Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция транскрипции генов системы рестрикции-модификации типа II Ecl18kI

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция транскрипции генов системы рестрикции-модификации типа II Ecl18kI"

На правах рукописи □034БЭЭ28

ПРОЦЕНКО АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ ТИПА II Ес118к1

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2009

003469928

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Захарова Марина Викторовна доктор биологических наук Северинов Константин Викторович

доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна

кандидат биологических наук Масулис Ирина Станиславовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита диссертации состоится_2009 г. в_на заседании

диссертационного совета Д 002.038.01 при Учреждении Российской академии Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии Институте биофизики клетки РАН, г. Пущино.

Автореферат разослан_2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук ' Т. И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Проблема рефляции активности генов является одной из главных проблем молекулярной биологии. Выяснение механизмов регуляции генной активности необходимо для понимания того, как функционирует клетка или отдельно взятая генетическая система. Системы рестрикции-модификации (СРМ) типа II состоят из двух основных генов, которые кодируют ферменты, узнающие одну и ту же последовательность ДНК; эндонуклеазу рестрикции (ЭР) и ДНК-метилтрансферазу (МТ). Эпдонуклеаза рестрикции катализирует разрыв фосфодиэфирной связи по обеим цепям ДНК в сайте узнавания, таким образом, она способна фрагментировать немодифицированную специфическим путем ДНК. Энзиматическое метилирование цитозиновых или адениновых оснований ДНК-метилтрансферазой в сайте узнавания защищает ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой.

Большинство генов СРМ локализованы на плазмидах, которые способны перемещаться как в клетки того же вида, что и бактерия-хозяин, но не имеющих плазмиды содержащей СРМ, так и в бактерии других видов. Очевидно, что в момент попадания плазмиды, несущей гены СРМ, в "наивную" клетку, не имеющую такой системы, синтез ЭР и МТ должен быть координирован. В противном случае, возможна гибель клетки-хозяина за счет преждевременной экспрессии ЭР или недостаточной продукции МТ, а вместе с хозяином погибнет и плазмида, содержащая СРМ. Способность таких плазмид к горизонтальному переносу между разными видами бактерий накладывают еще одно требование - регуляция экспрессии генов СРМ должна быть не зависима от хозяйских регуляторных факторов, которые могут существенно различаться у разных бактерий. Несмотря на существование различных способов организации генов СРМ типа И, отражающее различные молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов СРМ, для успешного заселения бактериальной клетки должны быть соблюдены следующие условия:

1) белок МТ должен быть синтезирован первым и уровень его активности

должен быть достаточным, чтобы обеспечить быстрое метилирование (защиту) всех сайтов узнавания в геномной ДНК хозяина;

2) активность белка ЭР должна появиться не раньше, чем будут прометилированы все сайты в ДНК хозяина;

3) на более поздних стадиях уровень метилазной активности может быть понижен, чтобы не допустить упреждающего метилирования чужеродной ДНК. Но даже такой пониженный уровень метилазной активности должен быть достаточным для того, чтобы обеспечить полное метилирование всех геномных сайтов узнавания (последнее требование предполагает, что наличие даже одного неметилированного сайта узнавания приведет к гибели клетки за счет действия ЭР).

Таким образом, слишком низкое соотношение МТ/ЭР активностей приведет к клеточной гибели в результате авторестрикции, слишком высокое соотношение МТ/ЭР активностей не обеспечит клетке защиту при проникновении чужеродной ДНК. Поэтому для выживания клетки-хозяина необходим строгий контроль экспрессии генов СРМ.

Однако, несмотря на очевидное существование регуляции экспрессии генов СРМ, на сегодняшний день крайне мало известно о регуляторных механизмах. Это определяет актуальность всестороннего изучения процесса регуляции экспрессии генов системы рестрикции-модификации. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось детальное исследование молекулярных механизмов регуляции транскрипции генов системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- локализовать промоторы генов системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl;

- выявить характер влияния метилтрансферазы M.Ecll8kI на активность промоторов генов СРМ EcI18kI.

Научная новизна работы. Впервые локализованы промоторы генов системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl. А также описан механизм регуляции транскрипции генов системы рестрикции-модификации типа II EcllSkI, было показано, что метилтрансфераза Ес11Ш является репрессором транскрипции собственного гена, а активность гена ЭР регулируется согласно механизму транскрипционной интерференции.

Практическое значение работы. Полученные в данной работе результаты имеют фундаментальное значение и представляют несомненный научный интерес.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Spring-Meeting and workshop "Protein-protein interactions" Margburg-Moscow, 2008; Международная конференция молодых ученых «Ломоносов», 2006 и 2007, Москва, МГУ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка использованной литературы. Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и 1 таблицой. Библиография включает 165 ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структурная организация системы рестрикции-модификации типа II

Ecll8kl

Система рестрикции-модификации типа II Ecll8kl была обнаружена в штамме Enterobacter cloacae и располагалась на природной плазмиде pECL18 (Den'mukhamctov et al., 1997). Система состоит из двух генов, расположенных дивергентно относительно друг друга, на расстоянии 109 п.н. (Рис. 1). Гену ecll8kl.R соответствует ОРС размером 915 н.п., кодирующая белок размером 305 а.о. (35937 Да), гену ес118к!.М соответствует ОРС размером 1137 н.п„ кодирующая белок размером 379 а.о. (42887 Да). Сравнение нуклеотидной последовательности генов СРМ Ecll8kl с СРМ SsoII показало, что они отличаются по восьми нуклеотидам. Следует отметить, что в межгенных областях обеих систем замен не было обнаружено.

• СРМ EcI18kI •

ecllSUSf

eel 1 Ski. К

1137 пл.-

Рис. 1. Генетическая организация системы рестрикции-модификации типа II

Ес118к1 (схема).

Ранее было показано, что M.SsoII, связываясь с операторной областью расположенной в межгенной области, снижает экспрессию собственного гена и одновременно повышает экспрессию гена ЭР ssoILR in vivo (Karyagina et al., 1997). Для изучения молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов СРМ Ecll 8kl был проведен ряд экспериментов.

Первоначально было решено идентифицировать стартовые точки транскрипции генов ecllSkl.Mи ecl!8kI.R in vivo методом удлинения праймера.

Для гена ес118к1.М была показана множественная инициация транскрипции в промежутке от 49 и до, примерно, 65 нуклеотида от инициирующего ATG-кодона, но наиболее часто инициация транскрипции происходит на нуклеотиде находящемся на расстоянии 50 нуклеотидов перед

6

инициирующим АТС-кодоном гена ес118к1.М (Рис. 2А). Стартовой точке транскрипции, на расстоянии шести нуклеотидов предшествует гексануклеотидная последовательность САТААТ - с высокой степенью гомологии с консенсусной -10-областью промотора. На расстоянии 17 нуклеотидов от -¡О-области, также была выявлена последовательность (ТГСААА), хорошо согласующаяся с консенсусной -35-областью.

А Б

Рис. 2. Определение стартовых точек транскрипции промоторов генов ес118к1.М (А) и ecll8kl.R (Б) методом удлинения праймера. Использовали тотальную РНК из клеток Е. coli несущих соответствующие плазмиды. В качестве праймера был использован олигонуклеотид, комплементарный последовательности репортерного gal.K-гена. Радиоавтограф 7% денатурирующего 11ААГ.

Для гена ecll8kI.R не был обнаружен продукт реакции удлинения праймера соответствующий ранее предсказанному промотору р ecll8kI.R (Karyagina et al., 1997). Вместо этого были обнаружены два сигнала находящиеся на расстоянии 111 и 109 п.н. перед инициирующим кодоном ATG гена ecll8kI.R (Рис. 2Б). 5'-концы РНК, соответствующие продуктам реакции удлинения праймера, локализованы значительно дальше от начала гена ecll8kI.R, чем биоинформатически предсказанные и располагаются в пределах САТ-сайта, который является наиболее предпочтительным для инициации транскрипции (Hawley and McClure, 1983). Стартовым точкам транскрипции предшествует протяженный промоторный -10-бокс GCTGCGATATT, последовательность которого хорошо согласуется с консенсусной (Gaal et al., 2001). Не было выявлено -35-элемента промоторной области, который, как

показано Варне с соавт. (Ваше et al., 1997), не требуется для активности промоторов данного класса.

Мы заключили, что эксперименты удлинения праймера показывают действительный промотор гена ecll8kI.R, который отличается от предсказанного ранее. Ранее предсказанный промотор гена ecll8kI.R оказался ошибочным. Факт того, что промотор гена ecll8kI.R расположен вне межгенной области СРМ Eel 18kl, указывает на то, что механизм регуляции транскрипции этих генов должен быть отличным от предложенного в более ранних работах.

