Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация генома карлавирусов: М вирус картофеля и В вирус хризантем

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация генома карлавирусов: М вирус картофеля и В вирус хризантем"

ЕСОЮЗНАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В.И.ЛЕНИНА ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 577.323.4:578.851.1 ЛЕВАИ Константин Эдуардович

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА КАРЛАВПРУСОВ: М ВИРУС КАРТОФЕЛЯ И В ВИРУС ХРИЗАНТЕМ.

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена в лаборатории молекулярной вирусологиии ВНИИ ■ »ьО.охозяйственной биотехнологии БАСХНИЛ.

Научный руководитель: до^ор биологических наук,

Заьриев С.К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Народицкий Б.С. кандидат биологических наук, Карасев А.В.

Ведущая организация - Биологический факультет Московского' Государственного Университета им. И.В.Ломоносова.

Защита диссертаций состоится " "__1991 г.

в _ час. на заседании Специализированного Совета Д.020.40.01 при

ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ по адресу:_ 127253, г.Москва, ул.Псковская, д. 12, корп. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ.

Автореферат разослан " " _1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

С.

Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследования в области строзния генома шрусов являются в настоящее время одними 'из наиболее быстро тзвимящихсл и значимых в современной вирусологии. Неослабевающий жтерес к вирусам объясняемся несколькими причинами. Во-первых, >азмножение вируса - модель развития клетки, так как оно :опровождгятся последовательным зыражением генов и сборкой ¡акромолекул в упорядоченные структуры. Во-вторых, вирусы - источник федставлений об эволюционных процессах и молекулярных аспектах ;заикоотношений типа "хозяин - паразит". Кроме того, зная в тонкостях" труктуру генома того или иного вируса и установив функциональную начимость белков кодируемых вирусным геномом, мокно вести поиск новых утей борьбы с вирусными инфекциями.

К числу наименее изученных с точки зрения структуры генома ярусов растений до недавнего времени относилась и довольно ногочисленная группа карлавирусов - палочковидных вирусов с дноцепочечной кодирующей (плюс-цепью) РНК.

В связи с тем, что карлавирусы зачастую вызывают латентную (т.е. ессимптомную) инфекцию и растение-хозяин представляет, собой скрытый сточник инфекции - борьба с ними ■ имеет большое экономическое начение, поскольку своим кумулятивным действием они наносят начительный ущерб пасленовым, бобовым и луковичным растениям. Поэтому ^следование строения и экспрессии генома карлавирусов имеет не только эоретическое, но и практическое значение.

Темой данной работы явилось исследование общей структуры генома арлавирусоЕ на примере двух представителей этой группы - М вируса артофеля (МВК) и В вируса хризантемы (ВВХ).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было 1ределение полной нуклеотидной последовательности геномной РНК МВК и ютяженного З'-концевого района геномной РНК ВВХ. Были поставлены 1едующие задачи:

получение библиотеки бактериальных клонов, содержащих 1НК-копии геномных РНК МВК и ВВХ;

отбор клонов, содержащих кДНК-встаски соответствующие •концевой области геномной РНК МВК;

отбор клонов, содержащих кДНК-вставки соответствующие ■концевой области геномной РНК ВВХ;

- определение последовательности нуклеотидов кДНК-вставок в

отобранных клонах;

анализ нуклеотидных и возможных регуляторных последовательностей РНК КЗК и ВВХ, а также аминокислотных последовательностей белков, кодируемых протяженными открытыми рамками считывания (ОРС) ;

Научная новизна работы. В работе впервые определена полная нуклеотидная последовательность геномной РНК карлавируса - НВК, а также протяженного З'-концевого района геномной РНК ВЗХ. Рассмотрены основные принципы организации генома карлавирусов в сравнении с рядом других фитовируссв с положительным РНК-геномом. Обсуждены характерные особенности и возможные функции белков, кодируемых карлавирусами, а также возможные механизмы экспрессии их З'-концевых цистронов.

Практическая ценность работы. ' Получена плазмида pCV3-CP, содержащая ген белка оболочки ВВХ, которая может быть использована для создания тргнсгенных растений хризантем, экслрессирующих белок оболочки ВВХ, что должно придать растениям устойчивость к этому вирусу. Возможность создания таких растений подтверждается на примере экспериментов с другими вирусами ряда зарубежных исследователей. Кроме того, получен ряд ллазмид pQE/CVB-CPl, 4, 7 и 12, позволяющих экспрессировать белок оболочки ВВХ в клетках Escherichia coli. Эти конструкции планируется использовать для получения антител к белку оболочки ВВХ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Конференциях молодых ученых и специалистов ВНИИСБ в 1989-1990 гг., на VIII Международном Вирусологическом Конгрессе (Берлин, август 1990), на Всесоюзной Конференции "Микробиологические и биотехнологическис основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ата, октябрь 1990) и на школе FEBS "Геном вирусов растений: структура I экспрессия" (Рига, май 1991).

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в сем1 печатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит и; введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты их обсуждение", заключения, выводов и списка использование литературы, включающего библиографических ссылок. Работа изложен на страницах машинописного текста, включая Z таблицы и 2

рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использована геномная РНК, выделенная из препаратов ш;енчых вирионов ВВХ и МВК по методу Proll et al. (1981).

Лрвую цепь ДНК, комплементарную 5'-концевой области РНК МВК <нтезировали обратной транскриптазой вируса миелобластоза птиц с пользованием в качестве затравки синтетического гзоксиош гонуклетидного праймера, комплементарного части генома в 5ласти гена белка оболочки, по методу Уотсон и Джексона (19S8). гору» цепь кДНК достраивали, используя ДКК-полимеразу I E.coli и Жазу Н по методу Gubler & Hoffman (1S33). Выступающие концы )лученной двунитевой кДНК затупляли ДЯК-полимеразой фага Т4. )лученнухз кДНК встраивали по Hindi-сайту в полилинкер плазмиды 5EM3z.

Первую цепь ДНК, комплементарной З'-концевой области РНК ВВХ (нтезкровали обратной транскриптазой вируса миелобластоза птиц с пользованием в качестве затразки олиго-{ dT)15- Вторую цепь кДНК »страивали с помощью ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы E.coli и РНКазы Н Уотсон и Джексон, 19SB). Полученную кДНК встраивали по Smal-сэйту в ншлинкер фагемиды pGEM7z( f+).

Трансформацию компетентных клеток E.coli, штамм XL-1B проводили

> методу описанному Ханааном ( 1983). Отбор клонов, содержащих в

1азмидах последовательности 5'-концевой области РНК МВК и З'-концевой

!ласти РНК ВВХ, осуществляли методом гибридизации in situ ДНК

>лоний, иммобилизованных на нитроцеллюлозных фильтрах, с фрагментом 3?

ШК, меченым Р (Grunstein & Hogness, 1975). Нуклеотиднуо >следовательность кДНК-вставок отобранных плазмиц определяли методом жгера (Sanger et а!.,1977) с использованием модифицированной 1К-полимеразы фага Т7 ( "Sequenase").

In vitro транскрипцию проводили по методу Melton et.al.( 1984). In 'го трансляцию РНК проводили в лизате ретикулоцитов кролика по •Iham & Jackson ( 1976).

Продукты in vitro трансляции и фьшин-белки, экспрессированные в coli анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, используя буферную ютему Laemmli (1970) или Schagger & von Jagov (i987).

Перенос продуктов трансляции и фьюжин-белков на нитроцелгаолозную :мбрану проводили электроблоттингом в приборе Мультифор (LKB).

Рассчет степени гомологии белковых последовательностей проводился помощью программы GENEPRO (Riverside Scientific Enterprises).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

г

1. Структурная организация 5-концевой области РНК МВК.

1.1 .Стратегия определения последовательности нуклеотидов.

Из очищенного препарата НВК выделяли РНК методом фенольной депротеинизации (ProJl et ah, 1979) и анализировали электрофорезом в IX агарознсм геле.

