АНАЛИЗ ЛОКУСОВ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТА К ФУЗАРИОЗУ И ВЕРТИЦИЛЛЕЗУ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДНК МАРКЕРОВ

Куклев, Михаил Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
АНАЛИЗ ЛОКУСОВ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТА К ФУЗАРИОЗУ И ВЕРТИЦИЛЛЕЗУ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДНК МАРКЕРОВ
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "АНАЛИЗ ЛОКУСОВ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТА К ФУЗАРИОЗУ И ВЕРТИЦИЛЛЕЗУ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДНК МАРКЕРОВ"

^На правах рукописи

КУКЛЕВ Михаил Юрьевич

АНАЛИЗ ЛОКУСОВ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТА К ФУЗАРИОЗУ И ВЕРТИЦИЛЛЕЗУ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДНК МАРКЕРОВ

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена в Центре молекутярной биотехнологии и на кафедре Сельскохозяйственной биотехнологии Российского государственного аграрного университета — МСХА имени К А Тимирязева

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Г И Карлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ф С Джалилов доктор биологических наук А Н Игнатов

Ведущая организация:

ВНИИ сеіьскохозяйственной биотехнологии РАСХН

диссертационного совета Д 220 043 10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, ут Тимирязевская, д 49

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

Защита состоится

мая 2007 г в

часов на заседании

Автореферат разослан «'*- »_<

и размещен на сайте университета птасасі ги

Ученый секретарь диссертационного совета

Е А Калашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одними из самых распространенных и вредоносных заболеваний на томате и других сельскохозяйственных культурах являются фузариозное и вертициллезное увядания. Потери урожая от данных заболеваний могут достигать 30%, а в случае тепличных условий выращивания - до 50% и более (Jurriaan J. Mes, 1999; Watterson, 1986; Cirulli 1981). Поэтому создание сортов томата, устойчивых к данным заболеваниям, является одной из приоритетных задач селекции.

До недавнего времени в селекции сельскохозяйственных культур на устойчивость к болезням и вредителям использовались морфологические маркеры. Они могли проявляться на различных этапах развития растений, идентифицироваться визуально или в результате биохимических исследований. Традиционные методы селекции на устойчивость требуют создания инфекционных фонов и трудоемкую оценку каждого образца. Проведение таких работ связано со значительными затратами труда и времени. Селекционный г.роцесс для однолетних культур затягивался на 10-20 лет. Применение молекулярных маркеров ускоряет и удешевляет селекционный процесс.

В 1990-х годах начало бурно развиваться новое направление в селекции -селекция, основанная на молекулярных маркерах (MAS - marker assisted selection). В 1998 году Kawchuk с соавторами предложили SCAR-маркер, тесно гцепленный с геном устойчивости томата к вертициллезу (Kawchuk et al., 1998). А в 2007 году Фесенко И.А с соавторами сообщили о создании CAPS-маркера на ген устойчивости томата к фузариозу (Фесенко И.А. и др., 2007). Использование ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому. Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются ге, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов устойчивости. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре локусов генов устойчивости у устойчивых и чувствительных к фитопатогену генотипов.

Сравнительный анализ и изучение организации кластеров и локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов в пределах одного вида проливает свет на эволюцию формирования устойчивости к различным фитопатогенам. Информация о структуре локусов у неустойчивых форм растений, аналогичных таковым у устойчивых генотипов, дополнит наши знания о строении и функциях доменов, свойственных генам устойчивости.

Цели и задачи работы. Целью работы являлся сравнительный анализ локусов генов устойчивости томата к фузариозу и вертициллзу у устойчивых и неустойчивых форм томатов. В соответствии с целью работы были поставлены

следующие задачи: . __

1. Создать библиотеку последовательностей ДНК локусов' - (кластеров) устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу? м с ни К. А. Тимирязева

ЦНБ имени Н.И. Жслсзнова Фонд на

2 Провести сравнительный анализ организации кластеров у устойчивых и неустойчивых форм растений,

