии составляет всего 18%

Аминокислотная последовательность RSse9I, как видно из рисунка 11, также содержит мотивы Р60Е Е76ХК и G84NAXER89 и, логично предположить, что у всех трех ферментов узнавание и расщепление последовательности ААТТ достигается с помощью одинаковых механизмов Интересно, что в консервативном мотиве PD ЕХК у ЭР Sse9I после остатка пролина находится остаток глутаминовой, а не аспарагиновой кислоты, как у R Muni, R EcoRI и большинства других эндонуклеаз Такая модификация мотива характерна, например, для HmdlII (PE51 D10SAK) и Bcgl (PE53 E^DK) Используя данные о пространственных структурах эндонуклеаз рестрикции Muni и EcoRI с ресурса REBASE (http //www rebase neb com), а так же основываясь на топологическом сходстве базовых элементов данных ферментов и R Sse9I, с помощью программы ESyPred3D можно построить пространственную модель рестриктазы Sse9I На рисунке 12а приведена модель третичной структуры эндонуклеазы рестрикции Sse9I, полученная при наложении элементов вторичной структуры R Sse9I на соответствующие элементы R Muni А на рисунке 126 представлена гипотетическая схема расположения элементов вторичной структуры R Sse9I с указанием позиций ключевых аминокислотных остатков мотивов РМЕ Е76ХК и Gs4NAXER89 Подобно Muni и другим ферментам подгруппы EcoRI основу R Sse9I составляет кор, включающий пятизвенную ß-складку, окруженную a-спиралями Консервативный мотив Р60Е Е76ХК у RSse9I расположен на рЗ-участке кора, а мотив GS4NAXER89 на a-спирали, соответствующей а4 у EcoRI или Зк>4 - у Muni (рис 126) При этом последовательность RSse9I (176 а о) короче по сравнению с рестриктазами Muni (202 а о ) и EcoRI (277 а о ), так что и мотивы, и другие элементы вторичной структуры изучаемого фермента оказались сближенными в пространстве Например, в последовательности R Sse9I (выделена черным цветом на рис 12а) отсутствуют участки, соответствующие аЗ, Зю2 и ЗюЗ спиралям эндонуклеазы рестрикции Muni (серый цвет) Как и следовало ожидать, в последовательность R Sse9I не содержит аминокислотные остатки, аналогичные узнающим внешнюю G-C или C-G пары нуклеотидов у EcoRI и Muni По- видимому, изменения или сокращения в данных районах не оказывают значительного влияния на трехмерную структуру фермента

А)

Fnc.lZ. (А) Гипотетическая модель пространственной структуры R,Sse9I (черный цвет) с наложением на структуру R.Munl (серый цвет). Буквами и цифрами отмечены элемента вторичной структуры R.Muni (Б) Гипотетическая схема расположения элементов вторичной структуры R Sse9l Плоскими стрелками показаны -складки, цилиндрами -- ас пира ли. Отмечены аминокислотные остатки, входящие в каталитический центр и остатки, вовлечённые в специфическое узнавание последовательности ЛЛ'[Т.

N. Получение рскочбиыантнмй тндонуклеяЗЫ рестрикции Sse9I

Анализ последовательности ОРТ 2 показал, что она имеет два альтернативных стартовых кодона ЛTü. отделанных друг от лруг;1 всего одним кодоном (рис. 9). Чтобы подтвердить, что ОРТ 2 кодирует функционально активную рестрнктазу Ssc91. мы

клонировали оба варианта данной рамки по сайтам ГаиКЕЙ-Е^Ш/БатНТ в термоинду цибельный вектор р.№2. В качестве штамм а-хозяина использовали клетки Е.соН Р-КI, несущие плазмиду рАСУС 184 со встроенным геном б$с91Щ для защиты бактериальной ДНК Колонии, выросшие на агаризованной селективной среде, содержавшей ампициллин и хлорамфеникол, подвергали термоиндукции и проверяли наличие активности рестриктазы 5ке91 в лизатах клеток. На рис. ! 3 показана электрофор еграмма продуктов расщепления ДНК фага Т7 лизэтами клеток из клона, несущего рекомбигантный ген 5зе9!Я (с первого АТС (А) и со второго АТО (Б», с индукцией и без неё Оказалось, что эндонуклеазная активность, характерная дня К.5$е91,

а б

¡1345673 | 1 3 4 5 $ v в

Рис.13. Злектрофореграмма продуктов расщепления ДНК фага Т7 после её обработки лизагами клеток Е.соН из клонов, несущих рекомбинантный ген ¡зе9!К (А) - е первого АТС, (К) - со второю АТС. Дорожки; 2-4 - без термоиндукции: ДНК фага Т7 + 5 мкя лизата, далее разведение в 4 и в 16 раз, 5-7 - после проведения термоиндукции: ДНК фага Т7 +- 5 мкл лизата, далее разведение в 4 к в 16 раз: 5 - контроль. ДНК фага Т7 2 ед. препарата фермента Й.;5зе91. Маркеры молекулярного веса ДНК 0.25 - 10 т.п.н (дор. 8). Продукты разделены 8 1% агарозном геле.

тестировалась в клонах, содержащих любой из вариантов ОРТ 2. Однако в случае, когда ген начинался со второго АТС, активность фермента в грубом лизатс была, по крайней мере, в 5 раз выше. Мы полагаем, что именно второй АТС является инициирующим кодопом гена т е, ген включает 531 п.н и кодирует белок, состоящий из 176

аминокислотных остатков. По-видимому, при клонировании более длинного варианта считывание, тем не уенее, происходит со второго АТС, а более низкая специфическая

активность фермента в лизате объясняется большим удалением старт-кодона от последовательности Шайна-Дальгарно, расположенной в векторной части Вариант ATG1 Вариант ATG2

ATG1 ATG2 ATG2

5' - AAGGAGA1АТАСАТ ATGGGAATGAACTCTCGG-3' 5' -AAGGAGATATACATATGAACTCTCGGCTGCTC-3' SD FauNDI sseSIR SD FauNDI sseSXR

В то же время на данный момент нельзя однозначно ответить на вопрос, который из двух стартовых кодонов является основным в живой клетке, и каким образом регулируется экспрессия гена эндонуклеазы рестрикции in vivo

Один из клонов, обладающих рестриктазной активностью (вариант рамки с ATG2), использовали для наработки биомассы и получения препарата рекомбинантной эндонуклеазы рестрикции Sse9I В результате, из 3 г биомассы путем хроматографической очистки на фосфо-цедлюлозе Р-11, гидроксиапатите и гепарин-сефарозе был получен препарат рекомбинантной рестриктазы Sse9I в количестве 20000 единиц активности, с концентрацией 5000 ед /мл

ВЫВОДЫ

1 Из природных изолятов выделен бактериальный штамм Sporosarcina species 9D, являющийся продуцентом эндонуклеазы рестрикции П типа Sse9I Показано, что R Sse9I узнает последовательность ДНК 5'-ААТТ-3' и расщепляет её перед первым остатком аденина

2 Получена геномная библиотека штамма Sporosarcina species 9D, в которой выявлена плазмида pSse9/l, несущая ген ДНК-метилтрансферазы Sse9I Показано, что М Sse9I модифицирует внутренний остаток аденина в сайте узнавания с образованием 5'-А(т6)АТТ-3' и относится к классу D12 ДНК-метилтрансфераз Ген sse9IM клонирован в экспрессирующий вектор, и выделен гомогенный препарат рекомбинантной М Sse9I

