Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация генов системы рестрикции-модификации EcoRII

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация генов системы рестрикции-модификации EcoRII"

г г о од

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

на правах рукописи УДК 577.123:577.117.2:577,152.211

РЕПИК АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ ЕсоИП'

(03.00.04-БИ0ХИМИЯ)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-1994

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии Наук.

Научные руководители: доктор биологических наук Я.И.Бурьянов Официальные оппоненты: доктор биологических наук А.Л.Мазин

Ведущее учреждение: Филиал Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина Российской Академии Наук.

на заседании Специализированного Совета Д.002.69.01. при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, по адресу: 142292, Московская область, г.Пущино-на-Оке.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

кандидат биологических наук А.А.Зимин

Защита состоится

1994 года в часов

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

В.М.Вагабов

Актуальность темы исследования. Диссертационная работа посвящена изучению структурно-функцинальной организации генов системы рестрикции-модификации Ecorii. За прошедшие со времени открытия явления рестрикции - модификации четыре десятилетия интерес исследователей к нему не ослабевает. Получены данные о роли метилирования ДНК в репликации, репарации ДНК, возникновения в ее структуре "горячих точек", в регуляции экспрессии генов. Ферменты рестрикции - модификации н-типа нашли широкое применение в научно-исследовательской практике,как инструменты для получения ре-комбинантных ДНК, при физическом картировании и определении первичной структуры ДНК. Исключительный интерес также представляет использование этих ферментов, отличающихся высокой специфичностью взаимодействия с ДНК, в исследовании такой фундаментальной проблемы молекулярной биологии, как механизм белок-нуклеинового узнавания. В связи с этим клонирование и определение первичной структуры генов, компьютерное моделирование, функциональный анализ ферментов рестрикции-модификации направлены на решение важных эволюционных и молекулярно-биологических вопросов. Полученная информация о структурно - функциональных свойствах ферментов и ее анализ открывают возможности разработки подходов к белковой инженерии ферментов рестрикции-модификации.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работа заключалась в изучении структурно-функциональной организации генов, входящих в состав системы рестрикции-модификации Ecorii. В задачу исследования входило определение первичной структуры гена рестри-кционной эндонуклеазы Ecorii, изучение экспрессии генов системы рестрикции - модификации EcoRH, функциональный анализ деле иконных вариантов метилазы, компьютерный анализ первичных структур генов и построение на его основе модели модификации ферментов.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые была определена первичная структура гена рестрикционной эндонуклеазы R.EcoRii и было показано, что система рестрикции-модификации Ecorii имеет конвергентный тип организации генов. Перед рестриктазным геном обнаружена трансляционная рамка для предполагаемого гена С. Изучена экспрессия генов ДНК- метплтрансферазы и эндонуклеазы в сопряженной прокариотической системе транскрипции-трансляции in vivo. Обнаружена строгая скоординированность их экспрессии. Исходя из анализа первичной структуры рассмотрены возможные механизмы их согласованной регуляции. Получены деле-ционные варианты гена ДНК-метилтрансферазы m.EooRII, изучена их экспрессия в системах in vivo и in vitro. Проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей генов системы рестрик-

цщ - модификации EcoRll. В ходе анализа вариабельных районов ме-гилгрансфераз M.EcoRii, M.dcm, M. NlaX, M.SPR и первичной структуры гена рестрикционной эндонуклеазы EcoRll обнаружены два района гомологии. Впервые среди систем рестрикции-модификации П-типа цри сравнении генов EcoRll системы обнаружен межмолекулярный район гомологии в составе тех аминокислотных участков, которые вовлечены в процесс сайт - специфического взаимодействия с ДНК. При анализе первичных структур гена r.Ecorii (ccwgg), а также ряда генов рестрикционных эндонуклеаз с близкой специфичностью R.Mspl (ccgg), r.smal (cccggg), r.CfrBi (ccwwgg) найдены сходные аминокислотные мотивы в их составе.

Научно-практическая значимость. Подученные в диссертационной работе данные расширяют современные представления о структурной организации и молекулярной эволюции генов, входящих в состав систем рестрикции-модификации. Результаты работы имеют также определенный практический интерес. Дальнейшее развитие современной биологической науки и ее прикладных аспектов во многом зависит от доступности широкого ассортимента ферментов рестрикции-модификации с различной субстратной специфичностью. В связи с этим весьма вероятно, что в ближайшие годы бежовая инженерия ферментов рестрикции-модификации будет магистральным направлением в решении проблемы белок-нуклеинового узнавания.Полученные данные по структурно-функциональной организации генов и ферментов системы рестрикции-модификации EcoRll, обнаружение консервативных аминокислотных остатков в составе ДНК-узнающих доменов позволяют построение модели модификации белков с целью изменения их специфичности.

Апробация. Основные положения диссертационной работы были представлены на конференции молодых ученых НЦ АН СССР (г.Пуиино, 1987 г), на I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (1991 г.), на v-ой конференции Российской Федерации " Новые направления биотехнологии " (1992), FASEB Summer Research Conference, Restriction Endonucleases and Modification Methyl-transferases ¡Structure and Mechanisms, Vermont, USA, (1993).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано семь печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 122 страшщах , состоит из введения,обзора литературы,описания материалов и методов исследования , обсуждения реультатов и выводов. Работа содержит 22 рисунка и 8 таблиц. Список цитируемой литературы состоит из 195 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Определение первичной стуктуры гена рестрикционной эндонуклеазы R.EcoRII.

1.1. Получение делеционных вариантов для определения первичной структуры гена R.EcoRII.

Задача первого этапа работы состояла в уточнении границ локализации эндонуклеазного гена, а также в получении делеционных вариантов для определения первичной структуры гена R.EcoRII. Первичная структура гена метилазы м.ЕсоКИ была определена в лаборатории д-ра Фридмана ( s.som et.al., 1987 ). Для получения делеционных вариантов были использованы плазмиды pKR2 и pKR9 . Эти плазмиды состоят из вектора рис19, в Pstl сайт которого был встроен фрагмент, содержащий гены системы рестрикции - модификации EcoRH в двух ориентациях по отношению к lac-промотору. Путем де-летирования отдельных участков Pstl - фрагмента плазмид pKR2 и рка9 был получен набор рекомбинантных плазмид . Вариант pER2i был получен путем делетировакия Banfll - фрагмента ( 700 п.н. ) в составе исходной плазмиды pKR2. Полученный делеционшй вариант pKR2i был проверен на способность ограничивать и модифицировать фаг in vivo. Как показал данный, анализ потеря плазмидой pKR2 BamHl фрагмента приводила к инактивации гена эндонуклеазы EcoRH, моди-фикащюнная активность сохранялась.Согласно данным работы (s.som et.al.,1987), встраивание транспозона Тп5 приблизительно 300 п.н. ниже сайта stul также приводит к инактивации гена R.EcoRII. Исходя из этих данных был сделан вывод о том, что ген рестрикционной эндонуклеазы EcoRH расположен в пределах Sphl - BamHl фрагмента . Затем наш был получен ряд делеционных вариантов Pstl -фрагмента плазмид pKR2/pKR9, которые были непосредственно использованы для определения первичной структуры гена R.EcoRII по методу Максама - Гилберта. Для определения первичной структуры гена r.Ecorii по методу Сэнгера, были получены Sau3A I-фрагменты, которые встраивались в BamHl сайт вектора М13тр8.