3 Разработать эффективные системы маркирования генов устойчивости

На\чная новизна. Впервые проведен анализ нуклеотидных постедоватетьностей генов, входящих в состав токусов 12 и Ve, у неустойчивых к фузариозу и вертицилтезу форм томатов Проведено сравнение структуры вышеуказанных локусов у устойчивых и неустойчивых форм томата

Показано, что в токусе, аналогичном iokvcy 12 S pimpinelhjolmm, у S esculentum присутствуют, по меньшей мере, два гена-гомоадга, причем один из них уникален по своей структуре

В токусе Ve у HevcTOH4HBbix генотипов томата показано присутствие нуклеотидных последовательностей, имеющих высокую степень гомологии к ранее клонированным Kawchuk с соавторами (2001) генам устойчивсоти Ve1 и Ve2 Выявлен полиморфизм по данному локусу между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата На основании данного почиморфизма создан кодоминантный CAPS-маркер

Основываясь на нуклеотидных постедоватечьностях региона, гесно сцепленного с локусом Ve (Kawchuk et al, 1999), создан удобный в применении при массовом анализе сетекционного материала на устойчивость к вертицилтезу кодоминантный SCAR-маркер На основании полиморфизма в данном регионе был синтезирован флуоресцентный зонд, позвотяюший быстро выявлять в селекционном материале растения, несущие доминантный алтель гена устойчивости к вертициллезу, с помощью ПЦР в реальном времени или детекции флуоресценции по конечной точке (end-point detection)

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на 4-й международной Российско-Иранской конференции «Сетьокое хозяйство и природные ресурсы», 2004, на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», 2005

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на

_ страницах машинописного текста и включает _ рисунок Диссертация

состоит из раздетое «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Закточение», «Выводы» и «Список литературы» Список цитируемой литературы включает наименований, из них_иностранных

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАИЯ

Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал сорта и гибриды F1 томата DRW Moneymaker, Белый налив, Amparo, Indiko, Метана, Durason, Pitenza Также бьпи использованы образцы из селекционной линии ИС-3, расщепляющейся по прклнак\

устойчивости к 1 вертициллезу (Селекционно-овощная станция им. H.H. Тимофеева РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева).

Растительный материал выращивали в пленочной теплице. Семена проращивали в чашках Петри при температуре 24°С.

Выделение ДНК. ДНК выделяли из молодых листьев по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями.

ПЦР-анализ. Для изучения структуры локусов 12 и Ve у устойчивых и неустойчивых генотипов томата использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

На основании данных о нуклеотидной последовательности генов-гомологов, входящих в состав локуса 12 устойчивых генотипов томата, были синтезированы следующие праймеры:

LR1 : ACT СТА CAA АТС TGG ААТ TTC СТТ LR2: AAA TTC TAG TAG TGG TGT GA VI27: TGG AAC AAT GTC GGC ACT TAT CTT VU127: CAA CCA CAT TTT CCA ACT TCA CAA Cl : CCT CCT TTT СТС АСС TCA СТТ CGC С2: ATT TGT GGC CAG TAT ТСС CC FG1: 5' ATG GAG ATT GGC TTA GCA GTT GGT 3' LF127: 5' TCG TTG TAA TTT TCA TTC CAC АСА 3' LF79: 5'CAT TTC TCA ATT CAT CCC ACT CGT 3' LF78: 5' TCA TTC CAC ACG TCA TCA AGG АСА 3' F7 : 5' CAG TTG TGA AGT TGG AAA ATG TGG 3' FU7: 5' CAA TTT CAA TTT TGG GCA ACG AGA 3' L79 : 5'ATT TAG GCA АСС AAT TCT TTC TCG 3' LU79: 5' TGG GCG TAG СТС АТС AAG TAT GTA 3' M78: S' TCT TGT TGT CCT TGA TGA CGT GTG 3' MU78: 5' СТА TTG AAT AGG ACA TGT GCC GAC 3' U127 S'GTT GAG GAC ATT GCT ТСС GAT ACG UN127 5' AAC AAC TGG АСА АТС ACT AAC TTC U78 5'ACT CGA TAA AGT ATT GGT TAC CCG UN78 5* TCA GCT ACA AGT CAA ATT GAA GGC UP78 5' TGT ATT GAT TAT ATG GTA GGC CCC

