Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антирестрикционная активность белков ArdA, ArsR, MerR

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Расторгуев, Сергей Михайлович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Системы рестрикции-модификации ДНК

Номенклатура и классификация R-M систем.

Основные характеристики R-M систем 1-го типа.

Семейства R-M систем 1-го типа.

Ферменты R-M 1-го типа: основные биохимические характеристики. а) Структура комплекса. б) Субъединида специфичности - HsdS. в) Субъединица модификации - HsdM. г) Субъединица рестрикции - HsdR. д) Функционирование R-M комплекса 1-го типа. 21 Биологическая роль R-M систем 1-го типа.

Антирестрикция. •

Феномен ослабления рестрикционной активности R-M систем 1-го типа: протеолитический контроль

Специфические системы антирестрикции а) Антирестрикционная активность бактериофагов. б) Антирестрикционная активность конъюгативных плазмид. 31 Белковая мимикрия ДНК ("protein mimicry of DNA") ars- и шег-опероны

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и бактериофаги.

Плазмиды.

Среды и буферы.

Выделение и очистка ДНК.

Измерение антирестрикционной и антимодификационной активностей.

Идентификация белка ArdA в клетках Е. coli.

УФ-облучение бактерий.

Измерение биолюминесценции

Определение нуклеотидной последовательности

Сайт-направленный мутагенез.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I Регуляторные белки ArsR и MerR ингибируют ферменты рестрикции-модификации 1-го типа. а) Ослабление рестрикции 1-го типа в Е. coli Kl 2 в присутствии плазмиды R64. б) Клонирование фрагментов ДНК R64, ответственных за ослабление ЕсоК-рестрикции. в) Определение нуклеотидной последовательности локуса R64, ответственного за ослабление £соК-рестрикции. г) Белки-регуляторы ArsR из R773 и pKW301 и белки MerR из pKLH2 и Тп5053 ослабляют рестрикционную активность систем R-M 1-го типа. д) Белки ArsR и MerR имеют общий «антирестрикционный мотив» с белками Ard.

II Влияние аминокислотных замещений в белке ArdA pKMIOl (incN) на его антирестрикционную и антимодификационную активности. а) Влияние мутационных замещений в «антирестрикционном мотиве» ArdA pKMIOl на его активность в качестве ингибитора системы рестрикции-модификации EcoKl. б) Влияние мутационных замен в предполагаемой области межсубъединичного интерфейса ArdA на его функциональную активность.

III Активность систем R-M 1-го типа ослабевает в клетках Е. coli К-12 при УФ-облучении и при действии /wx-регулона Vibriofischeri. а) Ослабление рестрикции 1-го типа при УФ-облучении бактериальных клеток, или эффект UV-RA. Входят ли гены ardA в состав SOS-регулона? б) Ослабление активности системы R-M 1-го типа ЕсоКА под действием lux-регулона Vibrio fischeri.

IV Практическое применение генов arsR для детекции ионов мышьяка. а) Конструирование гибридной плазмиды pSRlux 1. б) Конструирование гибридной плазмиды pSRlux2. с) Влияние арсенита на биолюминесценцию Е. coli (pSRluxl) и Е. coli (pSRlux2).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антирестрикционная активность белков ArdA, ArsR, MerR"

Системы рестрикции-модификации играют важную роль в жизни бактериальной клетки. В основе явления рестрикции-модификации лежит сопряженное действие рестрикционной эндонуклеазы и ДНК-метилтрансферазы. Ферменты рестрикции-модификации 1-, И- и Ш-го типов "узнают" специфическую последовательность в ДНК, и рестрикционная эндонуклеаза индуцирует в немодифицированной ДНК двойные разрывы. Для защиты собственной ДНК от рестрикционного расщепления используется специфическое метилирование "узнаваемых" последовательностей в ДНК, которое осуществляют ДНК - метилтрансферазы. Рестрикция эффективна против чужеродной ДНК независимо от способа ее проникновения в клетку: при инъекции из фаговой головки, при трансформации или при конъюгативном переносе. Таким образом, системы рестрикции-модификации клетки создают т.н. "рестрикционный барьер", препятствуя межвидовому "горизонтальному" переносу генетического материала. В природе "горизонтальный" перенос генов между бактериями осуществляется в основном с помощью конъюгативных плазмид и бактериофагов. Можно предположить, что в процессе эволюции как у плазмид, так и у бактериофагов возникли системы, способствующие преодолению "рестрикционных барьеров". У конъюгативных плазмид и ряда бактериофагов обнаружена способность преодолевать действие клеточных рестриктаз. Это явление получило название "антирестрикции". Исследование антирестрикционных механизмов у конъюгативных плазмид показало участие в этом процессе специального белка-антирестриктазы, продукта гена, названного агс!. Впервые гены агс! (агс!А и агсМ) были обнаружены в плазмидах N - и I - групп несовместимости (рКМ101, Со11ЬР9), а затем в плазмидах других групп. В настоящее время показано, что гены агс1 играют важную роль в "жизненном цикле" конъюгативных плазмид, обеспечивая успешное преодоление "рестрикционных барьеров" при переносе ДНК из одного вида бактерий в другие. Объектами настоящего исследования являются АгбЯ и МегЯ, белки-регуляторы транскрипции агд- и тег-оперонов, определяющих резистентность бактериальных клеток к ионам мышьяка и ртути, а также антирестрикционный белок (антирестриктаза) АгёА, ген которой расположен в конъюгативной плазмиде рКМ101 (тсИ). Впервые показано, что белки6АгэЯ и МегЯ обладают антирестрикционной активностью, т.е. способны ингибировать ферменты рестрикции-модификации 1-го типа.

Настоящая работа посвящена поиску новых генов в трансмиссивных плазмидах, а также в транспозонах, продукты которых обладают свойствами антирестриктаз, т.е. способны ингибировать рестрикционные эндонуклеазы 1-го типа. Кроме того, исследована роль «антирестрикционного мотива» в функциональной активности антирестрикционного белка АгёА, ген которого расположен в трансмиссивной плазмиде рКМ101, N -группа несовместимости.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫСистемы рестрикции-модификации ДНКСистемы рестрикции-модификации (системы R-M) играют важную роль в жизни бактериальной клетки [Arber W. 1971]. В основе явления рестрикции-модификации лежит сопряженное действие рестрикционной эндонуклеазы и ДНК-метилазы [Yuan R. 1981; Bickle Т. 1987]. Ферменты рестрикции-модификации I-, II- и Ш-го типов «узнают» специфические последовательности в ДНК [Bickle Т., Kruger D. 1993; Wilson G.,1988]. Рестрикционная эндонуклеаза индуцирует в немодифицированной ДНК двойные разрывы. Для защиты собственной ДНК от рестрикционного расщепления в клетке используется специфическое метилирование «узнаваемых» последовательностей в ДНК, которое осуществляют ДНК-метилтрансферазы, сопряженные с рестрикционными эндонуклеазами. Рестрикция эффективна против чужеродной ДНК независимо от способа ее проникновения в клетку: при инъекции из фаговой головки, при конъюгативном переносе или трансформации. Исследование явления рестрикции-модификации привело к открытию и широкому использованию рестрикционных эндонуклеаз 11-го типа, осуществляющих специфическое фрагментирование ДНК, что явилось одним из решающих факторов, определивших развитие исследований в области генной инженерии [Smith Н., Nathans D. 1973; Roberts R. 1987; Wilson G. 1988; Roberts R., Macelis D. 1997]. Показано, что системы рестрикции-модификации оказывают влияние на такие клеточные процессы как генетическая рекомбинация, транскрипция, транспозиция. Существуют также системы рестрикции, которые атакуют ДНК, только в том случае, если мишень модифицирована. К ним относятся системы МсгА, МсгВС, ведущие деградацию ДНК, содержащую модифицированные азотистые основания [Raleigh Е.А., Wilson G. 1986; Dila D., et al. 1990].

Впервые рестрикционные системы были обнаружены в бактериях на основании данных по эффективности посева на различных штаммах Е. coli Т-четных бактериофагов [Luria S., Human М. 1952; Luria S. 1953]. Однако, эта системарестрикции-модификации ДНК, связанная с модификацией цитозиновых остатков (5-гидроксиметилцитозин) и глюкозилированием модифицированных цитозинов по 5-ому положению, относится к особому (неклассическому) варианту модификации ДНК, определяемому генами Т четных фагов, а эндонуклеотическая деградация ДНК определяется клеточными ферментами, узнающими в ДНК модифицированные цитозины (например, система МсгВС (ранее RglB)) [Dila D., et al. 1990].

Классическая система R-M впервые была обнаружена в клетках Е. coli Бертани и Вейглом [Bertani G., Weigle J. 1953]. В данной работе авторы в качестве тест-фагов использовали умеренные бактериофаги А и Р2 и обнаружили зависимость эффективности посева этих фагов от штамма, на котором был получен урожай фага. Так были обнаружены системы R-M, характерные для штаммов Е. coli К12 и В (в настоящее время - это системы R-M 1-го типа EcoKl и ЕсоВ). Ключевую роль в этом анализе сыграл штамм Е. coli С, в хромосоме которого, как было выяснено позднее, делетированы гены рестрикции-модификации (hsd). Бактериофаг X, выращенный на Е. coli К12 (обозначен как А,.К), показывает равные эффективности посева на Е. coli К12 и на Е. coli С, поскольку защищен £соК-моди фикацией от рестрикции в штамме Е. coli Kl 2, а Е. coli С не имеет рестрикционной системы. Но на штамме Е. coli В фаг Х.К формирует бляшки с очень низкой эффективностью (примерно на четыре порядка ниже), поскольку Е. coli В имеет R-M систему (ЕсоВ) со специфичностью, отличной от специфичности R-M системы Е. coli К12 (ЕсоК).

В последующих работах, в основном В. Арбера (получившего за эти работы Нобелевскую премию), ферменты R-M 1-го типа были детально изучены [Arber W., Dussoix D. 1962; Arber W. 1965; Linn S., Arber W. 1968; Arber W. 1972; Murray N.E., et al. 1973]. Показано, что модификация ДНК связана с метилированием по 6-му положению адениловых остатков, расположенных в специфических сайтах. Рестрикция (т. е. ограничение эффективности посева фагов) определяется действием специфических рестрикционных эндонуклеаз, индуцирующих летальные двойные разрывы в немодифицированной ДНК. Было показано [Horiuchi К., Zinder N. 1972], что эти эндонуклеазы разрезают немодифицированную фаговую ДНК на значительном расстоянии (до нескольких тысяч п.н.) от немодифицированного сайта.

Номенклатура и классификация R-M систем.

Классические R-M системы обозначаются тремя буквами по названию организма, из которого они выделены. Первая буква - название семейства, вторая и третья буквы -названия вида, далее могут следовать буквы, относящиеся к конкретному штамму. Различные системы из одного организма обозначаются римскими цифрами. Например, обозначения Есо¥Л и ЕсоШ, первых классических системы R-M, открытых в Е. coli К-12 и Е. coli В соответственно (в ранних работах они обозначались как ЕсоК. и ЕсоВ).R-M системы классифицируют, исходя из их структуры, потребности кофакторов, природы «узнаваемого» и модифицируемого сайта, а также по относительному положению сайта разрезания ДНК. В настоящее время различают три классические R-М системы (I, II и III). Первыми, как уже указывалось выше, были открыты R-M системы 1-го типа. Но наиболее широко известны системы И-го типа, благодаря тому, что рестрикционные эндонуклеазы этого типа разрезают ДНК в сайте «узнавания» и модификации, что определило их широкое использование в генно-инженерных работах. Основные характеристики систем R-M 1-го, 11-го и Ш-го типов приведены в таблице 1.

Прежде всего необходимо четко различать АТФ-зависимые системы R-M (1-го и Ш-го типов), и АТФ-независимую систему R-M 11-го типа. Кроме того, принципиальным отличием системы 1-го типа от системы Ш-го типа является абсолютная зависимость активности рестрикционной эндонуклеазы 1-го типа от S-Аденозил метионина (AdoMet, или SAM), в то время как в случае систем 11-го и Ш-го типа AdoMet служит лишь донором метильной группы для метилтрансферазы. Наименее прихотливы рестрикционным эндонуклеазам 11-го типа, которым требуются для активности лишь ионы магния.

