Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ локусов генов устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу и создание на их основе ДНК маркеров

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Анализ локусов генов устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу и создание на их основе ДНК маркеров"

На правах рукописи

КУКЛЕВ Михаил Юрьевич

□03058369

АНАЛИЗ ЛОКУСОВ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТА К ФУЗАРИОЗУ И ВЕРТИЦИЛЛЕЗУ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДНК МАРКЕРОВ

Специальность 03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003058669

Работа выполнена в Центре молекулярной биотехнологии и на кафедре Сельскохозяйственной биотехнологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К А Тимирязева

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Г И Карлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ф С Джалилов доктор биологических наук А Н Игнатов

Ведущая организация:

ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита состоится <шр> мая 2007 г в часов на заседании диссертационного совета Д 220 043 10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К А Тимирязева по адресу 127550, Москва, ул Тимирязевская, д 49

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева

Автореферат разослан С?¿/LeU-t^-f 2007 г

и размещен на сайте университета www timacad ru

Ученый секретарь диссертационного совета

Е А Калашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одними из самых распространенных и вредоносных заболеваний на томате и других сельскохозяйственных культурах являются фузариозное и вертициллезное увядания Потери урожая от данных заболеваний могут достигать 30%, а в случае тепличных условий выращивания -до 50% и более (Jurriaan J Mes, 1999, Watterson, 1986, Cirulli 1981) Поэтому создание сортов томата, устойчивых к данным заболеваниям, является одной из приоритетных задач селекции

До недавнего времени в селекции сельскохозяйственных культур на устойчивость к болезням и вредителям использовались морфологические маркеры Они могли проявляться на различных этапах развития растений, идентифицироваться визуально или в результате биохимических исследований Традиционные методы селекции на устойчивость требуют создания инфекционных фонов и трудоемкую оценку каждого образца Проведение таких работ связано со значительными затратами труда и времени Селекционный процесс для однолетних культур затягивался на 10-20 лет Применение молекулярных маркеров ускоряет и удешевляет селекционный процесс

В 1990-х годах начало бурно развиваться новое направление в селекции -селекция, основанная на молекулярных маркерах (MAS - marker assisted selection) В 1998 году Kawchuk с соавторами предложили SCAR-маркер, тесно сцепленный с геном устойчивости томата к вертициллезу (Kawchuk et al, 1998) А в 2007 году Фесенко И А с соавторами сообщили о создании CAPS-маркера на ген устойчивости томата к фузариозу (Фесенко И А и др, 2007) Использование ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов устойчивости Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре локусов генов устойчивости у устойчивых и чувствительных к фитопатогену генотипов

Сравнительный анализ и изучение организации кластеров и локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов в пределах одного вида проливает свет на эволюцию формирования устойчивости к различным фитопатогенам Информация о структуре локусов у неустойчивых форм растений, аналогичных таковым у устойчивых генотипов, дополнит наши знания о строении и функциях доменов, свойственных генам устойчивости

Цели и задачи работы. Целью работы являлся сравнительный анализ локусов генов устойчивости томата к фузариозу и вертициллзу у устойчивых и неустойчивых форм томатов В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи

1 Создать библиотеку последовательностей ДНК локусов (кластеров) устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу,

2 Провести сравнительный анализ организации кластеров у устойчивых и неустойчивых форм растений,

3 Разработать эффективные системы маркирования генов устойчивости

Научная новизна Впервые проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав локусов 12 и Ve, у неустойчивых к фузариозу и вертициллезу форм томатов Проведено сравнение структуры вышеуказанных локусов у устойчивых и неустойчивых форм томата

Показано, что в локусе, аналогичном локусу 12 S pimpinelhfohum, у S esculentum присутствуют, по меньшей мере, два гена-гомолога, причем один из них уникален по своей структуре

В локусе Ve у неустойчивых генотипов томата показано присутствие нуклеотидных последовательностей, имеющих высокую степень гомологии к ранее клонированным Kawchuk с соавторами (2001) генам устойчивсоти Vel и Ve2 Выявлен полиморфизм по данному локусу между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата На основании данного полиморфизма создан кодоминантный CAPS-маркер

Основываясь на нуклеотидных последовательностях региона, тесно сцепленного с локусом Ve (Kawchuk et al, 1999), создан удобный в применении при массовом анализе селекционного материала на устойчивость к вертициллезу кодоминантный SCAR-маркер На основании полиморфизма в данном регионе был синтезирован флуоресцентный зонд, позволяющий быстро выявлять в селекционном материале растения, несущие доминантный аллель гена устойчивости к вертициллезу, с помощью ПЦР в реальном времени или детекции флуоресценции по конечной точке (end-point detection)

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 4-й международной Российско-Иранской конференции «Сельское хозяйство и природные ресурсы», 2004, на международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», 2005

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на

_ страницах машинописного текста и включает _ рисунок Диссертация

состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и

«Список литературы» Список цитируемой литературы включает _

наименований, из них_иностранных

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАИЯ

Объекты исследования. В работе был использован следующий растительный материал сорта и гибриды F1 томата DRW, Moneymaker, Белый налив, Amparo, Indiko, Мегана, Durason, Pitenza Также были использованы образцы из селекционной линии ИС-3, расщепляющейся по признаку

устойчивости к вертициллезу (Селекционно-овощная станция им H H Тимофеева РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева)

Растительный материал выращивали в пленочной теплице Семена проращивали в чашках Петри при температуре 24°С

Выделение ДНК. ДНК выделяли из молодых листьев по методу Bernatzky и Tanksley (1986) с некоторыми модификациями

ПЦР-анализ. Для изучения структуры локусов 12 и Ve у устойчивых и неустойчивых генотипов томата использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

На основании данных о нуклеотидной последовательности генов-гомологов, входящих в состав локуса 12 устойчивых генотипов томата, были синтезированы следующие праймеры

LR1 ACT СТА CAA АТС TGG ААТ TTC СТТ LR2 AAA TTC TAG TAG TGG TGT GA VI27 TGG AAC AAT GTC GGC ACT TAT CTT VU 127 CAA CCA CAT TTT CCA ACT ТС A CAA Cl CCT CCT TTT CTC ACC TCA CTT CGC C2 ATT TGT GGC CAG TAT ТСС CC FG1 5' ATG GAG ATT GGC TTA GCA GTT GGT 3' LF127 5' TCG TTG TAA TTT TCA TTC CAC АСА 3' LF79 5' CAT TTC TCA ATT CAT CCC ACT CGT 3' LF78 5 ' TCA TTC CAC ACG TCA TCA AGG АСА 3 ' F7 5 ' CAG TTG TGA AGT TGG AAA ATG TGG 3 ' FU7 5 ' CAA TTT CAA TTT TGG GCA ACG AGA 3 ' L79 5 ' ATT TAG GCA ACC AAT TCT TTC TCG 3 ' LU79 5 ' TGG GCG TAG CTC АТС AAG TAT GTA 3 ' M78 5 ' TCT TGT TGT CCT TGA TGA CGT GTG 3 ' MU78 5 ' СТА TTG AAT AGG АСА TGT GCC GAC 3 ' U127 5 ' GTT GAG GAC ATT GCT TCC GAT ACG UN 127 5' AAC AAC TGG АСА АТС ACT AAC TTC U78 5 ' ACT CGA TAA AGT ATT GGT TAC CCG UN78 5 ' TC A GCT AC A AGT CAA ATT GAA GGC UP78 5 ' TGT ATT GAT TAT ATG GTA GGC CCC

