Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование системы рестрикции - модификации MunI микоплазмы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование системы рестрикции - модификации MunI микоплазмы"

На правах рукописи

ЗАРЕЦКАЯ НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ -МОДИФИКАЦИИ Muni МИКОПЛАЗМЫ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

На правах рукописи

ЗАРЩСАЯ НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ Пил! микопллзмы

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание учаной степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1993

Работа выполнена в Институте Биотехнологии г. Вильнюс, Литовская Республика

"FERMENTAS",

Научные руководители

- член-кор. Ail Литвы, • доктор биологических наук, проф. A.A. Янулайтис,

кандидат биологических наук, научный сотрудник П.С. Стакенас

Официальные оппоненты

- доктор биологических наук, проф. Ю.И. Козлов

- доктор биологических наук Я.И. Бурьянов

Ведущая организация

- Институт Биохимии Литовской Республики

Защита состоится " 12 " октября 1993 года в /У часов на заседании специализированного ученого совета Д.098.12.01 при ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. I.-

С диссертацией мокпо ознакомиться в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан " " СёМ/ЛС^ЪЛ 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' Актуальность_теш. Достижения молекулярной генетики и генной инженерии неразрывно связаны с широким применением ферментов рестрикции, являющихся компонентами системы рестрикции-модификации (РМ), в качестве аналитических реагентов. Вместе с тем, эта ферменты, а также кодирующие их гены являются самостоятельными объектами научных исследований. В настоящее время проклонировано большое число генов рестрикщш-модкфикации и значительная их часть секвенирована (Wilson, 1991). Полученные данные используются как для изучения структурной организации клонированных генов, так и для сравнительного анализа аминокислотных последовательностей с целью выявления эволюционных связей между ферментами рестрикции-модификации, а также поиска функционально и структурно значимых районов этшс белков. Такой анализ позволяет выявить потенциальные районы рестриктаз и метилаз, ответственные за специфическое узнавание субстрата, что является предпосылкой для дальнейшего изучения взаимодействия этих белков с ДНК (Posfal et ai., 1989, Stephenson et al., 1989). Фермента рестрикции-модификации являются белками, отличительная черта которых - высокоспецифическое взаимодействие с короткими последовательностями ДНК. Наиболее многочисленной и просто организованной группой среди ферментов системы рестрикции-модификации являются представители II типа, которые служат привлекательной моделью при исследовании механизмов белок-нуклеинового взаимодействия.

Ц§ль_работы. Исследование системы рестрикции-модификации, выделенной из контаминированных микоплазмой эукариотических клеток.

Задачи:

1. Выделить обнаруженные специфические, зндонуклеазу и ме-тилазу {Muni) из контаминированных микоплазмой эукариотических клеток.

2. Охарактеризовать ферменты в отношении их субстратной специфичности.

3. Провести клонирование генов ферментов рестрикции-модификации Muni в E.coli.

4. Определить нуклеотидную последовательность клонированного участка ДНК. микоплазмы и проанализировать структурную орга-

низанию генов l'uni, включая кодирующие области и потенциальные регуляторние элементы.

5. Провести сравнительный-анализ на уровне аминокислотных последовательностей ме-^у системой рестрикции-модификации МилI к другими представителями ферментов РМ. * ■

УЗУНная_новизна. В настоящей работе впервые обнаружена и охарактеризована полная система рестрикции-модификации Muni, найденная у представителей Molllcutes, в частности в Mycoplasma spccies.

Установлено, чт^. рестриктаза R.Muni и модифицирующая мети-лаза U.Muni узнают последовательность нуклеотидов 5'CAATTG. В..Muni является изошизомером R.Mfel, обнаруженной ранее в Mycoplasma fermentons, и расщепляет узнаваемую последовательность следующим образом: 5'CjAATTG. Показано, что метилаза модифицирует адениновый остаток, расположенный рядом с осью симметрии палиндрома 5'CAm^ATTG. Такая модификация субстрата приводит к устойчивости ДНК к действию ростриктазы Muni.

На основе получинных данных делается вывод о принадлежности Muni ферментов к энзимам рестрикции-модификации II типа.

С целью характеристики структурной организации генов рестрикции-модификации и кодируемых ими оелков были проведены эксперименты по клонированию. Был секвенирован у.часток ДНК микоплазмы длиной 2177 п.н., включающий полную систему рестрикции-модификации. При изучении структурной организации данного участка было выявлено 3 открытых рамки считывания, соответствующие генам ме-тилазы, ростриктазы и предполагаемому регуляторному гену.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков Muni (предсказашг*х на основе нуклеотидной последовательности) с представителями других систем рестрикции-модификации обнаружил гомологию С.Muni с регуляторными белками РииИ-семейства; в мотилазе Muni - один из двух консерватшшх доменов (II домен), характерный для всех Ыб-^дениновых метилтрансфораз, а гомолога I домена в U.Muni обнаружить не удалось.

Впервые г^явлена гомология мегду неизошизомерными рестрикта-зами - liml (5'СЛАТТС), с одной стороны,-и парой изошизомеров ßsrl и EcoRI (5'GAATTC), с другой стороны, причем области наибольшего сходства соответствуют функционально значимым участкам EcoRI, важных для катализа реакции, структурной организации белка

и ДНК-белковых взаимодействий. Выдвигается предположение об аналогичных функциях указанных районов и законсервированных в них аминокислотных остатков и для обнаруженной рестриктазы //uni.