1.2. Определение и анализ первичной структуры гена R.EcoRII.

Определение первичной структуры гена R.EcoRII проводилось в основном с использованием метода Максама-Гилберта, часть последовательности была определена методом Сэнгера. Стратегия секвениро-вания представлена на рис.1. Была определенд-первичная структура фрагмента длиной 1627 п.н. В нашей-статье опубликована часть первичной последовательности с 234 по 1627 п.н.' ( Kossych et al., 1989).С помощьй программы Microgenie нуклеотидная последователь-

3

Sau3AI Sau3AI Kamill Sau3AI

^ S^u3AI ^B|tEII |l|iJIH Sau3|U Spb^_Sau^AI

B-EcoBll-

О Й00 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Рис.1. Стратегия определения первичной структуры гена r.EcoRII. — метод Максама-Гилберта, * — метод Сэнгера.

ность была проанализирована в б-ти рамках считывания с целью поиска трансляционной рамки для белка, состоящего более, чем из 300 аминокислотных остатков. Была обнаружена лишь одна рамка длиной 1212 п.н., которая находилась на комплементарной цепи в противоположном направлении транскрипции к метилазному гену (рис.2). В положении 378 и 384 в одной трансляционной рамке расположены два аминокислотных остатка метионина. Мы считаем, что инициирующим ATG кодоном является аминокислотный остаток в положении 384. С помощью сотрудников ИБ РАН Каашарова И.А. и Винокурова л.М была определена аминокислотная последовательность первых восьми аминокислотных остатков эндонуклеазы R.EcoRII. полученная в ходе анализа последовательность Ser-Val-Phe-His-Asn-X-Leu-Leu совпадает с последовательностью аминокислот исходя из первичной структуры ДНК, начиная со второго аминокислотного остатка, то есть происходит пострансляционное удаление остатка метионина. Инициирующий трансляционный atg и терминирующий tag кодоны разделены фрагментом ДНК длиной 1206 п.н. На открытой трансляционной рамке может кодироваться белок с расчетный молекулярным весом 45234 Д. Расчетный вес бежа хорошо согласуется с данными SDS-электрофореза гомогенного препарата бежа и данными, полученными нами при изучении экспрессии генов системы рестрикции-модификации ecoRII в сопряженной системе транскрипции -трансляции in vivo (рис. 4). Анализ нуклеотидной последовательности показал почти равный состав нуклеотидных пар в составе гена R.EcoRII а+Т (50,6$) и о+с (49,4$), что характерно для типичных генов e.coli. На расстоянии 7 п.н. от инициирующего atg кодона расположена предполагаемая последовательность Шайн - Дельгарно tm—ggg. Анализ нуклеотидной последовательности перед геном эндонуклеазы выявил два возмож-4

ctgcagcccggcatcaggggcgaggtgcgcttgtggagagagctittggcattgggccct 60

** ****** merafgigps cggcgctgcacggaggccatgggcatgctcaaccaccamtcgcagcagccgcctgatcg 120

ALHGGHGHAQPPFRSSRIIG

gcgcagagcgacagcctacctctgactgccgccaatctttgcaagagagcctccgtcgcc 180

aerqptsdcrqsiqqslrrh atgctcacctggctttggtgcacacgagtattgagcatagtcgagattggtgcagatcac 240

ahi/alvhtsiehsrdwcrsl ttctgatattgaactgtcaggagctggctgcacaacagccattacgcccaatcaactggt 300 l i l q e l a a q1qg plrpinwc

gcagtcgtcttctgaaaatgacactgotgtatataatcatgaaaaaatggtgagtagag 360

SRLLKMTbPVYUHEKMVSRV titcagggtaacaggggatgcttatgtcggttttccacaactggctacrrgagatcgcat 420

s g m s- v- p- h- ij- w- b- l- e i а с

gtgagaattacmcgtctacaicaaacgcctttccgccaacgataccggcgcaacaggtg 480

ehyfvyikrlsandtgatgg gtcaccaggtagggctctatatcccttcaggtatcgttgaaaaactctttccgtctatca 540

hqvglyipsgiveklfpsin accaracccgtgaactgaacccttcggtttttctcaccgcacatgtgtcatcgcatgatt 600 htrelhpsvfltahvsshdc

gccctgacagcgaagccagggcaatttattataacagccgtcattttggtaaaacccgga 660

pdsearaiyynsrhfgktrn

atgaaaaaaggattacccgctggggtagaggcagcccacttcaggatcctgaaaasacag 720 ekritrwgrgsplqdpeiítg

gggctctgacgctcctggccttcmgcttgatgagcaagggggggactgtaaggaagtaa 780

altlla?kldeqggdckevh atatttgggtatgcgccagcactgatgaagaggacgtcattgagaccgctattggtgaag 840

iwvcastdeedvietaigev ttatacccggagcgcttatatccggccccgcaggacagattctaggcggactatctctac 900

ipgalisgpagqilgglslq agcaagcgccagtaaatcataaatatattctacctgaagactggcacctgcgcmccgt 960

qapvwhkyilpedwhlrpps cgggmgtgaaattattcagtatgcagccagccatl'atgtgaaaaattccc'ttgatccgg 1020

gseiiqyaashyvkijsidpd atgagcaacitcttgaccgccggcgcgtggagtacgacaiatttctattggtrgaggaac 1080 eqlbdrrrveydiplbveeb

tgcatgttgtggatatcatccggaaaggatttggctctgtggatggatttattgcgctga 1140 hvldi irkgfgsvdgfialt