Для исследования локуса Ve у неустойчивых форм томата использовали следующие праймеры

VF 5' AGC TTA TTC ATT CCA CCC A 3' VR 5' CTG AAT AGC AAG АСА ACG TGG С 3' VVF1 5' TTG GCA AAA TGG AAC GAC ATG АСА 3' VVR1 5' GAG CCC AGG GTC AAT GTA GTC AAG 3' VVF2 5' GAC TAC ATT GAC CCT GGG CTC TTG 3' VVR2 5' TGA GAG CAC CTT AAG CCT TTC AAT 3'

Для проведения ПЦР в реальном времени использовался флуоресцентно меченый зонд, синтезированный на основе нуклеотидной последовательности, тесно сцепленной с геном Ve

F AM 5' GAT ATA ATA TCG GAG AAG GTA TAT С BHQ1 Все праймеры и зонды синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва) Амплификацию проводили на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва) и «DNA Engine Tetrad 2» (Bio-Rad, USA) Детекция флуоресценции осуществлялась на приборе «Джин» с программным обеспечением фирмы изготовителя («ДНК-технология», Москва)

Продукты ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле с буфером TBE при напряженности поля 6 V/cm. В качестве маркера размеров использовали «100 bp leader» (Fermentas),

Клонирование HLU'-hpujyktob. Клонирование ПЦР-продуктов проводили с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, USA) в соответствии с инструкцией, предложенной производителем.

Анализ нуклсотидных последовательностей. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программных пакетов GeneDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver, 2.6.Q02. Copyright© by K. Nicholas), Clone manager 6 version 6,00 (Sei Ed Central). Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили н открытых базах генетических данных GenBank (http:Vwwvv.ncbi.nlm.ni h. gov). Sol Genomic Network (http:.7ww\v.sun.comell.edu/about/tomato project), EM0L-EBI

(http://www.ebi.ac.uk),

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

t. Анализ локуса 12 V устойчивых и неустойчивых генотипов томата.

1.1. ПЦР-а пал из локуса 12. Для сравнительного анализа локуса 12 у устойчивых и неустойчивых к фузариозу генотипов томата были использованы два праймера UP78 и LF79. Прайм еры были синтезированы на основании нуклеотидной последовательности ранее клонированного гена I2C-2 (Orí N. et al., 1997). При проведении ПЦР с данными праймерами синтезировались ПЦР-продукты размером около 1100 п.н. Причем фрагменты одинакового размера синтезировались как на устойчивых, так и на неустойчивых генотипах.

Для выявления полиморфизма между устойчивыми и неустойчивыми к фузариозу генотипаМй томата, ам пли к он был обработан ретриктазами. При гидролизе ПЦР-продукта рестриктазой Лее I были выявлены отличия между устойчивыми и неустойчивыми генотипами (рис. I ).

I 2

Рис. 1. Продукты ПЦР. полученные с праймерами UP78, LF79, обработанные рестриктазой Açc / (1 устойчивый гомозиготный гибрид DRW; 2 - неустойчивый сорт

Monyemaker).

При анализе рестрикционной картины было выявлено, что сумма размеров рестрикционных фрагментов у устойчивого генотипа значительно превышает размер ПЦР-продукта до рестрикции. Нами было сделано предположение, что с помощью данной пары праймеров синтезируются ПЦР-продукты с нескольких reFtos-гомологов, входящих в состав кластера /2, и каждый из них имеет свои сайты рестрикции для рестриктазы Асс Í. Важно отметить, что структура локуеа 12 у устойчивых генотипов достаточно хорошо изучена, и данный локус перенесен в S.escidentum из дикого вида S. pimpinellifolium {Segal et al., 1992, Orí N. et al., 1997, Simons et al„ 1998, Sela-Buuriage et al. 20Ш, Couch, 2006). С другой стороны, структура аналогичного локуеа у S.esculentum не изучена и остается неизвестным какие гены-гомологи входят в его состав у неустойчивых генотипов,

1.2. Клонирование и анализ ПЦР продуктов, полученных с устойчивого и неустойчивого генотипов. Для дальнейшего анализа амилифицированных последовательностей проводилось их клонирование.

После обработки ПЦР-продуктов, полученных с клонов устойчивого генотипа, рестриктазой Асс J было выявлено два типа клонов (рис. 2).

Рис. 2. Рестрикция клонов устойчивого генотипа эндонуклеазой рестрикции Асс /(1 - клоны, не имеющие сай га рестрикции; 2 - клоны с двумя сай гами рестрикции: М - маркер молекулярного веса).

Таким образом, анализ клонов показал, что с праймерами иР78-1_Г79 на гомозиготных устойчивых растениях синтезируются два гена гомолога из локуеа 12. Один из гомологов имеет два сайта рестрикции для рестриктазы Асс /, а второй - не имеет сайтов рестрикции для этой рестриктазы.

Для проверки этих данных было проведено секвенирование полученных клонов. Анализ нуклеотидных последовательностей подтвердил данные рестрнкционного анализа.

В

2 '

84 5 H.H.

446 п,н.

399 п.н,

Рис. ?>. Нуклеотиднйя последовательность клона, имеющего два сайта рестрикции Асс I.

Один из гомологов имеет два сайта рестрикции рестриктазы Асс /, причем по сайту 2 (СТЛТЛС вместо ОТССАС) (рис. 3) рестрикция несколько ингибирована, так как данный сайт имеет замену одного из нуклеотидов. Этим объясняется присутствие н едоре стр и ц и рованного фрагмента размером 845 пар нуклеотидов (рис. 3), Данный гомолог имеет высокую (более 95%) степень гомологии к ранее изученному гену 12С-2 (Оп N. е1 а1., 1997). входящему в состав локуса 12. Ген 12С-2 в регионе, гомологичном клонированным нами фрагментам, также имеет два сайта рестрикции рестриктазы Асс I. Таким образом, можно сделать вывод, что одним из амплифицируемых в нашем случае гснов-гомолов является 12С-2.

