Антирестрикционный белок ArdA, кодируемый трансмиссивной плазмидой IncI группы: мутационный анализ и изучение механизма действия

Некрасов, Сергей Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Антирестрикционный белок ArdA, кодируемый трансмиссивной плазмидой IncI группы: мутационный анализ и изучение механизма действия
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Антирестрикционный белок ArdA, кодируемый трансмиссивной плазмидой IncI группы: мутационный анализ и изучение механизма действия"

На правах рукописи

НЕКРАСОВ СЕРГЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

АНТИРЕСТРИКЦИОННЫЙ БЕЛОК Агс1А, КОДИРУЕМЫЙ ТРАНСМИССИВНОЙ ПЛАЗМИДОЙ 1пс1 ГРУППЫ: МУТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ И ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2006

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Института экспериментальной кардиологии Федерального Государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Москва.

Научный руководитель:,

кандидат биологических наук А. А. Белогуров Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАМН Г.Б. Смирнов кандидат биологических наук В.В. Кушниров

Ведущая организация: Биологический факультет Московского государственного университета им М.В. Ломоносова

Зашита состоится «21» декабря 2006 года в 11 часов на заседании диссертационного совета К 208.073.02 в ФГУ РКНПК Росздрава по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15а.

С, диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологи ФГУ РКНПК Росздрава.

Автореферат разослан «21» ноября 2006 года.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Венгерова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям, в природе между различными, в том числе и филогенетически отдаленными, группами бактерий и даже таксономическими царствами (бактерии и дрожжи, бактерии и растения) постоянно осуществляется (посредством природных векторов - трансмиссивных плазмид) фундаментальный биологический процесс - обмен генетической информацией, который может оказать существенное воздействие на геном бактериальной клетки. Часто эти трансмиссивные плазмиды, а следовательно и объемы, кодируемой ими информации, сравнимы по размеру с бактериальной хромосомой, что позволяет классифицировать их как дополнительные мини-хромосомы клетки. С другой стороны, нередко такие плазмиды могут функционировать как эффективные доноры или, наоборот, акцепторы важных генетических факторов (вирулентности, резистентности к антибиотикам и др.), которые способны обмениваться между геномами плазмид и бактерий с помощью специальных рекомбинационных механизмов. В этой связи большую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение механизмов, контролирующих эти потоки генетической информации и способных тем самым играть важную роль в регуляции скорости и эффективности прохождения процессов адаптации и, возможно, эволюции бактерий. Один из таких уже известных регуляторных механизмов может осуществляться посредством систем рестрикции-модификации. Эти системы распознают "чужую" ДНК по специфическому метилированию, играющему роль своеобразного молекулярного паспорта", а их активность ассоциируются в настоящее время с природным механизмом "иммиграционного контроля", который, по-видимому, осуществляет контроль потока генов между различными популяциями бактерий и способствует определенной генетической изоляции между отдаленными микроорганизмами. Тем не менее, известно, что многие большие трансмиссивные плазмиды способны с высокой эффективностью осуществлять перенос своей ДНК между бактериями с различными системами рестрикции-модификации 1-го типа. Этот феномен связан с тем, что трансмиссивные плазмиды кодируют антирестрикционные белки, названные Ard (alleviation of restriction of DNA) белками. Показано, что белки Ard способны эффективно ингибировать активность системы рестрикции-модификации 1-го типа (Belogurov and Delver, 1995; Murray et al., 2002; Wilkins, 2002). В настоящее время известны три типа Ard белков (ArdA, ArdB и ArdC), которые классифицированы на основании сходства их аминокислотных последовательностей и кодируются плазмидами IncI, IncFV, IncN и IncW групп (Belogurov et al. 2000; Wilkins, 2002). Кроме того, в результате определения полных нуклеотидных последовательностей различных бактериальных геномов в настоящее время обнаружено целое семейство (около SO) ArdA-подобных белков, которые, по-видимому, широко распространены среди бактерий и плазмид и наряду' с системами рестрикции-модификации 1-го типа играют важную роль в процессах

регуляции обмена генетическим материалом между бактериальными клетками. Настоящая работа посвящена мутационному анализу антирестрикционного белка ArdA, кодируемого трансмиссивной плазмидой Со11Ь-Р9 группы IncI, и изучению механизма его действия на системы рестрикции-модификации 1-го типа.