Синтез и клонирование ДНК комплементарной РНК МВК, а также отбор клонов проводил!" способами описанными в Материалах и методах. В результате было отобрано шесть сильно гибридизующихся клонов (рУМЭ, pVM28, pVM30, pVM33, pVM47 и pVM107), охватывающих область длиной около 7000 нуклеотидов с 5'-конца РНК НВК (Рис. 1). Нуклеотидная последовательность 3'-концевой области геномной РНК МВК .была определена ранее ( Rupasov et at., 1289).

Последовательность 6000 нуклеотидов 5'-концевой области геномной РНК МВК представлена на рис.2. Последовательность самого 5'-конца РНК МВК была определена методом прямого секвенирования РНК МВК с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц и синтетического праимера, комплементарного 246-263 нуклеотидам РНК МВК. Первые два нуклеотида последовательности точно определить не удалось. Более 90% последовтельности было просеквенировано в обоих направлениях, причем .около 50% было прочитано с помощью нескольких независимых клонов.

1.2. Кодирующие районы.

Анализ установленной последовательности нуклеотидов в 5'-концеаой области РНК МВК показал наличие некодирущего района на 5'-конце, длиной 75 нуклеотидов и следующей за ним протяженной ОРС, кодирующей потенциальный полипептид длиной 1968 аминокислотных остатка с мол. массой 223316 ( 223К-белок) (Рис.2). Еще один некодирующий район длиной 38 нуклеотидов отделяет большую ОРС от ОРС, кодирующей потенциальный 25К-белок МВК (Rupasov et al., 1989).

1.3. Анализ аминокислотной последовательности 223К-белка МВК и

сравнение его с белками других фитовирусоа.

Аминокислотную последовательность потенциального 223К-белка сравнивали с последовательностями репликазных белков потексвирусоа и ряда других фитовирусов, входящих в ' супергруппу Синдбис-подобных, геном которых представлен плюс-РНК. Детальный анализ наиболее консервативных доненов аминокислотной последовательности белков, кодируемых большими ОРС у карла-, потеке- и тимовирусов проводилось

12К

25 К И ПК

223К___1 |7К 34К Г]

----■ D[=|J-

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 -1-с-г-1-1-■-1-1-,/v

рУМ 107 □19Кро1у(Л)

рУМ 9 ,рУМ 30, рУМ 33

рУМ 47 рУМ 28 ' '

'ис.1. Схематическое расположение шести ОРС в геномной РНК МЗК, 0РС в <инус-цепи и длинные, взаимно перекрывавщизся клоны, использованные 1ля сиквенирования. Стрелкой показано положение лраймера, ^пользовавшегося для прямого сикеенирования 5'-коьца РНК HPK.

!fA«tY8TP«EIMV»C

FEPAïaAVlARSAAllYKIIFEEailCOrF.'lYYlSPI.BKRKl

S4AG1YISPYSAVVHSHPVCKIL1KY11.YSVI.PSY1NSSF iraiERMmVACKitflGSUIIKülCIEGOT^ Î40

YFYGIKERKlQLLKSKCKtiCCSVOVVi'RYVÏSAERflftYÏN

шттамт'слтауадгажгс;^^ (во

tFVPYE!rEIIEClïllKt»«ES»£eiBEL»E?l»RHI(»KSL FFHDELHYK5SKVL1ÍFEPVHRPDKI.IGÍVVYPPELIFK.P

r«;i»£»CrïySjySt!l»fFPtC»0SE6ï»ÎPll(i5»tl

«тампатаядата'отпдал/да 8«

GAS5LXL£D67VYHVDVIGSKFPHHL1SÎÎKG1AAAPÏHR

по

AFSPFïAVA5cALKAÎE5PDYPCAFPVSYEVYHKlYRYt.R 7tXKPS£B5Al«KESaMA£S5G«£l»rVECFAetfiB»5

12»

SlIEftllllPEQLKEFIISNMIGKIlPSVLARfIFSSVRAVCVNK

им

FII!GLI.PYSFTlRl»Ell»liN!lf£«SrA»FF5tDAEVtVP

исдаохзшюшгж^шапсгапсм!^ uto

EÍL56LFI(tE6«6tVaH¡rSSPri'SrfPtJlIIH£«»AtlCII DSOKILHAHRRHFÍIRGAVGAHftCVISPEFLLKYFEARIXS

шжшлгспештисхЕШШОПМдга ua>

S t l I Й t il s s s ; S S « £ < ¡ f S i £ Ï l 6 L l S S D ь L F s Й л ; 1 L : я

A8£EPHfSES8l»FFl1«E«H»LY6lIKYI£Si;RA»lEV»

HlJiSNVVHEVSIKRNKGttlRLEKARVlEQRPSEFflSCVlE

P£VlífiDVEAAl.Cl£L8EVACACNAA£V05VVLSHOAGLHV ЕЩ/ША1[ЩШ|51гаШаСС1ЕИ!А1£С.^ПЕСШ;-ЛП^ JIM

R E S Ï í, t A S V ь l 1 I [ » в S » l < a í S S E l t S « 6 « Ь В S t S V « Я £

туашпздзшЕШгашвЕАсштожшАШ^^ 2290

1 К 5 V S 0 », F : V А V В I S Y S ( E 1 0 г, Я ï I t В 5 ^ Í S !• £ S t Л S í I V M iJ-.xrcLiTr^iXjV.v.M ! i^'.ibtï^x,'X'TI ivx

VHLRREGAFlVRCARGKfiLALAUNBHJClEVÍfAMVAYGHE ВПМ1С111и/ЛгеШ6ОШЕАТШ«|0С[ЕаС|Е»й^ 252<

С Y It P. 5 ï t i « « ï ÏV f ¡ I; Í a ! ï S £ S V ¡ f E S - li £ V S P I £ s 1; 5 ù

îcciAwcwcimimïxwaaieHGiGGicnccïivv^ 71л

SS«P6»6ï»l.iLt6VVSS£IPA»GAEFY<R»56Pei)GCEC

1Сшжсдщш»,'|1^11лнга«11с«;(!аг1сгпсэткЕ.^ШЕСИсэд 27Ы

« H S F A Y I V î í H И n £ £ « К I С 1 S H У F E N Í S I » V E I E в [ ï e S S

28»

AFVFMAAllAlALRlRAEIflVHHhGTGRVHRFAPKOKNH«

5ШИ11юи1Ешсш1£1ншжпш<№СА»11сш:;Асас1б№^^ ¡0«

L S l » £ E S E 11 Y E P О V L » * Б С V I £ S V A a A l 6 I R » » » I l А V V E ERCCEEVVESVQAGLGINEHHVEIVLDCFCIVSHCHLGOK

В

! 1 1 I » II Е 6 I; В P F С F [ I S В Е Н Л S F С 6 И « t t Р I С * I V S 6 А 1И

^тостгмгалогкдаатгопсдашиюстбвте^штотгта ш

G К И F А Е S А I L J I Е * С G L « I « F £ Р И « « R А 8 « L А « S И Y 0 6 А Т 6VL6SAIFNIIKRNI1REKFVRNVSISIHAIVSTF6S 6 К S Т I

•KSLUItKGaGKSLOFVSPRBULftCCrKBTVSftxEfteCRnii

аСАшшАаттшиг^^ошшшотсгашот я»

»S0t»«HViTLETfl.i«»EFl.lE6aiV!ltE»lll<VP5YF

за«

5lVVS»lKViVRlFlV5DPA«SIIYIIGEKDRI.l'l6ilIEE»«

S V IGAREYNYKVRGHRFLNCNFIGRLPCEiNKDilCTIlJE АксюпсстагасшаотАсШАсашшшсАта^ (с®

Р Н 1 « R И В I Е И I I D V А Е Е » К S V V I V S S f D Е К » V V С A Н I Г Е А

IfVlIEGESTGlYFrtHETIYISAVSERTNERfiHITAlRflFR

А/ететотти-вдтатетттклттшЕотк.^^ та

FRlCF.VUCSBItllYlllllAGRYKGSVRSKriCKIAIPtlllXS

nlPGQAlfKSEYPRllGKBESVftEEKlAGDPHttsYftlH'.Y ■ АШКССШТООТтжта^таКМВДП^^^ Ч»