Таблица 1. Характеристики систем рестрикции-модификации (R-M) трех типовТипы I II IIIКофакторы рестрикции АТФ, Ас1оМе1 Mg++, АТФКофакторы метилирования Ас1оМеЪ (АТФ, М^++) А(1оМе1 AdoMet (АТФ, Mg++)Структура ферментов Гетеромультимерные белки Три различные субъединицы (8,М,11) Гомомультимерные белки (метилазы и эндонуклеазы) Гетеромультимерны е белки, две различные субъединицы (Mod и Res)Совмещение активностей рестрикции и модификации Совмещены, фермент полифункционален Разделены, имеются отдельные ферменты метилаза и эндонуклеаза Совмещены, фермент полифункционаленУзнаваемая нуклеотидная последовательность Прерывистая (с дефисом), не имеет вращательной симметрии 2-го порядка Имеет вращательную симметрию 2-го порядка Нуклеотидная последовательность не имеет вращательной симметрии 2-го порядкаСайт метилирования Узнаваемая последовательность Узнаваемая последовательность Узнаваемая последовательностьСайт расщепления Значительное (не менее 1000 н.п.) нефиксированное расстояние от узнаваемой последовательности Совпадает с сайтом узнавания и модификации Фиксированное (24-29 н) расстояние от узнаваемой последовательностиВзаимосвязь рестрикции и модификации Одновременное проявление исключено Реакции идут раздельно Реакции идут одновременноВосстановление фермента после реакции Отсутствует Имеет место Имеет местоОсновные характеристики R-M систем 1-го типа.

Ферменты R-M 1-го типа состоят из трех субъединиц (R, М, S), которые кодируются тремя тесно сцепленными генами hsdR, hsdM и hsdS. Аббревиатура hsd (host specificity of DNA) была выбрана тогда, когда не была известна истинная природа явления рестрикции, и R-M системы называли системами хозяйской (host-) специфичности. Гены hsdM. и hsdS транскрибируются с одного промотора, a hsdR. транскрибируется с собственного промотора. Две субъединицы, кодируемые генами hsdM и hsdS - HsdM и HsdS (обычно обозначаемые как М и S) - необходимы и достаточны для метилтрансферазной активности. Третья субъединица HsdR (R) нужна для эндонуклеазной активности. S (specificity) субъединица включает два сайт-узнающих домена (TRDs - target recognition domains), которые определяют специфичность к последовательности-мишени. М субъединица содержит сайт связывания AdoMet и активный центр для метилирования ДНК. R- субъединица содержит активный центр гидролиза АТФ и другие домены, участвующие в транслокации ДНК и эндонуклеазной активности.Eco3.[Ecol&do +АТФ4EcoK ^'VEcoK-AdoMet 2.!?AdoMetAdoMet*YДНК*1et)-flHK (изначальный комплекс) (рекогносцирующий комплекс)I(EcoK-AdoMet) -K:K (EcoK-AdoMet]-0:K5.

ДНК6.EcoK-AdoMet + K:K ДНК(EcoK-AdoMet)-0:0ДНКI ДНК ± I^^CAdoMet)Метилированиеилир ДНКЕсоК-0:0 ДНКАТФ АДФ+Ф1Рисунок 1. Последовательность стадий реакции фермента EcoKi с ДНК.

На рис. 1 изображена последовательность стадий реакции фермента ЕсоШ с ДНК. AdoMet, являясь кофактором для реакции метилирования и одновременно аллостерическим фактором, который, связываясь с М-субъединицей, индуцирует конформационный переход в активированную форму ЕсоШ* (первый и второй этапы на рис. 1) [Hadi S., et al. 1975]. В активированной форме фермент способен неспецифически связываться с ДНК, т.е. наличие узнаваемых последовательностей -sK-сайтов необязательно. В результате образуется так называемый «начальный» комплекс (третий этап). Если в составе ДНК имеются sK-сайты (для ЕсоШ -последовательность с дефисом из шести нуклеотидов. АА C(N)6GTGC.„ в котором метилируется второй адениловый остаток, обозначен звездочкой, а в комплиментарной нити метилируется соответственно адениловый остаток напротив тимина), то происходит переход фермента на sK-сайт (с sK-сайтом взаимодействие энергетически выгоднее) и образуется более стабильный комплекс, который получил название «узнающего» (recognition) комплекса (четвертый этап, рис. 1). Взаимодействие фермента с sK-сайтом осуществляется S-субъединицей и происходит вдоль узкойбороздки двойной спирали, причем с последовательность. ААС связывается один из доменов TRD, а с последовательностью GTGC =другой домен TRD. Четвертый этап происходит независимо от состояния sK-сайта, метилирован он по адениловым остаткам или нет. В свою очередь, sK-сайт действует в качестве аллостерического эффектора, т.е. структура фермента меняется в зависимости от состояния сайта. Расположение AdoMet на М-субъединице таково, что СНз-группа AdoMet находится в тесном контакте с положением группы NH2 (шестое положение) аденилового остатка в большой бороздке ДНК, и тем самым способна фиксировать наличие СНз-группы в ш6А. Для последующих этапов необходимо наличие АТФ. Сами этапы различаются в зависимости от состояния sK-сайта (аллостерический эффект). sK-сайты в ДНК могут находиться в одном из трех состояний: 1) обе нити ДНК метилированы - К:К, 2) метилирована лишь одна нить - 0:К, 3) обе нити немодифицированы - 0:0. В отсутствие АТФ данный комплекс равнопрочен в независимости от степени метилирования sK-сайта. В присутствии АТФ фермент распознает состояние sK-сайта и выбирает один из трех типов действия [Bickle Т., et al. 1978]. Если обе нити в sK-сайте метилированы, то М-субъединица не входит в большую бороздку ДНК из-за стерических препятствий, и происходит диссоциация комплекса (пятый этап, рис. 1). Если sK-сайт гетерологичный (0:К), то одна из двух М-субъединиц входит в большую борозду ДНК в области неметилированного константного домена сайта. Тогда в присутствии АТФ фермент производит метилирование аденилового остатка и сходит с ДНК (шестой этап, рис. 1). Отметим, что без АТФ метилирование имеет место, однако скорость реакции снижена примерно на два порядка, т.е. АТФ лишь стимулирует реакцию. Наиболее сложная ситуация возникает, если sK-сайт полностью неметилирован (0:0). Тогда обе субъединицы М входят в большую борозду ДНК в области немодифицированных константных доменов. В результате фермент из так называемой «открытой» формы ЕсоШ* переходит в «закрытую» компактную форму ЕсоК1+, в которой две R-субъединицы сближены и образуют прочный комплекс с ДНК (седьмой этап). В комплексе с EcoKf ДНК подвергается разрыву в нефиксированной точке, отстоящей на одну-две тысячи нуклеотидов от сайта узнавания, этому разрыву предшествует транслокация ДНК, требующая гидролиза АТФ (восьмой этап). При транслокации фермент, оставаясь связанным с сайтом «узнавания», формирует суперскрученную петлеобразную компактную структуру ДНК [Ellis D.J., et al. 1999]. В такой структуре происходит двунитевой разрыв ДНК (девятый этап). В момент разрыва ДНК происходит интенсивный гидролиз АТФ до АДФ и неорганического фосфата[Burchardt J., et al. 1981]. Разрыв ДНК происходит на значительном расстоянии от сайта узнавания (примерно 1000-2000 н.п.) [Eskin В., Linn S. 1981].

Семейства R-M систем 1-го типа.

Важную роль в изучении структуры R-M систем 1-го типа сыграло открытие семейств IA, IB, 1С, ID, в состав каждой из которых входят системы с очень близкими характеристиками [Barcus V.A., Murray N.E. 1995]. Важнейшей характеристикой принадлежности ферментов к одному и тому же семейству является то, что мутантные гены, кодирующие R-M системы одного семейства (например, EcoYÄ и EcoBÏ), могут комплиментировать друг друга. На основании этого было заключено, что субъединицы у EcoYÄ и ЕсоШ взаимозаменяемы, и что субъединица, кодирующаяся геном hsdS, определяет сайт-специфичность фермента [Boyer H.W., Roulland-Dussoix D. 1969; Glover S.W., Colson С. 1969; Huba'cek J., Glover S.W. 1970]. Ферменты £coKI и EcoBl -входят в состав семейства IA. Специфичность узнавания sK-сайтов в ДНК определяется особенностями структуры доменов TRD в S-субъединице, которые, естественно, различны у членов одного семейства, так как эти ферменты узнают различные sK-сайты в ДНК.

В результате скрининга ДНК бактерий с помощью гибридизации, а также серологического скрининга бактериальных экстрактов, было проведено разделение R-М систем на различные семейства [Murray N.E., et al. 1982]. Как и ожидалось, нуклеотидные последовательности генов hsd для EcoYÄ и ЕсоШ гибридизуются друг с другом, и антитела на EcoYÄ реагируют на ЕсоШ. Однако, для EcoYÄ и Eco Al hsd- гены систем EcoYÄ и Eco Al имеют большие различия в нуклеотидных последовательностях [Daniel A.S., et al. 1988; Kannan P., et al. 1989] и не имеет место общей реакции с антителами. Поэтому система Eco Al является представителем другого семейства - IB. Подобным образом были выявлены представители третьего - 1С [Price С., et al. 1987] и четвертого - ID семейств [Titheradge A., et al. 1996]. На данный момент все R-M системы 1-го типа, обнаруживаемые в бактериях Е. coli и родственных видах, отнесены к одному из этих четырех семейств (табл. 2).

Таблица 2. Семейства R-M систем 1-го типа, идентифицированных в бактериях Enterobacteriaceae.

Семейство Фермент sK-сайт ссылкаIA EcoKl AAC(N6)GTGC Kan et al. 1979ЕсоШ TGA(N8)TGCT Ravetch et al. 1978ЕсоШ TTA(N7)GTCY Nagaraja et al. 1985%LTIII GAG(N6)RTAYG Nagaraja et al. 1985%SPI AAC(N6)GTRC Nagaraja et al. 1985£coR5I НП* Barcus et al. 1995£c0R1OI НП Barcus et al. 1995ЕсоШЪ! НП Barcus et al. 1995IB EcoAl GAG(N7)GTCA Kroger, Hobom,1984 Suri et al. 1984ЕсоШ GAG(N7)ATGC Cowan et al. 1989CfrAl GCA(N8)GTGG Kannan et al. 1989StySKl CGAT(N7)GTTA Thorpe et al. 1997%STI НП Barcus et al. 1995£coR17I НП Barcus et al. 1995EcoR42l НП Barcus et al. 19951С EcoRU4l GAA(N6)RTCG Price et al. 1989EcoDXXl TCA(N7)RTTC Gubler et al. 1992Ecoprrl CCA(N7)RTGC Tyndall et al. 1994ID %SBLI CGA(N6)TACC Titheradge et al. 1996EcoR9l НП Barcus et al. 1995KpnAl НП Lee et al. 1997*) НП - не представлен.

Ферменты R-M 1-го типа: основные биохимические характеристики.а) Структура комплекса.

В настоящее время полностью охарактеризованы R-M ферменты 1-го типа трех семейств (IA, IB и 1С). Каждый представитель этих семейств является крупным олигомерным комплексом с молекулярной массой от 400 кДа до 500 кДа, который в присутствии Mg++, АТФ и AdoMet функционируют как эндонуклеазы на ДНК субстрате, включающем неметилированные sK-сайты, а на полуметилированных sK-сайтах катализирует перенос метальной группы с AdoMet на ДНК [Vovis G.F., et al. 1974]. Фермент Есо¥А состоит из субъединиц с молекулярными массами - 135, 62 и 52 кДа. Было определено соотношение субъединиц в комплексе. Как оказалось, комплекс имеет структуру R2M2S1 [Sain В., Murray N.E. 1980].

