Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II C-белками

Богданова, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II C-белками
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II C-белками"

На правах рукописи

Богданова Екатерина Сергеевна

Регуляция экспрессии генов систем рестрикции -модификации типа II С-белками

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Пущино, 2009

003458915

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино, в лаборатории молекулярных механизмов транскрипции прокариот Института им. Ваксмана, г. Пискатавэй, шт. Нью Джерси, США.

Научные руководители: кандидат биологических наук Захарова Марина Викторовна

доктор биологических наук Северинов Константин Викторович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Железная Людмила Алексеевна

кандидат биологических наук Масулис Ирина Станиславовна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва.

Защита диссертации состоится « 22 » января 2009 года в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142 290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Институте биофизики клетки РАН.

Автореферат разослан « » декабря 2008г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Контроль генной экспрессии представляет собой основную задачу молекулярной биологии. Системы рестрикции-модификации (СРМ) широко распространены среди различных микроорганизмов. К настоящему времени обнаружено и охарактеризовано свыше 4000 СРМ у различных видов бактерий и археобактерий (Roberts et ah, 2007). Системы рестрикции-модификации типа II состоят из двух основных генов, которые кодируют ферменты, узнающие одну и ту же последовательность ДНК: эндонуклеазу рестрикции (ЭР) и ДНК-метилтрансферазу (МТ). Эндонуклеаза рестрикции катализирует разрыв фосфодиэфирной связи по обеим цепям ДНК в сайте узнавания и она способна фрагментировать немодифицированную специфическим путем ДНК. Энзиматическое метилирование цитозиновых или адениновых оснований ДНК-метилтрансферазой в сайте узнавания защищает ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой. Считается, что СРМ являются примитивной системой защиты бактериальной клетки от проникновения чужеродной ДНК. Большинство изученных СРМ типа II ведут себя как эгоистические мобильные генетические элементы (Dawkins,1989, Kobayashi, 2004): те хозяйские клетки, которые теряют гены рестрикции-модификации, погибают за счет действия ЭР после потери защиты, вызванной действием МТ (Engelberg-Kulka et al., 1999). Таким образом, СРМ действуют как системы токсин-антитоксин, так же называемые «аддиктивными модулями». При этом роль долгоживущего токсина выполняет ЭР, а антитоксином, защитное действие которого ограничено во времени, является МТ. По мнению Arber (Arber, 1993) и Price (Price, 1986), СРМ играют немаловажную роль в эволюции геномов, поддерживая разнообразие в поколении, принимая участие в процессах инициации рекомбинации.

Большинство генов СРМ типа II локализованы на плазмидах, которые способны перемещаться как в клетки того же вида, что и бактерия-хозяин, но не имеющие генов СРМ, так и в бактерии других видов (Bickle, 1993, Price, 1986). Очевидно, что в момент попадания плазм иды, несущей гены СРМ, в «наивную» клетку, не имеющую такой системы, синтез ЭР и МТ должен быть координирован. В противном случае, возможна гибель хозяина за счет преждевременной экспрессии ЭР (или недостаточной продукции МТ). Вместе с хозяином погибнет и плазмида с генами рестрикции-модификации - исход явно нежелательный с точки зрения эгоистического генетического элемента.

Для ряда СРМ типа II показано наличие третьего гена, кодирующего небольшой белок, т.н. С-белок (С - controller) играет важную роль в регуляции экспрессии генов данных СРМ, хотя механизм их действия мало изучен к настоящему моменту. В большинстве случаев ген, кодирующий С-белок, предшествует и иногда частично перекрывается с геном ЭР. Первоначально С-белки были описаны для BamHI и PvuII СРМ, а позже были обнаружены и для многих других СРМ (Brooks et al.,1991,Tao et al., 1991). Сравнение аминокислотных последовательностей С-белков позволило выявить т.н. "спираль-поворот-спираль" аминокислотный мотив, характерный для белков - активаторов или репрессоров транскрипции (Wintjens and Rooman,1996). Все известные к настоящему времени С-белки, за исключением С.Крп21 СРМ типа II Крп21, оказывают позитивное влияние на экспрессию гена ЭР. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК, расположенных перед генами С-белков из различных систем, позволил обнаружить консервативный мотив, т.н. «С-бокс», являющийся местом связывания С-белков (Remseline et al., 1995).

Способность плазмид, содержащих гены рестрикции-модификации, к горизонтальному переносу между разными видами бактерий накладывают еще одно требование, а именно, что регуляция экспрессии генов СРМ должна быть относительно независима от хозяйских регуляторных факторов, которые могут быть разными у разных бактерий. Однако, несмотря на очевидное существование регуляции генов СРМ, на сегодняшний день крайне мало известно о регуляторных механизмах. Изучение механизмов регуляции генов систем рестрикции-модификации является одним из актуальных направлений в области современной молекулярной биологии, т.к. получаемые знания расширяют наши представления о фундаментальных молекулярных процессах, таких как: инициация прокариотической транскрипции, ДНК-белковые взаимодействия, механизмы узнавания и катализа расщепления ДНК.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов у трех различных систем рестрикции-модификации типа II: Ahdl, Espl396I, EcoRV. Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:

♦ локализовать промоторные элементы генов СРМ типа И: Ahdl, Espl396I, EcoRV;

♦ определить характер связывания С-белков исследуемых СРМ с операторной последовательностью «С-боке»;

♦ изучить влияние С-белков на экспрессию генов СРМ типа И: Ahdl, Espl396I, EcoRV in vivo и iv vitro.

Данная работа выполнена на базе лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН и на базе лаборатории молекулярных механизмов транскрипции прокариот Института Ваксмана, США.

Научная новизна. Впервые получены данные о молекулярных механизмах регуляции экспрессии генов систем рестрикции -модификации на уровне инициации транскрипции с помощью С-белка (controller) у трех различных СРМ типа II Ahdl, Espl396I, EcoRV. Показано, что С-белки из различных систем связываются в виде димеров в промоторно-операторной области, названной «С-бокс», представляющей собой инвертированные повторы и расположенной перед генами ahdIC, esp!396IC и ecoRVC, а также перед геном espl396IM.

Продемонстрировано, что белки C.Esp 13961, C.EcoRV позитивно регулируют транскрипцию с промоторов Рesp!396ICR и РecoRVCR. Выявлено, что белок C.Ahdl выполняет двойную роль в регуляции экспрессии собственного гена и гена ЭР: взаимодействие C.Ahdl дистальным сайтом (0L) операторной последовательности активирует транскрипцию с промотора РahdICR, а взаимодействие с проксимальным сайтом (Or) - репрессирует транскрипцию с промотора РahdICR. Обнаружено, что транскрипция с промотора PahdIMS регулируется путем ковалентной модификации сайта узнавания, расположенного в промоторной области гена ahdIM. С.Esp 13961 является негативным регулятором транскрипции с промотора гена МТ; показано, что регуляторный белок ингибирует транскрипцию с промотора гена espl3961M при более низких концентрациях, по сравнению с концентрациями, необходимыми для активации транскрипции с промотора Рespl396ICR. Установлено, что C.EcoRV не изменяет общую транскрипционную активность промоторов гена ecoRVM: промотор VecoRVMoovm негативно, a ~PecoRVMUT позитивно регулируется белком C.EcoRV.

Практическое значение работы. Исследование регуляции экспрессии генов не только представляет несомненный научный интерес,

являясь фундаментальной задачей молекулярной биологии, но и важно в практическом плане, как создание фундамента для осуществления контроля процессов рекомбинации и постсегрегационной гибели клеток, вызываемых присутствием в клетке СРМ. В ходе данной работы сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гены регуляторных белков, и разработана схема очистки каждого из них, что делает возможным получение очищенных препаратов регуляторных белков для применения, например, в экспериментах по кристаллизации и изучению олигомерных комплексов и ДНК-белковых и белок-белковых взаимодействий. Результаты данной работы открывают широкие возможности для изучения временной задержки экспрессии различных генов, обеспечивая эффективный перенос генов, в данном случае, СРМ в новую клетку - хозяина, а полученные конструкции позволят исследовать кинетику экспрессии генов СРМ в системе реального времени.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 5th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, Wills Hall, Bristol (2004), FASEB Summer Research Conférence entitled: "Mechanisms & Régulation of Prokaryotic Transcription". Saxons River, Vermont (2007), Mini-symposium, "Microbiology at Rutgers University: cultivating traditions, current strength, and future frontiers". New Brunswick, New Jersey (2008), a также 8-ой Пущинской школе-конференции молодых учёных (Пущино, 2004), V Сибирском съезде физиологов (Томск, 2005) и ежегодной сессии Ученого совета ИБФМ РАН, посвященной подведению итогов конкурса научных работ (Пущино, 2003).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа

изложена на_страницах машинописного текста и состоит из следующих

разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает_источника. Работа содержит_рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Генетическая организация СРМ типа II АЬс!1, Езр13961, ЕсоЯУ.

Гены белков семейства С были обнаружены у СРМ типа II с различной генетической организацией. Нами были выбраны три СРМ АЬсН, Бэр 13961, ЕсоЮ/. Гены ЭР и МТ у СРМ АЬсП и Бэр 13961 транскрибируются конвергентно, а у СРМ ЕсоЯУ дивергентно (Рис.1

PahdXHS Т10 р ahdIHS

Met1 Н .All eil

5' сат agac aagggt аат aaagt t т5&СДТ actgtc ttäatgt at ttcgacaggc tgacagc atatg3'

с-бокс

Т.—

С .Ah (II _| ргдчии!) _(distal)

5 ' CATCTSTCRATTACACTCTTaATGftTGTCGAT№jTCCACSGACTOTGAGTACCGCCACTTTS 3'

* +1 "10 PahdlCR -35 PehdTCfl

С-бокс ssp1396IC esp1396IR

esp1396IM

_distal__proximal

5' imntttajfargactltatytccgtgtgajtat;

С-бокс

5' tactatttctttQ'

-10

_ , Posrpl3»6XCR +11 I

|stcaa|cä|tgaaggcattattgacctatcaaca 3'

r^lttctaaacatctaaggcttttttttcaatcttnnnn 3'

-35

Pespl396XK Vesp1396IH

icoRVC c.6oKC

-10 PocottVM Up I ■ -10 PeooßVW Di»™

5'ACTCTATTTTTTTTTATGATTTCTCTTACAGACATAGATTTACCATCATTTTTTTTATATATTA 3'

3' TGAGATAAAAAAAAATACTAAAGAGAATGTCTGTATCTAAATG'jTAGTAAAAAAAATATATAAT 5'

Met1 CTi ♦-J+l -10 Ресояь-Сй

С - бокс

- proximal ^ distal

5'tgca:cccaaaatgggataaccc^aatgggtttctttggcatattttttacaaatggttctta 3'

* " " * Mct'C,, _

Рис.1. Структурная организация генов системы рестрикции - модификации. Гены СРМ (А) Ahdl, (Б) Esp 13961, (В) EcoRV схематически представлены в верхней части рисунка в соответствующем боксе. Стрелками показано направление транскрипции. Терминаторы обозначены в виде шпильки. Ниже представлены нуклеотидные последовательности регуляторной области генов ahdl, espl396l, ecoRV. Трансляционные старты и точки инициации транскрипции выделены цветом, обозначены стрелками и соответствующие им промоторные элементы подчеркнуты. Последовательность сайта связывания для С белка, т.н. «С-бокс» выделена зеленым цветом, стрелками обозначены инвертированные повторы, границы проксимально и дистального сайтов обозначены как (0R) и (0L) соответственно. Красным цветом выделены дополнительный С-бокс, расположенный перед геном espI396IM и Ahdl сайт, звездочкой -модифицируемое основание. Для СРМ Espl396I боксами выделена альтернативная симметрия «С-бокса».