ccaattctgtcagcaatcgccgtaaatccagIgccgggaagtcgctggaactgcacCTGg 1200

nsvsnrrksragkslebhle

agcatctattcattgagcacggcctccgacactttgcgacgcagaccatcacagaaggta 1260 hlfiehglrkfatqtitegn

ataaaaaacccgatt'tccttttcccttccgcaggggcttaccacgatactgagrttcccg 1320

kkpdfbfpsagayhdtefpv tagaaaatctgcgcatgctggcagtcaagaciacctgtaaggatcgctggcgtcagatac 1380

ehlrmlavkttckdrwrqil tgaatgaggccgataaaattcatcaggtgcatctgittacactccaggagggagtttctc 1440 neadkihqvhlftbqegvsl

tggctgaatatcgggagatgcgggagtcgggtgtcagattggtcgtgccatcatctctgc 1500

aeyremresgvrlvvps5lh acaaaaaatacccggaggcggtgagagctgagctaatgaggctaggtgcgtttattgctg 1560

kkypeavraelmtlgafiae agctgacagggctttacgcagatattccatagatratcrcccggcataaataccgggagg 1620

btglyadip agcgatc

Рис.2. Первичная структура гена С и гена рестрикционной эндонуклеазы R.EcoRll.

ных кандидата на роль -10 .и -35 области промоторов Е.соН (татаат, стйААА), которые разделены участком ДНК длиной 15 п.н. Терминирующие трансляционные кодоны гена рестрикционной эндо-нуклеазы и ДНК-метилтрансферазы ЕооИН разделены 32 п.н., расположены на комплементарных цепях в основании инвертированного повтора. Кандидатом на роль йю-зависимого транскрипционного терминатора является ос-богатый инвертированный повтор в межгенной области (рис. 3). В ходе анализа нуклеотидной последовательности района, предшествующего эндонуклеазному гену, обнаружена открытая трансляционная рамка для белка, состоящего из 112 а.о. Инициирующий трансляционный ств (33 п.н.) и терминирующий ТАА (369 п.н) кодоны разделены фрагментом ДНК длиной 336 п.н. На открытой трансляционной рамке может кодироваться белок с расчетным молекулярным весом 12719 Д. В области ДНК, предшествующей данной рамке на расстоянии 5 п.н. от инициирующего кодона находится предполагаемая Шайн - Дельгарно последовательность сс-оаоотс. Терминирующий трансляционный кодон таа перекрывается с последовательностью Шайн-Дельгарно гена к.Есоби. в ходе анализа нуклеотидной последовательности перед геном не обнаружены кандидаты на роль -10 и -35 областей промотора. Возможно, что транскрипция гена С происходит с промотора, расположенного на плаз-мвдном векторе. Одновременно с наш изучением системы рестрикции-модификации ЕсойИ, в том числе и определением первичной структуры, занималась исследовательская группа в США (В1иицча1; е-и а1., 1490). При сравнительном анализе были обнаружены ряд различий в двух вариантах первичной структуры гена й.Еоойи, которые представлены на рис.2 и в таблице 1.

Таблица 1. Положение нуклеотидов,различающихся в двух вариантах первичной структуры.

Измененные нуклеотйды Нуклеотида ,

Позиция Замена Замена оставленные без изменений Нуклеотида нуклеотида аминокислоты

124 деления N

130 вставка G

327 делеция с

737 А - G 682 вставка G

1172 G - А 717 делеция с

1197 Т - С Ser-Leu 1126 G

1198 С - Т 1140 А

1308 G - А Ala-Thr 1245 1446 А G

Таким образом, система рестрикции - модификации ЕсоЕШ имеет конвергентный тип организации генов (рис.3). 6

н ЕеоНИ

сататтссатаоаттатстссссосатааатасссосаооа&ссатсасат

с 'В ЕсоЯН

ЕеоЯИ ^ и Егпрц

ЕсоЯИ ЕсойИ ЕсоРН ЕсоВН ЕооЯП .

Л

врЫ Н(гк»Ж1пЛ1

500 1000 1500 2000 2500 3000

Рис 3. Структурная организация генов системы рестрикции-модификации ЕооИП. Межгенный участок Р-М системы ЕсоЕН;— инвертированный повтор, - терминирующие трансляционные кодоны, С - ген С, й.ЕсоКП-ген рестрикционной эндонуклеазы, м.ЕооЫГ - ген ДНК - метилазы.

2.Изучение экспрессии генов системы рестрикции-модификации ЕсоНП в прокариотической сопряженной системе транскрипции-трансляции.

Штамм Х925-продуцент "мини-клеток" был трансформирован плазми-дой рКК2. Плазмида состоит из вектора рис19, в Ре« - сайт которого встроен фрагмент, содержащий гены ЕсоМ1 системы. После ме-чения [353]-метионином белков, кодируемых плазмидными генами, образцы анализировали в 8-18% Бпг-злектро^юрезе и проводили радиоавтографию (рис.4). На радиоавтографе видны четыре полосы, две

Рис.4. Изучение экспрессии генов системы рестрикции-<- М.ЕсоНН модификации ЕооИН в сохгря-женной системе транскрипции-трансляции.

<- И-ЕсоИН

<- 1ас1;*

из которых являются двумя формами лактамазы (31 и 28 КД). Полосы с молекулярным весом 58 КД и 44 КД соответствуют продуктам генов м.ЕооНИ и Н-ЕооНП. Эти данные хорошо согласуются с молекулярными весами, полученными при вББ - электрофорезе гомогенных белков м.ЕсоИ1 и й.ЕооНИ (Косых В.Г. и др, 1982). Анализ данных денситограммы с последующей коррекцией количества метионина для каждого гена ( в составе гена ы.ЕсоИХ - 6 а.о., н.ЕсоХШ- 4) свидетельствует о наличии контрольного механизма сбалансированной экспрессии генов данной системы, поскольку уровень экспрессии ме-тилазы к рестриктазе равен 1:1.

3.1. Получение делеционных вариантов генов EcoRII системы и изучение их экспрессии в системах in vivo и in vitro.

Рекомбинантная плазмида рккгг, содержащая фрагмент ДНК с интактным геном м.EcoRII, была получена путем делеции в составе плазмида рКЕ2 Pstx-Sphl-фрагменга. В плазмиде pKR22 был делегирован ген С и часть гена R.EcoRII.

PKR2 М+Е+

о 500 1000 _1500_аооо_zsoo_зооо

ркнзо

Прямой праймер (35 н.)