Второй гомолог, амплифицнруемый на гомозиготном устойчивом генотипе, не имеет сайтов рестрикции рестриктазы Асс I. Нуклеотидные последовательности таких клонов более чем на 95% гомологичны ранее клонированному гену 12С-5 (Оп N. е! а!.. 1997). Другие гены-гомологи локуса /2 имеют меньшую степень гомологии к клонированным нами последовательностям. Таким образом, вторым амплифицируемым с праймерами иР78-ЬР79, геном-гомологом является 12С-5.

На основании этих данных, нами сделан вывод о том, что на гомозиготных генотипах, устойчивых ко второй расе фузариоза, с праймерами иР78-1.Т79 а модифицируются последовательности двух генов-гомологов - 12С-2 И ¡2С-5.

При рестрикции ПЦР-продукгов с клонов неустойчивого генотипа ретрнктазой Асс 1 были выявлены два типа клонов - имеющие один сайт ретрикции Асс I и не имеющие такого сайта (рис. 4).

\ Мк 1 1 I 1 I 1 I | и

- 4ЯМ? ' Г ^^

Рис. 4. Клоны, полученные с неустойчивого генотипа (белыми стрелками указаны клоны, не имеющие сайт рестрикции Асс Г).

Нами было выявлено, что нуклеотидные последовательности клонов, не имеющих сайта рестрикции Асе /, гомологичны гену 12С.-5 (степень идентичности более 97% при покрытии более 82% последовательности). Степень гомологии к другим генам локуса 12 была также высока, однако процент перекрытия гомологичных последовательностей резко снижался — менее 70%. Также был проведен филогенетический анализ, и клонированный гомолог кластеризовался вместе с геном 12С-5. Таким образом, можно сделать вывод, что на неустойчивом генотипе амплифицнруется последовательность, имеющая высокую степень сродства к гену 12С-5, или же сам ген /2С-5.

Для второго типа клонов - имеющих один сайт рестрикции рестриктазы Асс I - также был проведен поиск высоко гомологичных последовательностей в базе данных СепВапк.

Клоны второго типа в отдельных случаях были идентичны рапсе клонированным последовательностям генов локуса 12 более чем на 96%. Однако степень перекрытия гомологичных последовательностей составляла ие более 77% (с высокой степенью гомологии - 96% и более). Филогенетический анализ показал, что клоны данного типа кластеризуются отдельно от генов локуса 12 (например, I2C-5), однако имеют достаточно высокую степень сродства к генам локуса в целом.

Таким образом, с помощью синтезированных нами праймеров, на неустойчивом генотипе S. esculentum нам удалось проамплифшшровать два гена-гомолога из кластера, аналогичного зону су /2, имеющему происхождение от устойчивого генотипа S. pimpinellifolhm.

Один из клонированных генов-гомологов имеет высокую степень гомологии к ранее изученному гену 12С-5 (Simons, G. et аЦ 1998), входящему в состав локуса 12 S. pimpinellifolium и, также как и ген I2C-5, не имеет сайта рестрикции Асс 1 в исследованном регионе.

Второй клонированный ген-гомолог хотя и имеет высокую степень идентичности к ранее клонированным генам из локуса 12, является уникальным по наличию одного сайта рестрикции Асс /, а также по его положению. Ни один из ранее изученных генов-гомологов локуса 12 не имел сайта рестрикции в положении, характерном для клонированного нами участка ДНК из локуса, аналогичного 12 (рис. 5, 6).

rowjniTr I2C-S

_ Tl .

У* 900 П.м.^^^ О» «mij k-"*

190 S*J S * »-»-+Щ-

*

PdKtfü не vi i F"..M : >iiJ-< TOHÜrtOl-

iomojioi

Рис, 5. Клоны, полученные с неустойчивого генотипа после рестрикции Лее /.

Ре ст рицирусыым гсиолог <—

Н*рестрицируе:

гомолог

44*> п.н. 199 п,н. ¿4Р> гьн.

f i

1 t

t t

Рис. 6. РестрикционныЙ анализ клонированных гомологов неустойчивого генотипа, в сравнении с ранее клонированными генами-гомологами локуса 12 (стрелками указаны сайты рестрикции Асс Г).

Локус 12, отвечающий за устойчивость томата ко второй расе F о lycopersici, был перенесен в культурный томат (S esculentum) из дикого вида 5 pimpinellifolium (Segal, G et al, 1992) Его структура была достаточно подробно изучена (Segal et al, 1992, Orí N et al, 1997, Simons et al, 1998, Sela-Buurlage et al 2001, Couch, 2006) На сегодняшний день известно, что данный локус у 5 pimpinelhfolium состоит по меньшей мере из семи генов-гомологов, четыре из них (12,12C-I, I2C-2,12C-5) были идентифицированы и исследованы

Однако структура аналогичного локуса у S esculentum по сей день оставалась неизученной С помощью праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности гена, входящего в состав локуса 12 S pimpinelhfolium, удалось амплифицировать и клонировать два гена-гомолога из аналогичного локуса у S esculentum

Нами показано, что в состав локуса 12 у S esculentum входит по меньшей мере два гена-гомолога (рис 7) Один из них имеет высокую степень сродства к ранее клонированному гену I2C-5, и, возможно, данный ген входит в состав кластера у неустойчивой формы Второй, клонированный нами участок локуса, позволил выявить ранее неизвестную уникальную последовательность ДНК, которая входит в его состав

Кластер 12

Гомолог 12С-5 \

О

Ранее неизвестный гомолог генов локуса 12

длинное плечо 11 хромосомы Рис 7 Структура локуса 12 у X Езси1еп!ит (неустойчивый генотип)

2. Изучение локуса Уе у неустойчивых генотипов томата.

2 1 ПНР-анализ локуса Уе Структура и состав локуса Уе у неустойчивых форм томата остается неизученной Такие данные позволили бы понять некоторые аспекты механизмов устойчивости, выявить различия на молекулярном уровне и создать высокоэффективные ДНК-маркеры

Для сравнительного анализа локуса Уе у устойчивых и неустойчивых форм томата, нами были синтезированы две пары праймеров (УУР1+УУШ, УУР2+УУЯ2), которые позволяют амплифицировать участок гена Уе1 (Ка1^!™!?., 2001) протяженностью около 1500 п н Данный участок расположен в начале гена

1 2 3 4 5 6 7 6

Put. 8- Результаты ПЦР с праймерами VVF] -VVR1 (дорожки I, 2, 3, 4) и VVF2+VVF2 (5. 6, 7, 8). Дорожки 1.2 и 5, 6 - устойчивый генотип; дорожки 3.4 Я 7,8 неустойчивый генотип.

