Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии генов системы рестрикции-модификации типа II Eco29kl

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии генов системы рестрикции-модификации типа II Eco29kl"

На правах рукописи

НАГОРНЫХ МАКСИМ ОЛЕГОВИЧ

Регуляция экспрессии генов системы рестрикции-модификации типа II Есо29к1

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2010

003491007

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино и в лаборатории молекулярных механизмов транскрипции прокариот Института им. Ваксмана, г. Пискатавэй, шт. Нью Джерси, США.

Научные руководители: кандидат биологических наук

Захарова Марина Викторовна

доктор биологических наук Северинов Константин Викторович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна

кандидат биологических наук Масулис Ирина Станиславовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва.

Защита диссертации состоится «/У'» февраля 2010 г. в ""часов на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН, г. Пущино.

Автореферат разослан « января 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Крупнейшая часть живых организмов в биосфере представлена бактериями, поэтому большая часть генетической информации -бактериальная (Whitman et al., 1998). Главной основой эволюционного развития бактерий является горизонтальный перенос генов (Holmes et al., 2003; Lawrence, 2001; Jain, 2002; Gogarten, 2002). Среди процессов, контролирующих перенос генов, одну из центральных ролей играет действие систем рестрикции-модификации.

К настоящему времени открыто несколько тысяч систем рестрикции-модификации в бактериях и архебактериях (Roberts et al., 2007). Наибольший интерес вызвало изучение систем рестрикции-модификации типа II, которые состоят из двух ферментов, узнающих одинаковую последовательность ДНК, но имеющих разное действие — эндонуклеазы рестрикции и метилтрансферазы. Эндонуклеаза вносит двухцепочечный разрыв в [«модифицированной ДНК (например, вирусной ДНК во время инфицирования бактериальной клетки бактериофагом), а метилтрансфераза защищает хозяйскую ДНК от действия эндонуклеазы рестрикции, модифицируя основания ДНК в сайте узнавания. Таким образом, система рестрикции-модификации образует примитивную иммунную систему бактериальной клетки. Однако системы рестрикции-модификации обеспечивают не только сохранность генетической информации бактериальной клетки-хозяина, но и способствуют горизонтальному переносу генов, что обеспечивает бактериальной популяции постоянное эволюционирование и адаптацию к новым экологическим условиям. Несомненно, что интерес к изучению систем рестрикции-модификации типа II был обусловлен использованием эндонуклеаз рестрикции этого типа в качестве одного из главных инструментов научных исследований в молекулярной биологии. Но и кроме прикладного аспекта, системы рестрикции-модификации типа II представляют собой хорошую модель для изучения взаимодействия биологических макромолекул. Благодаря разнообразию структурной организации таких систем, они очень удобны для исследования регуляции экспрессии генов, так как экспрессия обоих генов должна быть строго регулирована, чтобы сохранять баланс между этими антагонистичными ферментативными активностями в бактериальной клетке. Поскольку исследование молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии, то использование систем рестрикции-модификации типа II в качестве модельных объектов трудно переоценить.

До настоящего времени основное внимание уделялось изучению регуляции систем рестрикции-модификации типа II на уровне транскрипции, где основными регуляторами экспрессии генов являются метилтрансферазы или С-белки. Однако оставалась группа систем рестрикции-модификации типа II, о регуляции которых известно крайне мало, поскольку в них не были обнаружены регуляторы транскрипции, типичные для систем рестрикции-модификации типа II. В эту группу

входит система рестрикции-модификации Есо29к1 (СРМ Есо29к1), регуляция которой была исследована в данной работе.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование регуляции экспрессии генов СРМ Есо29к1. Для достижения указанной цели ставились следующие задачи:

-исследовать организацию регуляторных элементов в СРМ Есо29к1; -определить роль каждого из найденных регуляторных элементов в регуляции экспрессии генов СРМ Есо29к1;

-предложить модель регуляции СРМ Есо29кГ;

Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН и в лаборатории проф. Северинова К.В. института микробиологии Ваксмана, университет Ратгерс штата Нью-Джерси, США.

Научная новизна. Впервые получены данные о регуляции экспрессии генов СРМ Есо29к1, которая относится к группе так называемых "линейных" систем рестрикции-модификации типа II.

Продемонстрировано, что перед геном эндонуклеазы рестрикции находятся два промотора, с которых происходит синтез бицистронных мРНК, кодирующих оба фермента СРМ Есо29к1. Установлено, что в структурной части гена эндонуклеазы рестрикции находится промотор гена метилтрансферазы, с которого транскрибируется моноцистронная мРНК, кодирующая только метилтрансферазу. Показано, что в структурной части гена эндонуклеазы находятся два промотора, транскрипция с которых конвергентна транскрипции гена эндонуклеазы рестрикции. Показано, что активность антисенс-промоторов негативно влияет на экспрессию гена эндонуклеазы на пост-транскрипционном уровне.

Практическое значение работы. Выявление механизмов регуляции экспрессии генов является одной из задач фундаментальных исследований в молекулярной биологии. Однако результаты этих исследований позволяют применять накопленные знания на практике. Регуляторные механизмы обнаруженные в системах рестрикции-модификации, могут с успехом применяться для создания искусственных молекулярных переключателей генной экспрессии. В частности, природный механизм подавления экспрессии токсичного для бактериальной клетки гена эндонуклеазы в системе рестрикции-модификации Есо29к1, может быть применен для создания искусственных антисенс-РНК-ингибиторов генной экспрессии. Это позволяет применять данный способ регуляции экспрессии генов, как в научных исследованиях, так и в практической деятельности.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы диссертации были представлены на следующих российских и международных конференциях: на 11-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2007), на международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию

со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), на 5-ом международном конгрессе "5th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, Wills Hall" (Bristol UK, 2004), на международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008), на международной конференции "Meeting on Molecular Genetics of Bacteria & Phages" (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 2008) и на международной конференции "Sensory and regulatory RNAs in prokaiyotes" (Berlin, 2009)

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает > источника. Работа

содержит 2 рисунков и таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение тотальной РНК. Тотальную РНК выделяли из культуры клеток Е. coli с оптической плотностью 0,4-0,6. Очистку РНК проводили с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen) в соответствии с инструкцией фирмы производителя.

Реакция удлинения праймера. Реакцию обратной транскрипции проводили на тотальной РНК (~2-Змкг) с использованием 200 ЕД обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen) в присутствии 1 пМ у-Р32 меченного специфичного праймера. Реакцию удлинения праймера выполняли 50 минут при 50°С и останавливали прогреванием при 85°С в течение 5 минут. Продукты реакции обрабатывали хлороформом, осаждали этанолом и растворяли в буфере для нанесения. Продукты реакции разделяли в 7% денатурирующем геле и экспонировали с рентгеновской пленкой.

ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени. Реакция обратной транскрипции ставилась на 2мкг тотальной РНК, в присутствии специфичного олигонуклеотида и 200 ЕД обратной транскриптазы SuperScript III из набора "FirstStrand Synthesis Kit for RT-PCR" (Invitrogen) по описанному производителем протоколу. 1мкл от объема всей реакции обратной транскрипции был использован в качестве матрицы для ПЦР с детекцией в реальном времени. Уровни экспрессии генов Ыа и cat использовались для нормализации. Каждая реакция была поставлена трижды, в качестве результата бралось среднее значение. Уровень транскрипции определяли по значениям порогового цикла с учетом того, что концентрация исходных специфических фрагментов ДНК увеличивается приблизительно как 2N, где N -количество циклов.

Определение Р-галактозидазной активности. Для определения р-галактозидазной активности культуру клеток Е. coli с соответствующими плазмидами выращивали до оптической плотности 0.4-0,6. Точное значение оптической плотности фиксировалось для каждого измеряемого образца. Клетки из 1 мл культуры осаждали центрифугированием, суспендировали в 0,64 мл Z-буфера, добавляли лизоцим (2,5 мг/мл). После этого добавляли 8мкл 10% TritonXlOO, перемешивали на вортексе и помещали в лед. Подготовленные рабочие разведения экстракта инкубировали при 30°С в течение 5 минут, далее в образцы добавлялся раствор о-нитрофенил-D-галактопиранозида (ONPG) (4 мг/мл). Реакция останавливалась добавлением 0,4 мл 1М Na2C03. Время реакции фиксировалось для каждого образца. Активность р-галактозидазы рассчитывалась по формуле: (1000 х А42о) / (время реакции х ОП595).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Структурная организация генов СРМ Eco29kI. СРМ Eco29kI локализована на плазмиде рЕС029 в природном штамме Escherichia coli 29k (Pertzev, 1992) и состоит из двух генов, которые кодируют эндонуклеазу рестрикции (eco29kIR) и метилтрансферазу (есо29к1М). Гены расположены в порядке eco29kIR^eco29kIM. Ранее было сделано предположение, что гены СРМ Eco29kI транскрибируются в виде оперона.

Промоторы гена эндонуклеазы рестрикции СРМ Eco29kI. Анализ области перед геном эндонуклеазы методом удлинения праймера, выявил две точки начала транскрипции. С помощью метода транскрипции in vitro и перманганатного футпринтинга, было показано, что РНК-полимераза формирует открытые комплексы, соответствующие -10-областям двух промоторов, названных ResPl и ResP2 (рис.1).