В межгенной области СРМ Ecll8kl расположен совершенный инвертированный повтор AGGACAATTTGTCCT длиной 15 п.н. Такие структуры перед промоторными областями генов, как правило, являются участками взаимодействия с регуляторными ДНК-связывающими белками. В экспериментах по задержке в геле и по защите ДНК от расщепления ДНКазой I (материалы представлены ниже) было показано, что данный повтор является сайтом связывания с M.Ecll8kI. Определение сайта связывания M.Ecll8kI

По-видимому, M.Ecll8kí регулирует транскрипцию генов СРМ Ecll8kl, специфически связываясь с операторным участком в регуляторной области этих генов. Для выявления фрагментов, с которыми связывается M.Ecll8kI, ДНК рекомбинантной плазмиды, содержащей СРМ Ecll8kl, расщепляли соответствующими эндонуклеазами, полученные фрагменты инкубировали с препаратом очищенного белка M.Ecll8kl, реакционную смесь наносили на нативный 7% ПААГ. В результате, было установлено, что M.EcllSkI связывается с фрагментом длиной 533 п.н., включающим в себя регуляторную область генов СРМ Eel 18kl (Рис. 3).

Рис. 3. Электрофоретическая подвижность фрагментов ДНК, содержащих операторную область СРМ EcllSkl, и их комплексов с M.Ecll8kI. Электрофорез в 7%-ном ПААГ фрагментов ДНК плазмиды рВсп, расщепленной EcoRl и EcoRV, до (-Ecll8kl.M) и после инкубации с белком (+Ec]18kJ.M) M.Ecll8kI.

Генетическая организация рсгуляторной области системы рестрикции-модификации типа ПЕс118к1

-10 +1+1

сттгггслат CATATSAAGT CTTTCTCTIT ТТТСГПйАТ TSTPSC7GCG ДТДПХТСАе TCaTGCATGT CTfcCCAG

0AAAAACTCA ЭТАТАСТТСА QAAAQAGAAA AAAGAAACTA АСАДСЗАСОС TATÄÄTÄSTC AqiACSTACA ОАТ90ТГЛ'^

-^-ДГЗ^^'-'-''-^1-'.....Мя-

etílStí-ii

т^т'СА^'гпГ.:1, vV-rTM'yw.c gtgcatoaaa ааастттсал агдбдтдтАА

ЛШ» Л -'у.-ГТААТАСПО CACGTACTTT ТТТвЛАЛСП" СЛГС1АТЛТТ

+1 -20 -3S

¿ciim.R

Mut

Аладттдттг ТГГАТЭСААА ОАТТАДОТСС ТФЭТОДАТТТ ААААСТСТАЛ ТГТСТАААЗА 3AGAAAGTCG СДТТТТАТТА ТТССДАТААА АААТАСОГТТ CTAATTCAGG АССАСТТААА ТТТТОАОДТТ AAAGATTTCT СТСТТТСДвС ОТААААТААТ

еЫЖ-Ш verum. R ecl 18kl. Fi

Рис. 4. Генетическая организация регуляторной области системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl. Организация генов СРМ Ecll8kl схематически показана в нижней части рисунка. Последовательность межгенной области и начало генов СРМ EcilBkl расшифрованы и увеличены в верхней части рисунка (показаны обе цепи ДНК). Начало открытых рамок считывания генов СРМ Ecl 18kl подчеркнуты. Цифрами обозначены последовательности, соответствующие -10 и -35-областям промоторов, а также +1-сайты инициации транскрипции генов ccllSUM и ecllSkl.R, которые были определены в данной работе. Последовательность сайта связывания M.Ecll8kI с ДНК выделена светлым шрифтом. Сходящимися стрелками обозначен инвертированный повтор, который является операторным участком СРМ EcllSkl.

Регуляция транскрипции с промоторов генов ecll8kI.R и ecll8kI.M, осуществляемая метилтрансферазой M.EcI18kI in vitra

Было показано влияние M.Ecll8kI на однораундовую транскрипцию in vitro с промоторов генов С.РМ Ecll8kl, при использовании РНК-полимеразы Е. coli. С фрагмента ДНК, длиной 247 н.п., содержащего промоторы генов ecl 18kl.R и ecll8kI.M и начало структурных генов, в отсутствии M.Ecll8kI, образуется одиночный транскрипт соответствующий промотору гена ecll8kI.M

(Рис. 5). При добавлении в реакционную смесь M.Ecll8kI наблюдается сильное ослабление транскрипции с промотора гена ес118к1.М, и, одновременно, происходит образование транскрипта большей длины, соответствующего промотору гена ecll8kl.R. Из этого эксперимента следует, что M.EcllBkl является ре[улятором транскрипции генов CPMEcll8kI.

Рис. 5. Влияние M.Ecll8kI на транскрипцию in vitro с промоторов генов СРМ EcI18kI.

Электрофорез в 7%-ном денатурирующем ПААГ продуктов реакции транскрипции с фрагмента ДНК, содержащего промоторы генов ecll8kl.M и ecll&kl.R и межгенную область, в отсутствии и присутствии M.Ecll8kI.

Для более детального изучения механизмов регуляции было принято решение локализовать различными методами участки связывания белков, участвующих в транскрипции генов СРМ Ecll8kl (РНК-полимераза), а также её регуляции (M.Ecll8kI).

ДНК-белковые комплексы, а также образование открытых комплексов, формируемых РНК-полимеразой в присутствии и отсутствии M.Ecll8kI, были изучены методами ДНКаза i и КМПО4 (перманганатный) футпринтинга. Результаты тестирования топологии контактов РНК-полимеразы и M.Ecll8kI с фрагментом ДНК, содержащим промоторно - операторную область генов СРМ Ecll8kl, представлены на рисунке 6.

ДНКаза I и КМп04-футпринты показали, что РНК-полимераза образует открытый комплекс на промоторе гена ec!18kI.M: на рисунке видны KMnCV чувствительные тимины в положении -10, -6 и —1. РНК-полимераза также специфически защищает от расщепления ДНКазой I область ДНК в положении от +20 и до -40, относительно стартовой точки транскрипции гена ecll8kI.M (Рис. 6, дорожки 3 и 7). В этих условиях не наблюдается защиты от действия ДНКазы I в области соответствующей промотору гена ecll8kl.R (Рис. 6, дорожка 3); однако слабые сигналы КМпОд-чувствительных тиминов свидетельствуют об образовании открытого комплекса с промотором гена

10

+ EcllSkl.M -pecll8kl.lt

-р еМЫ.М

1 2

ecll8kI.R (Рис. 6, дорожка 7). M.EcllSkl специфически защищает от расщепления ДНКазой I область ДНК в положении от -14 и до +39 относительно стартовой точки транскрипции гена ecll8kl.M (в положении от +15 и до +67 относительно стартовой точки транскрипции гена ecll8kI.R) (Рис. 6, дорожка 2).

ДНКяэа! КМвО. РНКЛ МТЕШШ

iflliti |р«/(№!.*

mWí

II-i

ГТЗТПТТ5

р есПШМ

Рис. 6. Влияние М.Ес118к1 на локализацию участков взаимодействия и образование открытых комплексов с РНК-полимеразой Е.соН в промоторно-операторной области генов СРМ Ес118к1. Меченный у-Р32 фрагмент ДНК. содержащий промоторно-операторный участок СРМ Ес11Ш, инкубировали с белком М.Ес118Ы, РНК-полимеразой Е.соН, в комплексе М.Ес118к1 + РНК-полимераза и обрабатывали ДНКазой I. КМп04-реакции выполнялись в тех же условиях. Радиоавтограф 7% денатурирующего ПААГ.