В экстрактах Е. coli В наряду с комплексами с рестрикционной и модификационной активностями были изолированы комплексы лишь с модификационной активностью [Eskin В., Linn S. 1972; Lautenberger J.A., Linn S. 1972].

Впоследствии было показано, что все ферменты II-М 1-го типа могут быть изолированы в виде комплекса с модификационной (но не эндонуклеазной) активностью. Стехиометрический состав субъединиц этого комплекса соответствует структуре М/^.б) Субъединица специфичности - Ш(18.

Вариабельные последовательности. В генах ИбсШ имеются два протяженных региона негомологичных последовательностей (450-500 н. п.), названных «вариабельными регионами», остальные, консервативные участки генов, имеют незначительные различия.

Рисунок 2. Субъединица специфичности (ШёБ) фермента ЕсоК1241 (семейство 1С).a) на схеме отмечены два вариабельных участка (ТШ)) и консервативные участки ля всех представителей семейства 1С. Повторяющиеся последовательности в консервативных участках (под стрелками) обозначены каждая своей штриховкой, цифры под схемой - номера аминокислотных остатков.b) модель [Кпеа1е С.С. 1994], в которой повторяющиеся последовательности формируют соединения между сайт-узнающими доменами (ТМЗз) во вращательно симметричной конфигурации. Показаны нуклеотидные последовательности, которые узнаются каждым ТМ).c) модель метилтрансферазы.

Поскольку эК-сайт в ДНК содержит два консервативных блока из 3-4 н.п. и из 5-6 н.п., разделенных неспецифическим спейсером из 6-8 п.н., то было предположено, чтокаждый вариабельный регион в гене hsdS отвечает в структуре S-субъединицы за домен размером около 150-180 аминокислотных остатков, «узнающий» один из консервативных блоков sK-сайта [Gough J.A., Murray N.E. 1983]. Впоследствии подобная структура /гясй-генов (и соответственно, S-субъединиц) была продемонстрирована для систем рестрикции-модификации 1-го типа семейств IB [Kannan P., et al. 1989], 1С [Gubler, et al. 1992] и ID [Murray N.E. 2000]. Расположение вариабельных и консервативных участков представлено на рисунке 2, для S-субъединицы 1С-семейства.

Особенно показательно была продемонстрирована роль TRD доменов в узнавании sK-сайтов при конструировании и изучении свойств гибридного Ast/S-гена. Формирующийся химерный HsdS белок IA семейства узнавал sK-сайт, состоящий из разных блоков двух сайтов [Fuller-Pace F.V., et al. 1984; Nagaraja V., et al. 1985]. Такой же результат был получен и с гибридными сайтами семейств IB [Thorpe Р.Н., et al. 1997] и 1С [Gubler M., D., et al. 1992]. Было также показано, что аминокислотные замены в центральной консервативной части HsdS не приводят к изменению сайт специфичности и что если два TRD из разных семейств узнают один и тот же sK-сайт, то они имеют значительную гомологию, несмотря на отсутствие гомологии между последовательностями других субъединиц - HsdM и HsdR [Cowan G.M., et al. 1989].

Консервативные последовательности. Предполагают две роли для консервативных участков HsdS полипептида: 1) поддержание относительного положения двух TRD и 2) специфическое связывание HsdS с другими компонентами комплекса (R, М). Консервативная последовательность между двумя доменами TRD определяет пространственное расположение двух TRD в sK-сайте,- это было доказано при помощи мутантной £coR124I с новой специфичностью. Оказалось, что нуклеотидная последовательность hsdS гена мутантной £coR124II возникла в результате неравного кроссинговера между 12-нуклеотидным повтором в центре консервативной последовательности hsdS- гена и ошибки неспаривания при репликации ДНК, что привело к формированию тройного повтора фрагмента и несколько раздвинуло в белке HsdS домены TRD. В результате оказалось, что два блока sK-сайта у мутантного £coR124II разделены спейсером в 7 н. п., а не 6 п.н., как у дикого £coR124I [Gubler M., Bickle T.A. 1991; Price C., et al. 1989].

Субъединица HsdS имеет симметричную конфигурацию. В дополнении к регионам консервативным для HsdS субъединиц одного семейства, есть подобные регионы в каждой HsdS субъединице (рис. 2). У EcoKl (IA тип) это было замечено длярегионов в центральной и С-концевой консервативной последовательности. В 1В-семействе, кроме регионов, сходных с таковыми в ЕсоК1, имеется аминокислотный участок, общий для 1Ч-концевой и для центральной консервативной аминокислотной последовательности [Каппап Р., а1. 1989]. Оценка степени гомологии а.к.-последовательностей в НзёБ-субъединицах 1С-типа показывает, что последовательность в центральном консервативном регионе не полностью повторяет С-конец, и содержит остаток повтора расположенный на И-конце (рис. 2а). Этот факт позволил предложить модель, согласно которой N и С концы НзёБ-субъединицы расположены в тесной близости [Кпеа1е О.О. 1994], так что их ассоциация формирует линкерный домен, похожий на тот, который образуется центральной консервативной последовательностью (рис. 2Ь). Эти два домена с гомологичной последовательностью могут определять симметричное присоединение к Нзс18 двух Нзс1М-субъединиц (рис.2с).

Рисунок 3. Гипотетическая схема сборки двух усеченных субъединиц фермента EcoDXXl, вследствие чего происходит «узнавание» симметричного sK-сайта.

Симметричная конфигурация доменов в HsdS подтверждается тем, что усеченные формы HsdS субъединицы EcoDXXl или EcoR 1241, у которых удалена половина полипептида с С-конца, но оставлена центральная консервативная последовательность, образуют активный комплекс с HsdM, который узнает двойной SK-сайт, представляющий собой палиндромную версию тринуклеотида, определенного N-концевым TRJD [Abadjieva А., et al. 1993; Meister J., et al. 1993]. To есть, EcoDXXl узнает TCA(N7)RTTC, а его производная с усеченным HsdS полипептидом узнает TCA(N8)TGA (рис. 3).

Ожидалось, что роль консервативных последовательностей HsdS субъединицы -взаимодействие с другими субъединицами [Gough J.A., Murray N.E. 1983]. Убедительные доказательства этого предположения были получены на усеченных производных HsdS субъединиц EcoDXXl (рис. 3) и £coR.124I. Два усеченных полипептида могут заменить одну нормальную HsdS субъединицу, если они сохраняютспособность взаимодействовать с HsdM. Активный комплекс, то-есть такой, в котором HsdS сохраняет способность связываться с HsdM, обладает новой специфичностью [Abadjieva A., et al. 1993; Mac Williams M.P., Bickle T. A. 1996; Meister J., et al. 1993]. Анализ усеченных полипептидов выявил три консервативных региона HsdS субъединицы, участвующих в связывании с HsdM [MacWilliams М.Р., Bickle T.A. 1996]. Как и предсказывалось, делеции в центральной консервативной области HsdS субъединицы приводят к невозможности связывания с HsdM [Abadjieva A., et al. 1993].HsdS субъединица не обладает явным ДНК-связывающим мотивом в TRDs. Однако были получены косвенные доказательства, что некоторые аминокислоты в TRD взаимодействуют с ДНК - на основании двух подходов: на моделировании системы белок-ДНК [Sturrock S.S., Dryden D.T.F. 1997], и на случайном замещении аминокислот в TRD [O'Neill M., et al. 1998].в) Субъединица модификации - HsdM.

Как и HsdS, HsdM необходима как для рестрикции, так и для модификации. AdoMet, донор метильной группы,- необходим и для модификации, и для рестрикции [Meselson M., Yuan R. 1968]. Показано, что AdoMet связывается с HsdM субъединицей EcoKl [Buhler R., Yuan R. 1978]. Аминокислотная последовательность HsdM включает версию мотива, N/DPPF/Y/W (т.н. мотив IV), который является отличительной чертой N-6 аденин- и С-4 цитозин-метилтрансфераз [Cheng X. 1995; Dryden D.T.F. 1999; Noyer-Weidner M., Trautner T.A. 1993]. HsdM довольно консервативны (примерно 90%) внутри семейства, но сравнение между разными семействами [Sharp P., et al. 1992; Tyndall С., et al. 1994] показывает только 25-30% гомологии [Sharp P.M., et al. 1992]. Сайт-направленный мутагенез hsdM-геяа Е. coli К-12 показывает важность двух консервативных а.к.- последовательностей в белке HsdM для метилазной активности [Wilkins В.М., et al. 1996], эти последовательности - мотив I и уже отмеченный выше мотив IV. Изменения в мотиве I (D/E/SXFXGXG) приводят к потере ферментом способности связывать AdoMet, а изменения в мотиве IV (N/DPPF/Y/W) ингибируют каталитическую активность, не нарушая связывания с кофактором. Комплекс субъединиц S и М, но без R, в составе M2S был получен для представителей IA, IB и 1С семейств [Suri В., Bickle T.A. 1985; Taylor I., et al. 1992]. Эффективность связывания M.EcoYA и М.ЕсоКММ (комплекс M2S) со специфическим sK-сайтом значительно выше по сравнению с таковым с неспецифическими последовательностями ДНК [Powell L.M., et al. 1993; Powell L.M., et al. 1998]. Как показано в экспериментах пофутпринтингу с помощью экзонуклеазы III и ДНКазы I [Mernagh D.R., Kneale G.G. 1996; Powell L.M., et al. 1993; Powell L.M., et al. 1998; Taylor I., et al. 1993], M.£coKI и M.£coR124I покрывают примерно 25-30 нуклеотидных пар ДНК. Показано, что две субъединицы HsdM находятся по обе стороны от центрального HsdS, что определяет метилирование аденинов в комплиментарных нитях ДНК [Powell L.M., et al. 1998]. Ферменты M.£coKI [Powell L.M., Murray N.E. 1995] и M.£coR124I [Mernagh D.R., et al.,1998] контактируют с двойной спиралью ДНК по большой бороздке.г) Субъединица рестрикции - HsdR.

Субъединицы HsdR семейств IA, IB, 1С, ID имеют сравнительно низкую (20-30%) гомологию [Titheradge A.J., et al. 1996]. Однако все эти белки включают мотивы, характерные для АТФ-связывающих белков. Обнаружено также наличие других консервативных аминокислотных последовательностей, характерных для ряда семейств АТФ-зависимых геликаз [Gorbalenya А.Е., Koonin E.V. 1991; Murray N.E., et al. 1993; Titheradge A.J.B., et al. 1996]. Представители семейств 1 и 2 включают мотив DEAD или вариации этого мотива [Linder P., et al. 1989]. Структура DEAD-бокса у геликаз показывает, что мотивы формируют нуклеозидтрифосфат (НТФ) -связывающий карман и часть ДНК-связывающего сайта [Korolev S., et al. 1997; Velankar S.S., et al. 1999]. Это подтверждает, что консервативный мотив определяет транслокацию через HsdR-субъединицу однонитевой ДНК, а также раскручивание ДНК-дуплекса. Почти все мутации в DEAD-боксе ослабляют гидролиз НТФ или сопряжение гидролиза НТФ и раскручивание ДНК. Мутагенез гена hsdR EcoKl показывает, что каждый из семи DEAD- мотивов существенен для рестрикции in vivo [Davies G.P., et al. 1998; Webb J.L., et al. 1996].