есо29кШ

RH Т2 I

гг-

eco29UR

Res_P2 Res Р1

-10 область +1 [* -10 область +-] ["

5' GGTTGGGGTA TTAGCTTTAT GATCGWCA TAGGTGATGT TGAGTAGGAG TGTTAATATA AAGACCTTTC GGAAAACATA *"Í?CACAATA AGAAA З1 3' ССААССССАТ AATCGAAATA CTAGCATAGT АТССАСТАСА АСТСАТССТС АСААТТАТАТ TTCTGGAAAG CCTTTTGTAT TACGTGTTAT ТСТТТ 51

-1 .28

Рис.1 Схема расположения промоторов гена эндонуклеазы рестрикции. Стартовые точки транскрипции промоторов ResPl и ResP2 обозначены стрелками. -10-области промоторов выделены чертой над последовательностью ДНК. Серым цветом выделен стартовый кодон трансляции эндонуклеазы рестрикции.

Расстояние между двумя точками начала транскрипции промоторов ResPI и ResP2 составляет 26 нуклеотидов (рис.2А). Для определения силы промоторов in vivo, фрагмент ДНК, содержащий их. был клонирован в плазмиду. которая несла беспромоторный репортерный ген galK. В результате была получена плазмида pR-galK. Также были получены производные этой плазмиды - pRmutl-galK. pRmut2-gaIK и pRmut3-galK, в которых промоторы ResPl и ResP2 инактивированы мутациями по отдельности и вместе. С обоих промоторов транскрипция гена galK осуществлялась эффективно (рис.2Б). Результаты, полученные методом удлинения праймера, указывают на то. что транскрипция с промотора ResP2 происходит эффективнее, чем с промотора ResPl.

Для проверки трансляционной активности обоих вариантов мРНК. которые считываются с промоторов ResPl и ResP2. были получены плазмидные конструкции, в которых часть гена эндонуклеазы была трансляционно слита с репортерным геном lacZ. Результаты измерения активности Р-галактозидазы в клетках, несущих эти плазмиды показывают, что трансляция может происходить с обеих мРНК (рис.3).

Рис.2 Определение стартовых точек транскрипции промоторов гена эндонуклеазы рестрикции и транскрипционной активности этих промоторов in vivo. А) Радиоавтограф 6% денатурирующего полиакриламидного геля, в котором разделены продукты реакции удлинения праймера и продукты секвенирующей реакции. Б) Чашка с индикаторной средой МакКонки с добавлением галактозы. Секторами рассеяны клетки Е. coli HB 101. несущие плазмиды с репортерным геном galK под контролем промоторов гена эндонуклеазы рестрикции: 1) промоторы ResPl и ResP2; 2) промотор ResP2; 3) промотор ResPl: 4) инактивация обоих промоторов.

Таким образом, ген eco29kIR имеет два промотора и эндонуклеаза рестрикции может транслироваться как с мРНК, которая транскрибируется с промотора ResPl, так и с мРНК, которая транскрибируется с промотора ResP2.

Рис.3 Определение трансляционной активности мРНК, которые синтезируются с промоторов гена эндонуклеазы.

Представлена диаграмма с уровнями активности ß-галактозидазы в клетках Е. coli Z85, несущих плазмиды с репортерным геном lacZ. трансляционно слитым с геном эндонуклеазы.

Промотор гена метилтрансферазы СРМ Eco29kI. Методами транскрипции in vitro и перманганатного футпринтинга был обнаружен промотор перед геном метилтрансферазы, находящийся внутри структурной части гена эндонуклеазы на расстоянии -220 нукпеотидов от стартового кодона трансляции метилтрансферазы и названный нами MethP (рис.4). Фрагмент ДНК, содержащий промотор MethP, был клонирован в плазмиду, несущую беспромоторный репортерный ген galK. Было показано, что с промотора MethP эффективно осуществлялась транскрипция in vivo (рис.эА).

Res Р Res Р2 Res PI

к<-> Р2 Нм 14 f f •

eco 29 klR

MMh V

...Г...........

тг^"

ееo29klM

MethP -10 область p

5' CATGTCGCTT TGTTATCTTT GAGGCTACGG GGTCTGATAT GATTAGTACA GTTGAGGCCG Л AGTAATTTTA CATA V AGA TCATTAGAGA 3' 3' GTACAGCGAA ACAATAGAAA CTCCGATGCC CCAGACTATA CTAATCATGT CAACTCCGGC A TCATTAAAAT GTATTACTCT AGTAATCTCT 5'

-462 ' *689

Рис.4 Схема расположения промотора Ме&Р. Стартовая точка транскрипции промотора МеШР обозначена стрелкой. -Ю-область промотора выделена чертой над последовательностью ДНК. Серым цветом выделен стартовый кодон трансляции метил трансферазы.

Методом удлинения праймера установлено, что 5'-нетранслируемая область не оказывает влияния на транскрипцию с промотора МегЬР (рис.5Б). На основании полученных результатов, было сделано предположение, что МеЛР является промотором гена есо29к1М, с которого может считываться моноцистронная мРНК, кодирующая метилтрансферазу.

Б

G А т с: * Я-

pM-gafl<

pUTR-galK

pMmutl-galK

pM+lTR-gaJK

Рис.5 Транскрипционная активность in vivo и определение стартовой точки транскрипции промотора MethP. А) Чашка с индикаторной средой МакКонки с добавлением галактозы. Секторами рассеяны клетки Е. coli НВ101, несущие плазмиды с репортерным геном galK\ 1) под контролем промотора MethP; 2)под контролем нетранслируемой области между промотором MethP и стартовым кодоном гена метилтрансферазы; 3)под контролем промотора MethP с точечными мутациями; 4) под контролем промотора MethP с добавлением нетранслируемой области между промотором MethP и стартовым кодоном гена метилтрансферазы. Б) Радиоавтограф 6% денатурирующего полиакриламидного геля, в котором разделены продукты реакции удлинения праймера на образцах РНК. выделенных из клеток, несущих указанные плазмиды.

CPM Eco29kI кодирует два типа мРНК. Для подтверждения биологической роли промотора гена метилтрансферазы был проведен делеционный анализ СРМ Eco29kI. В результате получен делеционный вариант плазмиды, кодирующей СРМ Eco29kI без промоторного региона гена эндонуклеазы - p29-ResPdel. Эксперимент по ограничению развития фага X vir показал, что клетки, несущие плазмиду p29-ResPdel не обладали эндонуклеазной активностью, но проявляли метилтрансферазную активность, т.е. были способны модифицировать ДНК бактериофага. Модифицированный бактериофаг был способен успешно развиваться в клетках, несущих полностью функциональную СРМ Eco29kI, то есть в бактериальных клетках с эндонуклеазной активностью (рис.6).

R.Eco29ki активность in vivo

M.Eco29kI активность in vivo

Фаг

.Плашидй

ЭР-

ЭР+

МТ+

Рис.6 Результаты спот-теста по ограничению развития фага X vir на культурах клеток £. coli, несущих плазмиду р29, кодирующую СРМ Eco29kI и плазмиду с делеционным вариантом СРМ Eco29kI - p29-ResPdel. В случае плазмиды p29-ResPdel в клетках наблюдается метилтрансферазная активность.

Для подтверждения того, что в клетках, несущих плазмиду p29-ResPdel, метилтрансфераза транслируется с моноцистронной мРНК, был проведен эксперимент с использованием реакции обратной транскрипции и последующей амплификацией кДНК в полимеразной цепной реакции (ОТПЦР). Для этого были выделены препараты тотальной РНК из двух бактериальных культур - клетки первой культуры несли плазмиду, кодирующую СРМ Eco29kJ, а клетки второй культуры содержали плазмиду p29-ResPdeI. Оба образца РНК были использованы для постановки реакции обратной транскрипции с праймера, комплементарного 3" области гена метилтрансферазы. Полученные образцы кДНК были использованы в качестве матриц в полимеразной цепной реакции. В качестве праймеров использовали пару олигонуклеотидов, которая позволяла амплифицировать фрагменты кДНК, соответствующие только бицистронной мРНК, или другую пару, которая позволяла амплифицировать фрагменты кДНК. соответствующие как бицистронной, так и моноцистронной мРНК гена метилтрансферазы. Результат эксперимента показал, что в клетках, которые содержат плазмиду, кодирующую СРМ Eco29kI, транскрибируются как бицистронные мРНК (кодирующие оба гена), так и моноцистронные мРНК (кодирующие только метилтрансферазу). В случае клеток, несущих плазмиду p29-ResPdel, детектируется только кДНК. соответствующая моноцистронной мРНК, которая кодирует

метилтрансферазу М.Есо29к1, а кДНК, соответствующая бицистронной мРНК отсутствует (рис.7).

Данные эксперименты показывают, что ген метилтрансферазы имеет собственный промотор и, следовательно, метилтрансфераза транслируется как с общей бицистронной мРНК, так и с моноцистронной мРНК.

р29 р29-Яс5Р<к'1

-Х£-| г ■ ■ ■ ■ ^тт .,...••«»■" £ />•——

Ныдс.киш; РНК

3' 5: V

мРНК " мРНК

Обратная травскрницйя

кДНК__кДНК-

М I 2 3 4 5 6 7

Рис.7 Схема эксперимента по определению типов мРНК, кодируемых в СРМ Eco29kI. 1) ПЦР с праймеров. фланкирующих бицистронную мРНК (кДНК_р29 в качестве матрицы); 2) ПЦР с праймеров. фланкирующих бицистронную мРНК (плазмидная ДНК в качестве матрицы - положительный контроль); 3) ПЦР с праймеров. фланкирующих бицистронную мРНК (РНК в качестве матрицы - отрицательный контроль); 4) ПЦР с праймеров, фланкирующих моноцистронную мРНК (KflHK_p29-ResPdel в качестве матрицы); 5) ПЦР с праймеров, фланкирующих моноцистронную мРНК (плазмидная ДНК в качестве матрицы -положительный контроль); 6) ПЦР с праймеров, фланкирующих моноцистронную мРНК (РНК в качестве матрицы - отрицательный контроль); 7) ПЦР с праймеров, фланкирующих бицистронную мРНК (i^HK_p29-ResPdel в качестве матрицы).