В результате 11ЦР с синтезированными праймерами и на устойчивых, и на неустойчивых генотипах были получены ампликоны одинакового размера (рис,

8). Таким образом, можно сделать вывод, что у неустойчивых генотипов томата Яокус в целом присутствует, однако его функциональность нарушена и результате изменений на молекулярном уровне.

Так как явных различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами непосредственно после ПЦР выявить не удалось, было проведено клонирование ПЦР-продуктов, полученных на устойчивой и неустойчивой формах томата.

2.2. Анализ нуклеотидных последовательностей локуса Уе у неустойчивых генотипов томата. Анализ нуклеотидных последовательностей клонированных участков гена Уе показал высокую степень гомологии по данному локусу между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата. Поиск последовательностей с высокой гомологией к клонированным фрагмен там в оззе данных GenBank дал схожие результаты на устойчивом и неустойчивом к вертициллезу генотипах. Как и ожидалось, была обнаружена высокая степень гомологии к ранее клонированным генам Уе! и Уе2. Анализ нуклеотидных последовательностей полученных клонов не выявил никаких крупных (делеций, ннсеркий, дупликаций) различий между локусами Уе устойчивых и неустойчивых форм томата. Следующим шагом нашей работы был поиск полиморфизма по сайтам рестрикции между устойчивым и неустойчивым локусами. Обнаружение такого полиморфизма позволило бы создать молекулярный маркер непосредственно па ген Уе.

При анализе ПЦР-продукта, полученного с парой праймеров VVn+VVRI, полиморфизма по сайтам рестрикции между устойчивым и неустойчивым генотипами нами обнаружено не было.

ПЦР-продукты, полученные с парой праймеров VVF2+VVR2. были также проверены па полиморфизм по сайтам рестрикции на устойчивых и неустойчивых генотипах. Одна из рестриктаз - Xba 1 - позволила выявить различия между устойчивыми и неустойчивыми к вертициллезу формами томата. Ьыло выявлено, что в регионе, амПлифйцируемом с помощью указанной пары праймеров, у неустойчивого генотипа имеется один дополнительный сайт рестрикций для рестрикгазы Xba 1, по сравнению с устойчивым генотипом (рис.

9),

Рис. 9. Рестрикция ПЦР-продуктов с ресгриктазой ХЬй 1 (! - Мегака (устойчивый гомозиготный); 2 - Moneymaker (неустойчивый); 3 - Белый налив (неустойчивый); 4 -Амгтаро (устойчивый гомозиготный); 5 - lndiko (гетерозигота); ft - Durason (гетерозигота); 7 -

Pi ten/a (гетерозигота).

Таким образом, нами показано, что в локусе Ve у неустойчивых генотипов томата (S. езси1епшЩ находятся последовательности ДНК, имеющие высокую степень гомологии к ранее изученным генам Ve] и Ve2, расположенным в аналогичном локусе устойчивых форм. В данном регионе нам удалось выявить полиморфизм по сайту рестрикции Xba 1 между устойчивыми и неустойчивыми формами томата. На основании выявленного полиморфизма был создан кодомииантный ДНК-маркер.

3. Анализ региона, тесно сцепленного с локусом устойчивости томата к йертнциялету. Последовательности, тесно сцепленные с геном устойчивости к верти пил лезу, имеют высокую степень гомологии у гомозиготных устойчивых и неустойчивых форм томата. Изученные последовательности оказались высокоспецифичными, для них не было обнаружено гомологии в базе данных GenBank, Всего было найдено 43 нуклеотидные замены, отличающие устойчивый и неустойчивый аллели. Также в этом регионе была обнаружена делеция у неустойчивых генотипов размером 36 пар нуклеотидов. Расстояиние от локуса Ve до региона, в котором выявлена делеция, составляет 0,67 ± 0,49 сМ, или 240 тыс. п.н. (Kawchuk, 1998). В регионах до и после делеции полиморфизма не выявлено. На основании выявленного полиморфизма ранее был создан SCAR-маркер {Kawchuk, 1998). Kawchuk с соавторами предложили использовать пару праймеров. синтезированных на основе яуклеотиднйЙ последовательности полиморфного региона. Однако у данного маркера есть ряд недостатков, которые осложняют его использование для массового анализа селекционного материала. Одним из недостатков является большой размер ПЦР-продукта (более 1000 п.н.), синтезируемого с помощью предложенной пары праймеров. Учитывая, что делеция составляет 36 л.н., а размер ампликояов более 1000 п.н., выявить различие по размеру ПНР-продуктов у устойчивых и неустойчивых генотипов при электрофорезе в агарозном геле достаточно сложно. Для этого необходимо использовать высококонцентрированный агарочный гель и длительное разделение ПЦР-продуктов. Использование же электрофореза в полиакриламидном геле не приемлемо для массового анализа в связи со сложностью методики.

Нами была поставлена цель усовершенствовать вышеуказанный SCAR-маркер, Необходимо отметить, что подбор праймеров осложнялся тем, что

последовательности фланкирующие делецию, являются АТ-богатыми, что снижает температуру отжига праймеров, а это приводит к массовому синтезу неспецифических Г1ЦР-п роду кто в.

Нами были проверены несколько пар праймеров и с одной из них (УР+УЮ, после оптимизации условий ПЦР, удалось получить устойчивую амплификацию специфичных Г1ЦР-продукте в размером около 200 п.н. (рис. 10).

500—

1 2 3 4 5 6

200

Рис. 10. П1 (Р-продукты. полученные с п рай мерам и (ХТ+Х/К) (1,2 - устойчивые I ом зиготные; 3, 4 - гетерозиготные: 5,6 - неустойчивые).

При массовых анализах стадия электрофореза, необходимая для визуализации результатов ПЦР, остается достаточно трудоемкой, занимает до половины времени, необходимого для скрининга популяций, расщепляющихся по признаку устойчивости к вергициллезу. Избежать данную стадию, а также автоматизировать детекцию и хранение результатов и предотвратить контаминацию ПЦР-продуктом, позволяет метод флуоресцентного маркирования, основанный на применении молекулярных беконов.

Нами был синтезирован зонд на нуклеотидную последовательность, отсутствующую у неустойчивых форм растений, который используется н комбинации с ранее подобранными праймерами УР+УЯ (Куклев М.Ю. и др., 2006) (рис. II). В ходе 11ЦР, при наличии устойчивого зллеля, зонд гибридизуется на ДНК-мишени и разрушается Тац-полимеразой. в результате чего флуоресцентная метка освобождается, и мы можем детектировать излучение определенной длины волны.

atatttatatcttagtgatggaacaagttactcatatagaaffgtagcttattc atatttatatcttagtgatggaacaagttactcatataqaa~

■ щвдшг .