При добавлении в реакционную смесь M.Ecll8kI, вне зависимости от порядка добавления РНК-полимеразы, образование открытого комплекса с промотором гена ecll8kI.M сильно ослабевает (Рис. 6, дорожки 8 и 9). При этом сильно стимулируется образование открытого комплекса с промотором гена ecll8kI.R, а также появляется область, защищаемая от расщепления ДНКазой I в положении от -47 и до +12 от стартовой точки транскрипции гена ecllSkl.R (Рис. 6, дорожки 8 и 9). Учитывая месторасположение оператора M.Ecll8kl (от положения +7 до +20 относительно стартовой точки транскрипции гена ecll8kI.M) и области ДНК защищаемой связанной M.Ecll8kI (от -14 до +39), ингибирование транскрипции с промотора гена ecll8kl.M метилтрансферазой

M.EclS8kI должно быть простым следствием стерической помехи. И если механизм ингибирования транскрипции с промотора гена ес!18к].М был понятен, не ясен оставался механизм активации промотора гена ecll8tí.R, поскольку оператор M.Ecll8kI расположен в положении от +33 до +47 относительно точки начала транскрипции гена ecll8kI.R, а метилтрансфераза M.Ecll8kI, образуя комплекс с ДНК, защищает её в положении от +15 до +67. В принципе, промотор гена ecll8kI.R может быть активизирован метилтрансферазой M.Ecl 18kl непосредственно (например, посредством белок-белкового взаимодействие между метилтрансферазой M.Ecl 18И, связанной с оператором, и РНК-полимеразой, или косвенно, то есть, как простое следствие помехи создаваемой метилтрансферазой M.Ecl 18kl, связанной с оператором, для образования открытого комплекса молекулой РНК-полимеразы с промотором гена ecll8kI.M). Чтобы лучше понять эффект влияния метилтрансферазы M.Ecl 18kl связанной с оператором на активность промотора гена ecll8kl.R, были выполнены эксперименты по транскрипции in vitro, а также ДНКаза I и КМп04-футпринт на фрагменте ДНК, содержащей промотор гена ecll8kI.R и сайт связывания M.EcH8kI, но не содержащей промотор гена eclim.M.

- -f- EcllSkl.M рис. 7. Метилтрансфераза M.Ecll8kI не влияет на активность промотора гена edlSkJ.R in vitro в отсутствии промотора гена ecH8kl.M.

Электрофорез в 7%-ном денатурирующем ПААГ продуктов реакции транскрипций с фрагмента ДНК, содержащего промотор гена ec¡18kI.R и сайт связывания M.Ecl 1 Ski, но не содержащей промотор гена ecilSklM.

Из данных полученных в эксперименте по транскрипции in vitro (Рис. 7), следует, что промотор гена ecll8kl.R транскрибируется с одинаковой эффективностью, как в присутствие, так и в отсутствие M.Ecl 18kl. Из чего следует, что этот промотор конститутивный и для нормальной работы не нуждается в активации какими-либо дополнительными факторами.

Эксперименты по защите ДНК от ДНКазы I и КМпС>4-футпринтинга на фрагменте ДНК, также не содержащей промотор гена ecll8kl. М показали, что взаимодействие с РНК-полимеразой приводит к появлению на ДНК, в области промотора гена ecl!8kI.R, участка защищенного от расщепления ДНКазой I (Рис. 8, дорожка 3), и появлению тиминов чувствительных к воздействию КМп04 соответствующих промотору гена ecll8kI.R (Рис. 8, дорожка 7). В тоже время, добавление M.Ecl 18kJ в реакционную смесь приводит к образованию комплекса M.Ecll8kI с оператором (Рис. 8, дорожки 4 и 5), но не приводит к каким либо заметным изменениям места связывания РНК-полимеразы (Рис. 8, дорожки 4 и 5), и изменению активности промотора гена ecll8kI.R (Рис. 8, дорожки 8 и 9). Из этого следует, что наличие M.Ecl ¡ 8kl не обязательно для работы промотора гена ecll8kI.R в отсутствие промотора гена ес118к1.М.

ДНКзза! КЛ1»0. РНКП МТЕсИШ

+++++Д---

-----+ +++

- -++H¡ +++' -+-Í+ -#+

РНКП

F.cllSkl.M

l-f» vi

Í 'Г ■ i

V ;■ !

Рис. 8. Метилтрансфераза M.Ecll8kI не влияет на локализацию участков взаимодействия и образование открытых комплексов с РНК-полимеразой E.coli в области промотора гена ecllSkl.R в отсутствии промотора гена ecUSkl.M. ]рecll8kl.R меченный у.р32 фрагмент ДНК, содержащий промотор гена ecll8kI.R, сайт связывания М.Ес118И, но не содержащий промотор гена eel 18 kl. М инкубировали с M.Ec!18kI, РНК-полимеразой E.coli, в комплексе M.Ecl 18к1+РНК-полимераза и обрабатывали ДНКазой I. КМп04-реакции выполняли в тех же условиях. Радиоавтограф 7% денатушоуюшего НААГ.

1 2 34 567 8 9

Отсутствие прямого влияния M.Ecl 18kl на транскрипцию с промотора гена ecll8kI.R также было подтверждено in vivo. В экспериментах по удлинению праймера с использованием конструкции, в которой был делегирован промотор гена ес118к1.М, но оставался неизменным промотор гена ecll8kI.R и сайт связывания M.Ecl 18kl, было показано, что наличие или

отсутствие в клетке M.Ecll8kI практически не оказывает влияния на активность промотора гена ecllSkl.R (Рис. 9). Более того, заметно даже небольшое ослабление сигнала, что связано, по-видимому, с тем, что M.Ecll8kI, образуя комплекс со своим сайтом связывания, немного мешает нормальной транскрипции с промотора гена ecll8kI.R.

Рис. 9, Реакция удлинения праймера с использованием конструкции, в которой был дслстирован промотор гена ecllSkl.M в присутствии и отсутствии метилтрансферазы М.Ес118кТ. Использовали тотальную РЫК из клеток Е. coli несущих соответствующую плазмиду Метилтрансфераза M.Ecll8kI вносилась в клетки на совместимой плазмиде. В качестве праймера использовали олигонуклеотид, комплементарный последовательности репортерного ga/K-гена. Радиоавтограф 7% денатурирующего ПААГ.

GATC-+ EcllSkl.M

р tcll8U.it

При выполнении экспериментов КМпОгфутпринтинга, нами были получены данные, указывающие на то, что при увеличении количества РНК-полимеразы в реакции происходит образование двух открытых комплексов: комплекс с промотором гена ecllSkl.M и второй комплекс, не уступающий по интенсивности, с промотором гена ecll8kI.R (Рис. 10, дорожка 5). Следут отметить, что интенсивность сигнала образования открытого комплекса с промотором гена ecll8kl.R полученного с использованием избытка РНК-полимеразы аналогична интенсивности сигнала образования открытого комплекса полученного в результате добавления в реакцию M.EcllSkI (Рис. 10, дорожка 6), M.Ecll8kI в этой ситуации ослабляла образование открытого комплекса с промотором гена ecllSkl.M, но не приводила к дальнейшему усилению образования открытого комплекса с промотором гена ecll8kI.R. Однако эксперименты по транскрипции in vitro выполненные в тех же условиях показали, что увеличение количества РНК-полимеразы в реакции приводит лишь к незначительному увеличению транскрипции с промотора гепа ecl!8kI.R (Рис. 11, дорожка 4), что явно не соответствует уровню образования открытого

комплекса с промотором гена ecl¡8kI.R. Добавление же M.Ecll8kI в реакцию приводило к значительному увеличению количества транскриптов, соответствующих промотору гена ecll8kI.R, и уменьшало количество транскриптов соответствующих промотору гена ес118к1.М(Рис. 11, дорожка 5).

р ecllXkl.R

ресШкШ

Рис. 10. РНК-полимераза образует открытый комплекс как с промотором гена ес118к!.М, так и с промотором гена ес118к!.Я. Меченный у-Р32 фрагмент ДНК, содержащий промоторно-операторную область СРМ Ес118к1, инкубировали с увеличивающимися количествами РНК-полимеразы Е.соЧ и обрабатывали КМп04. (1) АЮ реакция. РНК-полимераза: (2) 2,5лмоль; (3) 5пмоль; (4) Юпмоль; (5) 20пмоль. Комплекс М.Ес118к1+РНК-полимераза (20пмоль) (6). Радиоавтограф 7% денатурирующего ПААГ.

PWKTI

.р ecUm.R

. ресПШ-М

Рис. 11. Избыток РНК-полимеразы не приводит к транскрипции с промотора гена ec!18kI.R. Электрофорез в 7%-ном денатурирующем ПААГ продуктов реакции транскрипции с фрагмента ДНК, содержащего промоторно-операторную область СРМ EcllSkI и начало генов в присутствии увеличивающегося количествами РНК-полимеразы E.coli, (1) 2,5пмоль РНК-полимеразы, (2) 5пмоль РНК-полимеразы, (3) Юпмоль РНК-полимеразы, (4) 20пмоль РНК-полимеразы, (6) в комплексе М.Ес! 1 Ш+РНК-полимераза (20пмоль).

Таким образом, в присутствии избытка РНК-полимеразы, открытые комплексы с промотором гена ес118к1Я образуются даже в отсутствии М.Ес118к1, но

15

образование этих комплексов не приводит к образованию полноценных транскриптов.

