Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические аспекты патогенеза при персистенции микоплазм у человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические аспекты патогенеза при персистенции микоплазм у человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ.А.Н.БАХА РАН

На правах рукописи

. - -> Л "1

ЧЕРНОВА Ольга Александровна

БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА ПРИ ПЕРСИСГЕНЦИИ МИКОПЛАЗМ У ЧЕЛОВЕКА

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Казанского института биологии Казанского научного центра РАН.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

С.Н.БОРХСЕНИУС

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Р.Г.ВАСИЛОВ

доктор биологических наук, профессор В.В.МЕСЯНЖИНОВ

доктор биологических наук, профессор Д .Н .ОСТРОВСКИЙ

Ведущая организация: Казанский государственный университет

Защита состоится 20 ноября 1997 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.96.01 при Институте биохимии им.А.Н.Баха РАН по адресу: 117071 МОСКВА, Ленинский проспект, 33.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института биохимии им.А.Н.Баха РАН.

Автореферат разослан октября 1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

т

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Микоплазмы (класс Mollicutes) - мельчайшие лишенные клеточной стенки прокариоты, способные к самостоятельному воспроизведению (Razin, Freundt, 1984). Располагая минимальным для самореплицирующихся прокариот размером генома (550-1600 тыс. н.п.), эти микроорганизмы имеют ограниченные биосинтетические возможности, что определяет их зависимость от клеток высших организмов. В процессе эволюции микоплазмы приспособились к сосуществованию с клетками эукариот и являются факультативными паразитами человека, животных vi растений (Борхсениус, Чернова, 1989; Maniloff, 1992). Для некоторых микоплазм получены данные о внутриклеточной локализации, тогда как другие микоплазмы считаются внеклеточными паразитами. Однако в обоих случаях микоплазмы находятся в тесном контакте с мембранами клеток хозяина и способны активно вмешиваться в их метаболизм (Чернов и др., 1996; Razin, 1992;).

Большой интерес к этим микроорганизмам обусловлен, с одной стороны, уникальностью их структурной организации, а с другой - диктуется практической необходимостью. Многие микоплазмы - возбудители болезней человека, а также животных и растений (Maniloff, 1992). Микоплазмы - основные контаминанты клеточных культур, в том числе клеток, используемых в биотехнологии для производства вирусных вакцин (Борхсениус и др., 1987; Rottem, Barile, 1993). Контами-нированные вакцины небезопасны, так как в организме человека микоплазмы способны вызывать респираторные, урогенитальные и аутоиммунные заболевания, артрит и иммунодефицит, а также активировать многие вирусы, в том числе онко-генные и ВИЧ (Прозоровский и др., 1995; Lo, 1992). Внутриутробное инфицирование микоплазмами может приводить к различным нарушениям развития плода (Мальцева, 1996; Krause, Taylor-Robinson, 1992). Механизмы патогенеза при пер-систенции микоплазм у человека пока не изучены.

Подавление микоплазменных инфекций представляет проблему. Микоплазмы быстро приобретают резистентность к антибиотикам (Brunner, Laber, 1985). Этот факт исследователи связывают с наличием у микоплазм уникальных механизмов генетической трансформации, определяющих высокую скорость мутационного процесса, а также нестабильность их генома вследствие частых событий реорганизации ДНК по типу "выщепления-встраивания" (Chernov, Chernova, 1994, 1995; Dybvig, Voelker, 1996).

Разрешение проблемы подавления микоплазменных инфекций связывают с изучением молекулярной биологии микоплазм, а также молекулярных основ патогенеза при персистенции этих микроорганизмов (Прозоровский и др., 1995; Dybvig, Voelker, 1996). В изучении основ патогенеза микоплазмозов пока сделаны лишь первые шаги. Исследования механизмов взаимодействия микоплазм с организмом человека сдерживаются не только естественными трудностями контроля молекулярных процессов в системе "паразит-хозяин", но и особенностями биологии микоплазм, а также отсутствием эффективных диагностических средств, позволяющих быстро и достоверно обнаружить, идентифицировать и оценить множественность инфекции (Борхсениус, Чернова, 1989; Baseman, 1996).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение биохимических аспектов патогенеза при персистенции микоплазм у человека. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать эффективные диагностические системы для обнаружения, идентификации и оценки множественности микоплазменных инфекций в любом биологическом материале.

2. Определить биохимические особенности персистенции микоплазм у человека.

3. Выявить особенности структурной организации генома микоплазм, а также характер воздействия микоплазм на генетическую систему клеток человека in vitro.

4. На основании полученных данных представить возможные пути развития хронического инфицирования человека микоплазмами и схемы индуцируемого ими каскада патологических реакций.

Научная новизна работы. Впервые получены данные о биохимических аспектах патогенеза при персистенции микоплазм у человека. В частности, показано, что персистенция у человека различных видов микоплазм может приводить к аналогичным патологическим изменениям в его организме, связанным с развитием иммунной дисфункции, дисбиоза, а также ультрацитопатологией форменных элементов крови, активацией гемокоагуляционного каскада, угнетением реакций антикоагуляции и фибринолиза. Установлено, что персистенция микоплазм у человека сопровождается хроническим окислительным стрессом (активацией реакций перекисного окисления липидов и угнетением ферментов системы антиоксидант-ной защиты). Высказано предположение, что хронический окислительный стресс может определять механизмы патогенеза у человека при персистенции микоплазм.

Впервые установлено явление реорганизации в генах поверхностных антигенных детерминант у микоплазм в процессе вертикального переноса и персистенции этих микроорганизмов у человека. Предполагается, что реактивная генетическая изменчивость микоплазм может быть существенным фактором, определяющим их персистенцию в организме человека. Выявлена специфичность индуцированных микоплазмами хромосомных нарушений в лимфоцитах периферической крови человека. Впервые высказано предположение, что специфичность взаимодействия микоплазм с генетическим аппаратом клеток человека может влиять на механизмы персистенции этих микроорганизмов у человека. Составлены схемы возможных путей развития хронического инфицирования человека микоплазмами и индуцируемого ими каскада патологических реакций.

Научно-практическая значимость работы заключается в создании высокоэффективных диагностических проб, позволяющих обнаружить, идентифицировать и оценить множественность микоплазменных инфекций в любом биологическом материале. В настоящее время эти зонды применяются для обнаружения микоплазменных инфекций человека в медицинских центрах Республики Татарстан.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в данной работе, могут быть использованы в исследовательской работе медицинских и биологических учреждений, занимающихся разработкой способов контроля и подавления мультиплексивных инфекций.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1983), на IV Международном симпозиуме СССР-ФРГ "Структура генома" (Ленинград, 1985), на 5-ом Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1986), на Всесоюзной конференции "Биологические свойства микоплазм: способы диагностики, профилактики и лечения микоплазмозов" (Киев, 1986), на Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия для решения биотехнологических проблем" (Тарту, 1988), 9-ой Всесоюзной конференции "Нуклеазы" (Казань, 1991), Международной конференции по быстрой диагностике микоплазм (Иерусалим, Израиль, 1991), 4-ой конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), 6-ом Международном Симпозиуме по микробной экологии (Барселона, Испания, 1993), Международной конференции "Молекулярная биология на рубеже 21 века" (Москва, 1994), 1-ом Евразийском конгрессе по генной терапии (Анкара, Турция^ 1995), 8-ом Международном конгрессе по бактериологии и

прикладной микробиологии (Иерусалим, Израиль, 1996), 2-ой Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан" (Казань, 1996), 5-ой конференции по фитоплазмам (Пекин, Китай, 1996), а также на 7-ом (Вена, Австрия, 1988), 8-ом (Стамбул, Турция, 1990), 9-ом (Эймс, США, 1992), 10-ом (Бордо, Франция, 1994), 11-ом (Орландо, США, 1996) Конгрессах Международного общества микоплазмологов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 82 работы, включая 1 монографию (в соавторстве с С.Н.Борхсениусом), 29 статей в центральных отечественных и зарубежных изданиях, а также 7 авторских свидетельств на изобретения.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Казанского института биологии КНЦ РАН. Экспериментальные результаты, изложенные в диссертации, получены автором лично, а также совместно с сотрудниками и аспирантами лаборатории молекулярной генетики, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежит разработка программы исследования, теоретическое обобщение получаемых результатов, выводы из работы. •

Часть работы по определению биохимических особенностей персистенции микоплазм у человека выполнена в соавторстве с сотрудниками Центра охраны семьи, материнства и детства Республики Татарстан, а также клиники детских болезней им. Е.М.Лепского Казанской медицинской академии. Автор приносит глубокую благодарность всем коллегам, способствовавшим осуществлению данной работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой литературы) и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и их обсуждение", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы". В работе представлено 6 таблиц и 46 рисунков. Список литературы включа-егт 401 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Научное сотрудничество с Центром Охраны Семьи, Материнства и Детства Республики Татарстан (ЦОСМиД РТ), проводимое в рамках Программы "Внутриутробные инфекции и микоплазмозы", позволило использовать для выполнения данной работы клинический материал пациентов, обратившихся в ЦОСМиД РТ по поводу репродуктивных дисфункций (бесплодия, привычного не-

вынашивания беременности, неразвивающейся беременности, а также генетических аномалий и пороков развития новорожденных, тяжелых форм гестоза с рождением нежизнеспособных детей) или предварительного обследования перед планированием беременности. В ЦОСМиД РТ всем пациентам проводили общеклиническое и специальное обследования, в том числе диагностику на наличие острых и хронических инфекций с использованием ДНК-проб (для обнаружения мико-плазменных инфекций), а также классических бактериологических способов выделения микроорганизмов на искусственные: питательные среды и тестов "Диа-плюс", основанных на иммуноферментном анализе, для выявления других патогенов.

Для выяснения биохимических особенностей персистенции микоплазм у человека был выполнен сравнительный анализ ряда показателей (с использованием указанных ниже методов) клинического материала пациентов с репродуктивными дисфункциями, у которых микоплазмы (Acholeplasma laidlami. Mycoplasma fernen-tans, M.genitalium, M.hominis, Ureaplasma urealyticum) были обнаружены в моче, крови и тканях урогенитального тракта (УГТ) (I группа - 52 человека), клинически здоровых людей, в УГТ которых были обнаружены микоплазмы (LI группа - 7 человек), а также клинически здоровых людей, у которых в исследуемых образцах (моче, крови и тканях УГТ) микоплазмы не были обнаружены (III группа - 18 человек). Наблюдения за представителями этих групп и анализ их клинического материала проводились в течение 1.5 лет.

Все представители указанных групп находились в репродуктивном возрасте (18-38 лет) и соматических заболеваний, а также острых или хронических инфекций (кроме микоплазменных в указанных группах) не имели.

Данная работа посвящена выявлению общих тенденций изменения ряда биохимических параметров при персистенции разных видов микоплазм у человека. Случаи достоверной разницы между соответствующими показателями клинических образцов, связанной с инфицированностыо конкретным (-и) видом (-ами) микоплазм, указываются в тексте особо.

Штаммы микоплазм были получены из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (г.Москва).

Плазмида рКК3535, содержащая рибосомный оперон rrnB E.coli, представлена А.М.Копыловым с любезного разрешения проф. Ноллера (США, Калифорнийский университет), плазмида pYA301, содержащая ген актина Saccharomyces cerevisiae, получена от Галлвитца (ФРГ, Марбургский университет), плазмида

pTKlQ, содержащая длинные концевые повторы вируса Раушера, - от Л.В.Генинга (Институт молекулярной генетики РАН), плазмида рШ, содержащая ген VI человека, - от А.П.Козлова (ВНИИОЧБ, Минмедмикробиопром), плазмида pEGIO, содержащая 6 копий сайтов топоизомеразы I из промоторной зоны генов рРНК Teîrahymena pyriformis, предоставлена О.Вестергардом (Дания, Университет г. Орхус).

Культивирование микоплазм проводили на среде Эдварда (Edward, 1974).

Выделение колицииогенных и микроциногенных штаммов проводилось методом отсроченного антагонизма (Сборник методик по..., 1970) с модификациями. Оценку чувствительности михоплазм к микроцинам бактериальных штаммов, изолированных в процессе исследований, также проводили методом отсроченного антагонизма с модификациями.

Выделение ДНК из клеток проводили по Marmur (1961). Гидролиз ДНК рест-риктазами проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984), элек-трофоретическое разделение фрагментов ДНК - в 1% агарозном геле с 40 мМ трис-ацетатным буфером рН 7.7, в вертикальных и горизонтальных блоках. Для определения размеров фрагментов строили калибровочные кривые, используя в качестве реперов Piîl-фрагменты ДНК фага \ известной длины. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем УФ-свете. Введение метки в препараты ДНК микоплазм и плазмид проводили методом ник-трансляции.

Перенос фрагментов ДНК на нитроцеллюлозные фильтры осуществляли по методу Саузерна (Southern, 1975). ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизацию проводили по Маниатис и др. (1984) с модификациями.

Выделение тотальной РНК из клеток млекопитающих, микоплазм и E.coli осуществляли по J.Taylor (1979). Электрофоретическое разделение тотальной РНК проводили в 12% ПААГ с 7 M мочевиной в вертикальных блоках. Введение метки в препараты РНК проводили методом кинирования (Маниатис и др., 1984). Извлечение фрагментов ДНК из геля осуществляли электрофоретическим переносом на ДЕАЕ-бумагу с последующей экстракцией 1 M NaCl. Клонотеки фрагментов ДНК микоплазм получали на основе векторов pBR.322 и pUC19 после трансформации штамма НВ101 E.coli и селекции на среде LB по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Отобранные плазмида выделяли в препаративных количествах с очисткой на колонке с биогелем А-15.