5' MSEFELLA3'

TCTGCGTCGACGATGTCTGAATTTGAATTACTGGC

Sali TGA

3'GCACGTTCCMCTTGCTTAGACTCCTAGGAGCTG 5' Обратный праймер (34 н.) BamHI

PKR23 М.EcoRII

A G F Р С R X BamHI Kpnl SacI EcoRI

GCAGGTTTCCCCTGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC pUC19 -----л л----------------------------

Рис.5.Схема получения делеционных вариантов гена ДНК -метилтранс-феразы EcoRII.Плазмида pKR23 с делецией в С-концевой части гена М.EcoRII. - новый терминирующий кодон ,ХХХ- полилинкер PUC19.

Таблица 2.Рестрикция и модификация in vivo фага Л. клетками рекомбинантных штаммов E.coli. Эффективность роста фага \ на штаммах E.coli

В834/pKR2 B834/pKR22 B834/pUC19 B834/pKR2 B834/pUC19 (M+.R+) (M+.R-) (M-.R-) (M+.R+) (M-.R-)

Специфичность Специфичность

фага фага

A. B834/pKR2 1 , 1 1 \ B834/PKR2 1 1

\ B834/PÜC19 1 х10 1 1 \ B834/pXR22 1 1

\ B834/PUC19 1x10 11 1

Как видно из таблицы 2, степень рестрикции in vivo фага выращенного на штамме е.coli В834, идентична при высеве на штаммы E.coli B834/pKR22 и E.coli B834/pUCl9 и отличается на четыре порядка от E.coli B834/pKR2, содержащем систему рестрикции -модификации EcoRH. Таким образом, в варианте E.coli В834 /рКК22 отсутствует эндонуклеазная активность. При этом модификационная активность сохраняется, так как титр фага, выросшего на E.coliB834/ pKR22, идентичен при высеве на штамм с Р-М системой EcoRii (E.co-

li B834/pKR2) и на штамм без данной системы E.coli В834/риС19.Для анализа гена метилазн в прокариотической системе транскрипции -трансляции in vivo плазмида pKR22 была трансформирована в штамм Х925. После мечения [^s] метионином и анализа в 8-18% ПААГ, проводили радиоавтографию. В качестве контроля были использованы штаммы E.coli Х925 с рекомбинантными плазмидами pKR2 с полной Р-М системой генов EcoRli и рис19 -без данной системы ( Рис. 6). На

Рис.6.Изучение экспрессии гена метилазн M.EcoRii в составе прокариотической сопряженной системы транскрипции - трансляции.

А-х925/рТО19,B-X925/PKR2, C-x925/pKR22.

<-M.EcoRII <-R.EcoRII

<-lact* <-lact

A

Б

С

радиоавтографе ( вариант рКК22 ) была обнаружена дополнительная полоса с молекулярным весом 58 КД, которая принадлежит продукту метилазного гена. Следует отметить различную интенсивность по-

9

лос на радиавтографе метилазного гена для вариантов pKR2 (m+,r+) и pKR22 (M+R-), что может говорить о снижении экспрессии метилазного гена в случае делеционного варианта.

Функциональная активность бежа (т.е.способность к метилированию цитозина) была проанализирована также в системе in vitro. Проводили метилирование лососевой ДНК бесклеточными экстрактами штаммов Е. coli В834/pKR22, В834/pKR2,В834/pUC 19 и последунций хро-матографический анализ проводили согласно метода (Butkus V.et al. 1985). Радиоактивность в пробе с B834/pKR22 (отдельно клонированный ген метилазы) в основном мигрировала вместе с маркерным 5-ме-тилцитозином Rf(0.29)• Следует отметить, что при этом наблюдается снижение включения радиоактивной метки в состав 5-метилцитозино-вой фракции гидрожзата ДНК в 2,64 раза (11810 тш/тт) в случае делеционного варианта B834/pKR22 в сравнении с контрольным штаммом B834/PKR2 (31200 имп/мин), содержащим рекомбинантную плазмиду с полной системой генов рестрикции - модификации EcoRll.

Как следует из данных, полученных при изучении экспрессии гена метилазы EcoRll (плазмида pKR22), в системах in vivo и in vitro происходит экспрессия полноразмерного, интактного белкаметила-зы, который сохраняет как функциональную активность, так и сайто-вую специфичность. При этом делеция Psti-Sphi фрагмента, содержащего ген С и часть гена R.EcoRli в составе плазмвды pKR2, приводит к снижению экспрессии метилазного гена.

Нами также была сконструирована плазмида pKR30, содержащая кодирующую часть гена M.EcoRii. Используя метод Полямеразной Цепной Реакции была амплифицирована часть гена M.EcoRii (1434 н.п.), заключенная между инициирующим ATG и термикирукрм TGA трансляционными кодонами. Амплификация гена была выполнена с помощью прямого и обратного праймеров в соответствии с рекомендациями фирмы "Perkin Elmer-Cetus" ( рис. 5 ). После 25 -циклов амплификации с помощью препаративного электрофореза выделяли фрагмент ДНК размером 1445 н.п., содержащий ген M.EcoRii и проводили гидролиз рестриктазами BamHi и Sali. После лигирования с вектором рис19 ( также гидролизованным ферментами BamHl, Sail) ДНК трансформировали в компетентные клетки штамма E.coli В834 и отбирали клоны, содержащие плазмиду размером 4119 п.н. Как показал анализ в системе in vivo , полученный вариант метилазы сохраняет функциональную активность. Делеционный вариант гена метилазы EcoRll представляет интерес, как объект для белковой иженерии, а также для переноса в эукариотические системы с целью изучения влияния дополнительного метилирования ДНК in vivo на 10

ряд основополагающих процессов жизнедеятельности эукариотической клетки.

Нам не удалось получить жизнеспособные клоны, содержащие отдельно функционирующий ген зндонуклеазы EcoRlI, путем делеции плазмиды pKR9 с ферментом Hindll ( при этом инактивируется ген M.EcoRii). Сотрудниками лаборатории Д-ра Фридмана, Колд Спринт Харбор(США), также был показан летальный эффект экспрессии эндо-нуклеазного гена при инактивации метилазного гена путем встраивания транспозона Тп 5 (Sora et. al, 1987). Эти данные говорят о том, что как и большинство эндонуклеаз Ii-типа экспрессия гена R.EcoRII в отсутствии метилазного гена является гибельной для жизнедеятельности клетки.

3.2. Получение делеционного варианта гена ДНК-метилазы EcoRII

и изучение его экспрессии в системах in vivo и in vitro.

В ходе выполнения работы нами был получен вариант гена мети-лазы EcoRII с делецией в С-концевой части. Рекомбинантная плазми-да pKR23 была получена путем гидролиза плазмиды pKR2 с эндонукле-азой Hindll. Делеция метилазы по Hindll сайту приводит к удалению около 60% ( 290 а.о) аминокислотных остатков с С-конца, при этом сохраняются первые два консервативных домена ( CEI, CEII ). В результате делеции происходит сдвиг рамки считывания,новый трансляционный терминирующий кодон расположен через 5 п.н. сразу после метилазного гена в составе полилинкера плазмиды püci9 (Рис.5).

При постановке эксперимента ставился ряд задач, связанных с косвенной проверкой модели эволюции ДНК-метилаз, построенной на основе дупликации гена предшественника (Lauster R.,1989). Согласно этой модели, декларирующей эволюционную взаимосвязь всех трех семейств ДНК - метилтрансфераз Ii-типа, формирование стуктурной организации бежов семейства моноспецифичных т5С- метилтрансфераз, к которому и принадлежит метилаза EcoRII, включало три последовательных этапа дупликации первоначальной стуктуры (ДНК или нуклеотид - связывающего белка с размером 15-20 КД). Два консервативных домена:домен CEI или GXG и домен CEII (dppy в случае m А-метилаз, либо tsppy для ш4С-метилаз, либо pc для m5 с -метилаз) играют ключевую роль в метилировании ДНК . Метилаза EcoRII - типичный представитель семейства моноспецифичных т5с-ме-тилтрансфераз, и в случае делеционного варианта pKR23 сохраняется GXG район и так называемый PC район, характерный только для класса m С - метилаз. При изучении делеционного варианта метилазы м.EcoRII возникал вопрос: насколько достаточно двух константных

II

доменов в составе белка для проявления функциональной активности фермента ? Для анализа делеционного варианта гена метилазы в системе "мини-клеток" плазмида рКЕ23 была трансформирована в штамм Х925. После мечения [35б] метионином и анализа в 12% ПААГ,

А Б Рис.7. Изучение экспрессии

делегированной формы гена метилазы м.ЕсоКИ в составе прокариотической сопря-жешой системы транскрипции -трансляции.

А-х925/рКЕ23,Б-Х925/риС19•

проводили радиоавтографию. В качестве контроля был использован штамм E.coii Х925 с рекомбинантной плазмидой рис19 (Рис.7). На полученном радиавтографе была обнаружена дополнительная полоса, соответствующая белку с молекулярным весом 22 КД, что совпадает с расчетным молекулярным весом исходя из первичной структуры. Таким образом, в клетке происходит экспрессия делеционного варианта метилазы EcoRiI.

Варианты В834/ркк2Э, а также В834/рКК2, В834/р0С19 (в качестве контроля) были проанализированы в системе in vivo по способности к модификации фаговой ДНК. Как видно из таблицы 3 титр фага X, выращенного на штамме E.coii B834/pKR23, был ниже на четыре порядка при посеве на E.coii B834/pKR2, содержащем систему рестрикции - модификации EcoRiI в сравнении с E.coii B834/pUCi9. Таким образом при проверке отобранного клона не было обнаружено модификационной активности с EcoRil - специфичностью.

Таблица 3.Модификация in vivo фага X клетками рекомбинантных штаммов E.coii.

Эффективность роста фага X на штаммах E.coii

Специфичность B834/PKR2 B834/pUC19

фага (M+.R+) (M-.R-)

X B834/PKR2 1 4 1

X B834/PKR23 1X10 7 1

X B834/PÜC19 1x10 4 1

При постановке эксперимента не исключался вариант релаксиро-ванного метилирования ДНК, т.е. метилирование цитозина в иной (отличной от EcoRii сайта) последовательности. В связи с этим, штаммы, содержащие плазмидо, pKR23 (делегированный вариант метила зы), а также pKR2 и рис19 (в качестве контроля), были проанализированы в системе in vitro. Метилирование лососевой ДНК бесклеточными экстрактами исследуемых штаммов выполняли согласно метода (Butkus V.V. et al.,1985). Хроматографию на бумаге проводили в буфере следующего состава: бутанол/вода/конц НН3 (84:15: 0.2, v/v), затем после высушивания и идентификации под ультрафиолетовым светом хроматограмму просчитывали в сцинтиляторе. Анализ проб после бумажной хроматографии не выявил какого-либо дополнительного метилирования ДНК в случае рккгз по сравнению с контролем.

Таблица 4. Локализация радиоактивности на хроматограмме кислотного гидролизата ДНК, метилированной бесклеточными экстрактами исследуемых штаммов E.coli.

Бесклеточные экстракты Включение сн3~групп в

E.coli В 834,содержащие цитозин и аденин ДНК

различные варианты ___(ими/мин)_

рекомбинантных плазмид модификация имп/мин Rf рестрикция in vivo фага А,

B834/PKR23 (М- R-) 157 (0.29)

95 тбС (0.46)

450 (0.53)

B834/pKR2 (М+ R+) 3II60 га4с (0.29)

87 (0.46)

486 т°А (0.53)

B834/pUC19 (М- R-) 148 пР.С (0.29)

80 ш5с (0.46)

490 т А (0.53)

Таким образом, для М.ЕсоНП сохранение консервативных аминокислотных блоков СЕ1, СЕН не достаточно для поддержания ме-тилцитозинтрансферазной функции фермента.

4. Структурная организация и возможные механизмы регуляции экспрессии генов системы рестрикции-модификации EcoRII.

Система рестрикции - модификации EcoRii имеет конвергентный тип организации генов. Сравнение частот встречаемости аминокислот метилазного и рестриктазного генов с частотами аминокислот в высокоэкспрессируемых генах E.coli позволяет отнести рестрик-тазный ген, как и метилазный , к типичным слабо экспрессируемым генам E.coli. В сильно экспрессируемых генах 23 кодона с частотой менее 5 на ЮОО, появляются в составе генов с суммарной частотой

13

36 на 1000 или 3,6$ (Gouy м.,1982). В рестриктазном гене данный показатель равен 26,5% ■ для метилазного гена- гъ,ъ% .

В экспериментах при получении суперпродукции ферментов Р-М системы EooRii была обнаружена согласованная экспрессия ДНК-метилазы и эядонуклеазы вне зависимости от расположения генов по отношению к внешнему промотору (lac.PI) (Косых В.Г., не опубликованные данные). Наши исследования в системах in vivo и in vitro штамма E.coli В834 с рекомбинантной плазмидой рКК22, содержащей ген метилазы, показали, что деления Pstl-Sphi района (содержащего ген С и часть R.EcoRii гена) приводит к снижению экспрессии метилазного гена. Таким образом, в системе Р-М системы EooRii имеется некий механизм, поддерживающий необходимый баланс данных белков в клетке. Для систем рестрикции-модификации (EcoRV, smai, BaraHi, Pvull) обнаружены гены - регуляторы. Гены расположены непосредственно перед эндонуклеазными, кодируют белки (80-100 а.о.), функционирующие в транс -положении, в их составе обнаружен ряд консервативных аминокислотных остатков. Аминокислотные последовательности семейства известных белков-регуляторов содержат "helix-turn-heiix"-мотив, характерный для класса ДНК-связывающих бежов (Тао Т. et.al.,1991)• Регуляция с ипользованием третьего гена обнаружена только у систем, которые имеют либо дивергентный, либо конвергентный тип организации генов. В ходе анализа нуклеотидной последовательности района, предшествующего эндонуклеазному гену, обнаружена открытая трансляционная рамка для белка (112 а.о) с расчетным молекулярным весом I27I9 Д. Полипептид содержит повы-шмпюе количество основных аминокислотных остатков (лизин - 2, аргинин - 12, гистидин - 8), что характерно для семейства ДНК-связывающих белков, в том числе и для регуляторных белков Р-М систем. При анализе последовательности ДНК, предшествующей эндонуклеазному гену, других трансляционных рамок подобного размера обнаружено не было. Наши эксперименты показали зависимость уровня экспрессии гена M.EcoRH от наличия или отсутствия Psti-Sphi фрагмента ДНК, в состав которого входит и трансляционная рамка гена С. Можно предположить, что эта последовательность участвует в регуляции экспрессии генов системы рестрикции-модификации EcoRll. Структурная организация района ДНК, заключенного между геном С и геном R.EcoRii, имеет много общего с подобными районами Р-М систем Smai, EcoRV, Pvull, Smai (Рис.8). Сравнительный анализ с известными регуляторными белками позволил обнаружить ряд консервативных аминокислотных' остатков в районе "helix - turn -helix" мотива (Рис.9). 14

EcoRV MSLRSDLINAL

CTTAAAGAAGTAATA^TfiiSXAAAAAAACATGAGTCTTCGTTCTGATTTAATTAAirGCACTA LKEVIMEKKHESSF л

Smal * * MSRDDQLFTLW

AAACTCCTAACiiGGCAGGGTiiAAAAAATGAGCAGGGATGACCAACTGT'rTACACTTTGG KLLTRQGLKNEQG —

PvuII „ MSHPALNELLE

ATATCAATACTAATGATGGAACACGAAAATGAGTCACCCAGATCTAAATAAATTATTAGAG ISILMMEHENESPRSK

BamHI ин „ MEVEKEFITDE

CAAMGAMiTOTGGGGGCAAATTAGAATGGAAGTAGAAAAAGAGTiM;A!M!ACTGATGAA Q К К

EcoRII ****** MSVFHNWLLEI

TAGAGmTCAGGGTlACAGGGGATGCTTATGTCGGTTTTCCACAACrGGCTACTTGAGATC R V S G

Рис.8.Районы перекрывания генов - регуляторов и соответствующих рестрикционных эндонуклеаз.Над нуклеотидной последовательностью изображены аминокислотные остатки, соответсвуюшие рестрикционным эндонуклеазам, ниже - аминокислотные остатки генов- регуляторов. ~~л-стоп-кодоны регуляторных белков,*** -участки гомологичные 3' -концу 16S рРНК.

EcoRV MPKKPIbGYPIbGCIIYKKNGKSMSVREIIKKNRVICKlSQG-EVAKAlG

smal mdikeilaenvrsyr-ninuxsqe-qlaeisg

pvuii msrtjthplsarltlaknvkkmr-gelglsqe-sladlvg

BamHI mtnhirlugqkvrqirlsksnmsqe-kiai'ecd

EcoRII MERAPGIGPSALHGGHGHACPPFRSSRIiIGAE-RQPTSDCRQSLCJQSIiRBHAHLA

. *.

RL A L Q Consensus LSQE LA G EcoRV KPQSYISKIEQGERRVDTOEFIAICPRIGIDPIN----TtKEVIMEKKHESSF-----

smal lhrtyigsverkernvtlstliiukalntsvpk----lltrqgikn-eqg-------

PvuII IHRTYIGSIERAERHlSIDNIERIAHAIiMVSISI----LMMEHENES-PRSK------

BamHI LHRTYISDIERGTRNVSLDNIEKISKALGVQPKD----LLDFTTIGHCEQKK------

ECORII LVHTSIffiSRDWCRSLLlLNCQEIiMQQPIjRPINWCSRIIiKMTIiPyYMHEKliVSRVSG . . *. *. . I II R

HRTYI IER ERHV

Рис.9 .Сравнительный анализ известных регуляторных белков систем рестрикции-модификации Ii-типа и предполагаемого белка с для системы Р-М EcoRII.

Модель регуляции экспрессии генов, разработанная для Р-М систем PvuII и Smal (Тао Т.,1991) приемлема и при объяснении регуляции генов EcoRII системы. Согласно этой модели при попадании в клетку экспрессия метилазного гена должна начинаться немедленно, рестриктазного гена - с задержкой.В начальный период транскрип-цияпредпочтительно начинается с промотора гена С. Возможно, что ¿случае системы рестрикции-модификации EcoRII, опережающая экспрессия гена С происходит на уровне взаимодействия последовательности Шайн-Дельгарно с рибосомой. Последовательность Шайн-

Дельгарно (gg-gaggtg), предшествующая инициирующему кодону гена С, имеет большую гомологию с канонической по сравнению с Шайн-Дельгарно последовательностью, расположенной перед рестриктазным геном (тла—ggg) . Возможно этот фактор оказывается решающим в ро--ализаг/л опережающей экспрессии гена С. Поскольку терминируюцчй кодои гена С (ТАА) перекрывается с предполагаемой Шайн-Дельгяуно последовательностью гена R.EooRii (таа—ggg), трансляция, которая г.?далась с гена-регулятора, должна мешать инициации транс щции рестриктазного гена. Накопление продукта гена-регулятора может приводить к увеличению транскрипции с внутреннего промототл, расположенного внутри рамки гена-регулятора, то есть к активации гена R.EcoRII.

Интересной особенностью обсуждаемой системы являемся неравномерное распределение сайтов ccwgg между генами (Fnc.2). Анализ первичной последовательности эндонуклеазного гена показал, что в состав гена входит 5-сайтов ccwgg для R. EcoRII( 485, 616, 734, 1196, 1424 ), в то время как в составе метилазного гена обнаружен лишь один сайт ccwgg . Возможно, что увеличение числа сайтов в рестриктазном гене, как и в случае r.tagi .связано с регуляцией экспрессии гена на уровне транскрипции. Аналогичное распределение узнаваемых сайтов в составе генов довольно редкое явление и данный тип регуляции не является общим для экспрессии генов Р-М систем и-типа.

Еще одним уровнем регуляции может быть субьедишчный состав активных форм рестриктазы и метилазы. ДНК - метилг:рансфераза EcoRiI, как и большинство других метилаз II- типа, является мономерным белком, в то время как эндонуклеаза активна в димер-ной форме. Исходя из данных о субьединичной организации и скоординированных уровнях экспрессии этих генов (1:'), полученных в экспериментах по изучению в составе сопряженной системы транскрипции-трансляции, можно объяснить упреждающее действие метилазы на собственную ДНК.

5.1. Сравнение аминокислотных последовательностей ДНК-метилазы и зндонуклеазы EcoRII.

Для поиска повторов в составе аминокислотных последовательностей метилазы и рестриктазы EooRll была использована программа Microgenie (Homology). Для гена М.EcoRII был обнаружен тройной повтор, расположенный рядом с NHg-концом метилазы EcoRII.

8 ALAGLN...ASPLEÜIEÜGLUXYS 14 М.EcoRII

43 ALA......GLULEUIEUARGLYS 48 M.EcoRII

75 AIAGLÜGLUGLUIEUIEÜARGLYS 82 M.EcoRII

Согласно гипотетической модели эволюции т6А-метилаз и ш5С-ме-тилаз этот участок встраивается в метилазу на 4 этапе и его деления не приводит к инактивации фермента. Для эядонуклеазы R.EcoRii обнаружен повтор в центральной и соои-частях.

248 GLY...PHEILEA1A...LEUTHR 253 R.EcoRII 388 GLYALAPHEILEAbAGLUIEUTHH 395 R.EcoRII

в вариабельном районе семейства т5с -метилаз были идентифицированы консервативные домены, ответственные за специфичность взаимодействия с ДНК. Мы провели сравнительный анализ вариабельных районов ряда ш5с - метилтрансфераз M.EcoRlK ccwgg ), M.dcm ( ccwgg ), M.NlaX ( сайт узнавания не установлен), m.spr ( ccwgg, ccgg, ggcc ) и аминокислотной последовательности рестрикционной эндонуклеазы EcoRll (/ccwgg) Рис.Ю. в случае изометиломеров (метилаз, узнающих и модифицирующих идентичные иуклеотидные последовательности) в вариабельных районах обнаружены три домена инвариантных аминокислотных остатков (А, Е, с). Два из них А и Е обнаружены в составе метилазы m.spr и рестрикционной эндонуклеазы EcoRll. в работах по сайт-направленному мутагенезу фаговой метилазы m.spr были охарактеризованы три домена в вариабельном районе, ответственные за сайт-специфичность узнавания на ДНК: домен Е - EcoRll, домен М - Mspl, домен Н - Haelll (Trautner Т.А.et.

37 а.о.

- район А -

M.SPR 203 P№RW'XAQSAATKRbKDblEEyVDEKiyMEI)KTNSb

M.HlaX 167 VDFRPPQPIGQATAVGDILEAYPDEKYTISDKLWQG-------YQKRKAETIRA

M.dcm 296 bRDISECFPAQRVI'LAQLbDPMVEAKYILTPVLWKYL------YRYAKKHQAR

M. EcoRII305 IRDISKPYPEQRPSFGELLEPWDSKYILTPKLTOL------YHYAKKHAAK.

R.BcoRII156 GAblS-GPAGQILGGLSLQQAPViiHKYllPEDWHbRi'PSGSEIIQYAASHYYK

консенсус .. .IS.....Q......Lle. .Vd.KYIL........1........YAk.H. .k

27 a.o. 19 a.o.

район E (CCA/TGG) район С

M.SPR 264 GNGMN-GNViHSSGEGISPTITTMKGEGEKIAyEY---------------

район M (CCGG)

M.SPR 230 KSGLGRElAVSHTLSASD'ÄRGbNRtIQKQHAW------------------

M.NlaX 215 GKGFGYGLF—NAESÄYTNTISARYYK----DGSEILIEQP-GKHPR---

M.dcm 344 GNGFGYGMVYPNNPQSVTRTLSARYYK----DGAEILIDRG-VffiMATGEK

M.EcoRI13 51 GNGFGFGLVHPENKESIARTLSARYEK----DGSEILIDRG-WDMATGET.

R.EcoRII240 RKGFGSVDGPIALTHSVSHRRKSRAGKSbElHSEHbFIEHGbRHFATQTI консенсус gnGPG..........SV. .tlsaR. .K........i____G____AT. . .

Рис 10. Сравнение методом множественного выравнивания вариабельных районов ДНК-метилтрэнсфераз M.EcoRll, M.dcm,

m.NlaX , m.spr и рестрикционной эндонуклеазы Ecorii.

al.,1988). Именно район Е ответственен за узнавание последовательности CCWGG. Обнаружение консервативных районов в составе генов M.EcoRll и R.EcoRII представляет определенный интерес по ряду причин:

- Это один из немногих примеров обнаруженных районов гомологии между метилазным и рестриктазным генами Р-М систем Н-го типа.

- Впервые среди Р-М систем н-типа при сравнительном анализе первичных структур генов системы рестрикции-модификации ЕооИН, обнаружен межмолекулярный район гомологии в составе тех аминокислотных участков, которые вовлечены в процесс сайт-специфического взаимодействия с ДНК ( домен Е-сслта ).

Наличие общих аминокислотных блоков в составе генов может свидетельствовать об эволюционной взаимосвязи этих ферментов.

- Два данных района уточняют структурно-функциональную топографию данных молекул, могут быть полезными для понимания механизмов сайт-специфического узнавания, а также служить моделью для разработки подходов к белковой инженерии этих ферментов с целью изменения их специфичности.

5.2, Сравнение аминокислотных последовательностей эндонуклеаза R.EcoRII с ферментами других систем рестрикции-модификации.

Наш проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей рестриктазк EcoRii о белковым банком известных эндо-нуклеаз с использованием ряда методов. Наиболее интересными прк сравнении объектами были рестриктазы типа сха , R.Mspi (ccgg), R.smai (cccggg).R.CfrBi (ccwwgg), поскольку имеют сайт, сходный с сайтом R.EcoRII(ccwgg). Также в сравнении был использован дупли-цированый участок эукариотического транскрипционного фактора CBF (Box-Binding Factor), который узнает последовательность cc(w)6gg. При сравнении первичных структур данных рестриктаз и вариабельного района фаговой ДНК-метилтрапсферазы m.spr методом множественного выравнивания ( программа CLUSTAiL ) обнаружены два блока инвариантных аминокислотных остатков в районе Айв районе м.

Таблица 4. Консервативные аминокислотные района Е и М в составе ферментов рестрикции-модификации, обнаруженные в ходе сравнительного анализа

Район E(CCA/TGG) Район M(CCC-G)

350 M.SPR 294 IAEYS—RKSGLGRELVSH

M.EcoRII KGNGFGFGbVHPENKESlA-RTIS R.Mspi 230 IAGSKA-RKPGFGTGLNViT 239 R.Smal 188 IMGSKQSPKPGYGYVLDEH

R.EcoRII IRKGFGSVDGiTAI/TNSVSNRRKS

R.Smal (CCCGGG) 188 IMSGSKQSPKPGYGYVLDENEIJKKPSL----

R.Mspi (CCGG) 230 XAEGSKA-HKPGFGTGLMIYASGSKA----

FactorCBF(CCW6GG)106 IKMDPBTGRSRGFGFIL—FKDSSSVE----

R.EcoRII (CCWGG) 237 -----DURK-CFGSVDGFlAbTNSVSN-RR

R.CfrBi (mw,'GG)242 -----DIGFI-GRGNTE—ISLDK-VSRFRR

консенсус ' RK GFG sv

Район м (Mspl) в составе метилазы M.spr ответственен за сайт-специфическое узнавани^ на ДНК-последовательности (CCGG), т.е и в случае рестриктазы R.Mspi обнаруженная гомология затрагивает ДНК-узнагацнй район.

При сравнительном анализе консервативных аминокислотных остатков в составе рестриктазы R.EcoRii и ряда рестриктаз с близкой сайт-специфичностью R.Mspi, R.Smal, R.CfrBl найдены сходные аминокислотные мотивы (Таблица 4).

ВЫВОДЫ.

1. Определена первичная структура гена рестрикционной эндонук-леэзы R.EcoRii и установлено, что система рестрикции-модификации EcoRll имеет конвергентный тш организации генов.

2. Перед геном рестрикционной эндонуклеазы обнаружена трансляционная рамка для белка, состоящего из 112 а.о. Сравнительный анализ данного гена с генами регуляторных белков систем рестрикции-модификации Il-типа позволил выявить ряд общих черт структурной организации, характерных для этого класса белков.

3. Изучена экспрессия генов ДНК-метилтрансферазы и эндонуклеазы в сопряженной прокэриотической системе транскрипции-трансляции in vivo. Обнаружена строгая скоординированность экспрессии генов в составе полной системы, в соотношении 1:1. Делеция Psti- sphi фрагмента ДНК, содержащего С-ген и часть R.EcoRii гена, вызывает снижение экспрессии метилазного гена.

4. Исходя из анализа структурной организации системы рестрикции - модификации EcoRll предложена модель согласованной регуляции экспрессии генов.

5. Анализ делеционного варианта гена ДНК-метилтрансферазы M.EcoRll в системах in vivo и in vitro показал, что происходит экспрессия инактивированного белка размером 22 КД . Наличие двух основных консервативных аминокислотных блоков CEI, CEII не достаточно для сохранения метилцитозинтрансферазной функции.

6. "Сравнительный анализ вариабельных районов метилтрансфераз M.EcoRll, M.dcm, M.NlaX , m.spr и первичной структуры гена рестрикционной эндонуклеазы EcoRll выявил два района гомологии. Впервые среди Р-М систем Il-типа при сравнительном анализе первичных структур генов системы рестрикции-модификации EooRll, обнаружен межмолекулярный район гомологии в составе тех аминокислотных участков, которые вовлечены в процесс сайт-специфического взаимодействия с ДНК.

7. При анализе первичных структур гена R.EcoRII, а также генов рестрикционных эндонуклеаз с близкой специфичностью R.Mspi, R.Smal, R.CfrBi найдены сходные аминокислотные мотивы в их составе.

СПИСОК РАБОТ.ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Kossykh V.G., Repyk A.V., Kaliman A.V., Buryanov Ya.I. Nucleotide sequence of the EcoRII restriction endonuclease gene. -Bioch. Bioph. Acts, 1989, v.1009, p.290-292.

2. Косых В.Г., Репик А.В., Калиман А.В., Бурьянов Я.И., Баев А.А. Первичная структура рестрикционной эндонуклеазы EcoRH.-ДАН СССР, 1989, Т.308, Мб, С.1497-1499.

3. Рукавцова Е.Б., Репик А.В., Баумляйн X., Вобус У., Бурьянов Я.И. Конструирование плазмиды, содержащей ген метилазы EcoRII под контролем промотора , экспрессирующегося в семенах растений. Тез. докл, I Всесоюзный симпозиум. Новые методы биотехнологии растений. (1991 г., г.Пущино), с.38.

4. Репик А.В., Косых В.Г., Бурьянов Я.И. Гены системы рестрикции - модификации EcoRII - обьект для бежовой инженерш. Тез. докл. v-ой конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" ,1992,стр.90.

5. Kossykh V.G., Repyk A.V., Hattman S. Sequence motifs common to the EcoRII restriction endonuclease and the proposed sequence specificity domain of three DNA - Ccytoslne-C5] -methyltransferases. - Gene (1993), 125, p.65-68.

6. M.V. Zakharova, A.N. Kravetz, I.V. Beletzkaja, A.V. Repyk, A.S. Solonln. Cloning and sequences of the genes encoding the CfrBI restrlcton - modification system from Cltrobacter freundll. -Gene, 129, (1993), p.TT-81.

7. M.V. Zakharova, A.N. Kravetz, I.V. Beletzkaja, A.V. Repyk, A.S. Solonln. Cloning and sequences of the genes encoding the CfrBI restrlcton - modification system from Cltrobacter freundll. - FASEB Summer Research Conference Co - Sponsored by New England Biolabs Inc., Restriction endonucleases and modification methyl-transferases; Structure and Mechanisms", (1993), Vermont, USA,

p.111.

I.12.93 г. Зак.58б8Р. Тир.130 эта. Уч.-изд.л. I.О

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ЯНЦ РАН