Определение точки инициации транскрипции генов исследуемых СРМ и локализация участков связывания для регуляторных белков С. Для того, чтобы выяснить влияние С белков на экспрессию генов исследуемых СРМ, необходимо было определить взаимное расположение промоторов генов исследуемых систем и участки связывания с ДНК соответствующих регуляторных белков. Точки начала транскрипции для генов всех трех исследуемых СРМ были определены с помощью реакции удлинения праймера. В качестве примера результатов приведены данные для генов системы АЬс11 (Рис.2.) Полученные данные о точках начала транскрипции и соответствующие им промоторные элементы отражены на схемах генетической организации генов изучаемых СРМ (Рис.1.) Локализация -10 элементов промотора во всех случаях подтверждалась наличием открытых комплексов, образуемых а70 холоферментом РНК-полимеразы на ДНК с помощью метода окисления тиминов, расположенных в одноцепочечных участках ДНК (перманганатный футпринт).

Анализ реакции удлинения праймера. РНК выделяли из клеток Е. coli Z85, несущих дикую плазмиду pAhdIRM (дорожка 1) и ее производную pAhdIRMinC с нарушенным геном ahdIC (дорожка 2) и реакцию удлинения праймера выполняли с олигонуклеотидами, комплементарными последовательностям начала генов ahdIC (2А) и ahdIM (2Б). Представлены радиоавтографы 6% денатурирующих гелей, в. которых разделены продукты реакции элонгации и продукты секвенирующей реакции, проведенной с теми же праймерами и плазмидой pAhdIRM в качестве матрицы.

Рис.2

GATC1 2 GATC1 2

Р ahdICR

Pahdms

Нами было установлено, что каждая пара генов ahdIM-ahdIS, ahdlC-ahdlR, espl396IC-espl396IR и ecoRVC-ecoRVR транскрибируется с единственного промотора и представляет собой независимый оперон. Точка начала транскрипции для генов МТ ecoRVM, ahdIMS и espl396IM удалены на 62 п.о., 26п.о. и 20п.о., соответственно. Точка начала транскрипции оперонов espl396ICR и ecoRVCR удалена от инициирующего ко дона С-белка на 26 и 10 п.о., соответственно, а для гена ahdlC совпадает с первым нуклеотидом инициирующего кодона ahdIC. Таким образом, матричная РНК, транскрибированная с промотора РahdICR, как и в случае СРМ PvuII, является безлидерной (Knowle et al., 2005). В отличие от физически независимо расположенных промоторов генов МТ и С/ЭР СРМ Ahdl и Espl396I, промоторы генов МТ и С/ЭР системы EcoRV перекрываются в районе -10 боксов (Рис.1).

Влияние С-белков на экспрессию генов СРМ ш vivo.

C.Ahdl.Исходя из предположения, что продукт гена ahdIC СРМ типа II Ahdl может принимать участие в регуляции экспрессии гена ЭР, а так же регулировать активность собственного гена, с помощью направленного мутагенеза была получена конструкция, несущая мутацию со сбивкой рамки в гене ahdIC. При использовании тотальной РНК, выделенной из клеток, несущих исходную плазмиду и плазмиду сбивкой рамки в генах ahdIC с помощью реакции удлинения праймера было показано, что транскрипция с промотора РahdICR была в 12,5 и менее эффективна, чем в клетках, несущих плазмиду дикого типа подтверждая тот факт, что для оптимальной транскрипции с данных промоторов требуются полноразмерные C.Ahdl (Рис.2А, сравнить дорожки 1 и 2).

Активность промотора гена МТ Р ahdIMS не зависела от присутствия функционально активного C.Ahdl в клетке (рис.2Б, сравнить дорожки 1 и 2). Тщательный анализ последовательности промотора РahdIMS выявил наличие уникального сайта Ahdl, последовательность которого - GACN5GTC - частично перекрывается с -10 областью данного промотора (рис.1). Нами было показано, что активность промотора PahdIMS, регулировалась путем ковалентной модификации сайта узнавания, расположенного в промоторной области гена ahdIM..

C.Espl396I. Невозможность получить конструкцию, одновременно несущую сбивку рамки в гене esp!396IC и полноразмерный ген espl396IM, подтвердил предположение о прямом влиянии продукта гена espl396IC на экспрессию гена МТ. Для решения данной проблемы, промоторные элементы генов СРМ Espl396I были клонированы в специализированную плазмиду pFD51, несущую беспромоторный вариант гена галактокиназы, с образованием плазмид Рesp1396ICR::galK и

P espl396IM\:galK, названных нами pEspRes-Gal и pEspEMet-Gal, соответственно. Направление клонирования промоторов Рespl396ICR и Vespl396IM совпадало с направлением транскрипции galK гена. Ген espl396IC под контролем собственных регуляторных элементов был клонирован в совместимую с плазмидой pFD51 плазмиду. Активность галактокиназы определяли по изменению цвета колоний на чашках с индикаторной средой МакКонки с добавлением 1% галактозы. Трансформанты использовали для выделения тотальной РНК с последующей постановкой реакции удлинения праймера.

Как видно из результатов опыта, в отсутствие плазмиды, содержащей ген регуляторного белка, клетки, несущие плазмиду pEspRes-Gal формировали белые колонии, что говорит о низкой активности промотора espl396ICR (Рис.ЗА, верхняя панель). Клетки, одновременно несущие плазмиду pEspRes-Gal и совместимую плазмиду, обеспечивающую продукцию C.Espl396I формировали малиновые колонии, а реакция

Рис. 3. Экспрессия генов СРМ Espl396I in vivo. Клетки E.coli НВ101 трансформировали плазми-дами (A) pEspRes-Gal или (Б) pEspMet-Gal в присутствие (1) или отсутствие (2) совместимой плазмиды рС, несущей ген espl396IC под контролем собственного промотора. Реакцию удлинения праймера выполняли с праймером, комплементарным началу гена galK. Представлены фотографии чашек с индикаторной средой МакКонки (верхняя панель) и радиоавтографы 6% денатурирующих гелей, в которых разделены продукты реакции элонгации (нижняя панель).

удлинения праймера выявила наличие четкого продукта элонгации (Рис.ЗА., нижняя панель, сравнить дорожки 1,2). Результаты данного опыта свидетельствуют о том, что C.Espl396I необходим для активности промотора Рespl3961CR. И наоборот, клетки, несущие только плазмиду pEspMet-Gal формировали малиновые колонии, а реакция удлинения праймера выявила наличие продукта элонгации (Рис.ЗБ, верхняя панель). Однако присутствие в клетке совместимой плазмиды, обеспечивающей продукцию C.Espl396I приводила к полному исчезновению продукта

реакции элонгации (Рие.ЗБ., нижняя панель, сравнить дорожки 1,2), а сами клетки формировали колонии белого цвета. Результаты данного опыта свидетельствуют о том, что C.Espl3961 репрессирует активность промотора Рespl396IM in vivo.

EcoRV. Аналогичный подход был использован для клонирования промоторных элементов генов СРМ EcoRV с образованиеу плазмид РecoRVCRy.galK и РecoRVM::galK, названных нами pEcoRes-Gal и pEcoMet-Gal, соответственно. Как видно из рис.4А присутствии гена регуляторного белка С.EcoRV на совместимой плазмиде обеспечивало эффективную работу промотора РecoRVCR (сравнить дорожки 1 и 2), что свидетельствует о том, что С.EcoRV является позитивным регулятором гена ecoR VCR.

Рис. 4. Экспрессия генов СРМ EcoRV in vivo. Клетки E.coli НВ101 трансформировали плаз-мидами (A) pEcoRes-Gal или (Б) pEcoMet-Gal в отсутствии (1) или присутствии (2) совместимой плазмиды рС, несущей ген ecoRVC под контролем собственного промотора. Реак-Up цию удлинения праймера вы-

^ полняли с праймером, компле-

ментарным началу гена galK. - do' Представлены радиоавтографы 6% денатурирующих гелей, в которых разделены продукты реакции элонгации.

Реакция удлинения праймера в отсутствии и присутствии плазмиды, несущей ген белка С.EcoRV на совместимой плазмиде выявила наличие двух четких продуктов элонгации, что позволило нам допустить наличие двух промоторов, расположенных перед геном ecoRVM, обозначенных нами как РecoRVMUP и PecoRVMDOWN. При этом транскрипция с промотора VecoRVMDOm наблюдалась в отсутствии регуляторного белка, а с промотора РecoRVMUP в его присутствии (Рис.4.Б, сравнить дорожки 1 и 2). Таким образом, мы предположили, что продукт гена ecoRVC не изменяет транскрипционную активность промоторов гена МТ. Полученные результаты подтверждались данными из экспериментов по инициации транскрипции in vitro (результаты представлены ниже). Общая характеристика «С-боксов» исследуемых СРМ. Полученные относительно недавно данные рентгеноструктурного анализа кристаллов C.Ahdl и C.Espl396I показали, что С-белки образуют симметричный

Peco RVCR

Т G С А 1 2

PecoR^íW

димер; структура каждого из мономеров очень похожа на структуру ДНК-связывающего домена репрессора бактериофага X. С-белки в виде димеров связываются с короткими (до 36 п.н.) последовательностями ДНК, т.н. «С-боксы», расположенными перед общим промотором генов С-белка и и ЭР. Большинство С-боксов состоят из двух пар близкорасположенных совершенных или почти совершенных инвертированных повторов, каждый из которых способен связывать один димер С-белка. Относительно начала гена в «С-боксе» выделяют дистальный и проксимальный участки. К моменту начала наших исследований «С-бокс», состоящий из двух прямых повторов, каждый из которых представляет собой палиндром, был локализован только для СРМ ЕсоЯУ (Железная, 2003). Позднее были опубликованы данные о «С-боксе» системы АЬс11 (81тее1ег, 2004). Участки связывания для регуляторного белка из СРМ Евр13961 определяли с помощью метода задержки комплекса ДНК-белок в геле и метода защиты комплекса ДНК - белок от расщепления ДНКазой I (Рис.5).

Рис. 5. Анализ комплексов ДНК - С.Е8р13961.

Меченные 32Р ДНК фрагменты, содержащие последовательности, расположенные перед генами (А) езр19361СЯ и езр19361М (Б) инкубировали с возрастающими концентрациями С.Еэр13961. Полученные комплексы ДНК-белок обрабатывали ДНКазой I. На рисунке представлены радиоавтографы 6% ПААГ. Инвертированные повторы заключены в рамку. Дистальный и проксимальный участки «С-бокса» обозначены расходящимися стрелками. Промоторные элементы выделены красным и заключены в рамку.

Результаты эксперимента показали наличие «С-бокса», расположенного перед геном езр19361С, а также дополнительного участка связывания для С.Е5р 13961, расположенного перед геном МТ ¥евр19361М.

Картирование промоторных элементов генов СРМ и локализация участков связывания ДНК соответствующими С-белками позволили позиционировать границы «С-боксов» относительно стартовых точек

В '

а *

А £ 1

С.Евр13961 |

тт

ш <м «

5235 ■ЯР

—«

*-* —

«НИИ — —

щ —

р агршб/сй

транскрипции. Во всех трех системах участки связывания С-белков перекрываются с промоторами генов СРМ (рис.1), что указывает на возможность регуляции активности этих промоторов со стороны С-белков.