Для исследования локуса Ve у неустойчивых форм томата использовали следующие праймеры:

VF 5' AGC TTA TTC ATT CCA CCC A 3' VR 5' CTG AAT AGC AAG АСА ACG TGG С 3' WF1 5' TTG GCA AAA TGG AAC GAC ATG АСА 3' WR1 5' GAG CCC AGG GTC AAT GTA GTC AAG 3' WF2 У GAC TAC ATT GAC CCT GGG CTC TTG 3' WR2 5' TGA GAG CAC CTT AAG CCT TTC AAT 3'

Для проведения ПЦР в реальном времени использовался флуоресцентно меченый зонд, синтезированный на основе нуклеотидной последовательности, тесно сцепленной с геном Ve.

F AM 5 ' GAT ATA ATA TCG GAG AAG GTA TAT CBHQ1 Все праймеры и зонды синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва). Амплификацию проводили на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва) и «DNA Engine Tetrad 2» (Bio-Rad, USA). Детекция флуоресценции осуществлялась на приборе «Джин» с программным обеспечением фирмы изготовителя («ДНК-технология», Москва).

Продукты ПЦР разделяли в 1 агаролном re те с буфером ГВЕ при напряженности поля 6 V/cm В качестве маркера размеров использовали «100 bp leader» (Fermentas)

Кюнированне ПНР-продуктов Клонирование ПЦР-продуктов проводит с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Svstems (Promega USA) в соответствии с инструкцией, предтаженной производителем

Анализ нуклеотидных последовательностей. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помошью программных пакетов GeneDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utilitv Ver 2 6 002 Copyright^ b\ К Nicholas) Clone manager 6 version 6 00 (Sei Ed Central) Поиск гомо югичных последовательностей и их анализ проводи™ в открытых базах генетических данных GenBank (http www nebí nlm nih gov) Sol Genomic Network (http www ьцп comell edu aboutnotrato proiect) EMBL-EBI

(http / www ebi ac uk)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Анализ юкуса 12 у устойчивых h неустойчивых генотнпов томата 1 1 ПЦР-анализ локуса [2 Дли сравнительного анализа локуса 12 у устоичивых и неустойчивых к фу кариозу генотипов томата бы ли использованы два праймера CP78 и LF79 Праймеры были синтезированы на основании нуклеотидной последовательности ранее клонированного гена Í2C-2 (On N et al, 1497) При проведении ПЦР с данными праймерами сингешров&лись ПЦР продукты размером около 1100 пн Причем фрагменты одинакового размера синтезировались как на устойчивых, так и на неустойчивых генотипах

Для выявления полиморфизма между устойчивыми и неустоичивыуш к фу ¡apnoiv генотипами гомата амп гакон был обработан ретриктазауш При гидролизе ПЦР-продукта рестриктазой -Joe / были выявлены отличия у1ежду устойчивыми и неустойчивыми генотипами (рис 1 )

Рис 1 Продукты ПЦР полученные с праимерами LP78 LF74 обраооганные рестриктазои íce / ( 1 \,_тоичивыщочолигогныи гибрид DRW 2 неустойчивый сорт

Vlonvemake-)

При анализе рестрикционной картины было выявлено, что сумма размеров рестрикционных фрагментов у устойчивого генотипа значительно превышает размер ПЦР-продукта до рестрикции. Нами было сделано предположение, что с помощью данной пары праймеров синтезируются ПЦР-продукты с нескольких генов-гомологов, входящих в состав кластера 12, и каждый из них имеет свои сайты рестрикции для рестриктазы Асс I. Важно отметить, что структура локуса 12 у устойчивых генотипов достаточно хорошо изучена, и данный локус перенесен в S.esculentum из дикого вида S. pimpinellifolium (Segal et al., 1992, Orí N. et al., 1997, Simons et al., 1998, Sela-Buurlage et al. 2001, Couch, 2006). С другой стороны, структура аналогичного локуса у S.esculentum не изучена и остается неизвестным какие гены-гомологи входят в его состав у неустойчивых генотипов.

