Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляторная роль 5'- и 3'-некодирующих последовательностей в трансляции РНК вирусов растений

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Регуляторная роль 5'- и 3'-некодирующих последовательностей в трансляции РНК вирусов растений"

0

? \ «к? й9Ц

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫМ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК. 578.2

МАВРОДИЕВА ВЕСЕЛА АСЕНОВА

РЕГУЛЯТОРНАЯ РОЛЬ 5'- И 3'- НЕКОДИРУЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ТРАНСЛЯЦИИ РНК ВИРУСОВ РАСТЕНИИ ( 03.00.ОБ. - вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре вирусологии Биологического факультета Московского Государственного Университета им.М.В.Ломоносова

Научные руководители: академик РАН, профессор И.Г.Атабеков

доктор биологических наук Н.П.Родионова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С.К.Завриев

кандидат биологических наук А.С.Воронина

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт фитопатологии, РАСХН

Защита состоится " Э « СЩ^^/Ц) 1994 Г- в час.

на заседании специализированного совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 1198ЭЭ, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета, МГУ.

Автореферат разослан: " ^ " 1994 г.

Ученый секретарь

Специализированного Ученого советаг кандидат химических наук:

/

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Трансляция является завершающей стадией реализации генетической информации. Среди основных этапов ансляции ( инициация, элонгация и терминвция) инициация отличается окностью составляющих ее элементарных актов и механизмов регуляции, о определяет ее лимитирующее значение в биосинтезе белка.

Большая группа рибовирусов растений содержат РНК положительной лярности в качестве носителя генетической информации . Изучение обенности инициации трансляции этих вирусов дает обильную формацию как о молекулярных механизмах контроля трансляции кариотических мРНК, так и о механизмах взаимодействия вирусов с еткой.

В наше время проблема разработки эффективных средств борьбы с русными болезнями растений, наносящими огромный ущерб сельскому зяйству, приобрела большую актуальность.Поэтому исследование ханизмов экспрессии генетической информации вирусов растений имеют только теоретическое, но и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Многие экспериментальные данные азывают на роль 5'- и 3'-нетранслируемых областей мРНК в регуляции ансляции.'

5'-нетранслируемые лидерные последовательности (НТП) ряда русных РНК являются цис-действугацими элементами и способны иливать трансляцию чужеродных эукариотических или прокариотических НК как in vitro, так и in и{но.Механизм этого усиления до сих пор ясен. Субгеяомные РНК (сгРНК) вирусов растений ( матрицы для руктурного белка) активно транслируются in viva и in uitT-o. Как авило^ эти сгРНК имеют достаточно короткие 5'-концевые НТП и эдставляют собой удобную модель с точки зрения изучения их роли

как трансляционных энхансеров. В литературе имеются противоречивые данные о возможности участия 5'- НТО сгРНК вирусов растений i усилении трансляции чужеродных генов. Так Б'-НТП сгРНК вирус! мозаики люцерны (ВМЛ) является активным трансляционным енхансером тогда как 5'-лидерная последовательность РНК4 вируса мозаики костр! (ВМК) не способна выполнять такую роль ( Jobling and Gehrke,1987) Целью настоящей работы явилось изучение возможной роли Б'-НТП сгРН! гена белка оболочки тобамовируса зеленой крапчатой мозаики огурца' ( ВЗКМО ) как трансляционного энхансера. Мы поставили перед собо: следующие задачи:

- создать ДНК-конструкции, содержащие репортерный ген неомицикфосфотрансферазы X (NFTI) под контролем 5'- НТП сгРНК ВЗКМО и ее производных;

- получить соответствующие мРНК с помощью транскрипции in vitr и исследовать эффективность их трансляции в бесклеточна белонсинтезирующей системе из лизатов ретикулоцитов кролика (JEF для выяснения возможных трансляционных энхансерных свойств втог лидера и выявления структурных элементов, определяющих эти свойстве

Ряд РНК вирусов растений, в частности, РНК ВМК и вирус табачной мозаики (ВТМ) не содержат поли(А) последовательности i 3'-конце молекулы: 3'-конец РНК этих вирусов организован в слокнз вторичную и третичную структуру, похожую на структуру транспорты РНК - (тРНК-подобные структуры). Роль З'-НИП в регуляции трансляцр вирусных РНК до сих пор не изучена, несмотря на наличие данных важности их роли в трансляции in vivo ( Gallie et al.,1990,1991,) * Примечание: В работе, для удобства изложения используется и обо: начение ОВЗ ( огуречный вирус 3 ), применявшийся раньше в качест) синонима ВЗКМО.