Для предсказания вторичной структуры HsdR было произведено выравнивание а.к.-последовательностей этого белка [Titheradge A.J. В., et al. 1996]. Сравнение HsdR последовательности с Rep и РсгА, ДНК- геликазами, для которых известны вторичные структуры [Korolev S., et al. 1997; Velankar S.S., et al. 1999], подтверждает, что HsdR имеет такую же вторичную структуру, как и эти геликазы в участке, включающем DEAD-бокс мотивы [Davies G.P., et al. 1999]. В Rep и РсгА мотивы находятся в двух доменах, которые дают возможность белку проводить АТФ- гидролиз и одновременно раскручивать ДНК [Bird L.E., et al. 1998]. Ограниченный протеолиз HsdR в области DEAD-мотивов показывает, что они тоже находятся в двух доменах, похожих на таковые в Rep и РсгА [Davies G.P., et al. 1999]. Выравнивания HsdRпоследовательностей [Titheradge A.J. В., et al. 1996] также определило дополнительную консервативную область в N-концевой части полипептида, которая, судя по результатам частичного протеолиза, находится в отдельном домене, отличном от тех, которые включают DEAD-бокс мотивы [Davies G.P., et al. 1999]. Эта консервативная последовательность имеет сходство с мотивами, найденными у ферментов - нуклеаз семейства RecB и рестрикционных эндонуклеаз И-го типа. Сайт-направленный мутагенез показал значимость этого мотива для эндонуклеазной активности Eco Al [Janscak P., et al. 1999] и EcoKl [Davies G.P., et al. 1999; Davies G.P., et al. 1999].д) Функционирование R-M комплекса 1-го типа.

Определенный интерес представляет механизм, с помощью которого R-M ферменты 1-го типа транслоцируют ДНК на значительное расстояние перед разрывом фосфодиэфирных связей в обеих нитях ДНК. Каким образом происходит остановка процесса транслокации и переключение на разрезание ДНК? На эти вопросы до сих пор нет ответа [Szczelkun M.D. 2000].

Связывание ДНК. С помощью футпринтинга [Powell L.M., et al. Есо¥Л показано, что £соК1-фермент связывается с ДНК в отсутствии АТФ, при этом фермент покрывает от 42 до 46 н.п., если ДНК включает sK-сайт. При добавлении АТФ в присутствии AdoMet и ДНК с неметелированными или полуметилированными sK-сайтами, этот участок сокращается до 30 н.п.; если же сайты sK модифицированы по обеим нитям, то фермент теряет связь с ДНК. АТФ и AdoMet нужны для конформационных изменений в sK-сайте, при этом AdoMet может быть заменен S-аденозил гомоцистеином, а АТФ -негидролизируемым аналогом [Powell L.M., et al. 1998].

Модификационная активность. В присутствии функциональных кофакторов, EcoKl метилирует полуметилированную ДНК, но если сайт не метилирован, то инициируется АТФ-зависимая транслокация. AdoMet участвует в определении модификационного статуса sK-сайта. Для модифицированной ДНК, стерические помехи от метальных групп на адениновом остатке могут предотвращать конформационные изменения. Только если оба аденина не метилированны, HsdM субъединицз входят в большую бороздку, образуя «закрытую» конформацию, в которой субъединицы HsdR располагаются таким образом, чтобы инициировать транслокацию ДНК. AdoMet служит как проба на модификационный статус sK-сайта [Powell L.M., Murray N.E. 1995]. Это объясняет важную роль AdoMet в рестрикции (как и в модификации), и предсказывает, что потеря связывания AdoMet с HsdM естьпричина фенотипа r"m\ В доказательство этому, мутант EcoYÄ, у которого блокирована связь субъединицы HsdM с AdoMet, в результате единичной аминокислотной замены в мотиве I (D/E/SXFXGXG) [Wilkins В.М., et al. 1996], не проявляет ни эндонуклеазной, ни модификационной активностей.

Транслокация ДНК. R-M ферменты 1-го типа разрезают ДНК на различном удалении от sK-сайта [Horiuchi К., ZinderN.D. 1972]. Для идентификации возможных продуктов расщепления при рестрикции линейной и кольцевой ДНК была применена электронная микроскопия [Endlich В., Linn S. 1985; Xu G., et al. 1995]. Было показано АТФ зависимое образование ДНК-петель для замкнутых в кольцо и линейных ДНК. Предполагается, что фермент связывается с sK-сайтом (S-субъединица), затем связывается с помощью R-субъединицы со второй, неспецифической последовательностью в ДНК, и далее протаскивает ДНК, образуя петлю (процесс сопровождается АТФ -гидролизом) [Xu G., et al. 1995]. Была предложена также модель [Studier F.W., Bandyopadhyay P.K. 1988], согласно которой ДНК протаскивается через связанный комплекс по обеим сторонам от sK-сайта, а разрезание ДНК происходит только в тот момент, когда два транслоцирующих комплекса встречаются (рис. 4). Эта модель была предложена на основании анализа продуктов, полученных после обработки ДНК фага Т7 ферментом Есо¥Л. Когда рестрикционная реакция была синхронизирована добавлением АТФ в присутствии AdoMet, то полосы ДНК при гель-электрофорезе носили строго дискретный характер, причем их размер строго соответствовал вдвое уменьшенному расстоянию между sK-сайтами. В соответствии с данной моделью, стимул для разрезания ДНК происходит при помехах для транслокации. Недавние эксперименты показывают, что инициация разрезания ДНК происходит, не только при столкновении двух транслоцирующих фермента, но и тогда, когда транслоцирующий фермент наталкивается на структуру (крест) Холлидея, при условии, что эта структура не способна мигрировать вдоль цепи ДНК [Janscak Р., et al. 1999].

Скорость транслокации ДНК через EcoYÄ составляет около 100 п.н. в секунду [Davies G.P., et al. 1999; Garcia L.R., Molineux I.J. 1999]. Так как фермент следует за спиральным контуром ДНК, оставаясь связанным с sK-сайтом, то впереди транслоцируемого комплекса ДНК спирализуется, образуя положительные супервитки, а позади комплекса формируются отрицательные супервитки [Davies G.P., et al. 1999; Szczelkun M.D., et al. 1996]. Были проведены эксперименты, подтверждающие это предположение и демонстрирующие, что негативные супервитки генерируютсяферментом Eco AI в присутствии АТФ и топоизомеразы IЕ. coli [Janscak P., Bickle T. A. 2000].

Рисунок 4. АТФ-зависимая транслокация ДНК. а) Модель [Studier F.W., Bandyopadhyay P.K. 1988]. Фермент EcoKI, оставаясь связанным с sK-сайтом, протаскивает ДНК через субъединицы R (направление транслокации ДНК показано белыми стрелками), разрезание происходит (черная стрелка), в момент, когда два транслоцирующих комплекса встречаются. Ь) Разрезание происходит в момент, когда транслоцирующий комплекс сталкивается с любым препятствием (белок или определенная структура ДНК) [JanscakP. 1999].

Эти топологические изменения могли бы препятствовать транслокадии на кольцевой ДНК в отсутствии никирующей или топоизомеразной активностей. Такие активности не были обнаружены у R-M ферментов 1-го типа. Поэтому возможна модель, согласно которой субъединица HsdR вращается вокруг M2S -ядра или временно отсоединяется от него, причем само ядро остается связанным с sK-сайтом в ДНК [Davies G.P., et al. 1999; Janscak P., Bickle T.A. 2000]. Сейчас нет прямых доказательств, что R-M системы 1-го типа являются геликазами, и попытки продемонстрировать геликазную активность окончились безрезультатно [Janscak Р., Bickle T.A. 2000]. Можно предположить, что обе субъединицы HsdR прочно связываются с фланкирующей ДНК лишь в отсутствие кофакторов, но в присутствии кофакторов эта связь может быть ослаблена вследствие конформационных изменений, требующихся для транслокации ДНК. Сборка фермента EcoKI была проанализирована in vitro [Dryden D.T.F., et al. 1997]. На основании экспериментов по определению количества интермедиатов комплекса и субъединиц был предложен процесс сборки в бактериальных клетках. Метилтрансфераза (M2S1) образуется в результате обратимого присоединения М-субъединицы к начальному комплексу MjSj. HsdR прочно соединяется с Mi Si и с M2S1, но эндонуклеазной активностью обладает только комплекс R2M2S].

Ь>^ - Г1 р'I » та— у у ьБиологическая роль R-M систем 1-го типа.

Хромосома бактериальной клетки, содержащей R-M систему 1-го типа, защищена модификационной активностью. Однако известно, что гены hsd, кодирующие R-M системы 1-го типа, могут эффективно переноситься в клетку-реципиент, в которой хромосомная ДНК неметилирована. Молекулярные основы этого явления выяснены сравнительно недавно. При переносе генов R-M систем 1-го типа в клетки реципиенты происходит задержка эндонуклеазной активности на время, необходимое для метилирования немодифицированной хромосомы реципиента [Prakash-Cheng A., Ryu J. 1993]. Осуществляется этот контроль клеточными протеазами, деградирующими R-субъединицу (подробнее см. в разделе «Антирестрикция»).

В настоящее время наличие R-M систем 1-го типа документировано, помимо Е. coli, в Bacillus subtilis [Winter М. 1998], Citrobacter freundii [Daniel A.S., et al. 1988], Klebsiella pneumoniae [Lee N.S., et al. 1997; Valinluck В., et al. 1995], Lactococcus lactis [Schouler C., et al. 1998], Mycoplasma pulmonis [Dybvig K., Yu H. 1984], Pasteurella haemolytica [Highlander S.K., Garza O. 1996], Salmonella enterica [Bullas L.R., et al. 1980], и Staphylococcus aureus [Sjostrom J.E., et al. 1978]. Системы R-M I- го типа обеспечивают наличие «рестрикционного барьера» против фаговой инфекции и вообще против внедрения в клетку любой чужеродной ДНК. Скрининг имеющихся баз данных полных геномных последовательностей показывает, что около половины бактериальных геномов включают близко связанные гены, которые по предсказанию кодируют три полипептида, составляющие R-M ферменты 1-го типа (табл. 3), а другая половина геномов содержит часть генов R-M систем I- го типа. Некоторые штаммы одного вида могут содержать или не содержать гены R-M 1-го типа, например, В. subtilis [Trautner Т.А., М. Noyer-Weidner. 1993]. Таким образом, оказалось неверным раннее предположение, что R-M-системы 1-го типа характерны лишь для семейства Enterobacteriaceae. Удивителен тот факт, что один штамм Helicobacter pylori использует более 1% своего маленького генома для кодирования R-M систем, три из которых являются системами 1-го типа [Tomb J.F., et al. 1997].

Пример R-M систем 1-го типа М. pulmonis иллюстрирует сложную систему экспрессии различной специфичности, причем различную специфичность показывают даже R-M системы потомков одной бактерии [Dybvig К., et al. 1998]. Бактериальная хромосома М. pulmonis содержит два локуса, каждый из которых содержит два генаhsdS фланкированных генами и /шЖ. Сайт-специфическая инверсия ДНК может происходить по одному из трех сайтов, расположенных в генах hsdS. У каждого къй локуса имеется лишь один промотор, так что только одна ориентация определяет транскрипцию функционального Няй оперона. Однако, альтернативные сайты инверсии с помощью генных перестановок создают дополнительно группу функционально активных различных субъединиц ШёБ.

Классическое объяснение наличия R-M систем у бактерий, данное В. Арбером, заключается в том, что они создают «рестрикционный барьер» против фаговой инфекции. Также было предложено, что разрывы ДНК, индуцируемые системами рестрикции-модификации, могут быть рекомбиногенными («горячие» точки рекомбинации), и было указано, что в результате случайного характера разрывов ДНК, индуцируемых системами 1-го типа, любой ген имеет шанс оказаться рядом с разрывом [Endlich В., Linn S. 1985; Price С., Bickle Т.А. 1986]. Рестрикционная фрагментация ДНК должна увеличить возможность рекомбинационного объединения преимущественно коротких отрезков ДНК. Сравнение последовательностей хромосомальной ДНК из нескольких штаммов Е. coli и анализы переноса генов между природными изолятами Е. coli и Е. coli К-12 с помощью трансдукции и конъюгации подтверждает влияние R-M-систем на структуру фрагментов ДНК, включенных в хромосому реципиента. Наличие R-M систем приводит к созданию мозаики коротких геномных последовательностей из различных штаммов [McKane М., Milkman R. 1995; Milkman R., et al. 1999; Milkman R., Bridges M.M. 1993]. Таким образом, R-M-системы влияют на поток генетического материала между популяциями бактерий, увеличивая возможность приобретения полезных кодирующих последовательностей и уменьшая опасность внедрения вредных последовательностей (например, из фаговой ДНК) [Milkman R., et al. 1999].