1.2. Клонирование и анализ ПЦР продуктов, полученных с устойчивого и неустойчивого генотипов. Для дальнейшего анализа амплифицированных последовательностей проводилось их клонирование.

После обработки ПЦР-продуктов, полученных с клонов устойчивого генотипа, рестриктазой Асс / было выявлено два типа клонов (рис. 2).

Рис. 2. Рестрикция клонов устойчивого генотипа эндонуклеазой рестрикции Лес /(I - клоны, не имеющие сайта рестрикции; 2 - клоны с двумя сайтами рестрикции; М - маркер молекулярного веса).

Таким образом, анализ клонов показал, что с праймерами ЦР78-ЬР79 на гомозиготных устойчивых растениях синтезируются два гена гомолога из локуса 12. Один из гомологов имеет два сайта рестрикции для рестриктазы Асс /, а второй - не имеет сайтов рестрикции для этой рестриктазы.

Для проверки этих данных было проведено секвенирование полученных клонов. Анализ нуклеотидных последовательностей подтвердил данные рестрикционного анализа.

446 Г). н . 399 п.н.

Рис. 3. Нуклеотидная последовательность клона, имеющего два сайта рестрикции Асс I.

Один из гомологов имеет два сайта рестрикции рестриктазы -ícс I причем по сайту 2 (GTATAC вместо GTCGAC) (рис 3) рестрикция несколько ингибирована, так как данный сайт имеет замену одного из нуклеотидов Этим объясняется присутствие недорестрицированного фрагмента размером 845 пар нуклеотидов (рис 3) Данный гомолог имеет высокую (более 95%) степень гомологии к ранее изученному гену 12С-2 (Orí N et al 1997) входящему в состав лок\са ¡2 Ген 12С-2 в регионе гомологичном ктонированным нами фрагментам также имеет два сайта рестрикции рестриктазы Ico / Таким образом можно сделать вывод что одним из амплифииируемых в нашем случае генов-гомолов является I2C 2

Второй гомолог, амплифицируемыи на гомозиготном устойчивом генотипе, не имеет сайтов рестрикции рестриктазы (сс I Нуклсотидный последовательности таких клонов более чем на <15% гомологичны ранее ктонированному ген\ I2C-5 (Orí \ et al 1997) Другие гены-гомологи iokvcj 12 имеют меньшую степень гомологии к ктонированным нами последовательностям Таким образом, вторым амплифицируемым с праимерами UP78-LF79, геном-гомологом является I2C 5

На основании этих данных, нами с те тан вывод о том что на гомозиготных генотипах устойчивых ко второй расе фузариоза с праимерами UP78-LF79 амплифицируются последовательности двух генов-гомологов - I2L 2 и 12С-5

При рестрикции ПЦР-продуктов с клонов неустойчивого генотипа ретриктазой Лее / были выявлены два типа клонов - имеющие один сайт ретрикции 1сс / и не имеющие такого сайта (рис 4)

I 111 ; І і 1

Рис 4 Клоны полученные с неустойчивого генотипа (Селыми стрелками >казаны ктоны не имеющие сайт рестрикции Ісс I)

Нами быто выявлено что нуклеотидные последовательности ктонов не имеющих сайта рестрикции Ісс I гомологичны гену 12С-5 (степень идентичности более 97% при покрытии более 82° о последовательности) Степень гомологии к другим генам локуса 12 была также высока однако процент перекрытия гомологичных последовательностей резко снижался -менее 70о/о Также был проведен филогенетическии анализ и клонированный гомолог кластеризовался вместе с геном 12С 5 Таким образом, можно сделать вывод что на неустойчивом генотипе амплифииируется последовательность имеющая высокую степень сродства к гену 12С Э, или же сам ген /ГС-">

Для второго типа клонов - имеющих один сайт рестрикции рестриктазы 4(.с I - также был проведен поиск высокогомологичных последовательностей в базе данных ОепВапк

Клоны второго типа в отдельных случаях были идентичны ранее клонированным последовательностям генов локуса 12 более чем на 96%. Однако степень перекрытия гомологичных последовательностей составляла не более 77% (с высокой степенью гомологии — 96% и более). Филогенетический анализ показал, что клоны данного типа кластеризуются отдельно от генов локуса 12 (например, I2C-S), однако имеют достаточно высокую степень сродства к генам локуса в целом.