vitra (Timrner et al.,1993..Ryabova et al.,1993). Чтобы изучить ияние тРНК-подобных структур РНК ВТМ и ВМК на трансляцию мерных мРНК in иttro, мы решали слвдущие задачи:

- получить функционально активные фрагменты, содержащие НК-подобнне структуры РНК ВМК и ВТМ, методом адресованного зрезания РНК РНКазой H E.ooli;

получить мРНК транскрипцией in vitro ДНК-конструкций, сущих разные репортврные гены под контролем различных лидерных следовательностей;

- с помощью РНК лигазы фага Т4 присоединить полученные Ж-подобные структуры к транскриптам и изучить роль зтих руктур в трансляции химерных мРНК в ЛР.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе зрвке показано, что 5'-НТП сгРНК ВЗКМО длиной 13нт стимулирует ансляцию чужеродного гена NPTI в ЛР , т.е. является трансляционным сансером. Особенности его первичной структуры, а также возможное яхлементарное взаимодействие мевду олигопиримидиновым кластером в -НТП с последовательностью Еа 3'-конце las рРНК не определяют его ^ансерные свойства. Слабая структурированность лидера играет сную роль в регуляции эффективности трансляции.

Сочетанием нетрадиционного метода адресованного разрезания РНК LsBoft H в присутствии комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов последующим сшиванием РНК лигазой фага Т4, были получены :зпированные химерные мРНК, содержащие ген HPTI под контролем ;ных Б'-лидеров и тРНК- подобные структуры РНК ВТМ или ВМК на конце. При трансляции в ЛР эф|®ктивность трансляции этих мРНК личивалась в 2-3 раза по сравнению с трансляцией некэпированной К, не содержащей тРНК-подобной структуры. Стимуляция трансляции в

результате влияния тРНК-подобной структуры сравнима с эффектом, вызываемым полиадвнилированием этих мРНК. Весьма существено, чтс З'-НТП РНК ВТМ не стимулирует трансляции кэп-содержащих мРНК. Наш исследования показывают, что З'-НТП РНК ВТМ и ВМК увеличивают эффективность трансляции некэпированных мРНК, а не толькс обеспечивают ее стабильность.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседанш кафедры вирусологии Биологического факультета. Материалы исследования были представлены на Всесоюзной конференцш "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификацш растениеводства и кормопроизводства"(Алма-Ата, 19Э0).

Структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования результаты, обсуждение, список литературы. Общий обьем диссертацш

I. Изучение роли 5'-НТО сгРНК ВЗКМО в регуляции трансляции иаго

1. Получение ДНК-конструкций.

Моноцистронная сгРНК ВЗКМО кодирует белок оболочки вируса Б1-нетранслируемая область (лидер) этой мРНК длиной 13 нуклеотидо: (нт) содержит кэп-структуру. (Табл.1)

Для изучения предполагаемых энхансерных свойств лидерно: последовательности сгРНК ВЗКМО, были сконструированы химерные мРНК содержащие репортерный ген под контролем изучаемого лидера

составляет <7.

литературы содержит публикаций.

рисунков. Список цитируемой

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Обозначение конструкции

Нуклеотидаая последовательность

овз (дикий тип) 5'guuucutjucgacgaugg

au2 5'gggagauucgacgaugg

aui 5' gggagautjgacgaggatjccttctjagag

ucgagg cggcgauuaaatjuc caacaugg 70/5 5'gggagaaugg

Табл.1. Нуклеотидаая б'-лидерная последовательность сгРНК ВЗКМО и ее производные, использованные в работе.

ективность трансляции которых оценивали в системе in vitro.

С этой целью нами была сконструирована плазмида рсашт, несущая ортерный ген ШТ1 под контролем промотора фага Т? и содержащая ер сгРНК ОВЗ. Плазмида оыла получена в 2 этапа. На первом пе отжигом химически синтезированных комплементарных олиго-оксирибонуклеотидов был получен двухцепочечный фрагмент, поящий из последовательно расположенных Т7 промотора, лидера "НК ОВЗ и инициаторного AUG кодона, который встраивали в илинкер pucie по EooRl и BamHl сайтам. В результате была [учена промежуточная плазмида pCGM. Далее из плазмиды pKMS )езали фрагмент Bam hl/Pstl, длиной 800 нт, содержащий ген NPTI и »нировали в pCGM, предварительно линеаризированной этими ¡триктазами. Таким образом была получена плазмида pCGUKm (Рис.1). )ининг клонов был проведен а-комплементацией, рестриктным анализом ¡еквенированием по Сэнгеру (Sanger et al., 1977).