OAPEVllAEEPEYir, »£E«Fa'»lFRtSt£S»R»D»»ltKl

LAKElREVRrtSDHVSElJF14EHTKi)LGAii0trHflA£RFET

l»RR«RASD!iTFlllAfl;K«l.SfSNPGi:f);S»Lf(tiASrS

KAlLSEFLKR»PL(PiBRVPF«£EAL»»fEEl!*lSliS*AI тмтятАГИшгЕоташЕбгтетдаои^^ sow

I E » К S S Я 5 С R t ». P ! ! V A 0 I F S К S 5 l С I К f S » R F II » А К A A ■ 0

мгетитяэтттетгатгсшкмте^ мм

s i к mi i и ( I F i f I I I 1 I E i n I ! H I [ I II [ i и ш

шпштпЕЖАтггаясшагаэтЕшесиштага 5га

EEttA«V(t!l:FtltlCYESI>YEAFIIASIllEfI»iF£t.El.n

им

((IKlPSIllElltriK ISLGSK. ISKFAIiRFSSEASlFl

аююшшпсшвгстшютапАстт^ »50

fKTlftHULFTFflPYRIRGDEFIEFA I I 8 > [ 1 t 111 1 Г 1 (I FiHFliJtilXAKViFVeFillKPIFCIIIHLCPSSItiiPl

57yt

IVtERWCtAXEPNRtSNClDNYAIEVAYAYKl.GFKAVNRII

кво

t{EE»AAF»»CV«I!l'»lll<Bll»SS(«5l'fEI>t<

шавж/жюжсиажтгжткгяжсмститшгпат^ mo

hOVIVDllYIIYliFtRLSijltLVCPIVVHCVPGAS

ГОАпгштЕмшгагЕсоттитгсгмтшЕмдшлсга^ 4120

К S S l I R E E L E L 0 S S F С J r I t 5 Y E E! 5 P P. I S G м « T Ч к К S E о « «ЮАССПАА1ТШЖШ!АтТТАШ1ШС1П:ГС1ЕШ1Ш Ш9

PEGXfUiEitYlllIEVPPVFALFSSPICSHISAiSJAtF

сюлоддетсшгстаАютздстяжтомшх^^ ш

»CS»SRBfSSAIC5Ll«Et.G»«4HS£X»GlVa»5SlYTKll

Рис.2. Последовательность нуклеотидов, соответствующая 5'-концеэой области РНК М8К. Аминокислотная последовательность шести ОРС представлена над нуклеотидной последовательность». Два первых неопределенных нуклеотида обозначены N. Подчеркнутые аминокислоты в первой ОРС соответствуют двум консервативным доменам GKS (с 3585 по 3594 нт) и GOD (с 5596 по 5504 нт).

визуально с использованием ранее опубликованных сравнений (Рис.3). При сравнении отдельных доменоз последовательности выявлено от 20% до 32% идентичных аминокислот (см. Табл.1). Наличие областей со столь высокой гомологией, указывает на то, что в большинстве случаев С-концевые части возможных репликаз плюс-РНК-содеркащих вирусов несут так называемый "полимеразный домен", мотивы которого являются общими не только для плюс-РНК-содержащих вирусов, на и для РНК-зависимых РНК-полимераз вирусов с минус- и двухцепочечной РНК, а также для РНК-зависимых ДНК-полимераз.

В С-концевой области 223К-белка МВК локализован дипептид Asp-Asp (см. Рис.ЗВ), который в характерном окружении встречается во всех РНК-зависимых поликеразах . Некоторые данные говорят о его ■возможном участии в расплетении двуспиральных участков матрицы во время элонгации, а также в распознавании субстрата и каталитических процессах.

В последовательности аминокислот 223К-белка МВК был выявлен домен Gly-Lys-Ser, который, как известно, представляет, собой часть нуклеотид-связующего центра белков, связывающих АТР и GTP {Рис.4). В случае Синдбис-подобных вирусов было показано, что такие МТР-связываодие домены структурно родственны определенным доменам некоторых бактериальных белков, вовлеченных 8 раскручивание ДНК и, возможно, являются членами семейства хеликазных ферментов (Gorbalenya & Koonin, 1989; Hodgman, 1988). Кроме того, серия "хеликазных" мотивов была обнаружена'еще и в 25К-белке МВК ( Rupasov et al., 2S89). Таким образом, карлавирусы представляют собой еще одну группу плюс-РНК-содержащих фитовирусов {вместе с фуро-, гордеи- и потексвирусами), чей геном кодирует "хеликазные" мотивы в двух индивидуальных белках.

Исходя из первичной структуры, можно обнаружить гомологию между N-концевыми частями репликазных белков ( "nsP ^подобных" доменов (Strauss & Strauss, 1988)) по крайней мере двух типов Синдбис-подобных вирусов. У фуро-, потеке-, тиио- и карлавирусов были найдены два коротких мотива, характерных для nsPl-подобных белков (Рис.4А). Важно отметить, что один из этих коротких мотивов включает аминокислоты, замена которых в nsPl-белке мутанта (LM21) вируса Синдбис ведет к усилению метилтрансферазной активности (Рис.4А).

Таким образом, ген 223К-белка МВК кодирует ряд консервативных доменов, последовательная локализация которых типична для репликазных белков альфавпрусоа животных, а также потеке-, тимо-, гсбамо-, тобра-,

л.

МОК (54} RKLSЧACIYLSPУSЛVVHSHr,VCKTLt^YЯYSVLfSVIflSSFY-'VGÍ^LRKLf)LlKS^'>:K^JLUS Ж (49) ^D'£Пr**Л:r¡♦**Ia*í*AДЛ"I•*KL■'tVL£GII.PCEPVT-^•1FL*P"•1M^,fi•|^'^^:^.•I

ВМТ { 43)

ЕМ& ( 48} :; * Г г* Г * К -ЛЛ ^ Ь Г К ? С/Е

............. ------- -----------------

----------------¿УМ5*7*ТК МЕ

ИПК УрУУМУУ15'

хвк г и—*ул1ерр,«;л**гкетппк1т*;

ВСУ* Г1--ЧАЦРИ'\<}*ПЕ*и\ч:5^Р.П7:,1У----

СНП Р1—^Н1£РК*УА**ОУ»Т|.Г!Ж?МР<51ТШ--

БШ Р'.Ъ'Г--------

ВМ5 и~пт.*Л*'П*-Р5Т5П7Р'К51--------

в>ио и--*т*А":;у«р57$7$1.рк»''1-------

-Л»Ги*Т»П1Р1ТА

МВК LIDFlD^•ПP0"KtLGTVVYГ',•ELLrl^PTÍ!SL^>^.'(-YTYD!V!:0TLrcFPDCV0SГ0Yа^I-KGGYLLГЛ БКБ I Г »* ГР£. I- С* * НVI Гл^Г^ С5"• Г

56К ( 50' ХВК (1143 Вин ( 1306 ВНаК ( 948 ЕНП { 123? бке.Т ( 143« С^Б { 1480 ВЖМО (1110

КИСУ! 11.41.6* 1

-КНЬСУЕ^О.'