3 Определена нуклеотидная последовательность и порядок расположения генов, входящих в оперон системы рестрикции-модификации Sse9I sse9IC-sse9IR-sse9IM Гены кодируют контрольный белок (С Sse9I), эндонуклеазу рестрикции (R Sse9I) и ДНК-метилтрансферазу (М Sse9I), соответственно

4 Установлено, что аминокислотная последовательность С Sse9I проявляет сходство с контрольными белками систем РМ и имеет наибольшую гомологию, 74%, с С PvuII Непосредственно перед геном sse9IC выявлена последовательность ДНК, гомологичная участкам связывания С-белков ряда систем рестрикции-модификации

5 Показано, что аминокислотная последовательность R Sse9I обнаруживает гомологию с эндонуклеазами рестрикции Muni (5'-CAATTG-3') и EcoRI (5-GAATTC-3'), главным образом за счет консервативных мотивов PD/E ЕХК и GNAXER, ответственных за катализ и узнавание общей внутренней тетрануклеотидной последовательности ДНК ААТТ

6 Предложена модель пространственной структуры эндонуклеазы рестрикции Sse9I на основе сходства ключевых структурных элементов фермента с RMunI и R EcoRI

7 Ген эндонуклеазы рестрикции Sse9I клонирован в экспрессирующий вектор, и получен препарат рекомбинантного фермента

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1 Gonchar D А. Wolf Yu I and Degtyarev S Kh i 996 Clonmg and characterization of Sse9I DNA-methyltransferase recognizing 5'-AATT-3' Nucleic Acids Res 24, 2790-2792

2 Гончар Д A, Дедков В С, Верхозина В А, Куснер Ю С , Шевченко А В , Дегтярев СХ 1998 Эндонуклеаза рестрикции Sse9I из штамма Sporosarcma sp 9D, узнающая последовательность ДНК 5'-ААТГ-3' Лрикл Биох иМикробиол 34, 139-141

3 Гончар Д А, Абдурашитов М А, Охапкина С С, Шагин Д А, Килева Е В , Дегтярев С X 2007 Система рестрикции-модификации Sse9I организация генов и сравнительный анализ структуры белков Молекулярная биология 41,491-498

Тезисы материалов конференций.

1 Gonchar D А, Wolf Yu I and Degtyarev S Kh Cloning of the gene and biochemical characterization of Sse9I DNA-methyltransferase recognizing 5'-AATT-3' "4ft New England Biolabs Workshop on biological DNA modification", 1997, Innsbruck, Austria

2 Gonchar D A, Gololobova N S , Akishev A G, Degtyarev S Kh Isolation of homogeneous preparation of Sse9I DNA-methyltransferase "2nd International symposium Separations in the Biosciences SBS 2001", 2001, Prague, Czech Republic

3 Гончар Д A, Абдурашитов M A, Охапкина С С, Шагин Д А , Дегтярев С X Бактериальная система рестрикции-модификации Sse9I организация генов и свойства ДНК-метилтрансферазы "Ш Съезд Биохимического Общества", 2002, Санкт-Петербург, Россия

4 Gonchar D А, Abdurashitov М А, Okhapkina S S , Shagin D А , Degtyarev S Kh Characterization of the Sse9I Restriction-Modification system recognizing 5'-AATT-3' "5th New England Biolabs Meetmg on Restriction/Modification", 2004, Bnstol, UK

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гончар, Данила Александрович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ФЕРМЕНТЫ СИСТЕМ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

2.1. Характеристика систем рестрикции-модификации бактерий

2.1 Л. Распространение и функции систем рестрикциимодификации

2.1.2. Специфичность эндонуклеаз рестрикции по отношению к природным модификациям оснований

2.1.3. Биологическая роль метилирования ДНК у прокариот

2.1.4. Классификация систем рестрикции-модификации

2.2. ДНК-метилтрансферазы

2.2.1. Классификация ДНК-метилтрансфераз

2.2.2. Особенности пространственной структуры ДНК-метилтрансфераз систем РМтипаП

2.3. Эндонуклеазы рестрикции

2.3.1. Изошизомеры

2.3.2. Особенности структуры эндонуклеаз рестрикции типа II

2.3.3. Связывание ДНК эндонуклеазами рестрикции и локализация сайта-мишени

2.3.4. Узнавание субстрата эндонуклеазами рестрикции

2.3.5. Механизм катализа расщепления фосфодиэфирной связи эндонуклеазами рестрикции

2.3.6. Влияние двухвалентных ионов металлов на процесс катализаА

2.4. Структура оперонов систем рестрикции-модификации

2.5. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации

2.5.1. Регуляция С-белками

2.5.2. Другие способы регуляции

2.6. Эволюционные связи систем рестрикции-модификации

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Материалы

3.2 Методы

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Характеризация эндонуклеазы рестрикции 8Бе

4.1.1. Выделение эндонуклеазы рестрикции 8$е

4.1.2. Определение специфичности эндонуклеазы рестрикции 8Бе91 и оптимальных условий реакции

4.1.3. Определение места гидролиза ДНК эндонуклеазой рестрикции &<?Р/

4.2. Клонирование гена ДНК-метилтрансферазы 8эе

4.3. Определение основания, метилируемого метилтрансферазой 8Бе

4.4. Анализ аминокислотной последовательности М.8зе

4.4.1. Метилтрансфераза $$е91 принадлежит к классу Б п

4.4.2. Родственные связи М.5зе91 с представителями класса

4.5. Получение препарата рекомбинантной метилтрансферазы 8Бе

4.6. Определение оптимальных условий для работы рекомбинантной М.8зе

4.7. Установление структуры оперона системы рестрикции-модификации 8эе

4.8. ОРТ1 является геном, кодирующим С.8зе

4.9. ОРТ2 является геном, кодирующим К.8зе

4.10. Получение рекомбинантной эндонуклеазы рестрикции 8эе

Введение Диссертация по биологии, на тему "Система рестрикции-модификации Sse91: клонирование, организация генов и сравнительный анализ структуры белков"

Бактериальные системы рестрикции-модификации (системы РМ) являются одним из интереснейших объектов, изучаемых в молекулярной биологии. Несмотря на большое число обнаруженных и охарактеризованных систем РМ микроорганизмов и установление их роли в защите бактериальной клетки от вторжения чужеродной ДНК, биологическое значение этих систем остается неизвестным. Система РМ включает в себя как минимум два фермента: сайт-специфические эндонуклеазу рестрикции (рестриктазу) и ДНК-метилтрансферазу (метилазу). После открытия первых ферментов систем рестрикции-модификации казалось, что их функция не вызывает сомнений. Два фермента специфически узнают одну и ту же короткую последовательность ДНК: один фермент - защищает хозяйскую ДНК (метилаза), другой - уничтожает чужеродную, главным образом фаговую (рестриктаза). Однако чем больше открывалось новых ферментов рестрикции-модификации и чем глубже изучались их генетическая организация и механизмы действия, тем больше возникало сомнений в том, что защита ДНК клетки-хозяина - единственная функция этих ферментов.

Одной из фундаментальных проблем современной молекулярной биологии является проблема белок-нуклеинового взаимодействия. Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-метилтрансферазы входят в ряд наиболее удобных объектов для исследования этой проблемы. Это обусловлено целым рядом уникальных свойств данных ферментов, таких как высокая субстратная специфичность, огромное разнообразие узнаваемых последовательностей (более 250), а также небольшой молекулярный вес и относительная простота организации. На сегодняшний день значительное количество генов, относящихся к системам РМ, клонировано, выделены рекомбинантные белки и получены кристаллы ферментов. Это позволило достигнуть существенного прогресса в понимании той роли, которую играют процессы специфического метилирования и расщепления ДНК в жизнедеятельности клетки. В то же время успешное развитие многих направлений молекулярной биологии и генетической инженерии немыслимо без расширения ассортимента эндонуклеаз рестрикции, которые являются одними из ключевых инструментов в этих областях науки.