Таким образом, с помощью синтезированных нами праймеров, на неустойчивом генотипе 5. esculentum нам удалось проамплифицировать два гена-гомолога из кластера, аналогичного локусу 12, имеющему происхождение от устойчивого генотипа S. pimpinellifolium.

Один из клонированных генов-гомологов имеет высокую степень гомологии к ранее изученному гену I2C-5 (Simons, G. et al., 1998), входящему в состав локуса 12 S. pimpinellifolium и, также как и ген I2C-5, не имеет сайта рестрикции Асс I в исследованном регионе.

Второй клонированный ген-гомолог хотя и имеет высокую степень идентичности к ранее клонированным генам из локуса 12, является уникальным по наличию одного сайта рестрикции Асс I, а также по его положению. Ни один из ранее изученных генов-гомологов локуса 12 не имел сайта рестрикции в положении, характерном для клонированного нами участка ДНК из локуса, аналогичного 12 (рис. 5, 6).

Гомолог 12С-S

Ранее неизвестный гомолог 5

Рис. 5. Клоны, полученные с неустойчивого генотипа после рестрикции Асс I.

рестришфуемый ГОМОЛОГ '

900 п.н.

нерестрицируемый

I2C-1 I2C-2

12С-5 ■ =

Рис. б. Рестрикционный анализ клонированных гомологов неустойчивого генотипа, в сравнении с ранее клонированными генами-гомологами локуса 12 (стрелками указаны сайты рестрикции Асс Г).

Л о кус 12, отвечающий за устойчивость томата ко второй расе F о

hcopersici, Сыч перенесен в культурный томат (V tsculbntum) из дикого вида S

pimpinellijohum (Segal, G et al 1942) Его структура была достаточно подробно

изучена (Segal et al, 1992, Orí N et al, 1997, Simons et al 1998, Sela-Buurlage et

al 2001, Couch, 2006) На сегодняшним день известно, что данный локус v 5

pimpinelhfolium состоит по меньшей мере из семи генов-гомологов, четыре из

них (12 I2C-I I2C-2 Í2C-5) были идентифицированы и исследованы

Однако структура аналогичного lohvca у S bsculentum по сен день

оставалась неизученной С помощью праймеров, синтезированных на основе

нуклеотидной последовательности гена, входящего в состав лок\са 12 S

pimpinelhfolium, удалось ампіифицировать и клонировать два гена-гомолога из

аналогичного локуса у S escuhntum

Нами показано что в состав íoKvca 12 у 5 esculentuni входит по меньшей

мере два гена-гомолога (рис 7) Один из них имеет высокмо степень сродства к

ранее клонированному reHv Í2C- * и, возможно данный ген входит в состав

кнастера у неустойчивой формы Второй, клонированный нами участок локуса

позволил выявить ранее неизвестную уникальную последовательность ДНК

которая входит в его состав

П і

Гомочог г ,

кластер 12

Р.ЇНЄЄ НЄИ бесТНЬІИ

ГО (ОПОГ г«?нов откуса I

Длинное ппечо 11 чр MOCtMbt

Рис 7 Структура то^са/» VЛ I:\i-ulenium (неустойчивым генотип)

2. Изучение юклса Уе \ неустойчивых генотипов гомата

2 1 ПЦР-анализ локуса 1е. Структура и состав локуса Уе у неустойчивых форм томата остается неизученной Такие данные позволили бы понять некоторые аспекты механизмов устойчивости, выявить различия на молекулярном уровне и создать высокоэффективные ДНК-маркеры

Для сравнительного анализа локуса Ус у устойчивых и неустойчивых форм гомата нами были синтезированы две пары праймеров (\'УР1 А' УК1, У\?Р2-УУЯ2), которые позволяют амплифицировать участок гена 1с/ (Ка\УсЬик, 2001) протяженностью около 1500 п и Данный участок расположен в начале гена