Антисенс-промоторы СРМ Eco29kI. Дальнейший анализ структурной части гена зндонуклеазы методами перманганатного футпринтинга и транскрипции in vitro, выявил две близкорасположенные последовательности, находящиеся примерно в 150 нуклеотидах от стартового кодона трансляции гена зндонуклеазы. с которыми РНК-полимераза формировала открытые комплексы и осуществляла транскрипцию. Необычным оказалось то, что транскрипция с этих двух промоторов была направлена в сторону, противоположную направлению транскрипции гена зндонуклеазы (рис.8). Обнаруженные промоторы были названы ASP1 и ASP2 (от "antisense'').

Расстояние между стартовыми точками транскрипции ASP1 и ASP2 составляет 18 нуклеотидов (рис.9А). Эти два промотора образуют антисенс-промоторный регион

CPM Eco29kI. Фрагмент ДНК, содержащий антисенс-промоторный регион, транскрипционно слитый с беспромоторным репортерным

Re, г: Кс, Г!

г г-

AS 1*2 AS J>1

eco2'JkIR

\1«l» Г

ШЩЩ

>

+ 189 +208

5' AAGGTGCTGG GGTGTATGCT CTTTACTATA CAGGACATTA TTCATTATAT GATGAATATT GTCGTATAAA TAGGTTGGCA ТАТААССТТС 3' 3' TTCCACGACC С С AC AT AC G A GAAATGATAT GTCCTGTAAT AAGTAATATA CTACTTATAA GAGCATATTT ATCCAACCGT ATATTGGAAG 5' J AS_P2 -10 область J A5 R1 -10 область ■+1 +1

Рис.8 Схема расположения антисенс-промоторов. Стартовые точки транскрипции промоторов ASP! и ASP2 обозначены стрелками. -10-области промоторов выделены чертой под последовательностью ДНК.

геном galK обеспечивал его эффективную транскрипцию. В то же время транскрипция репортерного гена происходила с обоих антисенс-промоторов по отдельности, а в случае их одновременной инактивации транскрипция гена galK отсутствовала (рис.9Б).

А

t _£JL_ "чм -;"к

2 pASlmutl-galK

Ш2

pASl mul2-ííaIK

pASlmiilJ-galK

Рис.9 Определение стартовых точек транскрипции антисенс-промоторов и транскрипционной активности этих промоторов ir? vivo. А) Радиоавтограф 6% денатурирующего полиакриламидного геля, в котором разделены продукты реакции удлинения праймера и продукты секвенирующей реакции. Б) Чашка с индикаторной средой МакКонки с добавлением галактозы. Секторами рассеяны клетки Е. coli HB10!, несущие плазмиды с репортерным геном galK под контролем антисенс-промоторов: 1) промоторы ASP1 и ASP2; 2) промотор ASP2; 3) промотор ASP1; инактивация обоих промоторов.

Влияние транскрипции с антисенс-промоторов на транскрипцию гена

эндонуклеазы рестрикции есо29к1Я. Регуляция транскрипции ш уп>о изучалась с помощью серии рекомбинантных плазмид, полученных на основе плазмиды с

беспромоторным репортерным геном galK. Для изучения влияния транскрипции с антисенс-промоторов на транскрипцию с промоторов Яе5Р1 и ЯезР2 были получены четыре плазмидные конструкции: рКА8^а1К; рНА8тШ1-§а1К; рКА5тШ:2-§а1К; рКАБтШЗ^аК. Все четыре конструкции были получены клонированием фрагмента ДНК СРМ Есо29к1 (с -72 до +252 относительно начала гена эндонуклеазы), включающего в себя промоторы гена эндонуклеазы и антисенс-промоторы. Транскрипция репортерного гена galK во всех четырех плазмидах находилась под контролем промоторов гена эндонуклеазы. Различия между плазмидами заключались только в наличии или отсутствии точечных мутаций в -10-областях антисенс-промоторов. Эффект от мутаций антисенс-промоторов наблюдали по окраске колоний клеток, содержащих плазмиды, на индикаторной среде МакКонки. а также по уровню galK мРНК. Инактивация антисенс-промоторов как по отдельности, так и одновременно не изменяла окраску колоний клеток — она оставалась насыщенно красной (рис.ЮА). Анализ количества транскриптов методами ПЦР с детекцией продуктов в реальном времени и удлиненем праймера показал, что мутации антисенс-промоторов не приводят к изменению уровня мРНК, синтезируемых с промоторов ЛеБР! иКезР2 (Рис.1 ОБ; Рис. И А).

/:, Л г 4 J

М.

-LL

pRAS-galK

pRASniutl-galK

-iA

pRASnmt2-galK

rh Hn

П

nb

pRAS-pitK ¡"RASrital- RRASmHÍ- pfíASimii

Рис.10 Влияние транскрипции с антисенс-промоторов на транскрипцию гена эндонуклеазы рестрикции in vivo. А) Чашка с индикаторной средой МакКонки с добавлением галактозы. Секторами рассеяны клетки Е. col i НВ101, несущие плазмиды с репортерным геном galK под контролем промоторов гена эндонуклеазы рестрикции: 1) активны ASP1 и ASP2; 2) активен ASP2; 3) активен ASP1; 4) ASP] и ASP2 инактивированы Б) Относительный уровень транскриптов, инициированных с промоторов гена эндонуклеазы в клетках, несущих шгазмидиые конструкций с репортерным геном galK. Данные получены методом ПЦР с детекцией продуктов в реальном времени.

Влияние активности антисенс-промоторов на транскрипцию с промоторов гена эндонуклеазы также было проанализировано in vitro (рис.11Б). В реакции транскрипции in vitro использовался фрагмент ДНК. содержащий промоторы гена эндонуклеазы и антисенс-промоторы. Также использовался фрагмент с мутациями.

которые инактивировали антисенс-промоторы. Оказалось, что наличие или отсутствие активных антисенс-промоторов не влияло на уровень транскрипции промоторов гена эндонуклеазы. При этом продуктов, соответствовавших преждевременной терминации транскрипции, которые должны были бы образовываться в результате столкновения транскрибирующих навстречу друг другу молекул РНК-полимеразы - с промоторов гена эндонуклеазы и с антисенс-промоторов - также не наблюдалось.

Эти данные указывают на то, что транскрипция с антисенс-промоторов не влияет на транскрипцию с промоторов гена эндонуклеазы рестрикции.

А Г

А <: л т г Ь

lit'1' AS J"

Рис.11 Влияние транскрипции с антисенс-промоторов на транскрипцию гена эндонуклеазы рестрикции ш vivo и in vilro. А) Радиоавтограф 6% денатурирующего полиакриламидного геля, в котором разделены продукты реакции удлинения праймера и продукты секвенирующей реакции. На первой дорожке - результат реакции удлинения праймера при использовании РНК из клеток, несущих плазмиду. с клонированным перед репортерным геном galK, фрагментом ДНК СРМ Eco29kI. содержащим промоторы гена эндонуклеазы рестрикции и антисенс-промоторы. На второй дорожке - результат реакции удлинения праймера при использовании РНК из клеток, несущих плазмиду с этим же клонированным фрагментом ДНК СРМ Eco29kI, но с внесением инактивирующих точечных мутаций в антисенс-промоторы. Б) Результат реакции транскрипции in vitro на фрагменте ДНК СРМ Eco29kI. В первой реакции был использован фрагмент, содержащий промоторы гена эндонуклеазы и антисенс-промоторы. Во второй реакции был использован этот же фрагмент, но с мутациями в антисенс-промоторах.

Влияние активности антисенс-промоторов на экспрессию гена эндонуклеазы. Для изучения регуляции экспрессии генов СРМ Eco29kI на посттранскрипционном уровне и исследования влияния активности антисенс-промоторов на экспрессию гена эндонуклеазы, был получен ряд плазмидных конструкций, в которых различные участки генов eco29klR или есо29к1М были трансляционно-слиты с репортерным геном lacZ.

Анализируя результаты измерений активности (3-галактозидазы в клетках, несущих полученные плазмиды. можно заключить, что уровень экспрессии гена lacZ, транслируемого в рамке считывания эндонуклеазы в конструкции pR-lacZ (содержит

участок ДНК СРМ Eco29kI от -44 до +168 и, следовательно, содержит промоторы гена эндонуклеазы), примерно в 8 раз выше, чем уровень экспрессии lacZ в рамке считывания метилтрансферазы в конструкции pM-lacZ (содержит фрагмент ДНК Eco29kI от +364 до +806 и, следовательно, содержит промотор гена метилтрансферазы) (рис.12). Наблюдаемая разница в уровнях экспрессии генов СРМ Eco29kI не может обеспечить опережающий синтез метилтрансферазы при установлении СРМ Eco29kI в бактериальной клетке; скорее наоборот, должен наблюдаться преимущественный синтез эндонуклеазы, что должно приводить к гибели клеток при попадании в них генов СРМ Eco29kI.

Нами было обнаружено, что экспрессия репортерного гена lacZ. трансляционно-слитого с 5'-областью гена eco29kIR сильно ослабляется, за счет включения антисенс-промоторов. Так, уровень экспрессии гена lacZ, обеспечиваемый конструкцией pRAS-lacZ (содержит участок ДНК СРМ Eco29kI от -44 до +282 и. следовательно, содержит антисенс-промоторы), понижен примерно в 8 раз, по сравнению с уровнем экспрессии в клетках с плазмидой pR-lacZ (содержит участок ДНК СРМ Eco29kl от -44 до + 168 и. следовательно, не содержит антисенс-промоторы) (рис.12).

jik-lac/-pRitiutl-lacZ pKmuü-lncZ Г- ' W ' pRAS-lacZ

"ff"_jX_£

ff

pRASM-lacZ f " pRASMett-larZ

"¿"'i"' r' pKASmutJ-lacZ

V rl ' pR-ASmurZ-lacZ

f Г

-13.