Поэтому особенную актуальность сегодня приобретает решение таких задач, как открытие новых систем рестрикции-модификации, изучение структуры и механизмов регуляции оперонов систем РМ, получение суперпродуцентов ферментов рестрикции-модификации, выявление ключевых аминокислотных последовательностей, отвечающих за связывание с сайтом узнавания на ДНК и катализ, а также поиск доказательств наличия эволюционных связей у различных групп ферментов.

Целью данной работы явилось изучение системы рестрикции-модификации II типа Sse9I из бактериального штамма Sporosarcina species 9D. В задачи настоящего исследования входило:

- установление субстратной специфичности и места расщепления ДНК новой эндонуклеазой рестрикции Sse9I;

- получение геномной библиотеки штамма Sporosarcina species 9D в E.coli с целью обнаружения плазмиды, несущей ген ДНК-метилтрансферазы Sse9I;

- определение основания модифицируемого метилтрансферазой Sse9I, клонирование гена sse9IM в экспрессирующий вектор и получение гомогенного препарата рекомбинантной M.Sse9I;

- определение нуклеотидной последовательности и порядка расположения генов в опероне системы рестрикции-модификации Sse9I;

- сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков системы рестрикции-модификации Sse9I с последовательностями близкородственных полипептидов.

- клонирование гена эндонуклеазы рестрикции Sse9I в экспрессирующий вектор и получение препарата рекомбинантного фермента;

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. Новая эндонуклеаза рестрикции II типа Sse9I из бактериального штамма Sporosarcina species 9D узнаёт последовательность ДНК 5'-ААТТ-3' и расщепляет её перед первым остатком аденина.

2. Рекомбинантная плазмида pSse9/l содержит фрагмент ДНК Sporosarcina species 9D, который включает ген ДНК-метилтрансферазы Sse9I. M.Sse9I модифицирует внутренний остаток аденина в сайте узнавания с образованием 5'-Ат6АТТ-3' и относится к классу D12 ДНК-метилтрансфераз. Ген sse9IM клонирован в экспрессирующий вектор, и выделен гомогенный препарат рекомбинантной M.Sse9I.

3. Оперон системы рестрикции-модификации Sse9I включает три гена, расположенные в порядке: sse9IC-sse9IR-sse9IM. Гены кодируют контрольный белок (C.Sse9I), эндонуклеазу рестрикции (R.Sse9I) и ДНК-метилтрансферазу (M.Sse9I), соответственно.

4. Аминокислотная последовательность C.Sse9I проявляет сходство с контрольными белками систем РМ типа II. Гену sse9IC предшествует последовательность ДНК, гомологичная участкам связывания С-белков ряда систем рестрикции-модификации.

5. Аминокислотная последовательность R.Sse9I обнаруживает наибольшую гомологию с участками эндонуклеаз рестрикции Muni и EcoRI, которые ответственны за узнавание общей внутренней тетрануклеотидной последовательности ДНК ААТТ.

6. Предсказана пространственная структура эндонуклеазы рестрикции Sse9I на основе сходства ключевых аминокислотных остатков изучаемого фермента и соответствующих элементов R.MunI и R.EcoRI.

7. Ген sse9IR клонирован в экспрессирующий вектор, и получен препарат рекомбинантной эндонуклеазы рестрикции Sse9I.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гончар, Данила Александрович

6. выводы

1. Из природных изолятов выделен бактериальный штамм Sporosarcina species 9D, являющийся продуцентом эндонуклеазы рестрикции II типа Sse9I. Показано, что R.Sse9I узнаёт последовательность ДНК 5'-ААТТ-3' и расщепляет её перед первым остатком аденина.

2. Получена геномная библиотека штамма Sporosarcina species 9D, в которой выявлена плазмида pSse9/l, несущая ген ДНК-метилтрансферазы Sse9I. Показано, что M.Sse9I модифицирует внутренний остаток аденина в сайте узнавания с образованием 5'-А(ш6)АТТ-3' и относится к классу Dj2 ДНК-метилтрансфераз. Ген sse9IM клонирован в экспрессирующий вектор, и выделен гомогенный препарат рекомбинантной M.Sse9I.

3. Определена нуклеотидная последовательность и порядок расположения генов, входящих в оперон системы рестрикции-модификации Sse9I: sse9IC-sse9IR-sse9IM. Гены кодируют контрольный белок (C.Sse9I), эндонуклеазу рестрикции (R.Sse9I) и ДНК-метилтрансферазу (M.Sse9I), соответственно.

4. Установлено, что аминокислотная последовательность C.Sse9I проявляет сходство с контрольными белками систем РМ и имеет наибольшую гомологию, 74%, с C.PvuII. Непосредственно перед геном sse9IC выявлена последовательность ДНК, гомологичная участкам связывания С-белков ряда систем рестрикции-модификации.

5. Показано, что аминокислотная последовательность R.Sse9I обнаруживает гомологию с эндонуклеазами рестрикции Muni (5-CAATTG-3') и EcoRI (5'-GAATTC-3'), главным образом за счёт консервативных мотивов PD/E.EXK и GNAXER, ответственных за катализ и узнавание общей внутренней тетрануклеотидной последовательности ДНК ААТТ.

6. Предложена модель пространственной структуры эндонуклеазы рестрикции 8Бе91 на основе сходства ключевых структурных элементов фермента с 11.Мип1 и 11.ЕсоШ.

7. Ген эндонуклеазы рестрикции 8зе91 клонирован в экспрессирующий вектор, и получен препарат рекомбинантного фермента.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение специфического взаимодействия белков с ДНК остаётся одной из интереснейших задач современной молекулярной биологии. Ферменты систем рестрикции-модификации благодаря целому ряду уникальных свойств служат прекрасной моделью для экспериментов в этой области. На сегодняшний день у представителей самых разных родов прокариотического царства открыто около 2000 различных систем рестрикции-модификации, узнающих более чем 250 нуклеотидных последовательностей. Клонирование значительного количества генов, относящихся к системам рестрикции-модификации, получение высокоочищенных препаратов ферментов и исследование их кристаллической структуры позволило существенно продвинуться в понимании механизмов специфического взаимодействия с ДНК эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз. Сегодня, несомненно, сохраняет свою актуальность решение таких задач, как изучение генетической структуры и способов регуляции экспрессии генов систем РМ, получение рекомбинантных ферментов рестрикции-модификации, установление аминокислотных участков, вовлеченных в процессы связывания с сайтом узнавания на ДНК и катализа, а также выявление признаков эволюционного родства, как между отдельными группами ферментов, так и между микроорганизмами-хозяевами.

