Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли 5-лидерной последовательности геномной РНК Х-вируса картофеля, как трансляционного энхансера

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли 5-лидерной последовательности геномной РНК Х-вируса картофеля, как трансляционного энхансера"

РГ6 0 —

2 8 map 19вг1 имени ы.в.лоыоносова

БИОЛОГИЧЕСКИЙ «АКУЛоТЕГ

Еа правах рукописи ТОШЕВОШ ОЛЕГА ЛВДОВИКОВНА

ЕЗУЧШШЕ ГОЛИ Б'-ЛИДЕШЙ ПОСЛВДЖТЕШККЗТЙ ГШШНОЙ ÎE5 1-ВШС& МИОШН, ГШ ТРАЖИЯЩОННПГО ЭНЗШЮ2РД.

03.00.06 - Вирусологая

¿Етортфорат ' дасартацйз на сопскашэ зрелой отопеш ваздадата Оиолопггосгапс паук

ИОСКВА, 1994

Работа выполнена на кафедре вирусологии Блолопшсюго факульта'. Московского Государственного Университета ш.Ы.ВЛошносопа

Научные руководители: академик ?Ш, профессор И.Г.Дтабаксш,

доктор бгологвчвскях наук Н.П.Ред^гпогз

Офзцнадьшш ошюненты: доктор хшэтеошх наук И.Н.Шацпй!

кандидат бяаютескях наук Е.В.Кузш2и

Ведущая организация - ШстЕтут шдаошалита и шрусшх внцафалнтов РШ

Зацита состоятся С^^г^с^Л 1934 г. в Ж™. но сасодаша споцяалзаировахшогр соната Д (БЗ.05.70 прз Сзсаовсши Государственное Уштарсгтото т.и.В.Ло^олоссша по а,1рзсу: 119393, йэсдаз, Л0ШВСК29 горц, ИГУ, ЕгашшюашЗ факультет.

О дкесердвдеа шзю ошибаться в СйШатш) Еашятезсшгс фзиуяьтата ИГУ ЕУ.и.В.£о^зносово.

¿вуорафэрат разослалЛ7" щга<1

т

Уташа сэцрэтарь спэцаатцроЕшюго соабга, эддцдз7 жглэша паук , А / Е.Н.Еагрл^агаг;

ОЗДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вирусы растений, содержащие геномные позитивные РНК, представляют собой чрезвычайно удобную модельную систему для изучения многих ватных пробл-л молекулярной биологии. В процессе вволвцяи вирусы приспособились к эффективному использованию трансляционного аппарата клетки, поэтому они являются удобным объектом для изучения механизмов регуляции трансляции в вукариотических системах. Изучение механизмов регуляции экспрессии эукариотичесхих генов является одной из основных задач современной молекулярной биологии. Контроль на трансляционном уровне (преимущественно на стада инищяции трансляции) является одним из способов регуляции экспрессии генов аукариот. Именно скорость инициации трансляции определяет трансляционную зфСзктивность мРНК.

Изучение . закономерностей, обусловливающих разную ¡Ераасляцшэннуэ эффективность мИШ, в частности усиление сФфвктишоста . трансляции за счет особенностей структуры б- -концевых шзтранслируешх' (лидерннх) последовательностей МРНК, иогло бы прояснить ряд теоретически и практически вааных проблем. В частности, ато позволило бы конструировать и использовать в биотехнологии химерные мРЖ, способные транслироваться с максимально высокой ¡эффективностью.

Само по себе изучение структура и экспрессии геномов вирусов растений необходимо для выработки аффективных средств борьбы о ними, поскольку вирусные, болезни растений наносят бользоЗ уадэрб сельскому хозяйству. :

Щ ль и задача исследования. Целью д- иной работы являлось изучения влияния отдельных структурных элементов'' б--концевой

нетранслируемой последовательности (сф-лидер) геномной РНК X-В1фуса картофеля (ХВК) на эффективность трансляции репортерного гена (неомицинфосфотрансфераза i, nptd. Ранее нашей группой было показано, что оф-лидер геномной РНК ХВК обладает свойством сильного энхансера на уровне трансляции (smimya0ine «t «/., 1991). сф-лидер содержит 83 нуклеотвда (до первого аш-кодонэ) в состоит из двух частей, обозначенных вами как а-последовательность (41 нуклеотид без гуаниловых остатков) и ^-последовательность (42 нуклеотида перед первым a us). В хода работы решались следущие задачи:

1. Получение ДНК-конструкций, содерващих ген npti иод контролем различных производных ар-лидера.