П H

Рис S Рез\ 1маты ПНР с праичерами VVF1 -VVR1 (дорожки 1 2 1 4) и \ VF2*-V VF2 (* fi < Я) Дорожки 1 2 и 5 6 vc i оичиныи гсногип дорожки ! 4 и ? 8 нечсгоичиньги i смоги и

В результате ПЦР с синтезированными праимерами и на устойчивых, и на неустойчивых генотипах были получены амптаконы одинакового размера (рис

8) Таким образом можно сделать вывод что у неустойчивых генотипов томата токуй в цетом npHcvтствует, однако его функциональность нарушена в результате изменений на молекулярном уровне

Так как явных различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами непосредственно посте ПЦР выявить не удалось, было проведено клонирование ПЦР-проду ктов полученных на устойчивой и неустойчивой формах томата

2 2 Анализ нуктеотидных последовательностей локуса lev неустойчивых генотипов томата Анализ нуктеотидных последовательностей клонированных участков гена I t показал высокую степень гомоаогии по данному локусу между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата Поиск последовательностей с высокой гомологией к клонированным фрагментам в базе данных GenBank дал схожие реiv 1ьтаты на устойчивом и неустойчивом к вертишп 1езу генотипах Как и ожидалось была обнаружена высокая степень гомологии к ранее клонированным генам lei и Ve2 Анализ нуклеотидных последовательностей полученных клонов не выявил никаких крупных (делений инсерции, дупликаций) различий между ток\сами I е устойчивых и неустойчивых форм томата Следующим шагом нашей работы был поиск полиморфизма по сайтам рестрикции межд\ устойчивым и неустойчивым локусами Обнаружение такого полиморфизма позволило бы создать молекулярный маркер непосредственно на ген 1е

При анхлизе ПЦР-проду кта полученного с парой праймеров V VF1 <-VVR1, полиморфизма по сайтам рестрикции между устойчивым и неустойчивым генотипами нами обнаружено не было

ПЦР продукты полученные с парой праймеров VVF2+VVR2, были также проверены на полиморфизм по сайтам рестрикции на устойчивых и неустойчивых генотипах Одна из рестриктаз - Xba I - позволила выявить различия между устойчивыми и неустойчивыми к вертициллезу формами гомата Было выявлено, что в регионе амп шфицируемом с помощью указанной пары праймеров, у неустойчивого генотипа имеется один дополнительный сайт рестрикции для рестриктазы Xba /, по сравнению с устойчивым генотипом (рис

12 3 4 5 6 7

Рис. 9. Рестрикция ПЦР-продуктов с рестриктазой ХЬа 7(1- Метана (устойчивый гомозиготный); 2 - Moneymaker (неустойчивый); 3 - Белый налив (неустойчивый); 4 -Ампаро (устойчивый гомозиготный); 5 - Indiko (гетерозигота); 6 - Durason (гетерозигота); 7 -

Pitenza (гетерозигота).

Таким образом, нами показано, что в локусе Ve у неустойчивых генотипов томата (S. esculentum) находятся последовательности ДНК, имеющие высокую степень гомологии к ранее изученным генам Vel и Ve2, расположенным в аналогичном локусе устойчивых форм. В данном регионе нам удалось выявить полиморфизм по сайту рестрикции Xba I между устойчивыми и неустойчивыми формами томата. На основании выявленного полиморфизма был создан кодоминантный ДНК-маркер.