11 Ч**У1КА'И.1С1*ГП*;Аж

Е::Б -РН1*У*С**ТР5Сг'Зр*$13Т11иЬС55----У1АИ**7***!)**Н"ЕДУУ1*си*КК*51*И5**51Н

8М0 *г;Р1*7»С*МР5**5»'5Н5Г1*СМ-.—УIСМ*»Т**лд**МЬ£ЛУ 1

СЛМТ 5У*К!1птчиГ5Н----Ч***УУГ.*А*С1ЯНЧА1Г1К1Н*ПйООА*СШ15Ч7*|

71 ККМ'Л«ЯР»ДЯТ5Н----Ч*"ПУ5*Н*ААК\»УА1ГАК1М*СУ11Эг'$*№К?;1$Ч2-?$72

РУМ ( 1661) RSCRCWPrDVЛOírSKS(;LCrí(FD^R-FRVЛKЛAQSIVCFQ^tЛVLCRFЛPYí лУ1гцк,/НЕУ1

Рис.3. Сравнение М-концееого (А) и С-концевого (8) доменов большого продукта трансляции ( 223К) геномной РНК МВК и С-концевой домена ОРС1 ВВХ с таковыми БВК, ХВК( 365К), ВМН< 186К), ВМБК{ 147К), ВЩ 176К), ВШ( 206Х), БМБ( 205К), ВЖМО( 198К). Звездочки расставлены вместо одинаковых аминокислот. Знак (-) введен для достижения максимального сходства. Стрелками указано положение аминокислот, абсолютно (три стрелки) и 8 значительной мере (две стрелки) консервативных во всех РНК-зависимых полимеразах.

7 1

ТАБЛИЦА 1

Процентное сходство консервативных доменов у больших белков карла-, потеке- и тимовирусов.

5ВК ХВК ВМН ЗМ5К 8МП ВЖМТ ВМБ вжме

М-концевой а домен

МВК н/оЬ 21 23 24 20 21 27 26

ХВК н/о — 59 55 52 31 32 • 31

вжмт н/о — 29 32 27 — 60 66

С-концевой домен3

МВК 76 " 32 31 30 29 27 . 25 28

ХВК 32 — 64 61 69 32 30 32

вжмт 26 — 27 27 30 — 73 70

а И-концевые и С-концевые домены, сравниваемые на Рис.15А и 15В. ^ н/о, неопределен из-за отсутствия полной последовательнее™ 5ВК.

А. * * + + ++

пзк 223К ¡69) УЖНРУС-КТЕЕНУ. ..43.. . лтклвкгаут

хвк 165К (64) аНТНААА-КТШК. ..41.. , .1ЕР«ПУ?Р,УР

в»:т 206К (64) SHHPHAAH-KTIE.Tr. ..41., , ЛИРИЗМ «Р

8нп:«с 237К (115) МНУ5Р,5АССУ5Р5«. .141., ..КОЗКШУИТТ

в:« 126К ¡84) 55НСРАААН!Н1ЕТ0. ..37.. .лрамсарлг

В!« 105Ж ¡78) АРНЯАС,ПШЕНУ. ..36., .ЛСЛУШАЕШЕ

ВНО 112К (79) АРааА0А1.иСЕи. ..39. . ЛСЛкСКГЛИТ

втм 12РК (79) АУ!!51АСС1Р5и1Е. ..37. . .ЮУРЛП'ЛНЕ

ваяя 130К (83) ЕТНедААСРР^ЕТЕ. ..39.

5Ш П5Р1 (36) П0НАМАЯАР5Н1А$К. ..36., .лсреорейм

в.

мех ггзп ]]бг)л1устга2ск5т1гк!11.1.

ХВК 165КС 732) УШСЛаС5«<5!1А1(]|<й|_.

РИГ госп 973) НРАОГЛССОШРИЛИ..

ВМ11 ПЙЛ 835) 1У0ЕЧАСССКТТ(ПКР1Л.

БЖ 1034 632) МТООУАССаКТТАТКОАР.

ВНО 112К(710) СУ0$УАССШТА1ШР.

ВТН 126К( 830) П^РССвКШИ^.

вия ]30К( 833) исшта^иш^с.

51« п$Р2( 183) ШСТРСЗЕКАПШУ. * +

* *

МВХ 25К (25) УУНСУРСА6К551ЛРЕ11. ХВК 25К (25) УУКАу'АОАбШАЕРЙЛ. ВШ,"!Я 58К(26б) ;15даС52К5Т1УГ!!и.

.60. . .УЛШЕНГДУР. .47.. .^1РСЭ'/5К1Р.

.52...ШГОЕСГ10Н.

.50...РУ1Л'СЕУШН. .54.. .Р.ШЕЕСП-ИН. •55...РРНЕОЕА1КУН. .47...УЕУУОЕАГАСН.

.35.. .FVVLCEVT1.LT. .34...РЛ1ЮЕУТ1.К>. .38..ЛШ0ЕУШ,с.

лб-.лпл'сог/дау

.1о...У1иС0Р1.УСЕУ . )5...У16РС0ТЕГ)1?Р . 15 .. .AC.CFGQSE.QI АР .15...А1СЕСП5Е!)1АР .15.. ,АУУУВ!)7Ср1РУ • 15...11.А(ДО:>Л()1.РМ

Ло...УИССОР;ЧСГ,Р +*+ «« * +

. .5.. .РАЕТССРЮЗИТ ..6...дА1РАВРУ()АРЕ .3 2...Уи1УСиУЛС|СКА

как . ..г9...яапгми.. .53.. .уигеЕБтеиркисцу!.. ло.. .рллшкр.р

хек .. .23.. .Атна;,<:<01.. ло.. .тртулссдаттэдт.. л р. . .ук-л^иа

ват ...г8..л'$УЯ1Р0С!...45...5ст1г$5чсирсррАШ...п...;;с1УА:.та5

СМП .. .22.. ЛТ«К5РА0А.. .66.. ЛРПНЕАЧГЛТРВЧУУРСЙ.. .19.. .«!Л'А1$аН

ЕЖ .. .23.. .КТУРСРСЯУ.. .78... ¡КТУНЕАОСПУРН'ЛШ.. .13.. .Усидим

В!» .. .23.. ЛТРРЗРСОУ. . .79... 1КТУНЕ50Е15ЕСНУТ1УР. . Л 3... УС1УАУ7КН

8ТЙ .. .2'.. ..ТНИ№№.■ .52.. .Ш*НЕ*<5СтайШ«.,.14.. .HVLV.ni.SRH

В5ЯЯ .. .25 — Й5УРЛ РССУ.. .78.. Л ., 17.. ,У1 УУиТ5:'И

ЭГМ .. .24. . . . .53.. Л'!>НААА5((С1ЛПШУА1'Я.. .14.. .К'ЛГЛПКТ

^ * *

*+«*+ » н * + + »+ +

13К 25К...14...У5РПРС5АТ...50...А151дЕ1ТОаТРЕУУТУВО..ЛО...ААУОО!ГРН ХВК 25К.. .12.. .ТЬШ'РЧет.. .52.. .ГУПРСОУТГЛЕРШТ."«.. .11.. -ЛРУГ.'АПКЗ В1?;я 53К.. .18.. .ТТУРХОдЕТ.. .62.. .САШ0УдСХЕГЮТТ1а... 12. ..LRI.VAl.SiM

Рис.4. Сравнение наиболее аысококонсерзатизных аминокислотных последовательностей в пеР1 (А) и пэРг (3)-белках вируса Синдбис и а больших продуктах трансляции РЖ1 ЗНПЖС, РНК1 8МЛ, РНК1 ЗК:<, Р1;К1 С!-:0, РНК ВТИ, РШ и ?!К2(5ВК) ВШ, РНК МВК ( 223К и 25К), РНК ХВК (165К и 25К) и РНК БХ'ЛТ. Номера в скобках указывают позицию первой аминокислоты. Кокера в промежутках указывают количество аминокислот, разделяющих сравниваемые дсмены. Укззано положение аминокислот абсолютно (*) и г. значительной «ере (+) консервативных со всех белках.

Фуро- и гордеивирусов растений. На основе вышеизложенных данных можно предположить, что И-концевой консервативный домен (приблизительно 50-260 ак) является вероятной метилтрачсферазой; второй консервативный домен (1160-1420 ак) представляет собой "МТР-хеликазу" или одну из ее субьединиц; . а С-концевой домен (1660-1930 ак) обладает РНК-полимеразной активностью.