2. Анализ структуры полученных ДНК-конструкццй катодам рестрикционного. анализа и/ши секвестрованием нуклеотцдаой последовательности.

3. Транскрипция ДНК-конструкций in vitro под контролем промотора бактериофага Т7 и характеристика РНК-транскриптов.

4. Сравнение афБектишости трансляции РНК-транскрпптов, различающихся по структуре Б - -лвдэрлоЯ госледоватшюстп, . в бэсклаточпой белок сннтеаярущай систекэ из лкаатов рэтикулоцстои кролика.

Научная новизна п практическая ценность работы. В настоящей работе впервые выявлены структурные элементы ар-лидера геномной РНК ХВК, отвэчсадио за его активность как впхансора на уровне трансляции. Показано, что яшаь а-послэдователъкость участвует в рэагпаацпя эффекта усиления трансляции репортерного гона npti, тогда как р-посяедовзтельность еэ является критически пзобходеам да трансляция, структураш асеыэшш сф-гшдара. В З'-копцовоЗ час::!

а-шследовательности выявлен элемент оф-лидара, определяющий его способность выполнять роль трансляционного энхансера - сайт усиления инициации трансляции (tps). tps впервые был обнаруаен в Б- -лидерных последовательностях мРНК вые .to экспрессируешх генов

Stccharonyces cerevisie (Thanaraj and Pandit, 1*?<?о). OH

представляет собой пэнтануклвотид з--ссасс-з- , который способен комплементарно взаимодействовать о консервативной шпилечной структурой в 3- -концевой частя iss рРНК в процессе формирования 4зз-преданициаторного комплекса. Результаты данной работы подтверждают идеи о роля комплементарного взаимодействия мезду tps в 5--лвдерной последовательности геномной РНК ЗШИ и 3--концевой" частью ios рРНК в инициации трансляции.

Апробация работы. Материалы исследования были представлены на Международной конференции febs "Геном вирусов растений: структура s экспрессия" (Рига, 1991), на МэкдувародЕпй конференции "Биосинтез белка" (Путано, 1991) ^ на и Российской сишюзиука "Новые метода биотехнологии растений" (Пувдноо, 1993). Основные натерязлн.работы нзлозаны в 2 публикациях и 3 сообщениях. Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введениэ, обзор литература, материалы и метода исследования, результаты, выводы, список цитируемой литературы. Общий объем дассортациа составляет'/^странсц, в том числе $4рисунков. Сшгсогс литературы содержит /публикаций.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕШЕ 1. Получение ДНК-ксяструидай. Все плазкида, испольаовшшые в работе, содервали промотор

РНК-полкморазы фага Т7, репортерный ген неомицивфосфотрансферазы 1 (npti) и сф-лидер РНК ХВК или его производные. Плазывда plx, содержащая сф-лвдер, была сконструирована на основе puc-i9 и PUC-4K, как источника гена NPTJ (Smii-nyagina fft ai., 1991 ).

Для создания плазмида р94в, содержащей только a-последовательность, был синтезирован олигонуклэотвд, комплементарный 3--концевой части a-последовательности в содержащий сайт рестрикции ncoi : 5 • -ggccatggtgggtttgsttgtgttg С помощью этого олигонуклеотида и универсального праймера с плазмида plx в нолимерегной цепной реакции был получен ДНК-Фрагмент, содержащий сайт рестрикции Hindi и, промотор РНК полшеразы фага Т7, полную а-последовательность я сайт рестрикции ncoi. После рестрикции hindi и и neo i ДНК-фрашеет клонировали л линеаризованную по сайтам hindixi и ncoi плазмиду plt, содержащую

ген npti (Sraiгпуаэina et ai., 1991 ). В результате бЫЛЭ ПОЛуЧбНа промежуточная плазмида р4л. Затем плазмида р(_т была линеаризована по сайту sail, концы затушены фрагментом Кленова и к ним приапгг синтетические линкеры доя ecori. Вырезанный га plt со ncoi q ecori ДНК-фрагмент клонировали в ncoi/ecori-лзкааризованяуо шгазыиду р4А. Скрининг клонов был проведен по рэстрикцдонному тесту шз удаленно из получившейся конструкции рестрЕкциоатго сайта etat. Полученная плазшда р94в содэргала roa npti шд контролгк а-последовательности (a-лидер, Рпс.1, Табл.1).