HJafl t»tí£t t gs t£sca -;c5 [¡

s ffi m ¡дда S £ И 3 S5E Яш- í 5 2 ЕВВВЗНЕ 5 * " " 3SC

АЛ 7 A АЛЛ'

SE Е

эЖЕ ШЕ g за

Шзссаc]ttgtctt'3ctattсааЯЙВИЩ^ЯД• @ ffi

Рис. 11. Места отжига праймеро» и флуоресцентного зонда на нуклеотидную последовательность региона, тесно сцепленного с локусом Ve

Рис 12 Результаты скрининга образцов на наличие доминантного аллеля гена устойчивости томатов к вертициллезу (Уе) Пояснения в тексте

На рисунке 12 представлены результаты детекции флуоресценции на приборе «Джин» Высокий уровень сигнала по каналу РАМ («Специфика») указывает на то, что в исследуемом образце присутствует доминантный аллель гена устойчивости томата к вертициллезу Уровни сигнала представлены графически в правой части окна программы Образцы, несущие признак устойчивости к вертициллезному увяданию, отмечаются знаком «+» в колонке «Результат», образцы, чувствительные к заболеванию, отмечаются знаком «НД» («нет детекции») в той же колонке В качестве фоновых по уровню флуоресценции образцов, используется та же реакционная смесь, что и для других образцов, но без добавления матричной ДНК Это позволяет избежать ложных результатов, вследствие спонтанного разрушения зонда Тая-полимеразой

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Примененный нами методологический подход - сравнительный анализ локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых к фузариозу и вертициллезу генотипов томата - позволил нам выявить нуклеотидные последовательности новых генов-гомологов у неустойчивых форм томата Анализ данных локусов у неустойчивых форм томата был проведен впервые На основании выявленных нами различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата по локусам устойчивости к фузариозу и вертициллезу созданы новые эффективные ДНК-маркеры

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор выражает огромную признательность Григорию Федоровичу Монахосу, директору селекционной станции им Н Н Тимофеева за предоставленный растительный материал, Якову Игоревичу Алексееву (ЗАО «Синтол») за помощь в освоении ПЦР в реальном времени, Игорю Александровичу Фесенко, старшему научному сотруднику Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева, за помощь в проведении исследований и ценные советы

Всему коллективу Центра молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА имени К А Тимирязева за помощь, понимание и поддержку

выводы

1 Клонированы нуклеотидные последовательности локусов 12 и Уе у устойчивых и неустойчивых форм томата Сравнительный анализ показал высокую степень гомологии между нуклеотидными последовательностями указанных локусов у устойчивых и неустойчивых генотипов

2 Выявлен полиморфизм на молекулярном уровне в локусах 12 и Уе у устойчивых и неустойчивых генотипов, на основе которого созданы высокоэффективные ДНК-маркеры

3 В локусе 12 неустойчивого генотипа 5 езси1епШт выявлены последовательность имеющая высокую степень гомологии к гену 12С-5, и ранее неизвестная последовательность ДНК, гомологичная гену 12 Б ргтртеПфзЬит

4 В локусе Уе неустойчивых форм томата выявлены нуклеотидные последовательности с высокой (более 96%) степенью гомологии к описанным ранее генам-гомологам Уе1 и Уе2

5 Выявлен полиморфизм по сайту рестрикции рестриктазы ХЪа I между локусами Уе устойчивых и неустойчивых генотипов На основании данного полиморфизма создан кодоминантный САРБ-маркер

6 На основании ранее выявленного полиморфизма в регионе, тесно сцепленном (0,67±049 сМ) с геном устойчивости томата к вертициллезу (Ка\\сЬик, 1998), создан новый кодоминантный ЗСАЯ-маркер

7 Создана флуоресцентная тест-система для детекции доминантного аллеля гена устойчивости томата к вертициллезу с помощью ПЦР в реальном времени или конечной детекции флуоресценции

Список опубликованных работ по материалам диссертации

1 M.Y. Kuklev, IA Fesenko, GI Karlov Флуоресцентное маркирование гена устойчивости томата к вертициллезу (Ve) с помощью молекулярных беконов (Fluorescence targeting of Verticillium dahliae resistance gene (Ve) in tomato with molecular beacons) Abstracts of Proceedings of the 4 International Iran and Russian Conference m Agriculture and Natural Resources 2004, P 94-95

2 Куклев М.Ю., Фесенко И A, Карлов Г И Разработка флуоресцентной тест-системы для выявления устойчивых к вертициллезу форм томата - М Известия ТСХА, выпуск 4, 2006, С 115120

3 Фесенко И А, Куклев М.Ю., Карлов Г И Создание ДНК-маркера гена устойчивости томата к фузариозному увяданию — М Известия ТСХА, выпуск 1, 2007, С 66-73.

1,0 печ л

Зак 361

Тир 100 экз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им К А Тимирязева 127550, Москва, ул Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Куклев, Михаил Юрьевич

СПИСОК ИЛЛЮСТРАЦИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Ботаническая характеристика томата.

1.2. Фузариозное увядание томата.

1.3. Вертициллезное увядание томата.

1.4. Гены устойчивости растений к заболеваниям.

1.4.1. Механизмы устойчивости.

1.4.2. Структура и функции протеинов, кодируемых генами устойчивости.

1.4.3. Локализация белков устойчивости и их элиситоров.

1.4.5. Взаимодействие между белками устойчивости и их элиситорами.

1.4.6. Белки устойчивости и передача сигналов.

1.4.7. Проведение сигналов R-белками с помощью предполагаемых сигнальных доменов.

1.5. Структура кластера, содержащего ген 12.

1.5.1. Состав и структура локуса 12.

1.5.2. Характеристика протеинов, кодируемых генами-гомологами семейства/2.

1.5.3. Эволюция генов-гомологов семейства 12.

1.6. Локус устойчивости томата к вертициллезу.

1.6.1. Структура и состав региона, содержащего ген устойчивости томата к вертициллезу.

1.6.2. Белковые продукты генов устойчивости томата к вертициллезу.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительный материал.

2.2. Выделение ДНК из растительного материала.

2.3. ПЦР-анализ.

2.4. Клонирование ПЦР-продуктов.

2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение локуса 12 у неустойчивых форм томата.

3.1.1. ПЦР анализ локуса 12.

3.1.1.1. Пара праймеров U127-UN127.

3.1.1.2. Пара праймеров UP78 и LF79.

3.1.2. Клонирование и анализ ПЦР продуктов, полученных с устойчивого и неустойчивого генотипов.

3.1.2.1. Анализ клонов, полученных от устойчивого генотипа.

3.1.2.2. Анализ клонов, полученных от неустойчивого генотипа.

3.1.3. Структура локуса, аналогичного

S. pimpinellifolium, у неустойчивого генотипа S. esculentum.

3.2. Изучение локуса устойчивости томата к вертициллезу у неустойчивых генотипов томата.