Взаимодействие регуляторных белков C.Ahdl, C.Espl396I и C.EcoRV с операторным участком «С-бокс». Характер взаимодействия связывания С-белков с операторной последовательностью был изучен методом электрофоретической подвижности ДНК-белковых комплексов в нативном геле и на основании данных, полученных из экспериментов были рассчитаны константы связывания для всех С-белков изучаемых СРМ с каждым из участков соответствующего «С-бокса». Были сконструированы штаммы-продуценты каждого из трех С-белков. Рекомбинантные белки были очищены до гомогенного состояния и использовались в экспериментах in vitro.

Нами показано, что регуляторные белки всех трех СРМ имеют высокое сродство к дистальному участку (0L) «С-бокса» и низкое сродство к проксимальному сайту связывания (0R).

C.Ahdl. Для ответа на вопрос, каким образом происходит связывание C.Ahdl с отдельными участками «С-бокса», нами были получены мутантные конструкции, несущие двойные замены в дистальном участке 0L (OLmutORwt) либо в проксимальном участке Or (OLwtORmut) связывания (Рис.б.А). Данный набор ДНК фрагментов, а также фрагмент ДНК, содержащий исходную последовательность, инкубировали с возрастающей концентрацией препарата белка C.Ahdl и проводили электрофорез в нативном ПААГ (Рис.6 Б-Г).

В результате взаимодействия C.Ahdl с фрагментом ДНК, содержащим замены в проксимальном сайте связывания (0R) при низких концентрациях белка, формировался слабо выраженный, обладающий промежуточной подвижностью в геле комплекс, соответствующий, вероятнее всего, комплексу ДНК-димер С-белка (Рис.б.В). Дальнейшее увеличение концентрации С-белка вело к постепенному образованию комплекса, состоящего из двух димеров, связанных с ДНК, и обладающего, соответственно, более низкой подвижностью в геле. При использовании фрагмента ДНК, несущего замены в дистальном участке (0L), C.Ahdl образовывал только комплекс с низкой подвижностью в геле, но, для образования подобного комплекса, требовались более высокие концентрации белка (Рис.б.Г). Следовательно, можно было заключить, что C.Ahdl обладает высоким сродством к дистальному участку (0L) «С-бокса» и низким сродством к проксимальному сайту связывания (0R). В случае связывания C.Ahdl с последовательностью «С-бокса» дикого типа наблюдается постепенное исчезновение свободной ДНК и появление

четкого фрагмента с низкой подвижностью в геле в результате образования комплекса, состоящего из двух димеров и фрагмента ДНК (Рис.б.Б).

-35

-ю

OLWt-OKWt TgGTAeTCATAGTeCGTGGACTTATCSACATCATTAAGAGTGTAATTGACAS

Oimut-ORWt тве ctcataggacgtggacttatcgacatc

Oiwt-Osmut TGGTACTCATAGTCCGTGGACTTATCG АТС

Obmut-Oimut tgg CTCATAGTCCOT3GACTTATCG. АТС

От О,

distal

proximal

OLwt-ORmut OLmut-ORwt

WWW r^j , I-»

f-»*.WWW г-»-«.i» ....

В Г д

C.Ahdl C.AhdlE30A-F34Q

Рис. 6. Анализ комплексов C.AhdI с дикой и мутантными операторными последовательностями Рд/г(//СД промоторов гена ЭР с помощью метода задержки в геле.

А. Сравнение нуклеотидных последовательностей дикого и мутантных вариантов «С-бокса». Инвертированные повторы, образующие проксимальный (Оц) и дис-тальный (Оь) сайты связывания для С.АЪсИ выделены зеленым цветом. Замены, введенные в операторную последовательность, обозначены красным. Промоторные элементы выделены чертой.

Б-Д. На рисунках представлены радиоавтографы электрофоретического разделения продуктов реакции связывания дикого (Б-Г) и мутантного (Д) белков в нативном 8% ПААГ Р - свободная ДНК, Б - комплекс, содержащий один димер, связанный с ДНК, Т - комплекс, содержащий два димера.

Отдельно комплекса димера С.АЬсИ, связанного только с проксимальным сайтом связывания (Оя), мы не наблюдали ни при каких условиях постановки и проведения эксперимента. Полученные результаты согласуются с результатами экспериментов по расщеплению ДНКазоМ комплексов ДНК-С.АЬсН. Определение констант диссоциации комплексов С.АЬсИ с отдельно взятыми сайтами связывания позволило сделать вывод о кооперативном характере связывания двух димеров С.АНсП с последовательностью «С-бокса».

Данные рентгеноструктурного анализа С.АИсИ (МсОееЬап ^ а!., 2005) позволили предположить, что аминокислотные остатки С1и30 и РЬе34 белка С.АЬсИ могут образовывать белок-белковые контакты между

двумя димерами и играть важную роль во взаимодействии с консервативным 4.2 районом а70-субъединицей бактериальной РНК-полимеразы. Для проверки этой гипотезы сотрудниками лаборатории проф. Кпеа1е был создан мутантный вариант белка С.А1к11Е30А-Р34р, использованный нами экспериментах по задержке в геле комплексов ДНК-белок. Как видно из рис.б.Д, при использовании белка С.АИсЛЕЗОА-Р34<3 происходило образование комплекса, обладающего промежуточной подвижностью и соответствующего комплексу ДНК - димер белка С.АЬс11Е30А-Н34О, что никогда не наблюдалось при использовании С-белка дикого типа. При использовании более высоких концентраций белка С.АЬсНЕ30А-Р34р происходило постепенное появление комплекса с низкой подвижностью в геле, соответствующего комплексу двух димеров С.АЬ<1[Е30А-Р34<5, связанных с ДНК. Таким образом, результаты эксперимента указывают на то, замены в аминокислотном составе регуляторного белка привели к нарушению белок-белкового контакта между двумя димерами, что, в свою очередь, нарушило кооперативный характер связывания.

С.Еэр13961. Сравнительный анализ последовательностей «С-боксов», показал что последовательность «С-бокс», расположенная перед геном е$р13961М, представляет собой совершенный инвертированный повтор, практически полностью совпадающий с последовательностью дистального участка связывания, расположенного выше стартовой точки гена езр13961С (Рис.7А). Исходя из этого, мы предположили, что только один димер будет связывать ДНК в промоторной области гена МТ. Результаты экспериментов по определению электрофоретической подвижности ДНК-белковых комплексов в нативном геле подтвердили наши предположения (Рис.7.Б).

7. Анализ комплексов (\Kspl396l с последовательностями «С-бокс». (А) Сравнение нуклеотидных последовательностей вариантов «С-бокса», расположенных перед генами езр13961С и езр13961М. Инвертированные повторы выделены зеленым цветом. Промоторные элементы подчеркнуты. (Б). На рисунках представлены радиоавтографы натив-ного 8% ПААГ. Б - свободная ДНК, Э - комплекс, содержащий один димер, связанный с ДНК, Т - комплекс, содержащий два димера.

Рис.

езр13961М т6тавастата0тс6ас-1иб-атв

РезрПЯбЮГ*

Р ир13961М

Используя аналогичный подход с набором мутантных матриц для «С-боксов», расположенных перед генами Резр13961М и Резр13961СЯ, описанный выше нами были получены данные для расчета констант связывания. Оказалось, что сродство димера С.Езр 13961 к участком связывания, расположенного перед геном МТ (^=0.3 пМ) было намного выше, чем сродство к каждому из участков связывания, расположенных перед геном елр13961С (К^б.9 и Ка=322 пМ для дистального и проксимального участков, соответственно). Низкое сродство каждого из двух димеров С.Езр13961 (Ка=2.3 пМ) к «С-боксу», расположенному перед геном езр13961С, компенсировалось высокой кооперативностью взаимодействием двух димеров с узнающей последовательностью. ЕсоКУ. В отличие от рассмотренных выше взаимодействий регуляторных С-белков из СРМ Ас1Ы и Бэр 13 961 со своими «С-боксами» связывание димеров ЕсоЮ/ с каждым из сайтов связывания происходит независимо друг от друга. Об этом свидетельствуют данные по изучению связывания С.ЕсоКУ с последовательностью «С-бокс». Результаты подвижности комплексов ДНК- С.ЕсоКУ в нативном геле представлено (Рис 8).

C.EcoRV

F —► mo.

OLwt-ORwt

OLmut-ORmut

OLmut-ORwt

OLwt-ORmut

Рис. 8. Анализ комплексов ЕсоИУ с последовательностями «С-бокс».

На рисунке представлены радиоавтографы нативного 8% ПААГ. Б - свободная ДНК, О -комплекс, содержащий один димер, связанный с ДНК, Т -комплекс, содержащий два димера.

Влияние С-белков на экспрессию генов СРМ in vitro. Влияние C.Ahdl на транскрипцию с промотора РahdICR in vitro.

Как упоминалось выше, перекрывание участка связывания для C.Ahdl с -35 элементом промотора РahdICR, указывают на возможность регуляции экспрессии генов С и ЭР с помощью C.Ahdl на транскрипционном уровне. Для подтверждения данного предположения нами были выполнены эксперименты по инициации транскрипции in vitro с использованием а70 холофермента РНК-полимеразы E.coli на фрагментах ДНК, содержащих исходную и мутантные варианты последовательности «С-бокса». Как видно из рис.9 в отсутствие белка регулятора транскрипция с промоторов системы фактически отсутствовала (Рис.9, дорожка 1, А-Г). Добавление

С.АЬсН в реакцию резко активировало транскрипцию с фрагмента ДНК, содержащего исходную последовательность «С-бокса», (Рис.9А, дорожки 2-5), однако дальнейшее повышение концентрации С.АЬсН в реакционной смеси репрессировало транскрипцию (Рис.9.А, дорожки 6-9). Такая зависимость активности реакции от концентрации регулятора может свидетельствовать о двоякой роли С.АЬсН. В случае использования матрицы, содержащей замену в проксимальном участке связывания (Ок) С.АЬсН активировал транскрипцию также эффективно, как и с фрагмента, содержащего исходную последовательность за исключением отсутствия негативного эффекта в области высоких концентраций С.АЬсН (Рис.9Б, дорожки 8 и 9).

А Б

СЛИЛ - -I С.АИШ - -I

OLwt-ORwt OLwt-ORmut

C.Ahdl

C.Ahdt -

Рис. 9. Влияние C.Ahdl на транскрипцию \п vitro с промотора PahdICR, содержащего исходную или мутантные варианты последовательности «С-бокса».

(А-Г) Однораундовую реакцию транскрипции w vitro о использованием о™ холофермента РНК-полимеразы Е. coli проводили на матрицах, содержащих исходную или мутантную операторную последовательность в присутствие возрастающих концентрации C.Ahdl. Продукты реакции разделяли в 8% денатурирующем ПААГ (Д) Графический анализ результатов, представленных на А-Г.

Данный результат свидетельствует о том, что взаимодействие C.Ahdl с проксимальным сайтом (0R) операторной последовательности приводит к репрессии транскрипции с промотора РahdICR. Результаты эксперимента, выполненные на фрагменте ДНК, содержащем замены в дистальном участке (0L) «С-бокса» практически полностью отражали картину, наблюдаемую в случае использования матрицы с заменами в обоих сайтах связывания для C.Ahdl, подтверждая тот факт, что связывание C.Ahdl с дистальным участком необходимо для активации транскрипции с промотора РahdICR (Рис. 9.В).

Как и предполагалось, мутантный вариант С-белка C.AhdIE30A-F34Q был не способен активировать транскрипцию in vitro.