При клонпроваши кДНК 5--кондовой области гоноглгаа FHK ХВК е шюзггиду pucie был получен ряд клонов. Из них был отобран ДНК-клсе с 24-нуклеотидаой делэцией в а-последовательвостп. В оту плазшд" клонировали ДНК-йрагсзнт, внразашшИ из plx со r.uni и sali» который содержал ß-последовательпость с ген npti . В результата

(йога получена пяазмида plc, несущая ген npti под контролем сф-лидера с 24-нуклеотидной делецией в а-последовательности (Дар-лидер, Рис.1, Табл.1).

для создания плаамиды рвгз тонна .^шеаризованной по сайту munt плазмида plx были затуплены фрагментом Клвнова и залигировавд на себя. Скрининг клонов был проведен по рестрикционному тесту на удаление из получившейся конструкции рестрикциондаго сайта Muni. Полученная плазмида рвгз содержала ген npti под контролем ар-лядэра с 4-нуклеотидной вставкой в ß-последовательности (сф1пв-лвдвр, Рас.1, Табл.1).

Плазмида р843 была сконструирована в два этапа. Сначала была получена плазмида pkms в результате клонирования Ncoi/sa 11-фрагмента из plt в ptzis, разрезанную го сайтам ecori и sali, с помощью синтетического EcoRi/Ncoi-адаптора. Плазмида ркмэ содергала перед геном npti короткую лидэряую последовательность о сайтом рестрикция ecori. Для конструирования плазмида рв4з из плазмида plc был вырезан ДНК-фрагмент по сайтам sau и Muni (Muni располагается в 5* -концевой части ß-последовательности). Этот ДШС-фрагмент клонировали в EcoRt/saii-линеаризованную плазшду , pkms . Скрининг клонов был проведен по рестрикционному тесту на удаленна из получквгэйся конструкции рв4з рестрикцпонного сайта Muni. Полученная плаз года ро43 содеряала в качестве лидера перед геном npti а-последовзтельность о 24-нуклеотндной делецией, перше 8 пар оснований из р-госледовательности и 5-пуклеотидпнй спейсор (¿одр-лидер, Рнс.1, Табл.1).

s

<ф

1 41 83

ЫРТ!

39

ЫРТ1

(41) (83)

ырт1

1 3 6(30)16(41) 38(83)

В I

ч/

ИРТ1

Далр

1 5 6 (41) (47)

ЫРТГ

сф

inя

41 47 52(48) 87(83)

■"'-'-у*

1 5 6 Ю 16(41) 58(83)

¿а(тР8>~р ^ О^иидииСЗ

ч/

1 5 18(30)28(41) 70(031

ла(трз>3р а<сдс>

ЫРТ1

НРТ1

1 5 б(ЗО) 16(41) 58(83) ДШсасоР щ р^дсс^^^^:

№0.1. Схема ДНК-конструкций для изучения энхавсерных свойств аф-ялд':

Для создания плазмида Pai7 ДНК-фрагмент, вырезанный из pLx то сайтам muni и sau, клонировали в ptzis. В результате была получена плазмида psi7, несущая ген npti под контролем р-последовательностиф-лидер, Рис.1, Таб',1). Скрининг клонов был проведен по рестрикционному тесту на удаление из получившейся конструкции рестрикционного сайта мипi.

Для конструирования плазмида рхз были синтезировали два комплементарных олигонуклеотида, при отакге которых получался ДНК-фрагмент, содержащий сайт рестрикции крщ, промотор Ï7-PHK-полимеразы, да-лидер, обогащенный ссдсс-последовательностямя, и сайт рестрикции Muni. Этот ДНК-фрагмент клонировали в plc, линеаризованную то Muni и Kpni. В результате была получена плазмида рхз, содержащая ген npti , под контролем ар-лидера, обогащенного дополнительными ссдсс-последовательностями (Ла<тр5>3р-лидвр, Рис.1, Табл.1). .

Для создания плазмида ргзо-,, с "испорченным" tps были синтезированы два комплементартучх олигонуклеотида, при отжиге которых получался ДНК-фрагмент, _ содержащий "липкие концы" для сайта рестрикции крш, промотор Т7-РНИ-полимеразы, Аа-лидер с заменой тоследовательности сссасс, содержащей тр-сайт, на тттатт п сайт рестрикции Muni. Этот ДНК-фрагмент клонировали в мип1/крш-линеаризованную плазмиду рис. Скрининг клонов проводился го рестрикционному тесту па удаление рестрикционного сайта Kpni. Излученная плазуада ргзо содержала ген npti под контролем ¿ар-лидера без тр-сайта в результате замены сссасс на тттатт-(Да<трз>~р-лцдер, Рис.1, Табл.1).