Антирестрикция.

Феномен ослабления рестрикционной активности R-m систем 1-го типа: протеолитический контрольИзвестно, что успешность переноса генов, кодирующих ЕсоКА, зависит от свойств клетки-хозяина [Prakash-Cheng A., et al. 1993]. Оказалось, что в этом повинны клеточные протеазы, а точнее, протеаза ClpXP (ClpX-субъединица с АТФазной активностью, отвечает за связь с белком-субстратом, ClpP- субъединица, осуществляющая протеолиз белка). Показано, что если реципиент содержит мутацию в генах clpX или clpP, то перенос генов hsd, кодирующих ферменты EcoYA или EcoAl, ведет к инактивации клетки- реципиента [Makovets S., et al. 1998]. Временное ослабление рестрикционной активности, или "restriction allevation" (RA) систем R-M I-го типа в бактериальных клетках имеет место также при индуцировании повреждений ДНК, например, при УФ-облучении, при выращивании клеток на среде, содержащей 2-аминопурин или 5-бромоурацил [Day R.S. 1977; Thorns В., Wackernagel W. 1982; Thorns В., W. Wackernagel 1984; Белогуров A. и др. 1987a; Белогуров A. и др. 1987b; Efimova E.P., et al. 1988; Hiom K.J., Sedgwick S.G. 1992]. Оказалось, что и в этом случае эффект RA, как при конъюгативном переносе hsd генов, зависит от активности С1рХР-протеазы [Makovets S., et al. 1998; 1999].

Анализ роли ClpXP в RA привел к тому, что был определен молекулярный механизм, который обеспечивает защиту бактериальной хромосомы от потенциального летального эффекта рестрикционных систем 1-го типа. В клетках, кодирующих ферменты R-M 1-го типа, ослабление рестрикции определяется деградацией субъединицы R (но не M и S), проводимой протеазой ClpXP. Принципиально важным оказалось, что деградация R-субъединицы происходит лишь в момент транслокации через нее немодифицированной нити ДНК. Ни отдельную субъединицу R, ни в комплексе с другими субъединицами, но при наличии в клетке ДНК, метилированной по сайтам sK, протеаза ClpXP не ведет деградацию субъединицы R [Makovets S., et al. 1999]. Выживание клеток зависит от ClpXP, и заключается в ClpXP-зависимой деградации HsdR [Makovets S., et al. 1999]. По-видимому, в момент транслокации R-субъединица несколько «раскрывается» и становится мишенью для протеазы ClpXP. Таким образом, для феномена RA в клетке требуется лишь наличие неметилированнойпо sK-сайтам ДНК. В случае конъюгативного переноса hsd-генов вся хромосомная ДНК реципиента является таковой для новой системы R-M. При УФ-облучении т других подобных обработках клеток неметилированная ДНК возникает в результате репаративного синтеза, однако, конечно, в меньшем количестве [Murray N.E.,2000].

Было получено экспериментальное подтверждение, что R-M гены П-го типа ведут себя как «эгоистичные» объекты [Kobayashi I. 1998; Naito Т., et al. 1995; Kulakauskas S., et al. 1995]: эти гены редко теряются из хозяйской клетки, так как обеспечивают стабильное содержание в клетке плазмид, которые их кодируют. Эти результаты показали, что потеря R-M генов П-го типа ведет к гибели клетки, так как остаточная эндонуклеазная активность приводит к формированию в хромосоме хотя бы одного летального двойного разрыва ДНК, а остаточной метилазной активности не достаточно, чтобы модифицировать все сайты в хромосоме. Объяснение разнообразия сайт-специфичности в случае эгоистичных R-M генов заключается в том, что одна система исключает другую, если они обе узнают одну и ту же последовательность [Kusana К., et al. 1995]. Другими словами, системы с одинаковым сайтом ведут себя как плазмиды одной группы несовместимости, отбор может возникнуть вследствие конкуренции за сайт.

Изученные системы 1-го типа, EcoYA, £coR124I, и EcoAI не ведут себя подобно системам Н-го типа. Потеря генов систем 1-го типа не имеет заметного влияния на жизнеспособность бактерий [Kulik Е.М., Bickle Т.А. 1996; Makovets S., et al. 1998; O'Neill M., et al. 1997].

Специфические системы антирестрикцииМожно предположить, что в процессе эволюции как у плазмид, так и у бактериофагов возникли системы, способствующие преодолению "рестрикционных барьеров". У конъюгативных плазмид и ряда бактериофагов обнаружена способность преодолевать действие клеточных систем рестрикции-модификации [Завильгельский Г.Б. и др. 1984; Bickle Т.А., Kruger D. 1993].а) Антирестрикиионная активность бактериофагов.

Широко распространенный среди вирулентных фагов способ избежать действия клеточных R-M систем, - это специфическая модификация фаговой ДНК, определяющая резистентность ДНК к действию R-M систем. Например, Т-четные бактериофаги глюкозилируют цитозины в своей ДНК, в результате чего ДНК становится резистентной к действию ферментов рестрикции 1-го, 11-го и Ш-го типов [Kruger D.H., Bickle Т. 1987]. Значительной модификации (примерно 15%) подвергается ДНК бактериофага Mu: продукт фагового гена тот модифицирует адениловые остатки (аденин превращается в ацетамидоаденин) в последовательностях типа 5'.(CG)-A-(GC)-N-Py.3', в результате чего ДНК становится резистентной к ферментам рестрикции [Hattman S. 1980]. Иначе действует умеренный бактериофаг X. Продукт фагового гена ral обладает способностью значительно ускорять процесс специфического метилирования полностью неметилированной ДНК [Zabeau М., et al. 1980]. В норме ферменты рестрикции-модификации 1-го типа практически не способны метилировать ДНК, обе нити которой неметилированы; точнее, реакция метилирования происходит, но крайне медленно (часы вместо секунд). Продукт фагового гена ral связывается с ферментом EcoYA и резко ускоряет процесс специфического метилирования. В результате ДНК фага в клетке сравнительно быстро превращается в "свою", которую EcoKl не деградирует. Ген типа ral найден также в дефектных профагах Rae, где получил название lar [Toothman P. 1981; King G. Murray N.E. 1995]. В норме ген lar закрыт, но при введении в геном Е. coli мутации sbcA (регуляторная область перед lar) в клетке синтезируется значительное количество белка Lar, и в результате в мутантных клетках Е. coli К12 sbcA активность EcoKl - рестрикции значительно ослаблена.

Интересный метод борьбы с клеточными системами рестрикции 1-го типа демонстрирует бактериофаг ТЗ. Ген sam фага ТЗ ответственен за синтез фермента SAMase, ведущего гидролиз SAM [Studier F.W., Movva N.R. 1976]. В результате действия этого фермента в клетке значительно уменьшается концентрация SAM -субстрата модификации и необходимого кофактора рестрикции для R-M систем 1-го типа, и, соответственно убывает активность клеточных ферментов рестрикции.

Особо необходимо отметить наличие у нескольких вирулентных фагов способа преодоления межклеточных рестрикционных барьеров с помощью белков-ингибиторов ферментов рестрикции, т.е. подобных белкам Ard конъюгативных плазмид (см.следующий раздел «Антирестрикционная активность конъюгативных плазмид). В настоящее время известны три фаговых белка-ингибитора клеточных R-M систем: Oer, ген которого 0.3 (или осг) расположен в геноме бактериофага Т7; Dar А, кодирующийся геном dar А бактериофага PI; Arn, ген которого агп расположен в геноме фага Т4. Белок Oer специфически ингибирует ферменты рестрикции 1-го типа, и относится к группе небольших (141 а.о.), очень кислых белков (суммарный заряд-12) [Studier F.W. 1975; Bandyopadhyay Р.К., at al. 1985]. Сходен по фенотипическому проявлению, но отнюдь не по молекулярным параметрам с белком Oer белок DarA бактериофага PI (фаг PI широко используется при генетическом картировании как фактор общей (general) транедукции). Белок DarA также ингибирует лишь R-M системы 1-го типа и относится к группе очень кислых белков (суммарный заряд -35), но он значительно больше размером (687 а.о.) и не гомологичен белку Oer [Iida S., et al. 1998]. Белок DarA входит в состав фагового корпускула и вместе с ДНК попадает в клетку при инфекции, так что защиту немодифицированной ДНК он осуществляет сразу после инъекции ДНК. В геноме Т-четных бактериофагов содержится ген am, который кодирует Arn - белок -ингибитор ферментов рестрикции МсгВ (или RglB) [Dharmalingam К., et al. 1997]. Как упоминалось выше, глюкозилированная ДНК этих фагов резистентна к любым ферментам рестрикции. Однако, неглюкозилированная ДНК мутантных бактериофагов Т4 glu деградирует под воздействием различных ферментов рестрикции и, в частности, R-M системы МсгВС (или RglB), которая рвет ДНК по специфическим сайтам, в которых содержится метилированный по 5-му положению цитозин. Так как ДНК Т4 содержит в своем составе вместо цитозина 5-гидроксиметилцитозин, то естественно, что у мутантных фагов Т4 glu ДНК будет подвергаться деградации клеточной R-M системой МсгВС. Продукт гена агп ингибирует фермент рестрикции МсгВ и тем самым защищает ДНК от клеточных R-M систем этого типа. Механизм подобной защиты выработан у Т-четных фагов, по-видимому, в связи с задержкой глюкозилирования, так как гидроксиметилирование цитозина осуществляется раньше. Arn - небольшой по размеру (122 а.о.), кислый белок (суммарный заряд -10) также не гомологичен другим ингибиторам R-M систем.

Очень интересный пример белкового ингибитора у фага, хотя и несколько из другой области, - это белок Ugi, продукт гена ugi бактериофагов PBS 1 и PBS2 грамположительных бактерий Bacillus subtilis. В ДНК бактериофагов PBS1 и PBS2 вместо тимина содержится урацил. При введении в клетку урацил-содержащей ДНК она подвергается атаке специфической урацил-ДНК-гликозилазой (UDG). В результатепоследовательного гидролиза гликозидной связи, проводимого UDG, и разрыва фосфодиэфирной связи рядом с АП-сайтом, индуцируемого апуриновой (АП)-эндонуклеазой, ДНК фага деградирует, по существу, точно также, как и при действии на немодифицированную ДНК клеточных R-M систем. Чтобы защитить свою ДНК от действия клеточной UDG, в геноме фагов PBS1 и PBS2 содержится ген ugi, кодирующий специфический ингибитор этого фермента. Белок Ugi, как и белки-ингибиторы ферментов рестрикции, относится к группе небольших по размеру (146 а.о.), сильно кислых (суммарный заряд -12) белков [Wang Z., Mosbaugh D.W. 1989; Wang Z., et al. 1991].б) Антирестрикиионная активность конъюгативных плазмид."Несущественные" гены конъюгативных плазмид и их биологическая роль.

Плазмиды называются конъюгативными, или трансмиссивными, если они способны автономно реплицировать в бактерии и переноситься из одной бактериальной клетки в другую в процессе конъюгации [Wilkins В.М. 1995; Lanka Е., Wilkins В.М. 1995]. В семействе энтеробактерий известны около тридцати различных групп "несовместимости" конъюгативных плазмид: FI, FII, Fill, FIV, FV, II, 12, N, В, P, К и т.д. [Couturier M., et al. 1988]. К "существенным" генам конъюгативных плазмид относят две группы генов, ответственных за репликацию плазмидной ДНК (гены области rep) и за конъюгативный перенос (гены области ira). Эти гены занимают в плазмидах, как правило, более 50% длины молекулы [Frost L.S., et al 1994; Pansegrau W., et al. 1994]. Оставшаяся часть ДНК плазмид заполнена как "случайными" элементами (IS-элементы, транспозоны, содержащие гены резистентности к антибиотикам, тяжелым металлам, гены вирулентности и т. д.), так и "несущественными" генами. В отличие от "случайных" последовательностей, свободно мигрирующих от генома к геному, "несущественные" гены сохраняют свою локализацию в ДНК плазмид столь же строго, как и "существенные" гены, а нуклеотидная последовательность этих генов высококонсервативна. Однако, при введении мутаций в "несущественные" гены, нарушающих их активность, основные свойства конъюгативных плазмид ни в коей мере не изменяются, т.е. они продолжают нормально реплицировать в клетке и переноситься в другие клетки в процессе конъюгации. Именно поэтому эта группа генов и получила название "несущественных" генов.ДНК-геликазаt ssbV!< прайм ерТгаЬрелаксазаРисунок 5. Схема конъюгативного переноса плазмидной ДНК из клетки-донора в клетку-реципиент.