Рис.1. Схема плазмам рсаюоп. Указаны сайты рестрикции, по которым проводили рестриктный анализ. Дана нуклеотидная последовательность Т7 промотора и Б'-НТП . Подчеркнуты сверху Т7 промотор к ВапН1 сайт, снизу EcoPJ сайт и 5'-НТП .

Для выявления цис-действущего элемента, опре делящего энхансерные свойства 5'- лидера сгРНК ОВЗ, нами были созданы конструкции, содержащие ИРТ1 ген в качестве репортерного под контролем производных этого лидера. Для конструирования эт::х плазмид мы пользовались методом амплификации фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Ба1к1 et а1. 1988). Праймерами служили химически синтезированные олигодезоксирибонуклеотида содержащие промотор фага Т7, производные лидера сгРНК ОВЗ и АТО кодон,а также прямой универсальный праймер. В качестве матрицы использовали исходную плазмиду рООШт.

В результате ПЦР получали двухцепочечные фрагменты длиной около 900 нт, содержащие последовательно связанные Т7 промотор, лидер к

ш ПРИ. Фрагменты, обработанные рестриктазами EooRI и Pstl, тонировали в pUCiа. Нужные клоны отбирали рестриктным анализом и эквенированием 5'-концевых последовательностей . Все конструкции одержали инициирущий кодон Ато в оптимальном контексте (-ЗА) и I-4G).

Для транскрипции ы vitro плазмиду pCGMKm и все ее производные таеаризовали рестриктазой Pstl. В результате гидролиза Pstl элучаются 3'-выступапцие концы, что в системе т vitro приводит к Зразованию деухцепочечных молекул мРНК, тем самым снижая Эффективность транскрипции. Поэтому 3'- выступающие концы затупляли рагментом Кленова. Нужно отметить очень низкую эффективность ранскрипции pCGMKm/Pstl, так как району (+1) - (+5) (GGAGA) ативной последовательности промотора, узнаваемой T7-FHK полимера-ой, в pCGMKm соответствует последовательность ( тттстт ). Шгазмидо, есущие производные 5'-НТП ОВЗ, транскрибировались с высокой эффектностью, так как содержали нативный Т7 промотор. Полученные ранскрипты анализировали электрофорезом в 1,5% агарозном геле.

2.Трансляция in vitro мРНК гена NPTI под контролем 5'-лидера

сгРНК ОВЗ и его производных.

Конструкция 0B3KPTI. Полученные in vitro транскрипты :спользовали в качестве матриц в системе трансляции ЛР. В качестве шокительного и отрицательного контролей были использованы мРНК, юдержащиэ ген NPTI, под контролем aß-лидера геномной РНК X вируса :артофеля (аргон) и его производного - ß-лидера ( aß-лидер с [елетированной a-последовательностью), любезно предоставленных 'омашевской О.Л. aß-лидер обладает свойством очень сильного

энхэнсера трансляции в системе in vitro (Smirayagina et al. 1991; Томашевская и др. 1992), в то время как p-лидер практически не имеет такую способность (TomashevEkaya et al.,1993).

Эффективность трансляции транскрипта сфЦРИ была принята за 100%. Усредненные результаты из трех независимых опытов представлены в еидв гистограммы ( рис.2). Продукты трансляции анализировали электрофорезом в 8-20% ПААГ (laemmli,i970) ( рис.3).

Продукт трансляции ОВЗ NPTI имеет молекулярный вес 28,5 кДа, подобно продукту трансляции арютч, что свидетельствует об инициации трансляции с первого AUG триплета гена. Как видно из рис.2, эффективность трансляции 0B3NPTI ниже чем apHPTI и существенно выше эффективности трансляции (3NPTI.

Результаты свидетельствуют, что лидерная последовательность сгРНК ОВЗ стимулирует трансляцию чужеродного гена NPTI, т.е. может рассматриваться как достаточно активный трансляционный энхансер.