Табл.1.

Цуклеотидные последовательности оф-лидера в его производных,

Название Название Нуклеотидаая последовательность Б" -лидера^ плазмида лидера

рЬХ

рЧ>48 р^

р823

рВ43 рВ17 пХБ

31

сф

дар АаДр

Р

Да<трБ>3р

доксасс) р

5' -ВААААСиАААССАиАСАССААСААСАСААССАААСССАССАС

а-последовательность

БСССААииБииАСАСАСССБСииББААААБСААВиС11ААСАААиВВ

^-последовательность

3'-еААААСиАААССАиАСАССААСААСАСААССАААСССАССАиее

а-последовательность

5'-6ААААСАААСССАССАС

До-последовательность

ВСССААШЛБииАСАСАСШЗСШББААААБСААВиСиААСАААиБВ

р-последовательность

5 • —6ААААС1)АААССА11АСАССААСААСАСААССАААСССАССАС

о- последовательность

ВСССААииААиШииАСАСАСССБСииББААААБСААбиСиААСАААиа

о230 Ла<ТРБ~)р

^^-последовательность

3•-БААААСАААСССАССАС ВСССААШ СиАССАиВб

Аа-последовательность др-последовательность

5 • -БСССААии(ЗииАСАСАССГБСииББААААБСААЗиСиААСАААиББ

р-последовательность

5•-ВААААССАССАССАССАААААСССАССАС

Аа<трб >3-последовзтвльность

БСССААииБииАСАСАСССБСиИБвААААБСААБиСиААСАААиББ

^-последовательность

5'-БААААСАААТТ7АТТАС

Дштрб> "-последовательность

6СССААииБииАСАСАСССБСииББААААБСААБи1СиААСАААиБ8

^-последовательность

5•-БААААСАААСССАССА

Дсксасо-последовательность

САСССААииБииАСАСАСССБСииББААААБСААБисиААСАААиВВ

р-последовательность !„а) Показаны такке нницнаторный кодон и нуклоотнд в пологэши.

Для конструирования шаздада p23i была синтезированы два комплементарных олигонуклеотида, при отжиге которых получался ДНК-фрагмент, содержащий "лишсие концы" для сайта рестрикции крш, промотор Т?-РНК-полимеразы, Да-лидер с дополнительным блоком комплементарности сдсс и сайт рестрикции миш. Этот ДНК- фрагмент клонировали в Muni/крш-линеаризованную плазмиду pi_c. Скрининг ДНК-клонов проводился по рёстривдионному тесту на удаленно рестряхционного сайта Kpni. Полученная плазмвда P23i содерзала ген №п под контролем ДаЗ-ладера с дополнительным блоком ксашлементарноота сасс (Аа<сйсop-ладер, Рио.1, Табл.1).

Все лвдерныа последовательности были проверены секвеннрованиеи Ш Свитеру (Sanger et al., 1977).

Плаамида plx , р9чв и рвгз боли линеаризованы по сайту рестрикции EcoRI, нлазмиды pLC, р843, pXS, р230 И р231 - ПО С8ЙТУ Patl, ШШЗМИДа рВ17 - ПО сайту Salí.

ii. .Результаты трансляции гена npti под контролем, сф-глидера и его производных. Изучалось влияние ар-лидера и его производных на еФХактивпость трансляции мРНК гена npti; Транскраптн, полученные с описанных выше конструкций, аспользовали в качества катрщ в бесклэточной бзлоксиптезирухщей системе из лизатов ретикулоцитов кролика. Эффективность трансляции мЕНК npti под контролем ар-лидера была принята за 100%. Усредненные результаты 5-19 независимых опытов представлены в виде гистограммы (Рис.2) с указанием среднеквадратичного отклонения.

a-конструкция (РисЛ, Табл.1). Делеция -всей ^-последовательности в а£-лидаре привела примерно к значител! ной

ч

стимуляции трансляционной эффективности транскриптов по сравнению с контролем (Рис.2, 3). Вероятно, ß-часть не является структурным компонентом aß-лидера критически необходимым для реализации эффекта усиления трансляции. Надо отметить, что в результате делеции ß-последовательности тр-сайт был приближен к aug ко дону.

ß-конструкция (Рис.1, Табл.1). Удаление а-части из aß-лидера привело к резкому сокращению (почти в 4 раза) эффективности трансляции npti-гена по сравнению с контролем (Рис.2, 3), что также подтверждает несущественность ß-послвдоватольности для усиления трансляции aß-лидером.