Проведенные в ходе данной работы исследования направлены именно на решение этих фундаментальных задач. Предметом настоящего исследования явилась новая система рестрикции-модификации Sse9I из бактериального штамма Sporosarcina species 9D. В ходе работы была охарактеризована эндонуклеаза рестрикции, узнающая последовательность ДНК 5'-ААТТ-3'. Изучение системы РМ Sse9I представляет интерес не только с точки зрения новизны, но и с эволюционной точки зрения, т.к. её сайт узнавания является внутренней частью последовательностей узнавания хорошо изученных систем рестрикции-модификации EcoRI (5'-GAATTC-3') и Muni (5'-CAATTG-3')

Гены ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции клонированы в E.coli, и выделены рекомбинантные ферменты. Определён порядок расположения генов в опероне системы РМ Sse9I. Проведён сравнительный анализ аминокислотных последовательностей M.Sse9I, R.Sse9I и C.Sse9I с последовательностями родственных белков. Оказалось, что несмотря на наличие всех консервативных мотивов, присущих тбА-метилтрансферазам, M.Sse9I наиболее гомологична метилазам, узнающим сайт 5'-CATG-3'. Тогда как M.EcoRI и M.MunI относятся к другим классам ДНК-метилтрансфераз. Анализ первичной структуры R.Sse9I, напротив, выявил крайне незначительный уровень гомологии аминокислотной последовательности в целом, но обнаружил существенное сходство с эндонуклеазами рестрикции Muni и EcoRI в пространственном расположении элементов вторичной структуры и локализации ключевых аминокислотных остатков, вовлеченных в специфичное узнавание сайта-мишени и катализ. Показана высокая гомология C.Sse9I с последовательностями контрольных белков систем РМ, а перед геном sse9IC, в районе предполагаемого промотора обнаружена последовательность, которая с большой вероятностью служит местом связывания С-белка.

Вся система рестрикции-модификации Sse9I кодируется тремя последовательно расположенными генами sse9IC-sse9IR-sse9IM. Подобное расположение генов в опероне не является необычным для систем рестрикции-модификации, но некоторые особенности организации оперона определённо представляют интерес. Во-первых, это наличие альтернативных старт-кодонов у генов sse9IC и sse9IR, присутствие которых может быть связано с регуляцией экспрессии гена эндонуклеазы рестрикции. Во-вторых, очень близкое расположение предполагаемого С-бокса к стартовому кодону гена, кодирующего С-белок. В-третьих, размер гена sse9IR (531 п.н.) оказался значительно меньше, чем у большинства генов эндонуклеаз рестрикции типа II, которые состоят примерно из 700-1500 п.н. Соответственно, и сам белок R.Sse9I (всего 176 аминокислотных остатков) является одним из самых маленьких среди эндонуклеаз рестрикции. В то же время тот факт, что аминокислотная последовательность R.Sse9I обладает наибольшим сходством с участками R.EcoRI и R.MunI, вовлеченными в процесс узнавания тетрануклеотида ААТТ, подтверждает существование общего механизма специфичного узнавания субстрата у ферментов данной группы.

Логическим продолжением данной работы будет, во-первых, клонирование обоих вариантов гена sse9IC, получение рекомбинантного белка C.Sse9I и подтверждение факта его связывания с С-боксом. Во-вторых, изучение влияния C.Sse9I на экспрессию генов sse9IR и sse9IM. В-третьих, несомненный интерес представляет получение рекомбинантной эндонуклеазы рестрикции Sse9I в кристаллическом виде и проведение её рентгено-структурного анализа, опираясь на данные по рестриктазам Muni и EcoRI.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гончар, Данила Александрович, Новосибирск

1. Абдурашитов М.А., Беличенко O.A., Шевченко A.B., Дегтярев С.Х. 1996. N.BstSE сайт-специфическая никаза из Bacillus stearothermophilus SE-589. Молекулярная биология. 30, 1261-1267.

2. Абдурашитов М.А., Охапкина С.С., Нетесова H.A., Голикова Л.Н., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. 2003. Уникальная система рестрикции-модификации Faul: клонирование и сравнительный анализ структуры белков. Молекулярная биология. 37, 619-624.

3. Белавин П.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. 1988. Метод определения эндонуклеаз рестрикции в колониях бактерий. Прикл. Биохим. Микробиол. 24,121-124.

4. Боринская С.А., Янковский Н.К. 1999. Структура прокариотических геномов. Молекулярная биология. 33, 941-957.

5. Воробьева О.В., Васильев С.А., Карягина A.C., Орецкая Т.С., Кубарева Е.А. 2000. Анализ контактов между ДНК и белком в комплексе метилтрансфераза &о11-промоторная область генов системы рестрикции-модификации ¿VöII. Молекулярная биология. 34, 174-180.

6. Дегтярев С.Х., Колыхалов A.A., Речкунова Н.И., Дедков B.C. 1989. Установление субстратной специфичности эндонуклеазы рестрикции Faul. Биоорг. химия. 15,130-132.

7. Дегтярев С.Х., Колыхалов A.A., Речкунова Н.И. и др. 1990. Bsil -новая необычная эндонуклеаза рестрикции. Молекулярная биология. 24, 244-247.

8. Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И. 1988. Определение чистоты препаратов эндонуклеаз рестрикции. Изв. Сиб. Отд. Акад. Наук СССР. 14,102-105.

9. Железная J1.A., Кайнов Д.Е., Юнусова А.К., Матвиенко Н.И. 2003. Регуляторный С-белок системы модификации-рестрикции EcoRV. Биохимия. 68, 125-132.

10. Краев А.С, Кравец А.Н., Чернов Б.К., Скрябин К.Г., Баев A.A. 1985. Система рестрикции-модификации EcoRV: гены, ферменты, синтетические субстраты. Молекулярная биология. 19, 278-284.

11. Льюин Б. 1987. Гены. М.: «Мир». 1-544.

12. Соловьев В.В., Кель А.Э., Рогозин И.Б., Колчанов H.A. 1988. Использование ЭВМ в молекулярной биологии. Учеб. Пособие. Новосиб. Унт. Новосибирск. 1-92.

13. Щелкунов С.Н. 1994. Генетическая инженерия: Учеб. пособие в 2 ч. Ч. 1. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та. 1-304.

14. Янулайтис А. 1989. Ферменты рестрикции модификации и их применение. Итоги науки и техники. Биотехнология. ВИНИТИ. 17, 1-203.

15. Ahmad I., Rao D.N. 1996. Chemistry and biology of DNA methyltransferases. CRCRev. Biochem. Mol. Biol. 31, 361-380.

16. Anderson J.E. 1993. Restriction endonucleases and modification methylases. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 24-30.

17. Aravind L., Makarova K.S., and Koonin E.V. 2000. Survey and summary: holliday junction resolvases and related nucleases: identification of new families, phyletic distribution and evolutionary trajectories. Nucleic Acids Res. 28, 34173432.

18. Arrand J.R., Myers P.A. 1978. A new restriction endonuclease from Streptomyces albus G.J. Mol. Biol. 118,127-135.

19. Beese L.S., and Steitz T.A. 1991. Structural basis for the 3'-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. EMBOJ. 10, 25-33.

20. Behrens В., Noyer-Weidner M., Pawlek В., Lauster R., Balganesh T.S., Trautner T.A. 1987. Organization of multispecific DNA methyltransferases encoded by temperate Bacillus subtilis phages. EMBO J. 6,1137-1142.

21. Bickle T.A., and Kriiger D.H. 1993. Biology of DNA restriction. Microbiol. Rev. 57,434-450.

22. Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W., Crosa J.H., Falkow S. 1977. Construction and characterization of new cloning vehicles. A multipurpose cloning system. Gene. 2,95.

23. Bujnicki J.M. 2000. Phylogeny of the restriction endonuclease-like superfamily inferred from comparison of protein structures. J. Mol. Evol. 50, 39-44.