ДНК-белковые комплексы, формируемые РНК-полимеразой в присутствии и отсутствии C.Ahdl, обрабатывали ДНКазой I. В результате эксперимента, показанного на рис.10, видно, что одновременное взаимодействие РНК-полимеразы и C.Ahdl с промоторной областью РahdICR не выявило дополнительных участков защиты от действия ДНКазы I (Рис.1 OA, дорожка 2), за исключением появления двух участков гиперчувствительности в позициях -25-26 относительно старта инициации транскрипции (сравнить дорожки 2 и 4).Защиты фосфодиэфирных связей от нуклеазной атаки не наблюдалось ни в -10 области промотора ни в области старта транскрипции из чего мы сделали вывод, что в отсутствии C.Ahdl в системе количество образованных открытых комплексов чрезвычайно мало. Данный результат согласуется с результатами, полученными методом перманганатного футпринта.

Рис. 10. Анализ комплексов ДНК -C.Ahdl - РНКП.

Меченные 32Р ДНК фрагмент (нижняя цепь), содержащие промотор - операторную область гена ahdICR, инкубировали с C.Ahdl, РНК-полимеразой и обрабатывали ДНКазой I (А) или КМп04 (Б). На рисунке представлены радиоавтографы 6% денатурирющего ПААГ. Инвертированные повторы обозначены зеленым и заключены в рамку. Дистальный (Ol) и проксимальный (0R) участки «С-бокса» обозначены вертикальной линией; замены выделены красным. Промоторные элементы выделены красным и заключены в рамку.

Тиминовые основания в -10 области промотора РahdICR слабо реагировали с КМп04 в присутствии только РНК-полимеразы (Рис.1 OA, дорожка 3), но становились заметно чувствительней когда РНК-полимераза и С-белок одновременно присутствовали в реакционной смеси (Рис.1 ОБ, сравнить дорожки 3 и 4). Полученные результаты свидетельствуют о том, что C.Ahdl необходим для образования каталитически активного открытого комплекса РНК-полимеразы с промотором РahdICR гена ahdICR.

Влияние C.Espl396I на транскрипцию с промоторов ?espl396ICR и Vespl396IM in vitro. Методом определения тиминов, находящихся в одноцепочечной ДНК, и чувствительных к окислению перманганатом калия, было показано, наличие модифицированных оснований в -10 области промотора генов espl936ICR. Данные основания не реагировали с КМп04 в присутствии только РНК-полимеразы, но становились заметно чувствительней, когда РНК-полимераза и C.Esp 13961 одновременно присутствовали в реакционной смеси (Рис. 11 А, верхняя панель, сравнить

11. Влияние C.Espl396I на формирование открытого комплекса и инициацию транскрипции in vitro.

Меченные 32Р ДНК фрагмент, содержащие промо-торные области генов espl936ICR (А) и espl936IM (Б) инкубировали с C.Esp 13961, РНК-полимеразой и обрабатывали КМп04 (верхняя панель) или ставили реакцию транскрипции in vitro (нижняя панель). На рисунке представлены радиоавтографы 6% денатури-рющего ПААГ. Последовательность добавления реагентов в реакционную смесь выделена красным цветом. Про-моторные элементы выделены красным и заключены в рамку.

дорожки 3 И 4).

Рис.

I "

О. т

с/

c.esb1396i

R т

а *

I 5/

Pesp1396ICR

Pesp1396IM

Из этого можно сделать вывод, что C.Espl396I является активатором транскрипции с промотора esp!936ICR.

Результаты экспериментов по инициации транскрипции in vitro с использованием а70 холофермента РНК-полимеразы E.coli на фрагментах ДНК, содержащих промотор Рespl396ICR, совпадали с данными перманганатного футпринта. Как видно из рис.11.А (нижняя панель), в отсутствие белка C.Espl396I наблюдалась слабая транскрипция с промотора РespI396ICR, тогда как добавление C.Espl396I значительно стимулировало транскрипцию. Дальнейшее увеличение концентрации C.Esp 13961 приводило к постепенному репрессированию транскрипции, хотя резко выраженного негативного эффекта, как в случае транскрипции с промотора РahdICR, мы не наблюдали.

В случае промотора гена МТ Pespl396IM и70 холофермент бактериальной РНК-полимеразы формировал открытый комплекс на промоторе Рespl396IM, что видно из результатов перманганатного футпринта (Рис.11Б, верхняя панель, дорожка 3). Добавление C.Espl396I к уже сформированному открытому комплексу практически не изменяло чувствительности тиминов к окислению КМп04, находящихся в одноцепочечной ДНК (Рис.11 Б, верхняя панель, дорожки7-9), что говорит о неэффективности взаимодействия C.Espl396I с участком «С-бокса», находящемся в открытом комплексе. И наоборот, количество формируемых РНК-полимеразой открытых комплексов на промоторе ?espl396IM резко снижалось, если промотор Pespl396IM изначально был занят белком C.Esp 13 961 (Рис.бБ, верхняя панель, дорожки 4-6). Из этого можно сделать вывод, что формирование открытого комплекса РНК-полимеразой и связывание C.Espl396I с промотором гена МТ esp!396IM являются взаимоисключающими себя процессами. Результаты

экспериментов по инициации транскрипции in vitro с использованием а холофермента РНК-полимеразы E.coli на фрагментах ДНК, содержащих промотор Рesp!396IM, отражали данные перманганатного футпринта. Снижение эффективности транскрипции с промотора Vespl396IM происходило в зависимости от увеличения концентрации белка C.Espl396I только в случае, когда белок C.Espl396I добавляли в реакцию до РНК-полимеразы (Рис.11Б, нижняя панель).

Влияние C.EcoRV на транскрипцию с промоторов генов СРМ EcoRV in vitro. Влияние C.EcoRV на активность промоторов системы EcoRV была исследована аналогичными методами. Результаты экспериментов по инициации транскрипции in vitro с использованием а70 холофермента РНК-полимеразы E.coli на фрагментах ДНК, содержащих промоторные области генов ecoRVCR и ecoRVM, подтвердили результаты

экспериментов по изучению влияния белка C.EcoRV на экспрессию генов СРМ EcoRV in vivo (Рис. 12). А Б

Рис. 12. Влияние C.EcoRV на транскрипцию in vitro с промоторов генов СРМ EcoRV. Однораундовую реакцию транскрипции in vitro с использованием а70 холофермента РНК-поли-меразы Е. coli проводили на матрицах, содержащих промоторы генов С/ЭР (А) и МТ (Б) в отсутствии и присутствии регуляторного белка C.EcoRV Продукты реакции разделяли в 8% денатурирующем ПААГ.

В отсутствие белка регулятора наблюдалась слабая транскрипция с промотора РecoRVCR. Добавление C.EcoRV в реакцию увеличивало эффективность транскрипции с данного промотора (Рис.12А, сравнить дорожки - /+). В результате экспериментов по инициации транскрипции in vitro с промоторов, расположенных перед геном ecoRVM мы наблюдали эффективную активацию транскрипции с промотора VecoRVMDomi в отсутствии регуляторного белка. Присутствие C.EcoRV в реакции резко снижало транскрипцию с промотора РecoRVMoom, но активировало транскрипцию с промотора РecoRVMUP (Рис. 12В. сравнить дорожки 1 и 2). Таким образом, можно предположить, что активация транскрипции с промотора РecoRVMUP необходима для поддержания определенного уровня МТ в клетке.

Предполагаемые схемы регуляции СРМ Ahdl, Espl396I, EcoRV, Для изученных СРМ типа II: Ahdl, Espl396I, EcoRV было показано, что гены МТ данных систем транскрибируются на высоком уровне, благодаря чему, при попадании в наивную клетку сначала появляется активность ДНК-МТ, обеспечивая тем самым быстрое метелирование всех сайтов узнавания в геномной ДНК клетки-хозяина. Для предотвращения чрезмерного уровня метилтрансферазы, способного допустить метелирование чужеродной ДНК, экспрессия генов МТ регулируется либо за счет действия регуляторных С-белков (Esp 13961, EcoRV), либо за счет альтернативных механизмов (Ahdl). Накопление ферментов ЭР

C.EcoRV + C.EcoRV +

UP„

1 *

Down

Poco RVCR PecoRVM

происходит постепенно, не раньше, чем будут модифицированы все сайты в ДНК клетки-хозяина. Относительно низкий базальный уровень транскрипции с промотора генов С-белка и ЭР, по сравнению с эффективным уровнем транскрипции с промоторов генов МТ, низкая эффективность трансляции безлидерных мРНК (АИс11), а также необходимость сопряженной трансляции генов С-белка и ЭР обеспечивает медленное накопление С-белка в клетке. Так как для связывания с проксимальным участком «С-бокса» а, следовательно, активации транскрипции с промотора С/ЭР, необходима димерная форма С-белка, то низкая эффективность образования димеров вследствие относительно высокой константы димеризации мономеров С-белка (в случае АЬШ - 2.5 иМ), вносит дополнительный вклад в отсрочку синтеза ЭР. Связывание второго димера С-белка с проксимальным участком «С-бокса» не дает возможности РНК-полимеразе связаться с промотором и сформировать открытый комплекс.

ВЫВОДЫ:

1. Локализованы промоторные элементы генов у трех различных СРМ типа II: АЬШ, ЕсоЯУ, Еэр 13961.

2. Показано, что димеры С.АЬсИ и С.Еэр 13961 кооперативно связываются с «С-боксами»; димеры С.ЕсоЯУ связываются с «С-боксом» независимо.

3. С-белки СРМ АИсН, ЕсоЯУ, Бэр 13961 являются позитивными регуляторами транскрипции с промоторов РаИсИСЯ, Ре&-р13961СК и РесоЯКСЯ.

4. Белок С.АЬсИ при высокой концентрации является негативным регулятором транскрипции с промотора РаИсИСЯ.

5. С-белки АЬсИ, ЕсоЯУ не изменяют транскрипционную активность промоторов генов МТ. С.Еэр 13961 является негативным регулятором транскрипции с промотора гена МТ.

6. Транскрипция с промотора РаксИМБ СРМ АЬсП регулируется путем ковалентной модификации сайта узнавания, расположенного в промоторной области гена аИс11М.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации по теме диссертации:

1. Bogdanova Е„ Nagornykh M., Severinov К., Solonin А., Zakharova M. (2004). C-Protein - a transcription regulator of the EcoRV RM genes. Abstracts of the 5th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, Wills Hall, Bristol.

2. Богданова E., Захарова M. (2005) С - белок -транскрипционный регулятор системы EcoRV. Бюллетень Сибирской медицины, Т.4, прил. 1, с. 104.

3. Semenova E., Minakhin L., Bogdanova E.. Nagornykh M., Vasilov A., Heyduk T., Solonin A., Zakharova M., Severinov K. (2005) Transcription regulation of the EcoRV restriction-modification system. Nucleic Acids Res., 33, 6942-6951.

4. .Bogdanova E.. Djordjevic M, Papapanagiotou L, Heyduk T., Kneale G., Severinov K. (2007) Transcription regulation of the Restriction-Modification Systems by C-proteins. Abstracts of FASEB Summer Research Conference entitled: "Mechanisms & Regulation of Prokaryotic Transcription". Saxons River, Vermont.

5. Bogdanova E.. Djordjevic M., Papapanagiotou I., Heyduk T., Kneale G. and Severinov K. (2008) Transcription regulation of the type II restriction-modification system AhdI. Nucleic Acids Research, Nucleic Acids Res., 36, 1429-1442

6. Нагорных M., Богданова E.. Захарова M., Проценко A., Солонин A., Северинов К. (2008) Регуляция экспрессии генов систем рестрикции - модификации типа II. Генетика, Т.44, № 2, с.1-10.