г

2. Структурная организация 3-концевого района РНК ВВХ.

2.1. Определение последовательности нуклеотидов.

РНК ВВХ била выделена из очищенного препарата вируса по методу РгоП е1 а1. ( 1979).

Синтез и клонирование кДНК проводились как описано' в разделе "Материалы и методы".

Для отбора клонов, содержащих кДНК-копии 3'-концевой области РНК

ВВХ использовали в качестве зонда короткую специфическую кДНК, 32

меченную (а)- Р. В результате было отобрано около двадцати клонов, шесть из которых (рШ2б, рСУВ38, рСУВ47, рСУВЮв, рСУВ272 и рШ385) гибридизсвались наиболее сильно. Для определения последовательности нуклеотидов за основу была выбрана плазмида рСУВ272, содержащая наиболее длинную вставку длиной более 3500 нуклеотидов.

I

Последовательность ДНК, соответствующая 3-концевому участку РНК ВВХ длиной 3426 нуклеотидов (-без поли(А)) представлена на рис.6. Представленная последовательность по большей части была секвенирована в обоих направлениях, при чем более 60% Выло прочитано с помощью двух или трех независимых клонов.

2.2. Кодирующие районы РНК ВВХ.

• Анализ установленной 3-концевой последовательости нуклеотидов РНК ВВХ с помощью компьютерной программы СепеРго позволил выявить шесть потенциальных протяженных открытых рамок считывания (0РС) схематически представленных на рис.5.

I

Первая потенциальная 0РС1, локализованная на самом 5-конце просекоенированной области РНК ВВХ заканчивается терминирующим кодоном в положении 787 и кодирует потенциальный полипептид с мол. массой по крайней мере 30255. 0РС2 начинается с А1Ю-кодона в положении 821, заканчивается в положении 1516 и кодирует полипептид с мол. массой 25749 (25К~белок). 0РСЗ начинается в положении 1494, заканчивается в положений 1814 и кодирует потенциальный полипептид с мол. массой 11435 (12К-белок). 0РС4 начинается А1Ю-кодоном в положении 1805, заканчивается в положении 1999 и кодирует потенциальный полипептид из

3

1 г 4 5 6

ьоо юоо 15со гооо 2500 зооо 3500 _1-1--1-:—I-1-1-'ЛЛЛ/

рСУВ272

ПО'ПИ-А __I

рСУВ385 I-

_1

рСУВ47

рСУБ103

рсуазз

рсуагб

7

Рис.5. Схематическое расположение шести 0РС в З'-квнцевом районе геномной РНК ВВХ, ОРС в минус-цепи РНК и длинные, перекрывающиеся клоны, использованные для секвенирования.

Iff! PYHRYlEAKVHEVLPS8FYl«SGI!SlEEl»E»yii:GKFE

GIClESUYEAFDAS!lDOYlVAfELAt.HEYl.£l.PR!ii.IEDY

2«

A F 1 К С II L G S К I 6 II F A l П R F S Б E A S T F L F « t Й A R II I F 7 F I R Ш71П№глйВ1П1ш:а;«га"\1ОТ J» fllXtSEHICFA G__p_D ICASERLClKKEHEGFlKtCLKLKAIi

V F t V t> P 7 F £ 6 И И L С F D 5 I I К К F 8 I V L E 1! й С 1 А К E К N К I (

£rcrrcmGr^4AV£c«7m!6!KS7GXOTr.™ma;M wo

II С l t II < Л 1 £ V S 1 A 1 К I S £ » A V » Я К D E £ E L E A A Y N С V R I 1 I смтш^аи'шгагашсгнж:;»^^ 720

К II К К l l * S 1 I l G F Y S К 1 E К g I I CJF! к 0 V F V К 1

l 5 1 F G F I S I S S S I » V P I V » К С (I P S A 5J(_j SCiRALLKADSR

шсасплттслтетхпжжлш:«^ m

FVAYllGVPDPC»lllol.CIKAFIG£Y»(.t:(F»Il.I>£Y»RY ЕИшкЕхкшгабпгатстгАткгсот ш

HEDASDFFALFGDPV0SfPRNl.YRAHFKAVt.SKftFSSC7A KmilVSn/KSAmcmEKICmBlCAI^^ ш

IlLLBElGrEuESliEtLVSlRGLYiFJPVSTVlYrECEIG SLiAiiraxffS'^iiKwiiraiittiSSG^ 1320

CLLRmIISIEAYEPEEVVGKIFEIVTFVTAENHIPAESRHI

mo

КПП PLTPPPDH7KVLIVAA1GL5I ViGCtlRHRSVIHEHIPtASYISIl

штотазтсжсгжаг^ ш

VASIlIYSRNriFjVGflHSHlLPHEGVYKBSTKTYVYEGP

ltm

8 К L II S L E G G F II L P » О P « F L V 1 L I. S A A 1 F I I 5 С R S G И R R V С Есйтемюшш.йкмдаспАС^^ ш

KF4 H5LS«lGLLLAFGCVLAVS»IV»CFLVSII»»Cv'l£ltEE. 5 а с и i

ETCftrtTblCATlHAoYTKTY^jHTIlFiCTlrYATjCTTYTG3yiEISTlCTGuCY-TIrCL£ilBTT51fiAr.TTECTtTrT6y 1920

AVRISECTFDRIFVELVKGLKPAKHI

[«It PPKPAPGDNEGHAGGSlP7PPPPPPARTA££ARlfi

^iiieiMiKuaitattxrcK/aa^ 21м

t,AEHEREA£QE0LLE£nH5HTPAEDAKIil5RLlQLAALLR

rao

«EG7KiR»7«fi»lEI£e?A10PPPNaRGtP!K»YS0VSSD FltlKlKP0RISIIKi:A75El>!!VI(10VAlE6l6VP7ESVKEV

llRLVlllCAII'SSS«(0!PP61,IE»5GSAI]AtiV»GVlI

^r^GIDClСнАТТGТй-^иАЛТrTCLGTrTftCCFOGiGij^CoflF7A7A30Gi>nftTTFiC 2Ш KHS7LRKVCRLYAAVAMNYHHLG07PPS.IiWSAHEF)IPIiilK

27 w

YAAFDFFDYVENSAAIRPS66I«PKPT«AEYVAYII77K»L A I » К A H И » D ! F S И F 0 S A 11 G G R 0 G P A 1 H » « l К H A « « К 7 I I

Ш flDVlVXHLILRKFV£Q6NVCPIHLCVBIYKRAFPR

Ш/даПет™ЕЖШ17БЖИ;ШАА1:тЕ!ШШ111мЖ 3tZ0

SVMKSRSSYARRRRAIELGRCRRCYRVYPPIFPEISRCDN

ШйгашАетАМсгакюАзтаопта 32W

R 7 С V P i I S I' »SCVKJillKSfiiVIPUfSYRFI

icGaniEiaGo;ii5iATi!crisrai;;r(,v.Gicii'«ii«iA!C£i!7CireiiA'aacs 33«

CaAftMAAIAttlfireGlIGlftXniWiWTCffilGfiGmiAAIAKmtrCCIIAcnAlAH Ш

Рис.6. Последовательность 3426 нуклеотидов, соответствующая геномной РНХ ВВХ. Аминокислотная последовательность шести ОРС дана над последовательностью нуклеотидов. Подчеркнутые аминокислоты в ОРС1 и 0РС2 соответствуют двум консервативным доменам - GDD (с 398 по 406 нт) и GKS (с 917 по 925 нт). Обнаруженная замена нуклеотида С на А (2058) вызывает замену аминокислоты (Pro на His).

64 аминокислотных остатков с мол. массой 6984 ( 7К-<5елок). ОРС5 начинается инициаторным кодоном в положении 2054, заканчивается в положении 3001 и кодирует полипептид мол. массой 34638 ( 35К-белок) Последняя шестая ОРС локализовала на саном З'-конце геномной РНК ВЗХ. Она начинается с инициирующего кодона в позиции 3017, заканчивается в позиции 3340 и кодирует полипептид с мол. массой 12609 ( Î2.бК-белок).