Кариологический анализ выполняли на лимфоцитах периферической крови человека, культивируемых по стандартной процедуре в среде 199, содержащей 10%

фетальной сыворотки, 100 мкг/мл фитогемагглютинина и 100 мкл стандартного раствора гепарина, а также цельную кровь (0.2- 0.3 мл). На 71 часу культивирования добавляли колхицин (0.25 мкг/мл) и культивировали еще 1.5 часа. Препараты метафазных хромосом получали по методу С.Ю.Демина и С.Е.Мамаевой (1993) и окрашивали 2% раствором Гимза в фосфатном буфере, рН 6.8.. Для дифференциального окрашивания хромосом препараты обрабатывали 0.25%-ным раствором трипсина.

Определение первичной нуклеотидной последовательности проводили по А.Максам и У.Гилберт (1986) твердофазным методом. Полимеразную цепную реакцию проводили в приборе для амплификации производства НПО "Биоприбор" (г.Пущино) по Harasawa (1993).

Электронно-микроскопические исследования клеток микоплазм и лимфоцитов, культивируемых in vitro, а также клеток цельной крови проводили на электронном микроскопе JEM-100X (Jeol, Япония). Материал фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7.2), постфиксировали 4 часа 1%-ным раствором четырехокиси осмия с добавлением 2.5 мМ сахарозы. После дегидратации в спирте восходящей концентрации, 100% ацетоне и окисипро-пилене материал заливали в эпон-812. Тонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-III (Швеция). Срезы контрастировали насыщенным водным раствором ура-нилацетата, а затем цитратом свинца. Для электронно-микроскопического исследования использовали лейкоконцетрат венозной крови. Ультрацитохимическое выявление активности АТФазы проводили по П.Д.Бонарцеву и Е.М.Демидовой (1990).

Иммунологическое обследование включало определение общего количества Т-лимфоцитов методом розеткообразования (Е-РОК) и В-лимфоцитов - методом непрямого розеткообразования с эритроцитами барана (ЕАС-РОК.), подсчетом процентного содержания и абсолютного числа клеток (Иммунологические ..., 1987). Субпопуляции Т-лимфоцитов CD4 и СВ8 (хелперы и супрессоры) определяли с помощью антител ОКТ4 и ОКТ8. Функциональную активность Т-лимфоцитов оценивали по реакции бластной трансформации с фитогемагглютинином и конка-навалином А (РБТЛ с ФГА, РБТЛ с ConA) (Moretta et al„ 1983). Содержание иммуноглобулинов (Ig A,M,G) исследовали методом радиальной иммунодифузии по Манчини (Иммунологические..., 1987).

Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по методу В.М.Бергман и Е.М.Славской (1958) с оценкой фагоцитарной активности и фагоцитарного чис-

ла. Для оценки резервных возможностей нейтрофилов использовали тест НСТ (реакция восстановления нитросинего тетразолия в спонтанной и стимулированной реакции) по методу М.Е.Виксмана и А.Н.Маянского (1979).

Уровень комплемента определяли по 50% гемолизу в единицах (СН 50) (Рэй, 1991). Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) выявляли с помощью осаждения их по методике Д.Кэтги и Ч.Райкундалиа (1991). Типирование антигенов I класса системы НЬА проводили стандартным микролимфоцитотоксическим тестом. Для выявления антигенных локусов А и В использовали панели типирующих антисывороток Санкт-Петербургского НИИ гематологии и переливания крови. Сопоставление частот НЬА-генов в выделяемых группах и анализ коэффицентов сцепления НЬА-А, НЬА-В осуществляли по Л.А.Певницкому (1988) и Ю.М.Зарецкой (1983). Статистическую достоверность различий частоты встречаемости антигена между больными и здоровыми оценивали по критерию у\

Исследование системы гемостаза осуществляли с помощью следующих тестов: определение спонтанной и индуцированной АДФ (в дозе 1 мкМ) агрегации тромбоцитов на лазерном агрегометре фирмы "Биола". На этом же приборе определяли фактор Виллебранда по его ристомицинккофакторной активности (Ибрагимова и др., 1995). Для косвенной оценки тромбопластинемии исследовали активность есю-5'-нуклеотидаш по Д.М.Зубаирову и И.А.Андрушко (1987). Уровень фибриногена определяли по Л.З.Баркаган (1993). Плазменные факторы крови оценивали по активированному частичному (или парциальному) тромбобластино-вому времени и активности антитромбина III. Для исследования фибринолитиче-ской системы использовали время лизиса эуглобулиновых сгустков, уровень тканевого актива юра плазминогена, . фактор ХПа-зависимый фибринолиз по Т.Ф.Ефремову и А.Г.Архипову (1982). Определение ранних продуктов деградации фибриногена (ПДФ) и растворимых фибрин-мономерных комплексов (ФМК) осуществляли по тесту склеивания стафилококков (Баркаган, 1988).

Кровь для исследования перекисного окисления липидов (ПОЛ) брали из вены и добавляли в нее 3.8% цитрат натрия в соотношении 9:1. Эритроциты осаждали центрифугированием при 1500 15 сек при 4° С с последующим 3-кратным промыванием охлажденным физиологическим раствором.

Содержание малонового диальдегида (МДА) в плазме крови определяли в эритроцитах флюорометрическим методом, описанным С.Чевари с сотрудн. (1991). Содержание диеновых коньюгатов в плазме крови определяли в гексановом экстракте по В.Е.Каган с сотрудн. (1986). Активность супероксиддисмутазы (СОД)

измеряли в осветвленном от гемоглобина гемолизате эритроцитов по ингибирова-нию скорости восстановления тетразолия нитросинего в неэнзиматической системе феназаминметасульфата и НАДФН (Матюшин и др., 1991). Активность каталазы (К) определяли спектрофотометрически при 410 нм в зависимости от скорости изменения поглощения перекиси водорода в единицу времени (Чевари и др., 1991). Активность глутатионпероксидазы (ГПО) измеряли при 340 нм, используя перекись водорода в качестве субстрата реакции (по Балашовой с сотрудн., 1996). Активность миелопероксидазы (МПО) определяли по М.З.Саидову и Б.В.Пинегину (1991). Микроэлементы в плазме крови исследовали методом атомно-абсорбционной спектроскопии.

Статистическую обработку клинических и лабораторных данных проводили по стандартной программе с вычислением критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание и применение молекулярных диагностических зондов для выявления микоплазм методом ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции

Идеальный метод диагностики микоплазменкых (как и любых других) инфекций должен быть высокоспецифичным, т.е. обеспечивать выявление и идентификацию патогена на фоне других микроорганизмов и клеток макроорганизма (хозяина), быть простым и быстрым в исполнении (осуществимым в течение нескольких часов), а также давать возможность оценить множественность инфекции. В этом отношении методы ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР) наиболее близки к идеальному диагностическому тесту для выявления микоплазменных инфекций в любом биологическом материале (Жуланова и др., 1993; Rärin, 1994; Chernov, Chemova, 1995).

Создание диагностических ДНК проб для обнаружения, идентификации и определения множественности микоплазм в любом биологическом материале явилось одной из задач данной работы.

Принцип метода ДНК-гибридизации основан на гибридизации тотальной ДНК микоплазм или ее клонированных видо/штаммо-специфичных участков (ДНК-зондов) с тотальной ДНК (РНК) клеток исследуемых образцов. При этом

ДНК микоплазм практически не гибридизуется с ДНК эукариот (Чернова и др., 1986).

Нами сконструированы диагностические зонды для обнаружения микоплаз-менных заражений в виде рекомбинантаых плазмид: специфичные зонды для обнаружения наиболее распространенных микоплазм, инфицирующих человека, животных, растений и клетки, культивируемые in vitro (в том числе A.laidlami, M.arginini, M.hominis, M.orale, M.salivarium, M.fermenlans, M.pneumoniae, M.genitalium, Ureaplasma urealyticum), а также универсальный зонд для обнаружения любого микоплазменного заражения методом ДНК-ДНК-гибридизации (Авторские свидетельства: Борхсениус и др., 1987, 1988, 1989; Чернова и др., 1989а,б, 1992; Чернов и др., 1992).

Специфичность сконструированных ДНК-зондов была неоднократно проверена методами блот- и дот-гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах с тотальными препаратами ДНК, выделенной из различных видов микоплазм и клеток эукариот.

Чувствительность способа ДНК-гибридизации с использованием меченных 32Р ДНК-зондов составляет 10Ч05 КОЕ микоплазм, что соответствует приблизительно 0.01-1 нг ДНК микоплазмы. Разница в уровне чувствительности определяется вариантом используемого ДНК-зонда, который может включать либо уникальные, либо повторяющиеся нуклеотидные последовательности ДНК микоплазм. Время, необходимое для получения результатов при использовании авторадиографии на рентгеновской пленке, составляет около двух суток. Использование метода ДНК-гибридизации дает возможность не только определить и идентифи-HI'pGSuTL» микоплазмеииые НПфсКДШд, IlO \1 Сц2!ШТи ИХ MilO/XCCTBvilllCCTL (рис.1). Применение ДНК-зондов в качестве диагностических инструментов открыло новые возможности решения проблем выявления микоплазм, - микроорганизмов, для которых в силу их уникальной организации традиционные способы, известные для обнаружения других патогенов, оказываются неэффективными (Razin, 1994). Однако широкое применение этого метода в производственных или медицинских лабораториях предполагает замену радиоактивной метки зондов на флюоресцентные или ферментные метки.

В этом отношении метод ПЦР, не требующий специфичного мечения ДНК, открыл новые перспективы не только в молекулярной генетике, но и клинической диагностике, в том числе микоплазменных инфекций (Жуланова и др., 1993). В основе этого метода лежит возможность избирательного "размножения" тех или

иных последовательностей ДНК в исследуемых образцах.

® Фа

12 3 4

© Ф б

12 3

В

1 2345 6 7 8 9.

V- г* - г I

Рис. 1. Обнаружение микоплазменных инфекций в клинических образцах методом ДНК-гибридизации (а, б) и ПЦР (в).

Цифрами обозначены точки (а: 1-6) или дорожки (в: 1-7), на которые нанесены препараты ДНК, выделенные из мочи клинически здоровых женщин (в период гестации (1) и вне его (3) у пациенток с отягощенным акушерским анамнезом (соответственно, в период гестации (2) и вне его (4)), а также (б) ДНК М.Лотш1 (I, 2) и свободных от микоплазм клеток НеЬа (3) в качестве контролей. На каждую точку 1-4 (а) и 3 (б) нанесено по 6 мкг, а на точки 1 и 2 (б) по 30 и 10 нг ДНК, соответственно. На дорожке 5 (в) представлен маркер размеров фрагментов ДНК. В качестве ДНК-зондов в реакции дот-гибридизации была использована универсальная ДНК-проба, содержащая фрагмент оперона рРНК ММотШа, а в ПЦР - две пары праймеров (16К1-23Я! и 16112-231*2).

В качестве ДНК-проб (праймеров) в ПЦР можно использовать нуклеотидные последовательности, специфичные для определенного вида микоплазмы (если ставится задача обнаружить именно этот вид патогена), или консервативные последовательности, характерные для всего класса микроорганизмов, позволяющие обнаружить любые микоплазмы в любом биологическом материале. Использование "универсальных" праймеров с последующим выполнением (в случае положительного ответа) ряда процедур (рестрицирования амплифицированных участков и сравнительного анализа) позволяет идентифицировать также и вид патогена.

На основании банка данных последовательностей генов рРНК нами идентифицированы участки ДНК микоплазм, которые используются в качестве праймеров для обнаружения микоплазм методом ПЦР, в том числе ее двух-шагового варианта (табл.1). Принцип этого варианта ПЦР основан на амплификации после-

довательностей с использованием двух пар праймеров(Нагаза\уа й а1., 1993). Первый шаг реакции связан с амплификацией последовательности-мишени, находящейся внутри амплифицированного (во время первого этапа) участка ДНК. Подобный подход позволяет значительно увеличить чувствительность метода по сравнению с обычным вариантом ПЦР, а также идентифицировать вид микоплазм (если первая пара праймеров "универсальна", а вторая - "специфична").

Таблица 1

Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых в двух-шаговой ПЦР, и ожидаемый размер продуктов амплификации

Праймер Последовательность (5'-3') Ожидаемый размер амплификата (п.н.)

1-ая пара I6R.1 23R.1 АСС ATG GGA GOT GGT ААТ TGA TGG ACT TTC AGA ССС 370-480*

2-ая пара I6R2 23R2 GTT СТТ TGA AAA CTG ААТ GCA ТСС АСС AAA ААС ТОТ 150-190»

Примечание: главным критерием для выбора праймеров на основе известных последовательностей (GenBank, 1989) рДНК микоплазм была минимальная гомология с куклеотидными последовательностями 18S рДНК эукариот и I6S рДНК прокариот (Gobel et al., 1987), а также отсутствие компле-ментарности между праймерами и областей самокомплементарности внутри праймеров (Uemori et ai., 1992).

♦Вариабельность размеров соответствующих участков связана с высокой степенью гетерогенности ДНК микоплазм (Жулавова и др., 1993; Harasawa et al., 1994).