Область конъюгативных плазмид, в которой располагаются "несущественные" гены, называется "лидерной" областью, т.к. она примыкает к сайту oriT, а ее гены первыми входят в клетку-реципиент при конъюгативном переносе (рис. 5). Сайт orïY -начало (origine) конъюгативной репликации - расположен на границе /га-оперона с остальной частью плазмиды. Гены "лидерной" области (которая обычно занимает 10-15 т.п.н. и заканчивается в связи с началом области тер (вегетативная репликация плазмиды)) в разных плазмидах расположены в разном порядке, причем их присутствие необязательно. Всего в состав "лидерной" области входит примерно 8-10 ORF. Однако, из них определены фенотипически и изучены подробно лишь четыре гена: ard, psïB,flm (hok-sok) и ssb (рис. 6). Природа остальных ORF остается неизвестной.

Гены ard (к настоящему времени обнаружено несколько разновидностей гена ard, получивших индексы ardA, ardB, ardC) кодируют небольшие, очень кислые белки (размер 140-170 аминокислотных остатков с характерным суммарным зарядом (-10 - -25), и, как показано в ряде работ, являются ингибиторами клеточных R-M систем 1-го типа [Delver Е.Р., et al. 1991; Belogurov A.A., et al. 1992; Belogurov A.A., et al. 1993; Завильгельский Г.Б., и др. 1994; Chilley P.M., Wilkins B.M. 1995; Belogurov A.A., et al 2000]. Ген psiB кодирует небольшого размера кислый белок, который ингибирует RecA,-ключевой белок рекомбинации и SOS-регулона [Bagdasarian М.М., et al. 1992].oriTardAPSiBssb■O iioriT flm <psiBssardAoriTpsiBssbFVFIoriTardAardN0681012kbРисунок 6. Расположение "несущественных" генов ardA, ardB, psiB, Jim, ssb в "лидерной" области различных конъюгативных плазмид.

Предполагается, что белок PsiB, инактивируя RecA, тем самым способствует снижению SOS-эффекта, который сопровождает конъюгативный перенос ДНК, т. к. плазмидная ДНК входит в клетку- реципиент в однотяжевом состоянии (рис.5). Ген ssb ответственен за синтез белка Ssb (Single-stranded DNA binding), о его роли в конъюгативном переносе см. ниже [Howland С.J., et al. 1989]. Ген flm/.F (hok-sok/RlOO) ответственен за синтез белка-киллера, убивающего бесплазмидную (точнее, потерявшую конъюгативную плазмиду) клетку и, следовательно, способствует стабилизации состояния клетки с плазмидой [Gerdes К., et al. 1990; Gerdes К., et al. 1997]. Механизм летального действия продуктов этих генов на клетку основан на принципе "токсин-антитоксин": белок-токсин убивает клетку, антитоксин нейтрализует действие токсина [Yarmolinsky М.В. 1995]. В настоящее время известны два различных типа пост-сегрегационных киллер-систем, кодирующихся генами конъюгативных плазмид: 1) антитоксин - белок, 2) антитоксин - антисмысловая РНК [Gerdes К., et al. 1990; Gerdes К., et al. 1997; Jensen R.B., Gerdes K. 1995; Franch Т., et al. 1999; Gerdes K. 2000]. Система flm (hok-sok) относится ко второй группе: ген sok определяет синтез короткой и нестабильной антисмысловой РНК (антитоксин) для гена ho к, ответственного за синтез стабильного белка-токсина Нок.

Антирестрикционная активность белков Аг(1.

Белки Агс! ингибируют только ферменты систем 11-М 1-го типа, причем как рестрикционную, так и модификационную активности всех четырех семейств ферментов 1-го типа. Если ген агс1А клонирован в мультикопийном векторе под сильным промотором, то его продукт белок АгёА защищает инфицированную в клетку немодифицированную ДНК фага А,.О, т.е. действует в транс-положении. В этом случае защита ДНК от фермента рестрикции 1-го типа полная: например, в случае системы рестрикции Есо¥Л (в качестве хозяина используется штамм Е. соИ К12) без гена агйА титр фага снижается примерно на четыре порядка, а в присутствии гена агс1к ДНК фагаА.О вообще не рестрицируется.

Рисунок 7.Выход трансконъюгаитов при переносе ^модифицированной ДНК плазмид из клетки-донора в клетку-реципиент: защитный эффект гена агдА. По оси абсцисс - время конъюгации в мин., по оси ординат - выход трансконъюгаитов (логарифмическая шкала). Пунктиром обозначен вариант переноса модифицированной ДНК (контроль).Индексом.0 обозначены ^модифицированные ДНК (подробное описание эксперимента - в тексте).

Способен ли ген агйк. защитить немодифицированную ДНК от клеточных 11-М систем, находясь в цис-положении, т.е. располагаясь на самой немодифицированной ДНК? Если ген агс1А расположен в векторе, и эта немодифицированная ДНК - плазмида вводится в клетку путем трансформации, то агс1А не защищает ее, т.к. белок Агс1А не успевает синтезироваться в достаточном количестве, а клеточные ферменты рестрикции немедленно после трансформации атакуют ДНК. Но в случае конъюгативного переноса защита плазмидной ДНК от клеточных Ы-М систем с помощью гена агйА имеет место: выход трансконъюгаитов значительно выше, если внемодифицированной плазмиде присутствует ген ardA ColIb-P9, если же ген инактивирован или если эта плазмида (RP4, incPa) не имеет в своем составе подобного гена, то эффективность образования трансконъюгантов примерно на два - три порядка ниже (рис. 7).

Удивительным фактом является отсутствие гомологии в аминокислотных последовательностях белков ArdA, ArdB и ArdC. В них обнаруживается лишь небольшой гомологичный участок из 14 аминокислотных остатков, который назван "антирестрикционным" мотивом (точнее, этот участок составляет "ядро" мотива) [Belogurov A.A., et al. 1993; Belogurov A.A., Delver E.P. 1995]. В табл. 4 приведен этот мотив для нескольких белков Ard, а также для других белков-ингибиторов ферментов рестрикции. Для "антирестрикционного мотива" характерно строго по месту расположение отрицательных зарядов (D/E, аспарагиновая и глутаминовая аминокислоты), а также расположение в начале и в середине гидрофобных аминокислот.

Таблица 4 "Антирестрикционный мотив" в аминокислотной последовательности белков ArsR, MerR и антирестриктаз Ard (ArdA,B,C,U), Oer. Идентичные аминокислотные остатки (а также несущие отрицательный заряд аспарагиновая и глутаминовая кислоты, D и Е) отмечены жирным шрифтомБелок Источник Последовательность СсылкаArdA ColIb-P9 130-xiadvpetvalyfd Delver E. P. et al. 1991ArdA R16 131-xxadvpeivalyfd Chilley P.M. et al. 1995ArdA pKMIOl 131-xxneipesvary fd Belogurov A.A. et al. 1992ArdA Folac 132-xxnevpepzrsyfd Chilley P.M. et al. 1995ArdA pMTl 132-zznevpepzrsy fD Karlyshev A.V. et al. 1999ArdB pKMIOl 12 0 - liretyvetxennsg Belogurov A.A et al. 1993ArdU pUElO 14 4-AZQEVPEWZRPY1N Meima R. Et al. 2000ArdC pSa (incW) 24 4-LIpdfdqsaayvcs Belogurov A.A. 2000Oer (0.3) фаг T7 101-ZZNEYLEE veeyee DunnJ.J. et al. 1981DarA Фаг PI 542-lqaevgeitqpepa Iida S. et al. 1998Гены агс1В и агс1С обнаружены пока лишь в единственном экземпляре каждый в конъюгативных плазмидах рКМ101 (агс!В) и рБа (агс!С) [Ве1о£игоу А.А., ег а1. 1993; Ве1о§игоу А.А., ег а1. 2000]. Белок ArdB гомологичен известному киллер-белку КИС (или К1сА), ген которого впервые был обнаружен в плазмидах Р-группы несовместимости (ЯР4,11К2 и др.), а позднее найден и в других репликонах [Ьагзеп М., е1 а1. 1995]. Однако, из белков этой группы лишь А^В (ген агсШ расположен в рКМ101) имеет характерный "антирестрикционный мотив" (табл. 4) и только он из этой группы белков проявляет антирестрикционную активность. Отметим, что в "лидерной" области плазмиды рКМ101 также расположен ген агс!А, кодирующий активную антирестриктазу. Белок ArdC (ген агс/С расположен в рЭа) гомологичен белку ТгаС 1 (праймаза), ген которого расположен в конъюгативных плазмидах Р-группы несовместимости. И вновь только АМС содержит "антирестрикционный мотив" и способен ингибировать ферменты рестрикции 1-го типа. Создается впечатление, что случайное приобретение в результате мутаций "антирестрикционного мотива" придает белку новое свойство, а именно, способность ингибировать 11-М системы 1-го типа. Отметим, что белок А^В, "превратившись" в антирестриктазу, потерял свойство киллера. По-видимому, лишь высоко гомологичную друг другу группу белков А^Аможно считать истинными антирестриктазами, т. к. гены ardh. имеются у многих конъюгативных плазмид.

Белковая мимикрия ДНК ("protein mimicry of DNA'*)Белковая мимикрия ДНК - новый механизм регуляции биологических процессов в клетке. Впервые белковая мимикрия ДНК была идентифицирована у фагового белка Ugi, ингибитора UDG (см. выше, а также [Mol C.D., et al. 1995; Savva R., Pearl L.H.

1995]. В дальнейшем подобный вид мимикрии белковых молекул наблюдался в рибосомальном факторе элонгации EF-G (tRNA-подобный мотив) [Nyberg J., et al.

1996] и в компоненте dTAFn 230 эукариотеческого транскрипционного фактора TFIID (ДНК-подобный домен) [Liu D., et al. 1998]. В каждом из этих случаев изменение активности белков-мишеней происходит за счет взаимодействия ДНК-связывающего домена с белком-модулятором.

Определение кристаллической структуры с разрешением 1,9А белка Ugi и комплекса UDG-Ugi отчетливо показало ключевую роль во взаимодействии этих белков фрагмента Ugi, состоящего из следующих аминокислотных остатков:Ugi: 20-£'-S-I-L-M-L-P-£'-E-y-£'-E-V.(*)(курсивом отмечены ключевые отрицательные заряды)и образующих на поверхности белковой молекулы Ugi последовательно бета-цепь и альфа-спираль [Putnam C.D., et al. 1999]. Показано, что расположение в пространстве отрицательных зарядов (Е) в этом фрагменте подобно расположению отрицательных зарядов фосфатных групп в сахаро-фосфатном остове B-формы ДНК (точнее, формы, занимающей промежуточное положение между kink- и B-формами ДНК) [Savva R., et al. 1999]. Мутационные замещения ключевых отрицательных зарядов на нейтральные аминокислотные остатки Е20А, Е28А, E31I приводило к значительному снижению стабильности комплекса UDG-Ugi [Lundquist A. J., et al. 1997].

Таким образом, основной принцип механизма регуляции активности ДНК-связывающих белков "protein mimicry of DNA" состоит в формировании особых белков-модуляторов, содержащих на поверхности глобулы домен, с характерным распределением отрицательных зарядов, имитирующем B-подобную структуру ДНК. Врезультате белки-модуляторы активно взаимодействуют с ферментами, связываясь с доменом, ответственным за взаимодействие с ДНК, и тем самым ингибируют активность этих ферментов (вариант классической "конкурентной ингибиции").