3.2.1. ПЦР-анализ локуса Ve у устойчивых и неустойчивых форм томата.

3.2.2. Анализ нуклеотидных последовательностей локуса Ve у неустойчивых генотипов томата.

3.2.2.1. Анализ нуклеотидной последовательности

ПЦР-продукта праймеров VVF1+VVR1.

3.2.2.2. Анализ нуклеотидной последовательности

ПЦР-продукта праймеров VVF2+VVR2.

3.2.3. Анализ региона, тесно сцепленного с локусом устойчивости томата к вертициллезу.

3.2.4. Разработка флуоресцентной тест-системы для выявления устойчивых к вертициллезу форм томата.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ локусов генов устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу и создание на их основе ДНК маркеров"

Одними из самых распространенных и вредоносных заболеваний на томате и других сельскохозяйственных культурах являются фузариозное и вертициллезное увядания. Урон урожайности от данных заболеваний может достигать 30%, а в случае тепличных условий выращивания - до 50% и более (Jurriaan J. Mes, 1999; Watterson, 1986; Cirulli 1981). Поэтому создание сортов томата, устойчивых к данным заболеваниям, является приоритетной задачей селекции.

До недавнего времени селекции сельскохозяйственных культур на устойчивость к болезням и вредителям использовались фенотипические маркеры. Они могли проявляться на различных этапах развития растений, идентифицироваться визуально или в результате биохимических исследований. Традиционные методы селекции на устойчивость требуют создания инфекционных фонов и трудоемкую оценку каждого образца. Проведение таких работ связано со значительными затратами труда и времени. Селекционный процесс для однолетних культур затягивался на 1020 лет. Применение молекулярных маркеров может ускорить и удешевить селекционный процесс.

В 1990-х годах начало бурно развиваться новое направление в селекции - селекция, основанная на молекулярных маркерах (MAS - marker assisted selection). В 1998 году Kawchuk с соавторами предложили SCAR-маркер, тесно сцепленный с геном устойчивости томата к вертициллезу (Kawchuk et al., 1998). А в 2007 году Фесенко И.А с соавторами сообщили о создании CAPS-маркера на ген устойчивости томата к фузариозу (Фесенко И.А. и др., 2007). Использование ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому. Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов устойчивости. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре локусов генов устойчивости у устойчивых и чувствительных к фитопатогену генотипов.

Сравнительный анализ и изучение организации кластеров и локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов в пределах одного вида проливает свет на эволюцию формирования устойчивости к различным фитопатогенам. Информация о структуре локусов у неустойчивых форм растений, аналогичных таковым у устойчивых генотипов, дополнит наши знания о строении и функциях доменов, свойственных генам устойчивости.

Целью работы являлся сравнительный анализ локусов генов устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу у устойчивых и неустойчивых форм томатов. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Создать библиотеку последовательностей ДНК локусов (кластеров) устойчивости томата к фузариозу и вертициллезу;

2. Провести сравнительный анализ организации кластеров у устойчивых и неустойчивых форм растений;

3. Разработать эффективные системы маркирования генов устойчивости.

Нами впервые проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав локусов 12 и Ve, у неустойчивых к фузариозу и вертициллезу форм томатов. Проведено сравнение структуры вышеуказанных локусов у устойчивых и неустойчивых форм томата.

Показано, что в локусе, аналогичном локусу 12 S. pimpinellifolium, у S. esculentum присутствуют, по меньшей мере, два гена-гомолога, причем один из них уникален по своей структуре.

Показано присутствие в локусе Ve у неустойчивых генотипов томата нуклеотидных последовательностей, имеющих высокую степень сродства к ранее клонированным Kawchuk с соавторами (2001) генам устойчивости Vel и Ve2. Выявлен полиморфизм по данному локусу между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата. На основании данного полиморфизма создан кодоминантный CAPS-маркер.

На основании нуклеотидных последовательностей региона, тесно сцепленного с локусом Ve (Kawchuk et al., 1999), создан удобный в применении при массовом анализе селекционного материала на устойчивость к вертициллезу кодоминантный SCAR-маркер. На основании полиморфизма в данном регионе синтезирован флуоресцентный зонд, позволяющий быстро выявлять в селекционном материале растения, несущие доминантный аллель гена устойчивости томата к вертициллезу, с помощью ПЦР в реальном времени или детекции флуоресценции по конечной точке (end-point detection).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Куклев, Михаил Юрьевич

выводы

1. Клонированы нуклеотидные последовательности локусов 12 и Ve у устойчивых и неустойчивых форм томата. Сравнительный анализ показал высокую степень гомологии между нуклеотидными последовательностями указанных локусов у устойчивых и неустойчивых генотипов.

2. Выявлен полиморфизм на молекулярном уровне в локусах 12 и Ve у устойчивых и неустойчивых генотипов, на основе которого созданы высокоэффективные ДНК-маркеры.

3. В локусе 12 неустойчивого генотипа S. esculentum выявлены: последовательность, имеющая высокую степень гомологии к гену I2C-5; и ранее неизвестная последовательность ДНК, гомологичная гену 12 S. pimpinellifolium.

4. В локусе Ve неустойчивых форм томата выявлены нуклеотидные последовательности с высокой (более 96%) степенью гомологии к описанным ранее генам-гомологам Vel и Ve2.

5. Выявлен полиморфизм по сайту рестрикции рестриктазы Xba I между локусами Ve устойчивых и неустойчивых генотипов. На основании данного полиморфизма создан кодоминантный CAPS-маркер.

6. На основании ранее выявленного полиморфизма в регионе, тесно сцепленном (0,67±049 сМ) с геном устойчивости томата к вертициллезу (Kawchuk, 1998), создан новый кодоминантный SCAR-маркер.

7. Создана флуоресцентная тест-система для детекции доминантного аллеля гена устойчивости томата к вертициллезу с помощью ПЦР в реальном времени или конечной детекции флуоресценции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокая степень гомологичности между нуклеотидными последовательностями локуса 12 у S. pimpinellifolium и S. esculentum говорит об общих путях эволюции локусов устойчивости у этих видов. Однако, по всей видимости, у S. esculentum устойчивость к фузариозу была преодолена патогеном. Дальнейшее изучение и сравнительный анализ данного локуса, возможно, прольет свет на причину потери устойчивости культурным томатом.

Благодаря выявленному в ходе данной работы полиморфизму между локусами 12 и Ve у устойчивых и неустойчивых генотипов томата, удалось создать эффективные ДНК-маркеры. Созданные маркеры успешно применяются на селекционном материале Селекционно-овощной станции им. Н.Н. Тимофеева, селекционных фирм «Гавриш», «Ильинична», «Манул».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куклев, Михаил Юрьевич, Москва

1. Вавилов П.П., Гриценко В.В., Кузнецов B.C. и др.; под ред. Вавилова П.П. «Растениеводство». М.: Агропромиздат, 1986. 512 стр.