Чувствительность способа ПЦР при использовании его для обнаружения ми-коплазменных инфекций может достигать 1 фкг ДНК (Wang et al., 1992). Учитывая, что размер генома микоплазм в среднем составляет 1000 тыс. н.п., можно заключить, что 1 фкг ДНК соответствует приблизительно одной микоплазменной частице. Таким образом, с помощью ПЦР в исследуемом образце можно обнаружить даже единственную клетку микроорганизма, что позволяет решать некоторые серьезные диагностические проблемы, связанные с клиническим анализом ас-симптоматичных пациентов (рис.1), оценкой успешности антибиотикотерапии (в том числе при тестировании клеточных культур), а также выявлением "некультивируемых" микоплазм в любой биологическом материале (Чернов и др., 1996).

Метод диагностики микоплазменных инфекций, основанный на использовании ДНК-проб в реакции ДНК-гибридизации или ПЦР, является в настоящее вре-

мя наиболее чувствительным способом выявления этих микроорганизмов в любом биологическом материале. Использование синтезированных праймеров в полиме-разной цепной реакции, а также сконструированных нами ДНК-зондов для обнаружения и идентификации микоплазменных инфекций методом ДНК-ДНК-гибридизации в сочетании с электронной микроскопией и микробиологическим культивированием позволяет решать задачи, связанные с выявлением микоплазм в любых образцах и контролем за развитием микоплазменных инфекций в различных биосистемах (Чернов и др., 1996; МаИгеуа е1 а1., 1996). Сконструированные нами ДНК-пробы используются в настоящее время в клинической диагностике в медицинских центрах Республики Татарстан, в том числе Центре охраны семьи, материнства и детства (рис.2), проводящем совместные исследования с нашей лабораторией по Программе "Внутриутробные инфекции и микоплазмозы", а также в Отделе эндогенной регуляции Казанского института биологии Казанского научного центра РАН.

п=1800 МВХ

Рис.2 Частота инфицирования различными видами микоплазм, а также герпетическими вирусами и хламидиями пациентов с репродуктивными дисфункциями.

С - М.ЪоттЬ, й • АЛаШат, П - М^епиаНит, 19 - \i.fermentans, О - и.игеЫуНсит.

МИ - мономикоплазменная инфекция, МВХ - сочетанная инфекция (микоплазма + ви-

рус/хламидии), ММИ - смешанная микоплазменная инфекция (микоплазма + микоплазма),

Биохимические аспекты микоплашенных инфекций у человека

Микробиоценозы при микоплазменных инфекциях: дисбиоз и его биохимические особенности

Основным способом "горизонтального переноса" большинства микоплазм у человека является половой контакт, поэтому инфекции, вызываемые этими микроорганизмами, относят к заболеваниям, передаваемым половым путем (Blanchard et al., 1992).

Ограниченные метаболические возможности микоплазм, естественно, определяют зависимость этих микроорганизмов от окружающей среды (Rodwell, Mitchell, 1979). Между тем, оптимальным условием их роста является не только присутствие ряда специфичных, богатых энергией соединений, но также определенная (pH 6.5-8.5) кислотность среды (Miles, 1992). В норме pH среды генитально-го тракта составляет 3.8-4.4 (Hengst et al., 1992). Это обуславливается сопряжением метаболизма микрофлоры биоценоза (Акопян, 1996). Кислую реакцию поддерживает молочная кислота, образуемая лактобациллами из гликогена полигональных клеток слизистой генитального тракта. 90-95% микроорганизмов генитального тракта в норме составляют факультативные анаэробы - лактобациллы. На долю других микроорганизмов (дифтероидов, стрептококков, стафилококков, кишечной палочки, гарднереллы и др.), соответственно, приходится менее 5-10% (Акопян, 1996).

В связи с этим нами было проведено специальное исследование микрофлоры пациенток 1-Ш групп. Результаты соответствующего тестирования отражены в диаграммах (рис. 3). Оказалось, что у пациентов II группы спектр и соотношения микроорганизмов незначительно отличались от таковых в контрольной группе. В то же время у пациенток I группы было обнаружено значительное уменьшение количества лактобацилл и увеличение условно-патогенной микрофлоры (Gardnerella vaginalis, Bacteroides spp., Peptococcus spp., Eubacterium spp.). Разница количественных соотношений лактобацилл и условно-патогенной микрофлоры (УПМФ) у этих пациенток составляла приблизительно 0.25 (против 9-4 в контроле) и сопровождалась значительным ростом условно-патогенных бактерий: у 70% пациенток I группы множественность УПМФ достигала 10б-109 КОЕ/мл. Подобный дисбиоз клиницисты определяют как бактериальный вагиноз, который, по их мнению, может играть значительную роль в генезисе репродуктивных дисфункций (Кира, 1994). Изменение соотношений микроорганизмов в микробиоценозе гени-

тального тракта, связанное с ростом микроаэрофилов, продуцирующих янтарную кислоту, необходимую для роста УМПФ, и увеличением числа этих бактерий, естественно, приводило к уменьшению количества молочной кислоты и увеличению значений рН среды (до 6.0-7.0), оптимальной для развития микоплазм. В этой связи микоплазменные инфекции можно рассматривать как индикатор патологии соответствующей экосистемы.

Garsbierella vaginalis (микрофэрофил, являющийся условно-патогенным микроорганизмом) продуцирует значительные количества янтарной кислоты. Янтарная кислота способствует росту других представителей условно-патогенной микрофлоры (которые используют ее в качестве субстрата в реакциях с образованием АТФ). Рост этих микроорганизмов сопровождается изменением рН среды за счет образования значительного количества аммония (главным образом в реакциях окислительного декарбоксилирования аминокислот), что является важным фактором изменения условий и, соответственно, обитателей в микробиоценозах

Рис.3. Соотношение (И) лактобацилл (а) и условно-патогенной микрофлоры* (б) генитального тракта

* - Gardnerella vaginalis, Bacteroides spp., Pepiococcus spp., Eubacterium spp.

Методом ПЦР микоплазмы были обнаружены на слизистых поверхностях кишечника (rectum)у всех представителей трех групп. Это позволяет предположить, что естественным резервуаром микоплазм в здоровом организме является кишечный тракт, тогда как урогенитальный тракт является вторичным ареалом их локализации как и некоторых других микроорганизмов (E.coli, G.vaginalis, Mobiluncus spp.), появление которых в УГТ обычно связано с изменением условий в соответствующих экосистемах (Mardh, Holst, 1990) и свидетельствует о патологии.

В результате выявления микроциногенных штаммов среди 319 клинических изолятов нормальной кишечной микрофлоры человека нами были идентифицированы клоны E.coli, которые ингибировали рост некоторых микоплазм. В то же время среди бактериальных штаммов, выделенных из кишечника людей, страдаю-

щих дисбиозом, микроорганизмы, обладающие антимикоплазменной активностью, выявить не удалось.

Возникновение дисбиоза, связанное с элиминацией бактериальных антагонистов вследствие воздействия ряда эндо- и экзогенных факторов, в том числе экологических, может способствовать развитию патологии микроэкосистем и колонизации урогенитального тракта микоплазмами. В связи с этим можно предположить, что решение проблемы контроля микоплазменных инфекций лежит на пути изучения эволюционной целесообразности антагонистических отношений в биосистемах.

Иммунные реакции у человека при персистенции миколлазм: биохимические особенности и иммунопатология

Персистенция микоплазм у человека обычно сопровождается иммунной дисфункцией: микоплазменные инфекции развиваются на фоне иммунодефицита и вызывают вторичный иммунодефицит (Прозоровский и др., 1995). Данные о биохимических аспектах иммунопатологии, обусловленной персистенцией микоплазменных инфекций у человека, в литературе отсутствуют.

В крови всех пациентов I группы нами было обнаружено высокое содержание есЮ-5 -нуклеогидазы (табл.2), Есю-5 -нуклеотидаза, являясь гликознл-фосфатидил-инозитол-связанным ферментом, может высвобождаться при воздействии бактериальной фосфатидилинозитол специфичной фосфолипазы С, обуславливающей гидролиз фосфолипидов клеточных мембран. В этой связи высокий уровень активности 5'-нуклеотидазы в крови пациентов I группы может свидетельствовать о деструкции клеточных мембран, тромбопластинемии, активирующий гемокоагу-ляционный каскад.

Будучи важным антигеном иммуннокомпетентных клеток, регулирующим активность Т и В лимфоцитов, а также их адгезию к эндотелию, 5'-нуклеотидаза катализирует превращение нуклеогидмонофосфатов в нуклеозиды и участвует в метаболизме пуринов и пиримидинов .

Высокий уровень содержания 5'-нуклеотидазы у обследованных пациентов может обеспечивать нарушение обмена нуклеиновых кислот и, соответственно, дисфункцию иммунокомпетентных клеток по механизмам, аналогичным развитию иммунодефицита при недостаточности аденозиндезаминазы.

Предположения о том, что восприимчивость некоторых людей к микоплаз-менным инфекциям может быть обусловлена иммуногенетическими особенностя-

ми их организма высказывались (Вульфович, 1991), однако прямых доказательств этому пока нет.

Таблица 2

Показатели иммунного статуса пациентов с персистенцией микоплазм (I), а также представителей контрольных групп (II, Ш)

№ Показатели I п III

1 Лимфоциты: абсолютное кол-во (■ 10'л) 2.30±0.12* 2.14Ю.21 2.13Ю.32

2 В-лимфоциты (%) 30.31Ю.31* 13.0811.1 11.611.7

3 В-лимфоциты абсолютное кол-во (Ю'л) 0.70±0.07* 0.28Ю.03 0.25Ю.04

4 Т-лимфоциты (%) 43.32±1.1 61.2114.9 61.5213.80

5 Т-лимфоциты (%) абсолютное кол-во ( Ю'л) 1.00+0.09 1.31Ю.15 1.31Ю.19

6 -Т-супрессоры (%) 30.7211.70* 16.8211.100 19.2411.10

7 -Т-супрессоры абсолютное кол-во (109л) 0.71Ю.09* 0.3610.06 0.4110.09

8 -Т-хелперы (%) 3.0711.90 31.7112.90 32.9111.80

9 -Т-хелперы абсолютное кол-во (Ю'л) 0.70Ю.08 0.6810.06 0.70Ю.04

10 ■Т-хелперы/Т-супрессоры 0.98* 1.90 1.70

II •"нулевые лимфоциты" (%) 24.24Ю.08* 10.2811.70 10.8211.20

12 нулевые лимфоциты абсолютное кол-во ( Ю'л) 0.5610.06* 0.22Ю.04 0.23Ю.03

13 РБТЛ с ФГА (%) 26.6111.40* 59.1116.90 59.72±4.10

14 РБТЛ с Кок А (%) 23.3212.10* 21.3212.30 21.8311.10

15 5'-нуклеотидаза 132.419.7* 43.113.0 42.612.9

16 -Ir А (г/л) 1.7010.19 1.68Ю.31 1.66Ю.90

17 -Ir М (г/л) 1.55Ю.06 1.57Ю.27 1.59Ю.30

18 -Ig С (г/л/ 11.8111.10 12.9012.90 13.1111.10

19 (ЦИК) (усл.ед.)»* 0.022Ю.004 0.020Ю.001 0.023Ю.001

20 Комплемент общий(50% п/т)** 29.1111.91* 56.1113.90 55.9111.20

21 Комп СЗ компл-та (мг/мл)** 0.38М.09* 0.73Ю.09 0.73Ю.08

22 ■НСТ**,спонт. (%) 11.12Ю.70 7.7311.20 7.8211.10

23 HCT»*, стим. (%) 21.2113.60* 41.9211.90 42.13Ю.90

24 ФАН (%)** 40.0011.90* 50.8312.80 51.1111.80

25 Фагоцитарное число (%)** 2.1511.30* 2.45Ю.07 2.48Ю.90

26 Индекс активации нейгрофилоз спонтанный** 0.06510.03 0.12Ю.001 0.11Ю.01

27 Индекс активации нейтрофилов стимулированный** 0.23Ю.05* 0.55Ю.006 0.57Ю.004

* Разница статистически достоверна (р<0.05)

** по этим показателям пациенты поделились на 2 неравные группы . У 5 из 52 человек I группы были обнаружены повышенный уровень ЦИК, активность комплемента, а также ФАН В анамнезе этих пациентов, по свидетельству клиницистов, имелись частые воспалительные заболевания. У них также было обнаружено снижение свертываемости крови . Эти пациенты составили отдельную группу, результаты обследования которой не вошли в данную работу.

Названия показателей, представленных в сокращенных вариантах, полностью приведены в разделе "Материалы и методы".

К настоящему времени установлена связь между наличием и уровнем некоторых антигенов сублокусов системы HLA и восприимчивостью организма к ряду инфекционных заболеваний, в том числе микоплазменным инфекциям у мышей (Прозоровский и др., 1995).

В результате сравнительного анализа распределения антигенов сублокусов А и В системы HLA было установлено, что спектр соответствующих антигенов 1 группы существенно отличается от такового контрольной (рис.4). При этом в группе пациентов с персистенцией микоплазм установлена достоверно завышенная частота антигенов HLA-A2 и HLA-B18. Показатель относительного риска развития соответствующей патологии у носителей этих антигенов составил 11.6 и 18.2 (соответственно, для А2 и В18). Это позволяет рассматривать носительство данных детерминант как маркер предрасположенности к персистенции микоплазм.

48%

AI AJ A3 AB А10 АН А19 А23 АЭЙ BS 87 ВЭ SJ2 В13 BU BIS BIT В19 В11 В27 335 В*И ЕМ! В ГО

Рис.4 Распределение антигенов А и В системы НЬА (в %) у пациентов с персистенцией микоплазм (I), а также у представителей контрольной группы (□).