2.3. Анализ минус-цепи РНК ВВХ.

При компьютерном анализе минус цепи секвенированного участка геномной РНК ВВХ было выявлено несколько ОРС длиной более 300 нуклеотидов. Их кодирующий потециал был изучен с помощью алгоритма Трифонова (Trifonov et al., 1987), который позволяет отличать потенциально транслируемые ОРС от случайных. Только одна протяженная ОРС начинающаяся с инициаторного кодона в положении 901 и заканчивающаяся в положении 1395 минус-цепи отвечает критериям алгоритма Трифонова и кодирует потенциальный полипептид длиной 164 аминокислотных остатка с мол. массой 16713 (17К-белок).

Ранее уже сообщалось о том, что минус цепь РНК МЗК содержит ОРС, локализованную в области, комплементарной гену белка оболочки МЗК и кодирующую потенциальный lSK-белок ( Рупасов и др., 1990). Проведенный нами анализ минус-цепей РНК других известных карлавирусов позволил обнаружить похожую ОРС только у еще одк;го карлавируса S-вируса хелениума. Эта ОРС также локализована s области, комплементарной гену белка оболочки SBX и кодирует потенциальный 12,5К-белок. Схема локализации потенциальных белков, кодируемых минус-цепью РНК карлавирусов дана на Рис.7А. Все три потенциальных белка обладают довольно высокой степенью гомологии друг с другом на всем протяжении за исключением С-концевой части ( Рис.73). Данных об экспрессии этих гипотетических белков in vivo и их возможной функциональной значимости пока нет.

2.4. Анализ аминокислотных последовательностей белков

ВВХ и сравнение их с белками других фитовирусов.

2.4.1. Открытая рамка считывания 1.

Ряд косвенных данных свидетельствует в пользу того, что 0РС-1 соответствует З'-концевой части гена вирусспецифической РНК-зависимой РНК-полимеразы.

В отсеквенированой части 0РС1, предсказанная аминокислотная последовательность высоко гомологична С-концевым областям больших белков карла- (см. Табл.2), потеке- и тиновирусов, а также клостеровируса хлоротичной пятнистости листьев яблони (8ХПЛЯ).

л.

ОРСБ (ген белка оболочки) ОРСб

] 1 11

—I— 1350

-!—

1050

750

450 150

Б8Х 17К $ВХ 12.SK КЗК 19К

"Т"

-ЛА/4

поли-А

В.

ВВХ М1тзьтс57СтаКРЗяЛТоХ1'Т133СУА!«11,ьЕХ1,сСЫ?нВк51;Рту*Ы1Х,\СВРЯ КВК ьтхКЗВТАхШЯАХСЫмЛлБмМЬЬУоетСВаН

МЗлуССЗЛОЬРТЗКЬлПЧьТАьЬЗилИАтксЗКЛиЗ-юЗЗАьЗртззы^СОО ХгзлзСхлСЬРУЗггрстемАрЬпзппМзппьЗэхлЗмшЗгзАЗллкрЗтезпу

сзкБнЗхзлзигаЛЗэлт^соооооУоУЕрьлт^зЬзроАаьаахуткхах* 164 уатоауАооС-ЬсосЗ» ' 125

^згрЗкЗАлуазагЛВььзсЕтрззьл'УзАГГУЕзРхЬтхзсэ - 43 он - * 179

Рис.7. Локализация ОРС в минус-цепях РНК карлавирусоз ВВХ, БВХ и К8К относительно гена белка оболочки (А) и сравнение аминокислотных последовательностей потенциальных белков, кодируемых этими ОРС (В). Совпадающие аминокислоты даны выделенным шрифтом."Пропуски (-) введены для достижения максимального сходства.

ТАБЛИЦА 2

Процентное сходство между белками, кодируемыми ВВХ и соответствующими белками других карлавирусоа.

0РС1а ОРС2 ОРСЗ 0РС4 0РС5 0РС6

мвк ' 76 51 47 34 44 39

5ВК 78 47 50 26 41. 40

БВЛ н/оЬ 50 54 31 42 44

5ВХ н/о н/о н/о н/о 55 56

лвг н/о н/о н/о н/о н/о 31

а

только для С-концевои-части ^ н/о, неопределено из-за отсутствия полных последовательностей

Определенная а работе аминокислотная последовательность С-концевой части белка, кодируемого ОРС1 содержит ряд участков, содержащих так называемые "поли.меразные" мотивы, локализация и расстояние между которыми соответствует схеме организации таковых у большинства пгаос-РНК-содержащих вирусов. Один из упомянутых мотивов -трипептид G00(cm. Р.,с,6,подчеркнут, и Рис.38), найденный также б большой ОРС РНК КЗК и SEK, высококомсервативен у всех известных РНХ-полимераз плюс-РНК-содержащих вирусов растений и животных ( Poch et al., 1589).

Таким образом, есть все основания предположить, "то полипептид кодируемый в ОРС1 является С-коииевой частью РНК-зависимой РНК-полимеразы ВВХ.

2.4.2. 2SK, 12К и 7К белки.

Кластер из трех ОРС, следующих за 0РС1 и кодирующих потенциальные 25К-, 12К- и 7К-белки ВВХ, получил у карла- и потексвирусоз название тройного блока генов (ТЕГ). Наличие структур, аналогичных Т5Г, кроме карла- и потексвирусов характерно для организации геномов фуро- и гордеивирусов (Morozov et al., 1S87; 1983). При сравнении аминокислотных последовательностей потенциальных 25К-, 12К- и 7К-6елкоз ВВХ с агш.'окислотньм!! последовательностями белков, кодируемых генами тройного блока карда-, потеке-, фуро- и гордеивирусов уста.чоалено их высокое сходство.

Потенциальный 25К-белск, так же как его аналоги у карлазирусоз (Ж, S вируса картофеля (SBK) и бессимптомного вируса лилии (БЕЛ) и потексвирусов, а также 42К-белок фуровируса некротического пожелтения милок свеклы ( ВНП'.дС) и 58К-бепок гсрдеивируса штрихосатой мозаихи ячменя (В!1ИЯ) содержит ряд высококонсервативных мотивов НТР-заеисимих хеликаз, включая консенсус G*GKS/T. Кы располагаем данными о том, что последовательность "халиказных" мотивов е геноме BOX кодируется дважды (данные ке приводятся), как и у МВК. Исходя из этого можно сделать предположение, что у карлавирусов как и у потеке-, фуро- и гордаивирусоз геномом кодируется ИТР-зависимые хеликазы, состоящие, г.о-видикому, из двух субъедичиц с разграниченными функциями. Возможно описанные белки принимают участие в раскручивании двухцепочечных РНК ( репликативных форм) в процессе репликации вирусной РНК

Наиболее четкая гомология установлена между, 12-14К белками всех перечисленных выше групп вирусоз. В эту картину идеально "вписывается" и 12К оелок ВВХ, имеющий 47%—54% гомологии с аналогичными белками карлавирусов (Табл',2).

Высокий уровень гомологии выявлен между аминокислотными последовательностями потенциальных 7К~белков карлавирусоо МВК, SBK, БВЛ и ЛВГ. Нами был проведен компьютерный анализ гидрофобности белков ВЗХ с помощью метода Kyte 1 Doolittle (1982). В аминокислотных последовательностях 12К- и 7К-белков ВБХ обнаружены обширные гидрофобные области, что типично для соответствующих белкос карла-, потеке- и небольших неструктурных белков некоторых других вирусов (см. Рупасов и др., 19S0). Возможно, что наличие таких гидрофобных областей обуславливает мембрано-связывающие свойства этих белков, что было показано in vitro для 12К- и 7К- белков потексвирусов, а такие 7К-белков каряавирусов МВК и SBK (Morozov et а!., 1991).

2.4.3. 35К-белок.

В связи с тем, что локализация 0РС5 ВВХ совпадает с локализацией генов белков оболочек других известных карлавирусов, а ~ама 0РС5 кодирует белок с мол. весом, близким к белкам оболочек других карлавирусов, и высокой степенью гомологии аминокислотной последовательности (см. Табл.2), нами было сделано предположение, что потенциальный продукт 0РС5 является белком оболочки ВВХ.

Для подтверждения того, что 35К белок является белком оболочки ВВХ нами была сконструирована ллазмида - ¡iCYB-CP, содержащая полную копию гена' 35К-белка ВВХ, фланкированного с 5'-конца промотором ДНК-зависимой PliK-полимеразы фага Т7. In vitro трансляцией РНК, синтезированной с плаэмиды pCVB-CP, установлено, что продукт гена 35К-белка реагирует в иммуноблоте с антисывороткой, полученной к ВВХ (Рис.8). Тем самым, было доказано, что ген 35К-белка кодирует белок оболочки ВВХ.

Стоит отметить тот факт, что С-концевые части белков оболочек карлавирусов обладают максимальной гомологией друг с другом и содержат блок, включающий ряд ароматических аминокислот, подобный консенсусу опр ¡деленному для белков оболочек поти- и потексвирусов (Lain et al.,1988). Исходя из существования такого гомологичного участка в белках оболочек ряда нитевидных фитовирусов, можно предположить, что такой участок может играть немаловажную роль в процессах сборки в'ирионов, будучи вовлечен в белок-РНК и/или белок-белковые взаимодействия.

2.4.4. 12,6К белок.

Анализ 12,бК-белка показал, что он содержит значительное количество положительно заряженных аминокислотных остатков, а также домен, в составе которого 4 Cys и 2 His остатка. Локализация четырех

£

I '1 С

Г '

—67К

—43К

-29К

5ч»' —18К

12 3 4

Рис.8. Иммуноблот продуктоэ экспрессии в клетках Е.соН (1) и трансляции т \ntro в лизате ретикулоцитов кролика (3) гена 35К-белка ВВХ. В качестве отрицательного контроля использовали экстракт клеток Е.соК (2) и продукт реакции трансляции без матрицы (4).

94К—

67 К—

43К—

—БО ВВХ

29К— с-..

—БО ХВК

1 2 3

Рис.9. Способность 12,6К-белка ВВХ связывать нуклеиновые кислоты.

Авторадиограмма после переноса электрофореза бактериальных экстрактов

32

в 10% ПААГ на нитроцеллюлозний фильтр и инкубации с Р-меченной РНК. Дорожки 1, 3 и 4 - экстракты колоний, экспрессирующих 12,6К- фыожин белок ВВХ, фыожин-белок оболочки ХВК и фьсжин-белок оболочки ВВХ, соответственно; Дорожка 2 - экстракт Е.соИ \V3110. Положение фыожин-белков оболочки ХВК и ВВХ отмечено справа. Положение белковых маркеров мол. веса отмечено слева.

Суь-остагков соответствует консенсусу (CysXjCysXj^CysX^Cys), установленному для связывающего ион металла (Zn++) и нуклеиновую кислоту центра белков - регуляторов транскрипции у зукариот (Struhl, 1983). Аналогичные цистеин богатые белки обнаружены у всех карлавирусов, структура которых известна на сегодняшний день, причем наибольшая гомологии имеется в области положительно-заряженных аминокислот и прилегавшего к ней мотива цинк-связывающего центра.

Недавно Gramstat et al. ( 1990) показали, что 12,2К белок KSK способен in vitro связывать одно- и двухцепочечные РНХ И ДНК. Для исследования аналогичных свойств 12,6К-белка ВВХ гены 12,6К-белка и белка оболочки были клонированы в векторы рЕАЗи5 и pQEll, соответственно, позволяющие экспрессировать эти белки в клетках E.coii. Экстракт клеточных белков ЕлоИ из экспрессирующих фьшин-белки - 12,6К-белок к белок оболочки ВВХ разделяли в 10% ПААГ и переносили на нитроцеллелозную мембрану. В качестве отрицательного контроля использовались неэкспрессируаций клон и клетки E.coli MIS, не несущие вектора экспрессии. После перенесения белков и их ренгтурации, фильтр инкубировали с радиоактивно-меченными РНК.

Результат эксперимента, представленный на Рис.9 демонстрирует способность 12,6К-белка ВВХ связывать in vitro РНК, синтезированную с плазмиды pCVB272, содержащей фрагмент кДНК ВВХ длиной около 3,5 тыс.н. (Рис.б). Белок оболочки ВВХ неспособен связывать эту РНК в таких условиях (Рис.9). Связь РНК и 12,6К-белка сохранялась даме после отмывки в "жестких" условиях. Также,- наблюдалось связывание 12,бК-белком РНК ВВХ в антисмысловой ориентации и гетерологичной РНК, синтезированной с фрагмента кДНК ВСЛК (данные не приводятся).

Общая структура 12,бК-белка ВВХ, равно как и аналогичных белков j других карлавирусов, и способность связывать нуклеиновые кислоты позволяет классифицировать его как члена одного класса зукармотичесхих белков-регуляторов транскрипции, для которых характерно наличие мотива цинк-связывающего центра и прилегающего к нему основного домена, связывающего нуклеиновые кислоты .

t

2.5. Анализ нуклеотидной последовательности 3-концевого

района РНК ВВХ.

2.5.1. Стратегия выражения З'-концевых генов ВЗХ.

Структура и локализация гомологичных генов в З'-концевых областях геномных РНК карла- и потексвирусов очень схожи, что позволяет по аналогии с потексвирусами предположить возможность экспрессии З'-дистальных цисТронов карлавирусов с соответствующих субгеномных

РНК.

Нами был проведен анализ нуклеотидной последовательности РНК ЕБХ, который позволил выявить явно выраженную гомологии участков, расположенных к 5'-концу от инициаторкых кодонов генов 25К-белка, белка оболочки и 12,6К-белка ВВХ (Рис.10). Гомологичные участки, найденные перед AUG-кедонами 25К-белка и белка оболочки очень похожи на ранее наблюдаемые у МЗК (Rupasov et al., 1989). При анализе аналогичных областей РНК других известных карлавирусов выявилось наличие высококонсервативного консенсуса C/UUUAGGU (см. Рис.10), расположенного к 5'-концу от AUG-кодонов генов 25К-белка и белка оболочки. Во всех РНК карлавирусов, последовательность которых определена на сегодняшний день такой консенсус найден только 8 двух, вышеуказанных районах. Исходя из этого можно предположить, что этот консенсус вероятно важен для инициации синтеза субгеномных РНК карлавирусов.

Интересна найденная гомология между вышеописанными районами и нетранслируемым районом, локализованным между генами белка оболочки и 12,6К-белка. Поскольку ни у одного карлавируса, последовательность РНК которого известна к настоящему времени, не найдено аналогичного нетранслируемого района, мы считаем возможным сделать предположение о существовании еще одной сгРНК длиной около 450 нт с которой мог бы экспрессироваться 12,6К-белок.

2.5.2. Анализ нетранслируемых районов ВВХ.

В установленной нуклеотидной последовательности РНК ВВХ обнаружено четыре нетранслируемых района. 5'-проксимальный нетранслируемый район длиной 33 нт локализован между генами репликазы и тройного блока. Второй - длиной 54 нт - между тройным блоком генов и геном белка оболочки. Третий - длиной 15 нт - между генами белка оболочки и 12,бК-белка. Четвертый нетранслируемый район длиной 86 нт (без поли-А) локализован на З'-конце РНК ВВХ.

Нами было проведено сравнение З'-концевых нетранслируемых районов известных на сегодняшний день карлавирусов. Выделяемый ранее-возможный сигнал полиаденилирования AAUAAA присутствует только у МВК и SBXen. Следует однако заметить, что для всех приведенных последовательностей характерен высококонсервативный домен UUUl)AA**UAU*UUU.