24. Bujnicki J.M., Radlinska M., Zaleski P., Piekarowicz A. 2001. Cloning of the Haemophilus influenzae Dam methyltransferase and analysis of its relationship to the Dam methyltransferase encoded by the HP1 phage. Acta Biochim. Pol. 48, 969-983.

25. Bujnicki J.M., Rychlewski L., Radlinska M. 2001. Polyphyletic evolution of type II restriction enzymes revisited: two independent sources of second-hand folds revealed. Trends Biochem. Sci. 26, 9-11.

26. Calvin K., Blumenthal R.M. 1995. Characterization of pPvul, the autonomous plasmid from Proteus vulgaris that carries the genes of the PvuW restriction-modification system. Gene. 157,73-79.

27. Campbell J.L., Kleckner N. 1990. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979.

28. Carugo O., Argos P. 1997. NADP-dependent enzymes. II: Evolution of the mono- and dinucleotide binding domains. Proteins. 28,29-40.

29. Chambers S.P., Prior S.E., Barstow D.A., Minton N.P. 1998. The pMTLnic" cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing. Gene. 68,139-149.

30. Chang A.C.Y. and Cohen S.N. 1978. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the pl5A cryptic miniplasmid. J.Bacteriol. 134, 1141-1156.

31. Cheng X. 1995 (1). Structure and function of DNA methyltransferases. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 124, 293-318.

32. Cheng X. 1995 (2). DNA modification by methyltransferases. Curr. Opin. Struct. Biol. 5,4-10.

33. Cheng X., Kumar S., Posfai J., Pflugrath J.W., Roberts R.J. 1993. Crystal structure of the Hhäl DNA methyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionine. Cell. 74,299-307.

34. Dedkov V.S., Rechkunova N.I., Prihod'ko E.A., et al. 1995. CciNI, an isoschizomer of NotI from Curtobacterium citreum recognizes 5'-GC j Cocoes'. Gene. 157, 99-100.

35. Deibert M., Grazulis S., Janulaitis A., Siksnys V., Huber R. 1999. Crystal structure of Muni restriction endonuclease in complex with cognate DNA at 1. 7Ä resolution. EMBOJ., 18, 5805-5816.

36. Dryden D.T. Bacterial DNA Methyltransferases. 1999. In: S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases: structures and functions. Eds. Cheng X., Blumenthal R.M. Singapore: World Scientific. 283-340.

37. Dryden D.T., Murray N.E., Rao D.N. 2001. Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes. Nucleic Acids Res. 29, 3728-3741.

38. Dunn D.B., Smith J.D. 1955. Occurrence of a new base in the deoxyribonucleic acid of a strain of Bacterium coli. Nature. 175, 336-337.

39. Eberhard J., Oza J., Reich N.O. 2001. Cloning, sequence analysis and heterologous expression of the DNA adenine-(N(6)) methyltransferase from the human pathogen Actinobacillus actinomycetemcomitans. FEMS Microbiol. Lett. 195,223-229.

40. Feng D.-F., and Doolittle R.F. 1987. Progressive sequence alignments as a prerequisite to correct phylogenetic trees. J. Mol. Evol. 25, 351-360.

41. Fräser C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., Clayton R.A. et al. 1995. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science. 270, 397-403.

42. Galburt E.A., Chevalier B., Tang W., Jurica M.S., Flick K.E., Monnat R.J., Stoddard B.L. 1999. A novel endonuclease mechanism directly visualized for I-Ppol. Nature Struct. Biol. 6, 1096-1099.

43. Goldman S., Navon Y., Fish F. 1987. Phase variation in Bordetella pertussis is accompanied by changes in DNA modification. Microb. Pathog. 2, 327-338.

44. Gong W., O'Gara M., Blumenthal R.M., Cheng X. 1997. Structure of PvwII DNA-(cytosine N4) methyltransferase, an example of domain permutation and protein fold assignment. Nucleic Acids Res. 25,2702-2715.

45. Gowher H., Leismann O., Jeltsch A. 2000. DNA of Drosophila melanogaster contains 5-methylcytosine. EMBOJ. 19, 6918-6923.

46. Greene P.J., Poonian M.S. 1975. Restriction and modification of a self-complementary octanucleotide containing the EcoRI substrate. J. Mol. Biol. 99, 237-261.

47. Greene P.J., Gupta M., Boyer H. 1981. Sequence analysis of DNA encoding the EcoRl endonuclease and methylase. J. Biol. Chem. 256, 143-153.

48. Guyot J.B., Grassi J., Hahn U., Guschlbauer W. 1993. The role of the preserved sequences of Dam methylase. Nucleic Acids Res. 21,3183-3190.

49. Hadi S.M., Bachi B., Iida S., Bickle T.A. 1983. DNA restriction-modification enzymes of phage PI and plasmid pl5B. Subunit functions and structural homologies. J. Mol. Biol. 165,19-34.

50. Heidmann S., Seifert W., Kessler C., Domdey H. 1989. Cloning, characterization and heterologous expression of the Smal restriction-modification system. Nucleic Acids Res. 17, 9783-9796.

51. Heithoff D.M., Sinsheimer R.L., Low D.A., Mahan M.J. 1999. An essential role for DNA adenine methylation in bacterial virulence. Science. 284, 967-970.

52. Heitman J. 1992. How the EcoRI endonuclease recognizes and cleaves DNA. BioEssays. 14,445-454.

53. Heitman J. 1993. On the origins, structures and functions of restriction-modification enzymes. Genet. Eng. 15,57-108.

54. Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li B.C., Herrman R., et al. 1996. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae. Nucleic Acids Res. 24,4420-4449.

55. Horton J.R., and Cheng X. 2000. PvuII endonuclease contains two calcium ions in active sites. J. Mol. Biol. 300,1049-1056.

56. Horton J.R., Blumenthal R.M., Cheng X. 2004. Restriction endonucleases: structure of the conserved catalytic core and the role of metal ions in DNA cleavage. In: Restriction Endonucleases. Pingoud A. (ed.). Springer. Berlin, pp. 361-392.

57. Horton N.C., and Perona J.J. 2004. DNA cleavage by EcoRV endonuclease: two metal ions in three metal ion binding sites. Biochemistry. 43, 6841-6857.

58. Hotchkiss R.D. 1948. The quantitative separation of pureness, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. J. Biol. Chem. 168,315-332.

59. Huai Q., Colandene J.D., Chen Y., Luo F., Zhao Y., Topai M.D., Ke H. 2000. Crystal structure of Nael an evolutionary bridge between DNA endonuclease and topoisomerase. EMBOJ. 19,3110-3118.

60. Hubbard T.J.P., Murzin A.G., Brenner S.E., Chothia C. 1997. SCOP: a structural classification of proteins database. Nucleic Acids Res. 25,236-239.

61. Ives C.L., Nathan P.D., and Brooks J.E. 1992. Regulation of the BamHI restriction-modification system by a small intergenic open reading frame, bamHIC, in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 174, 7194-7201.

62. Janosi L., Yonemitsu H., Hong H., Kaji A. 1994. Molecular cloning and expression of a novel hydroxymethylcytosine- specific restriction enzyme (PvwRtslI) modulated by glucosylation of DNA. J. Mol. Biol. 242, 45-61.

63. Janulaitis A., Klimasauskas S., Petrusyte M., Butkus V. 1983. Cytosine modification in DNA by Bcnl methylase yields N4-methylcytosine. FEBS Lett. 161,131-134.

64. Janulaitis A., Petrusyte M., Maneliene Z., Klimasauskas S., Butkus V. 1992. Purification and properties of the Eco51\ restriction endonuclease and methylase-prototypes of a new class (type IV). Nucleic Acids Res. 20, 6043-6049.