Конструкция AU2. Нативный лидер сгРНК ОВЗ содержит олиго(и) последовательность (Табл.1). Это позволило высказать предположение, о возможности ее взаимодействия с комплементарным районом на 3'-конце 18S рРНК при инициации трансляции ( NioholBon et al.,1991). Подобный олигопиримидановый кластер содержат и 5'-НТП некоторых других РЖ вирусов растений, проявляющие энхансерные свойства (РНК4 ВШЕ, РНКЗ ВМК ). С целью выяснения роли олиго(и) кластера в механизме усиления трансляции, мы заменили первые 5 нуклеотидов этого кластера (шптси) последовательностью (GGAGA) (Табл.1). Вопреки нашим ожиданиям эффективность трансляции мРНК лиг не только не снизилась, а даже увеличилась по сравнению с эффективностью трансляции ОВЗ ЮТ1 (Рис.2). Продукт мРНК AU2 имеет молекулярный вес 28,5 кДа (Рис.3). Результаты трансляции говорят о том, что

12 3 4 5В

Рис.2. Гистограмма включения [35s] в индивидуальные продукты трансляции KFTI гена под контролем: 1. ар-лидера; 2. Б'-НТП сгРНК ОВЗ и ее производные: з. ATJ1, 4. ДУ2, 5. 70\5; 6. р-лидера.

предполагаемое взаимодействие олигопиримидиноЕого кластера лидера сгРНК ОВЗ и З'-концеЕой последовательностью 18S рРНК не определяет энхансерных свойств Б'-ЕГО сгРНК ОВЗ.

Конструкция AU1. Поскольку Б'-НТП сгРНК ОВЗ имеет длину всего лишь 13 нт, мы предприняли попытку исследовать влияние изменения длины лидера на эффективность трансляции npti гена. Конструкция AU1 содержит 2 делеции - в Б'-НТП и в первом aug кодоне (Табл.1). Продукт трансляции мРНК Дш имел молекулярный вес 27 кДа, что соответствует по размеру продукту инициации на втором aug гена кри, отстоящем на 39 нт от первого AUG кодона (Рис.3). Эффективность

1 2 3 4 5 6

Рис.3. Электрофореграмма продуктов трансляции мРНК NPII под контролем следующих лидерных последовательностей: 1. эндогенная; 2. aß; 3. ОВЗ; 4. AU1; 5. AU2; 6. 70\5 .( денатурирующий 8-20% ПААГ)

трансляции ДТП мРНК сравнима с AU2 мРНК (Рис.2). Возможно, удлинение лидерной области сопровождается усилением энхансерного потенциала по сравнению с 0ВЗЮТ1.

Конструкция 70/5. Далее мы попытались оценить влияние резкого сокращения длины 5'-лидера сгРНК ОВЗ на его способность поддерживать трансляцию NPTI гена. При этом предпологалось, что сокращение Б'-НТП приведет к утрате его свойства как трансляционного энхансера. Для этого мы создали конструкцию, содержавшую перед aug кодоном только гексануклеотид (gggaga) (Табл.1). Неожиданно, даже такая длина лидера была достаточна для эффективной трансляции матрицы (Рис.2), а молекулярный вес продукта мРНК 70/5, соответствовал инициации трансляции с первого aug кодона (Рис.3).

Полученные нами результаты свидетельствуют о возможной роли 5'-НГП сгРНК ОВЗ в усилении трансляции NPTI гена in vitro. Олигопиримидиновый тракт не является критическим элементом. Предсказание возможной вторичной структуры программой Genebee показало наличие слабой шпилечной структуры (AG°=-I0,8kcal\mol), включающей лидер и первые 20нт кодирующей последовательности, присутствующих в химерном транскрипте 0B3NPTI. Наличие такой структуры может снижать энхансерные свойства лидера сгРНК ВЗКМО по сравнению с ар-лидера.

б'-НГП конструкций AU1, AU2 и 70\5 не структурированы, как и первые ЮОнт кодирующей последовательности KPTI, о чем свидетельствуют данные предсказания вторичной структуры. Можно думать, что отсутствие вторичной структуры в этих конструкциях способствует узнаванию Б'-конца 40S субъединицей рибосомы поможет быть, играет роль в усилении трансляции AU1 и AU2 по сравнению с 0B3HFTI.