2. Куклев М.Ю., Фесенко И.А., Карлов Г.И. (2006) Разработка флуоресцентной тест-системы для выявления устойчивых к вертициллезу форм томата. М.: Известия ТСХА, выпуск 4, стр. 115120.

3. Фесенко И.А., Куклев М.Ю., Карлов Г.И. (2007) Создание ДНК-маркера гена устойчивости томата к фузариозному увяданию. М: Известия ТСХА, выпуск 1, 66-73.

4. Agrios G.N. (1990). Plant Pathology. 3th ed. Academic Press,San Diego, CA. 803p.

5. Baker В., Zambyrski P., Staskawicz B. and Dinesh-Kumar S.P. (1997) Signaling in plant-microbe interactions. Science 276: 726-733.

6. Beckman, C.H., ed (1987). The Nature of Wilt Diseases of Plants. (St. Paul, MN: American Phytopathological Society).

7. Bent A.F. "Plant disease resistance genes function meets structure". Plant Cell 8: 1757-1771, 1996.

8. Bent, A.F., Kunkel, B.N., Dahlbeck, D., Brown, K.L., Schmidt, R, Giraudat, J., Leung, J., and Staskawicz, B.J. (1994). RPSP of Arabidopsis thaliana: A leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes. Science 265, 1856-1 860.

9. Bournival, B.L., Vallejos, C.E., and Scott, J.W. (1990). Genetic analysis of resistances to races 1 and 2 of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici from the wild tomato Lycopersicon pennellii. Theor. Appl. Genet. 79, 641-645.

10. Bruehl G. W. (1987). Soilborne Plant Pathogens. Macmillan Publishing Company, London. 368p.

11. Cirulli M (ed) (1981) Pathobiology of Verticillium species. Mediterranean Phytopathological Union, Firenze, Italy.

12. D'Arcy, W. G. (1972) Solanaceae studies II: typification of subdivisions of Solanum. Ann. Missouri Bot. Gard. 59: 262-278

13. D'Arcy, W. G. (1991) The Solanaceae since 1976, with a review of its biogeography. Pages 75-137 in: J. G.

14. Dangl J.L. (1999) Mechanisms of specific disease resistance: current understanding and future challenges. 9th International Congress on Molecular Plant-microbe interactions, Amsterdam.

15. Dangl J.L., Dietrich R.A. and Richberg M.H. (1996) Death don't have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions. Plant Cell 8: 17931807.

16. Delaney T.P. (1997) Genetic dissection of acquired resistance to disease. Plant Phys 113:5-12.

17. Dhingra O.D. and Sinclair J.B. (1985). Basic Plant Pathology Methods.CRCPress Inc., Boca Raton, Florida. 355p.

18. Diwan N., Fluhr R., Eshed Y., Zamir D., Tanksley S. D. (1999) Mapping of Ve in tomato: a gene conferring resistance to the broad-spectrum pathogen, Verticillium dahliae race 1 Theor Appl Genet 98: 315.319.

19. Dixon M.S., Jones D.A., Keddie J.S., Thomas C.M., Harrison K., Jones J.D.G. (1996) The tomato Cf-2 disease resistance locus comprises two functional genes encoding leucine-rich repeat proteins. Cell, vol. 84, pp. 451-459.

20. Ellis J., Lawrence G., Ayliffe M., Anderson P., Collins N., Finnegan J., Frost D., Luck J., Pryor T. (1997) Advances in the molecular genetic analysis of the flax-rust interactions". Annu Rev Phytopathol 35: 271-291.

21. Ellis, J.G., Lawrence, G.J., Finnegan, E.J., and Anderson, P.A. (1995). Contrasting complexity of two rust resistance loci in flax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92,4185-4188.

22. Fields S. and Song O. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions". Nature 340: 245-246.

23. Flor, H.H. (1971). Current status of gene-for-gene concept. Annu. Rev. Phytopathol. 9,275-296.

24. Fluhr, R. (2001) Sentinels of disease: Plant resistance genes. Plant Physiol., 127, 1367-1374.

25. Frank L.W. Takken and Matthieu H.A.J. Joosten (2000). Plant Resistance Genes: Their Structure, Function and Evolution. European Journal of Plant Pathology, Volume 106, Number 8 / October, 2000, 699-713.

26. Grant, M. R., Godiard, L., Straube, E., Ashfield, Т., Lewald, J., Sattler, A., Innes, R. W., and Dangl, J. L. (1995). Structure of the Arabidopsis RPM1 gene enabling dual specificity disease resistance. Science 269, 843-846.

27. Hashimoto C., Hudson K.L. and Anderson K.V. (1988) The Toll gene of Drosophila, required for dorsal-ventral embryonic polarity, appears to encode a transmembrane protein. Cell 52: 269-279.

28. Johal G.S. and Briggs S.P. (1992) Reductase activity encoded by the HM1 disease resistance gene in maize. Science 258: 985-987.

29. Jones J.D.G. (1997) Plant disease resistance a kinase with keen eyes. Nature 385: 397-398.

30. Jurriaan J. Mes, Emma A. Weststeijn, Frits Herlaar et al. (1999) Biological and Molecular Characterization of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici Divides Race 1 Isolates into Separate Virulence Groups. Phytopathology, Vol. 89, No. 2, pp. 156-160.

31. Kataoka Т., Broek D., Wigler M. (1985) DNA sequence and characterization of the S. cerevisiae gene encoding adenylate cyclase. Cell 43: 493-505.

32. Kawchuk L.M., Hachey J., and Lynch D.R. (1998) Development of sequence characterized DNA markers linked to a dominant verticillium wilt resistance gene in tomato. Genome, 41: 91.95.

33. Kawchuk, L.M., Lynch, D.R., Hachey, J., and Bains, P.S. (1994). Identification of a codominant amplified polymorphic DNA marker linked to the verticillium resistance gene in tomato. Theor. Appl. Genet. 89: 661664.

34. Kearney B. And Staskawicz B.J. (1990) Widespread distribution and fitness contribution of Xanthomonas campestris avirulence gene avrBs2. Nature 246: 385-386.

35. Kobe В., Deisenhofer J. (1994) The leucine-rich repeat: a versatile binding motif. Trends Biochem. Sci. 19: 415-421.

36. Kobe, В., and Deisenhofer, J. (1993). Crystal structure of porcine ribonuclease inhibitor, a protein with leucine-rich repeats. Nature 366, 751 -756.

37. Kobe, В., and Deisenhofer, J. (1995a). Proteins with leucine-rich repeats. Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 409-416.