3. Анализ региона, тесно сцепленного с локусом устойчивости томата к верти циллезу. Последовательности, тесно сцепленные с геном устойчивости к вертициллезу, имеют высокую степень гомологии у гомозиготных устойчивых и неустойчивых форм томата. Изученные последовательности оказались высокоспецифичными, для них не было обнаружено гомологий в базе данных GenBank. Всего было найдено 43 нуклеотидные замены, отличающие устойчивый и неустойчивый аллели. Также в этом регионе была обнаружена делеция у неустойчивых генотипов размером 36 пар нуклеотидов. Расстояиние от локуса Ve до региона, в котором выявлена делеция, составляет 0,67 ± 0,49 сМ, или 240 тыс. п.н. (Kawchuk, 1998). В регионах до и после делеции полиморфизма не выявлено. На основании выявленного полиморфизма ранее был создан SCAR-маркер (Kawchuk, 1998). Kawchuk с соавторами предложили использовать пару праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности полиморфного региона. Однако у данного маркера есть ряд недостатков, которые осложняют его использование для массового анализа селекционного материала. Одним из недостатков является большой размер ПЦР-продукта (более 1000 п.н.), синтезируемого с помощью предложенной пары праймеров. Учитывая, что делеция составляет 36 п.н., а размер ампликонов более 1000 п.н., выявить различие по размеру ПЦР-продуктов у устойчивых и неустойчивых генотипов при электрофорезе в агарозном геле достаточно сложно. Для этого необходимо использовать высококонцентрированный агарозный гель и длительное разделение ПЦР-продуктов. Использование же электрофореза в полиакриламидном геле не приемлемо для массового анализа в связи со сложностью методики.

Нами была поставлена цель усовершенствовать вышеуказанный SCAR-маркер. Необходимо отметить, что подбор праймеров осложнялся тем, что

последовательности фланкирующие детецию являются АТ-богатыми, что снижает температуру отжига праймеров а это приводит к массовому синтезу неспецифических ПЦР-продуктов

Нами были проверены несколько пар праймеров и с одной из них посте оптимизации условий ПЦР, удалось получить устойчивую амплификацию специфичных ПЦР-продуктов размером около 200 п н (рис 10)

Рис 10 ПЦР продукты по пченные с праимерами (V F-^VR) (12 Устойчивые п-чдеготные ' - гетерозиготные тлсгоичивые!

При массовых анализах стадия электрофореза, необходимая для визуализации результатов ПЦР остается достаточно трудоемкой, занимает до половины времени, необходимого для скрининга популяций, расщепляющихся по признаку устойчивости к вертицичлезу Избежать данную стадию а также автоматизировать детекцию и хранение результатов и предотвратить контаминацию ПЦР-продуктом, позволяет метод флуоресцентного маркирования, основанный на применении молекулярных беконов

Нами был синтезирован зонд на нуклеотидную последовательность отсутств\ющую у неустойчивых форм растений, который используется в комбинации с ранее подобранными праимерами УИ-гУЯ (Кук лев VI Ю и др 2006) (рис 11) В коде ПЦР, при наличии устойчивого аллеля зонд гибридизу ется на ДНК-мишени и разрушается Тац-полимеразой, в результате чего флуоресцентная метка освобождается и мы можем детектировать излучение определенной д шны волны

tatttatatcttafttatsfaacaafttactcatatajaaMtafctt»ttct tat tt atatctta« tMt««aacaafttactcat агама«« t

ЕШШЕЗВ

sltat-^ttsat* „с*. -а

tttMMHIH

ИВ1ПННН1ППЯ11»

Ш 5ШЕ КИЯИЯГ

l5íacitt3tctt®MtW54]

Рис 11 Metra oí жш i праймеров и флуоресцентного юнла на нуклсогилную ПОСЛеДОВаТеЛЫЮ1ЛЬ реГИОНа есНО сЦеПЛеННОШ С lOKVCOMÍt

1 ОКр4.«<н( 1 ' Гпоцмфика ЪК

ь ЙГ( 1 ..«-4

СП Т77 1 \Т

ч--> ЛТогчияый г « г 1 И

4 П VI ¿ЗЯ 1 1?

''ЮГоШыА % • %■-■* Ой

«к».**»!* ,. , * - » 1(. 1Л*> •И

J^>i .1

6 У 41Л ¿1

«М ' 1И? О *>

¡и.«.' ыЛ НД 1 У

1 'и «*ГЕ-Ой о»». А 1 ю V*

♦он 1,00 111

Рис. 12. Результаты скрининга образцов на наличие доминантного аллеля гена устойчивости томатов к вертициллезу (! е). Пояснения в тексте.