65. Janulaitis A., Vaisvila R., Timinskas A., Klimasauskas S., Butkus V. 1992. Cloning and sequence analysis of the genes coding for Eco51\ type IV restriction-modification enzymes. Nucleic Acids Res. 20,6051-6056.

66. Jeltsch A. 1994. Die restriktionsendonuklease EcoRI: Untersuchungen zur evolution, linearen diffusion, DNA-erkennung und zum mechanismus der DNAspaltung. Doctoral thesis. Universität Hannover, Germany.

67. Jeltsch A., Alves J., Maass G., Pingoud A. 1992. Hypothesis on the catalytic mechanism of EcoRI and EcoRV. FEBS Lett. 314,4-8.

68. Jeltsch A., Alves J., Wolfes H., Maass G., Pingoud A. 1993. Substrate-assisted catalysis in the cleavage of DNA by the EcoRI and EcoRV restriction enzymes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90, 8499-8503.

69. Jeltsch A., Alves J., Wolfes H., Maass G., Pingoud A. 1994. Pausing of the restriction endonuclease EcoRI during linear diffusion on DNA. Biochemistry. 33, 10215-10219.

70. Jeltsch A., Kröger M., and Pingoud A. 1995. Evidence for an evolutionary relationship among type-II restriction endonucleases. Gene. 160, 7-16.

71. Jeltsch A., and Pingoud A. 1998. Kinetic characterization of linear diffusion of the restriction endonuclease EcoRV on DNA. Biochemistry. 37,2160-2169.

72. Jeltsch A., Pleckaityte M., Selent U., Wolfes H., Siksnys V., Pingoud A. 1995. Evidence for substrate-assisted catalysis in the DNA cleavage of several restriction endonucleases. Gene. 157,157-162.

73. Johnson M.S., Sutcliffe M.J., Blundell T.L. 1990. Molecular anatomy: Phyletic relationships derived from three-dimensional structures of proteins./. Mol. Evol. 30,43-59.

74. Kan N.C., Lautenberger J.A., Edgell M.H., Hutchison C.A. 1979. The nucleotide sequence recognized by the Escherichia coli Kl2 restriction and modification enzymes./. Mol. Biol. 130,191-209.

75. Kelleher J. and Raleigh E.A. 1991. A normal activity in Escherichia coli K12 that directs restriction of DNA modified at CG dinucleotides. J. Bacteriol. 173, 5220-5223.

76. King G., Murray N.E. 1994. Restriction enzymes in cells, not eppendorfs. Trends Microbiol. 2,465-469.

77. Kita K., Kotani H., Sugisaki H., Takanami M. 1989. The Fokl restriction-modification system. I. Organization and nucleotide sequences of the restriction and modification genes. J. Biol. Chem. 264, 5751-5756.

78. Kita K., Suisha M., Kotani H., Yanase H., Kato N. 1992. Cloning and sequence analysis of the StsI restriction-modification gene: presence of homology to Fokl restriction-modification enzymes. Nucleic Acids Res. 20,4167-4172.

79. Klimasauskas S., Kumar S., Roberts R.J. and Cheng X. 1994. Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix. Cell. 76,357-369.

80. Klimasauskas S., Timinskas A., Menkevicius S., Butkiene D., Butkus V., Janulaitis A. 1990. Sequence motifs characteristic of DNA cytosine-N4. methyltransferases: similarity to adenine and cytosine-C5 DNA-methylases. Exp.Biol. 1,4-12.

81. Knowle D., Lintner R.E., Tourna Y.M., and Blumenthal R.M. 2005. Nature of the promoter activated by C.PvuII, an unusual regulatory protein conserved among restriction-modification systems. J. Bacteriol. 187,488-497.

82. Korona R., Korona B., Levin B.R. 1993. Sensitivity of naturally occurring coliphages to type I and type II restriction and modification. J. Gen. Microbiol. 139,1283-1290.

83. Kossykh V.G., Schlagman S.L., Hattman S. 1993. Conserved sequence motif DPPY in region IV of the phage T4 Dam DNA-N6-adenine.-methyltransferase is important for S-adenosyl-L-methionine binding. Nucleic Acids Res. 21,4659-4662.

84. Kossykh V.G., Schlagman S.L. and Hattman S.M. 1995. Phage T4 DNA N6-adenine.-methyltransferase. Overexpression, purification, and characterization. J. Biol. Chem. 270,14389-14393.

85. Kovall R.A., and Matthews B.W. 1998. Structural, functional and evolutionary relationships between lambda-exonuclease and the type II restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 7893-7897.

86. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Sha M., Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. 1994. The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res. 22,1-10.

87. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

88. Lambert C, Leonard N, De Bolle X, Depiereux E. 2002. ESyPred3D: Prediction of proteins 3D structures. Bioinformatics. 18, 1250-1256.

89. Lauster R., Trautner T.A., and Noyer-Weidner M. 1989. Cytosine-specific type II DNA-methyltransferases: a conserved enzyme core with variable target-recognizing domains. J. Mol. Biol. 206, 305-312.

90. Lindroth A.M., Cao X., Jackson J.P., Zilberman D., McCallum C.M., Henikoff S., Jacobsen S.E. 2001. Requirement of CHROMOMETHYLASE3 for maintenance of CpXpG methylation. Science. 292,2077-2080.

91. Lu M., Campbell J.L., Boye E., Kleckner N. 1994. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E.coli. Cell. 77,413-426.

92. Lukacs C.M., and Aggarwal A.K. 2001. Bglll and Muni: what a difference a base makes. Curr. Opin. Struct. Biol. 11,14-18.

93. Lukacs C.M., Kucera R., Schildkraut I., Aggarwal A.K. 2000. Understanding the immutability of restriction enzymes: crystal structure of Bglll and its DNA substrate at 1.5 À resolution. Nat. Struct. Biol. 7, 134-140.

94. Lunnen K.D., Barsomian J.M., Camp R.R. 1988. Cloning type-II restriction and modification genes. Gene. 74,25-32.

95. Malone T., Blumenthal R.M., Cheng X. 1995. Structure, guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyl-transferases and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. J. Mol. Biol. 253, 618-632.

96. Martin A.M., Sam M.D., Reich N.O., Perona J.J. 1999. Structural and energetic origins of indirect readout in site-specific DNA cleavage by a restriction endonuclease. Nature Struct. Biol. 6,269-277.

97. May B.J., Zhang Q., Li L.L., Paustian M.L., Whittam T.S., Kapur V. 2001. Complete genomic sequence of Pasteurella multocida, Pm70. Proc. Natl. Acad. Set U.S.A. 98, 3460-3465.

98. McClarin J.A., Frederick C.A., Wang B.C., Greene P., Boyer H.W., Grable J., Rosenberg J.M. 1986. Structure of the DNA-EcoRI endonuclease recognition complex at 3 Â resolution. Science. 234, 1526-1541.

99. McGeehan J.E., Streeter S.D., Papapanagiotou I., Fox G.C., and Kneale G.G. 2005. High-resolution crystal structure of the restriction-modification controller protein C.Ahdl from Aeromonas hydrophila. J. Mol. Biol. 346, 689-701.

100. Meisel A., Bickle T.A., Kruger D.H., Schroeder C. 1992. Type-Ill restriction enzymes need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage. Nature. 355,467-469.

101. Meisel A., Mackeldanz P., Bickle T.A., Kruger D.H., Schroeder C. 1995. Type III restriction endonucleases translocate DNA in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis. EMBOJ. 14,2958-2966.

102. Miner Z., Hattman S. 1988. Molecular cloning, sequencing, and mapping of the bacteriophage T2 dam gene. J. Bacteriol. 170,5177-5184.

103. Modrich P. 1989. Methyl-directed DNA mismatch correction. J. Biol. Chem. 264, 6597-6600.

104. Naito T., Kusano K., Kobayashi I. 1995. Selfish behavior of restriction-modification systems. Science. 267, 897-899.

105. Neidle S. 1994. DNA structure and recognition. IRL Press, New York.

106. Nelson M., Christ C., Schildkraut I. 1984. Alteration of apparent restriction endonuclease recognition specificities by DNA methylases. Nucleic Acids Res. 12, 5165-5173.

107. New England Biolabs Catalog. 1995. New England Biolabs, Inc. 32 Tozer Road Beverly, MA 01915-5599, USA. P. 8.

108. New England Biolabs Catalog. 2005-2006. New England Biolabs, Inc. 32 Tozer Road Beverly, MA 01915-5599, USA. P. 230-247.

109. Newman A.K., Rubin R.A., Kim S.H., Modrich P. 1981. DNA sequences of structural genes for EcoRI DNA restriction and modified enzymes. J. Biol. Chem. 256,2131-2139.

110. Newman M., Strzelecka T., Dorner L.F., Schildkraut I., Aggarwal A.K. 1994. Structure of restriction endonuclease BamHI and its relationship to EcoRI. Nature. 368, 660-664.

111. Nikolajeva S., Beyer A., Friedel M., Hollunder J., Wilhelm T. 2005. Common patterns in type II restriction enzyme binding sites. Nucleic Acids Res. 33, 27262733.

112. O'Gara M., McCloy K., Malone T., Cheng X. 1995. Structure-based alignment of three AdoMet-dependent methyltransferases. Gene. 157,135-138.

113. Pearson W.R., Lipman D.J. 1988. Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 85,2444-2448.

114. Pingoud A., Jeltsch A. 1997. Recognition and cleavage by type-II restriction endonucleases. Eur. J. Biochem. 246, 1-22.

115. Pingoud A., Jeltsch A. 2001. Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res. 29, 3705-3727.

116. Pingoud A., Fuxreiter M., Pingoud V., Wende W. 2005. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cell. Mol. Life Sci. 62,685-707.

117. Pingoud V., Sudina A., Geyer H., Bujnicki J.M., Lurz R., Lûder G., Morgan R., Kubareva E., Pingoud A. 2005. Specificity changes in the evolution of Type II restriction endonucleases. J. Biol. Chem. 280,4289-4298.

118. Polaczek P., Kwan K., Liberies D.A., Campbell J.L. 1997. Role of architectural elements in combinatorial regulation of initiation of DNA replication in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 26, 261-275.

119. Raleigh E.A. and Wilson G. 1986. Escherichia coli K-12 restricts DNA containing 5-methylcytosine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 9070-9074.

120. Ramalingam R., Prasad R., Shivapriya R., Dharmalingam K. 1992. Molecular cloning and sequencing of mcrA locus and identification of McrA protein in Escherichia coli. J. Biosci. 17, 217-232.

121. Reinisch K.M., Chen L., Verdine G.L., Lipscomb, W.N. 1995. The crystal structure of HaeIII methyltransferase covalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell. 82, 143-153.

122. Revel H.R. 1967. Restriction of nonglucosylated T-even bacteriophage: properties of permissive mutants of Escherichia coli B and K12. Virology. 31, 688701.

123. Roberts R.J. 1978. Restriction and modification enzymes and their recognition sequences. Gene. 4,183-193.

124. Roberts R.J., Belfort M., Bestor T. et al. 2003. A nomenclature for restriction enzymes, DNA-methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res. 31,1805-1812.

125. Roberts R.J., Halford S.E. 1993. Type II restriction endonucleases. In: Nucleases, 2nd edn., ed. Linn S.M., Lloyd R.S., Roberts R.J. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. 35-88.

126. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J. and Macelis D. 2003. REBASE: restriction enzymes and methyltransferases. Nucleic Acids Res. 31, 418-420.

127. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J. and Macelis D. 2005. REBASE restriction enzymes and DNA methyltransferases. Nucleic Acids Res. 33, D230-D232.

128. Robinson C.R., Sligar S.G. 1998. Changes in solvation during DNA binding and cleavage are critical to altered specificity of the EcoRJ endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95,2186-2191.

129. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

130. Sapranauskas R., Sasnauskas G., Lagunavicius A., Vilkaitis G., Lubys A., Siksnys V. 2000. Novel subtype of type lis restriction enzymes. J. Biol. Chem. 275,30878-30885.

131. Seeber S., Kessler C., and Gotz F. 1990. Cloning, expression and characterization of the Sau3AI restriction and modification genes in Staphylococcus carnosus TM300. Gene. 94, 37-43.

132. Shields S.L., Burbank D.E., Grabherr R., Van Etten J.L. 1990. Cloning and sequencing the cytosine methyltransferase gene M.CviJI from Chlorella virus IL-3A. Virology. 176, 16-24.

133. Schluckebier G., Labahn J., Granzin J., Schildkraut I. and Saenger W. 1995. A model for DNA binding and enzyme action derived from crystallographic studies of the Taql N6-adenine-methyltransferase. Gene. 157,131-134.

134. Schluckebier G., O'Gara M., Saenger W., Cheng X. 1995. Universal catalytic domain structure of AdoMet-dependent methyltransferases. J. Mol. Biol. 247, 1620.

135. Siebert P.D., Chenchik A., Kellog D.E., Lukyanov K.A. 1995. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res. 23, 10871088.

136. Siksnys V., Skirgaila R., Sasnauskas G., Urbanke C., Cherny D., Grazulis S., Huber R. 1999. The CfrlOI restriction enzyme is functional as a tetramer. J. Mol. Biol. 291, 1105-1118.

137. Siksnys V., Timinskas A., Klimasauskas S., Butkus V., Janulaitis A. 1995. Sequence similarity among type-II restriction endonucleases, related by their recognized 6-bp target and tetranucleotide-overhang cleavage. Gene. 157, 311-314.

138. Siksnys V., Zareckaja N., Vaisvila R., Timinskas A., Stakenas P., Butkus V., Janulaitis A. 1994. CAATTG-specific restriction-modification muni genes from Mycoplasma: sequence similarities between R.MunI and R.EcoRI. Gene. 142,1-8.

139. Simoncsits A., Tjôrnhammar M.L., Raskô T., Kiss A., Pongor S. 2001. Covalent joining of the subunits of a homodimeric type II restriction endonuclease: single-chain PvuII endonuclease. J. Mol. Biol. 309, 89-97.

140. Smith H.O., Annau T.M., Chandrasegaran S. 1990. Finding sequence motifs in groups of functionally related proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 826-830.

141. Smith C.L., Klco S.R. and Cantor C.R. 1987. In: Davies K. (ed.). Genome Analysis: A Practical Approach. IRL Press. Oxford. UK.

142. Smith H.O. and Nathans D. 1973. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. J. Mol. Biol. 81,419423.

143. Smith M.A., Read C.M., Kneale G.G. 2001. Domain structure and subunit interactions in the type I DNA methyltransferase M.EcoR\2A\. J. Mol. Biol. 314, 41-50.

144. Sohail A., Ives C.L., Brooks J.E. 1995. Purification and characterization of C.BamHI, a regulator of the BamHI restriction-modification system. Gene. 157, 227-228.

145. Stahl F., Wende W., Jeltsch A., Pingoud A. 1996. Introduction of asymmetry in the naturally symmetric restriction endonuclease EcoRV to investigateintersubunit communication in the homodimeric protein. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93, 6175-6180.

146. Stefan C., Xia Y., Van Etten J.L. 1991. Molecular cloning and characterization of the gene encoding the adenine methyltransferase M.CviRI from Chlorella virus XZ-6E. Nucleic Acids Res. 19,307-311.

147. Sternberg N., Coulby J. 1990. Cleavage of the bacteriophage PI packaging site (pac) is regulated by adenine methylation. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87, 8070-8074.

148. Stewart F.J., Raleigh E.A. 1998. Dependence of McrBC cleavage on distance between recognition elements. Biol. Chem. 319, 611-616.

149. Stewart F.J., Panne D., Bickle T.A. and Raleigh E.A. 2000. Methyl-specific DNA binding by McrBC, a modification-dependent restriction enzyme. J. Mol. Biol. 298,611-622.

150. Stöver T., Köhler E., Fagin U., Wende W., Wolfes H., Pingoud A. 1993. Determination of the DNA bend angle induced by the restriction endonuclease EcoRV in the presence of Mg2+. J. Biol. Chem. 268, 8645-8650.

151. Studier F. W., Bandyopadhyay P.K. 1988. Model for how type I restriction enzymes select cleavage sites in DNA. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 85,4677-4681.

152. Sugisaki H., Kita K., Takanami M. 1989. The Fok\ restriction modification system II. Presence of two domains in Fokl methylase responsible for modification of different DNA strands. J. Biol. Chem. 264,5757-5761.

153. Tao T., and Blumenthal R.M. 1992. Sequence and characterization ofpvuIIR, the PvuII endonuclease gene, and oipvuIIC, its regulatory gene. J. Bacteriol. 174, 3395-3398.

154. Tao T., Bourne J.C., Blumenthal R.M. 1991. A family of regulatory genes associated with type II restriction- modification systems. J. Bacteriol. 173, 13671375.

155. Taylor J.D., Badcoe I.G., Clarke A.R., Haiford S.E. 1991. EcoRV restriction endonuclease binds all DNA sequences with equal affinity. Biochemistry. 30, 8743-8753.

156. Thielking V., Selent U., Köhler E., Landgraf Z., Wolfes H., Alves J., Pingoud A. 1992. Mg2+ confers DNA binding specificity to the EcoRV restriction endonuclease. Biochemistry. 31, 3727-3732.

157. Timinskas A., Butkus V., Janulaitis A. 1995. Sequence motifs characteristic for DNA cytosine-N4. and DNA [adenine-N6] methyltransferases. Classification of all DNA methyltransferases. Gene. 157,3-11.

158. Tomb J.F., White 0., Kerlavage A.R., Clayton R.A., Sutton G.G. et al. 1997. The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature. 388, 539-547.

159. Torreblanca J., Casadesus J. 1996. DNA adenine methylase mutants of Salmonella typhimurium and a novel dam- regulated locus. Genetics. 144, 15-26.

160. Tran P.H., Korszun Z.R., Cerritelli S., Springhorn S.S., Lacks S.A. 1998. Crystal structure of the DpnM DNA adenine methyltransferase from the Dpnll restriction system of Streptococcus pneumoniae bound to S-adenosylmethionine. Structure. 6, 1563-1575.

161. Van Etten J.L., Xia Y., Burbank D.E. 1989. Viruses infecting a eukaryotic green alga are a new source of DNA methyltransferases and DNA site-specific endonucleases. J. Cell Biochem. Suppl. 0, 199.

162. Venclovas C., Timinskas A., Siksnys V. 1994. Five-stranded ß-sheet sandwiched with two a-helices: a structural link between restriction endonucleases EcoRI and EcoRV. Proteins. 20, 279-282.

163. Vertino P.M. Eukaryotic DNA Methyltransferases. 1999. In: S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases: structures and functions. Eds. Cheng X., Blumenthal R.M. Singapore: World Scientific, 341-372.

164. Vijesurier R.M., Carlock L., Blumenthal R.M., Dunbar J.C. 2000. Role and mechanism of action of C.PvuII, a regulatory protein conserved among restriction-modification systems. J. Bacteriol. 182,477-487.

165. Wah D.A., Hirsch J.A., Dorner L.F., Schildkraut I., Aggarwal A.K. 1997. Structure of the multimodular endonuclease Fokl bound to DNA. Nature. 388, 97100.

166. Wah D.A., Bitinaite J., Schildkraut I., Aggarwal A.K. 1998. Structure of Fokl has implications for DNA cleavage. Proc. Natl Acad. Sei. USA. 95,10564-10569.

167. Wahnon D.C., Shier V.K., Benkovic S.J. 2001. Mechanism-based inhibition of an essential bacterial adenine DNA methyltransferase: rationally designed antibiotics. J. Am. Chem. Soc. 123,976-977.

168. Waite-Rees P.A., Keating C.J., Moran L.S., Slatko B.E., et al. 1991. Characterization and expression of the Escherichia coli Mrr restriction system. J. Bacteriol. 173, 5207-5219.

169. Walsh C.P., Chaillet J.R., Bestor T.H. 1998. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosine methylation. Nat. Genet. 20,116-117.

170. Webb J.L., King G., Ternent D., Titheradge A.J., Murray N.E. 1996. Restriction by EcoYA is enhanced by co-operative interactions between target sequences and is dependent on DEAD box motifs. EMBOJ. 15,2003-2009.

171. Wenner J.R., and Bloomfield V.A. 1999. Buffer effects on EcoRV kinetics as measured by fluorescent staining and digital imaging of plasmid cleavage. Anal. Biochem. 268,201-212.

172. Willcock D.F., Dryden D.T., Murray N.E. 1994. A mutational analysis of the two motifs common to adenine methyl transferases. EMBOJ. 13,3902-3908.

173. Wilson G.G. 1992. Amino acid sequence arrangements of DNA-methyltransferases. Methods Enzymol. 216,259-279.

174. Wilson G.G., and Murray N.E. 1991. Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet. 25, 585-627.

175. Windolph S., and Alves J. 1997. Influence of divalent cations on inner-arm mutants of restriction endonuclease EcoRI. Eur. J. Biochem. 244,134-139.

176. Winkler F.K. 1992. Structure and function of restriction endonucleases. Curr. Opin. Struct. Biol. 2,93-99.

177. Wintjens R., and Rooman M. 1996. Structural classification of HTH DNA binding domains and protein-DNA interaction modes. J. Mol. Biol. 262,294-313.

178. Xia Y., Burbank D., Uher L. et al. 1987. IL-3A virus infection of Chlorella-like green alba induces a DNA-restriction endonuclease with novel sequence specifity. Nucleic Acids Res. 15, 1063.

179. Yoder J.A., Walsh C.P., Bestor T.H. 1997. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet. 13,335-340.

180. Yuan R. 1981. Structure and mechanism of multifunctional restriction endonucleases. Annu. Rev. Biochem. 50,285-315.

181. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene. 33,103-119.

182. Zhang J. and Madden T.L. 1997. PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. Genome Res. 7,649-656.

183. Zabarovsky E.R., Allikmets R.L. 1986. An improved technique for the efficient construction of gene libraries by partial filling-in of cohesive ends. Gene. 42,119-123.