¿сф~конструкция (Рис.1, Табл.1). Деления 24 нуклеотидов в пределах a-последовательности, на затрагивающая тр-сайт, сопровоздалась усилением трансляции NPTi-гена почти в два раза по сравнению с транскрштои, содержащим природный aß-лндер (Рис.2, 3). Этот результат интересен еще в потому, что при конструировании Aaß-лидера была делетирована неструктурированная (smirnyagin« *t ai., ¡991) и, как могло предполагаться, доступная для рибосом часть aß-лидера.

¿одр-конструкция (Рис.1, Табл.1). Наиболее сильным трансляционным внхаясером оказался модифицированный aß-лидар, в котором наряду с делзцией 24 нуклеотидов а-последоватольности бала делетирована таксе большая часть (36 нуклеотидов) ß-последовательности. Однако тр-сайт пра этом го только был сохранен, но в пряблиген к aus кодону. Трансляция таких транскриптов усиливалась более, чей в два раза.

aß. ^-конструкция (Рис.1, Табл.1). Введение дополнительных четырех нуклеотидов в ß-последовательность вызвало резкое (более, чем в два раза) сокращение трансляционной эффективности

¡о

sso

200 -

100 -

100

cc0 &airrs>30 &af3 ia&p Aaicxcop a 0 Acktps >0

Рис.2. Относительный уровень трансляции in vitro РНК-транскшптов,_ содержащих npti—ген* йод. контролем ' ap-лидера РНК ХВК и его производных. Приведены средние значения 5-19 независимых опытов. - среднеквадратичное отклонение.

соответствугдих транскриптов (Рис.2). Поскольку предполагается, что ^-последовательность практически целиком вовлечена в образование вторичной структуры (Рис.4, Блигпуад^а rt а1., 1991), воамогно, введение дополнительных некодаламентарных нуклеотидов в основание ппаяькя дестабилизирует или кодифицирует ев таким образом, что проявляется в »ии*нини трансляционной эффективности транскриптов.

Да<трз>~^-конструкция (Рис.1, Табл.1). В этой конструкции помимо 24-нуклеотпдной делэции в а-последовательности тр-сайт был замещен на последовательность ицилии, что правело примерно к такому 2Э сокраидашш аффактивности трансляции, как и в случав удаления всей а-последовательности (Рис.2, 3). Этот результат подтверждает значимость тр-сайта для эффективной трансляции мРЯК.

it

Дсктрб» 3р-конструкция (Рис.1, Табл.1). Введение двух дополнительных полных тр-сайтов (ели - трех перекрывающихся тр-сайтов) в Да-последовательность вызвало небольшое уменьшение эффективности трансляции по сравнению с. Дар-лидером (Рис.2, 3).

¿a(cacop-конструкция (Рис.1, Табл.1). Замена первого в в ^-последовательности на а привела к появлению в Дсф-лидаре дополнительной последовательности сасс, комплементарной 3--концевой части íes рРНК. В среднем это вызвало очень незначительна изменение в трансляционной эффективности та сравнению с Дсф-лидером (Рес.2, 3).

ш. Обсуждение. Ранее наией группой было показано, что сф-лидер геномной РНК ХБК усиливает трансляцию чужеродных генов, т.е. является трансляционным анхансером (SmirnyaQina et al., 1991f Zolenlna et ai., i??2). Предполагалось, что внхансерные свойства а0-лидера могут быть обусловлены, по крайней мере, двумя особенностями: способностью сф-лидера поддерживать Б--концевую часть РНК (30 нуклеотидов) в неструктурированном состоянии в/иди наличием в ар-лидере нуклеотидаых последовательностей, комплементарных 3--концевой части íes рРНК. Среда последних особую роль пграет tpsi представлязщай собой пентануклеотид з'-ссасс-з" и способный комплементарно взаимодействовать о 3- -концевой областью íes рРНК.

Для выявления элементов сф-лидера, ответственных ээ его свойства как трансляционного енхансера , сравнивали еффектшзость трансляции химерных трвнскриптов нрп-гена шд контролем различных производных сф-лидера (Рис.2).