>RA

Hila.7

ff

pM-IucZ

^ _t pEt(*44mut-lacZ

Рис.12 Экспрессия генов эндонуклеазы и метилтрансферазы ш vivo. Диаграмма отображает результаты измерений активности Р-галактозидазы в клетках Е. coli Z85, несущих в себе плазмидные конструкции с репортерным геном lacZ. трансляционно-слитым с геном эндонуклеазы или с геном метилтрансферазы. Антисенс-промоторы снижают в 8 раз экспрессию гена lacZ, трансляционно-слитого с геном эндонуклеазы рестрикции. Трансляция метилтрансферазы происходит эффективнее с моноцистронной мРНК. чем с бицистронной мРНК.

Дальнейшее увеличение длины клонируемого фрагмента СРМ Есо29к1 вплоть до стартового кодона гена есо29к1М не приводило к дополнительному снижению активности р-галактозидазы.

Для подтверждения необходимости активности антисенс-промоторов для понижения уровня экспрессии гена эндонуклеазы. на основе плазмиды р!*А5-1ас2 была получена плазмида р!1А8тЩЗ-1ас2, содержащая инактивирующие мутации в -

10-областях обоих антисенс-промоторов. Инактивация антисенс-промоторов приводила к восстановлению уровня экспрессии репортерного гена до уровня экспрессии, характерного для клеток с плазмидой рЯ-1ас2.

Таким образом, наличие активных антисенс-промоторов действительно достаточно для падения уровня экспрессии гена (3-галактозидазы, находящегося в рамке считывания эндонуклеазы рестрикции. Это указывает на то, что действие антисенс-промоторов снижает уровень экспрессии гена эндонуклеазы до уровня экспрессии гена метилтрансферазы, тем самым, выравнивая продукцию этих ферментов в бактериальной клетке.

Падение активности [3-галактозидазы в клетках, несущих плазмиду рЯА8-1ас2, может быть обусловлено двумя факторами: 1) снижением эффективности трансляции; 2) снижением количества транскриптов. Для выяснения причины изменения экспрессии репортерного гена 1ас1 под действием антисенс-промоторов были определены уровни 1ас2 мРНК в клетках, содержащих полученные плазмидные конструкции. Суммарные данные представлены на диаграмме (рис.1 ЗА).

с; л т с■ с. л т с -

§§§ ** "'5-it;:^.

"'.г- ' "... **

S

**>

.фу ■

-Z

Рис.13 Относительные уровни транскриптов гена ß-галактозидазы, стоящего в рамке считывания гена эндонуклеазы или гена метилтрансферазы. А) На диаграмме представлены результаты измерений относительных уровней транскриптов в клетках Е. coli Z85, несущих в себе плазмидные конструкции с репортерным геном lacZ, трансляционно-слитым с геном эндонуклеазы или с геном метилтрансферазы. Б) Радиоавтограф 6% денатурирующего полиакриламидного геля, в котором разделены продукты реакции удлинения праймера и продукты секвенирующей реакции. На первой дорожке результат реакции удлинения праймера при использовании РНК из клеток, несущих плазмиду, в которой репортерный ген lacZ трансляционно-слит с участком гена эндонуклеазы до антисенс-промоторов. На второй дорожке результат реакции удлинения праймера при использовании РНК из клеток, несущих плазмиду, в которой репортерный ген lacZ трансляционно-слит с участком гена эндонуклеазы после антисенс-промоторов.

Из результатов, представленных на диаграмме видно, что снижение активности ß-гапактозидазы в клетках, несущих плазмидные конструкции с антисенс-промоторами хорошо коррелирует со снижением уровня мРНК. При этом во всех случаях стартовые точки этих мРНК соответствуют промоторам гена эндонуклеазы (рис.13Б).

Снижение уровня мРНК в клетке может быть вызвано двумя причинами: 1) снижением скорости транскрипции данной мРНК; 2) увеличением скорости деградации данной мРНК в клетке. Поскольку в предыдущих экспериментах in vitro и in vivo было показано, что транскрипция с антисенс-промоторов не влияет на уровень транскрипции гена эндонуклеазы, то снижение уровня транскриптов репортерного гена IacZ в присутствии активных антисенс-промоторов может быть вызвано ускоренной деградацией мРНК, обусловленной действием антисенс-промоторов.

Активность антисенс-промоторов вызывает деградацию бицистронной мРНК. Из результатов предыдущего эксперимента с трансляционно-слитым репортерным геном IacZ и геном эндонуклеазы видно, что снижение уровня бицистронных мРНК связано с действием антисенс-промоторов. В клетках, несущих плазмиду, кодирующую СРМ Eco29kI, продукты, транскрибируемые с антисенс-промоторов не детектировались. Возможно, что антисенс-транскрипты не детектировались из-за взаимодействия с бицистронной мРНК и последующей деградации РНК-дуплексов. Предположение о том, что отсутствие детектируемых продуктов транскрипции с антисенс-промоторов в клетках, несущих плазмиду с СРМ Eco29kI, связано с активностью промоторов гена эндонуклеазы, было подтверждено опытным путем. Из предыдущих экспериментов известно, что в СРМ Eco29kI транскрибируются мРНК двух типов: бицистронные мРНК, кодирующие оба гена -eco29kIR и есо29к1М и моноцистронные мРНК, с которых происходит трансляция метилтрансферазы. Также было определено, что в случае плазмиды p29-ResPdel с делецией промоторного региона гена эндонуклеазы, происходит синтез только моноцистронной мРНК с промотора гена метилтрансферазы. В эксперименте проводили детекцию антисенс-транскриптов методом удлинения праймера, используя препараты тотальной мРНК из двух культур клеток, несущих плазмиды - р29 или р29-ResPdel.

Как отмечалось раньше, антисенс-транскрипты не детектировались в клетках с СРМ Eco29kI; однако в клетках, несущих мутантную плазмиду p29-ResPdel, антисенс-транскрипты присутствовали (рис.МА). Кроме того, при определении стартовой точки транскрипции гена метилтрансферазы методом удлинения праймера было обнаружено, что в препарате РНК из клеток, содержавших СРМ Eco29kI, наблюдались многочисленные продукты реакции обратной транскрипции, соответствующие 5' концам РНК, расположенным как ниже сигнала, соответствующего промотору MethP, так и выше его. В препарате РНК из клеток, несущих плазмиду p29-ResPdel, такие продукты отсутствовали, и детектировался лишь сигнал, соответствующий промотору MethP (рис.14Б). Таким образом, можно сделать вывод о том, что множественные продукты реакции обратной транскрипции, наблюдаемые в случае препарата РНК из клеток, несущих плазмиду с СРМ Eco29kI, соответствуют продуктам деградации бицистронных мРНК. Принимая во внимание, что антисенс-транскрипты в этом случае не детектируются, и, с другой стороны, что падение уровня бицистронной мРНК связано с действием антисенс-промоторов, можно сделать предположение, что

антисенс-транскрипты образуют с бицистронными мРНК дуплексы и вызывают их деградацию в клетке.

Рис.14 А) Детекция антисенс-транскриптов. На первой дорожке - результат реакции удлинения праймера при использовании РНК из клеток, несущих плазмиду р29. кодирующую СРМ Eco29kl. На второй дорожке - результат реакции удлинения праймера при использовании РНК из клеток, несущих плазмиду p29-ResPdel. кодирующую делеционный вариант СРМ Eco29kI, не содержащий промоторы гена эндонуклеазы. Антисенс-транскрипты детектируются только в случае делеционного варианта СРМ Eco29kl Б) Детекция моноцистронного транскрипта гена метилтрансферазы. На первой дорожке - результат реакции удлинения праймера при использовании РНК из клеток, несущих плазмиду р29. На второй дорожке - результат реакции удлинения праймера при использовании РНК из клеток, несущих плазмиду p29-ResPdel. В случае полной СРМ Eco29kI в ходе реакции обратной транскрипции образуются кДНК продукты, соответствующие разнообразным продуктам деградации бицистронной мРНК.

Деградация мРНК является важным механизмом регуляции экспрессии генов в клетках всех живых организмов. Известно, что стабильность мРНК (их защита от действия эндо- и экзорибонукпеаз) зависит от их взаимодействия с рибосомами. Защита бактериальных мРНК происходит за счет двух процессов: 1) связывания рибосом с последовательностями Шайн-Дальгарно; 2) движения транслирующих рибосом вдоль мРНК. Связывание рибосом с последовательностью Шайн-Дальгарно имеет большее значение для стабилизации мРНК в клетке, чем собственно сам процесс трансляции и зависит от свойств последовательности Шайн-Дальгарно (Wagner. 1994). Одним из механизмов действия цис-кодируемых антисмысловых РНК (асРНК) является блокирование места посадки рибосом на мРНК-мишени и последующая деградация РНК-дуплексов (Brantl, 2007).