Следует отметить, что crFHK некоторых вирусов растений ( эффективные матрицы для бежа оболочки ) содержат веськь короткие лидбрные последовательности. Тем не менее, эти б'-НГП оказываются достаточными для эффективного узнавания рибосомами соответствующего участка мРНК при инициации трансляции . В то же время делационный анализ энхансеров трансляции 0-лидера РНК ВТМ и ар-лидера РНК ХВК, являющихся лидерами геномных FHK, показал, что большая часть Б'-лидера не вносит вклад в механизм усиления трансляции, а скорее всего играет важную роль в репликации РНК (Takamateu et al.,1991;Томашевская и др.,1992; TomaBhevBkaya et al.,1993 ).

II. Изучение возможной роли 3'-концевых тРНК-подобных РНК ВМК и ВТМ в усилении трансляции in vitro.

Было изучено влияние 3'-концевых тРНК-подобных структур РНК В и ВТМ (t like), на трансляцию NPTI и GUS ( ß-глюкурунидаза E.ooli генов в системе ы vitro..

Фрагменты, содержащие тРНК-подобные структуры, получали метод адресованного разрезания РНК РНКазой Н E.ooli в присутствии комгы ментарных олигодезоксирибонуклеотидов, представленых на Табл.2:

РНК Нуклеотидная последова- Комплементарная Длине

тельность олигодезокси- область в РНК фрагмег

рибонуклеотидов 3'- 5' ( нт

ВТМ 5" GTTATTTATTATG 3' 6217-6205 178

РНКЗ ВМК 5' GGGTGAAGAAG 3' 1806-1796 301

РНКЗ ВМК 5' CAACOACGACT 3' 1956-1946 161

Продукты разрезания анализировали электрофорезом в 2% агаро: Полосы, содержащие фрагменты нужной длины (Табл.2), вырезали у. I выделяли фенольной экстракцией.

Для получения химерных мРНК использовали транскрипты КРТ1 ] контролем различных производных ар-лидера РНК ХВК, а также ] контролем лидерных последовательностей РНК4 вируса огуречной моза; ( ВОМ ) и лиг ( производного лидера сгРНК ОВЗ ), не содержа: кэп-структуры. К этим транскриптам с помощью РНК лигазы фага пришивали тРНК-подобные структуры РНК ВМК, ВТМ или синтетичес поли(А) последовательность длиной 80-100 нт. Лигирование проводил

стандартных условиях и в присутствии 105S ПЭГ. Продукты лигирования анализировали электрофорезом в 2% агарозе, вырезали соответствующие полосы и РНК выделяли фенольной экстракцией. Аналогично выделяли и транскрипты, нб содержащие тРНК-подобных структур или поли (А), которые использовали в качестве контролей.

Эффективность трансляции,полученных мРНК7 оценивали по включению [35s]Met в индивидуальные продукты трансляции в ЛР. Результаты анализа, в виде гистограммы представлены на рисЛ. Эффективность трансляции исходных транскрютоз Aa(3NPTl и BOM NPTI принята за 100%. Результаты трансляции транскрштов, содержащих ар лидер, AIJ2 лидер и др., не приводятся ( Дар- лидер содержит дэлецию 24нт в а-последова-тельности и является более сильным лидером, чем ар).

Как видно из Рис.4, присоединение к транскриптам тРНК-подобных структуры РНК ВМК длиной 301нт и 161нт сопровождается сходным, приблизительно двухкратным усилением трансляции химерных мРНК. мРНК, содержащие тРНК-подобную структуру ВТМ, транслируются в 3-3,5 раза эффективнее, по сравнению с исходными. Следует отметить, что эффект поли(А) тракта на трансляцию химерных мРНК сходен с эффектом тРНК-подобной структуры РНК ВТМ. Этот факт соответствует существующему мнению, что З'-НТП, образующая тРНК-подобную структуру, является функциональным эквивалентом поли (А) тракта (Gallie et al., 1990, 1991).

Присутствие тРНК-подобных структур стимулирует трансляцию мРНК KPTI гена, находящегося под контролем разных лидерных последовательностей ( Дар и Б'-НТП РНК ВОМ) в одинаковой степени (Рис.4). Замена при гена на GUS под контролем а§ лидера также не изменила наблюдаемой картины (данные не приводятся).

400 300 200 100 0

Рис.4. Гистограмма включения [35s]Met в индивидуальные продукты трансляции мРНК AaßNPTl и ВОММРИ: исходные (1) и с пришитыми тРНЕС-подобными структурами: 2. РНК ВМК (301 нт); 3. РНК ВМК (161нт); 4. РНК ВТМ(178нт); 5- Поли(А) (80-100НТ).