На основании данных, компьютерного шалква было выскваано

А

Б

1 s э Л S В У

■ Рис.з. Электрофоретический анализ продуктов трансляции хинерных РНК-транскриптов, содержащих npti-ген под контролем ар-лидера РНК ХВК и его производных: А. ар.пв(1); Дар(2); ар(3); андогенная{4)

Б. эндогенная (1): p(2j: ар(3); Дар(4); а( 5); Ашсасс>Р (6); ¿attps) р (7)

предпологение, что 5--концевые 30 нуклеотидов а-последовательности не структур.гровагш и доступны для взаимодействия с -ios рибосомами при инициации трансляции et al. , 1991 ). ДЛЯ ПрОВврКИ

роли отой неструктурированной части в усилении • трансляции был сконструирован Аар-лпдэр (Рис.1, Табл.1) в результате делегирования пз а-последовательности 24-х нуклеотидов с нэстого по тридцатый. Т.обр., ap-лидвр был почти целиком лишен неструктурированного района. Если бы энхансерные свойства ap-ладера была обусловлены отсутствием нлн слабой вырагашостью вторичной стррстура в его 5--концевой части, то такая деления дотаяв была бы вызвать сокращение трансляционной активности трзнскриптов. Однако ничего подобного не нвбладалось. Наоборот, ."ар-лидер значительно усаливал трансляции npt i -гена (Рис.2, 3).

прэдлоетгь два объяснения этому явлешх. Рсзмсяно,

IZ

5--концевые 30 нухлеотидов участвуют в дальних взаимодействиях, а 24-нуклеотидяая делеция нарушает их, высвобождая ¿ар-лидер в делая его более доступным для 43Б-предгнициаторного комплекса. Другое возможное объяснение основано на том, что в результате этой делеции из а-последовательности удаляется район, содержащий блоки ааасс, сасс, аасс (Табл.1), которые комплементарны 3'-концевому району íes рРНК, а тр-сайт при атом сохраняется. Можно предположить, что перечисленные нуклеотадшв последовательности могут конкурировать с тр-сайтом за 3--концевой район íss рРНК, тем самым сникая скорость инициации трансляции. Удаление этих последовательностей приводит к ускорению образовали инициирующего комплекса и, как следствие, к усилению еффективнос-гь трансляции репортерного гена.

В некоторой степени эта гипотеза Кййк^хчмцяД исдт>рмается следующими фактами. При введении дополнительной последовательности сасс, комплементарной 3'-концевой части íes рРНК, в Асф-лидвр получившийся Да<сАсс> p-лидер усиливает трансляцию №тг-гена немного слабее, чем исходный Аор-лидер (Рис.2, 3). А введение двух дополнительных rp-сайтов ощутимо снижает энхансерную способность Да!тР5>3р-.лидера (Рис.2, 3). Как упоминалось выше, это может быть связано с конкуренцией меаду тр-сайтами за 3- -концевую область íes рРНК.

Роль тр-сайта в обеспечении энхансершх свойств ар-лидера подтверждается тем фактом, что все Tps-оодвркащие производные ар-лидера (а, Дар, ДаДр, Да<сАсор, ia<TPS>3p) стимулируют трансляцию NPTi-гена (Рис.2). В то se время производные ар-лидера, не содержащие тр-сайта (р, Aaups>"P) утрачивают свойства трансляционного энхансера (Fue. 2).

Для окончательной проверки роли тр-сайта в усилении трансляции ар-лидером тр-сайт Сил удален из а-госледрвательности путем замены сссасс на тттатт, в результате чего был получен Да<трз>~р~лвдер (Рис.1, ТаОл.1). Эффективность трансляции NPTi-гена под контролем Да<трз>~р-лидара резко снизилась. Сокращение трансляционной еффективности, вызываемое ía< tps)"p-лцдаром, было сравнимо лишь с эффективность® трансляции npti-гена год контролем p-лидера, который полностью лишен а-шследовательности (Рис.2, 3). Т.обр., отсутствие тр-сайта приводит к инактивации ар-лидера как трансляционного енхансера.

Единственным исключением среди трз-содертащих производных а0-лидера, проявляющих енхансерные свойства, является ар1па-двдер, который алкает эффективность трансляции npti-гена, несмотря на то, что в евм присутствует тр-сайт (Рис.2). ар1п5-лидер отличается от ар-лздэра лазь наличием четырех некомплементарных нуклеотидов, сведенных в шшлачную структуру в ^-последовательности (Рис.1, Табл.1). Предполагается, что такая модификация сф-лидера вызывает Еовфоргзцяошое изменение шпилечной структуры, приводящее к пространственно?,?у маскированию -тр-сайта. (Рис.4А);~ ara к ero участив в фор:£фов2НШ1 новой вторичной структуры .(Рис.4Б). Могно полагать, что это препятствует комплементарному взаимодействию тр-сайта с 3--кояцевсЗ частью íes рРНН п сншшэт скорость шщнацпя трзпйШЕШ. Последнее согласуется с утратой ср1па-лздзрал ектнееостя трансляционного энхансера (Рис.2).