ООО «Фотон-век» ИНН 5039008988 г. Пущино, Московская область 8(916) 982-18-60 beornot@rambler.ru ЬПр://рЬо1оп-\/ек. пагос1. ги

ИЗДАТЕЛЬСКИЕ И ПОЛИГРАФИЧЕСКИЕ УСЛУГИ

Заказ 133. Подписано в печать 9.12.2008 Бумага офисная. Тираж 75 экз

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богданова, Екатерина Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Явление рестрикции-модификации

1.2. Системы рестрикции-модификации типа I

1.3. Системы рестрикции-модификации типа II

1.4. Системы рестрикции-модификации подтипа IIG

1.5. Системы рестрикции-модификации типа III

1.6. Распространение систем рестрикции-модификации

1.7. Молекулярная организация систем рестрикции-модификации

1.8. Регуляция экспрессии генов в системах Р-М типа I и III

1.9. Регуляция экспрессии генов в системах Р-М типа II 20 1.9.1 .Регуляция экспрессии генов СРМ за счет действия ДНКметилтрансфераз

1.9.1.а. Регуляция экспрессии генов за счет ковалентной модификации 20 промоторных элементов

1.9.1.6. ДНК-метилтрансфераза - авторегулятор собственного синтеза

1.9.2. Регуляция на пост транскрипционном уровне

1.9.3. Регуляция экспрессии генов СРМ С-белками 29 1.9.3.а. Структурная организация генов СРМ типа II, контролируемых Сбелками; организация «С-боксов».

I.9.3.6. Механизмы регуляции генов СРМ типа И С-белками. 34 II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

II. 1 Материалы и реактивы

II. 1.1. Штаммы бактерий и плазмидные вектора 38 II. 1.2. Среды и основные буферы 38 II. 1.3. Материалы и реактивы

II.2. Методы исследования

II.2.1. Выделение плазмидной ДНК

И.2.2. Получение препарата фага X-vir в высоком титре

II.2.3. Получение компетентных клеток E.coli и их трансформация

TI.2.4. ПЦР-амплификация ДНК

2.5. Препаративное выделение фрагментов ДНК

2.6. Метод задержки в геле комплексов ДНК-белок

II.2.7. Определение транскрипционной активности промоторов

II.2.8.1. Защита ДНК от расщепления ДНказой I

И.2.8.2. Перманганнатная проба.

11.2.9. Выделение тотальной РНК и реакция удлинения праймера

11.2.10. Определение и анализ первичной последовательности ДНК

11.2.11. Электрофорез в полиакриламидном и агарозном гелях

11.2.12. Определение активности галактокиназы

И.2.13. Определение ß- галактозидазы

11.2.14. Проведение реакций модификации ДНК

11.2.15. Плазмидные конструкции

11.2.16. Экспрессия и очистка белков 47 III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. Регуляция СРМ Ahdl

III. 1.1. Анализ первичной последовательности структуры генов ahdIM- 48 ahdIS и ahdIC-ahdIR.

III. 1.2. Экспрессия генов СРМ Ahdl in vivo.

III. 1.3. Взаимодействие регуляторного белка С.Ahdl с операторным 51 участком «С-бокс».

III. 1.4. С-белок регулирует транскрипцию in vitro с промотора гена ЭР 56 Р ahdICR.

III. 1.5. Активность промотора гена ahdIM зависит от модификации 59 уникального сайта Ahdl.

III.2. Регуляция СРМ типа II Espl396l.

111.2.1. Анализ первичной последовательности структуры генов 61 espl396IC- espl396IR и espl396IM.

111.2.2. Экспрессия генов СРМ типа II EspI396l in vivo.

111.2.3. Клонирование гена espl396IC и очистка рекомбинантного белка 65 C.Espl396I.

111.2.4. Определение участка связывания для регуляторного белка 65 N6His-C.Esp 13961.

111.2.5. Взаимодействие регуляторного белка C.Espl396I с промоторно - 67 операторными участками.

111.2.6. C.Espl396I позитивно регулирует транскрипцию гена - 71 espl396ICR in vitro.

111.2.7. Дополнительный механизм регуляции espl396IRl 1Ъ

Ш.2.8. C.Esp 13961 негативно регулирует транскрипцию гена espl936IM 74 in vitro.

III.3. Регуляция СРМ типа II EcoRV.

Ш.3.1. Анализ первичной последовательности структуры генов СРМ 16 типа II EcoKV.

111.3.2. Для полноценной работы генов СРМ EcoRV необходим продукт 77 малой ОРС.

111.3.3. Влияние C.EcoRV на экспрессию генов СРМ EcoKV in vivo.

111.3.4. Взаимодействие регуляторного белка C.EcoRV с «С-боксом».

111.3.5. Влияние C.EcoRV на транскрипцию с промоторов генов СРМ 81 EcoRV in vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II C-белками"

Системы рестрикции-модификации (СРМ) широко распространены среди различных микроорганизмов. К настоящему времени обнаружено и охарактеризовано свыше 3800 СРМ у различных видов бактерий и археобактерий (Roberts et al., 2005). Системы рестрикции-модификации II типа состоят из двух основных генов, которые кодируют ферменты, узнающие одну и ту же последовательность ДНК: эндонуклеазу рестрикции (ЭР) и ДНК-метилтрансферазу (МТ). Эндонуклеаза рестрикции катализирует разрыв фосфодиэфирной связи по обеим цепям ДНК в немодифицированном- сайте узнавания. Метилирование цитозиновых или адениновых оснований в сайте узнавания ДНК-метилтрансферазой с образованием полуметилированного или полностью метилированного сайта защищает ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой. Для некоторых СРМ типа И, например, ВатШ, Pvull, £0001091 и .EcoRV было показано наличие дополнительного гена, кодирующего короткий регуляторный белок С (controller) (Ives et al., 1992; Tao et al., 1991; Kita et al., 2002; Zheleznaya et al., 2003).

Большинство изученных СРМ ведут себя, как эгоистические мобильные генетические элементы, приводящие к постсегрегационной гибели клетки (Dawkins,1989; Lubys et al., 1995; Kulakauskas et al., 1995; Kobayashi, 2004): те хозяйские клетки, которые теряют гены рестрикции-модификации, погибают за счет действия' ЭР' после потери защиты, обусловленной действием МТ (Engelberg-Kulka et al., 1999). Таким образом, СРМ действуют как системы токсин-антитоксин, также называемые «аддиктивными модулями». При этом роль долгоживущего токсина выполняет ЭР, а антитоксином, защитное действие которого ограничено во времени, является МТ. По мнению Arber (Arber, 2003) и Price и др. (Price et al., 1986), СРМ также принимают участие в инициации рекомбинации ДНК клетки-хозяина.

Большинство генов СРМ локализованы на плазмидах, которые способны перемещаться как в клетки того же вида, что и бактерия-хозяин, но не имеющие плазмиды СРМ, так и в бактерии других видов (Bickle and Kruger, 1993; Price et al., 1986). Очевидно, что в момент попадания плазмиды, несущей гены СРМ, в «наивную» клетку, не имеющую такой- системы, синтез ЭР и МТ должен быть координирован. В< противном случае, возможна гибель хозяина за счет преждевременной экспрессии ЭР (или недостаточной' продукции МТ). Вместе с хозяином погибнет и плазмида с генами рестрикции-модификации - исход явно нежелательный с точки зрения эгоистического генетического элемента. Способность плазмид, содержащих гены рестрикции-модификации, к горизонтальному переносу между разными видами бактерий накладывают еще одно требование, а именно, что регуляция экспрессии генов СРМ должна быть относительно независима от хозяйских регуляторных факторов, которые могут быть разными у разных бактерий. Однако, несмотря на очевидное существование регуляции генов СРМ, на сегодняшний день крайне мало известно о регуляторных механизмах. Это определяет актуальность всестороннего изучения процессов регуляции экспрессии генов систем рестрикции-модификации.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов у трех различных систем рестрикции-модификации типа II: Ahdl, Esp13961 и EcoRV. Для достижения данной цели ставились следующие задачи:

Локализовать промоторные элементы генов СРМ Ahdl, Esp 13961 и

EcoRV;

Определить характер связывания С-белков с операторной последовательностью «С-бокс» во всех трех системах;

Изучить влияние С-белков на экспрессию генов СРМ Ahcñ, EcoRV и

Espl396l in vivo и in vitro.

Научная новизна. Впервые получены данные о молекулярных механизмах регуляции экспрессии генов систем рестрикции - модификации на уровне инициации транскрипции с помощью С-белка (controller) у трех различных систем Ahdl, Espl396l и EcoRV. Показано, что С-белки из различных систем связываются с инвертированными повторами, называемыми «С-боксами» и расположенными перед генами ahdIC, espl396IC и ecoRVC, а также перед геном espl396IM.

Продемонстрировано, что белки C.Esp 13961, C.EcoRV позитивно регулируют транскрипцию генов espl396ICR и ecoRVCR. Выявлено, что белок С.Ahdl выполняет двоякую роль в регуляции экспрессии собственного гена и гена ЭР: взаимодействие C.Ahdl с дистальным сайтом (Ol) «С-бокса» активирует транскрипцию с промотора РahdICR, а взаимодействие с проксимальным сайтом (Or) - репрессирует транскрипцию с этого промотора Обнаружено, что транскрипция с промотора РahdIMS не является C.AhdI-зависимой, а регулируется путем ковалентной модификации сайта узнавания, расположенного в промоторной области гена ahdIM. С.£л£>13961 является негативным регулятором транскрипции с промотора гена МТ; показано, что регуляторный белок ингибирует транскрипцию с промотора гена езр13961М в концентрациях более низких, чем те, которые необходимы для активации транскрипции с промотора генов езр13961СК. Установлено, что С.ЕсоЯУ не изменяет общую транскрипционную активность промоторов гена есоКУМ в результате того, что С.ЕсоЯУ подавляет транскрипцию с промотора РесоЯКМооип, и активирует транскрипцию с Ресо-/?КМиР.

Практическая ценность работы. Исследование механизмов регуляции экспрессии генов является фундаментальной задачей молекулярной биологии и поэтому представляет несомненный научный интерес. Кроме того, уяснение способов регуляции активности генов и важно в практическом плане, так как дает возможность контроля уровня активности различных генов, используемых в биотехнологии. Полученные в ходе работы генно-инженерные конструкции могут быть использованы для создания различных вариантов контролируемых генных переключателей, функционирующих в самых разных бактериях. В ходе данной работы сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие гены регуляторных белков трех различных СРМ, и разработана схема очистки каждого из них, что делает возможным получение очищенных- препаратов регуляторных белков для применения, например, в экспериментах по кристаллизации и изучению олигомерных комплексов и ДНК-белковых взаимодействий. Результаты данной работы открывают широкие возможности для экспериментального изучения динамики экспрессии генов систем рестрикции - модификации в реальном времени.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Богданова, Екатерина Сергеевна

ВЫВОДЫ:

1. Локализованы промоторы генов у трех различных СРМ типа II: А/пй, Езр13961 и ЕсоШ\

2. Показано, что димеры С.АЬсИ и С.Езр13961 связываются с соответствующими «С-боксами» кооперативно; димеры С.ЕсоЯУ связываются с «С-боксом» ЕсоЕУ некооперативно;

3. С-белки СРМ ЛксК, ЕсоКV, Еьр1396\ являются позитивными регуляторами транскрипции с промоторов РаксИСЯ, Ре$р13961СЯ и РесоЯУСЯ.