Расположение промоторов, подобное обнаруженному в СРМ EcllSkl, было описано для генов определяющих литический или лизогешшй путь развития умеренного колифага 186 (Callen et al., 2004). Для этих промоторов была показана высокая степень транскрипционной интерференции. Активность слабого промотора подавлялась в результате работы более сильного промотора. Транскрипция с сильного промотора объяснялась транскрипционной интерференцией по механизму "сидячей утки", который подразумевает, что переход из открытого комплекса в элонгациопный у одних промоторов происходит значительно быстрее, чем у других промоторов, и таким образом тот комплекс, который "стартует" быстрее, сталкивает открытый комплекс, образованный на другом, более "медленном" промоторе. Мы определили время перехода из открытого комплекса в комплекс элонгационный для промоторов генов ecllSkl.M и eclI8kI.R в отсутствии промоторов создающих эффект интерференции (промоторов генов ecll8kI.R и ес118к1.М, соответственно).

Рис. 12. Скорость образования элоигационных комплексов в реакции транскрипции iv vitro с промоторов генов есШкШ (рecllSkhM) и ecllSkl.R (р ecllSkl.R). Цифрами показана продолжительность реакции (в секундах).

р сс118к1.М р ecllSkl.R

30 60 98 120 1И 30 «1 49 (20 1st

* *

Как видно из рисунка 12, в экспериментах по однораундовой транскрипции in vitro с фрагментов ДНК содержащих, отдельно, промотор гена ecll8kI.M и промотор гена ecllSkl.R, а также по 500 п.н. транскрибируемой области, накопление полноразмерных транскриптов с промотора гена ес118к1.М происходит намного быстрее, чем с промотора гена ecll8kI.R (с промотора гена ес118к1.М полноразмерные транскрипты появляются уже через 60 сек после начала реакции, а с промотора гена ecll8kI.R полноразмерные транскрипты

16

появляются только через 90 сек). Из этого следует, что скорость перехода открытого комплекса в элонгационный на промоторе гена ес118к1.М выше, чем на промоторе гена ecll8kI.R, что может объяснить накопление транскриптов соответствующих промотору гена ecllSkl.M в отсутствии M.Ecll8kI, в условиях, когда образование открытых комплексов происходит на обоих промоторах СРМ Ecll8kl.

Определение уровня транскрипции с промоторов генов системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl

Определение общего уровня транскрипции с промоторов генов СРМ Ecll8kl было выполнено при помощи обратной транскрипции и ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени, как в присутствии, так и отсутствии M.Ecll8kI. Для этого из клеток E.coli К802, содержащих плазмиду рВсп(ш"г") или рВсп(ш+г+), выделяли тотальную РНК. Методом обратной транскрипции, при помощи праймеров комплементарных нуклеотидным последовательностям генов ecll8kI.M и ecll8kI.R, была получена кДНК. Следует отметить, что для того чтобы протранскрибировать, по возможности, максимальное количество молекул мРНК, было использовано избыточное количество праймеров, количество каждого праймера было одинаковое. Далее, полученную кДНК использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени. Уровень транскрипции с промоторов генов ec¡18kI.M и ecll8kI.R определяли по значениям порогового цикла (Таблица 1).

Таблица 1. Значения пороговых циклов для генов ecll8kI.M и ecll8kí.R полученные в отсутствии (т'г) и присутствии (mV) M.Ecll8kI, при помощи ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Ген Фенотип^. ecll8kI.M eclim.R

ШТ 7.31 14.44

ш+г+ 12.06 9.95

Были получены результаты (Рис. 13), указывающие на то, что в отсутствии М.Ес118к1 в клетке идет транскрипция с обоих промоторов, но активность промотора гена ес11Щ.М выше, чем активность промотора гена ес118к1Я примерно в 140 раз (значение порогового цикла 7.31 и 14.44 соответственно). При появлении М.Ес118к1 в клетке уровень транскрипции с промотора гена ес118к1.М падает примерно в 27 раз (значение порогового цикла 7.31 в отсутствии М.Ес118к1 и 12.06 в присутствии М.Ес118к1), при этом активность промотора гена ecll8kl.il возрастает примерно в 22 раза (значение порогового цикла 14.44 в отсутствии М.Ес118к1 и 9.95 в присутствии М.Ес118к1).

Рис. 13. Уровень активности промоторов в зависимости от отсутствия (т'г*) или наличия(т+г+) \I.Ecll8kV в клетке.

В присутствии М.Ес118к1 в клетке уровень транскрипции с промотора гена ес118к!.М примерно в 4 раза ниже, чем уровень транскрипции с промотора гена ecll8kl.il (значение порогового цикла 12.06 и 9.95 соответственно). Вычисление уровней транскрипции проводилось с учетом того, что концентрация исходных специфических фрагментов ДНК увеличивается приблизительно как 2м, где N - количество циклов.

Модель регуляции транскрипции генов системы рестрикции-модификации типа II Ес118к1

Для успешного функционирования СРМ Ес118к1 в качестве "иммунной" системы клетки, защищающей се от проникновения чужеродной ДНК, соотношение внутриклеточной активности МТ и ЭР должно быть таким, чтобы ЭР могла гидролизовать чужеродную ДНК до того, как она будет специфически модифицирована метилтрансферазой. Наиболее эффективно это достигается в

140 /

120 / • г"

^00 / /

80

60 /

40

20 /

/ ¿ввг ¿йзЭ^ ; - у

еетам еетш ес118к1М есПВкЮ

т"г пГг+

том случае, когда, наряду со снижением активности МТ до минимального уровня, происходит повышение активности ЭР. Именно такая ситуация наблюдается в СРМ Ecll8kl, когда в клетке накапливается определенное количество МТ, которая, связываясь с межгенным участком СРМ Ecll8kl, репрессирует собственный синтез, ослабляет транскрипционную интерференцию и тем самым способствует повышению уровня синтеза ЭР (Рис. 14). Особенно важным представляется контроль активности генов на стадии проникновения новой СРМ в клетку бактерии, хромосомная ДНК которой не модифицирована специфическим образом. Перенос СРМ в новые клетки достаточно часто происходит в природных сообществах микроорганизмов как при внутри-, так и при межвидовом обмене плазмидами, кодирующими СРМ. Кроме того, известны многочисленные примеры переноса СРМ в клетки новых гомо- и гетерологичных хозяев при клонировании фрагментов ДНК, определяющих СРМ. При проникновении ДНК, кодирующей СРМ в бактериальную клетку, транскрипция инициируется на промоторах генов ЭР и МТ в условиях отсутствия продуктов трансляции этих генов. В отсутствие МТ в СРМ Ecll8kl наблюдается избыточный уровень транскрипции гена МТ по отношению к слабодетектируемой транскрипции гена ЭР, что определяется эффектом транскрипционной интерференции. Этот эффект обеспечивает высокую скорость метилиривания ДНК клетки-хозяина и предупреждает ее гидролиз соответствующей ЭР.

ш т

вкл 1

Рис. 14. Модель регуляции транскрипции генов в системе рестрикции-модификации

lbpüSoTKi M.Ecll8ld в кпеткх и взаимодействие с

типа II EcllSkl. А. Стадия проникновения в клетку. Б.

£ Состояние

системы.

обеспечивающее эффективную защиту клетки от инфекции бактериофагом.

выводы

Локализованы промоторы генов системы рестрикции-модификации Ес118к1.

Метилтрансфераза М.ЕсЧ8к1 является репрессором транскрипции собственного гена.

Метилтрансфераза М.Ес118к1 не оказывает прямого влияния на активность промотора гена ЭР. Активность промотора гена ЭР регулируется согласно механизму транскрипционной интерференции.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Е.А. Федотова, Ф.Ян, Е.А.Кубарева, Е.А. Романова, А.С. Проценко. М.Б. Вирясов, Т. Гианик, Т.С. Орецкая. Синтез и свойства модифицированных ДНК-фрагментов с включением тимидингликоля. Биоорганическая химия, 2008, том 34, №2, с. 236-244.

2. М.О. Нагорных, Е.С. Богданова, А.С. Проценко. М.В. Захарова, А.С. Солонин, К.В. Северинов. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации второго типа. Генетика, 2008, том 44, № 5, с. 606-615.

3. Е.А. Федотова, А.С. Проценко, М.В. Захарова, Н.В. Лаврова, А.В. Алексеевский, Т.С. Орецкая, А.С. Карягина, А.С. Солонин, Е.А. Кубарева. SsoII-подобная ДНК-метилтрансфераза Ecll8kl: взаимосвязь между регуляторной и метилирующей функциями. Биохимия, 2009, том 74, вып. 1, с. 109-116.

4. Е.А. Федотова, А.С. Проценко. Влияние аминокислотных замен на функционирование ДНК-метилтрансферазы SsoII как регуляторного белка. Сборник тезисов 13-й международной конференции молодых ученых «Ломоносов», Москва, 2006.