Роль р-последовательности в трансляция, Еэроятпо, заключается а пр^йшззши тр-сайта к шшцзэ торному кодоцу в рззудьтатэ сСрззозгшзя швшзчеой структура (Рао.4). Сема го саба р-послодователыгасть еэ усиливает трансляцав репортерпого- гена

ар-лидер

6 а в а и-а ц-а с-в 6-с с а с а с а

с-е

а-и

с с

а-и ц-а ц-а в-с ц-а и-а

5' —ссассасбсссаа аш

Сф^-ЛВДвР

в а 6 а и-А ц-а с-в

е-с

с а с а

с

а

с-в а-и с с а-и ц-а аас/иби—а

11111 С ииаасс а с а

5'-ссассаса аио

Рис.4А. Возможное конфорыационное изменение структура р-фрагыента в сф1лв-лидере, приводящее к

маскирование тр-сайта (подчеркнуты трв г див-кодон).

ф-лидер на Рис.2), а ее отсутствие никак на влияет на своЗотва ар-лидера как трансляционного энхансера (а- и Млр-лидера на Рио. 2). Наконец, нарушение структуре щшлыш в результате введения четырех нуклеотидов отрицательно влияет на 'трансляцию «рп-гена (сф.пЕ-лидар на Рис.2). Т.обр., ^-последовательность не является критически необходимым структурам компонентом ар-лидера и ыохзх быть удалена сиз какого-либо влияния на трансляционную эффективность.

Нак упоминалось вше, самым сильным трансляционным знхшсэром был Аадр-лидер (Рис.2). Иными словами, удаление, из природного ар-лидера большей части а-последователыюсти и почта всей р-шслодоватвлыюсти привело к самому большому усилению трансляции мрп-геко (Рас.2). В атом лидере тр-сайт бал отделен от

ар-лидер ар.пв-лидер

за б а

б а е а

и-а и-а

и-а и-а

с-з с-а

б-с 0-с

с а с а

с а с а

с с

а а

с-8 __с-б

а-и а-и

с с с с

А-и А-и

и-А и-А

и-А Мииви-Л

6-с || И |

и-а шаасс с

и-а с а

хз'-ссасслсосссаа ашв в а

с а| а-и

с-е|

с—б

а сстс6аб0 с

Рпа.4В. Возкоэгое ковформацпоннов изменение р-фрагмэнта в ар.пз-лздере, приводящее к

трб в модифицированную шпилечную (подчеркнуты трз и аш-кодон).

яшщкатарного гсодона 15 нукяэотадака (Тейл.1). Ратае сообщалось, что проязЕодцне ар-лидера, отделенный от ауз кодона спайсерннма тслэдоватэлкгосткгга в 8-38 нуклэотвдов, сохраняли свойство усиливать ТреНСЛПЦЯ) (ге1еп1па а я1., 1992). Т.обр., тр-сайт ?,'о.гэт пагодпться на некотором рзсстоянш от диз в отличпэ ои прокарготпческоЯ последовательности Шабн-Далгарно, которая должна Присутствовать НЗГОСРОДСТГОПЕО трэд ШШСШТОрШС! КОДОВОМ (Когак, 1991).

Во всех конструкциях, за исшшчвЕнеи а а дадр, сохранено

структуры включению

структуру

природное окружение инициагорного кодоаа - свмивв (Табл. 1), которое не является оптимальным (кохак, 1987а). В случаях а- в дадр-лидеров инициаторный кодов имеет благоприятное окружение и является сильным - АсслиеБ (Табл. 1). Однако, как показывает результаты трансляции, контекст лис кодона на оказывает критического влияния на эффективность трансляции транскриптов. Например, транскрипты, содержащие Дар- и Да<сасс>р-лидеры с неблагоприятным окружением див, транслируются даже лучше, чем а-транскрипт : сильным аио (Рис.2).

С другой стороны, эффективность трансляции Далр-содержащего транскрипта была вше трансляционной эффективности Дар-транскрипта (Рис.2). Возможно, это обусловлено, хотя бы частично, наличием сильного лие в Лодр-транскрипте.