»-достоверное различие частоты антигенов (р<0.05)

Точные механизмы включения продуктов комплекса НЬА в патогенез заболеваний пока неизвестны. Наибольшее количество аргументов получено в пользу гипотезы "молекулярной мимикрии" (Зарецкая, 1983). Предполагают, что структурное сходство антигенных детерминант НЬА и антигенов некоторых патогенных микроорганизмов может обеспечивать толерантность организма к этим инфекционным агентам (Петров и др., 1992). Сравнительный анализ соответствую-

щих антигенов НЬА и основных поверхностных антигенных детерминант мико-плазм, вероятно, позволит проверить гипотезу "молекулярной мимикрии" и, возможно, раскрыть молекулярные основы иммуногенетических механизмов восприимчивости к микоплазменным инфекциям у человека,

Известно, что гены антигенов системы HLA расположены в коротком плече шестой хромосомы и сцеплены с некоторыми компонентами и факторами активации системы комплемента (Зарецкая, 1983; Хаитов и др., 1991). Возможно, недостаточность комплемента, обнаруженная у обследованных пациентов I группы (табл.2), обуславливается активностью локусов HLA, кодирующих антигены А2 и В18. Вместе с тем низкий уровень содержания комплемента может быть и следствием персистенции микоплазм, так как перманентная активация комплемента может приводить к истощению его компонентов (рис.5).

рХ сзь\

xl3c5a

-С6,С7,С6 ' С9

С1-С9 -неактивные компоненты комплемента, образующие активные составляющие С1дп, С4Ь2Ь СЗЬВЬ. опре деляющие ключевые реакции каскада

Н,РЛВ -кофакторы реакций активации комплемента, присутствующие в норме в плазме крови человека МАК -мембран-атакую-

щий комплекс пм -персистирующие

микоплазмы АТ -антитела ПСК -полисахаридиые компоненты микоплазм

СЗЬВЬ -СЗ-конвертаза С4ЬС2Ь -белок, подобный по свойствам СЗ-конвертазе

СЗа, С5а -пептиды, отщепляемые в процессе активации комплемента от молекул предшественников, могут активировать фагоциты (в том числе ПМЯЛ), а также воздействовать на эндотелио-циты и, совместно с МАК, индуцировать повреждения клеток тканей организма. О - реакции, присутствующие в норме

О и П - активация системы комплемента по классическому и альтернативному путям.

СЗЬ

Рис. 5. Схема возможных путей истощения компонентов комплемента при персистенции микоплазм у человека

Окислительный стресс при персистенции ми ко плазм у человека: перекисное окисление липидов и истощение систем антиоксидантной защиты.

Установлено, что окислительный стресс может вносить существенный вклад в патогенез ряда инфекционных заболеваний (Klebanoff, 1992). Экспериментальные результаты, полученные на клеточных культурах, позволяют предполагать, что цитопатология клеток, инфицируемых микоплазмами, может быть в значительной степени обусловлена окислительным стрессом (Kahane, 1984). Однако данные о роли активных метаболитов кислорода (АМК) при персистенции микоплазм у человека пока отсутствуют.

Определение и анализ показателей окислительно-восстановительных реакций, а также оценка возможного участия АМК в патологических процессах у человека при персистенции микоплазм явились одним из этапов выполнения данной работы.

Наиболее чувствительными к окислительному повреждению и токсическому действию свободных радикалов кислорода, а также продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) плазмы являются эритроциты (Fraga et al., 1990). Это обу-словлено.с одной стороны повышенным содержанием полиненасыщенных жирных кислот (субстрата ПОЛ) в их мембранах, высокой концентрацией кислорода в клетке (а также гемоглобина и железа, катализирующих окислительные реакции), а с другой - невозможностью ресинтезировать поврежденные структуры.

В данной работе было проведено исследование ПОЛ и системы антиоксидантной защиты (АОЗ) плазмы крови и эритроцитов. О степени ПОЛ плазмы крови судили по концентрации малонового диальдегида (МДА) и диеновых коньюга-тов (ДК). Для определения перекисного статуса эритроцитов исследовали уровень МДА мембран и активность факторов антиоксидантной защиты: супер-оксиддисмутазы (СОД), каталазы (К) и глутатионпероксидазы (ГПО) эритроцитов.

Результаты исследования ПОЛ и активности АОЗ эритроцитов крови у пациентов I-III групп отражены на рис. 6,7, 8. Представленные данные могут свидетельствовать о наличии у пацентов I группы недостаточности системы АОЗ и сдвига окислительных процессов в сторону образования вторичных продуктов ПОЛ -МДА, ДК.

Важным источником АМК при инфекционных процессах являются фагоцитирующие клетки, в частности, полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ). Стимуляция фагоцитов приводит к развитию метаболического "взрыва", который сопро-

вождается увеличением окисления глюкозы и синтеза Ог в результате активации мембрансвязанной НАДФН-оксидазы и последующего образования различных АМК.

600 «о

300 200 100

Рис.6. Содержание метаболитов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови и в мембранах эритроцитов у пациентов I группы (I), а также у представителей контрольных II (II) и III (Ш) трупп

А - концентрация малонового диальдегида (МДА) в плазме крови (нмоль на 1 мг белка) Б - концентрация диеновых конъюгатов (ДК) в плазме крови (в отн.ед.флюоресц.на 1 мл плазмы) В - концентрация МДА в мембранах эритроцитов (в отн.ед.флюоресц. на 1 мг белка)

* - разница достоверна (при р<0.05) **- разница достоверна (при р<0.001)

МДА и ДК образуются, например, при окислении арахидоновой кислоты, находящейся в свободном состоянии или в составе сложных липидов. Значительные количества ДК возникают при ли-пооксигеназной реакции арахидоновой кислоты: пентадиеновые кислоты превращаются в лейкот-риены- соединения с сопряженными двойными связями, т.е. нефлуоресцируюшие структуры

рон

[-СН=СН-СНг-СН=СН-] переходят во флуоресцирующие - [-СН-СН=СН-СН=СН-].

Рис.7. Показатели активности антиоксидантной защиты плазмы крови, эритроцитов и полиморф-ноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) у пациентов I группы (I), а также у представителей контрольных II (II) и III (III) групп.

А - супероксиддисмутаза (в отн.ед.на 1 мг гемоглобина) Б - хаталаза (ммоль на I мг гемоглобина) В - глутатионпероксидаза (мкмоль на 1 мг гемоглобина) Г- миелопероксидаза (в отн.ед.на 1 мг

* - разница достоверна (при р<0.02)

Рис.8 Содержание цинка и железа в плазме крови у пациентов I группы (I), а также у представителей контрольных II (II) и Ш (III) групп.

* - разница достоверна (при р<0,05)

*♦ - у пациентов, инфицированных \J.ureaiyiicum, уровень свободного железа в плазме крови был достоверно ниже контрольных значений и составлял 0.68 мг/л

Схема возможной последовательности событий, обуславливающих развитие окислительного стресса при микоплазменных инфекциях, представлена на рис.9 с учетом известных путей образования АМК у человека (Меньщикова, Зенков, 1997, Гамалей, Клюбин, 1996,1997) и определенных в данной работе показателей активности ряда реакций и параметров (рис.6,7,8), отражающих их механизмы.

К настоящему времени установлено, что некоторые хронические патологии (в том числе аутоиммунные нарушения) могут быть следствием аутотоксического воздействия АМК (Ра1гаиг е! а1„ 1993). Механизмы патогенеза в этих случаях могут быть связаны с цепью реакций. Так, повышенный уровень синтеза АМК индуцирует повреждение белков, липидов и нуклеиновых кислот. Модификация белков вызывает появление у них антигенных свойств. Образующиеся иммунные комплексы в свою очередь стимулируют продукцию АМК фагоцитами. Окисление липидов приводит к появлению хемоатграктантов, усиливающих миграцию фагоцитов (Меньщикова, Зенков, 1997). Подобные реакции, образуя порочный круг, приводят к хронической патологии и могут лежать в основе патогенеза у человека при персистенции микоплазм, Не исключено, что реакции "порочного круга" имеют

Рис.9. Схема возможного каскада реакций образования активных метаболитов кислорода при пер-систенции микоплазм у человека.

НАДФ-Опмялл-ц -НАДФ-оксидаза полиморфно- гпо -глутатиоипероксидаза

ядерных лейкоцитов или тром- к -каталаза

боцитов ДК -диеновые конъюгаты

ПС -гипоксантин МДА - малоновый диальдегид

КО -ксантиноксидаза Г -органические радикалы произ-

мк -мочевая кислота водных активных метаболи-

сод тов кислорода

-супероксидксмутаза ПМ -персистирующие микоплазмы

В кружки заключены показатели, которые были определены у представителей 1-Ш групп.

место у части пациентов с персистенцией микоплазм, для которой была установлена повышенная активность ПМЯЛ (примечание к табл.2). Однако у большинства представителей I группы было обнаружено угнетение ПМЯЛ. Источником активных метаболитов кислорода, инициирующих процессы перекисного окисления ли-пидов в их организме, помимо микоплазм могут быть другие клетки: ферментативный комплекс для образования АМК, аналогичный НАДФН-оксидазе фагоцитов, обнаружен во многих типах клеток, в том числе тромбоцитах (Магегса ее а1., 1992).

Изменения в системе гемостаза при персистенции микоплазм у человека: ультраци-топатология форменных элементов крови и угроза синдрома диссемннированного внугрисосудистого свертывания крови

Персистенция микоплазм в организме человека, сопровождающаяся хроническим окислительным стрессом, может приводить к серьезным нарушениям ультраструктуры форменных элементов крови (ФЭК) (Меньшикова, Зенков, 1997). Данные о проведении исследований ФЭК при персистенции микоплазм в литературе отсутствуют.

Сравнительный анализ ультраструктуры клеток периферической крови у представителей 1-111 групп был одним го этапов данной работы.

В периферической крови пациентов I группы было обнаружено значительное уменьшение доли темных (менее 60% по сравнению с 80% в контроле) и увеличение светлых клеток. Светлые тромбоциты представляли собой овальные или округлые клетки, практически не имеющие отростков. Плотность гиалоплазмы в этих клетках была значительно разрежена, а количество специфичных гранул уменьшено. Значительная часть пространства светлых пластин была занята вакуолями.

Образование агрегатов клеток было самым характерным свойством форменных элементов крови в лейкоконцентратах пациентов I группы. Наиболее часто агрегаты были представлены тромбоцитами, включающими как светлые, так и темные пластины (рис.Ю), контактирующие с другими клетками крови (лимфоцитами, эритроцитами, гранулоцитами). Образующиеся в результате агрегаты иногда содержали до 30 пластин. В образовавшихся комплексах часто обнаруживалось фагоцитирование тромбоцитов нейтрофилами. Рядом с подобными комплексами, а также между составляющими его клетками были видны макромо-лекулярные комплексы в виде нитей и хлопьев, а также клеточные фрагменты, в том числе мембраны, являющиеся тромбопластином. Известно, что тромбопла-стин, а также продукты специфичных гранул активированных ФЭК могут существенно влиять на систему гемостаза в организме (Зубаиров и др., 1985).

Рис. 10. Трансмиссивная электронная микроскопия форменных элементов крови пациентов с перси-стенцией микоплазм. Агрегация тромбоцитов.

Выявленные нами тенденции изменения в ультраструкгуре ФЭК у пациентов I группы аналогичны тем, что наблюдаются при угрозе развитии синдрома диссе-минированного внутрисосудистого свертывания крови (сДВС) (Зербина, Мукасе-вич, 1985). Такие изменения обнаруживаются у больных при стенокардии и ин-

фаркте миокарда,при септических процессах, а также у некоторых женщин с привычным невынашиванием плода (Бонарцев, Демидова, 1990; Бонарцев, Асымбеко-ва, 1997). В этой связи можно предположить, что у пациентов I группы также имеется угроза развития синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови.

В литературе имеются сообщения об изменении гемостаза у человека при некоторых инфекциях (Гланц, 1989; Макацария, 1991). В экспериментальных исследованиях на лабораторных животных было показано, что хронические микоплаз-менные инфекции также могут сопровождаться нарушением микроциркуляции, тромбообразованием, увеличением проницаемости сосудистой стенки (Прозоровский и др., 1995). В работе Л.И.Мальцевой (1996) было также показано, что при хронических микоплазменных инфекциях у женщин с отягощенным акушерским анамнезом обычно возникают нарушения системы гемостаза и микроциркуляции, которые при беременности приводят к плацентарной недостаточности и патологии развития плода.

Таблица 3

Показатели гомеостаза у пациентов с персистенцией микоплазм (I), а также представителей контрольных групп (II,III)

№ Показатели I II III

1 Агрегация тромбоцитов спонтанная (ед.) 0.045±0.04* 0.025±0.01 0.02±0.01

2 Агрегация тромбоцитов, стимулированная АДФ: амплитуда по радиусу агрегатов 33.8±3.3 21.1±2.5 20.2±2.5

скорость (%/мин) 35.2+1.2* 28.1+2.4 26.2±2.8

амплитуда дезагрегации тромбоцитов (%) 0.500±0.04* 0.85±0.0б 0.80±0.08

скорость (%/мин) 0.136±0.07* 0.213±0.05 0.212±0.05

амплитуда по светопропусканию (%) 88.2±7,6* 49.7±2.3 50.2±2.2

скорость (%/мин) 29.7±1.9* 16.8±1.6 16.3±1.8

3 Антитромбины III (%) 87.8±3.1* 114.6+3.9 114.4+4.8

4 АПТВ (сек) 31.2±2.2* 42.1±3.1 41.5±3.2

5 Виллебранда фактор (%) 138.7±12.8* 66.9±5.8 67.7±6.2

6 Время лизиса эуглобулинового сгустка (мин) 197.б±18.8* 155.8±7.1 15б.2±6.8

7 ПДФ (мкг/мл) 26,1+2.3* 3.6±1.3 3.8±1.2

8 Активность 5'-нуклеотидазы (нкат/л) 132.4±9.7* 43.1 ±3.0 42.6±2.9

9 Тканевый активатор плазминогена (мм!) 5б.8±5.5* 45.8±1.3 45.5±1.1

10 Тромбоциты (кол-во 10«) 260.2±16.8* 229.1 ±5.9 22б.0±б.1

II Фибриноген (мг/дл) 372.2±13.1* 291.1±9.9 290.2±10.8

♦Разница достоверна по сравнению с контрольной группой (р<0.05)

В результате анализа биохимических (а также некоторых биофизических) показателей систем гемостаза у пациентов I группы было обнаружено характерное для угрозы развития сДВС нарушение динамического равновесия реакций гемостаза: гиперкоагулемия, выявленная у этих пациентов, сопровождалась угнетением антикоагуляционных механизмов и торможением реакций фибринолиза (табл.3).