4. Белок С.АЬсИ при высокой концентрации является негативным регулятором транскрипции с промотора РаксИСЯ.

5. С-белки Лксй и ЕсоКЧ не изменяют транскрипционную активность промоторов соответствующих генов МТ. С.Ебр 13961 является негативным регулятором транскрипции с промотора гена МТ Ейр13961.

6. Транскрипция с промотора РаксИМБ регулируется путем ковалентной модификации сайта АЬс11, перекрывающегося с -10 областью этого промотора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предполагаемые схемы регуляции СРМ Ahdl, Espl396l, EcoKV.

Во всех трех исследуемых системах обнаруженные промоторы генов МТ являются очень сильными, благодаря чему при попадании в новую клетку - хозяина, сначала появляется активность ДНК-МТ, для предотвращения ауторестрикции. Временная задержка появления ЭР может достигаться за счет нескольких механизмов. Базальный уровень транскрипции с промотора генов С-белка и ЭР низкий, кроме того, константа димеризации мономеров С-белка относительно высокая (в случае Ahdl - 2.5 uM (Streeter, 2004). Так как для связывания с ДНК (и, следовательно, активации транскрипции гена ЭР) необходима димерная форма С-белка, низкая эффективность образования димеров вносит дополнительный вклад в отсрочку синтеза ЭР. У СРМ Ahdl и EcoKV точка начала транскрипции гена С-белка совпадает с точкой начала трансляции С-белка. Эффективность трансляции таких безлидерных мРНК невысока (Moll, 2005) и, следовательно, требуется дополнительное время для накопления количеств С-белка, достаточных для образования димеров. И, наконец, еще одним механизмом, который ограничивает преждевременную трансляцию гена ЭР с двухцистронной мРНК генов С-белка и ЭР, является сопряженная трансляция обоих генов. Частичное перекрывание генов С-белка и ЭР приводит к тому, что трансляция ЭР может начаться только после того, как будет транслирован ген С-белка. Накопление димерных форм регуляторных белков в клетке ведет к их связыванию с дистальными участками «С-боксов» и активации транскрипции с промоторов генов С/ЭР. Связывание с проксимальными сайтами второй

70 молекулы димера создает стерическую помеху для посадки а субъединицы РНКП и формировании открытого комплекса.

Для предотвращения чрезмерного уровня ДНК-метилтрансферазы, способного допустить метелирование чужеродной ДНК, экспрессия генов МТ регулируется либо за счет действия регуляторных С-белков (Espl396l, EcoRV), либо за счет альтернативных механизмов (Ahdi).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богданова, Екатерина Сергеевна, Пущино

1. Кравец, А.Н., Солонин, А.С., Захарова, М.В., Тарутина, З.Е. Плазмидная локализация и клонирование генов системы рестрикции-модификации из штамма Citrobacter freundii 4111. (1992). Мол.Ген.Микробиол.Вирусол. №7-8, стр.4-7.

2. Нагорных М.О., Богданова Е.С., Проценко А.С., Захарова М.В., Солонин А.С., Северинов К.В. (2008) Регуляция экспрессии генов систем рестрикции — модификации второго типа. Генетика. Т.44, № 2, с. 1-10.

3. Соловьев В.В. (1988) Генетические сигналы. I. Структура и функции регуляторных последовательностей в геномах прокариот. ИЦиГ СО АН СССР, Новосибирск, 80 с.

4. Alvarez M.A., Chater K.F., Rodicio M.R. (1993) Complex transcription of an operon encoding the Sali restriction-modification system of Streptomyces albus G. Mol. Microbiol. V. 8. P.243-252.

5. Anton,B.P., Heiter,D.F., Benner,J.S., Hess,E.J., Greenough,L., Moran,L.S., Slatko,B.E. and Brooks,J.E. (1997) Cloning and characterization of the BglII restriction-modification system reveals a possible evolutionary footprint. Gene, 187, P. 19-27.

6. Arber W. (2003) Elements for a theory of molecular evolution. Gene, 317, P.3-11.

7. Arber W., and Dussoix D. (1962) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J. Mol. Biol. V.5, P.18-36.

8. Barcus V.A. and Murray N.E. (1995) Barriers to recombination: restriction, in Population Genetics of Bacteria Cambridge University Press, Cambridge, P.31-58.

9. Ваше K.A., Bown J.A., Busby S.J., Minchin S.D. (1997) Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase a70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended 10' motif at promoters. EMBOJ., V. 16, P. 4034-4040.

10. Bart,A., Dankert,J. and van der Ende,A. (1999) Operator sequences for the regulatory proteins of restriction modification systems. Mol. Microbiol., 31, 1277-1278.

11. Beletskaya I. V., Zakharova M. V., Shlyapnikov M. G., Semenova L. M., and Solonin A. S. (2000) DNA methylation at the CfrBI site is involved in expression control in the CfrBI restriction-modification system. Nucleic Acids Res., V.28. P. 3817-3822.

12. Bertani G., and Weigle J. J. (1953) Host controlled variation in bacterial viruses. J. Bacteriol. V. 65. P. 113-121.

13. Bickle T.A. and Kruger D.H. (1993) Biology of DNA restriction. Microbiol Rev. V. 57. P. 434-450.

14. Blumenthal, R.M. and Cheng, X. Restriction-modification systems, in Modern Microbial Genetics, eds. Yasbin, R. & Streips, U. Wiley-Liss, New York, 2002. P. 177226.

15. Brennan R.G., Roderick S.L., Takeda Y. and Matthews B.W.(1990) Protein-DNA conformational changes in the crystal structure of a lambda Cro-operator complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 87. P. 8165-8169.

16. Burbank, D.E., S.L. Shields, A.M. Schuster, and J.L. Van Etten. (1990). 5-Azacytidine resistant mutants of chlorella virus IL-3A. Virology 176, 311-315.

17. Bushman, F.D., Shang, C., and Ptashne, M. (1989). A single glutamic acid residue plays a key role in the transcriptional activation function of lambda repressor. Cell 58, 1163-1171.

18. Butler D., and Fitzgerald G. F. (2001) Transcriptional analysis and regulation of expression of the ScrFI restriction-modification system of Lactococcus lactis subsp. cremoris UC503. J. Bacteriol. V. 183. P. 4668^1673.

19. Cesnaviciene,E., Mitkaite,G., Stankevicius,K., Janulaitis,A. and Lubys,A. (2003) Esp 13961 restriction-modification system structural organization and mode of regulation. Nucleic Acids Res.,743-749.

20. Christensen L. L., and Josephsen J. (2004) The methyltransferase from the LlaDII restriction-modification system influences the level of expression of its own gene. J. Bacteriol. V. 186. P. 287-295.

21. Dawkins R. (1989). The Selfish Gene. Oxford University Press, Oxford.

22. Dodd, I.B, Shearwin, K.E. and Sneppen, K. (2007) Modelling Transcriptional Interference and DNA Looping in Gene Regulation. J. Mol. Biol., 369, P. 1200-1213.

23. Dryden,D., Cooper,L., Thorpe,P. and Byron O. (1997) The in Vitro Assembly of the EcoKl Type I DNA Restriction/Modification Enzyme and Its in Vivo Implications. Biochemistry, 36 (5), 1065 -1076.

24. Dussoix D., and W. Arber. (1962) Host specificity of DNA produced by Eschenichia coli. II. Control over acceptance of DNA from infecting phage lambda. J. Mol. Biol. 5, 37-49.

25. Engelberg-Kulka H. and Glaser G.(1999) Addiction modules and programmed cell death and antideath in bacterial cultures. Annu. Rev. Microbiol. V. 53. P. 43-70.

26. Fitzgerald,L., Graves,M., Li,X., Feldblyum,T., Nierman,W. and Etten,J. (2007) Sequence and annotation of the 369-kb NY-2A and 345-kb AR158 viruses that infect Chlorella NC64A. Virology, 358(2): 472-484.

27. Fox,K., Dowideit,S., Erwin,A., Srikhanta,Y., Smith,A. and Jennings,M. (2007) Haemophilus influenzae phasevarions have evolved from type III DNA restriction systems into epigenetic regulators of gene expression. Nucleic Acids Res., 35: 5242 -5252.

28. Gaal T., Ross W., Estrem S.T., Nguyen L.N., Burgess R.R., Gourse R.L. (2001) Promoter recognition and discrimination by Eas RNA polymerase. Mol. Microbiol., V. 42, P. 939-954.

29. Gottesman S. (1999) Regulation by proteolysis: Developmental switches. Curr. Opin in Microbiol. Vol. 2, 142-147.

30. Guthrie EP, Quinton-Jager T, Moran LS, Slatko BE, Kucera RB, Benner JS, Wilson GG, Brooks JE. (1996) Cloning, expression and sequence analysis of the SphI restriction-modification system. Gene. 180(1-2):107-12.

31. Handa N., Ichige A., Kusano K. and Kobayashi 1.(2000) Cellular responses to postsegregational killing by restriction-modification genes. J. Bacteriol. V. 182. P. 22182229.

32. Handa, N. and Kobayashi,I. (2005) Type III Restriction Is Alleviated by Bacteriophage (RecE) Homologous Recombination Function but Enhanced by Bacterial (RecBCD) Function. J. Bacteriol. 187, 7362-7373.

33. Heidmann,S., Seifert,W., Kessler,C. and Domdey,H. (1989) Cloning, characterization and heterologous expression of the Smal restriction-modification system. Nucleic Acids Res., 17, 9783-9796.

34. Hendrix, R. W., M. C. M. Smith, R. N. Burns, M. E. Ford, and G. F. Hatfull. (1999) Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: all the world's a phage. Proc. Nad. Acad. Sci. USA 96:2192-2197.

35. Ives,C.L., Nathan,P.D. and Brooks,J.E. (1992) Regulation of the BamHI restriction-modification system by a small intergenic open reading frame, bamHIC, in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 174, 7194-7201.

36. Ives C.L., Sohail A., Brooks J.E. (1995) The regulatory C Proteins from different restriction-modification systems can cross-complement. J. Bacteriol. 1995. p.6313-6315.

37. Janscak P, Dryden DT, Firman K.(1998) Analysis of the subunit assembly of the type IC restriction-modification enzyme EcoR124I. Nucleic Acids Res. 26(19), P.4439-4445.

38. Janulaitis,A., Petrusyte,M., Maneliene,Z., Klimasauskas,S. and Butkus,V. (1992) Purification and properties of the Eco57I restriction endonuclease and methylase -prototypes of a new class (type IV). Nucleic Acids Res., 20, 6043-6049.

39. Jeltsch, A. (2003) Maintenance of species identity and controlling speciation of bacteria: a new function for restriction/modification systems? Gene, 317, 13-16.

40. Jeltsch,A. and Pingoud,A. (1996) Horizontal gene transfer contributes to the wide distribution and evolution of type II restriction-modification systems. J. Mol. Evol., 42, 91-96.

41. Jordan S.R. and Pabo C.O. (1988) Structure of the lambda complex at 2.5 A resolution: details of the repressor-operator interactions. Science V. 242. P. 893-899.

42. Kelly T.J. Jr., Smith H.O. (1970). A restriction enzyme from Hemophilus influenzae II. J Mol Biol. 51(2), P.393-409.

43. Khosaka T., Kiwaki M., Rak B. Two site-specific endonucleases BinSl and BinSll from Bifidobacterium infantis. // FEBS Lett. 1983. V. 163. P. 170-174.

44. Kiss A.G., Posfai C.C., Keller C.C., Venetianer P., Roberts R.J. (1985) Nucleotide sequence of the i&«RI restriction-modification system. Nucleic Acids Res, V. 13. P. 6403-6420.