Для выяснения, реализуется ли такой механизм в случае асРНК, кодируемых в СРМ Eco29kl. были получены две плазмиды с репортерным геном lacZ - pRAS_SD-lacZ и pRASmut3_SD-lacZ (рис.15). В плазмиде pRAS_SD-lacZ за фрагментом СРМ

18

Eco29kI (содержит участок ДНК СРМ Eco29kI от -44 до +282 и, следовательно, содержит антисенс-промоторы) был расположен беспромоторный ген IacZ с собственной последовательностью Шайн-Дальгарно и стартовым кодоном трансляции. Плазмида pRASmut3_SD-lacZ была устроена таким же образом, но содержала точечные мутации, которые инактивируют антисенс-промоторы. Таким образом, плазмиды pRASSD-lacZ и pRASmut3_SD-lacZ представляют собой модификацию плазмид pRAS-lacZ и pRASmut3-lacZ с дополнительной последовательностью Шайн-Дальгарно перед геном IacZ. С помощью метода ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени в клетках, несущих эти плазмиды, были измерены уровни мРНК гена IacZ. Оказалось, что наличие дополнительной последовательности Шайн-Дальгарно, которая не блокируется асРНК и, следовательно, остается доступной для рибосом даже после взаимодействия асРНК с мРНК. транскрибированной с промоторов гена эндонуклеазы, позволяет стабилизировать мРНК в клетках, несущих плазмиду pRAS_SD-lacZ.

pRAS-laeZ

■Mi

pRAS SD-lacZ АтяшшжЗвй® ?'*?

Неэффективная l |!;1ш:.н1ПИ я Деградация мРНК

Эффективная трансляции Стабилизации мРНК

X

Дс! радакия .тттинчдаш •мРНК-асРИК-

Рис.15 асРНК блокируют трансляцию мРНК и вызывают их деградацию. Схема структуры участка плазмиды pRAS-lacZ и плазмиды рЯА5_50-1ас2. На диаграмме представлен результат измерения относительного уровня транскриптов в клетках, несущих плазмиды рЯА5-1ас7, рЯАЗттЗЧасг, рЯА5_8П-1асг и рКА8тигЗ_50_1ас2.

Таким образом, ингибирование экспрессии гена эндонуклеазы есо29к!К происходит на пост-транскрипционном уровне за счет блокирования связывания рибосом с последовательностью Шайн-Дальгарно, вследствие образования дуплексов между бицистронными мРНК и асРНК и их дальнейшей деградации.

Модель регуляции экспрессии генов СРМ Есо29к1. На основании полученных результатов была построена модель регуляции экспрессии генов СРМ Бсо29к1

(рис.16). Так как промоторы СРМ Есо29к1 имеют примерно одинаковую силу и транскрипция с антисенс-промоторов не влияет на транскрипцию гена эндонуклеазы, то можно представить, что на стадии установления СРМ Есо29к1 в новом бактериальном хозяине синтезируются три типа РНК: а) бицистронные мРНК (кодируют эндонуклеазу и метилтрансферазу); б) моноцистронные мРНК (кодируют метилтрансферазу) и в) антисмысловые РНК (синтезируемые с антисенс-промоторов). С моноцистронных мРНК транслируется метилтрансфераза, что дает клетке дополнительное количество этого фермента для упреждающего метилирования генома до появления эндонуклеазной активности в бактериальной клетке. Антисмысловые РНК взаимодействуют со значительной частью бицистронных мРНК, блокируя трансляцию эндонуклеазы рестрикции и вызывая деградацию РНК-дуплексов. Возможно, цистрон, кодирующий метилтрансферазу. успевает транслироваться, что тоже давало бы дополнительное количество метилтрансферазы на стадии установления СРМ Есо29к1 в новом хозяине.

Уровень трянскриншж

бициорокшш м Р! IК ЧШ101!1*1Тр0111!ЯЯ ч Р Н К

Посг-траткрмпшю........ \ |11)и('111.

МстИ

50

Ьнщич ровная м!1ик(- Н%)

Ьишк'ЦНЯШИМ МГНЮ. -12%)

Моишшспкышаи м I' 11К

С -

X

Дсгрялшии дуплексов "бинисгронняя мРНК'-асРНК"

• •

Рис.16 Модель регуляции экспрессии генов СРМ Есо29к1 (описание в тексте).

С оставшейся части бицистронных транскриптов происходит трансляция обоих белков - эндонуклеазы и метилтрансферазы. Это происходит после метилирования всех сайтов узнавания в геноме бактериальной клетки, т.е. после установления СРМ Есо29к1 в новом хозяине. В этот момент в клетке в основном детектируются бицистронные транскрипты. Эффективность трансляции метилтрансферазы с такой мРНК ниже, чем с моноцистронной, что ведет к снижению уровня синтеза метилтрансферазы в бактериальной клетке.

выводы

1. Охарактеризованы два промотора гена эндонуклеазы и отдельный промотор гена метилтрансферазы. С них транскрибируются мРНК двух типов: бицистронные и моноцистронные.

2. В структурной части гена эндонуклеазы обнаружены два промотора, транскрипция с которых конвергентна транскрипции гена эндонуклеазы.

3. Показано, что транскрипция с антисенс-промоторов не оказывает влияния на транскрипцию гена эндонуклеазы.

4. Активность антисенс-промоторов снижает экспрессию гена эндонуклеазы на пост-транскрипционном уровне.

5. На основе полученных результатов представлена модель регуляции СРМ Есо29к1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Semenova Е., Minakhin L., Bogdanova Е., Nagornykh M., Vasilov A., Heyduk T., Solonin A., Zakharova M., Severinov K. "Transcription regulation of the EcoRV restriction-modification system" Nucleic Acids Res., 2005 6;33(21)

2. Ibryashkina E.M., Zakharova M.V., Bogdanova E.S., Nagornykh M.O., Den'mukhametov M.M., Melnik B.S., Kolinski A., Gront D., Feder M., Solonin A.S., Bujnicki J. M. "Type II restriction endonuclease R.Eco29kI is a member of the GIY-YIG nuclease superfamily" BMC Structural Biology, 2007 7:48

3. Нагорных M.O., Богданова E.C., Проценко A.C., Захарова М.В., Солонин А.С., Северинов К.В. «Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации второго типа» Генетика, 2008 т.44 №5

4. Protsenko A., Zakharova M., Nagornykh M., Solonin A., Severinov K. "Transcription regulation of the restriction-modification system Ecll8kl" Nucleic Acids Res., 2009,37(16)

5. Bogdanova E., Nagornykh M., Severinov K., Solonin A., Zakharova M. "C-protein -a transcription regulator of the EcoRV RM genes" 5th New England Biolabs Meeting on Restriction-Modification, Wills Hall, University of Bristol, Bristol, United Kingdom, 2004

6. Нагорных M., Захарова M. "Регуляторные элементы системы рестрикции-модификации Eco29kI" 11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2007

7. Nagornykh M., Zakharova M., Solonin A., Severinov K. "Regulation of gene expression in restriction-modification system Eco29kI" Meeting On Molecular Genetics Of Bacteria & Phages, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 2008

8. Нагорных M., Захарова M., Солонин A. "Антисмысловые РНК как молекулярные переключатели экспрессии генов" Международный форум по нанотехнологиям (Rusnanotech), Москва, 2008

9. Nagornykh M., Zakharova M., Solonin A., Severinov K. "Regulation of gene expression in restriction-modification system Eco29kI" Sensory and regulatory RNAs in prokaryotes, International meeting, Berlin, 2009

Ю.Нагорных M.O., Захарова M.B., Солонин A.C., Северинов К.В. "Регуляция экспрессии генов системы рестрикции-модификации Eco29kI" Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино, 2009

Подписано в печать:

13.01.2010

Заказ № 3237 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нагорных, Максим Олегович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Системы рестрикции-модификации у прокариот

1.1.1. Явление рестрикции-модификации

1.1.2. Типы систем рестрикции-модификации

1.1.3. Биологическая роль систем рестрикции-модификации

1.1.4. Структурная организация систем рестрикции-модификации типа II

1.1.5. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II

1.1.5.1. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II метилтрансферазой

1.1.5.2. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации типа II С-белками

1.1.5.3. Регуляция экспрессии генов "линейных" систем рестрикции-модификации типа II

1.2. Регуляция экспрессии генов антисмысловыми РНК

1.2.1. Биологические функции малых антисмысловых РНК

1.2.2. Характеристика цис-кодируемых антисмысловых РНК

1.2.3. Механизмы действия цис-кодируемых антисмысловых РНК

1.2.4. Различия между цис-кодируемыми и транс-кодируемыми асРНК

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и реактивы

2.1.1. Штаммы бактерий и плазмидные вектора

2.1.2. Среды и основные буферы

2.1.3. Материалы и реактивы

2.2. Методы исследования

2.2.1. Получение бактериальной биомассы

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК

2.2.3. Выделение тотальной РНК

2.2.4. Препаративное выделение фрагмента ДНК

2.2.5. Получение препарата фага A.vir в высоком титре

2.2.6. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация

2.2.7. Анализ рекомбинантных клонов

2.2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.9. Мечение 5'-конца ДНК полинуклеотидкиназой фагаТ

2.2.10. Определение и анализ первичной последовательности ДНК

2.2.11. Цитирование фрагментов ДНК

2.2.12. Реакция транскрипции in vitro

2.2.13. КМ11О4 (перманганатный) фут-принтинг

2.2.14. Реакция удлинения праймера

2.2.15. ПЦР с детекцией продуктов в режиме реального времени

2.2.16. Электрофорез нуклеиновых кислот

2.2.17. Northern-гибридизация

2.2.18. Определение (3-галактозидазной активности

2.2.19. Сайт-направленный мутагенез

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Структурная организация генов системы рестрикции-модификации типа II Eco29kI

3.2. Промоторы гена эндонуклеазы рестрикции системы рестрикции-модификации типа II Eco29kI

3.3. Промотор гена метилтрансферазы системы рестрикции-модификации типа II Eco29kI

3.4. Система рестрикции-модификации типа II Eco29kI кодирует два типа мРНК

3.5. Антисенс-промоторы системы рестрикции-модификации типа II Eco29kI

3.6. Влияние транскрипции с антисенс-промоторов на транскрипцию гена эндонуклеазы рестрикции eco29kIR

3.7. Влияние активности антисенс-промоторов на экспрессию гена эндонуклеазы рестрикции eco29kIR

3.8. Активность антисенс-промоторов вызывает деградацию бицистронной мРНК

3.9. Модель регуляции экспрессии генов системы рестрикции-модификации типа II Eco29kI

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии генов системы рестрикции-модификации типа II Eco29kl"

Крупнейшая часть живых организмов в биосфере представлена бактериями, поэтому большая часть генетической информации -бактериальная (Whitman et al., 1998). Главной основой эволюционного развития бактерий является горизонтальный перенос генов. (Holmes et al., 2003; Lawrence, 2001; Jain, 2002; Gogarten, 2002). Среди процессов, контролирующих перенос генов, одну из центральных ролей играет действие систем рестрикции-модификации.