Практичоская_ценность. В настоящее время рестриктаза Muni, выделяемая из клона E.coli, содержащего рекомбинантные плазмида с генами системы РМ Muni, является коммерческим препаратом и находит широкое применение как аналитический реагент в области молекулярной генетики и генной инженерш. Подобранные метода хромато-графической очистки позволяют получить практически гомогенный препарат рестриктазы, который можно в дальнейшем использовать для более глубокого изучения процесса взаимодействия ДКК-белок методами рентгеноструктурного анализа.

Апробация_работы.. Материалы диссертации докладыеэдись на международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и СПИД (Ленинград, СССР, 1991); на 8-ом интернациональном конгрессе по иммунологии (Будапешт, Венгрия, 1992); на 7-ой республиканской научной конференции "Актуальные вопросы аллергологии, иммунолопш и СПИДа" (Каунас, Литва, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

^бьем_и_стр2ктура_щссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. • '

Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 15 рисунков. Библиография включает 217 ссылок.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования - новые специфические зндонуклоаза и метилтрансфераза, обнаруженные в штамме микоплазмы, контаминяру-кдей эукариотические клетки.

В опытах по выделению ферментов использовали контаминирован-ные культуры клеток DS19 и F4N, предоставленные ВОНЦ АМН СССР и Институтом биохимии АН Литвы, а также выделенную из них культуру Мусор1азта зр.

Специфическую нуклеазнуга активность тестировали по способности фрагментировать ДНК фага к (Sharp et al., 1973), а специфическую метилазную активность - по защите этой же ДНК от действия

сопряженной рестриктазы.

Культивирование микоплазмы проводили в питательной среде следующего состава: 3,7 мг/мл сердечно-мозгового экстракта, по 0,5'мг/мл дрожжевого экстракта и NaCl, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, по 0,5« глюкозы и-аргинина, I04 Ед/мл пенициллина, 0,5 мгХ фенольного красного. Суспензионные эукариотические клетк; ву- ^ ращивали в среде DMEM, содержащей дополнительно 10% эмбриональной телячьей сиворотки, 160 мкг/мл гентамицина.

Для экспериментов по клонированию, субклонированию и секве-нировашно использовалм плазмиды pJRD184, pACYC184, pUGl 9. Для трансформации использовали клетки E.coli штамм RRI. Все штаммы клеток культивировали в среде следующего состава (г/л): пептон 10,0, дрожжевой экстракт - 5,0, NaCl - 10,0, рН 7,0-7,2.

ДНК из микоплазмы выделяли по методике, описанной для Нусо-plasma galllseptlcum (Khan et al., 1989), ДНК из эукариотических клеток выделяли по методике (Smith et al., 1982). Плазмидная ДНК была изол!фована по способу (Birnboim et al,, 1979).

Конструирование рокомбинантных плазмид, рестрикционное картирование, лигирование, гидролиз ДНК рестриктазами, дефосфорили-ровашш ДНК, трансформацию и отбор трансформантов, а также электрофорез в агарозном и в денатурирующем полиакриламидном геле главным образом проводили по методикам, описанным в работах Мани-атиса (Maniatls et al., 1982), отщепление нуклеотидов с концов двухцепочечной ДНК проводили с помощью нуклеазы BaZ31 (Legerskl et al., 1986).

Нуклеотидную последовательность клонированной ДНК определяли дидезоксинуклеотидным методом по Сэнгеру (Sanger et al., 1977) с использованном в качества метки как [a-SldATP, так и

по

[a- PJcIATP, руководствуясь методическими указаниями фирмы "Pharmacia".

РЕЗУЛЬТАТЫ'И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. 02И5к_И_иссле2ование_систеш_рестржции

В экспериментах, проводимых с целью изучения процесса дифференциации, в эукариотических,клетках DS19 и F4N была обнаружена сайт-специфическая энчонуклеазная активность. Для оценки суб-

стратной специфичности фермент был очищен из экстракта эукарио-тических клеток методами хроматографии <табл. I). Очищенная таким образом эндонуклеаза сила пригодна для дальнейших исследований по определению субстратной специфичности. Было обнаружено, что для исчерпывающего фрагментирования субстрата необходимы только ионы магния, что указывало на возможность того, что обнаруженный нами фермент является типичной рестриктазой II класса. Для определения субстратной специфичности в отношении узнаваемой последовательности нуклеотидов использовали традиционные косвенные и прямые методы Butkus et al., 1987, Fuchs et al., 1978, 1980). Методом картирования были локализованы координаты расщепляемых участков ДНК фагов \ и ФХ174. Рассмотрение известных нуклеотидных последовательностей ДНК этих фагов в окружении картированных точек расщепления позволило обнаружить последовательность 5'СААТТС. Для подтве-рздения саР "а узнавания исследуемой эндонуклеазы и определения места расщепления 5'-меченый синтетический самокомплементарный декадезоксиолигонуклеотид S'-pdCGCAATTGCG, содержащий предполагаемый узнаваемый сайт, инкубировали с исследуемой рестриктазой. Продукты гидролиза разделяли хроматографией на ДЭАЭ-целлюдозе. В качестве маркера использовали частичный гидролизат того-же печенного олигонуклоотида. Единственным меченным продуктом оказался ■ тркнуклеотид pCGC (рис. I) Полученные результаты указывали, что • рестриктаза расщепляет субстрат следующим образом: 5'C»AATTG 3*