5. Т.А. Бабаян, Е.А. Федотова, А.С. Ершова, А.С. Проценко. Регуляция в системе рестрикции-модификации Ecll8kl. Сборник тезисов 14-й международной конференции молодых ученых «Ломоносов», Москва, 2007.

6. Е. Fedotova, A. Protsenko, М. Zakharova, A. Solonin, Т. Oretskaya and Е. Kubareva. (Cytosine-5)-DNA methiltransferase EcllSkI: interrelation between methilation and regulatory function. Spring-Meeting and workshop "Proteinprotein interactions" Margburg-Moscow, 2008.

Подписано в печать:

27.04.2009

Заказ № 1953 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Проценко, Алексей Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Системы рестрикции-модификации у прокариот

1. 1. 1. Сайт-специфические эндонуклеазы и ДНК-метилтрансферазы

1. 1.2. Классификация ферментов систем рестрикции-модификации

1. 1.3. Системы рестрикции-модификации типа I

1. 1.4. Системы рестрикции-модификации типа II

1. 1.5. Системы рестрикции-модификации типа III

1. 1.6. Молекулярная организация систем рестрикции-модификации

1. 1.7. Распространение систем рестрикции-модификации

1. 2. Метилирование ДНК в E.coli и ее роль в регуляции генной экспрессии

1. 3. Регуляция экспрессии генов в системах рестрикции-модификации

1.3. 1. Регуляция экспрессии генов системы рестрикции-модификации

Liai из Lactococcus lactus 1. 3. 2. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа I и III 1. 3. 3. Регуляция экспрессии генов в системах рестрикции-модификации типа II 1. 4. Общая характеристика структурных и функциональных свойств

ДНК-зависимой РНК-пол имеразы Е. Coli 1. 5. Особенности нуклеотидной последовательности промотора и инициация транскрипции 1. 6. Транскрипционная интерференция 1.6. 1. Механизмы транскрипционной интерференции 1.6. 1. 1. Конкуренция промоторов 1.6. 1.2. Механизм "сидячей утки" 1. 6. 1. 3. Окклюзия 1.6. 1.4. Столкновение

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2. 1. Материалы

2. 1. 1. Штаммы бактерий и плазмидные вектора

2. 1.2. Среды и основные буферы

2. 1.3. Материалы и реактивы

2. 2. Методы исследования

2. 2. 1. Получение бактериальной биомассы

2. 2. 2. Выделение плазмидной ДНК

2. 2. 2. 1. Лизис щелочью

2. 2. 2. 2. Очистка ДНК в градиенте хлористого цезия

2. 2. 3. Выделение тотальной РНК

2. 2. 4. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация

2. 2. 5. Анализ рекомбинантных клонов

2. 2. 6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2. 2. 7. Препаративное выделение фрагментов ДНК

2. 2. 8. Плазмидные конструкции

2.2. 9. Мечение 5'-конца ДНК полинуклеотидкиназой фагаТ

2. 2. 10. Реакция транскрипции in vitro

2. 2. 11. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2. 2. 12. Лигирование фрагментов ДНК

2. 2. 13. Реакция метилирования in vitro 51 2. 2. 14. Образование комплекса M.Ecll8kl с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации Eel 18kl

2. 2. 15. Защита ДНК от расщепления ДНКазой I

2. 2. 16. КМ11О4 (перманганатный) футпринтинг 53 2.2. 17. Реакция удлинения праймера

2. 2. 18. Определение уровня транскрипции с промоторов генов системы рестрикции-модификации Ecll8kl

2.2. 19. Экспрессия и очистка метилтрансферазы M.Ecll8kI-N6His до гомогенного состояния

2. 2. 20. Очистка РНК-полимеразы 56 2.2.21. Электрофорез ДНК и белков

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 57 3.1. Структурная организация системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl

3. 2. Определение сайта связывания M.Ecl 18kl 60 3. 3. Генетическая организация регуляторной области системы рестрикции-модификации Eel 18kl 61 3. 4. Регуляция транскрипции с промоторов генов ecll8kI.R и ес118к1.М, осуществляемая метилтрансферазой M.Ecl 18kl in vitro 63 3. 5. Определение уровня транскрипции с промоторов генов системы рестрикции-модификации Eel 18kl 71 3. 6. Модель регуляции транскрипции генов системы рестрикции-модификации Ecll8kl

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция транскрипции генов системы рестрикции-модификации типа II Ecl18kI"

Проблема регуляции активности генов является одной из главных проблем молекулярной биологии. Выяснение механизмов регуляции генной активности необходимо для понимания того, как функционирует клетка или отдельно взятая генетическая система. Системы рестрикции-модификации (СРМ) типа II состоят из двух основных генов, которые кодируют ферменты, узнающие одну и ту же последовательность ДНК; эндонуклеазу рестрикции (ЭР) и ДНК-метилтрансферазу (МТ). Эндонуклеаза рестрикции катализирует разрыв фосфодиэфирной связи по обеим цепям ДНК в сайте узнавания, таким образом, она способна фрагментировать немодифицированную специфическим путем ДНК. Энзиматическое метилирование цитозиновых или адениновых оснований ДНК-метилтрансферазой в сайте узнавания защищает ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой.

Большинство генов СРМ локализованы на плазмидах, которые способны перемещаться как в клетки того же вида, что и бактерия-хозяин, но не имеющих плазмиды содержащей СРМ, так и в бактерии других видов. Очевидно, что в момент попадания плазмиды, несущей гены СРМ, в "наивную" клетку, не имеющую такой системы, синтез ЭР и МТ должен быть координирован. В противном случае, возможна гибель клетки-хозяина за счет преждевременной экспрессии ЭР или недостаточной продукции МТ, а вместе с хозяином погибнет и плазмида, содержащая СРМ. Способность таких плазмид к горизонтальному переносу между разными видами бактерий накладывают еще одно требование - регуляция экспрессии генов СРМ должна быть не зависима от хозяйских регуляторных факторов, которые могут существенно различаться у разных бактерий. Несмотря на существование различных способов организации генов СРМ типа II (Рис. 1), отражающее различные молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов СРМ, для успешного заселения бактериальной клетки должны быть соблюдены следующие условия: 1) белок МТ должен быть синтезирован первым и уровень его активности должен быть достаточным, чтобы обеспечить быстрое метилирование (защиту) всех сайтов узнавания в геномной ДНК хозяина;

2) активность белка ЭР должна появиться не раньше, чем будут прометилированы все сайты в ДНК хозяина;

3) на более поздних стадиях уровень метилазной активности может быть понижен, чтобы не допустить упреждающего метилирования чужеродной ДНК. Но даже такой пониженный уровень метилазной активности должен быть достаточным для того, чтобы обеспечить полное метилирование всех геномных сайтов узнавания (последнее требование предполагает, что наличие даже одного пеметилированного сайта узнавания приведет к гибели клетки за счет действия ЭР).

Таким образом, слишком низкое соотношение МТ/ЭР активностей приведет к клеточной гибели в результате ав i орестрикции, слишком высокое соотношение МТ/ЭР активностей не обеспечит клетке защиту при проникновении чужеродной ДНК. Поэтому для выживания клетки-хозяина необходим строгий кон i роль экспрессии генов СРМ.

Однако, несмотря на очевидное существование регуляции экспрессии генов СРМ, на сегодняшний день крайне мало известно о регуляторных механизмах. Это определяет актуальность всестороннего изучения процесса регуляции экспрессии генов системы рестрикции-модификации.

Цель данной работы - определить молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl. Исходя из этого, перед нами были поставлены следующие задачи:

- локализовать промоторы генов системы рестрикции-модификации типа II Ecll8kl; выявить характер влияния метилтрансферазы M.Ecll8kI на активность промоторов генов СРМ Eel 18kl.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Проценко, Алексей Сергеевич

выводы

1. Локализованы промоторы генов системы рестрикции-модификации Ес118к1.

2. Метилтрансфераза М.Ес118к1 является репрессором транскрипции собственного гена.

3. Метилтрансфераза М.Ес118к1 не оказывает прямого влияния на активность промотора гена ЭР. Активность промотора гена ЭР регулируется согласно механизму транскрипционной интерференции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Проценко, Алексей Сергеевич, Пущино

1. Кравец А.Н., Солонин A.C., Захарова М.В., Тарцтина З.Е. (1992) Плазмидная локализация, клонирование генов системы рестриции-модификации из штамма Citrobacter freundii 4111. Мол. генет. микробиол. вирусом., 5, 4-7.

2. Alvarez M.A., Gomez A., Gomez P., Brooks J.E., Rodicio M.R. (1996) Comparative analysis of expression of the Sail restriction-modification system in Escherichia coli and Streptomyces. Mol. Gen. Genet., 253, 74-80.