45. Kita K., Kotani H., Sugisaki H., and Takanami M. The Fokl restriction-modification system. I. (1989) Organization and nucleotide sequences of the restriction and modification genes. J. Biol. Chem. V. 264. P. 5751-5756.

46. Kita, K., J. Tsuda, T. Kato, K. Okamoto, H. Yanase, and M. Tanaka. (1999). Evidence of horizontal transfer of the EcoO 1091 restriction-modification gene to Escherichia coli chromosomal DNA. J. Bacteriol., 181, P.6822-6827.

47. Kita,K., Tsuda,J. and Nakai,S.Y. (2002) C.Eco0109I, a regulatory protein for production of EcoO 1091 restriction endonuclease, specifically binds to and bends DNA upstream of its translational start site. Nucleic Acids Res., 30, 3558-3565.

48. Kobayashi,I. (2001) Behavior of restriction-modification systems as selfish mobile elements and their impact on genome evolution. Nucleic Acids Res., 29, 37423756.

49. Kobayashi I. (2004) Restriction-Modification Systems as Minimal Forms of Life. In Restriction Endonucleases, Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol. 14, ed Alfred Pingoud. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

50. Korona, R. and Levin, B.R. (1993) Phage-mediated selection and the evolution and maintenance of restriction-modification. Evolution, 47, 556-575.

51. Kosykh V.G., Buryanov Ya.I., Bayev A.A. (1980) Molecular cloning of .EcoRII endonuclease and methylase. Mol. Gen. Genet., V. 178. P. 717-718.

52. Kraev AS, Kravets AN, Chernov BK, Skriabin KG, Baev AA. (1985) A system of EcoRV restriction-modification: genes, enzymes and synthetic substrates. Mol Biol (Mosk). 19(l):278-84.

53. Kroger M., Hobom G., Schutte H., Mayer H. (1984) Eight new restriction endonucleases from Herpetosiphon giganteus divergent evolution in a family of enzymes. Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 3127-3141.

54. Knowle,D., Lintner,R.E., Tourna,Y.M., and Blumenthal,R.M. (2005) Nature of the promoter activated by C.PvuII, an unusual regulatory protein conserved among restriction-modification systems. J. Bacteriol., 187, 488-497.

55. Kulakauskas S, Lubys A, Ehrlich SD (1995) DNA restriction-modification systems mediate plasmid maintenance. J Bacteriol 177:3451—3454.

56. Lacks S.A., Mannarelli B.M., Springhorn S.S., Greenberg B. (1986) Genetic basis of the complementary DpnI and Dpnll restriction systems of S. pneumoniae: An intercellular cassete mechanism. Cell. V. 46. P. 993-1000.

57. Lagunavicius,A., Sasnauskas,G., Halford,S. and Siksnys,V. (2003) The Metal-independent Type lis Restriction Enzyme Bfil is a Dimer that Binds Two DNA Sites but has Only One Catalytic Centre. J. Mol. Biol. 326, 1051-1064.

58. Laursen,B.S., Sorensen,H.P., Mortensen,K.K. and Sperling-Petersen,H.U. (2005) Initiation of Protein Synthesis in Bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rew., 69, 101-123.

59. Lepikhov K, Tchernov A, Zheleznaja L, Matvienko N, Walter J, Trautner TA. (2001) Characterization of the type IV restriction modification system BspLUllIII from Bacillus sp. LUI 1. Nucleic Acids Res., 29(22), P.4691-4698.

60. Li, M., McClure W.R. and Susskind,M (1997) Changing the mechanism of transcriptional activation by phage À repressor Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, pp. 3691-3696.

61. Linn, S. And Arber, S. (1968) A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. I. Purification and general properties. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V 59, 1300.

62. Liu,Y., Ichige,A., Kobayashi,I. (2007) Regulation of the EcoRI restriction-modification system: Identification of ecoRIM gene promoters and their upstream negative regulators in the ecoRIR gene. Gene, 400(1-2), p. 140-149.

63. Liu Y, Kobayashi I. (2007) Negative regulation of the EcoRI restriction enzyme gene is associated with intragenic reverse promoters. J Bacteriol. 189 (19), P.6928-6935.

64. Lubys A., and Janulaitis A. (1995) Cloning and analysis of the plasmid-borne genes encoding the Bsp6I restriction and modification enzymes. Gene, V. 157. P. 25-29.

65. Lubys,A., Jurenaite,S. and Janulaitis,A. (1999) Structural organization of the plasmid-borne restriction-modification system type II Kpn2l from Klebsiella Pneumoniae RLF2. Nucleic Acids Res., 27,4228-4234.

66. Lubys A., Menkevicius S., Timinskas A., Butkus V. and Janulaitis A. (1994) Cloning and analysis of translational control for genes encoding the Cfr9I restriction-modification system. Gene, V. 141. P. 85-89.

67. Lurlia S. E., and Human M. L. (1952) A nonhereditaxy, host-induced variation of bacterial viruses. J. Bacteriol., V. 64. P. 557-569.

68. Madsen A, Josephsen J.(1998) Cloning and characterization of the lactococcal plasmid-encoded type II restriction/modification system, LlaDII. Appl Environ Microbiol. 64(7), P.2424-2431.

69. Makovets, S., Doronina, V. A. & Murray, N. E. (1999). Regulation of endonuclease activity by proteolysis prevents breakage of unmodified bacterial chromosomes by type I restriction enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9757-9762.

70. Makovets,S., Titheradge,A. and Murray N. (1998) ClpX and ClpP are essential for the efficient acquisition of genes specifying type IA and IB restriction system. Mol. Microbiol 28 (1), P.25-35.

71. Makula R.A., Meagher R.B. (1980) A new restriction endonuclease from the anaerobic bacterium, Desulfovibrio, desulfuricans, Norveay. Nucleic Acids Res., V. 8. P. 3125-3131.

72. Marks,P., McGeehan,J. and Kneale, G. (2004) A novel strategy for expression and purification of the DNA methyltransferase, M.Ahdl. Prot. Exprès. Purif., 37, 236-242.

73. Marshall,J. Gowers,D and Halford,S. (2007) Restriction endonucleases that bridge and excise two recognition sites from DNA. J. Mol. Biol, 367(2), P.419-431.

74. Matvienko,N., Kramarov,V., Ivanov,L. Matvienko,N. (1992) Bse83I, a restriction endonuclease frome Bacillus cereus 83, which recognizes novel nonpalindromic sequence 5'-CTTGAG-3' and is stimulated by S-adenosylmethionine. Nucleic Acids Res. 20. P.1803.

75. McConnell D.J., Searcy D.G., Sutcliffe J.G. (1978) A restriction enzyme Thai from the thermophilic mycoplasma Thermoplasma acidophilum. Nucleic Acids Res., V. 5. P. 1729-1739.

76. McGeehan,J.E., Streeter,S.D., Papapanagiotou,!, Fox,G.C. and Kneale,G.G. (2005) High-resolution crystal structure of the restriction-modification controller protein C.Ahdl from Aeromonas hydrophila. J. Mol. Biol, 346, 689-701.

77. McGeehan,J.E., Papapanagiotou,I., Streeter,S.D. and Kneale,G.G. (2006) Cooperative binding of the C.Ahdl controller protein to the C/R promoter and its role in endonuclease gene expression. J. Mol. Biol., 358, 523-531.

78. McGeehan,J.E., Streeter,S.D. Thresh, S.J., Ball,.N. Ravelli, R. and Kneale,G.G. (2008) Structural analysis of the genetic switch that regulates the expression of restriction-modification genes. Nucleic Acids Res., V 36, 14, P.4778-4787.

79. Metzger,W. and Heumann,H. (1994) Footprinting with Exonuclease III. In Kneale,G.G (ed.), DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc., Totowa, NJ, Vol. 30, pp. 11-20.

80. Meselson, M. And Yuan, R. (1968) DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 217, 1110.

81. Miller,J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

82. Modrich P. (1982). Studies on sequence recognition by type II restriction and modification enzymes. CRC Crit Rev Biochem., 13(3), P.287-323.

83. Moll I., Grill S., Gualerzi C. O., and Blasi U. (2002) Leaderless mRNAs in bacteria: surprises in ribosomal recruitment and translational control. Mol. Microbiol. V. 43. P. 239-246.

84. Morgan,R.,. Bhatia,T., Lovasco,L., and Davis,T. (2008) Mmel: a minimal Type II restriction-modification system that only modifies one DNA strand for host protection. Nucleic Acids Res., 36(20), P.6558-6570.

85. Mruk,I. and Blumenthal.R. (2008) Real-time kinetics of restriction-modification gene expression after entry into a new host cell. Nucleic Acids Res. 36(8), P.2581-2593.

86. Mruk,I., and Blumenthal, R.M. (2009) Tuning the relative affinities for activating and repressing operators of a temporally regulated restriction-modification system. Nucleic Acids Res., P. 1-16, Advance Access published January 6.

87. Mruk,I., Rajesh.P. and Blumenthal.R. (2007) Regulatory circuit based on autogenous activation-repression: roles of C-boxes and spacer sequences in control of the PvuII restriction-modification system. Nucleic Acids Res., 35(20), P.6935-6952.

88. Murray, N. (2000) Type I Restriction systems: Sophisticated Molecular Machines (a Legacy of Bertram and Weigle). Microbiol. Mol. Rew., 64, 412-434.

89. Murray, N. (2002) Immigration control of DNA in bacteria: self versus non-self. Microbiol, 148, 3-20.

90. Naito T., Kusano K. and Kobayashi I. (1995) Selfish behavior of restriction-modification systems. Science, V. 267. P. 897-899.

91. Nakayama,Y. and Kobayashi,I. (1998) Restriction-modification gene complexes as selfish gene entities: roles of a regulatory system in their establishment, maintenance, and apoptotic mutual exclusion. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 6442-6447.f

92. O'Connor C.D., Humphreys G.O. (1992) Expression of the Eco RI restriction-modification system and the construction of positive-selection cloning vectors. Gene, V. 20. P. 219-229.

93. O'Driscoll J., Fitzgerald G.F., van Sinderen D. (2005) A dichotomous epigenetic mechanism governs expression of the LlaJI restriction/modification system. Mol. Microbiol., V. 57. P. 1532-1544.

94. O'Driscoll J., Glynn F., Cahalane O., O'Connell-Motherway M., Fitzgerald G.F., and Van Sinderen D. (2004) Lactococcal plasmid pNP40 encodes a novel, temperature-sensitive restriction-modification system. Appl. Environ. Microbiol., V. 70. P. 55465556.

95. Ohshima, H., S. Matsuoka, K. Asai, and Y. Sadaie. (2002). Molecular organization of intrinsic restriction and modification genes BsuM of Bacillus subtilis Marburg. J. Bacteriol. 184:381-389.

96. Papapanagiotou, S. D. Streeter, P. D. Cary and G. G. Kneale. (2007) DNA structural deformations in the interaction of the controller protein C.Ahdl with its operator sequence. Nucleic Acids Research, 35(8), P.2643-2650.

97. Patterson N.IL, Pauling C. (1985) Evidence for two restriction-modification systems in Halobacterium cutirubrum. J. Bacteriology., V. 163. P. 783-784.

98. Petrusyte M., Bitinaite J., Menkevicius S., Klimasauskas S., Butkus V., Janulaitis A. (1988) Restriction endonucleases of a new type. Gene, V.74., P. 89-91.