Однако, в любом случав вклад окружения шщиаторного кодона в усиление трансляции не сравним с влиянием тр-сайта. Это еще раз подтверждается резким различием (в шесть раз) эфХективностей трансляции Дар- и Ш<трз>"р-транскриптов (Рис.2), которые отличаются друг от друга лииь присутствием или отсутствием тр-сайта (Табл.1).

В заключение моззно сказать, что именно присутствий трз в составе ар-лидера обеспечивает его активность как трансляционного анхансера. Комплементарное взаимодействие кеаду трз и рРНК, В031ХШЮ, облегчает поиск сайтов инициации трансляции для 4оз рибосом.

вывода

1. Анализ роли отдельных структурпш элементов а^-лидара, ответственных за его активность как трансляционного анхансера.

показал, что значительная часть последовательности оф-лидера, включая весь р-фрагмент, не вносит позитивного вклада в эффективность трансляции.

2. Роль ^-последовательности, по-ввдимому, заключается в приближении aug-кодона к tps за счет формирования вторичной структуры.

3. Анализ а-последовательности выявил в ней так называний "сайт усиления инициации трансляции" (tps ), включающий ссАСс-последовательность, комплементарную 3--проксимальной консервативной области tes рРНЕС.

4. Экспериментально доказано обязательное присутствие tps в 5- -нетранслируемой лвдерной последовательности РНК ХЕК , для реализации &й)экта усиления трансляции репортерногЬ гена. Удаление tfs из ар-лидера приводит к резкому сншзвнио эффективности трансляции !.!РНК и утрате ap-лпдером активности трансляционного энхансера.

б. Избыток ссАсс-пооледовательностей в ар-лидере приводит в ослаблзнтп) гагацяащш трансляции, возмолво, из-за конкуренции этих посхэдокатолшастой за 3--концевую область ibs рРНК рлбосо:.!. 3. Получзпшэ рззультаты экспериментально подтвзрздшт участка ххкзкокзЕторпого взаимодействия поеду ар-лидером ИШ ХЕК п 3--кспцоЕоЭ облостья 183 рРНК в пгетттгепцпя трзпалягщп.

CmiCCIt РДЕОТ, (ШЗВШШВШ ПО ШТЕР1ШШ ДКССЕРТДЦШ!

1. Rodionov -j,N,P. , Horoiov.S.Yu., Mlroshnichenkc.N.А.,

Solovyov, A.G., Fedorkin,Q.N. , Lukaahova,L. I., Snirnyagina,E. V. , Karpova,0. V., Tomashcvakaya.Q.t.., and Atabskov, j.q., (1991) Translation onchcncing proportiœe of thu З'-loader eequcnca of

potato virus X RNA. FEBS advanced course 91-04. The plant virus genomes structure arid expression. Programme abstracts.- Riga, 1991, IB.

2. Horozov.S. Yu., Miroshnichenkq.N.A., Karpova,0. V., Rodionova.N.F., Solovyev,A.G., Fedorkin,O.N., Zeloriin*, D. A. t Lukasheva,L. I., Tomaehevekaya,O.L. , and Atabekov,J. B., (1991» Expression of potato virus X genome. International Conference "Protein Biosynthesie" Abstracts, Pu»chino, 1991.

3. Томашавскгч О.Л., Соловьев А.Г., Карпова O.B., Федоркин О.Н.# Морозов С.Ю., Родионова Н.П., Атабеков И.Г., (1992) Роль структурных элементов Б- -нетранслируемой последовательности PIE Х-вируса картофеля (ар-лидер) в определении его активности как трансляционного внхавсера. ДАН, 1992, 324, Ж, 697-70Q.

4. Томашавская О.Л., Карпова О.В., Родионова Н.П., <1993), Роль комплементарного взаимодействия б*-нетранслируемоЗ ладаряой шследовательности геномной РНК Х-вируса картофеля и 3V -концевой области las рРНК в инициации трансляции* Тезисы ii Российского симпозиумэ "Новый методы биотехнологии' растений", Оущино, 1933,, с.92.

5. Tama«hevskaya,0.l..., Solovyev,A.G., Karpava,O.V., FedOrkin,0. N. , Rodionova,N.P., Moroiov,Б.Yu., and Atabekov, 0M3., <l493>, Effoete of sequence elements of potato Virus X RNA 3'-nontranslafced Op- seder on its tfaiieiation erthbfteir>0 activity. Journal of General Virology 74, IS.

Подписано l печать жт Усл. печ. л. f, Л Ь

Формат Зйиз 3

Тираж Hi"

Типография Россслъхозакадемян