Также было показано, что антирестриктаза фага Т7 - Oer «работает» по тому-же принципу: димер этого белка по пространственной структуре и расположению отрицательно заряженных аминокислотных остатков похож на B-форму ДНК (рис. 9).

ЕШ ms шEUD42miРисунок 9 *** Структура антирестриктазы фага Т7 - Oer, полученная по данным рентгеноструктурного анализа, с наложенной на нее структурой В формы ДНК, показаны отрицательно заряженные аминокислоты на Oer, совпадающие с фосфатными группами ДНК [Walkinshaw M.D, et al. 2002].

Субстратом рестрикционных эндонуклеаз, как и UDG, является молекула ДНК. Было сделано предположение [Завильгельский Г.Б.,2000], что плазмидные и фаговые антирестриктазы (ArdA, В, С, Oer и др.), как и белок Ugi, относятся к группе модуляторов, действующих согласно принципу "protein mimicry of DNA". Во-первых, для всех этих белков характерен высокий отрицательный суммарный заряд (от -6 до -35). Во-вторых, наблюдается значительное сходство в аминокислотных последовательностях и расположению отрицательных зарядов вдоль цепи в ключевых мотивах ("антирестрикционный мотив") (табл. 4). Впоследствии, эта гипотеза была подтверждена в результате получения третичной структуры белка Oer Т7 [Dryden D., et al. 2002].ars- и Шег-ОПЕРОНЫИоны тяжелых металлов и металлоидов высокотоксичны, поэтому многие организмы (про- и эукариоты) содержат специальные системы резистентности [Rosen В. 1996]. Гены, определяющие резистентность к ионам металлов и металлоидов, расположены в плазмидах и в хромосоме. Как правило, они составляют опероны и расположены внутри транспозонов [Никифоров В. и др. 1999]. Опероны ars определяют резистентность клеток к ионам мышьяка и состоят из пяти генов, arsRDABC, из которых arsR и arsD - регуляторные гены, ars С - определяет синтез редуктазы, восстанавливающей As(V) до As (III), и генов arsАВ, отвечающих за синтез АТФ-азной помпы, выкачивающей ионы AsC^"1 из клетки в окружающую среду [Chen Chih Ming et al.,1986; Xu Ch., et al. 1998]. Транскрипция ягя-оперона осуществляется с единственного промотора, расположенного перед геном arsR. Белок ArsR является репрессором, закрывающим транскрипцию оперона. Однако, при связывании с As(III) белок ArsR перестает взаимодействовать с ДНК в области оператора, в результате чего синтезируются Ars-белки, и клетка становится резистентной к ионам мышьяка [Wu J., Rosen В. 1993а,1993Ь]. В настоящее время ars-опероны обнаружены у ряда грамотрицательных и грамположительных бактерий. У Е. coli ars-опероны расположены в конъюгативных плазмидах R773 (incFI) и R46 (incN), кроме того неполный ап-оперон (arsRBC) расположен в хромосоме [Mobley Н., et al. 1983; Bruhn D., et al. 1996; Diorio C., et al. 1995].

Мгг-опероны определяют резистентность бактерий к ионам ртути. В настоящее время найдено большое количество /иег-оперонов [Osborn М., et al. 1997]. Как правило, тег-опероны расположены в составе транспозонов [Никифоров В.Г. и др., 1999]. Детальный анализ тег-оперона из Тп21 грамотрицательных бактерий показал, что он состоит из 6 генов merRTPABD. Ключевую роль в этом опероне играет ген тег А и соответственно белок МегА-редуктаза, восстанавливающая с помощью NADPH (NADPH - NADP+) токсичный двухвалентный ион Hg(II) до нетоксичной металлической ртути Hg(0), которая затем пассивно выходит через мембрану в окружающую среду. Белки МегТ и МегР способствуют переносу через мембрану ионов ртути внутрь клетки в цитозоль для связывания с МегА. Роль белков МегВ и MerD неизвестна. Белок MerR является репрессором оперона, который при связывании с ионами ртути становится активатором транскрипции тег-оперона, что позволяет быстро синтезировать достаточное количество белка МегА. В отличие от ¿жу-оперонов,ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬМАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫБактериальные штаммы и бактериофаги.

В работе использовали штаммы Е coli К-12: JM101 thi supE44 А(1ас-ргоАВ) [¥'traD36 pro AB lacfiZ ДМ15]; JM109 recAl end Al gyr А9в thi supE44 relAl hsdRll A(lac-proAB) [F YraD36 pro AB lacïqZ ДМ15] ; JM83 thi ara rpsL A(lac-proAB) ßO /acIqZ ДМ15; TG-1 thi relA supE44 hsdR\7 hsdWl A(lac-proAB) [F 'trameproAB tocIqZ AM15]; ABl 157 F" thr-1, leu-6, pro Al, his-4, thi-1, argE3, lacYl, galK2, aral4, xyl-5, mtl-1, tsx-33, rpsL3 1, supE44, r+m+; AB2463 (генотип ABl 157, также recAl3); AB1886 (генотип ABl 157, также uvrAó)-, АВ1899 (генотип ABl 157 также lonl00)\ JC5519 recB21 recC22 и JC8111 recB21 recC22 sbcB15 recFI43 - оба штамма производные ABl 157 (получены от Д.С. Кларка (США)); МА2 AuvrD29l uvrAó, остальные маркеры, как у ABl 157 (получены от М. Алыиулера, Россия); Е. coli С r0m0 (прототроф); Е. coli BL21(DE3). Большинство используемых штаммов получены из коллекции ГосНИИгенетика.

Бактериофаг Àvir получен от Р.Деворе (Франция). В работе использовалинемодифицированные фаги л.О и модифицированные фаги LK, выращенные на Е. coli С (или TG-1) и E.coli Kl2 ABl 157, соответственно.

Плазмиды.

Использовали следующие вектора: pUC18, pUC19, pET-15b, pBR322, pACYC184 и pBlueScript II KS+, которые были получены из коллекции ГосНИИгенетика. Для создания конструкций, содержащих металлорегуляторные гены использовали следующие плазмиды: pKLH2.5 Apr Hgr, содержит вектор pUC19 и ДНК фрагмент размером 9,7 т.п.н. из конъюгативной плазмиды pKLH2 (60 т.п.н.) с тег-опероном [Ломовская О.Л., Никифоров В.Г. 1988]. Плазмида pKLH2 была изолирована из штамма Acinetobacter calcoaceticus КНР 18 [Миндлин С.З. и др. 1986].pKLH53.1 Apr Hgr, содержит вектор pUC19 и ДНК-фрагмент размером около 8,5 т.п.н. из хромосомы Xanthomonas sp. W17, содержащий транспозон Тп5053 с тег-опероном [Kholodii G.Ya., et al,. 1995].pWSUl Apr Asr, содержит вектор pBR322 и ДНК-фрагмент из конъюгативной плазмиды R773 (IncFI) размером около 7 т.п.н., содержащий an-оперон (arsRDABC) получена от проф. Б. Розена (США) [San-Francisco M.J.D., et al.,1990].pKW301 - плазмида, содержащая ars оперон из Acidiphilium multivorum AIU301 (получена от К. Сакка, Япония);pDEW201 Арг - беспромоторный вектор, содержащий кассету с генами /¿aCDABE Photorhabdus luminescens, (получена от Т. Ван Дейк, США) [Van Dyk Т.К., Rosson R.A. 1998].

Для создания конструкций, содержащих мутантные гены ardA, использовали векторы серий pBluescript II ("Stratagene"), а также pUC 19 и рЕТ-15Ь. Плазмида рАВ7 с клонированным геном ardA pKMIOl была получена от Е. Дельвера [Belogurov А.А., Delver Е.Р., Rodzevich О.V.,1992.].

Для изучения влияния биолюминесценции на рестрикцию были использованы следующие плазмиды, сконструированные ранее в нашей лаборатории [Чернова Т.А., Завильгельский Г.Б. 1991]: pFl- полный lux-регулон (16 т.п.о.) Vibrio fischeri MJ-1 в векторе pBR322; pF2 - фрагмент (7.1 т.п.н.) /wx-регулона V. fischeri (luxABE) в вектор pUC18; pF4 - фрагмент (4.2 т.п.н.) lux регулона содержащий регуляторные участки -гены luxR-luxl и промоторы pi и рг- в векторе pBR322.

Плазмида Со11Ь-Р9 (тсП)получена от Н. Датта (Англия). Плазмида pKMIOl (incN) получена от Г.К. Волкер (США). Трансмиссивная плазмида R64 (Incll) получена из коллекции ГосНИИгенетика. Плазмиды исходно находились в штамме J5-3, из которого конъюгацией переносились в другие штаммы.

Среды и буферы.

Состав использованных сред и концентрации добавок приведены в работе [Котова В.Ю. и др. 1988.]. В опытах с клонированием использовали L-бульон и L-arap. Для верхнего и нижнего слоев чашек Петри использовали 1.8 %-ный и 0.7 %-ный L-arap. В опытах по оценке резистентности бактерий к солям мышьяка использовали в качестве добавки натриевую соль NaAsC>2, мета-арсенит ("Sigma") в концентрации от 1 мкМ(100%-ное выживание контрольных штаммов E.coli, без плазмиды) до 5 мМ (полное подавление роста газона).

ТМ-буфер: 0.05 М трис-HCI, 0.01 М NaCI, 0.01 М MgS04, pH 7.8. Выделение и очистка ДНК.

Выделение и очистка ДНК мультикопийных плазмид, клонирование и рестрикционный анализ проводили стандартными методами согласно [Маниатис и др. 1984] с использованием ферментов фирмы "Fermentas" (Литва). Выделение ДНК плазмиды R64 проводили методом осветленного лизата с последующей очисткой в градиенте CsCl+EtBr согласно [Маниатис с соавт.,1984].

Измерение антирестрикционной и антимодификационной активностей.

Для измерения антирестрикционной активности (Ard) белка ArdA и его мутационных производных использовался штамм Е. coli К-12 JM83 с активной системой рестрикции-модификации 1-го типа EcoKl. Для измеренияантимодификационной активности (Amd) белка ArdA использовался штамм Е. coli Kl2 JM109 r"m+ с активной метилтрансферазой системы рестрикции-модификации Есо¥Л.

Идентификация белка ArdA в клетках Е. coli.

Бактерии BL21(DE3), содержащие гибридную плазмиду pET-SRl с геном ardA pKMIOl под контролем Т7 промотора в векторе рЕТ-15Ь, растили до оптической плотности 0,6-0,8. Затем проводили индукцию РНК-полимеразы Т7 в течение 30-60 мин с помощью изопропил-Р-О-тиогалактопиранозида (IPTG) и добавления рифампицина, ингибитора бактериальной РНК-полимеразы. Белки разделяли в 15%-ном полиакриламидном геле + додецилсульфат натрия с последующей прокраской Куммасси R250.

УФ-облучение бактерий.

Суспензию бактерий в TM-буфере облучали при комнатной температуре различными дозами УФ-света (254 нм) (лампа БУВ-15). Дозу УФ-света измеряли дозиметром УФД-4.

Измерение биолюминесценцииИзмерение биолюминесценциипроводили на люминометре (ФЭУ-85, микровольтметор В2-15), в специальных кюветах при объеме суспензии 200 мкл. При измерении биолюминесценции у клеток, содержащих плазмиду pF2, в суспензию добавляли субстрат люциферазы и-деканаль (3 мкл 0.001 %-ного спиртового раствора).

Определение нуклеотидной последовательностиОпределение нуклеотидной последовательностипроводили согласно [Sanger et al. 1977] методом терминации синтеза с помощью дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Сиквенс в векторе pUC18 проводили с использованием стандартных прямого и обратного праймеров по обеим нитям матричной ДНК. В опытах использовали секвеназу фирмы «Amersham». Набор дезоксинуклеозидтрифосфатов и дидезоксинуклеозидтрифосфатов был получен от фирмы «Fermentas». Электрофорез в полиакриламидном геле проводили на секвенаторе фирмы «Pharmacia» стандартным методом согласно (Маниатис и др., 1984). В качестве радиоактивной метки использовали, как правило, дезоксиаденозинтрифосфат, содержащий Р или Р.