Известно, что нарушение структуры мембраны (главным образом асимметрии фосфолипидного слоя нативных клеточных мембран) является необходимым условием протекания реакций гемокоагуляционного каскада (Зубаиров, 1978, 1997). Микоплазмы, способные существовать как вне, так и внутри эукариотиче-ских клеток хозяина, всегда находятся в тесной связи с мембраной клетки хозяина (поэтому их называют "мембранными паразитами" (Maniloff, 1992)). Посредством фосфолипаз, а также фермента карнитинпальмитоилтрансферазы микоплазмы могут существенно влиять на метаболизм фосфолипидов клеток хозяина и нарушать структуру клеточных мембран.

Фосфолипазы (Ai, А2, С) микоплазм, атакующие различные эфирные связи фосфолипидов:

Фосфолипаза Ai

О

9

НгС - О - С - Ri

Кг -С-О-С-Н

9

НгС - О - р - О - N-основание Фосфолипаза Аг lj

Фосфолипаза С,

способны обеспечивать гидролиз, вслед за которым могут снова происходить реакции синтеза, в процессе которых возможно образование фактора активации тромбоцитов (ФАТ):

HjC-O-C-Ri

Rz-C-O-C-H

О

H2C - О - P - О - (СН2)2 №(СНэ)з О-

Фосфатидилхолин

Н20 —^ RrCOOH

Фосфолипаза А2

Н2С - О - С - Ri ОН-С-Н

Н26 - О фхолин

Лизофосфатидилходин (лизолецитин)

j-Ri-(CH2)2-OH

Синтаза НООС - Ri

Hzg-O-iCHzJz-R! ОН-С-Н

Н2С - О фхолин

1-Ашсил, 2-лизоглицеролфосфохолин ^Ацетил СоА

Адетил-трансфераза К

9

СоА

H2C-0-(CH2)2-Ri

НзС - С - О - С - Н

Н2С - О - Р - О - (СН2)2Ы+(СНз)з

о-

1-Алкил, 2-ацилглицерол-З-фосфохолин (ФАТ).

Фактор активации тромбоцитов совместно с тромбоксанами (образующимися при перекисном окислении фосфолипидов, в частности, арахидоновой кислоты), стимулируют агрегацию тромбоцитов и их адгезию к эндотелию.

Схема возможного каскада реакций, обуславливающих развитие сДВС у человека при персистенции микоплазм, представлена на рис.11.

ПМ -персистирующие микоплазмы

ФЛМ -фосфолипиды мембран

ФЛ -фосфолипазы

АХК -арахидоновая кислота

ЦОГ -циклооксигеназа

ЛОГ -липоксигеназа

ТО -тромбоксаны

ПГ -простагландины

ЛТ -лейкотриены

ТЦа -активированные тромбоциты

ПМЯЛа -активированные полиморфно-

ядерные лейкоциты АМК -активные метаболиты кислорода

НЭ -нарушение эндотелия

АКС -антикоагуляционная система ФС -фибринолитическая система сДВС -синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови

ГКК -гемокоагуляционный каскад ФАТ -фактор, активирующий тромбоциты

ода-

Рис. 11. Схема возможного каскада реакций, обуславливающих развитие хронического окислительного стресса и синдрома диссеминированного свертывания крови у человека при персистенции микоплазм.

Эйкозаноиды второй группы - арахидонат и его производные (простагландины (ПГДг, ПГЕ;, ПГРг), простациклины (ПГ1г), тромбоксаны (ТОАг) и лейкотриены (ЛТА<, ЛТВ4, ЛТС4, ЛТД,, ЛТН^)) являются важными регуляторами при многих заболеваниях, в том числе инфекционных процессах. Их биосинтез связан с высвобождением арахидоновой кислоты под действием фосфо-липаэ (Аг, а также С) из фосфолипидов клеточных мембран.

Превращение аранидйнйьой кислоты в биологически активные вещества может происходить несколькими путями. Однако первой стадией любого из этих путей является внедрение молекулярного кислорода в арахидоновую кислоту с образованием гидроперекисных интермедиаторов, - гид-роксипероксиэйкозотетраековых кислот, которые могут спонтанно превращаться в соотвествую-щие гидроксиэйкоэотетраеновые кислоты или, ферментативно, в лейкотриены (ЛТ), простагландины (ПГ, втом числе ПГЕ2 и ПГРг, высокие концентрации которых при беременности могут привести к преждевременной родовой деятельности), тромбоксаны (ТО), а также простациклины (ПГ;, - антагонисты тромбоксанов, препятствующие агрегации тромбоцитов, но образование которых ингибируется при повреждении эндотелия сосудов).

Стимуляция биосинтеза эйкозаноидов, в свою очередь, приводит к активации форменных элементов крови и продуцированию активированными тромбоцитами и ПМЯЛ активных метаболитов кислорода, а также протеолитичесхих ферментов. В результате этих процессов происходит по-вреодние собственных клеток организма человека, в первую очередь эвдотелиоцитов кровеносных сосудов. Повреждение эндотелия сосудов и активация тромбоцитов стимулируют реакции гемо-коагуляционного каскада, в норме находящегося в динамическом равновесии с системой фибрино-лиза и антикоагуляции. Перманентное протекание этих реакций в организме человека при персистенции микоплазм (уникальность биологии которых определяет способность вмешиваться в метаболизм фосфолипидов клеток хозяина и избегать иммунного контроля, а таже воздействия АМК) может обеспечивать развитие хронического окислительного стресса и сДВС вследствие истощения систем фибринолиза и антикоагуляции.

Молекулярно-генетические особенности микоплазм

Как установлено в нашей работе, в организме человека способны персисти-ровать и вызывать аналогичные патологические процессы различные виды мико-плазм, что, вероятно, обусловлено наличием у разных микоплазм общих механизмов, обеспечивающих их персистенцию (например, регуляции иммунной толерантности организма хозяина посредством генетической изменчивости). Основы подобных механизмов могут быть связаны с молекулярно-генетическими особенностями этих микроорганизмов.

Определение и анализ гомологии геномов разных видов микоплазм

Уже в конце 60-х годов было установлено отсутствие значительной гомологии между ДНК многих микоплазм (McGee et al., 1967). Техника выполнения экспериментов в то время не позволяла сделать однозначных выводов при гибриди-зуемости ДНК на уровне 1-5%. По более точным количественным данным (при перекрестной гибридизации ДНК разных микоплазм в растворе с отделением дуплексов на оксиапатите) для 21 исследованного вида было установлено, что гомология по ДНК у большинства видов не превышает 2%. (Stephens et al., 1983). Более информативным подходом к оценке степени гомологии разных микоплазм оказалась перекрестная ДНК-ДНК-блот-гибридизация, которая была выполнена нами (Чернова и др., 1986).

Одной из задач нашей работы было проведение генетического анализа ДНК микоплазм, в том числе - определение степени и участков гомологии геномов разных микоплазм с помощью ДНК-ДНК-блот-гибридизации.

При гидролизе ДНК микоплазм рестриктазами малые размеры геномов и характерный состав оснований обеспечивают образование сравнительно небольшого количества фрагментов (20-50), что дает возможность их простого электрофорети-ческого разделения (в зависимости от размеров) в 0.8-1.0%-ных агарозных гелях с образованием дискретных спектров. Поскольку ДНК микоплазм характеризуется низким содержанием Г+Ц, то рестриктазы, сайты узнавания которых содержат несколько ГЦ-пар, обычно разрезают ДНК микоплазм всего на несколько фрагментов. Вследствие геномной гетерогенности ДНК разных микоплазм, естественно, дают различные электрофоретические спектры фрагментов, специфичные для видов и даже штаммов (рис. 12).

1 IS * J 4 7 8

Рис. 12. Сравнительный анализ ДНК ахолеплазм по злектрофоретическим спектрам рестриктазных EcoR (-'-фрагментов (а) и блот-гибридизации с отдельными EcoR ^-фрагментами ДНК Acholeplasma laidlawit (б).

1 - Acholeplasma, штамм 5738/5, выделенный из почки мартышки лапундры; 2 • Acholeplasma, штамм 220, выделенный из крови павиана гамадрила; 3 - Acholeplasma, штамм 221, выделенный из крови павиана гамадрила; 4 - Acholeplasma А (референтный штамм); 7 - A.oculi (референтный штамм); 8 - /^¡¡-фрагменты ДНК фага . Штаммы (1-3) ахолеплазм выделены от обезьян в НИИ экспериментальной патологии н терапии (г.Сухуми) А.Н.Марантиди.

Электрофоретические спектры ресгриктазных фрагментов ДНК хорошо воспроизводятся, их легко сравнивать, они могут быть использованы для идентификации микоплазм, так как непосредственно отражают первичную структуру геномов.

Из представленных данных (табл.4) следует, что при перекрестной блот-гибридизации микоплазменной ДНК удается выявить индивидуальные протяженные фрагменты, по которым между исследованными нами видами микоплазм имеется гомология. При низком уровне гомологии, отмеченном для ДНК большинства микоплазм, эта гомология, по-видимому, касается лишь отдельных протяженных фрагментов генома, а не коротких участков, распределенных по всей длине. В последнем случае на радиоавтографах наблюдались бы не дискретные полосы, а главным образом фон.

Естественно предположить, что гомология ДНК разных микоплазм относится в первую очередь к консервативным, функционально важным участкам генома (например, генам рРНК). Для проверки этого предположения в качестве зонда при блот-гибридизации с £Ы?У-фрагментами ДНК микоплазм была использована плазмида рКК3535, содержащая рибосомный оперон wiB E.coli. Показано, что

фрагменты ДНК микоплазм, гомологичные рнбосомному гену, совпадают по размерам с фрагментами, гибридизующимися у разных микоплазм. Более того, для ДНК Achaleplasma laidluwii, Mycoplasma mycoiJes subsp. capri, M.galliseplicum, M.ho-

Таблица 4

Перекрестная гибридизация ДНК микоплазм (размеры ¿TcöÄV-фрагыентов ДНК (в тыс. п.н.), содержащих участки, гомологичные у разных микоплазм, а также плазмиды рКК3535, содержащей рибо-сомный оперой rrnB Е. coli).

ДНК на фильтрах

ДНК-зонды A.laidl-mi A M.gdllisep-ticum M.mycoides svbsp, capri Al.artkritidts S. citri M.hominis

A.laidlawii А 11.5 5.5 14.0 11.0 6.5 15.0 15.0 8.6 11.7 6.7 13.0 11.0

M.gallisepticum 11.5 8.3 14.0 U.O 6.5 15.0 11.7 6.7 13.0 8.6 13.0 11.0 5.0

M.mycoides subsp. capri 11.5 10* 8.3 10.7 i 2.0 13.0 11.5 15.06.0 11.73.0 6.7 2.5 13.0 8.6 3.0 13.0 11.0 5.0

11.5 15« 11.5 10* 15.0 8 6 13.0

M.arlhritidis 8.6 14.5 8.3 4 2.0 5.5 14.0 4 1.5 2.5 11.0 S.O

11.5 14.0 6.7 15.0 13.0

S. citri S.5 11.0 6.5 5.0 11.7 3.0 11.0

Mhominis 11.5 11.5 11.0 15.0 13.0

8.3 5.5 6.5 11.7 6.7 8.6

11.5 13.S 7.5 14.0 15.0 13.0 15.0 11.0

PKK3535 8.3 11.5 5.5 11.0 6.5 11.7 6.7 8.6 5.0

Примечание: Фрагменты ДНК условно (по степени гомологии) разделены на две группы (сильная -левый столбец и слабая - правый столбец); * - число фрагментов. Например, 10* 10.7 -> 2.0 - приблизительно 10 фрагментов размером от 10.7 до 2,0 тыс. н.п.

minis и Spiroplasma citri эти фрагменты оказываются единственными, по которым гомология выявляется при условиях гибридизации, принятых в нашей работе (Чернова и др., 1986).

Преимущественную гибридизацию рибосомных генов можно было бы объяснить их множественностью в геноме микоплазмы, но установлено, что в отличие от эубактерий микоплазмы содержат по одному или по два рибосомных оперона (Glaser et al., 1992).