38. Kobe, В., and Deisenhofer, J. (1995b). A structural basis of the interactions between leucine-rich repeats and protein ligands. Nature 374, 183-1 85.

39. Kooman-Gersmann M. (1998) The Avr9 elicitor peptide of Cladosporium fulvum; Molecular aspects of recognition. PhD thesis Phytopathology, wageningen University, Wageningen.

40. Kumar S., Colussi P.A. (1999) Prodomains-adaptors-oligomerization: the pursuit of caspase activation in apoptosis. Trends Biochem Sci 24: 1-4, 1999.

41. Landschulz W.H., Johnson P.F. and McKnight S.L. (1988) The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science 240: 1759-1764.

42. Landschulz, W. H., Johnson, P. F. & Mcknight, S. L. (1988). The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA-binding proteins. Science 240, 1759-1764.

43. Lauge R., Joosten M.H.A.J., Van Den Ackerveken G.F.J.M., Van Den Broek H.W.J, and De Wit P.J.G.M. (1997) The in planta-producedextracellular proteins ECP1 and ECP2 of Cladosporium fulvum are virulence factors. Mol Plant-Microbe Interact 10: 735-744.

44. Lawrence, G.J., Finnegan, E.J., Ayliffe, M.A., and Ellis, J.G. (1995). The L6 gene for flax rust resistance is related to the Arabidopsis bacterial resistance gene RPSP and the tobacco viral resistance gene N. Plant Cell 7, 11 95-1 206.

45. Mindrinos, M., Katagiri, F., Yu, G.-L., and Ausubel, F.M. (1994). The A. thaliana disease resistance gene RPSP encodes a protein containing a nucleotide-binding site and leucine rich repeats. Cell 78,1089-1 099.

46. Morel, J-B. and J.L. Dangl (1999) Suppressors of the Arabidopsis Isd5 cell death mutation identify genes involved in regulating disease resistance responses. Genetics 151, 305-319.

47. Moyle W.R., Campbell R.K., Rao S.N., Ayad N.G., Bernard M.P, Han Y. And Wang Y. (1995) Mode for human chorionic gonadotropin and lutropin receptor interaction that explains signal transduction of the glycoprotein hormones. J Biol Chem 270: 20020-20031.

48. Parniske M. and Jones J.D.G. (1999) Recombination between diverged clusters of the tomato Cf-9 plant disease resistance gene family. Proc Natl Acad Sci USA 96: 5850-5855.

49. Rohe M., Gierlich A., Hermann H., hahn M., Schmidt В., Rosahl S. And knogge W. (1995) the race-specific elicitor, NIP1, from the barley pathogen,

50. Rhynchosporium secalis, determines avirulence on host plants of the Rrs 1 resistance genotype. EMBO J 14: 4168-4177.

51. Ryals J.A., Neuenschwander U.H., Willits M.G., Molina A., Steiner H.Y. and Hunt M.D. (1996) Systemic acquired resistance. Plant Cell 8: 18091819.

52. Ryerson D.E. and Heath M.C. (1996) Cleavage of nuclear DNA into oligonucleosomal fragments during cell death induced by fungal infection or by abiotic treatments. Plant cell 8: 393-402.

53. Saraste, M., Sibbald, P.R., and Wittinghofer, A. (1990). The P-loop: A common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biol.Sci. 15, 430434.

54. Sarfatti, M., Abu-Abied, M., Katan, J., and Zamir, D. (1991). RFLP mapping of /7, a new locus in tomato conferring resistance against Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici race 1. Theor. Appl. Genet. 82,22-26.

55. Sarfatti, M., Katan, J., and Zamir, D. (1989). An RFLP marker in tomato linked to the Fusarium oxysporum resistance gene 12. Theor. Appl. Genet. 78,755-759.

56. Sattler, A., Innes, R.W., and Dangl, J. (1995). Structure of the Arabidopsis RPM7 gene enabling dual specificity disease resistance. Science 269,843846.

57. Schaible P, Cannon OS, Waddoups V (1951) Inheritance of resistance to Verticillium wilt in a tomato cross. Phytopathology 41: 986.990.

58. Scofield S.R., Tobias C.M., Rathjen J.P., Chang J.H., Lavelle D.T., Michelmore R.W. and staskawicz B.J. (1996) Molecular basis of gene-for-gene specificity in bacterial speck disease of tomato. Science 274: 20632065.

59. Tang X.Y., Frederick R.D., Zhou J.M., Halterman D.A., Jia Y.L. and Martin G.B. (1996) Initiation of plant disease resistance by physical interaction of Avrpto and Pto kinase. Science 274: 2060-2063.

60. Tang X.Y., Xie M.T., Kim Y.J., Zhou J.M., Klessig D.F. and Martin G.B. (1999) Overexpression of Pto activates defense responses and confers broad resistance. Plant Cell 11: 15-29.

61. Thomas C.M., Dixon M.S., Parniske M., Golstein C. And Jones J.D.G. (1998) Genetic and molecular analysis of tomato Cf genes for resistance to Cladosporiumfulvum. Phil Trans R Soc Lond В 353 (1374): 1413-1424.

62. Tjamos E.C., Rowe R.C., Heale J.B. and Fravel D.R. (2000). Advances in Verticillium Research and Disease Management. APS Press. St. Paul, MN. 376 p.

63. Tornero, P., Mayda, E., Gomez, M.D., Canas, L., Conejero, V., and Vera, P. (1996). Characterization of LRP, a leucine-rich repeat (LRR) protein from tomato plants that is processed during pathogenesis. Plant J. 10, 315-330.

64. Van der Biezen E.A. and Jones J.D.G. (1999) Plant disease-resistance proteins and the gene-for-gene concept. Trends Biochem Sci 23: 454-456.

65. Watterson JC (1986) Diseases. In: Atherton JG, Rudich JT (eds) The tomato crop, Chapman and Hall, New York, pp 443.484.

66. Whitham, S., Dinesh-Kumar, S.P., Choi, D., Hehl, R., Corr, C., and Baker, B. (1994). The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and the interleukin-1 receptor. Cell78, 1101-1115.

67. Wolter M., Hollricher K., Salamini F., Schulze-Lefert P. (1993) The mlo resistance alleles to powdery mildew infection in barley trigger a developmentally controlled defense mimic phenotype. Mol. Gen. Genet. 239: 122-128.

68. Zamir D, Bolkan H, Juvik JA, Watterson JC, Tanksley SD (1993) New evidence for placement of Ve. The gene for resistance to Verticillium race 1. Tomato Genet Coop 43 : 51.52.

69. Zhue Q., Droge-Laser W., Dixon R.A., Lamb C. (1996) Transcriptional activation of plant defense genes. Curr. Opin. Gen. Dev. 6: 624-630.