К настоящему времени открыто несколько тысяч систем рестрикции-модификации в бактериях и архебактериях (Roberts et al., 2007). Наибольший интерес вызвало изучение систем рестрикции-модификации типа II, которые состоят из двух ферментов, узнающих одинаковую последовательность ДНК, но имеющих разное действие — эндонуклеазы рестрикции и метилтрансферазы. Эндонуклеаза вносит двухцепочечный разрыв в немодифицированной ДНК (например, вирусной ДНК во время инфицирования бактериальной клетки бактериофагом), а метилтрансфераза защищает хозяйскую ДНК от действия эндонуклеазы рестрикции, модифицируя основания ДНК в сайте узнавания. Таким образом, система рестрикции-модификации образует некую примитивную иммунную систему в бактериальной клетке. Однако системы рестрикции-модификации обеспечивают не только сохранность генетической информации бактериальной клетки-хозяина, но и обеспечивают горизонтальный перенос генов, что обеспечивает бактериальной популяции постоянное эволюционирование и адаптацию к новым экологическим условиям. Несомненно, что интерес к изучению систем рестрикции-модификации типа II был обусловлен использованием эндонуклеаз рестрикции этого типа в качестве одного из мощнейших инструментов научных исследований в молекулярной биологии. Но и кроме прикладного аспекта, системы рестрикции-модификации типа II представляют собой хорошую модель для изучения взаимодействия биологических макромолекул. Благодаря разнообразию структурной организации таких систем, они очень удобны для исследования регуляции экспрессии генов, так как экспрессия обоих ферментов должна быть строго регулирована, чтобы сохранять баланс между этими антагонистичными ферментативными активностями в бактериальной клетке. Поскольку исследование молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии, то использование систем рестрикции-модификации типа II в качестве модельных объектов трудно переоценить.

До настоящего времени основное внимание уделялось изучению регуляции систем рестрикции-модификации типа II на уровне транскрипции, где основными регуляторами экспрессии генов являются метилтрансферазы или С-белки. Однако оставалась группа системы рестрикции-модификации типа II, о регуляции которых известно крайне мало. В эту группу входит система рестрикции-модификации Eco29kI (СРМ Eco29kI), регуляция которой была исследована в данной работе.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование регуляции экспрессии генов СРМ Eco29kI. Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:

- исследовать организацию регуляторных элементов в СРМ Eco29kI;

- определить роль каждого из найденных регуляторных элементов в регуляции экспрессии генов СРМ Eco29kI;

- предложить модель регуляции СРМ Eco29kI;

Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН и в лаборатории проф. Северинова К.В. института микробиологии Ваксмана, университет Ратгерс штата Нью-Джерси, США.

Научная новизна работы.

Впервые получены данные о регуляции экспрессии генов СРМ Eco29kI, которая относится к группе так называемых "линейных" систем рестрикции-модификации типа II.

Продемонстрировано, что перед геном эндонуклеазы рестрикции находятся два промотора, с которых происходит синтез бицистронной мРНК и она кодирует оба фермента СРМ Eco29kI. Установлено, что в структурной части гена эндонуклеазы находится дополнительный промотор гена метилтрансферазы, с которого транскрибируется моноцистронная мРНК, кодирующая только метилтрансферазу. Показано, что в структурной части гена эндонуклеазы находятся два промотора имеющие обратную ориентацию. Транскрипция с этих промоторов происходит в антисенс-направлении. Показано негативное влияние на экспрессию гена эндонуклеазы этих антисенс-промоторов на пост-транскрипционном уровне.

Практическое значение работы.

Выявление механизмов регуляции экспрессии генов является задачей фундаментальных исследований в молекулярной биологии. Однако результаты этих исследований позволяют применять накопленные знания на практике. Регуляторные механизмы обнаруженные в системах рестрикции-модификации, могут с успехом применяться для создания искусственных молекулярных переключателей генной экспрессии. В частности, природный механизм подавления экспрессии токсичного для бактериальной клетки гена эндонуклеазы в СРМ Eco29kI, может быть применен для создания искусственных антисенс-РНК-ингибиторов генной экспрессии. Это позволяет применять данный способ регуляции экспрессии генов, как в научных исследованиях, так и в практической деятельности.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Нагорных, Максим Олегович

ВЫВОДЫ:

1. Охарактеризованы два промотора гена ЭР и отдельный промотор гена МТ. С них транскрибируются мРНК двух типов: бицистронная и моноцистронная.

2. В структурной части гена ЭР обнаружены два промотора, транскрипция с которых конвергентна транскрипции гена ЭР.

3. Показано, что антисенс-промоторы не оказывают влияния на транскрипцию гена ЭР.

4. Антисенс-промоторы снижают экспрессию гена ЭР на посттранскрипционном уровне.

5. На основе полученных результатов представлена модель регуляции СРМ Eco29kI.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нагорных, Максим Олегович, Пущино

1. Alvarez М., Chater К. and Rodicio R. (1993) Complex transcription of an operon encoding the Sail restriction-modification system of Streptomyces albus G. Mol. Microbiology 8, 243-252.

2. Anderson, D.G., Churchill, J.J. & Kowalczykowski, S.C.(1999) A single mutation, RecB(D1080A), eliminates RecA protein loading but not chi recognition by RecBCD enzyme. JBC 274, 27139-27144.

3. Arber W. (1965) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. V. The role of methionine in the production of host specificity. J. Mol. Biol. 11,247-256.

4. Arber W., and Dussoix D. (1962) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J. Mol. Biol. 5, 18-36.

5. Arber, W. (2000) Genetic variation: molecular mechanisms and impact on microbial evolution. FEMS Microbiol. Rev. 24, 1-7.

6. Arthur D., Ghetu A., Gubbins M., Edwards R., Frost L., Glover J. (2003) FinO is an RNA chaperone that facilitates sense-antisense RNA interactions. EMBO J 22, 6346-6355.

7. Asano K., Mizobuchi K. (2000) Structural analysis of late intermediate complex formed between plasmid Collb-P9 Inc RNA and its target RNA. How does a single antisense RNA repress translation of two genes at different rates? JBC 275, 1269-1274.

8. Asano K., Niimi Т., Yokoyama S., Mizobuchi K. (1998) Structural basis for binding of the plasmid Collb-P9 antisense Inc RNA to its target RNA with the 5'rUUGGCG3' motif in the loop sequence. JBC 273, 11826-11838.

9. Ban, C. & Yang, W. (1998) Structural basis for MutH activation in E. coli mismatch repair and relationship of MutH to restriction endonucleases. EMBO J. 17, 1526-1534.

10. Barcus, V.A. & Murray, N.E. Barriers to recombination: restriction.(Cambridge University Press, Cambridge, 1995)

11. Bart A., Dankert J., and van der Ende A. (1999) Operator sequences for the regulatory proteins of restriction modification systems. Mol. Microbiol. 31, 1277-1278.

12. Beletskaya I. V., Zakharova M. V., Shlyapnikov M. G., Semenova L. M., and Solonin A. S. (2000) DNA methylation at the CfrBI site is involved in expression control in the CfrBI restriction-modification system. Nucleic Acids Res. 28,3817-3822.

13. Bertani G., and Weigle J. J. (1953) Host controlled variation in bacterial viruses. J. Bacterid. 65, 113-121.

14. Bickle, T.A. & Kruger, D.H. (1993) Biology of DNA restriction. Microbiol.Rev. 57, 434-450.

15. Blumenthal, R.M. and Cheng, X. Restriction-modification systems, in Modern Microbial Genetics (eds. Yasbin, R. & Streips, U.) 177-226 (Wiley-Liss, New York, 2002).

16. Bogdanova E, Djordjevic M, Papapanagiotou I, Heyduk T, Kneale G, Severinov K. (2008) Transcription regulation of the type II restriction-modification system. Nucleic Acids Res. 36, 1429-1442.

17. Brantl S, Wagner E. (2000) Antisense RNA-mediated transcriptional attenuation: an in vitro study of plasmid pT181. Mol Microbiol 35, 14691482.

18. Brantl S. (2002) Antisense-RNA regulation and RNA interference. Biochim. Biophys. Acta 1575, 15-25.

19. Brantl S. (2007) Regulatory mechanisms employed by c/s-encoded antisense RNAs. Current Opinion in Microbiology 10, 102-109.

20. Brantl S., Wagner E. (1994) Antisense RNA-mediated transcriptional attenuation occurs faster than stable antisense/target RNA pairing: an in vitro study of plasmid pIP501. EMBO J 13, 3599-3607.

21. Brantl S., Wagner E. (1996) An unusually long-lived antisense RNA in plasmid copy number control: in vivo RNAs encoded by the streptococcal plasmid pIP501. JMB 255, 275-288.

22. Brennan R.G., Roderick S.L., Takeda Y. and Matthews B.W. (1990) Protein-DNA conformational changes in the crystal structure of a lambda Cro-operator complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8165-8169.