99. Pertzev A.V, Ruban N.M., Zakharova M.V., Beletzkaja I.V., Petrov S.I., Kravetz A.N., Solonin A.S. (1992) £co29kI, a novel plasmid encoded restriction endonuclease from Escherichia coll Nucl. Acids Res., V. 20. P. 1991-1996.

100. Piekarowicz A, Golaszewska M, Sunday AO, Siwinska M, Stein DC. (1999) The HaelV restriction modification system of Haemophilus aegyptius is encoded by a single polypeptide. J Mol Biol., 12;293(5): 1055-65.

101. Pingoud A. M. (2004) Restriction endonucleases. In Nucleic Acids and Molecular Biology ed. Hans Joachim Gross., V. 14. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg.

102. Posfai J., Bhagwat A.S., Posfai G. and Roberts R.J. (1989) Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res., V. 17. P. 2421-2435.

103. Prakash-Cheng A, Ryu J. (1993) Delayed expression of in vivo restriction activity following conjugal transfer of Escherichia coli hsdK (restriction-modification) genes. J Bacteriol., 175(15), P. 4905-4906.

104. Prangishvili D.A., Vashakidze R.P., Chelidze M.G., Gabriadze I.Yu. (1985) A restriction endonuclease Sual from the thermoacidophilic archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius. FEBS Letters Res., V. 192. P. 57-60.

105. Price C. and Bickle T.A. (1986) A possible role for DNA restriction in bacterial evolution. Microbiol. Sci. V. 3. P. 296-299.

106. Ptashne, M. (2005) Regulation of transcription: from lambda to eukaryotes. Trends Biochem. Sci., 30, 275-279.

107. Raghavendra,N. and Rao,R. (2004) Unidirectional translocation from recognition site and a necessary interaction with DNA end for cleavage by Type III restriction enzyme. Nucleic Acids Res, Vol. 32, No. 19 5703-5711.

108. Redaschi, N. and Bickle, T. (1996) Posttranscriptional regulation of EcoPlI and EcoP15I restriction activity. J. Mol. Biol., 257, 790-803.

109. Rimseliene R, Vaisvila R, Janulaitis A. (1995) The eco72IC gene specifies a trans-acting factor which influences expression of both DNA methyltransferase and endonuclease from the Eco72I restriction-modification system. Gene, 157(1-2), P.217-219.

110. Roberts R, Belfort M., Bestor T, et al. (2003) A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res., 31, 1805-1812.

111. Roberts, RJ. and Halford, S.E. (1993) In Nucleases, Second Edition Linn, S.M., Lloyd, S.R. and Roberts, R.J., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 35.

112. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J. and Macelis D. (2005) REBASE restriction enzymes and DNA methyltransferases. Nucleic Acids Res., V. 33. P. 230-232.

113. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J. and Macelis D. (2007) REBASE—enzymes and genes for DNA restriction and modification. Nucleic Acids Res., V. 35. P. 269-270.

114. Rocha,E., Blanchard,A. (2002) Genomic repeats, genome plasticity and the dynamics of Mycoplasma evolution. Nucleic Acids Res., Vol. 30, 2031-2042.

115. Rodicio M. R., Chater,K. (1988) The Sail (SalGT) restriction-modification system of Streptomyces albus G*. Gene, V. 74. P. 39-42.

116. Rimseliene,R., Vaisvila,R. and Janulaitis,A. (1995) The eco72IC gene specifies a trans-acting factor which influences expression of both DNA methyltransferase and endonuclease from the Eco72I restriction-modification system. Gene, 157, 217-219.

117. SambrookJ., Fritsch,E.F. and Maniatis,T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

118. Sawaya M.R., Zhu Z., Mersha F. Chan, S., Dabur, R., Shuang-yong Xu, S and K. BalendiranG.K. (2005) Crystal structure of the restriction-modification system control element C.Bcll and mapping of its binding site. Structure. V. 13. P. 1837-1847.

119. Schell J., Glover S.(1966) The effect of various physiological conditions on host-controlled restriction in Escherichia coli K(P1). Genet. Res. V2. P. 273-276.

120. Schmid K., Thomm M., Laminet A., Laue F., Kessler C., Stetter K.O., Schmitt R. (1984) Three new restriction endonucleases Mae I, Mae II and Maelll from Methanococcus aeolicus. Nucl. Acids Res., V. 12 P. 2619-2628.

121. Sears,A., Peakman,L.J., Wilson,G.G. and Szczelkun, M.D. (2005) ) Characterization of the Type III restriction endonuclease Pstll from Providencia stuartii.

122. Nucleic Acids Research, Vol. 33, P. 4775-4787.

123. Semenova,E., Minakhin,L., Bogdanova,E., Nagornykh,M., Vasilov,A., Heyduk,T., Solonin,A., Zakharova,M. and Severinov,K. (2005) Transcription regulation of the EcoRV restriction-modification system. Nucleic Acids Res., 33, 6942-6951.

124. Shea M.A., and Ackers G.K. (1985) The OR control system of bacteriophage lambda. A physical-chemical model for gene regulation. J. Mol. Biol., 181, 211-230.

125. Shilov I., Tashlitsky V., Khodoun M., Vasil'ev S., Alekseev Y., Kuzubov A., Kubareva E., Karyagina A. (1998) DNA-methyltransferase SsoII interaction with own promoter region binding site. Nucleic Acids Res. V. 26. P. 2659-64.

126. Smith H.O., Wilcox K.W. (1970). A restriction enzyme from Hemophilus influenzae I. Purification and general properties. J Mol Biol., 51(2), P.379-91.

127. Sneppen,K., Dodd,I.B., Shearwin, K.E., Palmer, A.C., Schubert, R.A., Callen, B.P. and Egan, J.B. (2005) A Mathematical Model for Transcriptional Interference by RNA Polymerase Traffic in Escherichia coli. J. Mol. Biol., 346, P. 399-409.

128. Som S, Bhagwat AS, Friedman S. (1987) Nucleotide sequence and expression of the gene encoding the EcoRII modification enzyme. Nucleic Acids Res., 15(1), P.313-332.

129. Som S., and Friedman S. (1997) Characterization of the intergenic region which regulates the Mspl restriction-modification system. J. Bacteriol., V. 179. P. 964—967.

130. Som S., and Friedman S. (1994) Regulation of EcoRII methyltransferase: effect of mutations on gene expression and in vitro binding to the promoter region. Nucleic Acids Res., V. 22. P.5347-5353.

131. Soper B.W., Hollister W.R., Reddy K.J. (1996) Characterization of additional host restriction-modification systems in the unicellular cyanobacterium Cyanothece sp. Biochem. Biophys. Res. Commun., V. 223. P. 24-30.

132. Sorokin,V., Severinov.,K and Gelfand, M. (2008) Systematic prediction of control proteins and their DNA binding sites. Nucleic Acids Res. 1-11.

133. Streeter,S.D., Papapanagiotou,I., McGeehan,J.E. and Kneale,G.G. (2004) DNA footprinting and biophysical characterization of the controller protein C.Ahdl suggests the basis of a genetic switch. Nucleic Acids Res., 32, 6445-6453.

134. Studier, F. W., and P. K. Bandyopadhyay. (1988). Model for how type I restriction enzymes select cleavage sites in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4677— 4681.

135. Suzuki M., Brenner S.E., Gerstein M. and Yagi N. (1995) DNA recognition code of transcription factors. Protein Eng., V.8. P. 319-328.

136. Suzuki M. and Yagi N. (1994) DNA recognition code of transcription factors in the helix-turn-helix, probe helix, hormone receptor, and zinc finger families. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 91. P.12357-12361.

137. Tamulaitiene,G., Grazulis,S., Janulaitis,A., Janowski,R., Bujacz,G., Jaskolski,M. (2004) Crystallization and preliminary crystallographic studies of a bifunctional restriction endonuclease Eco57I. Bioch. Bioph. Acta, 1698(2), 251- 254.

138. Tao T., Bourne J.C. and Blumenthal R.M. (1991) A family of regulatory genes associated with type II restriction-modification systems. J. Bacteriol., V. 173. P. 13671375.

139. Tao T. and Blumenthal R.M. (1992) Sequence and characterization of pvuIIR, the PvuII endonuclease gene, and of pvuIIC, its regulatory gene. J. Bacteriol., V. 174. P. 3395-3398.

140. Tucholski, J., Zmijewski, J. W. & Podhajska, A. J. (1998). Two intertwined methylation activities of the Mmel restriction-modification class-IIS system from Methylophilus methylotrophus. Gene, 223, 293-302.

141. Vesely Z., Muller A., Schmitz G.G., Kaluza K., Jarsch M., Kessler C. (1990) i?/eAI: a novel class-IIS restriction endonuclease from Rhizobium leguminosarum recognizing 5'-CCCACA(N)i2-3* and 3'-GGGTGT(N)9-5'. Gene., V. 95. P. 129-113.

142. Vijesurier R. M., Carlock L., Blumenthal R. M., and Dunbar J. C. (2000) Role and mechanism of action of C. PvuII, a regulatory protein conserved among restriction-modification systems. J. Bacteriol. V. 182. P. 477-487.

143. Vincze R.J., Posfai J. and Macelis D. (2005) REBASE restriction enzymes and DNA methyltransferases. Nucleic Acids Res., V. 33. P. 230-232.

144. Voelker L.L., Dybvig K. (1996) Gene transfer in Mycoplasma arthritidis: Transformation, conjugal transfer of Tn916, and evidence for a restriction system recognizing AGCT. J. Bacteriol., V. 178. P. 6078-6081.

145. Watson R., Zuker M., Martin S.M., Visentin L.P. (1980) A new site-specific endonuclease from Neisseria cinerea. FEBS Letters Res., V. 118. P. 47.

146. Whitehead P.R., Brown N.L. (1985) A simple and rapid method for screening bacteria for II restriction endonucleases: enzymes in Aphonothece halophytica. Arch. Microbiol. V. 141. P. 70-74.

147. Wilson G.G. (1991) Organization of restriction-modification systems. Nucleic Acids Res. V. 19. P. 2539-2565.

148. Xia YN, Burbank DE, Uher L, Rabussay D, Van Etten JL.(1987) IL-3A virus infection of a Chlorella-like green alga induces a DNA restriction endonuclease with novel sequence specificity. Nucleic Acids Res., 15(15):6075-90.

149. Xia Y., Burbank D.E., Van Etten J.L. Restriction endonuclease activity induced by NC-1A virus infection of a Chlorella-like green alga. // Nucleic Acids Res. 1986. V. 14. P.6017T6030.

150. Zakharova M., Minakhin L., Solonin A., and Severinov K. (2004) Regulation of RNA polymerase promoter selectivity by covalent modification of DNA. J. Mol. Biol. V. 335. P. 103-111.

151. Zhang,Y., Nelson,M., Nietfeldt, J W., Burbank, D E. and Van Etten J L. (1992) Characterization of Chlorella virus PBCV-1 CviAII restriction and modification system. Nucleic Acids Res., 20, P.5351-5356.

152. Zheleznaya L.A., Kainov D.E., Yunusova A.K., Matvienko N.I. (2003) Regulatory C protein of the EcoRV modification-restriction system. Biochemistry (Mosc), V. 68. P. 125-132.1. Благодарности

153. Также хотелось бы высказать благодарность Леониду Минахину за поддержку и бесценные советы при освоении методик, Анатолию Василову за моральную поддержку и сопереживание.

154. Отдельно хотелось бы поблагодарить Максима Нагорных за нахождение нужных слов и предметов для поддержания моего душевного спокойствия.

Информация о работе

Богданова, Екатерина Сергеевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II C-белками - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы