Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика ферментов системы рестрикции-модификации Eco29kl и их бифункционального гибридного варианта
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Характеристика ферментов системы рестрикции-модификации Eco29kl и их бифункционального гибридного варианта"
На правах рукописи
00500332/
МОКРИЩЕВА МАРИНА ЛЕОНИДОВНА
ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ СИСТЕМЫ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ ЕС029К1 И ИХ БИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ГИБРИДНОГО ВАРИАНТА
03.01.03 - молекулярная биология
2 4 НОЯ 2011
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущшю - 2011
005003322
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино.
Научный руководитель:
Официальные оппопснты:
кандидат биологических наук Солонин Александр Сергеевич
доктор биологических наук Железная Людмила Алексеевна
кандидат биологических наук Кошелева Ирина Адольфовна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН.
Защита диссертации состоится " {£_ " декабря 2011г. в " " часов на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН, по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская, д.З.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБК РАН. Автореферат разослан" " ноября 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
Т.И. Смолихина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы: Системы рестрикции-модификации (СРМ) широко распространены среди различных микроорганизмов и составляют до 1% их генома. Бактериальные СРМ обычно состоят из двух ферментов, конкурирующих за одну и ту же ДНК-мишень: эндонуклеазы рестрикции (ЭР), узнающей и расщепляющей специфические последовательности ДНК, и ДНК-метилтрансферазы (МТ), метилирующей по определенным положениям ту же последовательность. Тем самым МТ защищает хозяйскую ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой. СРМ служат защитным механизмом от проникновения в клетку чужеродной ДНК, ограничивая горизонтальный перенос генов и, таким образом, обеспечивают поддержание целостности генома микроорганизмов и способствуют увеличению разнообразия их видов.
Обнаружение эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз открыло новую эру в молекулярной биологии благодаря развитию технологии рекомбинантных ДНК. Большинство описанных к настоящему времени СРМ относится к типу И. Это связано, главным образом, с преимущественным распространением их в природе по сравнению с системами других типов, а также обусловлено целенаправленностью поиска в связи с их практическим применением в генной инженерии и молекулярной медицине. ЭР и МТ служат идеальными модельными объектами для изучения взаимодействий белок - ДНК и эволюционных взаимосвязей среди различных групп ферментов. Белки СРМ являются объектами исследования структурной биологии. К настоящему времени с помощью рентгеноструктурного анализа охарактеризованы пространственные структуры 37 эндонуклеаз и 8 ДНК-метилтрансфераз типа II.
Ферментативный перенос метальной группы на определенные нуклеотиды в молекуле ДНК является самой распространенной формой биологической модификации ДНК. Эта реакция катализируется МТ путем переноса метальных групп с кофактора аденозил-Ь-метионина (АсЗоМеО на ДНК с образованием продуктов реакции, метилированной ДНК и З-адснозил-Ь-гомоцистеина (АйоНсу). Метилирование ДНК является важнейшим способом передачи наследственной информации, не закодированной в нуклеотидной последовательности ДНК. В микроорганизмах метилирование ДНК играет важную роль в контроле репликации ДНК, репарации, транскрипции, контроле клеточного цикла, а также бактериальной вирулентности. Распознавание своей и чужеродной ДНК ассоциировано с СРМ, функционирующими в качестве механизмов защиты от бактериофаговой инфекции.
У эукариот метилирование ДНК связано с такими биологическими процессами, как регуляция экспрессии генов, контроль эмбрионального развития, геномный импринтииг,
инактивация Х-хромосомы и стабильность генома. Уровень эпигенетического метилирования ДНК является важным фактором в патогенезе различных заболеваний человека. Учитывая высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей прокариотических и эукариотических МТ, использование бактериальных ферментов в качестве модельных объектов представляется важным для изучения механизмов и роли метилирования у млекопитающих.
Объектом исследований данной работы является СРМ типа II Есо29к1. Ферменты этой системы специфически узнают палиндромную последовательность 5'-СССССО-3'. Изучение биохимических свойств, механизмов действия ферментов СРМ и возможности образования на ее основе слитого бифункционального белка важно для понимания эволюции СРМ, функционирования клетки или отдельно взятой генетической системы.
Цели и задачи исследования: Целью данной работы является характеристика ферментов СРМ Есо29к1, конструирование бифункционального гибридного белка, несущего зндонуклеазную и метилтрансферазную активности в одном полипептиде, и сравнительный анализ гибридного белка с его нативными предшественниками. Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
1. Сконструировать штаммы с увеличенным синтезом ЭР и МТ Есо29к1;
2. Получить высокоактивные гомогенные препараты белков и определить оптимальные условия каталитических реакций;
3. Локализовать метилируемый цитозин в сайте узнавания Есо29к1;
4. Определить кинетический механизм МТ Есо29к1;
5. Сконструировать бифункциональный гибридный белок 1Ш.Есо29к1, несущий нуклеазную и метилтрансферазную активности в одном полипептиде, и определить его функциональные активности.
Научная новизна и практическая ценность работы: В данной работе разработаны методы очистки и определены оптимальные условия каталитических реакций ферментов СРМ Есо29к1, что делает возможным их применение в генной инженерии и биотехнологии. Локализован метилируемый цитозин в сайте узнавания Есо29к1: СС'"СССС. Сайт метилирования охарактеризован впервые как для фермента М.Есо29к1, так и для его изошизомеров. Определен кинетический механизм действия МТ М.Есо29к1 и установлены ее основные биохимические константы. Упорядоченный би-би механизм с использованием Ас1оМе1 в первую очередь, обнаруженный в случае М.Есо29к1, более
характерен доя экзоциклических ДНК-метилтрансфераз и является новым для семейства m5C МТ.
Впервые сконструирован бифункциональный гибридный белок, обладающий эндонуклеазной и метилтрансферазной активностями СРМ Eco29kI. Проведен сравнительный анализ функциональных активностей очищенного препарата гибридного белка с его нативными предшественниками. Показано, что слитый белок сохранил специфичность узнавания исходных ЭР и МТ. Выявлено, что удельная метилтрансферазная активность почти не изменилась, составляя 80% активности исходного фермента M.Eco29kI, а удельная эндонуклеазная активность понизилась в три раза, что может бьпъ связано с пространственными ограничениями для взаимодействия этой части нового белка с субстратами. Установлено, что оптимумы эндонуклеазной реакции гибридного белка RM.Eco29kI изменились по сравнению с исходной эндонуклеазой R.Eco29kI: оптимумы концентраций солей NaCl, KCI и рН среды сдвинулся в область более низких значений, а температурный оптимум остался прежним.
Полученные данные служат моделью образования бифункциональных ЭР типа IIC и изменения функций существующих белков. Впервые предложено использование искусственного слияния генов, подобного описанному в данной работе, для конструирования бифункциональных белков, которые затем могут быть использованы для создания ферментов с новыми сайтами узнавания. Полученные в настоящей работе данные о свойствах ЭР и МТ Eco29kI расширяют знания о бактериальных СРМ.
Публикации и апробация работы: По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 5th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification (Bristol, 2004), 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002) и ежегодной сессии Ученого совета ИБФМ РАН, посвященной подведению итогов конкурса научных работ (Пущино, 2010).
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа изложена на 3£_ страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает тУ/источника. Работа содержит//рисунков и ^ таблицы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. I. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ 6HIS-R.EC029KI.
Очистка эндонуклеазы 6His-R.Eco29kI в нативных условиях.
Схема очистки эндонуклеазы 6His-R.Eco29kI из растворимой белковой фракции основана на комбинации ионообменной (фосфоцеллюлоза Р11) и аффинной (Ni-NTA) хроматографии. Как представлено в Таблице 1 А, из 2 г замороженных клеток получено
А Б
M 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5
94 щц tg^ ja^b jjg
Щ ЩШ 67 ш
V. ■
94
43 "■* <*<•» 43
ШШш -ШШ'
ДО 30
20 • Ш ; 21)
Шт т ■№■>
Рие. 1. Продукция и очистка эндонуклеазы рестрикции 6Н1я-К.Есо29к1.
Электрофоретическое разделение белков в 12% ПААГ в денатурирующих условиях. А) 1) - лизаты клеток Е.соИ MI5[pREP4] трансформированных плазмидами р29К11 (с геном МТ М.Есо29к1) и р29К6НВ (экспрессионный вектор с ОРС К.Есо29к1) до индукции; 2), 3) -после индукции 0.5 мМ ИПТГ через 2 и 4 часа соответственно; 4), 5) - конечные препараты фермента очищенного в нативных условиях. Б) фракции, содержащие наиболее высокую активность ЭР 6Н1х-К.Есо29к1 после гель-фильтрации на ультрагеле Аса54 при очистке белка в денатурирующих условиях. М - маркеры молекулярных масс (кДа).
1.16 мг гомогенного белка с молекулярным весом около 28 кДа (Рис. 1 А, дорожка 4). Специфическая активность препарата белка составила 2400 у.е./мкг. Таким образом, 1 мкг полученного фермента способен гидролизовать 2.4 мг ДНК фага (р80уц за 1 час. Однако количество растворимого белка составляло лишь - 5% от общего количества индуцированного фермента 6№5-К.Есо29кТ. Большая часть белка оказалась в нерастворимой фракции в виде телец включения. Для очистки фермента из нерастворимой фракции применяли метод ренатурации с помощью гель-фильтрации (см. ниже). Специфические активности нативного фермента Я.Есо29к1 и его производного с шестью гистидиновыми остатками оказались практически одинаковыми (2660 и 2400 у.е./мкг, соответственно). Таким образом, присоединение б-Н^Б тага не привело к значительному снижению ферментативной активности.
Таблица 1 А. Очистка 6His-R.Eco29kI из растворимой фракции.
Стадия очистки Общее количество белка, мг Общая активность, 106 УЕ Удельная активность УЕ/мкг Фактор очистки Выход, %
Грубый лизат 180 8.7 48 1 100
DE52 целлюлоза 165 8.7 53 1.1 100
Р11 целлюлоза 26 6 231 4.8 69
Ni-NTA 1.16 3.2 2400 50 27
Таблица 1 Б. Очистка 6His-R.Eco29kI ш телец включения.
Стадия очистки Общее количество белка, мг Общая активность, 106 УЕ Удельная активность, УЕ/мкг
Ренатурация с помощью гель-фильтрации на ультрагеле АсА 54 0.4 0.85 2100
УЕ - условные единицы.
Очистка эндонуклеазы 6His-R.Eco29kI в денатурирующих условиях.
Как видно из Рис. 1 А (дорожка 3), после 4 часов индукции количество 6His-R.Eco29kI составляло около 15-20% от общего белка клетки. Однако 90-95% фермента переходит в нерастворимую фракцию в виде телец включения. Поэтому для повышения выхода фермента был применен метод ренатурации из телец включения. Разработана схема ренатурации ЭР 6His-R.Eco29kI из телец включения, растворенных в 8М мочевине. Предложенная схема основана на гель-фильтрации через АсА54 Ultragel носитель после экстракции 1 и 2 М мочевиной в соответствии с работами (Werner et al„ 1994; Mihic and Harris, 1996). На Рис.1 Б представлен 12% денатурирующий ПААГ с наиболее активными фракциями после гель-фильтрации. Некоторые фракции (Рис. 1 Б, дорожки 1-3) содержали дополнительные белки в основном высокого молекулярного веса, в то время как другие (дорожки 4 и 5) содержали гомогенный препарат эндонуклеазы 6His-R.Eco29kI. Таким образом, с помощью восстановления фермента из телец включения и фракционирования на АсА54 Ultragel за одну стадию очистки получен высокоочищенный препарат белка. Результаты выделения 6His-R.Eco29kI из нерастворимой фракции представлены в Табл. 1 Б. Из 0.5 г замороженной биомассы получено 0.4 мг активного гомогенного фермента с удельной активностью 2100 у.е./мкг, что лишь на 20% ниже
удельной активности нативного фермента (2660 у.е./мкг) и на 12.5% фермента выделенного из растворимой фракции (2400 у.е./мкг).
Сравнение биохимических свойств нативного 1{.Есо29к1 белка и его бШв-
производного.
Для обоих ферментов были определены оптимумы каталитической реакции. Максимальная каталитическая активность нативного белка наблюдалась при 50 мМ №С1, 50 мМ КС), рН 7.0-8.5, и 37°С. Для шестигистидинового производного оптимумы каталитической реакции измененились: 100-150 мМ №С1, 25-75 мМ КС1, рН 7.5-8.0, и 30-37°С. Оптимальная концентрация ионов Mg2+ составляет 10 мМ для обоих ферментов. Таким образом, добавление шестигистидинового тага сдвигает оптимум концентрации №С1 в область более высоких значений, расширяет оптимумы концентрации КС1 и температуры, и сужает оптимум рН среды. Специфичность белка 6№5-К.Есо29к1 сохранилась.
II. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ 6Н18-М.ЕС029К1.
Очистка ДНК-метилтрансферазы 6Н15-М.Есо29к1.
Схема очистки фермента основана на комбинации ионообменной (ОЕ52 целлюлоза) и аффинной (№-ЫТА) хроматографии. Белок элюировали с целлюлозы ОЕ52 линейным градиентом 100 - 500 мМ ЫаС1. Максимальная активность была обнаружена во фракциях, соответствующих 200-250 мМ МаС1. С аффинного носителя №-ОТА бН^-М.Есо29И фермент элюировали 100 мМ имидазолом после предварительных промывок 5 и 10 мМ имидазолом. Затем белок был дочищен на целлюлозе ВЕ52 по описанной выше схеме.
Рис. 2. Продукция и очистка ДНК-метилтрансферазы 6Ш8-М.Есо29к1.
Электрофоретическое разделение белков в 12% ПААГ в денатурирующих условиях. 1) - лизаты клеток Е.соН М15[рЯЕР4] трансформированных плазмидой р29М6Н15 (зкспрессионный вектор с ОРС М.Есо29к1) до индукции; 2-4) - индукция 1 мМ ИПТГ после 1, 2 и 3 часов соответственно; 6) -белок после очистки на целлюлозе ОЕ52; 7) -белок после очистки на КьКТА; 8) - конечный препарат белка после рехроматографии на целлюлозе иЕ52; М - маркеры молекулярных масс (кДа), в порядке убывания: 63, 45, 29, 20 и 14.
Таким образом, из 3 г биомассы получено около 4 мг высокоочищенного (>99 %) М.Есо29к1 белка (Рис. 2, дорожка 8) с молекулярным весом -46 кДа. Удельная активность фермента составила -225 у.е./мкг. Эта величина была близка величине удельной активности нативного (без шестигистидинового тага) белка - 270 у.е./мкг. Таким образом, присоединение тага не привело к существенному снижению метилтрансферазной активности данного фермента. В отличие от нативного, 6Н1«-М.Есо291с1 белок не был обнаружен в нерастворимой фракции, то есть шестигистидиновый таг снижает агрегацию и способствует стабилизации данного белка в растворе.
Биохимическая характеристика ДНК-метилтрансферазы 6КИ8-М.Есо29к1, и определение сайта метилирования.
Для МТ 6Н15-М.Есо29к1 были определены оптимумы каталитической реакции. Максимальная каталитическая активность фермента наблюдалась при 50 мМ №С1, 5 мМ ЕОТА, рН 7.0-8.5 и 37°С. Положение цитозина в сайте узнавания Есо29к1, подвергающегося метилированию, определялось с использованием метода бисульфитной обработки (0!ек е( а!., 1996). Метилированным оказался второй цитозин в последовательности сайта узнавания-. ССМЧ]ССС (Рис. 3).
Рис. 3. Определение сайта метилирования 6Н15-М.Есо29к1 бисульфитным методом. В результате обработки последовательность ССвССС была преобразована в последовательность ТСОТСС.
В результате обработки раствором бисульфита натрия все не метилированные цитозины превратились в урацилы, и единственный цитозин на секвенирующем геле (Рис. 3) соответствует модифицированному основанию. Данный результат был подтвержден в экспериментах по включению радиоактивных метальных групп в синтетические олигонуклеотиды с модифицированным и не модифицированным вторым цитозином в сайте узнавания. В случае метилированного основания включение метки не отличалось от фонового уровня. Ранее сайт метилирования не был охарактеризован ни для бШБ-М.Есо29М МТ, ни для его изошизомеров.
О А Т С
Влияние концентрации субстратов, ДНК и А(1оМе1, на начальные скорости реакции ДНК-метилтрансферазы 6Ш5-М.Есо29к1.
Для определения механизма функционирования фермента изучали влияние различных концентраций ДНК и АёоМе! на начальные скорости реакций (Рис. 4).
Рис. 4 А. Зависимость начальных скоростей реакции 6Шв-М.Есо29к1 МТ при
фиксированных концентрациях Ас)оМе1 и варьировании Концентрации ДНК. График Лайнувера-Берка в двойных обратных координатах. Реакционная смесь содержала 1 мкМ 6Н15-М.Есо29к1, фиксированные концентрации [3Н-теЛу!]-А(к>Ме1 (0.5, 1, 2 и 3 мкМ) и различные концентрации ДНК (0.2-2 мкМ),
Рис. 4 Б. Зависимость начальных скоростей реакции 6His-M.Eco29kI МТ при
фиксированных концентрациях ДНК и варьировании концентрации
AdoMet. График Лайнувера-Берка в двойных обратных координатах. Реакционные смеси содержали 1 мкМ 6His-M.Eco29kI, фиксированные
концентрации ДНК (0.25, 0.5, 1 и 2 мкМ) и различные концешрации [3H-methyI]-AdoMet (0.2-3 мкМ).
Эти эксперименты при варьировании концентрации одного и фиксированной концентрации второго субстрата позволяют дифференцировать последовательный и пинг-понг механизмы (Roberts, 1977). Для метилтрансферазы 6His-M.Eco29kI как в случае варьирования концентрации ДНК, так и AdoMet, график Лайнувера-Берка в двойных обратных координатах показал серии линий, пересекающихся слева от оси 1/v (Рис. 4 А и 4 Б). Такой характер графика соответствует реакции с образованием тройного комплекса при случайном или упорядоченном механизме (Roberts, 1977). При протекании каталитической реакции по пинг-понг механизму, без образования тройного комплекса, линии на графике Лайнувера-Берка располагаются параллельно. Таким образом, на основании данных по изучению зависимости начальных скоростей реакций от концентрации субстратов, пинг-понг механизм для 6His-M.Eco29kI МТ может быть исключен.
В Таблице 2 представлены кинетические параметры ДНК-метилтрансферазы 6His-M.Eco29kI, такие как константы Михаэлиса по ДНК (KmDNA=0.55 мкМ) и AdoMet (Km'"10"" =1.1 мкМ), и константа катализа (^„=0.047 сек"1) в сравнении с другими изученными ферментами этого класса. Как видно из таблицы, константы Михаэлиса 6His-M.Eco29kI метилтрансферазы выше соответствующих значений, характерных для бактериальных С5-цитозин метилтрансфераз, которые обычно находятся в наномолярном диапазоне. Константы Михаэлиса 6His-M.Eco29kI ближе по значению МТ млекопитающих DNMT1 и DNMT3a (Yokochi and Robertson, 2002), а также таким экзоциклическим МТ, как M.Kpnl (Bheemanaik et al., 2002) и EcoRV (Rao et al., 1989).
Таблица 2. Сравнение кинетических параметров 6His-M.Eco29kI и других метилтрансфераз.
Фермент KmMOMa KmmA Kill
6His-Eco29kI 1.1 мкМ 0.55 мкМ 0.047 сек"'
Hhal 14.5 нМ 2.3 нМ 0.022 сек"'
Mspl 13.5 нМ 2.28 нМ 0.056 сек"'
DNMT1 0.63 мкМ 0.36 мкМ 0.000042 сек"'
DNMT3a 0.52 мкМ 0.25 мкМ 0.0000072 сек"1
Kpnl 0.56 мкМ 0.15 мкМ 0.00033 сек"1
EcoRV 12 мкМ 0.3 мкМ 0.0016 сек'
Самым близким по кинетическим параметрам ферментом МТ 6His-M.Eco29kI является M.Kpnl (KmDNA 0.55 и 0.15 мкМ, KmAdoMl!' 1.1 и 0.56 мкМ, соответственно). Константа катализа 6His-M.Eco29kI близка по значению МТ M.MspI (Bhattacharya and Dubey, 1999) и M.Hhal (Wu and Santi, 1987), 0.047 сек"1, 0.056 сек"1 и 0.022 сек"1, соответственно.
Порядок связывания субстратов ДНК-метнлтрансферазой 6His-M.Eco29kI.
В реакции метилирования ДНК-метилтрансферазы взаимодействуют с двумя субстратами: ДНК и донором метальных групп AdoMet. При случайном кинетическом механизме ферменты связывают субстраты в любом порядке, а при упорядоченном один из субстратов связывается первым. Для установления порядка связывания субстратов МТ 6His-M.Eco29kI применяли методы предварительной инкубации с субстратами и разделения изотопов. При использовании первого метода фермент предварительно
инкубировали с одним из субстратов, радиоактивно меченым AdoMet либо ДНК. Реакцию метилирования инициировали добавлением недостающего субстрата. В обоих случаях конечные концентрации ДНК, AdoMet и фермента были идентичны. Как видно из Рис. 5 А, бинарный комплекс фермент-AdoMet демонстрировал более высокие уровни метилирования (около 4 раз), чем комплекс фермент-ДНК, если последний вообще существует. Сходные результаты были получены в случае МТ M.Kpnl (Bheemanaik et al., 2002) и M.EcoRV (Gowler and Jeltsch, 2000). В обоих случаях авторы исследований сделали вывод, что с данными ферментами AdoMet связывается первым.
t, сек
Рис. 5 А. Определение порядка связывания субстратов МТ бНц-М.Есо29к1 методом предварительной инкубации фермента с субстратами.
Реакционные смеси содержали 1 мкМ бИя-Есо29к1 МТ, 2 мкМ линеаризованной плазмиды риС128, либо, 2 мкМ [3Н-теИ»у1]- Ас1оМее. Метилазные реакции инициировали добавлением ДНК к раствору, содержащему фермент и Ас1оМе1 ([Ф, АсЬМсО+ДНК вариант), либо добавлением Ас1оМеГ к раствору, содержащему фермент и ДНК ([Ф, ДНК]+Ас1оМе1 вариант).
Рис. 5 Б. Определение порядка связывания субстратов МТ 6His-M.Eco29kI методом разделения изотопов.
Реакционные смеси содержали 1 мкМ 6His-Eco29kI МТ, 2 линеаризованной плазмиды мкМ pUC 128, и 5 мкМ AdoMet. Линия [3H-methyl] AdoMet показывает образование продуктов реакции после предварительной инкубации фермента с 5 мкМ [3H-methyll AdoMet и инициировании реакции добавлением ДНК и меченого [3H-methyl] AdoMet. Линия AdoMet показывает образование продуктов реакции после предварительной инкубации фермента с 5 мкМ [ H-methyll AdoMet и инициировании реакции добавлением ДНК и не меченого AdoMet.
Для подтверждения полученных результатов была проверена способность бинарного комплекса 6№8-М.Есо29кГ^оМе1 метилировать ДНК с помощью метода разделения изотопов. Фермент предварительно инкубировали с радиоактивно меченым [3H-methyl]-AdoMet, а затем смешивали с метилазной реакционной смесью, содержащей избыток ДНК с меченым либо не меченым AdoMet. В обоих случаях наблюдался резкий скачок включения радиоактивных [3Н]-метильных групп в ДНК (Рис. 5 Б), после чего
AdoMet
10 20 30 40 50 60 70 t, сек
AdoMet
следовал этап медленной постоянной скорости включения. С не меченым Ас1оМе1 в реакционной смеси уровень включения был заметно ниже, чем в эксперименте с присутствием меченого аналога. Если бы бинарный комплекс фермент-А<1оМе1 был не активен, все меченые молекулы АбоМе! были бы замещены в комплексе не мечеными группами из реакционной смеси, и никакого включения не наблюдалось. Таким образом, полученные результаты по разделению изотопов подтверждают готовность бинарного комплекса 6№5-М.Есо29к1-А£1оМе1 к метилированию ДНК.
В третьем эксперименте по определению порядка связывания субстратов использовался метод субстратного ингибирования. В этом случае уровень включения меченых [3Н]-метильных групп определяли при фиксированной концентрации одного из субстратов и увеличении концентрации второго (Рис. 6). В данном эксперименте при увеличении концентрации ДНК более 3 мкМ ферментативная активность 6Н1з-М.Есо29к! МТ снижалась (Рис. 6 А), в то время как замедления реакции при концентрации Ас1оМе[ вплоть до 5.36 мкМ не наблюдалось (Рис. 6 Б).
Рис. 6 А. Зависимость каталитической активности МТ 6Н15-М.Есо29к1 от концентрации ДНК.
Реакционные смеси содержали ] мкМ бН^-М.Есо29к1, 2 мхМ А13оМе1 и различные концентрации ДНК (0.5-10 мкМ).
Рис. 6 Б. Зависимость каталитической активности МТ 6Ш5-М.Есо29к1 от концентрации Ас1оМе1.
Реакционные смеси содержали 1 мкМ бШз-М.Есо29к1, 2 мкМ линеаризованной плазмиды риС12й и различные концентрации Ас!оМе1 (0.084-5.36 мкМ).
[Дс1оМеЦ, мкМ
Для снижения возможного влияния неспецифической ДНК на активность 6His-M.Eco29kI был проведен подобный кинетический эксперимент с использованием олигонуклеотидных дуплексов длиной 24 п.н., несущими сайт узнавания Eco29kI. В этом случае ингибирутощий эффект наблюдался при концентрации ДНК более 2 мкМ. Полученные результаты свидетельствуют в пользу упорядоченного механизма связывания субстратов, когда присоединение второго субстрата перед первым (по порядку), особенно вероятным в случае его высокой концентрации, приводит к снижению ферментативной активности. Возможно, при высокой концентрации второй субстрат образует с ферментом каталитически неактивный двойной или тройной комплекс. Подобный ингибирующий эффект высоких концентраций ДНК на ферментативную активность был продемонстрирован для M.Kpnl и Т4 Dam метилтрансфераз (Bheemar.aik et al., 2002; Evdokimov et al., 2002). Оба фермента связывают ДНК после AdoMet. Таким образом, мы привели несколько доказательств в пользу функционирования 6His-M.Eco29kI по упорядоченному би-би механизму, со связыванием AdoMet перед ДНК.
Упорядоченный тип кинетического механизма наиболее характерен для всех изученных на сегодняшний день С5 цитозиновых метилтрансфераз с одним исключением: M.Hhal при высоких концентрациях AdoMet может связывать субстраты в любом порядке (Vilkaitis et al., 2001). Остальные ферменты этого класса связывают ДНК перед AdoMet. Кинетический механизм, установленный для МТ 6His-M.Eco29kI, более характерен для экзоциклических ДНК метилтрансфераз и является новым для семейства m5C МТ. Он мог возникнуть в ходе эволюции данной СРМ в качестве адаптации к ее биологической функции. Метилтрансферазы, связывающие AdoMet перед ДНК обычно имеют дистрибутивный тип метилирования ДНК, что предотвращает метилирование чужеродной ДНК перед взаимодействием с эндонуклеазой рестрикции (Jeltsch, 2002; Gowler and Jeltsch, 2000). Как описано в работах Zakharova et al. (1998) и Pertzev et al. (1992), в СРМ Eco29kI OPC эндонуклеазы рестрикции находится перед ОРС метилтрансферазы и оба гена могут транскрибироваться с одного промотора (Рис. 7). Возможно, необычный порядок связывания субстратов метилтрансферазой этой СРМ способствует ее распространению среди популяций бактерий. В системе рестрикции-модификации EcoRI, имеющей схожую организацию генов, метилтрансфераза функционирует по упорядоченному би-би механизму и связывает AdoMet перед ДНК, как и исследуемая метилтрансфераза M.Eco29kI (Reich and Mashoon, 1991).
III. КОНСТРУИРОВАНИЕ БИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА, НЕСУЩЕГО ЭНДОНУКЛЕАЗНУЮ И МЕТИЛТРАНСФЕРАЗНУЮ АКТИВНОСТИ СРМ EC029KI, И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО СВОЙСТВ.
Очистка и биохимическая характеристика бифункционального гибридного белка 6Н18-1Щ.Есо29к1.
На природной плазмиде рЕС029 гены ЭР и МТ расположены последовательно, в порядке ЭР—>МТ, причем Стоп кодон гена эндонуклеазы перекрывается со Старт кодоном гена метилтрансферазы (Рис. 7). С помощью сайт-направленного мутагенеза перекрывающиеся Стоп и Старт кодоны были заменены на два кодона глицина (Рис. 7), образуя ген есо29кШМ. Полученный ген кодирует белок б№з-КМ.Есо29к1, несущий эндонуклеазную и метилтрансферазную части, соединенные двумя остатками глицина, в едином полипептиде.
pEC029kl eco29klFt есо29к1М
p29RM eco29klRM
Рис. 7. Схема организации генов СРМ Есо29к1 и мутагенеза для создання гена бифункционального белка КМ,Есо29к1.
Для выделения бифункционального белка 6Н1$-1Ш.Есо29к( были подобраны условия одностадийной очистки методом аффинной хроматографии на металл-хелатной колонке №-САМ. Из 200 мл бактериальной культуры было получено около 0.4 мг высокоочищенного (>99%) фермента (Рис. 8) с молекулярным весом -67 кДа.
В том случае, когда Стоп кодон гена ЭР 1?.Есо29к1 был заменен на кодон глицина без изменения первого кодона метионина гена МТ М.Есо29к1, наблюдалась экспрессия гена метилтрансферазы (неопубликованные наблюдения). Предполагается, что это могло произойти в результате образования вторичной структуры мРНК в районе последовательности Шайна-Дальгарно и сайта инициации трансляции эндонуклеазы Л.Есо29Ы, или, как описано в работе (Nagornykh ег а1., 2011), в результате инициации
транскрипции гена метилтрансферазы с собственного альтернативного промотора, расположенного перед ее ОРС.
М
шшш щи! .......... ш
Рис. 8. Продукция и очистка бифункционального фермента 6His-RM.Eco29kI.
Электрофоретическое разделение белков в 12% I (ААГ в денатурирующих условиях. 1) - лизаты клеток E.coli BL21(DE3) трансформированных плазмидами p29kll (с геном МТ M.Eco29kI) и p29RM (экспрессионный вектор с геном гибридного белка) до индукции; 2) - индукция 0.1 мМ ИПТГ, 3) - очищенный препарат белка; М - маркеры молекулярных масс, по возрастанию; 26, 34,47, 86 и 120 кДа.
Тестирование эндонуклеазной активности гибридного белка 6П|5-НМ.Есо29кГ.
Изучение специфичности расщепления ДНК гибридного белка 6Н!;>^М.Есо29к1, очищенного до гомогенного состояния, проводилось в сравнении с ЭР 6Ш5-К.Есо29к1. На Рис. 9 представлены результаты гидролиза ДНК фага ф8СМг гибридным белком 6Н15-ЯМ.Есо29к1 (дорожка 2) и эндонуклеазой 6№5-Я.Есо29к1 (дорожка 3). Картина гидролиза в обоих случаях была одинаковой. Таким образом, бифункциональный фермент сохранил специфичность нативной эндонуклеазы К.Есо29к1.
М 1 2 3
Рис. 9. Тестирование специфичности эндонуклеазной активности бШв-КМ.Есо29к1.
1) - ДНК фага (р80У1Г без добавления ферментов;
2), 3) - гидролиз ДНК фага ф80уп ферментами 6Н18-1Ш.Есо29к1 и ЭР 6Н)5-11.Есо29к1, соответственно.
М - маркеры молекулярных масс, по возрастанию; 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, б, 8 и Шт.п.н.
Затем для бифункционального белка были определены оптимумы эндонуклеазной активности в зависимости от концентрации 1ЧаС1, КС1, температуры и рН среды. Максимальная активность фермента наблюдалась при концентрации 0-50 мМ №С1; 0-25 мМ КС1; 10 мМ М2СЬ; рН 7.0 и 30-37°С. В Табл. 3 представлено сравнение оптимумов каталитической активности для ЭР 6Н18^.Есо29к1 и бифункционального белка бИя-
1Ш.Есо29к1. Как видно из таблицы, оптимумы гибридного белка были несколько изменены: на 100 мМ меньше для ЫаС1, на 50 мМ меньше для КС1 и на одну единицу ниже значение рН. Это означает, что в результате слияния биохимические свойства эндонуклеазной части гибридного белка изменились, несмотря на то, что ее аминокислотная последовательность осталась прежней. При оптимальных условиях реакции удельная специфическая активность ЭР 6Н15-11.Есо29к1 была равна 60 у.е./пМоль, в то время как для гибридного белка 61И5-}Ш.Есо29к1 она равна 20 у.е./пМоль, что составляет 33% значения активности нативного фермента.
Таблица 3. Сравнение оптнмумов эндонуклеазной активности ЭР 6Н15-К.Есо29к1 и бифункционального белка 6Н1.ч-КМ.Есо29к1.
6Шз-К.Есо29к1 6Ш5-1Ш.Есо29к1
№С1, мМ 100-150 0-50
КС1, мМ 25-75 0-25
рн 7.0-8.0 7.0
Т, °с 30-37 30-37
Таким образом, после слияния с метилтрансферазой М.Есо29к1 эндонуклеазная активность гибридного белка уменьшилась в 3 раза.
Тестирование метнлтрансферазноП активности гибридного белка бШя-ЫМ.Есо29к1.
Биохимическая характеристика гибридного белка проводилась в сравнении с МТ 6Н1Х-М.Есо29к1. Специфичность метилирования гибридным ферментом осталась прежней, так как не наблюдалось включения меченых ['1Н]-метильных групп в ДНК, обработанной нативным ферментом и не меченным Ас1оМе1. Оптимумы каталитической реакции также не изменились: оба фермента демонстрировали максимальную активность при 50 мМ ЫаС1, 5 мМ ЕБТА, рН 7.0-8.5 и 37°С. При оптимальных условиях реакции МТ 6Н|5-М.Есо29к1 обладала удельной специфической активностью 10 у.е./пМоль, а гибридный белок - 8 у.е./пМоль, что составляет 80% от активности нативного белка. Таким образом, в результате слияния с эндонуклеазой биохимические свойства метилтрансферазной части нового белка практически не изменились.
Характеристика функциональной активности гибридной СРМ RM.Eco29kI in
vivo.
Функциональную активность новой гибридной СРМ in vivo проверяли по способности ограничивать развитие фаговой инфекции в клетках E.coli.
Разведения фага X
Рис. 10. Функциональная активность гибридной СРМ RM.Eco29kI in vivo.
BL2](DE3)xp29kl I клетки содержат плазмиду, несущую ген МТ Eco29kI и не содержат гена ЭР. BL2!(DE3)xpEC029RM клетки содержат природную плазмиду. на которой гены ЭР и МТ слиты (pEC029RM). BL2l(DE3)xp29k! l+p29RM клетки несут гены МТМ.Есо29М и гибридного белка RM.Eco29kI на двух разных плазмидах. BL21(DE3)xpEC029 клетки содержат природную плазмиду рЕС029, несущую гены МТ и ЭР Eco29kI дикого типа.
Как видно из Рис. 10, гибридная СРМ способна ограничивать распространение фага в 102 раз. В таких же условиях нативная СРМ Eco29kI защищает клетки от проникновения фага более эффективно - в 104 раз. Однако уровень защиты в 102 раз все же отражает способность гибридной СРМ защищать клетки хозяина от проникновения чужеродной ДНК, то есть основная биологическая функция бактериальных систем рестрикции-модификации сохранилась.
Характеристика функциональной активности гибридного белка RM.Eco29kI in vitro.
Для изучения in vitro взаимодействия бифункционального фермента RM.Eco29kI с ДНК и оценки влияния AdoMet на его эндонуклеазную активность белок инкубировали с ДНК фага cp80vir в условиях оптимальных для эндонуклеазной (Рис. 11 А) и метилтрансферазной (Рис. 11 Б) реакций без добавления или с добавлением избытка AdoMet (10 мкМ). В метилтрансферазной реакционной смеси 5 мМ ЭДТА был заменен на 10 мМ MgCh для обеспечения эндонуклеазной части фермента ионами Mg2+, необходимыми для реакции гидролиза. В нуклеазном буфере картина гидролиза была одинаковой независимо от присутствия AdoMet. В метилтрансферазном буфере в
10° 10"2 10"4 10
E.coli BL21(DE3)xp29kll
E.coli BL21(DE3)xp29kl l+p29RM, О.ОЗтМ ИПТГ/ E.coli BL21 (DE3)xpEC029RM
E.coli BL21 (DE3)xpEC029
присутствии Ас1оМе1 был заметен слабый неполный гидролиз даже при самом низком разбавлении фермента (Рис. 11 Б), который указывает на защиту ДНК метилазной частью фермента. Из полученных данных следует, что т \>Нгп в реакции, катализируемой бифункциональным ферментом 1Ш.Есо29к1, эндонуклеазная активность фермента преобладает над метилтрансферазной; а также АёоМе! не влияет на эндонуклеазную часть бифункционального фермента, в отличие от других известных на сегодняшний день систем рестрикции-модификации ПС типа.
Эндонуклсазпый буфер -AdoMct +AdoMet
Метнлтрансферазный буфер -AdoMet +AdoMet
: . ■
v
, -
Рис. 11. Анализ влнянне АДоМе! на эндонуклеазную и метнлтрансферазную активности бифункционального белка 6НЬ-Г{\1.Есо29к1.
А - реакции проводили в оптимальном эндонуклеазном буфере в отсутствии (-Ас1оМе1) и присутствии (+АаоМеО АйоМй;
Б - реакции проводили в оптимальном метшггрансферазном буфере в отсутствии (-АйоМеО и присутствии (+Ас1оМеО АйоМеЕ.
Треугольниками над гелями показано направление двукратных разбавлений фермента в реакционных смесях. Рисунок отражает соотношение эндонуклеазной и метилтрансферазной активностей в гибридном белке.
Номенклатура нового гибридного фермента RM.Eco29kI.
На сегодняшний день описано 12 бифункциональных ферментов, несущих эндонуклеазную и метилтрансферазную активности в одном полипептиде: Alol, Bcgl, BseMII, BseRI, Bsgl, BspLUllIII, Cjel, Eco57I, HaelV, Mmel, Ppil, и Tstl. Эти ферменты являются членами группы СРМ ПС типа. Их свойства представлены в Таблице 4. Эти белки также принадлежат группам СРМ IIB, расщепляющим ДНК по обеим сторонам от сайта узнавания, или СРМ 1IG, стимулирующимся или ингибирующимся AdoMet (Roberts et al., 2003). Новый гибридный белок RM.Eco29kI также попадает в категорию 1IC ферментов, однако отличается от остальных членов этой группы следующими характеристиками: данный фермент узнает непрерывную палиндромную последовательность; расщепляет ДНК внутри сайта узнавания; его эндонуклеазная
активность не зависит от Ас1оМе1; его метилтрансфераза принадлежит ш5С типу, в отличие от остальных ПС ферментов, принадлежащих к тбА типу ДНК-метилтрансфераз. Таким образом, свойства 11М.Есо29к1 расширяют границы свойств семейства ферментов ИС типа.
Таблица 4. Основные свойства СРМ типа ПС.
Фермент Другие подтипы Последовательность узнавания AdoMet влияния на ЭР Тип Мт Отдельный ген МТ
AloI (7/12-13) GAACNNNNNNTCC (12-13/7) да m'A нет
BcgI В, в, Н, Б (10/12) CGANNNNNNTGC (12/10) да m'A нет
BseMII в, Б CTCAG (10/8) да m'A да
BseRI в, Б GAGGAG (10/8) да m'A нет
Bsgl С, Б GTGCAG (16/14) да m'A нет
BspLUUIII в, Б GGGAC (10/14) да m6A да, два гена
Cjel в, а в (8/14) CCANNNNNNGT (15/9) да m6A нет
RM.Eco29kI р CCGC*GG нет m5C да
Eco57I Е, в, Б CTGAAG (16/14) да m'A да
HaelV В,С,Р (7/13) GAYNNNNNRTC (14/9) да m'A нет
Mmel а Б TCCRAC (20/18) or TCCRAC (21/19) да m'A нет
Ppil в, о, э (7/12) GAACNNNNNCTC (13/8) да m'A нет
TstI В, в, Б (8/13) CACNNNNNNTCC (12/7) да m'A нет
Роль слияния генов в эволюции систем рестрикции-модификации.
В данной работе мы получили полностью функциональный гибридный полипептид с помощью слияния эндонуклеазной и метилтрансферазной ОРС системы рестрикции-модификации Eco29kI. Новый белок сохранил специфичность узнавания исходных ЭР и МТ. Метилтрансферазная удельная активность почти не изменилась, составляя 80% активности исходного фермента M.Eco29kI. Его нуклеазная активность понизилась в три раза, что может быть связано с пространственными ограничениями для взаимодействия этой части нового белка с субстратом. Кроме того, оптимумы эндонуклеазной реакции гибридного белка RM.Eco29kI изменились по сравнению с оптимумами исходной эндонуклеазы R.Eco29kI: на 100 мМ меньше для NaCl, 50 мМ меньше для КС1 и на одну единицу ниже значение рН (Табл. 3). Точная причина этого сдвига не ясна, так как в новом гибридном белке изменились многие физико-химические свойства, такие как молекулярный вес, изоэлектрическая точка, суммарный заряд, пространственная структура и др. Предположительно, в ходе эволюции наблюдаемая разница в биохимических свойствах исходного и гибридного белков может привести к еще более сильной дивергенции характеристик и биологических функций этих полипептидов.
Данная работа представляет экспериментальную модель молекулярной эволюции систем рестрикции-модификации в частности и мультифункциональных белков вообще. В ней приведены прямые доказательства того, что в результате нескольких точечных мутаций может возникнуть мультифункциональный белок с измененными биохимическими свойствами. С одной стороны, это может служить примером молекулярного механизма возникновения систем рестрикции-модификации ПС типа. На Рис. 12 представлена схема организации известных на сегодняшний день белков этого класса. Характер организации их генов позволяет предположить, что все они возникли в результате слияния близко расположенных эндонуклеазных и метилтрансферазных ОРС. Возможное участие слияния генов было предложено в формировании таких гибридных белков как AIoI, BseMII, Cjef, Eco57I, HaelV и Mmel. Ферменты Alol, Cjel и HaelV предположительно возникли в результате слияния генов HsdS, HsdM с нуклеазными доменами (Cesnaviciene et al., 2001); Eco57I - генов Mod и Res субъединиц ферментов СРМ типа III (Rimseliene et al., 2003); в то время как BseMII и Mmel - слияния генов ЭР и МТ (Jurenaite-Urbanaviciene et al., 2001; Nakonieczna et al., 2009).
Можно предположить, что новые СРМ IIC типа могут возникнуть в результате слияния генов их двухкомпонентных предшественников, в которых соответствующие гены близко расположены и ориентированы в одном направлении.
А1о1 Вс61
ВвеМП ВвеШ
ВврЬи 11Ш
С]е1 Есо571
Нае1У Мше1 Рр(1 ТвЯ
М'
К' М' _.
R.BcgI R.BcgI
а субъдшшца |) субъдиница
Потенц-я ОРС
R' М'
«4-
ЯМ.ВяеМП R' М'
М.ВвеМП
RM.BseRI
М.ВяеВГ М' R'
М1.в$рш11ш мг.ввршшп
Потенц-я
КМ. ВярИШШ
МшЯ к'
М'
Потенц-я трансфераза
Потенц-й
М' ^
М.Есо571 R' М'
КМ.Есо571
Потенц-я ОРС
R' М'
Потенц-я
ОРС -►
R' М' ТКО
R' М' ТКБ
Рис. 12. Схемы организации СРМ ПС типа.
Черными стрелками отмечено расположение соответствующих ОРС. Я' - ЭР часть; М'- МТ часть; Б' - часть фермента, ответственная за узнавание ДНК.
Такой характер организации довольно распространен среди СРМ различных типов. В соответствии с работой Wilson (1991), СРМ типа I, такие как CfrA, EcoA, EcoB, EcoD, EcoE, ЕсоК, EcoR124, StySB, StySI, StySP и StySQ; типа И, такие как AccI, Banl, Bsp6I, BsuBI, Cfr9I, Ddel, EagI, EcoPI, EcoP15, EcoRI, FnuDI, Haelll, HgiBI, HgiCI, HgiCII, HgiDI, HgiEI, HgiGI, Hhall, HincII, Hindlll, Hinfl, Hpal, MboII, Mwol, Ncol, Ndel, NgoMI, NgoPII, Nlalll, PaeR7I, RsrI, Sail, Sau3A, Sau96I, TaqI, TthHBSI, Xbal и Xmal имеют подходящие для слияния расположение и ориентацию генов, являясь потенциальными кандидатами для возникновения новых ферментов типа ПС.
С другой стороны, данная работа служит примером общего механизма изменения функций существующих белков. Можно предположить, что любая пара ОРС может быть слита без сбивки рамки считывания в результате точечных мутаций, делеций, инверсий, транслокаций или их комбинаций. Затем новые гибридные белки могут изменяться в ходе естественного отбора, и либо сохранять старые функции, либо адаптироваться к новым функциям в клетке. Например, M.SsoII-родственные бифункциональные ферменты, включая их изошизомеры с регуляториым и метилтрансферазным доменами (Karyagina et al., 1997; Denjmukhametov et al., 1998) могли возникнуть в результате слияния соответствующих ОРС на определенном этапе их эволюции. Данное предположение подтверждается существованием метилтрансферазы M.NlaX, близкого гомолога метилтрансферазы M.Sson лишенной регуляторного N-концевого домена. Оба полипептида обладают высокой гомологией аминокислотной последовательности за исключением 70 аминокислотного N-концевого домена метилтрансферазы M.SsoII, принимающего участие в авторегуляции собственного гена (Karyagina et al., 1997). Подобное слияние ОРС С-белка и эндонуклеазы в СРМ BamHJ, Eco72I, Muni, PvuII и Smal RMS может привести к возникновению эндонуклеаз с авторегуляторными транскрипционными функциями. В зависимости от взаимного расположения, существует вероятность слияния генов двух различных метилтрансфераз в таких системах рестрикции-модификации, как Dpnll и Hgal, что может привести к появлению бифункциональных метилтрансфераз, подобных M.Fokl и M.Llal (Wilson, 1991).
В принципе, любые близлежащие и одинаково ориентированные гены могут слиться с генами ЭР и МТ систем рестрикции-модификации. В этом случае тот факт, что удаление системы рестрикции-модификации летально для клетки (Kobayashi, 1999), будет предотвращать потерю любой слитой с ними ОРС. Это происходит в результате того, что ЭР дольше сохраняют активность, и при разбавлении соответствующей защитной метилтрансферазной активности в результате клеточных делений будут фрагментировать геномную ДНК, убивая клетки с потерянной СРМ. Поэтому слияние с генами рестрикции-
модификации может способствовать поддержанию и распространению в популяциях бактерий любой ОРС, не нарушающей их функционирование.
Применение искусственного слияния генов для получения эидоиуклеаз с новыми специфнчностями.
Эндонуклеазы рестрикции являются основными инструментами в технологии рекомбинантных ДНК. Несмотря на то, что на сегодняшний день описано более 200 различных сайтов узнавания, многие специфичности не были обнаружены (Rimseliene et al., 2003; Jurenaite-Urbanaviciene et al., 2007). Для искусственного создания ферментов с новыми сайтами узнавания используются метод селекции, основанный на метилтрансферазной активности - MABS (Methylation Activity Based Selection; Rimseliene et al., 2003) и обмен сайт-узнающими доменами (TRD reassortment; Jurenaite-Urbanaviciene et a.I, 2007). С применением этих подходов ранее удалось создать белки с новыми специфнчностями, используя бифункциональные СРМ типа IIC, такие как Eco57I, AloT, Ppil и Tstl. Для этих подходов принципиальным требованием является присутствие эндонуклеазной и метилтрансферазной активностей в одном белке, что дает возможность использовать ДНК-модифицирующую активность бифункциональных полипептидов для селекции мутантных вариантов с новыми сайтами узнавания. Для расширения списка бифункциональных белков, подходящих для данных манипуляций, может быть предложен подход, основанный на искусственном слиянии генов, подобный тому, что описан в данной работе. С его помощью могут быть созданы сотни новых бифункциональных белков из СРМ типов I и Ш, которые после мутагенеза и селекции нужных вариантов дадут возможность существенно пополнить список ферментов с новыми сайтами узнавания.
ВЫВОДЫ:
1. Разработаны методы очистки гомогенных препаратов ДНК-метилтрансферазы M.Eco29kI и эндонуклеазы рестрикции R.Eco29kI, из растворимой и нерастворимой фракций;
2. Установлены основные биохимические константы ДНК-метилтрансферазы M.Eco29kI: константа Михаэлиса по ДНК, KmDNA = 0.55 мкМ; константа Михаэлиса no AdoMet, KmAlbMc< =1.1 мкМ; константа катализа, kcat = 0.047 сек"1;
3. Определен кинетический механизм ДНК-метилтрансферазы M.Eco29kI: упорядоченный би-би механизм с использованием AdoMet в качестве первого субстрата;
4. Локализован метилируемый цитозин в сайте узнавания M.Eco29kI: CCMtGCGG;
5. Получен и охарактеризован бифункциональный гибридный фермент RM.Eco29kI: оптимумы его эндонуклеазной активности отличаются от исходного фермента R.Eco29kI, а удельная нуклеазная активность снижена в три раза.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Mokrishcheva M.L., Solonin A.S. and Nikitin D.V. (2011) Fused eco29kIR- and M genes coding for a fully functional hybrid polypeptide as a model of molecular evolution of restriction-modification systems. BMC Evol Biol., 11:35.
2. Nikitin D., Mokrishcheva M. and Solonin A. (2007) 6His-Eco29kI methyltransferase methylation site and kinetic mechanism characterization. Biochim Biophys Acta., 1774(8): 1014.
3. Nikitin D., Mokrishcheva M.. Denjmukhametov M., Pertzev A., Zakharova M., Solonin A. (2003) Construction of an overproducing strain, purification, and biochemical characterization of the 6His-Eco29kI restriction endonuclease. Protein Expr Purif., 30(1): 26-31.
4. Nikitin D., Mokrishcheva M„ Rykunova A. and Solonin A. (2004) Eco29kI DNA-methyltransferase binds AdoMet before DNA: kinetic and crystallization data. Proceedings of the 5th New England Biolabs Meeting on Restriction/Modification, Wills Hall, (Bristol, UK), P. 124.
5. Мокрищева M.. Никитин Д.В, Солонин А.С. (2002) Сравнение биохимических свойств нативной Eco29kI эндонуклеазы рестрикции и ее б-Ш-производной. Труды "6"" Пущинской школы-конференции молодых ученых: Биология - наука XXI века", (Пуи/ино, Россия), с. 284.
БЛАГОДАРНОСТИ
Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю зав. лабораторией «Молекулярной микробиологии» к.б.н. Александру Сергеевичу Солонину за помощь, понимание, конструктивные замечания и мудрое руководство при выполнении данной работы. Выражаю особую благодарность к.б.н. Дмитрию Валериевичу Никитину за переданный опыт, неординарные идеи, постоянную помощь в написании диссертационной работы, терпение и неоценимый вклад в данную работу. Глубоко признательна к.б.н. Марине Викторовне Захаровой за консультации, ценные советы и способность находить простое в сложном. Выражаю благодарность всем сотрудникам нашей лаборатории и друзьям за поддержку и помощь, оказанную мне в процессе выполнения экспериментов. Благодарю проф. Е.С. Громову и к.х.н. H.A. Черепанову за предоставленную возможность и помощь в проведение некоторых экспериментов при химическом факультете МГУ. Я признательна оппонентам и рецензентам за критические замечания и обсуждение работы. Искреннюю благодарность выражаю моему мужу за постоянную поддержку и помощь, терпение и понимание. Особую благодарность выражаю моим родным за многолетнюю моральную поддержку, сопереживание, бесконечную веру и любовь.
Подписано в печать:
01.11.2011
Заказ № 6180 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мокрищева, Марина Леонидовна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Основные понятия о системах рестрикции-модификации
1.2. Номенклатура ферментов СРМ
1.3. Классификация СРМ
1.3.1. Системы рестрикции-модификации типа
1.3.2. Системы рестрикции-модификации типа II
1.3.3. Системы рестрикции-модификации типа III
1.3.4. Системы рестрикции-модификации типа IV
1.4. Классификация ДНК-метилтрансфераз
1.4.1. Структура ДНК-метилтрансфераз
1.4.1.1. Структура большого домена ДНК-метилтрансфераз
1.4.1.2. Структура малого домена ДНК-метилтрансфераз
1.4.1.3. Ас1оМе1-связывающий сайт ДНК-метилтрансфераз
1.4.2. Связывание и узнавание ДНК
1.5. Каталитические механизмы ДНК-метилтрансфераз
1.5.1. Каталитический механизм С5-цитозиновых ДНК-метилтрансфераз
1.5.2. Каталитический механизм экзоциклических ДНК-метилтрансфераз
1.6. Разнообразие кинетических механизмов ДНК-метилтрансфераз
1.7. Выпетливание основания-мишени ДНК-метилтрансферазами
1.8. Требования ДНК-метилтрансфераз к ионам металлов
1.9. Система рестрикции-модификации Есо29к
1.10. Пространственная структура эндонуклеазы Я. Есо29к
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы бактерий, бактериофагов и плазмидные вектора
2.1.2. Материалы, реактивы и ферменты
2.2. Методы исследования
2.2.1. Общие, широко используемые методы
2.2.2. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.2.3. Конструирование плазмид и рекомбинантных штаммов
2.2.4. Получение бактериальной массы и экспрессия генов рекомбинантных белков
2.2.5. Выделение и очистка рекомбинантных белков
2.2.5.1. Очистка эндонуклеазы рестрикции 6№з-11.Есо29к1 в нативных условиях
2.2.5.2. Очистка эндонуклеазы рестрикции 6№8-11.Есо29к1 в денатурирующих условиях (восстановление из телец включения)
2.2.5.3. Очистка ДНК-метилтрансферазы 6Шз-М.Есо29к
2.2.5.4. Очистка гибридного белка 6Н1з-1Ш.Есо29к
2.2.6. Тестирование эндонуклеазной активности ферментов 11.Есо29к1, 6Шз-11.Есо29к1 и 6Н1з-11М.Есо29к
2.2.7. Определение оптимумов ферментативных реакций Я.Есо29к1, 6Н1з-Я.Есо29к1 и 6№8-1Ш.Есо29к
2.2.8. Тестирование метилтрансферазной активности ферментов
6Шз-М.Есо29к1 и 6№8-11М.Есо29к
2.2.9. Определение сайта метилирования метилтрансферазы 6His-M.Eco29kI
2.2.10. Кинетические исследования ферментативной активности 6№з-М.Есо29к
2.2.10.1. Зависимость начальных скоростей реакций М.Есо29к1 от ДНК и АёоМй
2.2.10.2. Ингибирование ферментативной активности 6Н15-М.Есо29к1 субстратами
2.2.10.3. Предварительная инкубация фермента с субстратами
2.2.10.4. Метод разделения изотопов
2.2.11. Анализ влияния АбоМег на эндонуклеазную активность 6Н1з-ЯМ.Есо29к
2.2.12. Анализ ограничения роста бактериофага А. системой рестрикции-модификации ЯМ.Есо29к1 методом «спот-теста»
2.2.13. Измерение концентрации белка
2.2.14. Измерение 3Н-меченых препаратов 54 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Изучение свойств эндонуклеазы рестрикции 6№5-11.Есо29к
3.1.1. Конструирование штамма с повышенным синтезом эндонуклеазы 6Н1з-Я.Есо29к
3.1.2. Очистка эндонуклеазы 6№8-11.Есо29к1 в нативных условиях
3.1.3. Очистка эндонуклеазы 6Н1з-Я.Есо29к1 в денатурирующих условиях
3.1.4. Сравнение биохимических свойств нативного белка 11.Есо29к1 и его бИэ-производного
3.2. Изучение свойств ДНК-метилтрансферазы 6Н1з-М.Есо29к
3.2.1. Конструирование штамма с повышенным синтезом ДНК-метилтрансферазы 6Н1з-М.Есо29к1 и очистка белка
3.2.2. Биохимическая характеристика ДНК-метилтрансферазы 6№з-М.Есо29к и определение сайта метилирования
3.2.3. Влияние концентрации субстратов, ДНК и AdoMet, на начальные скорости реакции ДНК-метилтрансферазы 6His-M.Eco29kI
3.2.4. Порядок связывания субстратов ДНК-метилтрансферазой 6His-M.Eco29kI 64 3.3. Конструирование бифункционального гибридного белка, несущего эндонуклеазную и метилтрансферазную активности СРМ Eco29kI, и изучение его свойств
3.3.1. Конструирование штамма с повышенным синтезом бифункционального фермента RM.Eco29kI и очистка гибридного белка
3.3.2. Тестирование эндонуклеазной активности гибридного белка 6His-RM.Eco29kI
3.3.3. Тестирование метилтрансферазной активности гибридного белка 6His-RM.Eco29kI
3.3.4. Характеристика функциональной активности гибридной
СРМ RM.Eco29kI in vivo
3.3.5. Характеристика функциональной активности гибридного белка RM.Eco29kI in vitro
3.3.6. Номенклатура нового гибридного фермента RM.Eco29kI
3.3.7. Роль слияния генов в эволюции систем рестрикции-модификации
3.3.8. Применение искусственного слияния генов для получения эндонуклеаз с новыми специфичностями
ВЫВОДЫ
Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика ферментов системы рестрикции-модификации Eco29kl и их бифункционального гибридного варианта"
Системы рестрикции-модификации (СРМ) широко распространены среди различных микроорганизмов и составляют до 1% их генома. Бактериальные СРМ обычно состоят из двух ферментов, конкурирующих за одну и ту же ДНК-мишень: эндонуклеазы рестрикции (ЭР), узнающей и расщепляющей специфические последовательности ДНК, и ДНК-метилтрансферазы (МТ), метилирующей по определенным положениям ту же последовательность. Тем самым МТ защищает хозяйскую ДНК от расщепления соответствующей эндонуклеазой. СРМ служат защитным механизмом от проникновения в клетку чужеродной ДНК, ограничивая горизонтальный перенос генов и, таким образом, обеспечивают поддержание целостности генома микроорганизмов и способствуют увеличению разнообразия их видов.
Обнаружение эндонуклеаз рестрикции и ДНК-метилтрансфераз открыло новую эру в молекулярной биологии благодаря развитию технологии рекомбинантных ДНК. Большинство описанных к настоящему времени СРМ относится к типу II. Это связано, главным образом, с преимущественным распространением их в природе по сравнению с системами других типов, а также обусловлено целенаправленностью поиска в связи с их практическим применением в генной инженерии и молекулярной медицине. ЭР и МТ служат идеальными модельными объектами для изучения взаимодействий белок - ДНК и эволюционных взаимосвязей среди различных групп ферментов. Белки СРМ являются объектами исследования структурной биологии. К настоящему времени с помощью рентгеноструктурного анализа охарактеризованы пространственные структуры 37 эндонуклеаз и 8 ДНК-метилтрансфераз типа II.
Ферментативный перенос метильной группы на определенные нуклеотиды в молекуле ДНК является самой распространенной формой биологической модификации ДНК. Эта реакция катализируется МТ путем переноса метальных групп с кофактора Б-аденозил-Ь-метионина (АёоМе^ на ДНК с образованием продуктов реакции, метилированной ДНК и Б-аденозил-Ь-гомоцистеина (АёоНсу). Метилирование ДНК является важнейшим способом передачи наследственной информации, не закодированной в нуклеотидной последовательности ДНК. В микроорганизмах метилирование ДНК играет важную роль в контроле репликации ДНК, репарации, транскрипции, контроле клеточного цикла, а также бактериальной вирулентности. Распознавание своей и чужеродной ДНК ассоциировано с СРМ, функционирующими в качестве механизмов защиты от бактериофаговой инфекции.
У эукариот метилирование ДНК связано с такими биологическими процессами, как регуляция экспрессии генов, контроль эмбрионального развития, геномный импринтинг, инактивация Х-хромосомы и стабильность генома. Уровень эпигенетического метилирования ДНК является важным фактором в патогенезе различных заболеваний человека. Учитывая высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей прокариотических и эукариотических МТ, использование бактериальных ферментов в качестве модельных объектов представляется важным для изучения механизмов и роли метилирования у млекопитающих.
Объектом исследований данной работы является СРМ типа II Есо29к1. Ферменты этой системы специфически узнают палиндромную последовательность 5'-ССОСОО-3\ Изучение биохимических свойств, механизмов действия ферментов СРМ и возможности образования на ее основе слитого бифункционального белка важно для понимания эволюции СРМ, функционирования клетки или отдельно взятой генетической системы.
Цели и задачи исследования: Целью данной работы является характеристика ферментов СРМ Есо29к1, конструирование бифункционального гибридного белка, несущего эндонуклеазную и метилтрансферазную активности в одном полипептиде, и сравнительный анализ гибридного белка с его нативными предшественниками.
Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
1. Сконструировать штаммы с увеличенным синтезом ЭР и МТ Есо29к1;
2. Получить высокоактивные гомогенные препараты белков и определить оптимальные условия каталитических реакций;
3. Локализовать метилируемый цитозин в сайте узнавания Есо29к1;
4. Определить кинетический механизм МТ Есо29к1;
5. Сконструировать бифункциональный гибридный белок КМ.Есо29к1, несущий нуклеазную и метилтрансферазную активности в одном полипептиде, и определить его функциональные активности.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мокрищева, Марина Леонидовна
выводы
1. Разработаны методы очистки гомогенных препаратов ДНК-метилтрансферазы М.Есо29к1 и эндонуклеазы рестрикции 11.Есо29к1, из растворимой и нерастворимой фракций;
2. Установлены основные биохимические константы ДНК-метилтрансферазы М.Есо29к1: константа Михаэлиса по ДНК, КтША = 0.55 мкМ; константа Михаэлиса по Ас1оМе1:, КтА(1оМе' =1.1 мкМ; константа катализа, кса1 = 0.047 сек"1;
3. Определен кинетический механизм ДНК-метилтрансферазы М.Есо29к1: упорядоченный би-би механизм с использованием Ас1оМе1 в качестве первого субстрата;
4. Локализован метилируемый цитозин в сайте узнавания М.Есо29к1: ССл,еОСОО;
5. Получен и охарактеризован бифункциональный гибридный фермент КМ.Есо29к1: оптимумы его эндонуклеазной активности отличаются от исходного фермента 11.Есо29к1, а удельная нуклеазная активность снижена в три раза.
БЛАГОДАРНОСТИ
Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю зав. лабораторией «Молекулярной микробиологии» к.б.н. Александру Сергеевичу Солонину за помощь, понимание, конструктивные замечания и мудрое руководство при выполнении данной работы. Особую благодарность выражаю к.б.н. Дмитрию Валериевичу Никитину за переданный опыт, неординарные идеи, постоянную помощь в написании диссертационной работы, терпение и неоценимый вклад в данную работу. Глубоко признательна к.б.н. Марине Викторовне Захаровой за консультации, ценные советы и способность находить простое в сложном. Выражаю благодарность всем сотрудникам нашей лаборатории за поддержку и помощь, оказанную мне в процессе выполнения экспериментов. Благодарю проф. Е.С. Громову и к.х.н. H.A. Черепанову за предоставленную возможность и помощь в проведение некоторых экспериментов при химическом факультете МГУ. Я признательна оппонентам и рецензентам за критические замечания и обсуждение работы. Искренне благодарю своих друзей за внимание, соучастие, ценные советы и эффективное стимулирование к завершению данной работы. Огромную благодарность выражаю моему мужу за постоянную поддержку и помощь, терпение и понимание. Особую благодарность выражаю моим родным за многолетнюю моральную поддержку, сопереживание, бесконечную веру и любовь.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мокрищева, Марина Леонидовна, Пущино
1. Зайцев E.H., Зайцева Е.М., Бакланова И.В., Горелов В.Н., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Ланцов В.А. (1986) Клонирование и секвенирование гена гесА из штамма Pseudomonas aeruginosa. Генетика. 22. 2721-2727.
2. Adams G.M., Blumenthal R.M. (1997) The PvuII DNA (cytosine-N4)-methyltransferase comprises two trypsin-defined domains, each of which binds a molecule of S-adenosyl-L-methionine. Biochemistry. 36, 8284-8292.
3. Ahmad I., Rao D.N. (1996) Chemistry and biology of DNA methyltransferases. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31, 361-380.
4. Alexandrov K. Simon 1. Yurchenko V., Iakovenko A., Rostkova E., Scheidig A.J., Goody R.S. (1999) Characterization of the ternary complex between Rab7, REP-1 and Rab geranylgeranvl transferase. Eur J Biochem, 265, 160-170.
5. Arber W., Waulers-Willems D. (197.0) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. XII. The two restriction and modification systems of strain 15T". Mol. Gen. Genet., 108, 203-217.
6. Beifort M. Roberts R.J. (1997) Homing endonncleases: keeping the house in order. Nucleic Acids Res., 25, 3379-3388.
7. Berge 'Г., Ei I is D.J., Dry den D.T., Edwardson J.M., Henderson R.M. (2000) Translocation-lndependent Dimerization of the EcoKl Endonuclease Visualized by Atomic Force Microscopy. Biophysical .Journal, 79, 479-484.
8. Bertani G.; Wciglc J.J. (1953) Most-controlled variation in bacterial viruses. J.Bacteriol., 65, 113-121.
9. Bhattacharya S.; Dubey A. (1999) Kinetic mechanism of cytosine DNA methyltransferase Mspl,J. Biol Chan., 214, 14743-14749.
10. Bheemanaik S., Sistla S., Krishnamurthy V., Arathi S., Desirazu N.R. (2010) Kinetics of Methylation by EcoPlI DNA Methyl transferase. Enzyme Res., 302731.
11. Bheemanaik S., Chandrashekaran S., Nagaraja V., Rao D.N. (2003) Kinetic and catalytic properties of dimeric Kpnl DNA methyltransferase. J. Biol. Chem., IIS, 7863-7874
12. Bheemanaik S. Rcddy Y.V. Rao D.N. (2006) Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases. Biochemical .Journal, 399, 177-190.
13. Biclcle T.A., Krüger D.H. (1993) Biology of DNA restriction. Microbiological Reviews, 57, 434-450.
14. Biclcle T.A. (1982) The ATP depended restriction endonucleases. In: Linn S.M. and Roberts R.J. (Eds.) Nucleases. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, 85-108.
15. Biclcle T.A. (1993) Restriction endonuclcases. In: Linn S.M., Lloyd R.S. and Roberts R.J. (Eds) Nucleases. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York, 89-109.
16. Bist P., Rao D.N. (2003) Identification and mutational analysis of Mg2+ binding site in EcoPl 51 DNA methyltransferase. .1 Biol Chem , 278, 41837-41848.
17. Bist P., Sistla S.; Krishnanuirth)' V., Acharya A., Chandrakala B., Rao D.N. (2001) Sr aclenosyl-Lmethionine is required for DNA cleavage by type III restriction enzymes. J. Mol. Biol., 310, 93-109.
18. Bourniquel A.A., Bickle T.A. (2002) Complex restriction enzymes: NTP-driven molecular motors. Biochimic, 84, ! 047-1059.
19. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.
20. Bujnicki J.N4. (2002) Sequence permutations in the molecular evolution of DNA mclhyltransferascs. BMC Evol Biol. 2, 3.
21. Bujnicki J.M , Radlinska M. (1999) Molecular evolution of DNA-(cytosine-N4) mcthyltransferascs: evidence for their polyphyletic origin. Nucleic Acids Res., 27, 4501.
22. Bujnicki J.M. (2001) Understanding the evolution of restriction-modification systems: Clues from sequence and structure comparisons. Acta Biochim Pol., 4, 935-967.
23. Bujnicki J.M., Rychlcwski L. (2001) Grouping together highly diverged PD-(D/E)XK nucleases and identification of novel superfamily members using structure-guided alignment of sequence profiles./ Mol Microbiol Biotechnol., 3, 69-72.
24. Bujnicki J.M. Radlinska M , Rychlewski L. (2001) Polyphyletic evolution of type II restriction enzymes revisited: two independent sources of second-hand folds revealed. Trends Biochem Sei., 26. 9-11.
25. Cal S., Connolly B.A. (1996) The EcoRV modification methylase causes considerable bending of DNA upon binding to its recognition sequence GATATC. J. Biol. Chem., 271, 1008-1015.
26. Cerritelli S., Springhorn S.S., Lacks S.A. (1989) DpnA, a methylase for single-strand DNA in the Dpn li restriction system, and its biological function. Proc. Natl Acad. Sci.1. US.A., 86, 9223-0227.
27. Cesnaviciene E., Petrusiyte M., Kazlauskiene R., Maneliene Z., Timinskas A., Lubys A., Janulaitis A. (2001) Characterization of Alol, a Restriction-modification System of a New Type. J Mo! Biol, 314, 205-2 ! 6.
28. Cesnaviciene. E. Petrusyte M. ICazlauskiene R. et al. (2001) Characterization of Alol, a restriction-modification system of a new type./ Mol. Biol., 314, 205-216.
29. Cheng X. (1995) Structure and ¡'unction of DNA methyltransferases. Annu. Rev. Biophys. Biomol Sfruci. 24, 293-318.
30. Cheng X., Kumar S.; Posfai .L Pdugrath J.W., Roberts R.J. (1993) Crystal structure of the I-Ihal DNA mcthyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionine. Cell, 74, 299.
31. Cheng X., Roberts R.J. (2001) AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping. Nucleic Acids Res . 29, 3784-3795.
32. Crampton N 5 Rocs S. Dryclcn D.T. Rao D.N., Edwardson J.M., Henderson R.M. (2007 a) DNA looping and translocation provide an optimal cleavage mechanism for the type 111 restriction enzymes. EMBO.J. 26, 3815-3825.
33. Daniel A.S. Fuller-Pace F:.V.; Lcgge D.M., Murray N.E. (1988) Distribution and diversity of hsd genes in Escherichia coli and other enteric bacteria. J. Bacteriol., 170, 1775-1782.
34. Dcnjmukhametov M.; Bre\nov M. Zakharova M., Repyk A., Solonin A., Petrauskene O. Gromova E. (I99S) The EcllSkl restriction-modification system: cloning, expression, properties of the purified enz\ mcb FEBS Lett., 433, 233-236.
35. DreierMacWilliams P., Dickie T.A. (1996) DNA cleavage by the type IC restriction-modification enzyme EcoR 12411./ Mol Biol, 264, 722-733.
36. Dryden D.T. (1999) S-Adenosylmethionine-dependent Methyltransferases: Structures and Functions. In: Cheng X., Blumenthal R.M. (Eds) World Scientific Publishing. Singapore. 283.
37. Dryden D.T., EcUvardson J., Henderson R. (2011) DNA translocation by type III restriction enzymes: a comparison of currcnt models of their operation derived from ensemble and single-moleculc measurements. Nucleic Acids Res., 39, 4525-4531.
38. Dryden D.T., Murray N.E., Rao D.N. (2001) Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes. Nucleic Acids Res., 29, 3728-3741.
39. Dryden D.T. Cooper L.P. Thorpe P.H., Byron 0. (1997) The in vitro assembly of the EcoIvl type I DNA restriction/modification enzyme and its in vivo implications. Biochemistry, 36, 1065-1076.
40. Dubey A.K. Bhattacharya S.K. (1997) Angle and locus of the bend induced by the msp I DNA methyltranslcra.se in a scquence-spccific complex with DNA. Nucleic Acids Res., 25, 2025-2029.
41. Ellis D.J. Dryden D.T., Bergc T., Edwardson J.M., Henderson R. (1999) Directobservation of DNA translocation and cleavage by the EcoKl endonuclease using atomic force microscopy, h'cit. Struct Biol., 6, 15-7.
42. Estabrook R.A. Reich N.O. (2006) Observing an induced-fit mechanism during sequence-specific DNA methylation. J. Biol. Chau, 281,37205-37214.
43. Faumann E.B. Blumenthal R.M., Cheng X. (1999) S-adenosylmethioninedependent methyltransferases: structures and functions, in: Cheng X., Blumenthal R.M. (Eds). World Scientific Publishing. Singapore. 1.
44. Fiandt M., Hraedecna Z., Lozeron H., Szybalski W. (1971) The Bacteriophage Lambda. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. 366.
45. Fricdrich T.; Roth M., Hclm-Kruse S. Jeltsch A. (1998) Functional mapping of the FcoRV DNA methyitransferase by random mutagenesis and screening for catalytically inactive mutants. Biol Chem, 379, 475-480.
46. Fukuda E.; Kaminska K H.; Bujnicki J.M., Kobayashi I. (2008) Cell death upon epigenetic genome methylation: a novel function of methyl-specific deoxyribonucleases. Genome Biol. 9. 163
47. Fuller-Pace F.V., Bullas L.R., Delias H., Murray N.E. (1984) Genetic recombination can generate altered restriction specificity. Proc. Nail. Acad. Sei. U.S.A., 81, 6095-6099.
48. Furmanek B., Sektas M., Wons E.; Kaczorowski Ï. (2007) Molecular characterization of the DNA methyltransfcrase Ml.Ncul from Neisseria cuniculi ATCC 14688. Research in Microbiology, 158, 164-174.
49. Furmanek-Blaszk B., Boratvnski R., Zolcinska N., Sektas M. (2009) Ml.Mboll and M2.Mboll type IIS mcthyllransferases:differcnt specificities, the same target. Microbiology, 155, 1111-1121.
50. Garcia R.A., Buslamanle C.J., Reich N.O. (1996) Sequence-specific recognition of cylosine C5 and adenine N6 DNA methyltransferases requires different deformations of DNA. Proc. Nail. Acad. Sei U.SA , 93, 7618-7622.
51. Gast F.U., Brinkmann T. Pieper U., Kruger T. Noyer-Weidner M., Pingoud A. (1997) The recognition of methylated DNA by the GTP-dependent restriction endonuclease McrBC resides in the N-tcrminal domain ofMcrB. Biol. Chem., 378, 975-982.
52. Gerasimaite R., Merkiene E., Klimasauskas S. (2011) Direct observation of cytosine Hipping and eovalent catalysis in a DNA methyltransferase. Nucleic Acids Res., 39, 3771-3780.
53. Gerasimaite R., Merkiené E.: Klimasauskas S. (2011) Direct observation of cytosine Hipping and eovalent catalysis in a DNA methyltransferase. Nucleic Acids Res., 39,3771-3780.
54. Cioedecke K., Pignot M., Goody R.S., Scheidig A.J., Weinhold E. (2001) Structure of the N6-adeninc DNA methyltransferase M.Taql in complex with DNA and a cofactor analog. No! Siruci Biol, 8, 121-125.
55. Gong W., O'Gara M., Blumenthal R.M., Cheng X. (1997) Structure of PvuII DNA-(cytosinc N4)-methyltranslerase, an example of domain permutation and protein fold assignment. Nucleic Acids Res., 25, 2702-2715.
56. Gorbalenya A.E., Koonin E.V. (1991) Endonuclease (R) subunits of type-I and type-Ill restriction-modification enzymes contain a helicase-like domain. FEBS Lett., 291, 277281.
57. Gowher H., Jeltsch A. (2000) Molecular enzymology of the EcoRV DNA-(adenine-N6) methyltransferase: kinetics of DNA binding and bending, kinetic mechanism and linear diffusion of the enzyme on DNA. J Mol Bio!., 303, 93-110.
58. Gubler M., Braguglia D.; Meyer J., Piekarowicz A., Bickle T.A. (1992) Recombination of constant and variable modules alters DNA sequence recognition by type IC restriction-modification enzymes. EMBO J ,1 1. 233-240.
59. Guyot J.B., Grassi J., I-lahn U., Guschlbauer W. (1993) The role of the preserved sequences of Dam methylasc. Nucleic Acids Res., 21, 3183-3190.
60. Hadi S.M., Bachi B., lida S., Bickle T.A. (1983) DNA restriction-modification enzymes of phage PI and plasmid pl5B. Subunit functions and structural homologies. J. Mol. Biol., 165, 19-34.
61. Ho D K., Wu J.C., Santi D.V., Floss, H.G. (1991) Stereochemical studies of the C-mcthy lation of deoxycytidine catalyzed by H ha I methylase and the N-methylation of dcoxyadenosine catalyzed by EcoRI mclhylase. Arch. Biochem. Biophys. 284, 264-269.
62. Janscak P., Bickle T.A. (1998) The DNA récognition subunit of the type IB restriction-modi fication enzyme Eco M tolerates circulai permutions of its polypeptide chain. J. Mol Biol. 284, 937-948.
63. Janscak P., Dryden D.T., Firman !v. (1998) Analysis of the subunit assembly of the typcIC restriction-modification enzyme /rcoR124l. Nucleic Acids Res., 26, 4439-4445.
64. Jellsch A. (2001) The cvtosine N4-methyltransierase M.PvuII also modifies adenine residues. Biol. Chem., 382, 707-710.
65. JelEsch A., Christ F., Fatemi M., Roth M. (1999) On the substrate specificity of DNA methyltransferases. adenine-N6 DNA methyltransferases also modify cytosine residues at position N4. J. Biol. Chem., 274, 19538-19544.
66. Jcltsch A. Friedrich T., Roth M. (1998) Kinetics of methylation and binding of DNA by the EcoRV adenine-N6 methyltranslerasc. J. Mol Biol., 275, 747-758.
67. Kaczorowski T., Sektas M., Skowron P, Podhajska A.J. (1999) The Fokl methyltransfera.se from Flavobaclerium okcanokoi/es: purification and characterization of the enzyme and its truncated derivatives. Applied Biochem Biotech., 13, 1-15.
68. Kannan 1', Cowan G.M., Daniel A.S. Gann A.A. Murray N.E. (1989) Conservation of organization in the specificity polypeptides of two families of type I restriction enzymes. ,/. Mol Biol., 209, 335-344.
69. Kelleher .I.E., Raleigh E.A. (1991) A novel activity in Escherichia coli K-12 that directs restriction of DNA modified a! CG dinucleotides. J. Bacieriol., 173, 5220-23.
70. Kesslcr C.; Manta V. (1990) Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases a review (Edition 3). Gene, 92, 221-248.
71. Kim Y.5 Grable J.C., Love R.; Green P.I., Rosenberg J.M. (1990) Refinement of EcoRI cndonuclcase crystal structure: A rc\ iseel protein chain tracing. Science, 249, 1307-1309.
72. Kiss A. Posfai G., Zsurka G., Rasko T.; Venelianer P. (2001) Role of DNA minor groove interactions in substrate recognition by the M.Sinl and M.EcoRII DNA-(cytosine-5)-mcihyltransfcrases. Nucleic . Icids Res., 29. 3 1 88-3194.
73. Klimasauskas S., Kumar S., Roberts R.J., Cheng X. (1994) Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix. Cell, 76, 357-369.
74. Klimasauskas S., Roberts R.J. (1995) M.Hhal binds tightly to substrates containing mismatches at the target base. Nucleic Acids Res., 23, 1388-1395.
75. Kobayashi I., Nobusato A., Kobayashi-Takahashi N., Uchiyama I. (1999) Shaping the genome-restriction-modification systems as mobile genetic elements. Curr. Opin. Genet. Dev., 9, 649-656.
76. Kong H., Morgan R.D., Maunus R.E, Schildkraut I. (1993) A unique restriction endonuclease, Bcgl, from Bacillus coagulans. Nucleic Acids Res., 21, 987-991.
77. Kong H., Smith C.L. (1997) Substrate DNA and cofactor regulate the activities of a multi-functional restriction-modification enzyme, Bcgl. Nucleic Acids Res., 25, 36873692.
78. Krissinel E., Henrick K. (2007). Inference of macromolecular assemblies from crystalline state. J. Mol. Biol., 372, 774-797.
79. Kruger D.H., Kupper D., Meisel A., Reuter M., Schroeder C. (1995) The significance of distance and orientation of restriction endonuclease recognition sites in viral DNA genomes. FEMS Microbiol. Rev. 17, 177-184.
80. Kumar S., Cheng X., Pflugrath J.W., Roberts R.J. (1992) Purification, crystallization, and preliminary X-ray diffraction analysis of an M.Hhal-AdoMet complex. Biochemistry, 31, 8648-8653.
81. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Mi S., Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. (1994) The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res., 22, 1-10.
82. Laemmli U. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.
83. Lau E.Y., Bruice T.C. (1999) Active site dynamics of the Hhal methyltransferase: insights from computer simulation. J. Mol. Biol., 293, 9-18.
84. Liebert K., Hermann A., Schlickenrieder M., Jeltsch A. (2004) Stopped-flow and mutational analysis of base flipping by the Escherichia coli Dam DNA-(adenine-N6)-methyltransferase. J. Mol. Biol., 341, 443-454
85. Lindstrom W.M.Jr., Malygin E.G., Ovechkina L.G., Zinoviev V.V., Reich N.O. (2003) Functional analysis of BamHI DNA cytosine-N4 methyltransferase. J. Mol. Biol., 325, 711-720.
86. Lindstrom W.M.Jr., Flynn J., Reich N.O. (2000) Reconciling structure and function in Hhal DNA cytosine-C-5 methyltransferase. J.of Biol. Chem., 275, 4912-4919.
87. Looney M.C., Moran L.S., Jack W.E., Feehery G.R., Benner J.S., Slatko B.E., Wilson G.G. (1989) Nucleotide sequence of the Fokl restriction-modification system: separate strand specificity domains in the methyltransferase. Gene, 80, 193-208.
88. Mak A.N, Lambert A.R., Stoddard B.L. (2010) Folding, DNA recognition, and function of GIY-YIG endonucleases: crystal structures of R.Eco29kI. Structure., 18, 1321-1331.
89. Malone T., Blumenthal R.M., Cheng X. (1995) Structure-guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyltransferases, and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. J. Mol. Biol. 253, 618-632.
90. Mandel M., Higa A. (1970) Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol., 53, 159-162.
91. Marks P., McGeehan J., Wilson G., Errington N., Kneale G. (2003) Purification and characterisation of a novel DNA methyltransferase, M.AhdI. Nucleic Acids Res., 31, 2803-2810.
92. Meisel A., Mackeldanz P., Bickle T.A., Kruger D.H., Schroeder C. (1995) Type III restriction endonucleases translocate DNA in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis, EMBOJ., 14, 2958-2966.
93. Meselson M., Yuan R., Heywood J. (1972) Restriction and modification of DNA. Annu. Rev. Biochem., 41, 447-466.
94. Mihic S., Harris R. (1996) Single-step purification solubilization of recombinant proteins: application to surfactant protein B. BioTechniques, 20, 804-808.
95. Moncke-Buchner E., Reich S., Mucke M., Reuter M., Messer W., Wanker E.E., Kruger D.H. (2002) Counting CAG repeats in the Huntington's disease gene by restriction endonuclease EcoP15I cleavage. Nucleic Acids Res., 30, 83.
96. Mucke M., Reich S., Moncke-Buchner E., Reuter M., Kruger D.H. (2001) DNA cleavage by type III restriction-modification enzyme EcoP15I is independent of spacer distance between two head to head oriented recognition sites. J. Mol. Biol., 312, 687-698.
97. Mulligan E.A., Dunn J.J. (2008) Cloning, purification and initial characterization of E.coli McrA, a putative 5-methylcytosine-specific nuclease. Protein Expr. Purif., 62, 98103.
98. Mulligan E.A., Hatchwell E., McCorkle S.R., Dunn, J.J. (2010) Differential binding of Escherichia coli McrA protein to DNA sequences that contain the dinucleotide m5CpG. Nucleic Acids Res., 38, 1997-2005.
99. Murray N.E. (2000) Type I restriction systems: sophisticated molecular machines. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64, 412-434.
100. Nagornykh M., Zakharova M., Protsenko A., Bogdanova E., Solonin A.S., Severinov K. (2011) Regulation of gene expression in restriction-modification system Eco29kI. Nucleic Acids Res., 39, 4653-63.
101. Newman M., Lunnen K., Wilson G., Greci J., Schildkraut I., Phillips S.E. (1998) Crystal structure of restriction endonuclease Bgll bound to its interrupted DNA recognition sequence. EMBOJ., 17, 5466-5476.
102. Newman M., Strzelecka T., Dorner L.F., Schildkraut I., Aggarwal A.K. Structure of BamHI endonuclease bound to DNA. (1995) Partial folding and unfolding on DNA binding. Science, 269, 656-663.
103. O'Gara M., Horton J.R., Roberts R.J., Cheng X. (1998) Structures of Hhal methyltransferase complexed with substrates containing mismatches at the target base. Nat. Struct. Biol., 5, 872-877.
104. O'Gara M., Klimasauskas S., Roberts R.J., Cheng X. (1996a) Enzymatic C5-cytosine methylation of DNA: mechanistic implication of new crystal structures for Hhal methyltransferase-DNA AdoHcy complexes. J. Mol. Biol., 261, 634-645.
105. O'Gara M., Roberts R.J., Cheng X. (19966) A structural basis for the preferential binding of hemimethylated DNA by Hhal DNA methyltransferase. J. Mol. Biol., 263, 597-606.
106. Olek A., Oswald J., Walter J. (1996) A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res., 15, 5064-5066.
107. Olek A., Oswald J., Walter J., (1996) A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res., 24, 5064-5066.
108. Pertzev A., Kravetz A., Mayorov S., Zakharova M., Solonin A. (1997) Isolation of a strain overproducing endonuclease Eco29kI. Biochemistry (Moscow), 62, 732-741.
109. Pertzev A., Ruban N., Zakharova M., Beletzkaja I., Petrov S., Kravetz A., Solonin A. (1992) Eco29kI, a novel plasmid encoded restriction endonuclease from Escherichia coli. Nucleic Acids Res., 20, 1991.
110. Pieper U., Pingoud A. (2002) A mutational analysis of the PD.D/EXK motif suggests that McrC harbors the catalytic center for DNA cleavage by the GTP-dependent restriction enzyme McrBC from Escherichia coli. Biochemistry, 41, 5236-5244.
111. Pieper U., Schweitzer T., Groll D.H., Gast F.U., Pingoud A. (1999) The GTP-binding domain of McrB: more than just a variation on a common theme? J. Mol. Biol., 292, 547556.
112. Pingoud A., Jeltsch A. (1997) Recognition and cleavage of DNA by type-II restriction endonucleases. Eur. J. Biochem., 246, 1-22.
113. Pingoud A., Jeltsch A. (2001) Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res., 29, 3705-3727.
114. Pogolotti A.L., Ono A., Subramaniam R., Santi D.V. (1988) On the mechanism of DNA-adenine methylase. J. Biol. Chem., 263, 7461-7464.
115. Raghavendra N.K., Rao D.N. (2005) Exogenous AdoMet and its analogue sinefungin differentially influence DNA cleavage by R.EcoP15I—usefulness in SAGE. Biochem. Biophys. Res. Commun., 334, 803-811.
116. Raghavendra N.K., Rao D.N. (2004) Unidirectional translocation from recognition site and a necessary interaction with DNA end for cleavage by Type III restriction enzyme, Nucleic Acids Res., 32, 5703-5711.