Гибридизуемость ДНК разных микоплазм с зондом на рибосомные гены значительно различается по эффективности, что можно связать только с различиями в их первичной структуре. Об этом можно судить по относительной интенсивности соответствующих полос на радиоавтографах. Вывод о таких различиях в структуре рибосомных генов микоплазм, которые могли бы влиять на эффективность образования дуплексов при перекрестной гибридизации, подтверждаются результатами сравнительного анализа олигонуклеотидов 16S РНК и 5S РНК, выполненного для разных видов микоплазм (Rogers et al., 1985), а также данным по первичной структуре генов рРНК некоторых видов микоплазм (Harasawa et al., 1994; Fraser et al., 1995; Himmelreich et al., 1996). В этой связи сравнение тонкой структуры рибосомных оперонов разных микоплазм представляется особенно интересным для выяснения возможных пределов и закономерностей их изменчивости.

По критериям, принятым в микробиологии для бактерий, гомология по ДНК для штаммов, принадлежащих к одному виду, должна быть не менее 70%. При уровне гомологии 60-70% штаммы рекомендуется выделять в подвиды, а при уровне 20-60% - в отдельные виды (Razin, 1992).

Микоплазмологи пока не спешат применять критерий "вида" по степени ДНК-гомологии к организмам класса Mollicutes, аргументируя свои позиции, с одной стороны, недостаточной определенностью понятия "вид" и общим несовершенством системы классификации бактерий, а с другой - возможной распространенностью у микоплазм явления генетической нестабильности (Dybvig, Maniloff, 1983; Dybvig, Voelker, 1996).

Дивергенция геномов микоплазм может быть связана с актами генетической рекомбинации в процессе их сложных взаимоотношений с клетками организма хозяина. В клетках микоплазм нами обнаружены ннзкомолекулярные РНК, а в ДНК микоплазм участки, гомологичные гену нмРНК человека. В ДНК микоплазм, обладающих подвижностью, обнаружены фрагменты, гомологичные генам актина эукариот, а в ДНК других микоплазм - участки, гомологичные длинным концевым повторам ретровирусов, а также сайтам узнавания эукариотической топоизомера-зы I. Учитывая тесное сосуществование микоплазм с клетками эукариот, можно предположить, что эти последовательности являются результатом "горизонтального переноса" (Борхсениус, Чернова, 1989). С другой стороны, наличие подобных последовательностей в геномах микоплазм может быть, в свою очередь, материальной основой взаимодействия микоплазм с клетками эукариот на уровне геномов и реорганизации их ДНК.

Весьма вероятно, что в клетках мнкоплазм, обладающих феноменально высоким уровнем гетерогенности геномов, наряду с известными механизмами реорганизации геномов существуют и принципиально иные пути генетической изменчивости, обуславливающие уникальность феноменологии патогенеза при микоплаз-менных инфекциях.

Генетическая изменчивость мнкоплазм при взаимодействии их с организмом хозяина: вертикальный перенос и реорганизация в генах поверхностных антигенных детерминант

Известно, что высокий уровень видовой гетерогенности ДНК у некоторых патогенных микроорганизмов связан с генетически детерминированной антигенной вариабельностью, которая, как полагают, может быть способом "ускользания" бактерий от защитных механизмов организма хозяина (Dybvig, 1993). К настоящему времени получено множество фактов, свидетельствующих о широком распространении явления антигенной вариабельности у разных видов микоплазм (Dybvig, Voelker, 1996), инфицирующих млекопитающих и человека. Более того, в специальных экспериментах in vitro было показано, что при добавлении специфичных антител в культуральную среду Mycoplasma hominis происходят структурные перестройки в последовательностях генов ImpMl, кодирующих поверхностные антигенные детерминанты микоплазмы (Torp et al., 1994). При этом изменяется степень сродства соответствующих антител к антигену.

Предполагают, что триггерные механизмы антигенной реорганизации микоплазм in vivo могут быть связаны с реактивностью защитных механизмов в системе "паразит-хозяин", а также сменой хозяина, в том числе при вертикальной передаче микроорганизмов. Однако прямых доказательств этому пока нет.

Для выявления возможных генетических перестроек, возникающих у микоплазм в результате вертикального переноса от матери к ребенку при внутриутробном инфицировании, нами был выполнен гибридизационный анализ ДНК клинического материала (мочи и крови) беременных женщин, инфицированных Mycoplasma hominis,и их детей (при рождении и спустя 3-7 месяцев в связи с развитием у младенцев острого пиелонефрита, трансформировавшегося впоследствии в хронический) с использованием универсальных и специфичных ДНК-проб, в том числе РМН7, полученной нами на основании данных о структуре генов Imp!/2 М. hominis.

В результате выполненного нами сравнительного анализа в гибридиза-ционных спектрах ДНК микоплазм клинических образцов матерей и их 3-7 месячных детей были обнаружены различия. Эти различия наиболее четко выявлялись при использовании гибридизационной пробы РМН7 (рис.13). Во всех случаях было обнаружено, что гибридизационные спектры ДНК микоплазм детей, включая в себя соответствующие спектры ДНК микоплазм матерей, содержали также дополнительные фрагменты.

12315 6 709

Рис. 13. Сравнительный анализ £соЯ\7//ае-Ш-фрагментов тотальной ДНК, выделенной из клинического материала женщин, инфицированных А{.hominis (дорожки 1,4, 7), а также их внутриутроб-ноиифицированых М.hominis детей при рождении (дорожки 2, 5, 8) и во время госпитализации (по поводу острого пиелонефрита (дорожки 3,6,9), по бдот-гибридизацик с зондом РМН7.

Наличие дополнительных фрагментов можно было бы объяснить гибриди-зуемостью используемых ДНК-проб с ДНК других микроорганизмов клинического образца и/или другого штамма микоплазмы. Однако результаты соответствующих контролей, связанные с использованием универсального и специфичных ДНК-проб, позволили это опровергнуть. Другой причиной указанного факта может быть недорестрикция ДНК клинических образцов, однако результаты сравнительного анализа с использованием ряда уникальных ДНК-проб позволяют исключить и это предположение.

Остается заключить, что подобное явление обусловлено наличием в исследуемых образцах по крайней мере двух генетически различных субпопуляций одного и того же штамма микоплазм, претерпевшего генетическую трансформацию в процессе смены хозяина. Исходя из полученных нами результатов, а также физической карты гена lmpl/2 M.hominis, можно предположить, что изменения в гибриди-зационных спектрах пар I-III (рис.13) могут быть обусловлены расслоением в организме ребенка материнской популяции штамма M.hominis на субпопуляции, различающиеся количеством повторов в гене lmpl/2. При этом во всех представлен-

ных случаях отбор благоприятствовал клеткам, соответствующий ген которых имел размер (и, соответственно, эпитопный узор антигена) отличный от исходного в геноме клеток материнской линии.

Реактивная генетическая изменчивость может быть ключевым механизмом ускользания микоплазм от иммунного контроля в организме человека и, соответственно, существенным фактором их патогенности.

Последовательности ДНК микоплазм, гомологичные сайтам эукариотической топоизомеразы I

Известно, что значительный вклад в реорганизацию ДНК организмов может обеспечиваться активностью топоизомеразы I (Tonol) (Ehrlich et al., 1993). Этот фермент, определяющий фолдинг ДНК, изменение ее топологии, играет важную роль в репликации, транскрипции, репарации и рекомбинации, в том числе незаконной (Wang, 1991). Последовательности узнавания Топо I в ДНК организмов, как правило, являются "горячими" точками рекомбинации геномов. (Bonven et al., 1985). Молекулярные основы процессов, связанных с Топо I у микоплазм, пока не исследованы.

В процессе анализа первичной структуры повторяющихся фрагментов ДНК микоплазм нами был обнаружен фрагмент MBR1 (Mycoplasma bovis), содержащий 4 копии последовательности TCTTTA/GAAAACT/AG/AA, гомологичной сайтам узнавания эукариотической Топо I (рис.14).

•* I

I я

А"/. 1

V /у-/-,, ? •• ./

- "ЦЖШжЩ ?

• I * ' t

< f » f~A

f 1 \

Рис. 14. Предполагаемая вторичная структура последовательности МВК1, построенная с помощью программы ОЫАБгё ("Н1ТАСНГ, версия 5.0).

Последовательность нуклеотидов MBR1 представлена многочисленными короткими повторяющимися палиндромио-шпилечными структурами и их сочетаниями. Подобная организация ДНК характерна для самых активных зон геномов про- и эукариот (Гусев и др., 1991). Результаты анализа первичной структуры последовательностей нуклеотидов MBR1 позволили предположить генетическое родство MBR1 с транспозон-подобными элементами, кодирующими белки, содержащие повторяющиеся цистеин-богатые домены. Полагают, что эти белки участвуют в реакциях с АМК (например, НгСЬ) и являются важной сигнальной системой в защите клеток от окислительного стресса (Mcintosh, 1992).

Фрагмент MBR1, как оказалось, гибридизуется с несколькими EcoRY-фрагментами ДНК M.bovis, а также ДНК других микоплазм, в том числе участками, содержащими их гены рРНК. На основании анализа известных нуклеотидных последовательностей MBR1 нами установлено, что участками гомологии клонированного фрагмента ДНК M.bovis и оперонов рРНК микоплазм являются 14-мерные тракты TCTTTA/GAAAACT/AG/AA, которые также встречаются в спей-серных и промоторных зонах (соответственно по одной копии в каждой) генов рРНК всех изученных микоплазм (Harasawa et al., 1992). Эти районы генома микоплазм являются "горячими участками" реорганизации по типу "выщепления-встраивания" (Glaser et al., 1992; Harasawa et al., 1994a 1994b).

Молекулярные механизмы регуляции оперонов рРНК микоплазм пока не выяснены; канонические для бактериальных промоторов последовательности "-35" и "-10" в оперонах рРНК ряда микоплазм не обнаружены вообще (Glaser et al., 1992). Не исключено, что повторяющиеся 14-мерные последовательности TCTTTA/GAAAACT/AG/AA связаны с регуляцией работы генов рРНК микоплазм и, возможно, реорганизацией соответствующих участков их геномов.

До сих пор 14-мерные последовательности были обнаружены только в геномах эукариот и вирусов. Наличие подобных участков в геномах микоплазм может служить аргументом в пользу существования общих молекулярных основ регуляции процессов репликации, транскрипции и рекомбинации у микоплазм, вирусов и эукариот.

Недавно появилось сообщение (Horowitz et al., 1996), что выделенный из клеток микоплазм (M.fermentans subsp. incognitas, ассоциированных со СПИД у ВИЧ-инфицированных пациентов) белок Топо имеет свойства, характерные для соответствующего эукариотического фермента. Известно, что одним из ингибиторов эухариотической топоизомеразы I является камптотецин (антибиотик, исполь-

зукпцийся в онкологической практике как противоопухолевый препарат) (Бронштейн и др., 1989а,б). В наших экспериментах было установлено, что добавление этого антибиотика к клеткам микоплазм, находящимся в латентной стадии, приводит к подавлению роста культуры микроорганизмов, однако внесение кам-птотецина в культуру микоплазм, находящуюся в логарифмической фазе роста, вызывает реакции, свидетельствующие о расслоении популяции микроорганизмов и возникновении генерации клеток, устойчивых к действию этого антибиотика. Реактивная трансформация микоплазм в ответ на ингибитор Топо I может быть сравнима с реакцией этих микроорганизмов на присутствие в культуральной среде специфичных антител (Тогр et al., 1994). В этой связи можно предположить, что соответствующая мишень камптотецина (как и антигенные детерминанты в случае антител) является важной детерминантой клеток микоплазм, определяющей их выживание и, соответственно, персистенцию в организме хозяина.

Хромосомные аберрации, индуцированные мнкоплазменными инфекциями в лимфоцитах периферической крови человека

Микоплазменные инфекции могут влиять на любой параметр, функцию и активность клетки (Rottem, Barile, 1993). Тесный контакт микоплазм с клетками хозяина не исключает обмена между ними любыми макромолекулами, а также экстрахромосомными компонентами. Однако сообщения о влиянии микоплазм на морфологию и структуру хромосом инфицированных клеток in vitro немногочисленны и противоречивы (Полянская, Ефремова, 1993, 1994, 1996; Barile, 1979). Одной из задач наших исследований было определение влияния микоплазм (Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma hominis) на морфологию хромосом лимфоцитов периферической крови человека in vitro.

В результате наших экспериментов установлено, что инфицирование лимфоцитов периферической крови человека микоплазмами А.laidlawii и M.hominis in vitro приводит в 12 и 18% случаев (соответственно) к появлению в лимфоцитах множественных хромосомных аберраций, которые локализуются главным образом в верхних (р) плечах хромосом группы Сив нижних (q) группы А. При этом основным типом хромосомных аномалий в клетках являются хроматидные пробелы, разрывы без соединения разорванных концов (приводящие к появлению одиночных и парных фрагментов хромосом), тогда как хромосомные перестройки (результатом которых является появление диценгриков, транслокаций) наблюдаются редко (табл.5, рис.15).

Таблица 5

Частота хромосомных аберраций, индуцированных михопламеиными инфекциями в лимфоцитах периферической крови человека in vitro_

Показатель контроль Инфицированные

A.laidawaii М. hominis

Проанализировано метафаз 150 150 320

Доля клеток с аберрациями, % 0 12.7±1.2* I8.l±1.4*

Число аберраций на 50 метафаз одиночные фрагменты парные фрагменты прочие (дицектрики, транслокации) ООО З.ОЮ.б* 2.2±0.4" 0.7±0.2* 5.3±0.8* 3.1±0.6* 1.3±0.3*

Доля анеуплоидаых клеток, % гилоплоидные клетки гиперплоидные клетки 3.3±0.6 !.5±0.3 4.6±0.7 2.6±0.5 5.3±0.8 2.8±0.5

•Значения, достоверно отличающиеся от контроля при р<0.05.