Стабильность мРНК при трансляции в системе ЛР в пределах одного часа (продолжительность инкубации в системе in vitro) существенно не меняется, как показали наши эксперименты с меченой мРНК (Aaß npti и bom hpti) ( данные не приводятся). В связи с этим мы не анализировал! влияние пришивания З'-НТП РНК ВМК и ВТМ на стабилизацию транскриптов. Таким образом, можно предположить, что усиление эффективности трансляции npti гена вследствие пришивания тРНК-подобных структур ВМК и ВТМ не было обусловлено повышенной стабильностью транскриптов и не связано также с влиянием лидерных последовательностей.

Мы не выявили регуляторной области среди ЗООнт З'-НТП РНК ВМК подобно тому, как это было показано для З'-НГП РНК ВТМ (Gallie et al.,1990,1991)- В соответствии с нашими результатами пришивание З'-НТП РНК ВМК разной длины 301нт и 161нт ( тРНК-подобная структура состоит из 135нт) сопровождается одинаковым эффектом (Рис.4).

Ряд данных говорит о роли взаимодействия 5'- и З-'НГП, а также кэп-структуры и З'-НТП РНК з регуляции трансляции in vivo (Gallie et al. ,1990,1991 ) И tn vitro ( Timmel« et al.,1993). Чтобы проанализировать роль этих взаимодействий in vitro к кэп-содержащаему транскрипту B0MNPTI, пришивали тРНК-подобную структуру РНК ВТМ и сравнивали эффективность трансляции полученных мРНК и контрольных матриц без кэп- и тРНК-подобных структур. Результаты трансляции представлены на Рис.5.

200

150 100 50

♦capBOM -сарВОМ

■1 -HikeBTM ЁЗЗ *HlkeBTM

Рис.5. Гистограмма относительного уровня трансляции продукта гена ПРИ под контролем лидера сгННК ВОМ.

Из рисунка видно, что присутствие кэп-структуры не оказываете на трансляции мРНК, что характерно для системы ЛР. В тоже врек матрица, содержащая как 5'-, так и 3'- регуляторные облает транслируется в 2 раза хуже чем мРНК с тРНК-подобной структурой, i без 5'- концевого кэпа. Можно предположить, что присутстш кэп-структуры в составе мРНК снимает стимулирующий эффект З'-НГП ] трансляцию ЛР, что указывает на возможные взаимодействия между 3'-Б'-НТП в регуляции трансляции. Этот результат наводит на мысль существовании некого транс-фактора, за который могут' конкурирова' регуляторные цис-элементы нетранслируемых областей мРНК.

Мы предприняли попытку выявить подобный специфический факт методом uv-пришивания. С этой целью [32р]итр меченные транскрип инкубировали в системах tn vi tro ЛР и асцитной карциномы Крабе I с последующим облучением инкубационных смесей при X 254 н К сожалению, эти эксперименты, а также опыты с использована специфических и неспецифических конкурен4ов, не выявили подобно транс- фактора.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально показано, что 5'-НТО сгРНК ВЗКМО усиливе трансляцию репортерного гена NFTI в бесклеточной белоксинтезируюп системе из .лизатов ретикулоцитов кролика, т.е. являет трансляционным энхансером.

2. Сравнительный анализ эффективности трансляции производи (мутантов) 5'-лидера сгРНК ВЗКМО не выявил структурных элементе отвечающих за его энхансерную активность. По-видимому, эффе усиления трансляции определяется низкой структурированостью 5'-К

3. З'-НТП ВТМ и ВМК (тРНК-подобная структура) стимулирует )ансляцию химерных мРНК в бесклеточной белоксинтезирущей системе s лизатов ретикулоцитов кролика.

СПИСОК, ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Мавродиева В.А., Карпова О.В., Ткшькина Л.Г., Родионова Н.П. Изучение роли и механизма образования поли(А)-структуры РНК

¡икробиологические и биотехнологические основы интенсификации ¡стениеводства и кормопроизводства", Алма-Ата, 1990, с.64.

2. Тюлькина Л.Г., Мавродиева В.А., Карпова О.В., Родионова П., Атабеков И.Г. " ЛигироЕанке фрагментов РНК в присутствии >мплементарного олигодезаксирибонуклеотида - "подложки"". ДАН,

юмовирусов".

Тезисы докладов Всесоюзной конференции

194, в печати.