23. Brenner M., Tomizawa J. (1991) Quantitation of ColEl-encoded replication elements. PNAS 88, 405-409.

24. Brussow, H. (2007) Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Mol.Microbiol. 65, 583-589.

25. Butler D., and Fitzgerald G. F. (2001) Transcriptional analysis and regulation of expression of the ScrFI restriction-modification system of Lactococcus lactis subsp. cremoris UC503. J. Bacteriol. 183, 4668-4673.

26. Campbell, A.M. in Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. 2041-2046 (ASM Press, Washington, D.C. 1996)

27. Carlson, K. & Kosturko, L.D. (1998) Endonuclease II of coliphage T4: a recombinase disguised as a restriction endonuclease? Mol. Microbiol 27, 671-676.

28. Casjens, S. (2003) Prophages and bacterial genomics: what have we learned so far? Mol.Microbiol. 49, 277-300.

29. Cesnaviciene E., Mitkaite G., Stankevicius K., Janulaitis A., and Lubys A. (2003) Espl396I restriction-modification system: structural organization and mode of regulation. Nucleic Acids Res. 31, 743-749.

30. Chibani-Chennoufi, S., Bruttin, A., Dillmann, M.L. & Brussow, H. (2004) Phage-host interaction: an ecological perspective. JB 186, 3677-3686.

31. Christensen L. L., and Josephsen J. (2004) The methyltransferase from the LlaDII restriction-modification system influences the level of expression of its own gene. J. Bacterid. 186, 287-295.

32. Churchill, J.J., Anderson, D.G. & Kowalczykowski, S.C. (1999) The RecBC enzyme loads RecA protein onto ssDNA asymmetrically and independently of chi, resulting in constitutive recombination activation. Genes Dev. 13,901-911.

33. Dawkins R. The Selfish Gene. (Oxford University Press, Oxford. 1989)

34. Duhring U., Axmann I., Hess W., Wilde A. (2006) An internal antisense RNA regulates expression of the photosynthesis gene isiA. PNAS 103, 7054-7058.

35. Dussoix D., and W. Arber. (1962) Host specificity of DNA produced by Eschenichia coli. II. Control over acceptance of DNA from infecting phage lambda. J. Mol. Biol. 5, 37-49.

36. Eguchi Y., Ithoh Т., Tomizawa J. (1991) Antisense RNA. Annu Rev Biochem 60, 631-652.

37. Engelberg-Kulka H. and Glaser G. (1999) Addiction modules and programmed cell death and antideath in bacterial cultures Annu. Rev. Microbiol. 53,43-70.

38. Feinstein, S.I. & Low, K.B. (1982) Zygotic induction of the rac locus can cause cell death in E. coli. Mol.Gen.Genet. 187, 231-235.

39. Fire A. et al. (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.

40. Franch Т., Petersen M., Wagner E.G.H., Jacobsen J., Gerdes K. (1999) Antisense RNA regulation in prokaryotes: rapid RNA/RNA interaction facilitated by a general U-turn-loop structure. JMB 294, 1115-1125.

41. Gerdes K., Wagner E. (2007) RNA antitoxins. Curr Opin Microbiol 10, 117-124.

42. Gogarten, J. P., Doolittle, W.F. & Lawrence, J.G. (2002) Prokaryotic evolution in light of gene transfer. Mol. Biol. Evol. 19, 2226-2238.

43. Greenfield Т., Franch Т., Gerdes K„ Weaver K. (2001) Antisense RNA regulation of the par post-segregational killing system: structural analysis and mechanism of binding of the antisense RNA, RNAII and its target RNAI. Mol Microbiol 42, 527-537.

44. Gubbins M., Arthur D., Ghetu A., Glover J., Frost L. (2003) Characterizing the structural features of RNA/RNA interactions of the F-plasmid FinOP fertility inhibition system. JBC 278, 27663-27671.

45. Handa N., Ichige A., Kusano K. and Kobayashi I. (2000) Cellular responses to postsegregational killing by restriction-modification genes. J. Bacterid. 182,2218-2229.

46. Heidrich N., Brantl S. (2003) Antisense-RNA mediated transcriptional attenuation: Importance of a U-turn loop structure in the target RNA of plasmid pIP501 for efficient inhibition by the antisense-RNA. JMB 333, 917-929.

47. Heidrich N., Brantl S. (2007) Antisense-RNA mediated transcriptional attenuation in plasmid pIP501: the simultaneous interaction between two complementary loop pairs is required for efficient inhibition by antisense RNA. Microbiol 153,420-427.

48. Heidrich N„ Chinali A., Gerth U„ Brantl S. (2006) The small untranslated RNA SRI from the B. subtil is genome is involved in the regulation of arginine catabolism. Mol Microbiol 62, 520-536.

49. Hjalt Т., Wagner E.G.H. (1992) The effect of loop size in antisense and target RNAs on the efficiency of antisense RNA control. NAR 20, 67236732.

50. Hjalt Т., Wagner E.G.H. (1995) Bulged-out nucleotides in an antisense RNA are required for rapid target RNA binding in vitro and inhibition in vivo. NAR 23, 580-587.

51. Holmes, A.J., Gillings, M.R., Nield, B.S., Mabbutt, B.C., Nevalainen, K.M. & Stokes, H.W. (2003) The gene cassette metagenome is a basic resource for bacterial genome evolution. Environ. Microbiol. 5, 383-394.

52. Ives C.L., Nathan P.D., Brooks J.E. (1992) Regulation of the BamHI restriction-modification system by a small intergenic open reading frame, bamHIC, in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 174, 7194-7201.

53. Ives C.L., Sohail A., Brooks J.E. (1995) The regulatory С Proteins from different restriction-modification systems can cross-complement. J. Bacteriol. 6313-6315.

54. Jain, R., Rivera, M.C., Moore, J.E. & Lake, J.A. (2002) Horizontal gene transfer in microbial genome evolution. Theor. Popul. Biol. 61, 489-495.

55. Jerome L., van Biesen Т., Frost L. (1999) Degradation of FinP antisense RNA from F-like plasmids: the RNA binding protein, FinO, protects FinP from endoribonuclease E. JMB 285, 1457-1473.

56. Jordan S.R. and Pabo C.O. (1988) Structure of the lambda complex at 2.5 A resolution: details of the repressor-operator interactions. Science 242, 893-899.

57. Kessler C., Manta V. (1990) Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases a review (Edition 3). Gene 92, 1248.

58. Kita К., ICotani H., Sugisaki H., and Takanami M. (1989) The Fokl restriction-modification system. I. Organization and nucleotide sequences of the restriction and modification genes. J. Biol. Chem. 264, 5751-5756.

59. Knowle D., Lintner R., Touma Y. M., Blumenthal R. M. (2005) Nature of promoter activated by C. PvuII, an unusual regulatory protein conserved among restriction-modification systems. J. Bacteriol. 187, 488-497.

60. Kobayashi I. (1998) Selfishness and death: raison d'etre of restriction, recombination and mitochondria. Trends. Genet. 14, 368-74.

61. Kolb F., Westhof E., Ehresman C., Ehresman В., Wagner E., Romby P. (2001) Bulged residues promote the progression of a loop-loop interaction to a stable and inhibitory antisense-target RNA complex. NAR 29, 3145-3153.

62. Krinke L., Wulff D. (1987) OOP RNA, produced from multicopy plasmids, inhibits ell gene expression through an RNase Ill-dependent mechanism. Genes Dev 1, 1005-1012.

63. Krinke L., Wulff D. (1990) RNase Ill-dependent hydrolysis of cll-0 gene mRNA by OOP antisense RNA. Genes Dev 4, 2223-2233.

64. Kruger, D.H. & Bickle, T.A. (1983) Bacteriophage survival: multiple mechanisms for avoiding the deoxyribonucleic acid restriction systems of their hosts. Microbiol. Rev. 47, 345-360.

65. Kuzminov, A., Schabtach, E & Stahl, F.W. (1994) Chi sites in combination with RecA protein increase the survival of linear DNA in E. coli by inactivating ExoV activity of RecBCD nuclease. EMBO J. 13, 2764-2776.

66. Lao, P.J. & Forsdyke, D.R. (2000) Crossover hot-spot instigator (Chi) sequences in E. coli occupy distinct recombination/transcription islands. Gene 243, 47-57.

67. Lawrence, J.G. (2001) Catalyzing bacterial speciation: correlating lateral transfer with genetic headroom. Syst. Biol. 50, 479-496.

68. Liu Y. and Kobayashi I. (2007) Negative regulation of the EcoRI restriction enzyme gene is associated with intragenic reverse promoters. JB 189, 6928-6935.

69. Lubys A., and Janulaitis A. (1995) Cloning and analysis of the plasmid-borne genes encoding the Bsp6I restriction and modification enzymes. Gene 157, 25-29.

70. Lubys A., Jurenaite S., Janulaitis A. (1999) Structural organization of the plasmid-borne restriction-modification system type II Kpn2I from Klebsiella Pneumoniae RLF2. Nucleic Acids Res. 27, 4228-4234.

71. Lubys A., Menkevicius S., Timinskas A., Butkus V. and Janulaitis A. (1994) Cloning and analysis of translational control for genes encoding the Cfr9I restriction-modification system. Gene 141, 85-89.

72. Lurlia S. E., and Human M. L. (1952) A nonhereditaxy, host-induced variation of bacterial viruses. J. Bacteriol. 64, 557-569.

73. McGeehan J.E., Papapanagiotou I., Streeter S.D., Kneale G.G. (2006) Cooperative binding of the C.Ahdl controller protein to the C/R promoter and its role in endonuclease gene expression. J. Mol. Biol. 358, 523-531.

74. McGeehan J.E., Streeter S.D., Papapanagiotou I., Fox G.C. and Kneale G.G. (2005) High-resolution crystal structure of the restriction-modification controller protein C.Ahdl from Aeromonas hydrophila. J. Mol. Biol. 346, 689-701.