117. Raleigh E.A., Wilson G. (1986) Escherichia coli K-12 restricts DNA containing 5-methylcytosine. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 83, 9070-9074.
118. Ramanathan S.P., van Aelst K., Sears A., Peakman L.J., Diffin F.M., Szczelkun M.D., Seidel R. (2009) Type III restriction enzymes communicate in one-dimensional without looping between their target sites. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 106, 1748-1753.
119. Rao D.N., Page M.G., Bickle T.A. (1989) Cloning, over-expression and the catalytic properties of the EcoP15I modification methylase from Escherichia coli. J. Mol. Biol., 209, 599-606.
120. Rao D.N. Saha S. Krishnamurthy V. (2000) ATP-dependent restriction enzymes. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 64, 51-63.
121. Rasko T., Finta C., Kiss A. (2000) DNA bending induced by DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res., 28, 3083-3091.
122. Reddy Y.V., Rao D.N. (2000) Binding of EcoP15I DNA methyltransferase to DNA reveals a large structural distortion within the recognition sequence. J. Mol. Biol., 298, 597-610.
123. Reich N.O., Mashhoon N. (1991) Kinetic mechanism of the EcoRI DNA methyltransferase. Biochemistry, 30, 2933-2939.
124. Reich N.O., Olsen C., Osti F., Murphy J. (1992) In vitro specificity of EcoRI DNA methyltransferase. J. Biol. Chem., 267, 15802-15807.
125. Reich S., Gossl I., Reuter M., Rabe J.P., Kruger D.H. (2004) Scanning force microscopy of DNA translocation by the Type III restriction enzyme EcoP15I. J. Mol. Biol., 341, 337-343.
126. Reinisch K.M., Chen L., Verdine G.L., Lipscomb W.N. (1995) The crystal structure of Haelll methyltransferase convalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell, 82, 143-153.
127. Roberts D.V. (1977) Enzyme Kinetics, Cambridge Univ. Press, London.
128. Roberts R.J., Belfort M., Bestor, T., et al. (2003) A nomenclature for restriction enzymes, DNA methyltransferases, homing endonucleases and their genes. Nucleic Acids Res., 31, 1805-1812.
129. Roth M., Helm-Kruse S., Friedrich T., Jeltsch A. (1998) Functional role's of conserved amino acid residues in DNA methyltransferases investigated by site-directed mutagenesis of the EcoRV adenine-N6-methyltransferase. J. Biol. Chem., 273, 17333-17342.
130. Roth M., Jeltsch A. (2001) Changing the target base specificity of the EcoRV DNA methyltransferase by rational de novo protein-design. Nucleic Acids Res., 29, 3137-3144.
131. Rubin R., Modrich P. (1977) EcoRI methylase. Physical and catalytic properties of the homogeneous enzyme. J. Biol. Chem., 252, 7265-7272.
132. Saha S., Ahmad I., Reddy Y.V., Krishnamurthy V., Rao D.N. (1998) Functional analysis of conserved motifs in type III restriction-modification enzymes. Biol.I Chem., 379,511-517.
133. Sambrook J.D. (2001) Molecular cloning laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.
134. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467.
135. Scavetta R.D., Thomas C.B., Walsh M.A., Szegedi S., Joachimiak A., Gumport R.I., Churchill M.E. (2000) Structure of RsrI methyltransferase, a member of the N6-adenine beta class of DNA methyltransferases. Nucleic Acids Res., 28, 3950.
136. Schluckebier G., Kozak M., Bleimling N., Weinhold E., Saenger W. (1997) Differential binding of S-adenosylmethionine S-adenosylhomocysteine and Sinefungin to the adenine-specific DNA methyltransferase M.Taql. J. Mol. Biol., 265, 56-67.
137. Schluckebier G., Labahn J., Granzin J., Saenger W. (1998) M.TaqI: possible catalysis via cation-pi interactions in N-specific DNA methyltransferases. Biol. Chem., 379, 389400.
138. Schluckebier G., O'Gara M., Saenger W., Cheng X (1995) Universal catalytic domain structure of AdoMet-dependent methyltransferases. J. Mol. Biol., 247, 16-20.
139. Schumann J.J., Walter J., Willert J., Wild C., Koch D., Trautner T.A. (1996). MBssHII: a multispecific cytosine-C5-DNA-methyltransferase with unusual target recognizing properties. J. Mol. Biol., 257, 949-959.
140. Seidel R., Bloom J.G., Dekker C., Szczelkun M.D. (2008) Motor step size and ATP coupling efficiency of the dsDNA translocase EcoR124I. EMBO J., 27, 1388-1398.
141. Shibata T., Ikava S., Kim C., Ando T. (1976) Site specific deoxyribonucleases in Bacillus subtilis and other Bacillus strains. J. Bacteriol., 128, 473-476.
142. Sistla S., Krishnamurthy V., Rao D.N. (2004) Single-stranded DNA binding and methylation by EcoPlI DNA methyltransferase. Biochem. Bioph. Res. Commun., 314, 159-165.
143. Stankevicius K., Lubys A., Timinskas A., Vaitkevicius D., Janulaitis A. (1998) Cloning and analysis of the four genes coding for BpulOI restriction-modification enzymes. Nucleic Acids Res., 26, 1084-1091.
144. Stewart F.J., Panne D., Bickle T.A., Raleigh E.A. (2000) Methylspecific DNA binding by McrBC, a modification-dependent restriction enzyme. J. Mol. Biol., 298, 611-622.
145. Studier F.W., Bandyopadhyay P.K. (1988) Model for haw tapy I restriction enzymes select cleavage sites in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 4677-4681.
146. Sugisaki H., Yamamoto K., Takanami M. (1991) The Hgal restriction-modification system contains two cytosine methylase genes responsible for modification of different DNA strands. J. Biol. Chem., 266, 13952-13957.
147. Surby M.A., Reich N.O. (1996) Contribution of facilitated diffusion and processive catalysis to enzyme efficiency: implications for the EcoRI restriction-modification system. Biochemistry, 35, 2201-2208.
148. Szczelkun M.D., Dillingham M.S., Janscak P., Firman K., Halford S.E. (1996) Repercussions of DNA tracking by the type 1C restriction endonuclease £coR124I on linear, circular and catenated substrates. EMBO J., 15, 6335-6347.
149. Szczelkun M.D., Janscak P., Firman K., Halford S.E. (1997) Selection of non-specific DNA cleavage sites by the type IC restriction endonuclease EcoR124I. J. Mol. Biol., 271, 112-123.
150. Szilak L., Der A., Deak F.,Venetianer P. (1993) Kinetic characterization of the Ecal methyltransferase. Eur. J. Biochem., 218, 727-733.
151. Tamulaitis G., Sasnauskas G., Mucke M., Siksnys V. (2006) Simultaneous binding of three recognition sites is necessary for a concerted plasmid DNA cleavage by EcoRII restriction endonucleases. J. Mol. Biol., 358, 406-419.
152. Vilkaitis G., Dong A., Wienhold E., Cheng X., Klimasauskas S. (2000) Functional roles of the conserved threonine 250 in the target recognition domain of Hhal DNA methyltransferase. J. Biol. Chem, 275, 38722-38730.
153. Vilkaitis G., Merkiene E., Serva S., Weinhold E., Klimasauskas S. (2001) The mechanism of DNA cytosine-5 methylation. Kinetic and mutational dissection of Hhai methyltransferase. J. Biol. Chem., 276, 20924-20934.
154. Waite-Rees P.A., Keating C.J., Moran L.S., Slatko B.E., Hornstra L.J., Benner J.S. (1991) Characterization and expression of the Escherichia coli Mrr restriction system. J. Bacteriol., 173, 5207-5219.
155. Watanabe M., Yuzawa H., Handa N., Kobayashi I. (2006) Hyperthermophilic DNA methyltransferase M.PabI from the archaeon Pyrococcus abyssi. Appl. Env. Microbiol., 72, 5367-5375.
156. Werner M., Clore G., Gronenborn A., Kondoh A., Fisher R. (1994) Refolding proteins by gel filtration chromatography. FEBS Lett., 345, 125-130.
157. Willcock D.F., Dryden D.T., Murray N.E. (1994) A mutational analysis of the two motifs common to adenine methyltransferases. EMBOJ., 13, 3902-3908.
158. Wilson G.G. (1992) Amino acid sequence arrangements of DNA-methyltransferases. Methods Enzymol., 216, 259-279.
159. Wilson G.G., Murray N.E. (1991) Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.
160. Wilson G.G. (1991) Organization of restriction-modification systems. Nucleic Acids Res, 19, 2539-2566.
161. Wong D.L., Reich N.O. (2000) Identification of tyrosine 204 as the photo-cross-linking site in the DNA-EcoRI DNA methyltransferase complex by electrospray ionization mass spectrometry. Biochemistry, 39, 15410-15417.
162. Wu J., Santi D. (1987) Kinetic and catalytic mechanism of Hhal methyltransferase, J. Biol. Chem., 262, 4778^1786.
163. Xia Y., Burbank D.E., Van Etten J.L. (1986) Restriction endonuclease activity induced by NC-1A virus infection of a Chlorella-like green alga. Nucleic Acids Res., 14, 6017-6030.
164. Xu D., Evans K.O., Nordlund T.M. (1994) Melting and premelting transitions of an oligomer measured by DNA base fluorescence and absorption. Biochemistry, 33, 95929599.
165. Yokochi T., Robertson K. (2002) Preferential methylation of unmethylated DNA by Mammalian de novo DNA methyltransferase Dnmt3a. J. Biol. Chem., 277, 11735-11745.
166. Youngblood B., Buller F., Reich N.O. (2006) Determinants of sequence-specific DNA methylation: target recognition and catalysis are coupled in M.Hhal. Biochemistry, 45, 15563-15572.
167. Zakharova M., Beletskaya I., Kravetz A., Pertzev A., Mayorov S., Shlyapnikov M., Solonin A. (1998) Cloning and sequence analysis of the plasmid-borne genes encoding the Eco29kI restriction and modification enzymes. Gene, 208, 177-182.
168. Zylicz-Stachula A., Bujnicki J.M., Skowron P.M. (2009) Cloning and analysis of a bifunctional methyltransferase/restriction endonuclease TspGWI, the prototype of a Thermus sp. Enzyme family. BMC Mol. Biol., 10, 52.
169. Wilson G.G. (1991) Organization of restriction-modification systems. Nucleic Acids Res, 19, 2539-2566.
170. Wong D.L., Reich N.O. (2000) Identification of tyrosine 204 as the photo-cross-linking site in the DNA-EcoRI DNA methyltransferase complex by electrospray ionization mass spectrometry. Biochemistry, 39, 15410-15417.
171. Wu J., Santi D. (1987) Kinetic and catalytic mechanism of Hhal methyltransferase, J. Biol. Chem., 262, 4778-4786.
172. Xia Y., Burbank D.E., Van Etten J.L. (1986) Restriction endonuclease activity induced by NC-1A virus infection of a Chlorella-like green alga. Nucleic Acids Res., 14, 6017-6030.
173. Xu D., Evans K.O., Nordlund T.M. (1994) Melting and premelting transitions of an oligomer measured by DNA base fluorescence and absorption. Biochemistry, 33, 95929599.
174. Yokochi T., Robertson K. (2002) Preferential methylation of unmethylated DNA by Mammalian de novo DNA methyltransferase Dnmt3a. J. Biol. Chem., 277, 11735-11745.
175. Youngblood B., Buller F., Reich N.O. (2006) Determinants of sequence-specific DNA methylation: target recognition and catalysis are coupled in M.Hhal. Biochemistry, 45, 15563-15572.
176. Zakharova M., Beletskaya I., Kravetz A., Pertzev A., Mayorov S., Shlyapnikov M., Solonin A. (1998) Cloning and sequence analysis of the plasmid-borne genes encoding the Eco29kI restriction and modification enzymes. Gene, 208, 177-182.
177. Zylicz-Stachula A., Bujnicki J.M., Skowron P.M. (2009) Cloning and analysis of a bifunctional methyltransferase/restriction endonuclease TspGWI, the prototype of a Thermus sp. Enzyme family. BMC Mol. Biol., 10, 52.
-
Мокрищева, Марина Леонидовна
-
кандидата биологических наук
-
Пущино, 2011
-
ВАК 03.01.03
- Регуляция экспрессии генов системы рестрикции-модификации типа II Eco29kl
- Антирестрикционная активность белков ArdA, ArsR, MerR
- Малая субъединица гетеродимерной эндонуклеазы рестрикции нового типа BspD61
- Бактериофаг Т4: молекулярное клонирование генов и суперпродукция ферментов метаболизма ДНК
- Исследование полиморфзма генов казеинов у крупного рогатого скота с помощью ПЦР маркеров