Как правило, ростриктазе в клетках сопутствует csp;*--специфическая ДНК-метилаза, модифицирующая ту же последовательность нук-леотидгг, которую узнает и сопряженная эндонуклеаза. Путем хроматографии ядерных экстрактов контамгашровашшх эукариотичоских клеток была очищена метилаза (табл. I), способная полностью защитить ДНК от действия исследуемой эндонуклеазы. Для определения природы метилированного основами и его положения в узнаваемом участке руководствовались ранее описанной мотодикои (Klimasausltas et al., 1990) с использованием снлтетического олгсгонуклэотидного дуплекса d(CGCAATTGCG),'который инкубировали с исследуемой мэти-лп;к,й в присутствии [%]-Лдомет. Метилированный субстрат подвергали гидролизу при помощи нуклеазн Р1 и щелочной фосфатазы. Продукты роакции анализировали методом-HPLC Бместе с заранее подгот товлонными стандартами n4dCyd, m5dCyd, ra6Ado и измеряли радиоактивность в отдельных пиках ('рис.2). Оказалось, что.радаоактив-

Схема очистки ферментных препаратов

Таблица 1

Название фермента Количество биомассы Стадии очистки

I- II III

Я.Мизг!* М.Мип1* 9x10У клеток 2x107 кле-. . ток Ф^И (1,5x9 см) б„фер В, 0,15 М КаС1 Э: 0,15-0,8 М ЫаС1 ОЗБ: 200 мл ЭФ: 0,4-0,5 М N301 ФРИ (1,5x4,5 см) буфер Г, 0,15 Л!-ЦаС1 Э: 0,15-1,0 М НаС1 ОЗБ: 100 мл ДЭАЭс (1,5x6 см) буфер В Э: 0-0,6 М N301 ОЭБ: 150 мл ЭФ: 0,16-0,2 М N301 ГС (1x5 см) буфер Г, 0,15 М N301 Э: 0,15-0,8 Н N301 ОЭБ: 100 мл ГС (1,5x3 см) буфер В Э: 0,2-0,7 М КаС"1 ОЭБ: 100 мл ЭФ: 0,5-0,6 М ЫаС1

** П.Ыип! ** М.йигс! 20 г 5 г ГС (1,5x16 см) буфер Г, 0,1 М МаС1 Э: 0,1-0,8 М ИаС1 ОЭБ: 400 мл ЭФ: 0,56-0,64 М ИаС1 ФРИ (1x10 см) буфер В, 0,1 М ЫаС1 Э: 0,1-0,8 М N801 ОЗБ: 100 мл ■ЭФ: 0,5-0,8 М НаС1 ЦТС (1,5x12 см) буфер Г, 0,1 М N301 Э: 0,1-0,8 М N301 ОЭБ: 300 мл ЭФ: 0,36-0^46 М N801 ДЭАЭс (1x10 см) буфер В, 0,2 М №01 Э: 0,2-0,8 М N301 ОЭБ: 100 мл ЭФ: 0,02-0,15.М N301 ФРИ (1x10 см) буфер Г, 0,1 И N301 Э: 0,1-0,8 М МаС1 ОЭБ: 130 мл . ЭФ: 0,4-0,5 М^аС1 ГС (1x10 см) буфер В,0,15 М N801 Э: 0,15-1,2 М N301 ОЭБ: 100 мл ЭФ:0,65-0,85 М N301

Примечания к таблица I: * - очистка ферментов из контаминиро-нных эукариотических клеток, ** - очистка ферментов из E.col i.RRI, содержала рекомбинантные плазмиды, ФРИ - фосфоцеллюлсза PII, ДЭАЭс - ДЭАЭ-сефароза, ЦТС - голубая сефароза, ГС - гепаринсефа-роза, Э - границы концентрату соли при элюции линейным градиентом, ОЭБ - объем элюирущего буфера, ЭФ - интервал концентрации соли, при которой элшруется основная часть фермента. Рядом с названием сорбента указаны размеры колонки (в скобках), а на второй строке - буфер, которым он уравновешен.

ФрСбС

о.г

0.1

*?яо

ro4Cyd

m5Cyd

m6Àdo

. !Ь es

ЬрСКЯ. til

Рис. I. определение места расщепления декадезсксинуклеотида

32pCGCAATTGCG исследуемой эндо-нуклеазоЯ Html: 1 - гидролиз рестриктазой ami, 2 - частач-ный З'-экзонуклеазннй гидролиз Фосфодиэстеразой змеиного яда. ХС - краситель ксиленцианол FF.

Рис. 2. HPLC анализ продуктов

гидролиза 3Н-металкрованного декадезо^синуклеотида 5'CGCAATTGCG вместе со стандартами ra4Cyd, ra5Cyd, m6Ado.

ность обнаруживается только в пике, соответствующему шьАс1о (98% от суммарной радиоактивности). Для определения местоположения модифицированного основания °Н-метилированный олигонуклеотид фосфо-рилировали Т4-полинуклеотидаиназой в присутствии 1732РЗ-АТФ и подвергали частичному гидролизу фосфодиэстеразой змеиного яда. Продукты реакции анализировали методом нуклеотидных карт и измеряли "Н- и Р-радиоактивность (табл. 2). Результаты опыта свидетельствует, что метилзза модифицирует центральный адешш в узнаваемой последовательности: 5'САтбАТТС.

Таблица 2.

Измерение 3Н- и 32Р-радиоактивности в продуктах частичного З'-экзонуклэазного гидролиза декадезоксинуклвотада, кодифицированного метилазой ¡¿uni.

Радиоактивность (имп/мин)

Продукты зн 32 p Отношение

гидролиза " 3H/ 32P

PC - - -

pCG - -

pCGC 20 106 0,2

pCGCA 29 50 ' 0,58

pCGCAA 432 1 34 . 12,7

pCGCAAT 200 27 7,2

pCGCAATT 180 10 10,0

Совокупность полученных данных свидетельствует, что в исследуемых клетках содержится типичная система рестрикции-модификации II типа. Однако такие ферментные системы обнаружены только в • прокариотах и некоторых вирусах низших, эукариот (\vilson,'1991). Известно, что многие лабораторные линии клеток заражены микоплаз-мами. Доказательство наличия микоплаош было получено микробиологическими методами (Борхсениус и др., 1989). Бесклеточные экстракты Евделенной микоплазмы проявляли эндонуклеазную активность, идентичную активности рестриктазы, полученной из клеток эр^тро-лейкемии. Для установления видовой принадлежности микоплазмы была проведена дот-гибридизация с видоспецифическими зондами. Однако результата гибридизации не позволили однозначно идентифицировать

видовую принадлежность микоплазмы, поэтому она первоначально была условно названа Mycoplasma unidentified, а обнаруженные в ней ферменты согласно общепринятой номенклатуре (Smith et al., 1973)-R.Jftinl и U.Muni. Для более полной характеристики генов, кодирующих ферменты рестрикции-гмодификации Muni, были прояздздг эксперименты по клонированию.

2. Клонирование и локализация генов РМ Muni

Стратегия клонирования генов систем! рестрикции-модификации Muni основывалась на селекции самомодифицированных рекомбинаит-ных плазмид, которые были бы устойчивы к действию рестриктазы Html. В качестве вектора клешфовочия использовали г:.\оо:лзду PJHD184, в которую встроили два синтетических олигонуклеатида, включающих Muni сайт (pJRD184-M). Библиотека, состоящая из 500.000 клонов, была получена после трансформации клеток E.coïi RRI лигатом Sav3AI фрагментов ДНК микоплазмы с вектором PJRD184-M, расщепленным по BgZII сайту и дефосфорилировангшм. Тотальную ДНК рекомбинантных плазмид обрабатывали избытком Я.Muni и ретрансформировали E.coli. В 13 из IS проверенных рекомбинантов ДНК была устойчива к пиролизу Muni эндопуклеазой, указывая, что в них зкспрессируется метилтрансфераза. С дако ш в одном из 13 клонов, экспрессировавших метилазу, не удалось бнарукить растри-ктазную активность ни по ограничению фага, ни по реакции фрагкен-тирования ДНК-фага к бесклеточкыми экстрактам этих клоноа. 5 рекомбинантных плазмид, а также некоторые ja производные были подвергнуты рострикционному и делеционному картированию (рис. 3). Было обнаружено, что во всех вставках содержится общий EcoRV-CZal фрагмент, кодирующий-предположителько метилазу. Так как область 4,5 кб (в одной из рекомбинантных плазмид рМип!-!6,2) является достаточно протяженной, чтобы содержать эндопуклеазный ген и интергенный район, но ни в одном из клонов не била определена рестрик-тазная активность, было-сделано предположение, что гглтШ ген локализован ка противоположной стороне от EcoWJ-Cläl субфрагмента. Поэтому метилазный ген реклонировали на перекрывающемся фрагменте. Эксперименты по субклошфованию обнаружили, что ClaX- сайт находится рядом с геном метилазы, но ке затрагивает сам ген. фрагменты ДНК микоплазмы, полученные после гидролиза Clal рестрикта-

m i Ш

ll I, T I 1!/

pA/imM5.7 ~

рЛ/ипМЗ.б

fit/и л M 2.6

p&/unM2.2 —

A£coRVpA/unM6.2

ДС7а1рЛ/ипМ2.6

«—Ap

-»Ap

-»Ар

бкь «-Тс

-Ар

£VoRV C/ol

♦—Ар

Рис. 3. Субклош и рестриктазная карта вставок, содержащих Kuril модифицирующий фермент. Два черных блока в векторе pJRD184-M соответствуют двум встроенным олигонуклеотидам, содержащим llunl-сайты узнавания. Стрелга указывают направление транскрипции генов Тс и Ар .Заштрихованная область обозначает район ДНК, кодирующий метилазу Muni.

вой, били гибридизированы по Саузерну с 0,8 кб //col-фрагментом рекомбинантной плазмида рйилМЗ.б, представляющим часть метилаз-ного гена и,вектора. В результате был выявлен фрагмент величиной 3,2 кб, предположительно достаточно протяженный для кодирования как метилазы, так к рестриктазы.

Умтыиая тот факт, что не всегда попытки клонировать полную систему рестрикции-модификации, лежащей на одном фрагменте, были удачными (Howard et al., 1988, Bocklage et al., 1991),' в качестве рецшшентного штамма использовали клетки E.eoli, несущие клониро-

ванный метилазный ген на плазмиде р!?илМ6,2. ДНК микоплазмы была полностью расщеплена R.CZal. Фракцию фрагментов, включающих и 3,2 кб фрагмент, дотировали с Clal расщепленным и дефосфорилированным вектором рАСУС184. После трансформации E.colt (рШл.М6,2) было пот лучено 360 клонов, из них 24 клона ограничивали рост фага X. Из всех 24 клонов были выделены бесклеточные экстракт.»)... в которых тестировалась рестриктазная активность in vitro. В II экстрактах выявили характерное для R.Munl фрагментирование ДНК фага X. ДНК отобранных трансформантов была устойчива к воздействии R.Мита. Следовательно, рекомбинантные плазмиды содержали гены, экспрес-рующие как метилтрансферазу, так и эндонуклеазу Muni, и вся РМ Muni система находится в пределах 3,2 кб фрагмента микоплазмати-ческой ДНК. Одна из плазмид (названа pAftmRM3,2) былт 7,егюльзозана в дальнейших экспериментах. Попытки получить клоны, содержащие только piíunRM3,2, но дали положительного результата, подтверждая предположение, что система РМ Muni не клонируется напрямую.

Для оценки экспрессии генов РМ Muni в E.colt, а также с целью использования ферментов в качестве аналитических реагентов были разработаны методы очисткл рестриктазы и метилазы (табл. I), Выход очищенных, целевых ферментов составил 60.000-80.00С ед. рестриктазы и 50.000 ед. метилазы на г биомассы.

3. Организация генов и'анализ их'нуклеотидпой ■ последовательности

В результате секвенирования была определена последовательность 2177 пар нуклеотидов обеих цепей клонированного фрагмента (рис. 4). Поиск кодирующих областей" выявил две открытые ратаи считывания (ОРС), достаточной длины для кодирования кзтилазы и рестриктазы: большая - GS9 н.п., кодирующая белок из 233 аминокислот (метилаза), и ыэнкзая - 606 н.п., кодирующая 202 аминокислоты (рестриктаза). Гены дивзргентно направлены и разделены областью длиной'358 н.п. Гену рестриктазы предшествует короткая ОРС (кОРС) протяженностью 222 н.п. и отделенная от munIR иестью нуклеотиднымй парами. Ориентация кОРС та же,что и mxmlR гена.

Области, прилежащие к трем ОРС, были проверены на присутствие канонических промоторных последовательностей Mycoplasma

1 статсаотта?>таастатостаатоатсаааттаттатсатас;ааасастсааоасаааоаасттсссса1аттсаатас 81 САССССЛАСТААССТАААААТАТАТАСАТТТАСТААССАТААССААААА0СААСАТАТ0СС7ТСТТАСАТС<К)СССТТТТ 161 тсааалттасслосатааасааааатсоттасттатаатаатттатсслааттсстсатсоатааааататкастааааа

2 41 ссаасттосссатосас€тоаасттасттсатстасаатйтсааасттааасаааостсаааатсттастаг'гсатоттс 321 тттйтаасатттстаасоссттсастотсасттсаасаататаатссаатататаааассатаатааааас* „стссста

■ Ьор

401 стассаатталстлссаасслссас » ттстстаттатттаттстсатстатттссссттоастатстатттстаттттат

•ККЕО1ЕС0ТР1Е1КМ

4 81 татсасюаатттстастссссааттатсссатссаасааааттатттссаосааатааттстаттттатсттсасстссс

218 ОР1ЕЬОНКииСУГИКИАГ1.Е1КООА*

5 61 алсатттттотааттссатсааттасайсатаасссттттсостатлтсссстстатстатттссаааасттсгсттас 192 гмкт1с01уаурке5носяк1оьь0ку 641 атттстаостсстсттссаоття<х:аттттсссттттттеаатассаааассааттстотттсссатаааотататсттс

165 nragrptpikgkkfvi.vfetqsi.TyRG

721 саооаттстссассаттттатсссааасааатссаастсттттататтсааасссссаасастсассаасаасааттсаа 138 рынуикоиугауткуегсизесььхб 801 ттаоссат1тслсстсстсттстссасат;1/'"'таасатссастсатсаск:аотаатастаосгасатстасстсстссаа 112как0рсттнм> 1.1с01>ат15ру01.(101. 8 81 ттсттттастттсааастссса \tttaaatgatgcagaacttataaatatatctcttttaaaaccttcattttcagatt 85 ек1.к1.трукг£л551г1011крсене5к 961 тааттстгллтттатсататтосатттттсссссатаетсссатсотосатстосатааатсасттоататттттттстт 58 утзксу(гмкссу0кррвау1у0уккк 1041 сстлаттстссаалаасттс атсаайсосаттаасттттстаттттттттсосттттттаттатааатасаататосаот 32 р1.0ргуе01.рхуктыккаккну15уат вип1И

1121 тассттоттттссататтаасстсстаасссаатттаттататсааааааатастаааастсаастосастйттйсттат 5 v к n е м 30 -10 -35

шпЮ

1201 айтсссттг.тттттааасаасатттттсатлтааттаатсагаттттттсаос.татаааттатсаатсататсааааттс

-35 -10 вй м n 0 i к i

1281 сттттссаалтаааттаааааааттасоааллсаааасасасасттааатсассаатсттттоссосасааатасасстт 7 ягснкьккьякектсь50е5гаа011>ь 1361 сатасаасатастастсттстаттсаааатйсаааалссаатотатстттастааатстаоаааааататстссассатт 34 октуу55 1екскяну5ьуы1.ек15ас1

8Э аЬор ШШ11Я

14 41 асстатсастттатстсаастттттайтсататссааааойаотаааааатйсстааатстсааттааотссааоаттаа

61 С1ТЬЗЕЬГ501ЕКЕ* МСКЗЕЬЗБЯ!, 1521 АТТСССААОСАТТ'КСТОСАТТААААССТЛОТССТОСТСаЛСААААСТТАТАТААСОТСТТТААСССТОТТТТТОААООА

12 НИ0А1АСЬКА5САЕ0«ЬУЫУГНАУГЕО

1601 астааатлсоттттатассасаасссаааосассттааааатстатасостсааотастсттасстсатйатсттаттаа

39 ткууьуекркн1кыьуаоуу1.?ооу1к 1681 асааатттттамсстттааттсатттатсаастастсаатссоссотттстссаоатттсослатаоаааатасасааа

66 Е1Г11Р1,101.3ТТ0ИОУЗРГГА1ЕиТЕ 1761 сссаталааттстттттсстсааатталаааасаасатсоатссотасаайстааасатсстастсстоссасссстаат

92 тнк1 ь р с е i ккоосмуескорбасксн 1в 4 1 ссасатсасасатсттотаааттатттастсстссаттаттааааосттатасаасааттсстссааттаасоатсааоа

119 анек5ск1.гтрс1.1.каукт1с01мсее 1921 сататтс€саттстсостт6тлттсс.\аостоататаасассасатссса.-1аасаотаасаоаааттастттстсстатс

146 1ьргууугес01тк0рквуке1тгну 2001 ассасосолаалаттасттсаасасттсаатсаааааттаааалаататттаоаттаааттатааосстатассаатста

172 о к у о 0 n у г н и 'я р n е 5 с е к ь v 0 н г н е к ь

аЪор

2081- ттаааттатат'гстстатасост—ттаааттатааатосттааатсстсссааатосттастатсааоатааттатттс 199 к к у ь 0 • 2161 АТОТОСССАССАААТйА

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК микоплазмы, включающего гены мстщи£м, рсстриктазы и регулнториын ген. Под пук-леотидной последовательностью приведены аминокислотные последовательности открытых рамок считывания. Направление и предполагаемое начало транскрипции белков указано стрелками. Подчеркнуты предполагаемые области связывания с рРНК (50), а также возможные промоторные зоны -35 и -10.

(Christiansen, 1988). Такие последовательности были найдены перэд генами mxnlM и ггип 1С (шс. 4). Перед гензч рестриктазы была обнаружена только последовательность, напоминающая участок связывания с рибосомами (Shine-Dalgarno). Локализация и структура известных промоторных и SD последовательностей, обнаруженных в Mycoplasma, похожи на регуляторные последовательности транскрипции и трансляции E.coli (Christiansen, 1988). Это указывает на то, что клонированные гены системы РМ Muni экспрессируются в E.coli под контролем последовательностей микоплазматической ДНК. Дополнительным аргументом в пользу этого предположения служит и организация генов: они транскрибируются дивергентло с интергенной области, которая, несомненно, происходит из ДНК микоплазмы. Кроме того, экспрессия гена метилазы независимо от его ориентации (рис. 3) также указывает на возможность транскрипции с собственного промотора.

Последовательность, аналогичная промоторной регуляторной зоне Mycoplasma [E.coli), перед геном рестриктазы не найдена. Возможно , что. оба гена munie и munIR транскрибируются с промотора регуляторного гена. Вышеуказанное позволяет предположить участие гена шп1С в регуляции экспрессии гена эндонуклеазы.

4. Сравнительный анализ еминокислотшх последовательностей

Сравнение предсказанных аминокислотных последовательностей рестриктазы и метилазы Muni не выявило гомологий, что наблюдалось и в других аналогичных исследованиях секвенированных до сих пор генов рестрикции-модификации (Wilson, 1991). Эти наблюдения подтверждают общепринятый вывод, что ферменты рестрикции-модификации не имеют эволюционных связей и узнают идентичный субстраты, используя разную стратегию.

В ряде систем рестрикции-кодификации наряду с генами рестри-ктаз и метилаз выявлены короткие открытые рамки сшивания (Вгоокз et al., 1991, Tao et al., 1991,.Tao et al., 1992). Предполагаемым продуктам otîîx генов, получившим название, контролирующих, отводится регуляторная роль (Tao et al., 1991). Их сравнительный анализ выявил группу родственных бежоз, получивших название C.PuuII семейства (Tao et al.r 1991).Наблюдаемая гсмалогия между полипептидом, кодируемым ттЮ геном, и соответствующим! короткими Селкамл этой группы позволяет отнести его„к семейству

pvuîl (рис. 5). Ген munie, как и в случае других систем рестрик-ции-модифпкации, имеющих в своем составе контролирующие гены pwll семейства, расположен перед геном рестриктазы. Представленные данные позволяют предположить регуляторную роль для C.&'unl полипептида.

С.Muni MNDITIRFGNgLKftfLHKEKTDl

с .ртип msrntnplsarltiaSnvQkmrgelgJS

C.BamUl MTNHIRLLFGeSVRQIRLSKSNM

С.Яиа! MDIKEILAENVRSYR-HINNf

c.ïoorv msvreiikQnrv-ick]

IaqicED

DLVGIH FECDpjH E I S GfcjH ALGKPQSHl

Ш1

tîVl

С.Mnnl С .Pv-ul I С .BamlII С . SniZ С.JScoRV

LnKnoAGWJlTLSEjjFSDIEKm* IRRHANAMÏÏVSIsIRmmeНЕКШЗ PRSK* lBK0sKA№jVQPKDHLDFÏTIGHCEOKK* 5T0STLI XLAKAlJÏÏTSVPKHLTRQOLKilEQG* 1 D VD E FI A[^CFA P X KT LKE VIM^KKHE S S F*

Рис. 5. Сравнение аминокислотной последовательности кОРС МилI с четырьмя контролирующими белками системы РМ II типа. Выделе ш области, содержащие консервативные позиции.

При сравнительном анализе ДНК-метилаз было выявлено два общих' консервативных участка: (Б/3/Е)-Е'-0-0 (I домен) и (Б/8/Н/С)РР(У/Р) (.II домон), участвующих в катализе метилирования ДНК (КИтаааизкаа ег а1., 1989, Ьаизгег, 1989, РозГа1 ег а1., 1989). Так как »мтилаза Ыип1 является 6-метиладениновой, то предполагалось наличие двух указанных выше консервативных областей. Одпако была выявлена только одна последовательность БРРУ/, напоминающая характерный ii домон. Следует отметить, что ото. первый • случай, когда ?/ остаток появляется вместо ¥ или У аминокислот во втором участке. С другой стороны, все три аминокислоты являются структурно близкими ароматическими остатками, поэтому их замену друг на друга можно оценивать как консервативную. Типичной структуры, соответствующей канонической последовательности I домена, в йип! метилазе обнаружить не удалось.

Сравнение аминокислотных последовательностей, предсказанных на основе структуры клонированных генов, выявило некоторую гомологию рестриктазы Иип1 с парой изошизомерных ферментов Нзг1 и

EcoRI (рис. 6).

Ранее было ус- новлено.что в ип,- изомерах EcoRI и fisrl на фоне общей гомологии выделяются 6 участков длиной 8-17 аминокислот, в которых обнаруживается 75-100% идентичных аминокислот (Stephenson et al., 1989). Cr? дует указать, что наибольший уровень аминокислотного сходства меящу Hxml и EcoRI \RsrI) ферментами был обнаружен в пяти из шести вышеуказанных консервативных районах.

R. Muni 1

R. R.rl I

R. Zoo RI 1

R. Muni 32

R. R»rl 52

R. EooRX 56

R. Muni 91

R. R.rl 108

R. ïooRX 102

R. Muni 140

R. R»rl 167

R. Saoul 161

R. Muni 185

R. R»rl 227

R. JTaoRI 221

MGKS-LSGrîUÎWQXLAOLKASGASQHLVNvn KAOEVErKCKGGALRLGIQQÏI.aaapI,3irOAAJ.QKHnLSIRZVTACVLTKLAED-FPHLE!| MSNKKQ3HRLTEQHKL9QGVIGX FCDYAKAHOLAVGEV3KLVKKAL3HE — YPQLSy

1-

-I

л t.^vFEOTl^LYSKPKHLKM-rjYAQWlPDBVflKïtfWitlBtST'tQVaVSjTÎFAn-gMTr.-

52 _IRT3LTSKAINRXI-RSFDPWG0ALFVESA3Î]R-----------------^.GGnTKVKDR

- . -----oSIKflTEINaALKKIDFcIJaOTLFVaHIsBK-----------------|ïÎ3G[}VQVKriD

ISFC3ISK3

iRVGasQHac

........DR

l--gp9-Aap.yroHrnscraLFTPGLI.KAYRTIG

SliaGKDIIMIPJ^LLV^X&VQBLMAifïSjlQJSl^NISEXAKFML----

II

Рг.". 6. Сравнешю аминокислотных последовательностей рест-риктаз Мил1, EcoRI и ЯзП: римскими цифрами (I-VI) обозначены консервативные районы, найденные для изоиизомеров R.EcoRI и Р RsrI (Stephenson et al., 1989); арабскими цифрами указаны функционально и структурно зна'шмые аминокислотные остатки, в черный блок заключены идентичные аминокислоты.

В соответствии с данными о трехмерной структуре EcoRI (Kim et al., 1990) аминокислотные остатки I и II консервативного районов формируют (З-структуру, включающую каталитический связывающий сайт. Вероятно, что обнаруженная гсиологпл в этих районах между ферментами Мил! и EcoRI (RsrI) отражает общую структурную организацию каталитического центра.

Достаточно протяженный участок гомологии был выявлен в III регионе. Согласно исследованиям трехмерной структуры EcoRI (Kim

et al., 1990) аминокислотные остатки этого участка формируют петлю, предшествующую спирали, и часть спирали, узнающей внутренние пуклеотиды. Следует указать, что все.аминокислотные остатки III района EcoRI (G140, N141, А142, R145), а'также Q115 из II района, участвующие в специфическом контакте с тетрануклеотидом ААТТ (Heitman, 1992, Rosenberg et al., 1987), законсервированы и в Muni ферменте.. Учитывая, что рестриктазы Muni, Eco RI, RsrI имеют в своих сайтах узнавания идентичный тетранукл'еотид ААТТ, можно предположить, что Muni эндонуюшаза при взаимодействии с сайтом узнавания использует те же структурный элементы, что и ферменты EcoRI и Пзг1. Аминокислотные остатки MI37 и AI38 в рёстриктазе EcoRI участвуют в образовании контактов с С нуклеотидом последовательности, узнаваемой EcoRI (Klm et al., 1990). Кроме того, эти аминокислоты предшествуют спирали, узнающей внутренние нуклеоти-да. Указанные аминокислоты отсутствуют в рестриктазе 'Muni, которая узнает в этой же позиции другой нуклеотид - 0.

В IV и V консервативных областях также найдено несколько идентичных аминокислот между ¿uni и EcoRI (ЯзП). Эти районы в EcoRI отвечают за правильную ориентацию основных- элементов, узнающих нуклеотидпую последовательность (Klm et al., 1930). Возможно, что аналогичные структурные элементы присутствуют и в ферменте Muni.

Гомолога, соответствующего VI району EcoRI, выявить не удалось. Амшю1сислотц VI района формируют структурную основу для узнавания внешней пары.нуклеотидов (Klm et al., 1990). Отсутствие гомологии в этом участке, предположительно, отражает тот факт, что ферменты узнают различные внешние пары нуклеотидов: CG - для Muni и GC-пара, узнаваемая EcoRI и RsrI рестриктазами.

Так как оба фермента Muni и EcoRI (RsrI) узнают родственные гексануклеотида (5'СААТТО и 5'GAATTC соответственно), различающиеся только внешней парой нуклеотидов, и расщепляют в одинаковых позициях, было предположено, что аминокислотное сходство мевду ферментами отражает структурную организацию, важную для взаимодействия с идентичным тетрануклеотидом ААТТ!,

ВЫВОДЫ

I. Впервые у представителей класса Molltcutea обнаружена и

исследована полная система рестрикции-модификации II типа РМ Mml, выделенная из Mycoplasma sp.

2. Разработаны схемы выделения очищенных препаратов рэстрик-тазы ami и сопряженной метилтрансферазы, пригодных для определения субстратной специфичности и для использования в камастве аналитических реагентов в молекулярно-генетических исследованиях.

3. Сайт-специфическая эндонуклеаза узнает последовательность 5'c|aatTG и расщепляет в указанной позиции. Сайт-специфкческая метилаза модифицирует внутренний аденин этой же последовательности: 5'CAm6ATTG.

4. Проведено клонирование микоплазменных генов РМ ¿'uni в клетки В.coll RRI.

5. Определена первичная структура клонированного фрагмента ДНК микоплазмы величиной 2177 н.п. Обнаружено три ои^рытые рамки считывания, соответствующие генам рестриктазы, металазн и, предположительно, регуляторному гену.

6. Проведен сравнительный анализ аминокислотный последовательности белков системы РМ Muni с другими ферментами системы рестрикции-модификации II класса. В системе РМ Mml найдена короткая открытая рамка считывания (кОРС), гомологичная другим контролирующим элементам из семейства Pvull. В M.ííunI обнаружен II домен, являющийся консервативной областью модифицирующих метилтрансфе-раз. Выявлено сходство рестриктазы Muni с R.BcoílI и R.ñarl. Впервые найдена гомология мегду неизошизомерными эндонуклеазами II типа систем рестрикции-модификации в районах, играющих ключовую роль в нуклеотидно-белковом взаимодействии.

Основной мзтериал диссертации опубликован в следующих работах:

1. Стакенас П.С., Зарецкая Н.М., Манелене З.П., Маурицас М.М., Буткус В.В.', Янулайтис А.А. Микоплазменная система рестрик-ции-модификацш l'uni и ее возможная роль в процессах патогенеза. - Молекулярная биология, 1992, т.26, № 3, с. 546-557.

2. Zareckaja N., Stakenas P., Janulaitls A. Su AIDS su3iji-sios mlkoplasmines lnfekcljos cllagnostikos metodai. - Тезисы VII республиканской научной конференции "Актуальные вопросы аллергологии, иммунологии и СПИДа", Вильнюс, 1992, с.93.

3. Zareckaja N.. Stakenas P., Valsvlla R., Maurlcas M.,Mane-llene Z., Petrusyte V., Butkus V., Bumelis V., Janulaltls A. Investigation of the restriction-modification system of mycoplasma contaminated, cell llpes. - International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, 1991, P2 24.

4. Stakenas P., Zareckaja N., Janulaitis A. DNA probes for Mycoplasma incognitus. - 8-th International Congress of Immunology, Budapest, 1992, W63.

AUTORE PK FJ ATAS

Zoreckajn N.M.

<Tlrazas 100. Uzsakymo Nr. 2 74

Spausdlno LictuyöS ln/ormacijos institutas TOtoritv 2 7. 2 000 Vilnius