75. Milkman, R., Raleigh, E.A., McKane, M., Cryderman, D., Bilodeau, P. & McWeeny, K. (1999) Molecular evolution of the E. coli chromosome. V. Recombination patterns among strains of diverse origin. Genetics 153, 539554.

76. Moll I., Grill S., Gualerzi С. O., and Blasi U. (2002) Leaderless mRNAs in bacteria: surprises in ribosomal recruitment and translational control. Mol. Microbiol. 43,239-246.

77. Naito Т., Kusano K. and Kobayashi I. (1995) Selfish behavior of restriction-modification systems. Science 267, 897-899.

78. Nakayama Y. and Kobayashi I. (1998) Restriction-modification gene complexes as selfish gene entities: roles of a regulatory system in theirestablishment, maintenance, and apoptotic mutual exclusion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6442-6447.

79. O' Connor C. and Humphreys G. (1982) Expression of the EcoRI restriction-modification system and the construction of positive-selection cloning vectors. Gene 20, 219-229.

80. O'Driscoll J., Glynn F., Cahalane 0., O'Connell-Motherway M., Fitzgerald G.F., and Van Sinderen D. (2004) Lactococcal plasmid pNP40 encodes a novel, temperature-sensitive restriction-modification system. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5546-5556.

81. O'Driscoll J., Fitzgerald G.F., van Sinderen D. (2005) A dichotomous epigenetic mechanism governs expression of the LlaJI restriction/modification system. Mol. Microbiol. 57, 1532-1544.

82. Opdyke J., Kang J., Storz G. (2004) GadY, a small RNA regulator of acid response genes in Escherichia coli. JB 186, 6698-6705.

83. Pertzev A., Ruban N., Zakharova M., Beletskaya I., Petrov S., Kravetz A., Solonin A. (1991) Eco29kI, a novel plasmid encoded restriction endonuclease from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 20

84. Petrusyte M., Bitinaite J., Menkevicius S., Klimasauskas S., Butkus V., Janulaitis A. (1988) Restriction endonucleases of a new type. Gene 74, 8991.

85. Pingoud A. M. Restriction endonucleases // Nucleic Acids and Molecular Biology (ed. Hans Joachim Gross) V. 14. (Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, 2004)

86. Posfai J., Bhagwat A.S., Posfai G. and Roberts R.J. (1989) Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. Nucleic Acids Res. 17, 2421-2435.

87. Price, C. & Bickle, T.A. (1986) A possible role for DNA restriction in bacterial evolution. Microbiol. Sci. 3, 296-299.

88. Rak B, von Reutern M (1984) Insertion element IS5 contains a third gene. EMBO J. 3,807-811.

89. Rasmussen A., Eriksen M., Gilany K., Udesen C., Franch Т., Petersen C., Valentin-Hansen P. (2006) Regulation of ompA mRNA stability: the role of a small regulatory RNA in growth phase-dependent control. Mol Microbiol 58, 1421-1429.

90. Roberts, R.J., Vincze, Т., Posfai, J. & Macelis, D. (2007) REBASE -enzymes and genes for DNA restriction and modification. NAR 35, D269-270.

91. Sarkar G. and Sommer S. (1990) The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis. BioTechniques 8, 404-407.

92. Sawaya M.R., Zhu Z„ Mersha F., Chan S.H., Dabur R„ Xu S.Y., Balendiran G.K. (2005) Crystal structure of the restriction-modification system control element C.Bcll and mapping of its binding site. Structure 13, 1837-1847.

93. Semenova E., Minakhin L., Bogdanova E., Nagornykh M., Vasilov A., Heyduk Т., Solonin A., Zakharova M., Severinov K. (2005) Transcription regulation of the EcoRV restriction-modification system. Nucleic Acids Res. 33,6942-6951.

94. Shilov I., Tashlitsky V., Khodoun M., Vasil'ev S., Alekseev Y., Kuzubov A., Kubareva E., Kaiyagina A. (1998) DNA-methyltransferase SsoII interaction with own promoter region binding site. Nucleic Acids Res. 26, 2659-64.

95. Silvaggi J., Perkins J., Losick R. (2005) Small untranslated RNA antitoxin in Bacillus subtilis. JB 187,6641-6650.

96. Som S., and Friedman S. (1994) Regulation of EcoRII methyltransferase: effect of mutations on gene expression and in vitro binding to the promoter region. Nucleic Acids Res. 22, 5347-5353.

97. Som S., and Friedman S. (1997) Characterization of the intergenic region which regulates the Mspl restriction-modification system. J. Bacteriol. 179, 964-967.

98. Spanjaard R.A. and Van Duin J. (1989) Translation reinitiation in the presence and absence of a Shine and Dalgarno sequence. NAR 17, 55015507.

99. Streeter S.D., Papapanagiotou I., McGeehan J.E. and Kneale G.G. (2004) DNA footprinting and biophysical characterization of the controller protein C.Ahdl suggests the basis of a genetic switch. Nucleic Acids Res. 32, 644553.

100. Suzuki M. and Yagi N. (1994) DNA recognition code of transcription factors in the helix-turn-helix, probe helix, hormone receptor, and zinc finger families. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12357-12361.

101. Suzuki M., Brenner S.E., Gerstein M. and Yagi N. (1995) DNA recognition code of transcription factors. Protein Eng. 8, 319-328.

102. Tao T. and Blumenthal R.M. (1992) Sequence and characterization of pvuIIR, the PvuII endonuclease gene, and of pvuIIC, its regulatory gene. J. Bacterid. 174,3395-3398.

103. Tao Т., Bourne J.C., Blumenthal R.M. (1991) A familiy of regulatory genes associated with type II restriction-modification systems. J. Bacterid. 174,1367-1375.

104. Trautner, T.A., Pawlek, В., Behrens, B. & Willert, J. (1996) Exact size and organization of DNA target-recognizing domains of multispecific DNA-(cytosine-C5)-methyltransferases. EMBO J. 15, 1434-1442.

105. Vijesurier R. M„ Carlock L., Blumenthal R. M., and Dunbar J. C. (2000) Role and mechanism of action of C. PvuII, a regulatory protein conserved among restriction-modification systems. J. Bacterid. 182, 477-487.

106. Vogel J., В artels V., Tang Т., Churakov G„ Slagter-Jager J., Huttenhofer A., Wagner E. (2003) RNomics in Escherichia coli detects new sRNA species and indicates parallel transcriptional output in bacteria. NAR 31, 6435-6443.

107. Wagner E.G.H. and Simons R.W. (1994) Antisense RNA control in bacteria, phages and plasmids. Annu. Rev. Microbiol. 48, 713-742.

108. Wagner L., Gesteland R., Dayhuff T. and Weiss R. (1994) An efficient Shine-Dalgarno sequence but not translation is necessary for lacZ mRNA stability in Escherichia coli. JB 176, 1683-1688

109. Waldbeser L., Chen Q., Crosa J. (1995) Antisense RNA regulation of the fatB iron transport protein gene in Vibrio anguillarum. Mol Microbiol 17, 747-756.

110. Wang, J., Chen, R. & Julin, D.A. (2000) A single nuclease active site of the E. coli RecBCD enzyme catalyzes single-stranded DNA degradation in both directions. JBC 275, 507-513.

111. Weaver K. (2007) Emerging plasmid-encoded antisense RNA regulated systems. Curr Opin Microbiol 10, 110-116.

112. Weinbauer, M.G. (2004) Ecology of prokaryotic viruses. FEMS Microbiol. Rev. 28, 127-181.

113. Weitz, J.S., Hartman, H. & Levin, S.A. (2005) PNAS 102, 9535-9540.

114. Whitman, W.B., Coleman, D.C. & Wiebe, W.J. (1998) Prokaiyotes: the unseen majority. PNAS 95, 6578-6583.

115. Will W., Frost L. (2006) Hfq is a regulator of F-plasmid TraJ and TraM synthesis in E. coli. JB 188, 124-131.

116. Wilson G.G. (1991) Organization of restriction-modification systems. Nucleic Acids Res. 19, 2539-2565.

117. Yang C.C., Topal M.D. (1992) Nonidentical DNA binding sites of endonuclease Nael recognize different families of sequences flanking the recognition sate. Biochemistry 31, 9657-9664.

118. Zakharova M., Beletskaya I., Kravetz A., Pertzev A., Mayorov S., Shlyapnikov M. and Solonin A. (1998) Cloning and sequence analysis of the plasmid-bome genes encoding the Eco29kI restriction and modification enzymes. Gene 208, 177-182.

119. Zakharova M., Minakhin L., Solonin A., and Severinov K. (2004) Regulation of RNA polymerase promoter selectivity by covalent modification of DNA. J. Mol. Biol. 335, 103-111.

120. Zamore P.D. (2001) RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct. Biol. 8, 746-750.

121. Zhang A., Wassarman K., Rosenow C., Tjaden В., Storz G., Gottesman S. (2003) Global analysis of small RNA and mRNA targets of Hfq. Mol Microbiol 50, 1111-1124.

122. Zheleznaya L.A., Kainov D.E., Yunusova A.K., Matvienko N.I. (2003) Regulatory С protein of the EcoRV modification-restriction system. Biochemistry (Mosc). 68, 125-132.1. БЛАГОДАРНОСТИ

123. Я искренне благодарен своим научным руководителям к.б.н. Захаровой Марине Викторовне и д.б.н. Северинову Константину Викторовичу за руководство и помощь при выполнении данной работы.

124. Я благодарен зав. лабораторией «Молекулярной микробиологии» к.б.н. Солонину Александру Сергеевичу за поддержку и понимание.