3. Alvarez M.A., Gomez A., Gomez P., Rodicio M.R. (1995) Expression of the Sailrestriction-modification system of Streptomyces albus G in Escherichia coli. Gene, 157, 231-232.

4. Anton B.P., Heiter D.F., Benner J.S., Hess E.J., Greenough L., Moran L.S., Slatko B.E., Brooks J.E. (1997) Cloning and characterization of the Bg/II restriction-modification system reveal a possible evolutionary footprint. Gene, 187, 19-27.

5. Arber W. (1974) DNA modification and restriction. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 14, 1-37.

6. De Backer 0., Colson C. (1991) Identification of the recognition sequence for the

7. M StyLTI methyltransferase of Salmonella typhimurium LT7: an asymmetric site typical of type-Ill enzymes. Gene, 97, 103-107.

8. De Backer 0.5 Colson C. (1991) Two-step cloning and expression in Escherichia coli of the DNA restriction-modification system StyLTI of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol, 173, 1321-1327.

9. Barne K.A., Bown J.A., Busby S.J., Minchin S.D. (1997) Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma 70 subunit is responsible for the recognition of the "extended-10" motif at promoters. EMBO./. 16, 4034-4040.

10. Bart A., Dankert J., van der Ende A. (1999) Operator sequences for the regulatory proteins of restriction modification systems. Mol. Microbiol., 31, 1277-1278.

11. Beletskaya I.V., Zakharova M.V., Shlyapnikov M.G., Semenova L.M., Solonin A.S. (2000) DNA methylation at the CfrBI site is involved in expression control in the CfrBI restriction-modification system. Nucleic Acids Res., 28, 3817-3822.

12. Bist P., Sistla S., Krishnamurthy V., Acharya A., Chandrakala B., Rao D.N. (2001) Sadenosyl-L-methionine is required for DNA cleavage by type III restriction enzymes. J. Mol. Biol., 310, 93-109.

13. Bujard H., Gentz R„ Lanzer M., Stueber D„ Mueller M., Ibrahimi I., Haeuptle M.T.,

14. Cesareni G., Muesing M.A., Polisky B. (1982) Control of ColEl DNA replication: the rop gene product negatively affects transcription from the replication primer promoter.Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 79, 6313-6317.

15. Cesnaviciene E., Mitkaite G., Stankevicius K., Janulaitis A., Lubys A. (2003) Espl396I restriction-modification system: structural organization and mode of regulation. Nucleic Acids Res., 31, 743-749.

16. Charlier D., Gigot D., Huysveld N., Roovers M., Piérard A., Glansdorff N. (1995)

17. Pyrimidine regulation of the Escherichia coli and Salmonella typhimurium carABopérons: CarP and integration host factor (IHF) modulate the methylation status of a

18. GATC site present in the control region. J. Mol. Biol, 250, 383-391.

19. Chater K.F., Wilde L.C. (1980) Streptomyces albus G mutants defective in the SalGIrestriction-modification system. J. Gen. Microbiol., 116, 323-334.

20. Christensen L.L., Josephsen J. (2004) The methyltransferase from the LlaDII restrictionmodification system influences the level of expression of its own gene. J. Bacteriol.,186, 287-295.

21. Djordjevic G.M., Klaenhammer T.R. (1998) Inducible gene expression systems in Lactococcus lactis. Mol. BiotechnoL, 9, 127-139.

22. Dodd LB., Egan J.B. (2002) Action at a distance in CI repressor regulation of the bacteriophage 186 genetic switch. Mol. Microbiol. 45, 697-710.

23. Epshtein V., Nudler E. (2003) Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation. Science, 300, 801-805.

24. Gaal T., Ross W., Estrem S.T., Nguyen L.H., Burgess R.R., Gourse R.L. (2001) Promoter recognition and discrimination by EsigmaS RNA polymerase. Mol. Microbiol., 42, 939-954.

25. Gelinas R.E., Myers P.A., Roberts R.J. (1977) Two sequence-specific endonucleases from Moraxella bovis. J. Mol. Biol., 114, 169-179.

26. Gelinas R.E., Myers P.A., Weiss G.H., Roberts R.J., Murray K. (1977) A specific endonuclease from Brevibacterium albidwn. J. Mol. Biol., 114, 433-440.

27. Glatman L.I., Moroz A.F., Yablokova M.B., Rebentish B.A., Kcholmina G.V. (1980) A novel plasmid-mediated DNA restriction-modification system in E. coli. Plasmid, 4, 350351.

28. Glover S., Schell J., Symonds N. Stacey K. (1963) The control of the host induced modification by phage PI. Genet. Res., 1063-1067.

29. Gottesman S., Maurizi M.R. (1992) Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol. Rev., 56, 592-621.

30. Groger R.K., Morrow D.M., Tykocinski M.L. (1989) Directional antisense and sensecDNA cloning using Epstein-Barr virus episomal expression vectors. Gene, 81, 285-294.

31. Gruber T.M., Gross C.A. (2003) Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu. Rev. Microbiol., 57, 441-466.

32. Halden N.F., Wolf J.B., Cross S.L., Leonard W.J. (1988) Identification and characterization of a novel restriction enzyme derived from Mycoplasma fermentons. Clin. Res., 36, 404a.

33. Harley C.B., Reynolds R. (1987) Analysis of Escherichia coli promoter sequences. Nucl. Acids Res., 15,2343-2361.

34. Hartman S., Brooks J.E., Masurekar M. (1978) Sequence specificity of the PI modification methylase (MEcoPl) and the DNA methylase (M Ecodam) controlled by the Escherichia coli dam gene. J. Mol. Biol, 126, 367-380.

35. Hawley D.K., McClure W.R. (1983) Compilation and analysis of Escherichia coli promoter DNA sequences. Nucleic Acids Res., 11, 2237-2255.

36. Hedgpeth J., Goodman H.M., Boyer H.W. (1972) DNA nucleotide sequence restricted by the RI endonuclease. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69, 3448-3452.

37. Hinkle N.F., Miller R.V. (1979) pMG-7 mediated restriction of Pseudomonas aeruginosa phage DNAs is determined by a class II restriction endonuclease. Plasmid, 2, 387-393.

38. Huang X., Lopes de Saro F.J., Helman, J.D. (1997) Sigma factor mutations affecting the siquence-selective interaction of RNA polymerase with -10 region single-stranded DNA. Nucl. Acids Res., 25, 2603-2609.

39. Ishihama A. (1993) Protein-protein communication within the transcription apparatus. J. Bacteriol., 175,2483-2489.

40. Ives C.L., Nathan P.D., Brooks J.E. (1992) Regulation of the BamHI restriction-modification system by a small intergenic open reading frame, bamHIC, in both

41. Kelly T.J., Smith H.O. (1970) A restriction enzyme from Hemophilus influenzae II. Base sequence of the recognition site. J. Mol. Biol., 51, 393-409.

42. Kessler C., Holtke H.J. (1986) Specificity of restriction endonucleases and methylases a review (Edition 2). Gene, 47. 1-153.

43. Kiss A.G., Posfai C.C., Keller C.C., Venetianer P., Roberts R.J. (1985) Nucleotide sequence of the BsuRI restriction-modification system. Nucleic Acids Res., 13, 64036420.

44. Kita K., Kotani H., Sugisaki H., Takanami M. (1989) The Fokl restriction-modification system. I. Organization and nucleotide sequences of the restriction and modification genes. J. Biol. Chem., 264, 5751-5756.

45. Rnaus R., Bujard H. (1988) PL of coliphage lambda an alternative solution for an efficient promoter. EMBOJ., 7, 2919-2923.

46. Koons M.D., Blumenthal R.M. (1995) Characterization of pPvul, the autonomous plasmid from Proteus vulgaris that carries the genes of the PvuII restriction-modification system. Gene, 157, 73-79.

47. Kosykh V.G., Buryanov Ya.I., Bayev A.A. (1980) Molecular cloning of EcoRII endonuclease and methylase. Mol. Gen. Genet., 178, 717-718.

48. Kroger M., Hobom G., Schutte H., Mayer H. (1984) Eight new restriction endonucleases from Herpetosiphona gigantens divergent evolution in a family of enzymes. Nucleic Acids Res., 12,3127-3141.

49. Kulik E.M., Bickle T.A. (1996) Regulation of the activity of the type IC EcoR124I restriction enzyme. J. Mol. Biol., 264, 891-906.

50. Lacks S., Greenberg B. (1977) Complementary specificity of restriction endonucleases of Diplococcuspneumoniae with respect to DNA methylation. J. Mol. Biol, 114, 153-168.