На рисунке 12 представлены результаты детекции флуоресценции на приборе «Джин». Высокий уровень сигнала по каналу РАМ («Специфика») указывает на то, что в исследуемом образце присутствует доминантный аллель гена устойчивости томата к вертициллезу. Уровни сигнала представлены графически в правой части окна программы. Образцы, несущие признак устойчивости к вертициллезному увяданию, отмечаются знаком «+» в колонке «Результат», образцы, чувствительные к заболеванию, отмечаются знаком «НД» («нет детекции») в той же колонке. В качестве фоновых по уровню флуоресценции образцов, используется та же реакционная смесь, что и для других образцов, но без добавления матричной ДНК. Это позволяет избежать ложных результатов, вследствие спонтанного разрушения зонда Тая-полимеразой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Примененный нами методологический подход - сравнительный анализ локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых к фузариозу и вертициллезу генотипов томата - позволил нам выявить нуклеотидные последовательности новых генов-гомологов у неустойчивых форм томата. Анализ данных локусов у неустойчивых форм томата был проведен впервые. На основании выявленных нами различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата по локусам устойчивости к фузариозу и вертициллезу созданы новые эффективные ДНК-маркеры.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор выражает огромную признательность Григорию Федоровичу Монахосу, директору селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева за предоставленный растительный материал; Якову Игоревичу Алексееву (ЗАО «Синтол») за помощь в освоении ПЦР в реальном времени; Игорю Александровичу Фесенко, старшему научному сотруднику Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, за помощь в проведении исследований и ценные советы.

Всему коллективу Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева за помощь, понимание и поддержку.

выводы

1 Клонированы нуклеотидные последовательности локусов 12 и Уе у устойчивых и неустойчивых форм томата Сравнительный анализ показал высокую степень гомологии между нуклеотидными последовательностями указанных локусов у устойчивых и неустойчивых генотипов

2 Выявлен полиморфизм на молекулярном уровне в локусах 12 и 1-е \ Устойчивых и неустойчивых генотипов, на основе которого созданы высокоэффективные ДНК-маркеры

3 В локусе 12 неустойчивого генотипа 5 е'лх и1епШт выявлены последовательность имеющая высокою степень гомологии к гену 12С-5 и ранее неизвестная последовательность ДНК, гомологичная гену 12 Б ртртеШМгит

4 В локусе 1-е неустойчивых форм томата выявлены нуклеотидные пос ¡едовательности с высокой (более 96° о) степенью гомологии к описанным ранее генам-гомологам и 1е2

5 Выявлен полиморфизм по сайту рестрикции рестриктазы ХЬа I между шкУсами (■ е устойчивых и неустойчивых генотипов На основании данного полиморфизма создан кодоминантныи CAPS-мapкep

6 На основании ранее выявленного полиморфизма в регионе, тесно сцепленном (0 67±049 сМ) с геном устойчивости гомата к вертициллезу (КашсИик 1498) создан новый кодоминантныи БС А Я-маркер

7 Создана флуоресцентная тест-система для детекции доминантного аллеля гена устойчивости томата к вертициллезу с помощью ПЦР в реальном времени или конечной детекции флуоресценции

Список опубликованных работ по материалам диссертации

1. M.Y. Kuklev, I.A. Fesenko, G.I. Karlov Флуоресцентное маркирование гена устойчивости томата к вертициллезу (Ve) с помощью молекулярных беконов (Fluorescence targeting of Verticillium dahliae resistance gene (Ve) in tomato with molecular beacons). Abstracts of Proceedings of the 4 International Iran and Russian Conference in Agriculture and Natural Resources. 2004, P. 94-95.

2. Куклев М.Ю., Фесенко И.А., Карлов ГЛ. Разработка флуоресцентной тест-системы для выявления устойчивых к вертициллезу форм томата - М.: Известия ТСХА, выпуск 4,2006, С. 115120.

3. Фесенко И.А., Куклев М.Ю., Карлов Г.И. Создание ДНК-маркера гена устойчивости томата к фузариозному увяданию — М.: Известия ТСХА, выпуск 1,2007, С. 66-73.

1,0 печ л

Зак 361

Тир 100 экз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

5 ом "л- '

is - wO-'С/

ґ •

/ ' • л / » - "

Jtct^r

" - » - л ----у

- \¿J.r-;J->P У. V

А."*/- сС.ї-о"