Полученные нами результаты позволяют заключить, что микоплазмы способны индуцировать крупномасштабные специфичные хромосомные нарушения в клетках человека in vitro. Однако подобные эффекты микоплазменные инфекции, вероятно, могут вызывать и in vivo.

Рис. 15. Морфологические изменения хромосом лимфоцитов периферической крови человека, ин-фиикрованных микошшмами {Mycoplasma hominis PG21).

Наличие хронических михоплазменных инфекций у женщин и отягощенного акушерского анамнеза, связанного с привычным невынашиванием беременности на сроках 6-8 недель, а также рождением детей с различными пороками развития (в том числе обусловленными изменениями хромосом), очевид-

но, являются неслучайным совпадением.

Применение специальной методики, связанной с дифференциальным окрашиванием хромосом, позволило нам установить, что наиболее часто хромосомные аномалии в лимфоцитах периферической крови человека, инфицированных михо-плазмами in vitro, возникают в хромосомах 3 и 6. При этом большая часть хромосомных нарушений приходится на локусы короткого плеча шестой хромосомы.

В локусах короткого плеча шестой хромосомы сосредоточены гены, ассоциированные с системами HLA и МНС, обуславливающими иммуногенетические особенности человека, а также гены некоторых факторов, связанных с системой АОЗ, и гемокоагуляционного каскада (McKusick et al„ 1995). Изменения в соответствующих участках хромосомы могут обеспечить дисфункцию иммунной системы и толерантность организма к микоплазмам. В этой связи тропизм микоплазм по отношению к короткому плечу шестой хромосомы человека может быть эволюцион-но закрепленным механизмом, определяющим персистенцию этих микроорганизмов у человека.

Преобладание также хроматидных пробелов и разрывов в лимфоцитах периферической крови человека, инфицированных Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma fermentans, было независимо установлено в экспериментах американских исследователей (Stewart et al., 1994). Это позволяет предположить общие механизмы индукции хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека при инфицировании разными видами (в том числе различающимися по свойствам патогенности) микоплазм in vitro.

Известно, что хроматидные разрывы преобладают среди хромосомных перестроек, индуцированных некоторыми вирусами в клетках высших эукариот in vitro (Бужиевская, 1984). Возникновение разрывов хромосом в этих случаях связывают с непосредственным внедрением инфекционного агента (или фрагмента его генома) в хромосому клетки хозяина. Возможно, образование хромосомных аберраций в случаях микогшазменных инфекций опосредовано подобными событиями, в которые могут вовлекаться экстрахромосомные компоненты (в том числе вирусы) и определять специфичность хромосомных нарушений как в отношении их типа, так и локализации. Материальной основой генетических рекомбинаций в системе ми-коплазма-клетка хозяина могут быть гомологичные участки геномов микоплазм, вирусов и клеток эукариот, а также повторяющиеся последовательности ДНК и подвижные элементы типа IS и Тп, играющие значительную роль в мутационных событиях микоплазм (Dybvig, Voelker, 1996).

Другой причиной образования разрывов хромосом в клетках высших организмов при инфекционном мутагенезе может быть мутагенное воздействие продуктов патогена или общего метаболизма в системе паразит-хозяин (Rottem, Barile, 1993). Показано, что введение экзогеннных антиоксидантов, например, глу-татиона, позволяет ограничить кластогеиный эффект микоплазм (Kahane, 1984). Это позволяет заключить, что значительный вклад в цитопатологию клеток , инфицированных микоплазмами, может вносить окислительный стресс. В связи с этим микоплазменные инфекции, обуславливающие хронический окислительный стресс, можно рассматривать как существенный фактор генетической изменчивости в клетках высших организмов (Чернов, Чернова, 1996; Chernov, Chemova, 1994,1995).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микоплазменные инфекции относят к мультиплексивным (сложным, неоднозначным) заболеваниям (Chernov, Chemova, 1994). Для этих инфекций характерно хроническое течение. Исчезновение симптомов инфекции не означает элиминации микоплазм из организма. Следствием перенесенной микоплазменной инфекции часто является длительная (а иногда и пожизненная) персистенция микоплазм. При этом явные повреждения макроорганизма могут отсутствовать (Прозоровский и др., 1995). Пациенты с хроническими микоплазменными инфекциями, клинический материал которых был использован в данной работе, никаких жалоб не предъявляли (за исключением репродуктивных дисфункций, по поводу которых обратились некоторые пациенты в Центр Охраны Семьи, Материнства и Детства Республики Татарстан) и соматическими заболеваниями на момент обследования не страдали. Однако в результате проведенных биохимических исследований патогенеза при персистенции микоплазм было установлено, что неимеющая явных клинических проявлений персистенция разных видов микоплазм у человека сопровождается скрытыми патологическими изменениями в его организме, связанными с иммунной дисфункцией, дисбиозом, накоплением продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови и эритроцитах, угнетением их системы антиоксидант-ной защиты, ультрацитопатологией форменных элементов крови, активацией ге-мокоагуляционного каскада, а также угнетением фибринолиза и антикоагуляции, и, таким образом, угрозой развития синдрома диссеминированного внутрисосуди-стого свертывания крови (Maitzeva et al., 1994, 1996а,б). Хронический окислитель-

ный стресс, по-видимому, определяет основные механизмы патогенеза при перси-стенции микоплазм, хотя особенности биологии возбудителя также могут вносить вклад в эти процессы.

Механизмы защиты микоплазм от воздействия окислительного стресса пока не выяснены, В клетках разных видов микоплазм (в том числе способных к перси-стенции в организме человека) не обнаружены известные для других бактерий гены и соответствующие им системы антиоксидантной защиты (Pollack, 1992; Himmelreich, 1996). Это позволяет предполагать, что микоплазмы используют нетрадиционные способы защиты от окислительного стресса. Возможно, они синтезируют соединения, аналогичные лизодектозе, аммонигенину, а также циклопиро-фосфату метилэритрита, обнаруженные в условиях окислительного стресса у ряда бактерий (включая патогенов, способных к длительной персистенции в организме человека) (Островский, 1997). Однако так ли это, еще предстоит выяснить. Вместе с тем, уже сегодня очевидно, что окислительный стресс, объект пристального внимания в связи с его активным участием в различных патологических реакциях организмов, является также важной составляющей патогенеза при персистенции микоплазм у человека. В этой связи расшифровка механизмов быстрого реагирования на окислительный стресс и регуляции стрессорного ответа у микоплазм имеет как фундаментальное, так и прикладное значение.

Полученные нами данные о структуре и реакциях форменных элементов крови позволяют предположить, что основным источником медиаторов (в том числе АМК через их НАДФН-систему), определяющих каскад патологических реакций у человека при персистенции микоплазм, являются тромбоциты. Это может быть связано с особенностями инфекционных агентов, которые, будучи мембранными паразитами, способны вмешиваться в метаболизм фосфолипидов. Перманентная стимуляция тромбоцитов в связи с жизнедеятельностью персистирующих микоплазм может приводить к значительным изменениям гемостаза и связанных с ним систем.

На основании полученных нами результатов, а также имеющихся в литературе данных, можно заключить, что персистенция микоплазм у человека определяется следующими механизмами: патогенетическими (связанными главным образом с неспецифическими реакциями, обусловленными хроническим окислительным стрессом), а также триггерными и пролонгирующими (связанными с иммунологическими особенностями организма и уникальными способностями микоплазм ускользать от иммунного надзора).

Реактивная генетическая изменчивость, вероятно, является ключевым механизмом ускользания микоплазм от иммунного контроля, и, соответственно, существенным фактором их патогенности.

Высокая скорость генетической изменчивости микоплазм может объяснять низкую эффективность антибиотикотерапии при микоплазменных инфекциях, связанную с быстрым приобретением устойчивости этих микроорганизмов к антибиотикам (Chernov, Chemova, 1995). Результаты, полученные в данной работе, позволяют предположить, что использование препаратов, воздействующих на регуляторы существенных клеточных реакций (например, топологию ДНК и, соответственно, транскрипции, репликации, рекомбинации), может также способствовать реактивной изменчивости микоплазм и эволюции их вирулентности.

Представляется вероятным, что разрешение проблемы контроля и подавления микоплазменных инфекций лежит на пути изучения не только молекулярной биологии микоплазм и механизмов взаимодействия в системе "паразит-хозяин", но также эволюционной целесообразности антагонистических взаимоотношений в природе (Chernov, Chemova, 1994,1995).

В литературе есть данные (Прозоровский и др., 1995), свидетельствующие о том, что основным депо персистирующих микоплазм является костный мозг. Это обстоятельство в свете полученных нами результатов позволяет предположить, что микоплазмы могут непосредственно воздействовать как на метаболизм, так и на генетическую систему предшественников ФЭК, в том числе иммунокомпетент-ных клеток, нарушая их структуру и функции и, таким образом, способствовать закреплению собственной персистенции.

Данные, полученные в нашей работе, позволяют также предполагать, что персистенция микоплазм, препятствуя распространению некоторых гаплотипов, может приводить к существенным сдвигам в генетической структуре популяции человека, так как восприимчивость организма к микоплазменным инфекциям, связанная с определенным спектром антигенов системы HLA, оборачивается серьезными патологиями и, как правило, влияет на репродуктивные функции (Мальцева, 1996). В этой связи особый интерес представляют факторы, контролирующие невосприимчивость человека к микоплазменным инфекциям, изучение которых может определить новые пути решения проблемы персистенции микоплазм.

Изучение взаимодействия микоплазм с организмом человека сдерживается как естественными трудностями мониторинга взаимоотношений в системе

"паразит-хозяин", так и недостатком эффективных средств контроля инфекционного процесса (Борхсениус, Чернова, 1989; Baseman, 1996).

Выполнение данной работы стало возможным в результате создания нами высокочувствительных диагностических зондов, позволяющих обнаружить даже единственную частицу инфекционного агента в биологическом материале. Вместе с тем, использование этих диагностических тестов позволило убедиться, что наличие микоплазм в клинических образцах пациентов еще не означает микоплазмен-ной инфекции как заболевания.

При анализе клинического материала человека или животных, то есть тех случаев, когда имеется сложная система симбиоза с различными микроорганизмами ("хемостат", в котором присутствуют многочисленные вирусы, бактерии, простейшие эукариоты, находящиеся под контролем эндо- и экзогенной регуляции), высокая разрешающая способность диагностического теста может привести к ложному заключению о наличии инфекционного процесса. В клинической диагностике очень высокий уровень чувствительности не так важен, как важна специфичность метода. Клиническая диагностика микоплазменных инфекций должна основываться на биосенсорах, обеспечивающих как специфичную идентификацию патогена, так и факторов, свидетельствующих о развитии патологического процесса. Вероятно, подобным требованиям будут отвечать диагностикумы следующего поколения.

ВЫВОДЫ

1. Персистенция микоплазм может быть индикатором патологии микробиоценозов у человека. Показано, что персистенция микоплазм разных видов (Mycoplasma hominis, M.fermentans, M.genitalium, Acholeplasma laidlami, Ureaplasma urealyticum) у человека сопровождается дисбиозом генитального тракта и характеризуется преобладанием условно-патогенных микроорганизмов (Gardnerella vaginalis, Bacteroides spp., Peptococcus spp., Eubacterium spp.J. Особенности метаболизма этих микроорганизмов создают благоприятные условия для размножения микоплазм.

2. Персистенция микоплазм у человека связана с хроническим окислительным стрессом. При этом накопление вторичных продуктов перекисного окисления

. липидов в мембранах эритроцитов и плазме крови сопровождается угнетением системы их антиоксидантной защиты.

3. Обнаружены изменения ультраструктуры и взаимодействия форменных элементов крови у пациентов с персистенцией микоплазм, характерные для синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. Эти изменения также сопровождаются нарушением динамического равновесия систем гемостаза, связанного с активацией гемокоагуляционного каскада, угнетением антикоагуляции и фибринолиза.

4. Персистенция микоплазм у человека сопровождается высоким уровнем содержания в крови фермента есю 5'-нуклеотидазы, что может обеспечивать нарушение метаболизма пуринов и пиримидинов в клетках организма и свидетельствовать о развитии патологических изменений системы гемостаза и иммунитета.

5. Персистенция микоплазм разных видов у человека сопровождается аналогичными изменениями специфичных и неспецифичных иммунных реакций организма. Это может быть связано с наличием у разных микоплазм общих механизмов воздействия на иммунную систему организма-хозяина.

6. Микоплазмы являются чрезвычайно гетерогенной по ДНК группой микроорганизмов. Установлено, что при вертикальном переносе микоплазм (мать-ребенок) может возникать реорганизация в гене, кодирующем поверхностную антигенную детерминанту этих микроорганизмов. Предполагается, что реактивная генетическая изменчивость является основным фактором патогенности микоплазм.

7. В геномах микоплазм, вирусов и эукариот обнаружены общие нуклеотидные последовательности, происхождение которых в ДНК микоплазм может быть связано с "горизонтальным переносом". Представлена возможная вторичная структура повторяющегося фрагмента ДНК одной из микоплазм, содержащего 4 копии 14-мерных последовательностей, гомологичных сайтам узнавания эука-риотической топоизомеразы I. Предполагается, что эти последовательности связаны с общими механизмами регуляции реорганизации ДНК у микоплазм, вирусов и эукариот.

8. Разные виды микоплазм могут индуцировать аналогичные хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови человека in vitro. Установлено, что основным типом индуцированных микоплазмами хромосомных аберраций являются хроматидные пробелы и разрывы, большая часть которых обнаруживается в коротком плече шестой хромосомы.