Анализ З'-концевых нетранслируемых районов РНК карлавирусов с помощью компьютерной программы DNASIS (Farmacia) показал, что все они способны укладываться в характерную вторичную структуру, включагцую элементы ствола и петли (данные не приводятся). Исходя из этого можно

ВВХ 12.6К AUUgcgAAUAauaagAcaUUauaaAGUaGUAG—UUGaUAUAUGGAUGUGaUUGUgAAGAUg ВВХ 25К AUUuaaAAUACgCUUAGGU-UGU-AGcuaUAGGAUUGUUAUAUGGAUGUGUUUGUaAAGAUu ВВХ БО AUUagugAUACuCUUAGGUUUGUgAGUgGUuaGAUcGUUAUAUuugaauuuuagucacuAUG

И8К 25К CUUAGGU - 22 HT - AUG

НЗК БО UUUAGGU - 26 HT - Я05

SBK 25К CUUAGGU - 26 IIT - AUG

SBK БО UUUAGGU - 39 HT - Ж

БЕЛ 25К CUUAGGU - 19 HT - AUG

БВЛ БО UUUAGGU - 43 HT - Ш

SBX БО UUUAGGU - 41 HT - AUG

Рис.10. Сравнение нуклеотидной последовательности перед AUG кодоном гена 25К-белка ВВХ с таковыми 12,6К-белка и белка оболочки. Совпадающие нуклеотиды даны высоким шрифтом. Консервативная последовательность C/UUUAGGU перед инициаторными кодонами генов 25К-белков и белков оболочек показана также для.других карлавирусов. Пропуски (-) введены для достижения максимального сходства.

46К— .

■ _ ____• ■ а. ,?

зок—

С") .

21.5К—-

14.ЭК—

1 2 3 4 5

Рис.11. Трансляция копированных РНК-транскриптов, содержащих участки генома ВВХ в лизате ретикулоцитов кролика. Дорожка 1 - реакция без матрицы (отрицательный контроль); дорожки 2, 3, 4 и 5 - трансляция РНК-транскриптов, полученных с плазмид рСУВ272/4, рШ272/7, рШ272/9 и рСУВ-СР, соответственно. Положение маркерных белков отмечено слева.

сделать предположение, что такая кокф/гурация РНК карлааирусов на З'-конце может иметь значение для репликации РНК.

5.6. In vitio трансляция синтетических РНК, содержащих фрагменты

генома 6ВХ.

Используя ДНК-зависимую РНК-полимеразу фага SP6 с ллазмид

pCVB272/4, pCVB272/7 и pCVB272/3 были получены кэпироаанные

РНК-транскрипты, представляющие собой фрагменты генома ВВХ,

начинающиеся от AUG-кидоноз 25К-, 12К- и 7К-белков, соответственно, и

14

заканчивающиеся в области участка полиаденилирования. Меченые С продукты трансляции РНК-транскриптов разделялись электрофорезом 8 ПААГ по методу Schagger & von Jagov ( 1987) и визуализировались радиоавюграфией (Рис.11).

При трансляции РНК-транскрипта, начинающегося от AUG-кодона 25К-белка синтезируются по меньшей мере три (¡елка размером около 38К, 26К и 6К,размер которых коррелирует .с размерами белка оболочки, 25К-бепка и 7К-бглка, рассчитанными по их ы:;:нскислотной последовательности. При трансляции РНК-транскриптов, начинающихся от AUG-кодонов 12К- и 7К-белков синтезируются по меньшей мере два белка -белок оболочка и 7К-белок. Кроме того, можно видеть также некоторые минорные белки, представляющие собой продукты распада белка оболочки под действием протеаз.

В приведенном эксперименте нам не удалось обнаружить синтеза 12К-белка, что имеет свое объяснение. Дело в том, что в состав лизата ретикулоцитсв кролг.ка входит большой процент гемина, являющегося сильным супрессором ингибитора фактора инициации EIF2a. В отсутствии гемяна синтез белка в лизате ретикулоцитов прекращается после короткого промежутка времени (Jackson & Hunt, 1933). Гемин, мигрируя в полиакриламидном геле ксщным фронтом как раз на уровне 12К-белка по-видимому просто размывает его.

Тот факт, что при in vitro трансляций описанных РНК-транскриптов синтезируются одновременно несколько белков свидетельствует о том, что РНК СЗХ по-видимому представляет собой полицистронную матрицу, т.к. направляет синтез нескольких независимых полипептидов. Аналогичные результаты были получена Канюка (1991) в экспериментах по трансляции тройного блока генов М8К. Исходя из вышесказанного можно предположить, что возможным механизмом трансляции является независимая внутренняя инициация, при которой рибосомы связываются с 5'-концом mWK и сканирует матрицу в попках инициьторных кодоное, с равной степенью вероятности связываясь с инициаторными кодонами 5'- и З'-концевых

цистронов.

ВЫВОДЫ

1. Получен банк клонов, содержащих в плазмидных векторах кДНК РНК двух карлавирусов - МВК и ВВХ.

2. При сравнительном анализе последовательностей 6000 5'-концевых нуклеотидов геномной РНК МВК и 3426 З'-концевых нуклеотидов геномной РНК ВВХ установлена общая схема организации генома карлавирусов.

3. Анализ первичной структуры потенциальных белков показал, что крупный 5'-проксимальный цистрон в 5'-концевой области геномной РНК карлавирусов является . геном потенциальной РНК-зависимой РНК-полимеразы; З'-проксимальный цистрон кодирует белок, обладающий свойством связывать нуклеиновые кислоты, а четыре других цистрона, локализованных во внутренней области генома, кодируют 25К-, 12К-, 7К-и 35К-белки, имеющие высокий уровень гомологии с соответствующими белками потексвирусов.

4. Сконструирована плазмида, содержащая ген 35К-белка ВВХ. В эксперименте по in vitro трансляции доказало, что этот ген кодирует белок оболочки вируса.

5. С 'помощью in vitro трансляции биохимически идентифицированы неструктурные продукты З'-проксимальных ОРС генома карлавирусов.

Основное содержание диссертации отражено в следующих работах:

1. Morozov S.Yu., Kanyuka K.V., Lcvay K.E. & Zavriev S.K. The putative RNA replicase of potato virus M: ovious sequence similarity with potex- and tymoviruses. // Virology - 1990- V.179 - P.911-914.

2.- Zavriev S.K., Kanyuka K.V. & Levay K.E. The complete nucleotide sequence and gene organisation of potato virus ,H genomic RNA. // Abstracts of the VIHth International Congress of Virology -Berlin, Germany, 26-31.08.1990 • P.m.

3. Завриев C.K., Канюка K.B. и Левай К.Э. Структура генома карлавирусов: M вирус картофеля.// Тезисы всесоюзной конференции 'Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства". - Алма-Ата, октябрь 199• С.ЗО.

4. Zavriev S.K., Kanyuka K.V. & Levay K.E. The genome

organization of potato virus M RNA. // Journal of General Virology -1991 - V.72- P.9-14.

5. Zavriev S.K., Kanyuka K.V. & Levay K.E. The genome structure of carlaviruses. // Abstracts of the FEBS Advanced Course: 'The Plant Virus Genome: Structure and Expression". - Riga, USSR 29.04.-5.05. 1991 ■ P.19.

6. Заврнев C.K., Канюка K.B. и Левак К.Э. Полная нуклеотидная последовательность геномной РНК М-вируса картофеля. // Молекулярная биология - 1991. - Т.25, ■ С.761-769.

7. Lev ay K.E. & Zavriev S.K. Nucleotide sequence and gene organization of the З'-terminal region of chrysanthemum virus 8 genomic RNA. //Journal of General Virology - 1991 - V.72 - P.

Подписано в печать 13.11.91. Заказ 629 Формат 60x90/16 Тираа 100

Москва. Типография ВАСЖ-Ш