Сайт-направленный мутагенез.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Расторгуев, Сергей Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведено клонирование и определение нуклеотидной последовательности генов йг/\5'11 и тегК из агв- и даег-оперонов, расположенных в различных трансмиссивных плазмидах и транспозонах. Впервые показано, что белки АгеК и МегЯ, регуляторы транскрипции этих оперонов, способны также ингибировать клеточные рестрикционные эндонуклеазы 1-го типа. Впервые получены сайт-направленным мутагенезом аминокислотные замещения в «антирестрикционном мотиве» белка Агс1А рКМ101 (тс]Ч). Показано, что замены консервативных отрицательно заряженных аминокислотных остатков Э и Е на гидрофобный аланин, не влияя на антирестрикционную (Агф активность АгёА, полностью снимают его антимодификационную активность (Ашё). Предложена модель, согласно которой белок АгйА взаимодействует как с Б-, так и с Я-субъединицами фермента рестрикции-модификации 1-го типа.

Основные результаты работы могут быть использованы на практике при клонировании больших фрагментов немодифицированной ДНК для повышения эффективности трансформации штаммов с активными системами рестрикции-модификации 1-го типа. Сконструированный /мх-биосенсор р8Ших2 может быть использован в качестве высокочувствительного детектора ионов мышьяка в среде.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что ангаресгрикционная активность коньюгашвной плазмиды R64 {ind\) связана с продуктом гена arsR. Проведено клонирование гена arsR R64 и определена его нуклеотидная последовательность. Показана его идентичность с геном arsR конъюгативной плазмиды R773 (incFl).

2. Показана антирестрикционная активность белков-регуляторов ArsR и MerR, гены которых расположены в различных ars- и тег-оперонах. Показано, что белок ArsRpKW301 A. multivorum характеризуется самой высокой антиресгрикционной активностью среди белков данной группы.

3. С помощью сайт-направленного мутагенеза сконструирован ряд мутантных форм антиресгрикционнош белка ArdA pKMIOl. Исследовано влияние мутационных замещений консервативных, отрицательно заряженных аминокислотных остатков в «аширестрикционном мотиве» белка ArdA pKMl 01 (incN) на его ангарестрикционную (фенотип Ard) и антимодификационную (фенотип Amd) активности. Показано, что замены ключевых аминокислотных остатков Е134А, Е137А, D144A не влияют на феномен And, но при этом полностью снимают антимодификационную (Amd) активность у белка ArdA. Предложена схема взаимодействия двух димеров ArdA с S- и с R- субьединицами фермента рестрикции-модификации 1-ш типа R2M2S.

4. С помощью сайт-направленного мутагенеза проведены аминокислотные замены в предполагаемом межсубьединичном интерфейсе белка ArdA pKMIOl; показано, что произведенные замены уменьшают эффект ослабления рестрикции (Aid) на два порядка и полностью снимают антимодификационный эффект (Amd).

5. Показано участие геликазы II (UvrD) в эффекте UV-RA. Показано, что экспрессия генов ard А в конъюгативных плазмидах pKMIOl и Со1П>Р9 не регулируется SOS-системой клеток К coli.

6. Показано ослабление ÄoKI-рестрикции в присутствии гибридной плазмиды pF 1 с полным 1га-ретулоном морских бактерий Vibrio fischeri. Показана зависимость этого эффекта от мутации в гене Ion (Lon-протеаза) в хромосоме Е coli. Предполагается, что в присутствии плазмиды pFl вЕ. coli Ion в клетке снижается концентрация S-аденозил-метионина (SAM), кофактора рестрикционной активности фермента EcóKI,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Расторгуев, Сергей Михайлович, Москва

1. Белогуров A.A., Ефимова Е.П., Дельвер Е.П., Завильгельский Г.Б. Ослабление рестрикции 1-го типа у Е. coli: действие 2-аминопурина и 5-бромурацила //1987. Мол. генетика, микробиол. и вирусол., 11: 34-40.

2. Белогуров A.A., Ефимова Е.П., Дельвер Е.П., Завильгельский Г.Б. Ослабление рестрикции 1-го типа у Е. coli: влияние мутации dam // 1987. Мол. генетика, микробиол. и вирусол., 9: 10-16.

3. Белогуров A.A., Завильгельский Г.Б. Влияние плазмидырКМ101 на K-специфическую рестрикцию и модификацию ДНК бактериофага лямбда // 1983. ДАН СССР. 269:738-741;

4. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В. Lon-протеаза участвует в регуляции транскрипции Iwc-оперона Vibriofischerill 1994. Генетика 30:337-341.

5. Маниатис Е., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование., Москва: "Мир". 1984.

6. Abadjieva A., Patel J., Webb M., Zinkevich V., Firman К. A deletion mutant of the type 1С restriction endonuclease £coR1241 expressing a novel DNA specificity. // 1993. Nucleic Acids Res. 21:4435-4443.

7. Altshuler M.X. Role of E. coli DNA helicase II in a wwwCD-dependent weigle reactivation // 1995. Mutat. Res. 273:324-327.

8. Arber W. Host-controlled modification of bacteriophage. // 1965. Annu. Rev. Microbiol. 19:365-378.

9. Arber W. Host-controlled variation, A.D. Hershey (ed.), The bacteriophage lambda. //1971. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harber. N.Y. p. 83.

10. Argos P. Evidence for a repeating domain in type I restriction enzymes. // 1985. EMBO J.4:1351-1355.

11. Bandyopadhyay P.K., Studier F.W., Hamilton D.L., Yuan R. Inhibition of the type I restriction - modification enzymes EcoB and EcoK by the gene 0.3 protein of bacteriophage T7. // 1985. J. Mol. Biol. 182:567-578.

12. Bates S., Roscoe R.A., Althorpe N.J., Brammar W.J., and Wilkins B.M. Expression of leading region genes on Incll plasmid ColIb-P9: genetic evidence for single-stranded DNA transcription// 1999. Microbiology 145:2655-62.

13. Belogurov A.A., Delver E. P., Rodzevich O.V. IncN plasmid pKMlOl and Incll plasmid ColIb-P9 encode homologous antirestriction proteins in their leading regions. // 1992. J.Bacteriol. 174:5079-5085

14. Belogurov A.A., Delver E., Rodzevich O. Plasmid pKMlOl encoded two nonhomologous antirestriction proteins (ArdA and ArdB) whose expression is controlled by homologous regulatory sequences. // 1993. J. Bacteriol. 175:5079-5085

15. Belogurov A.A., Yussifov T.N., Kotova V.Yu., Zavilgelsky G.B. The novel gene(s) ard of plasmid pKM 101: alleviation of EcoK restriction// 1985. Mol. Gen. Genet. 19: 509513.

16. Bertani G., Weigle J.J. Host-controlled variationin bacterial viruses. // 1953. J. Bacteriol. 65:113-121.

17. Bickle T.A., Kruger D.H. Biology of DNA restriction. // 1993. Microbiol. Rev. 57:434450.

18. Bird L.E., Subramanya H.S., Wigley D.B. Helicases: a unifying structural theme? // 1998. Curr. Opin. Struct. Biol. 8:14-18.

19. Delver E., Kotova V.Yu., Zavilgelsky G.B., Belogurov A.A. Nucleotide sequence of the gene (ard)sncoding the antirestriction protein of plasmid ColIb-P9. //1991. J.Bacteriol. 173:5887-5892.

20. Diorio C., Cai J., Marmor J., Shinden R., DuBow M.S. An E. coli chromosomal ars operon homolog is functional in arsenic detoxification and is conserved in gram-negative bacteria. // 1995. J. Bacteriol. 177:2050-2056.

21. Dixon D.A., Kowalczykowski S.C. The recombination hotspot X is a regulatory sequence that acts by attenuating the nuclease activity of the E. coli RecBCD enzyme. // 1993. Cell 73:87-96.

22. Doronina V.A., Murray N.E. The proteolytic control of restriction activity in E. coli K-12 //2001. Mol. Microbiol. 39:416-428.

23. Dryden D.T.F., Cooper L.P., Thorpe P.H., Byron O. The in vitro assembly of the EcoKl type I DNA restriction/modification enzyme and its in vivo implications. // 1997. Biochemistry 36:1065-1076.

24. Kruger D.H., Bickle T.A. Bacteriophage survival: multiple mechanisms for avoiding the deoxyribonucleic acid restriction systems of their hosts. // 1983. Microbiol. Rev. 47:345360.

25. Kuhnlein U., Arber W. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. XV. The role of nucleotide methylation in in vitro Bspecific modification. // 1972. J. Mol. Biol. 63:9-19.

26. Kulakauskas S., Lubys A., Ehrlich S.D. DNA restrictionmodification systems mediate plasmid maintenance. // 1995. J. Bacteriol. 177:3451-3454.

27. Kulik E.M., Bickle T.A. Regulation of the activity of the type IC EcoKllAl restriction enzyme. // 1996. J. Mol. Biol. 264:891-906.

28. Kusana K., Naito T., HandaN., Kobayashi I. Restrictionmodification systems as genomic parasites in competition for specific sequences. // 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11095-11099.

29. Mac Williams M.P., Bickle T.A. Generation of new DNA binding specificity by truncationof the type IC EcoDXXl hsdS gene. // 1996. EMBO J. 15:4775-4783.

30. Magee T.R., Kogoma T. Requirement of RecBC enzyme and an elevated level of activated.

31. RecA for induced stable DNA replication in Escherichia coli // 1990. J. Bacteriol.172:1834-1839.

32. Makovets S., Doronina V.A., Murray N.E. Regulation of endonuclease activity by proteolysis prevents breakage of unmodified bacterial chromosomes by type I restriction enzymes. // 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9757-9762.

33. Makovets S., Titheradge A.J.B., Murray N.E. ClpX and ClpP are essential for the efficient acquisition of genes specifying type IA and IB restriction systems. // 1998. Mol. Microbiol. 28:25-35.

34. McKane M., Milkman R. Transduction, restriction and recombination patterns in Escherichia coli. II 1995. Genetics 139:35-43.

35. Price C., Bickle T.A. A possible role for DNA restriction in bacterial evolution. // 1986. Microbiol. Sci. 3:296-299.

36. Price C., Lingner J., Bickle T.A., Firman K., Glover S.W. Basis for changes in DNA recognition by the Z?coR124 and EcoR 124/3 type I DNA restriction and modification enzymes. // 1989. J. Mol. Biol. 205:115-125.

37. Price C., Pripfl T., Bickle T.A. £coR124 and £coR 124/3: the first members of a new family of type I restriction and modification systems. // 1987. Eur. J. Biochem. 167:111115.

38. Roberts R.J. Restriction and modification enzymes and their recognition sequences. // 1987. Nucleic Acids Res., 15:rl89-r217.

39. Rosen B.P. Bacterial resistance to heavy metals and metalloids. // 1996. JBIC. 1:273-277. Rost B., Sanders C. Prediction of protein secondary structure at better than 70% accuracy // 1993. J. Mol. Biol. 232:584-599.

40. San Francisco M., Hope C., Owolabi J. Tisa L.S., Rosen B.P. Identification of the metalloregulatory element of the plasmid-encoded arsenical resistance operon. // 1990. Nucleic Acids Res. 18:619-624.

41. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-termination inhibitors // 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74:5463-5468.

42. Schouler C., Gautier M., Dusko Ehrlich S., Chopin M.C. Combinational variation of restriction modification specificities in Lactococcus lactis. II1998. Mol. Microbiol. 28:169-178.

43. Sharp P.M., Kelleher J.E., Daniel A.S., Cowan G.M., Murray N.E. Roles of selection and recombination in the evolution of type I restriction-modification systems in enterobacteria. // 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9836-9840.