9. На основании полученных данных предложены схемы возможных путей развития хронических микоплазменных инфекций и индуцируемого ими биохимического каскада патологических реакций у человека. Предполагается, что механизмы персисгенции микоплазм в значительной мере определяются реактивной генетической изменчивостью этих микроорганизмов, а также особенностями иммунной системы хозяина (включая характер распределения антигенов его системы HLA). Хронический окислительный стресс может запускать каскад неспецифических реакций патогенеза по механизмам, уже известным для инфекционных процессов.

10. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, содержащие консервативные и уникальные фрагменты генома микоплазм, а также синтетические олигонуклео-тидные последовательности этих микроорганизмов. На их основе созданы диагностические ДНК-зонды. Эти зонды используются в медицинских центрах Республики Татарстан для обнаружения, идентификации и определения множественности микоплазменных инфекций.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борхсениус С.Н., Чернова O.A., Меркулова H.A., Арэ А.Ф. Геном микоплазм: оценка возможности "горизонтального перекоса фрагментов ДНК" - Тез. Всесоюзн. биохим. съезда, Киев, 19Е6, Т.2. С.347.

2. Чернова O.A., Меркулова H.A., Борхсениус С,Н. Рибосомные гены - единственные гомологичные участки ДНК некоторых микоплазм,- Мол.ген., микробиол., вирусол., 1986, N9. С. 16-21.

3. Борхсениус С.Н., Чернова O.A. Микоплазмы. - Цитологи«, 1987, т.29, N 4, с.379-390.

4. Борхсениус С.Н., Чернова O.A. Геном микоплазм. - Цитология, 1987. Т.29, N б, С.619-631.

5. Борхсениус С.Н., Чернова O.A., Меркулова H.A., Аре А.Ф. Обнаружение и идентификация микоплазменных инфекций с помощью ДНК-ДНК- гибридизации. - Цитология, 1987. Т.29, N 8 С.934-941.

6. Чернова O.A., Меркулова H.A., Борхсениус С.Н. Обнаружение в ДНК мшсоплазм, обладающих подвижностью, фрагментов, гомологичных гену актина. - Биопол.и клетка, 1987. Т.З., N 6. С.318-319.

7. Борхсениус С.Н., Шаги-Мухаметова Ф.Ф., Чернова O.A. Современные методы диагностики микопдазменнных контаминации клеточных культур - Биотехнология, 1987, Т,3. N 6. С.775-782.

8. Борхсениус С.Н., Чернова O.A., Меркулова H.A., Смирнова Т.Д. Способ обнаружения микоплазменных заражений. - А.С.1374783, 1987.

9. Борхсениус С.Н., Раковская И.В., Чернова O.A., Меркулова H.A. Фрагменты, гомологичные длинным концевым повторам вируса Раушера, обнаружены в ДНК микоплазм. - Биополимеры и клетка, 1988. Т.4, N 2, С. 108-111.

10. Борхсениус С.Н., Меркулова H.A., Шаги-Мухаметова Ф.Ф., Чернова O.A., Скамров A.B., Крылова С.Ю.Комплект плазмид для обнаружения и идентификации микоплазменных инфекций в клеточных культурах. - Сб. трудов Всесоюз. конференции "Генная и клеточная инженерии для решения биотехнологических проблем", Тарту, 1988. С.3-9.

11. Борхсениус С.Н., Меркулова H.A., Чернова O.A. Рекомбинантная плазмидная ДНК pMg 16 для обнаружения микоплазменных заражений.-A.C. 1413960, 1988.

12. Чернова O.A., Меркулова H.A., Чернов В.М., Крылова С.Ю., Шаги- Мухаметова Ф.Ф. Диагностикум для микоплазменных инфекций на основе ДНК-проб. - Тез. Всесо-зной конференции "Новые направления медицинской диагностики", Москва, 1988. С. 108.

13. Борхсениус С.Н., Чернова O.A. Михоплазмы: молекулярная и клеточная биология, патогенность, диагностика. Ленинград, Наука, 1989, 156с.

14. Борхсениус С.Н., Чернова OA., Меркулова H.A., Чернов В.М. Способ идентификации M.orale в клетках, культивируемых in vitro. - A.C. 1559710, 1989.

15. Чернова O.A., Чернов В.М., Меркулова H.A., Борхсениус С.Н. Способ идентификации M.fermenlans в клетках, культивируемых in vitro. - A.C. 1559709, 1989.

16. Чернова O.A., Чернов B.M., Меркулова H.A., Борхсениус С.H., Шаги-Мухаметова Ф.Ф. Способ идентификации M.salivarium в клетках, культивируемых in vitro. -A.C. 1559708, 1989.

17. Чернова O.A., Хасанова М.А., Гоголев Ю.В., Чернов В.М. Киты для обнаружения и подавления микоплазменных инфекций. - Сб. статей конференции "Карликовость люцерны и меры борьбы с заболеванием", Саратов, 1990. С.8-10,

18. Chernova O.A., N.A.Merkulova, I.V.Rakovskaya.S.N.Borhsenius. Homologous sequences in genomes of mycoplasmas, viruses and eukaryotes -In: Recent Advances in

Mycoplasmology. Ed. G.Stanek, G.Cassel, J. TuIly.R.Whitcomb. Gustav Fischer Stuttgart, N-Y, 1990. Р.б 12-614

19. Chernov V.M., O.A.Chernova, R.G.Kijaraova, A.B.Ivanova, S.N.Borhsenius. Mycoplasma infections of plant cell cultures,- In: Recent Advances in Mycoplasmology. Ed. G.Stanek, G.Cassel, J.Tully, R. Whitcomb. Gustav Fischer, Stuttgart, New York, 1990. P.937-939.

20. Borhsenius S.N., O.A. Chernova, N.A. Merkulova, V.M.Chemov. Detection and identification of mycoplasma infections by DNA-hybridization with complect of DNA probes. - In: Recent Advances in Mycoplasmology. Eds. G.Stanek, G.Cassel, J.Tully, R.Whitcomb. Gustav Fischer, Stuttgart, New York, 1990. P.411- 413.

21. Чернов B.M., Чернова O.A. Экстрахромосомные компоненты микопяазм - новый класс векторных систем в генной инженерии. Тез. 9-ой Всес. конф. "Нуклеаэы", 1991. C.U.

22. Чернов В.М., Чернова O.A., Мальцева Е.С. Клиническое значение микоплазменных инфекций при хроническом пиелонефрите у детей. - Сб. трудов ГИДУВа, Казань, 1992. С.24-25.

23. Хасанова М.А., Чернов В.М., Чернова O.A. Рекомбинантная плазмидная ДНК рА17, используемая в качестве ДНК-зонда для обнаружения A.laiälawii 118 в клетках растений. A.C. 1835851, 1992.

24. Ситншсова С.Н., Хасанова М.А., Чернов В.М., Чернова O.A. Рекомбинантная плазмидная ДНК рА18, используемая в качестве ДНК-зонда для обнаружения Acholeplasma laidlami 185 в клетках растений. A.C. 1835852, 1992.

25. Chernova O.A., Maricina O.N., Chernov V.M. Repeated DNA sequences shared by mycoplasmas. - Thes. of the 9th Congress of the ЮМ, Iowa, USA, 1992. P.256.

26. Maitzeva L.I., Chernov V.M., Rnyazev A.A., Chernova O.A. Prevalence of mycoplasma infections in women with late term gestosis. Thes. of the 9th Congress of the IOM, Iowa, USA, 1992. P.293.

27. Мальцева E.C., Чернова O.A., Чернов В.М. Диагностика и особенности клинического течения хронических пиелонефритов у детей. Сб.: "Современные методы диагностики и лечения", Казань, 1993. С.287-289.

28. Чернова O.A. Феноменология муяътиялежсивных инфекций и проблемы выживания в экстремальных условиях. В сб.: "Феномены природы и экология человека", Казань, 1994. С. 157-160.

29. Чернова O.A., Чернов В.М. Феноменология микоплазменных инфекций и проблема выживания в условиях антропогенных перегрузок, - Тез. докл. конференции "Влияние экологических факторов на состояние здоровья женщин и детей", г.Казань, 1994, С. 1213.

30. Chernov V.M., Chernova O.A. The phenomenon of mycoplasma infections and anthropogenic overloads, - Biomedical Letters, 1994. N 50. P.275-277.

31. Chemova O.A., Skvortsov V.V., Danilevsky A.N., Chernov V.M. Exogenic regulators of mycoplasmas. - Thes. of the 10th Congress of the IOM, Bordeuax, France, 1994. P.205.

32. Chernov V.M., Chemova O.A., Gogolev V.V., Markina O.S. Repeated tetradecamer nucleotide sequences as elementary structures of genetic regulation in Mallicuies - Thes. of the 1 Oth Congress of the IOM, Bordeuax, France, 1994. P.402.

33. Chernov V.M., Chemova O.A., Volkova E.N., Sitnikova S.N., Chekmeneva Y.Y., Malcev S.V. Chromosome abnormalities in human cells infected with mycoplasmas - Thes. of the 10th Congress of the IOM, Bordeuax, France, 1994. P.642.

34. Чернов B.M., Гаффаров X.C., Маркина O.H., Чернова O.A. Для обнаружения Mycoplasma bovis сконструирован диагностический зонд. Сельскохозяйств. биолопм.-1995. Т 2. С.47-52.

35. Чернов В.М., Волкова E.H., Чернова O.A. Кяастогенное воздействие микоплазм. -ДАН, 1995. Т. 344. N 3. С.130-132.

36. Чернова O.A., Чернов В.М. Повторяющиеся тетрадекамерные последовательности в геномах микоплазм. - ДАН, 1995. Т. 344. N 2. С.278-281.

37. Maksuytova K.N., Yakovleva V.G,, Tarchevsky I.A. Chernov V.M., Chemova O.A. Synthesis of new polypeptide induced by pathogen and some organic acids. • Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995. V.8. N4. P. 189.

38. Chernov V.M., Chemova O.A. Methods for diagnostics and suppression of mycoplasmas. -Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995. V.8. N4. P.235.

39. Chemova O.A., Chernov V.M. Mycoplasmas as a factor of genetic mutability for human cells. - Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995. V.8. N4. P.235.

40. Chernov V.M., Maitzeva L.I., Andrushko I.N., Ibragimov O.K., Chemova O.A. Mycoplasma infections in women: effect on the blood stasis and pregnancy outcome. - Thes. of 8th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division. Jerusalem, Israel, August 18-23, 1996. P.77.

41. Chemova O.A., Volkova E.N., Popova N.V., Chernov V.M. Mycoplasmas as chromosome-damaging agents for human cells. - Thes. of 8th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division. Jerusalem, Israel, August 18-23, 1996. P.77.

42. Leschinskaya I.В., Chernov V.M., Kuprianova-Ashina F.G., Khasanova M.A., Chemova O.A. Mycoplasma membrane as a target for RNase of Bacillus intermedius. - Thes. of 8th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division. Jerusalem, Israel, August 18-23, 1996. P.78.

43. Chernov V.M., Leschinskaya I.B., Kuprianova-Ashina F.G., Khassanova M.A., Chemova O.A. Mycoplasma membrane as a target for binase effect. - Thes. of 11th Congress of IOM, Florida, 12-19 Julay 1996. USA, IOM Lett. v. 4. P.373.

44. Chemova O.A., Chernov V.M. Repeated nucleotide sequences and rearrangements in genomes of mycoplasmas - Thes. of 11th Congress of IOM, Florida, 12-19 July 1996, USA, IOM Lett. v.. 4. P.233.

45. Tarchevsky I.A., Maksuytova N.N., Yakovleva V.G., Gogolev Y.V., Chernov V.M., Chemova O.A. Mycoplasma induced proteins and genome rearrangements in plants - Thes. of 11 th Congress of IOM, Florida. 12-19 July 1996, USA, IOM Lett. v. 4. P.258.

46. Maltzeva L.I., Andrushko I.N., Ibragiraov O.K., Chemova O.A., Chernov V.M. The influence of mycoplasma infections in women on the blood stasis and pregnancy outcome • Thes. of 1 Ith Congress of IOM, Florida, 12-19 July 1996, USA, IOM Lett. v. 4. P.326.

47. Maltzeva L.I., Saphronov V.V., Valeev V.N., Chernov V.M., Chemova O.A. The microelement homeostasis in parturient women and their neonates at mycoplasma infection -Thes. of 11th Congress of IOM, Florida, 12-19 July 1996, USA, IOM Lett. v. 4. P.327.

48. Maltzeva L.I., Chernov V.M., Chemova O.A. The potency of laser and ozonetharapy for supression of urogenital mycoplasma infections - Thes. of 11th Congress of IOM, Florida, 1219 July 1996, USA, IOM Lett. v. 4. P.328.

49. Чернов B.M., Чернова O.A. Мисоплазменные инфекции как возможный фактор генетических изменений в клетках высших эукариот. - Цитология, 1996. Т. 38. N 2. С. 107114.

50. Чернов В.М., Чернова О.А. Последовательности, гомологичные сайтам узнавания зу-кариотической топоиэомеразы I, в геномах микоплазм. - Молекулярная биология, 1996. Т. 30. Вып. 2. С.95-103.

51. Чернова Ó.A., Волкова Е.Н., Чернов В.М, Хромосомные аберрации, индуцированные микоплазменными инфекциями в лимфоцитах периферической крови человека. - Генетика, 1996. N 6. С.754-763.

52. Chernov V.M., Markina O.S., Chemova O.A. Topoisomerase 1 recognition like sites in mycoplasma genomes. - Microbios, 1996. v.86. P. 19-22.

£ ¿í/Ud.f.'ée^.