51. Lacks S.A., Mannarelli B.M., Springhorn S.S., Greenberg B. (1986) Genetic basis of the complementary Dpnl and DpnII restriction systems of S. pneumoniae: An intercellular cassete mechanism. Cell, 46, 993-1000.

52. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227,680-685.

53. Liang S., Bipatnath M., Xu Y., Chen S., Dennis P., Ehrenberg M., Bremer H. (1999) Activities of constitutive promoters in Escherichia coli. J. Mol. Biol, 292, 19-37.

54. Lieb M. (1987) Bacterial genes mutL, mutS, and dcm participate in repair of mismatches at 5-methylcytosine sites. J. Bacteriol., 169, 5241-5246.

55. Marinus M.G. (1973). Location of DNA methylation genes on the Escherichia coli K-12 genetic map. Mol. Gen. Genet., 127, 47.

56. Marinus M.G., Morris N.R. (1973) Isolation of deoxyribonucleic acid methylase mutants of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 114, 1143-1150.

57. Marinus MG. (1985) DNA methylation influences irpR promoter activity in Escherichia coli K-12. Mol. Gen. Genet., 200, 185-186.

58. Martens J.A, Laprade L„ Winston F. (2004) Intergenic transcription is required torepress the Saccharomyces cerevisiae SER3 gene. Nature, 429, 571-574.

59. May M.S., Hattman S. (1975) Analysis of bacteriophage deoxyribonucleic acidsequences methylated by host- and R-factor-controlled enzymes.,/. Bacteriol., 123, 768770.

60. McClelland M., Nelson M. (1992) Effect on site-specific methylation on DNA modification methyltransferases and restriction endonucleases. Nucleic Acids Res., 20, 2145-2157.

61. McGeehan J.E., Papapanagiotou I., Streeter S.D., Kneale G.G. (2006) Cooperative binding of the C.Ahdl controller protein to the C/R promoter and its role in endonuclease gene expression. J. Mol. Biol., 358, 523-531.

62. Meselson M., Yuan R. (1968) DNA restriction enzyme from E. coli. Nature, 217, 11101114.

63. Minakhin L., Niedziela-Majka A., Kuznedelov K., Adelman K., Urbauer J.L., Heyduk Т.,

64. Sevennov K. (2003) Interaction of T4 AsiA with its target sites in the RNA polymerasesigma70 subunit leads to distinct and opposite effects on transcription. J. Mol. Biol., 326, 679-690.

65. Minakhin L., Severinov K. (2003) On the role of the Escherichia coli RNA polymerase sigma 70 region 4.2 and alpha-subunit C-terminal domains in promoter complex formation on the extended -10 gal?\ promoter. J. Biol. Chem., 278, 29710-29718.

66. Mise K., Nakajima K. (1985) Purification of a new restriction endonuclease, Styl, from Escherichia coli carrying the hsct miniplasmid. Gene, 33, 357-361.

67. Moll I., Grill S., Gualerzi C.O., Blasi U. (2002) Leaderless mRNAs in bacteria: surprises in ribosomal recruitment and translational control. Mol. Microbiol., 43, 239-246.

68. Murakami K.S., Masuda S., Darst S.A. (2002) Structural basis of transcription initiation: T. aquaticus RNA polimerase holoenzime at 4 Â resolution. Science, 296, 1280-1284.

69. Murakami K.S., Masuda S., Campbell E.A., Muzzin O., Darst S.A. (2002) Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science, 296, 1285-1290.

70. Nagaraja V., Shepherd J.C.W., Pripfl T., Bickle T.A. (1985) Two type I restriction enzymes from Salmonella species. J. Mol. Biol., 182, 579-587.

71. Noyer-Weidner M., Trautner T.A. (1993) Methylation of DNA in prokaryotes. In: Jost J.P. and Saluz H.P. (Eds.) DNA Methylation, Basel, 39-108.

72. Nyengaard N.R., Falkenberg-Klok J., Josephsen J. (1996) Cloning and analysis of the restriction modification system LlaBI, a bacteriophage resistance system from Lactococcus lactis subsp. cremoris W56. Appl. Environ. Microbiol., 62, 3494-3498.

73. O'Connor C.D., Humphreys G.O. (1982) Expression of the Eco RI restriction-modification system and the construction of positive-selection cloning vectors. Gene, 20, 219-229.

74. O'Sullivan D.J., Zagula K„ Klaenhammer T.R. (1995) In vivo restriction by Liai is encoded by three genes, arranged in an operon with llalM, on the conjugative Lactococcus plasmid pTR2030. J. Bacteriol., 177, 134-143.

75. O'Sullivan D.J., Klaenhammer T.R. (1995) C.Llal is a bifunctional regulatory protein of the Hal restriction modification operon from Lactococcus lactis. Dev. Biol. Stand., 85, 591-595.

76. O'Sullivan D.J., Klaenhammer T.R. (1998) Control of expression of Liai restriction in Lactococcus lactis. Mol. Microbiol., 27, 1009-1020.

77. Ozoline O. N., Tsyganov M. A. (1995) Structure of open promoter complexes with Escherichia coli RNA polimerase as revealed by the DNAse I footprinting technuque compilation analisys. Nucl. Acids Res., 23, 4533-4541.

78. Ozoline O.N., Deev A.A., Arkhipova M.V. (1997) Non-canonical sequence elements in the promoter structure. Cluster analysis of promoters recognased by Escherichia coli RNA polymerase. Nucl. Acids Res., 25, 4703-4709.

79. Patterson N.H., Pauling C. (1985) Evidence for two restriction-modification systems in Halobacterium cutirubrum. J. Bacteriology, 163, 783-784.

80. Pérez-Rueda E., Gralla J.D., Collado-Vides J. (1998) Genomic position analyses and the transcription machinery. J. Mol. Biol., 275, 165-170.

81. Pertzev A.V., Ruban N.M., Zakharova M.V., Beletzkaja I.V., Petrov S.I., Kravetz A.N., Solonin A.S. (1992) Eco29kI, a novel plasmid encoded restriction endonuclease from Escherichia coli. Nucl. Acids Res., 20, 1991.

82. Peterson K.R., Wertman K.F., Mount D.W., Marinus M.G. (1985) Viability of Escherichia coli K12 DNA adenine methylase (dam) mutants requires increased expression of specific genes in the SOS regulon. Mol. Gen. Genet., 201,14-19.

83. Petrusyte M., Bitinaite J., Menkevicius S., Klimasauskas S., Butkus V., Janulaitis A. (1988) Restriction endonucleases of a new type. Gene, 74, 89-91.

84. Prangishvili D.A., Vashakidze R.P., Chelidze M.G., Gabriadze I.Yu. (1985) A restriction endonuclease Sual from the thermoacidophilic archaebacterium Sulfolobusacidocaldarius. FEBS Letters Res., 192, 57-60.

85. Predki P.F., Nayak L.M., Gottlieb M.B., Regan L. (1995) Disseeting RNA-protein interactions: RNA-RNA recognition by Rop. Cell, 80, 41-50.

86. Prescott E.M., Proudfoot N.J. (2002) Transcriptional collision between convergent genes in budding yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 8796-8801.

87. Radman M., Wagner R. (1986) Mismatch repair in Escherichia call Annu. Rev. Genet., 20, 523-538.

88. HO- Rak B., von Reutern M. (1984) Insertion element IS5 contains a third gene. EMBOJ.,3, 807-811.

89. Redaschi N. Sickle T.A. (1996) Posttranscriptional regulation of EcoPlI and EcoP15I restriction activity. J. Mol. Biol., 257, 790-803.

90. Rimseliene R., Vaisvila R., Janulaitis A. (1995) The ecolllC gene specifies a transacting factor with influences expression of both DNA methyltransferase and endonuclease from the Eco72I restriction-modification system. Gene, 157, 217-219.

91. H. Roberts R.J., Macelis D. (1996) REBASE-restriction enzymes and methylases. Nucleic Acids Res., 24, 223-235.

92. Roberts R.J., Macelis D. (1997) REBASE-restriction enzymes and methylases. Nucleic Acids Res., 25, 248-262.

93. Roberts R.J., Macelis D. (1998) REBASE-restriction enzymes and methylases. Nucleic1. Acids Res., 26, 338-350.

94. Roberts R.J., Macelis D. (2003) REBASE-restriction enzymes and methylases. Nucleic1. Acids Res., 31, 418-420.

95. Roberts J., Park J.S. (2004) Mfd, the bacterial transcription repair coupling factor: translocation, repair and termination. Curr. Opin. Microbiol., 7, 120-125.

96. Roberts C.W., Roberts J.W. (1996) Base-specific recognition of the nontemplate strand of promoter DNA by E.coli RNA polymerase. Cell, 86, 495-501.

97. Rodicio M.R., Quinton-Jager T., Moran L.S., Slatko B.E., Wilson G.G. (1994) Organization and sequence of the Sail restriction-modification system. Gene, 151, 167172.

98. Ruther U. (1981) A reck lacZ transformation host. Nucleic Acids Res., 9, 4087-4098.

99. Sambrook J., Frith E.F., Maniatis T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab. Press. New York.

100. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7, 5463-5467.

101. Sawaya M.R., Zhu Z„ Mersha F., Chan S.H., Dabur R., Xu S.Y., Balendiran G.K. (2005) Crystal structure of the restriction-modification system control element C.Bcll and mapping of its binding site. Structure, 13, 1837-1847.

102. Semenova E., Minakhin L., Bogdanova E., Nagornykh M., Vasilov A., Heyduk T., Solonin A., Zakharova M., Severinov K. (2005) Transcription regulation of the EcoRV restriction-modification system. Nucleic Acids Res., 33, 6942-6951.

103. Schmid K., Thomm M., Laminet A., Laue F., Kessler C., Stetter K.O., Schmitt R. (1984) Three new restriction endonucleases Mael, Maell and Maelll from Methanococcus aeolicus. Nucl. Acids Res., 12, 2619-2628.

104. Shilov I., Tashlitsky V., Khodoun M., Vasil'ev S., Alekseev Y., Kuzubov A., Kubareva E., Karyagina A. (1998) DNA-methyltransferase SsoII interaction with own promoter region binding site. Nucleic Acids Res., 26, 2659-2664.

105. Siksnys V., Zareckaya N., Vaisvila R., Timinskas A., Stakenas P., Butkus V., Janulaitis A. (1994) CAATTG-specific restriction-modification muni genes from Mycoplasma: sequence similarties between R.MunI and EcoRI. Gene, 142, 1-8.

106. Smith H.O., Wilcox K.W. (1970) A restriction enzyme from Hemophilus influenzae I. Purification and general properties. J. Mol. Biol., 51, 379-391.

107. Smith D.W., Garland A.M., Herman G., Enns R.E., Baker T.A., Zyskind J.W. (1985) Importance of state of methylation of oriC GATC sites in initiation of DNA replication in Escherichia coli. EMBO J., 4, 1319-1326.

108. Sneppen K., Dodd I.B., Shearwin K.E., Palmer A.C., Schubert R.A., Callen B.P., Egan J.B. (2005) A mathematical model for transcriptional interference by RNA polymerase traffic m Escherichia coli. J. Mo.lBiol., 346, 399-409.

109. Sohail A., Ives C.L., Brooks J.E. (1995) Purification and characterization of C.BamHI, a regulator of the BamHI restriction-modification system. Gene, 157,227-228.

110. Som S. and Friedman S. (1994) Regulation of EcoRII methyltransferase: effect of mutations on gene expression and in vitro binding to the promoter region. Nucleic Acids Res., 22, 5347-5353.

111. Som S. and Friedman S. (1997) Characterization of the intergenic region which regulates the Mspl restriction-modification system. J. Bacteriol., 179, 964-967.

112. Soper B.W., Hollister W.R., Reddy K.J. (1996) Characterization of additional host restriction-modification systems in the unicellular cyanobacterium Cyanothece sp. Biochem. Biophys. Res. Commun., 223, 24-30.

113. Sozhamannan S., Stitt B.L. (1997) Effects on mRNA degradation by Escherichia coli transcription termination factor Rho and pBR322 copy number control protein Rop. J. Mol. Biol, 268,689-703.

114. Sternberg N. (1985) Evidence that adenine methylation influences DNA-protein interactions in Escherichia coli. J. Bacterial., 164, 490-493.

115. Streeter S.D., Papapanagiotou I., McGeehan J.E. and Kneale G.G. (2004) DNA footprinting and biophysical characterization of the controller protein C.Ahdl suggest the basis of a genetic switch. Nucleic Acids Res., 32, 6445-6453.

116. Tao T., Bourne J.C., Blumenthal R.M. (1991) A familiy of regulatory genes associated with type II restriction-modification systems. J. Bacteriol., 174, 1367-1375.

117. Tao T. and Blumenthal R.M. (1992) Sequence and characterization of pvuIIR, the PvuII endonuclease gene, and ofpvuIIC, its regulatory gene. J. Bacteriol., 174, 3395-3398.

118. Timinskas A., Butkus V., Janulaitis A. (1995) Sequence motifs characteristic for DNA cytosine-N4. and DNA [adenine-N6] methyltransferases. Classification of all DNA methyltransferases. Gene, 157, 3-11.

119. Tonebianca J., Casadesûs J. (1996) DNA adenine methylase mutants of Salmonella typhimurium and a novel cfam-regulated locus. Genetics, 144, 15-26.

120. Vesely Z., Muller A., Schmitz G.G., Kaluza K., Jarsch M„ Kessler C. (1990) RleAI: a novel class-IIS restriction endonuclease from Rhizobium leguminosarum recognizing 5'-CCCACA(N)i2-3' and 3'-GGGTGT(N)9-5'. Gene, 95,129-131.

121. Vijesurier R.M., Carlock L., Blumenthal R.M., Dunbar J.C. (2000) Role and mechanism of action of C.PvuII, a regulatory protein conserved among restriction-modification systems. J. Bacteriol., 182, 477-487.

122. Voelker L.L., Dybvig K. (1996) Gene transfer in Mycoplasma arthritidis:

123. Transformation, conjugal transfer of Tn916, and evidence for a restriction system recognizing AGCT. J. Bacteriol., 178, 6078-6081.

124. Watabans T., Nishida H., Ogata C., Azai T., Sato S. (1964) Episome mediated transfer of drug resistance in Enterobacteriaceae. J. Bacteriol., 88, 716-726.

125. Watson R., Zuker M., Martin S.M., Visentin L.P. (1980) A new site-specific endonuclease from Neisseria cinerea. FEBS Letters Res., 118, 47-50.

126. Whitehead P.R., Brown N.L. (1985) A simple and rapid method for screening bacteria for II restriction endonucleases: enzymes in Aphonothece halophytica. Arch. Microbiol., 141, 70-74.

127. Whitehead P.R., Brown N.L. (1985) Three restriction endonucleases from Anabaena flos-aquae.J. Gen. Microbiol., 131, 951-958.

128. Wilson G.G. (1992) Amino acid sequence arrangements of DNA-methyltransferases. Methods Enzymology, 216, 259-279.

129. Wilson G.G. (1991) Organization of restriction-modification systems. Nucleic Acids Res., 19,2539-2565.

130. Wilson G.G., Murray N.E. (1991) Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.

131. Woese C.R., Magrum L.J., Fox G.E. (1978) Archaebacteria. J. Mol. Evol., 11, 245-251.

132. Wood W.B. (1966) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli: Bacterial mutations affecting the restriction and modification of DNA. J. Mol. Biol. 16, 118-133.

133. Xia Y., Burbank D.E., Van Etten J.L. (1986) Restriction endonuclease activity inducedby NC-1A virus infection of a Chlorella-like green alga. Nucleic Acids Res., 14, 6017-6030.

134. Yamada Y., Mizuno H. Sato H., Akagawa M., Yamasato K. (1989) A new restriction endonuclease from Agrobacterium gelatinovorum, a marine agrobacterium (Agel). Agric. Biol. Chem., 53, 1747-1749.

135. Yang C.C., Topai M.D. (1992) Nonidentical DNA binding sites of endonuclease Nael recognize different families of sequences flanking the recognition sate. Biochemistry, 31, 9657-9664.

136. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33, 103-119.

137. Yoshimori R.N. (1971) A genetic and biochemical analysis of the restriction and modification of DNA by resistance transfer factors. Ph.D. Thesis. University of California. San Francisco.

138. Yuan R. (1981) The reaction mechanism of type I restriction endonucleases. In: Chirikjian J.G. (Eds.) Gene Amplification and Analysis. Part I. Restriction endonucleases. Elsevier/North. Holland Biomedical Press. New York, 45-72.

139. Zakharova M., Minakhin L., Solonin A., Severinov K. (2004) Regulation of RNA polymerase promoter selectivity by covalent modification of DNA. J. Mol. Biol., 335, 103-111.

140. Zakharova M.V., Kravetz A.N., Beletzkaja I.V., Repyk A.V., Solonin A.S. (1993) Cloning and sequences of the genes encoding the CfrBI restriction-modification system from Citrobacter freundii. Gene, 129, 77-81.

141. Zheleznaya L.A., Kainov D.E., Yunusova A.K., Matvienko N.I. (2003) Regulatory C-protein of the EcoRV modification-restriction system. Biochemistry (Mose), 68, 125-132.