Цель и задачи работы. Цель данной работы являлось изучение механизма действия белка ArdA на системы рестрикции-модификации 1-го типа и идентификация его аминокислотных остатков, которые существенны для его активности. В соответствии с этим в ходе исследования были поставлены следующие задачи:

1. Картировать участки белка ArdA, существенные для его функционирования.

2. Идентифицировать аминокислотные остатки белка ArdA, которые существенны для его активности.

3. Изучить действие белка ArdA на активность системы рестрикции-модификации 1-го типа in vitro.

Научная новизна результатов. В данной работе показано, что в основе антирестрикционного действия белка ArdA лежит его способность блокировать взаимодействие комплекса рестрикции-модификации 1-го типа EcoKI со специфической немодифицированной ДНК. Идентифицирован участок антирестрикционного белка ArdA, содержащий аминокислотный остаток Phel64, который, по-видимому, играет ключевую роль в функционировании белка ArdA. Показано, что кодируемый трансмиссивными плазмидами белок ArdA значительно более эффективно ингибирует рестрикционную, чем модификационную активность системы рестрикции-модификации 1-го типа клетки-хозяина. Предполагается, что это свойство белка ArdA может иметь важное значение для успешной адаптации немодифицированной ДНК трансмиссивной плазмиды, входящей в новую бактериальную клетку.

Практическая ценность работы. Данная работа позволяет прояснить механизмы регуляции обмена генами между различными бактериями, осуществляемого в природе при помощи трансмиссивных плазмид. Полученные результаты важны для понимания путей и способов распространения генов вирулентности и резистентности к антибиотикам среди бактерий, что имеет важное значение для медицины и медицинской генетики.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: "Biocatalysis-2002" (Москва, 2002), "Ломоносов-2004" (Москва, 2004), "Biocatalysis-2005" (С.-Петербург-Кижи-Валаам, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисных сообщения.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения,

выводов и списка литературы, содержащего У// ссылок. Работа изложена на страницах. содержит^У рисунков и таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы стандартные методы молекулярной биологии и биохимии. Выделение ДНК плазмид, конструирование плазмид и другие генно-инженерные манипуляции проводили согласно методам, описанным в руководстве (Sambrook et al., 1989). Для продукции белка ArdA, в опытах in vivo и in vitro использовали ПЦР копии гена ardA трансмиссивной плазмиды группы IncI, Со11Ъ-Р9 (Belogurov et al., 1992), которые были клонированы в вектора серий pBluescriptll (Stratagene) и рЕТ (Novageix). Для анализа действия белка ArdA в экспериментах in vivo и in vitro в качестве модели была использована классическая система рестрикции-модификации (R-M) 1-го типа EcoKI. Антирестриционную активность ardí гена и его производных в клетках Е. coli оценивали при помощи высокочувствительной системы, основанной на измерении эффективности посева немодифицированного тест-фага X в клетках Е. coli, кодирующих систему рестрикции-модификации 1-го типа EcoKI. 5'-делеции гена ardA получали при помощи Ва!31 нуклеазы в векторе рТМ19, содержащем буферные фрагменты, и при помощи полимеразной цепной реакции. З'-делеции гена ArdA получали путем введения стоп-кодона при помощи сайт-направленного мутагенеза. Полимеразную цепную реакцию проводили с участием Р/и-полимеразы. Сайт-направленный мутагенез проводили с использованием системы сопряженного праймирования на однотяжевой форме плазмиды на основе вектора pALTER-1 (Promega). Однонитевую ДНК плазмид получали при помощи фага-помощника VSC (производного фага М13). Секвенирование проводили по методу Сэнгера, используя наборы фирмы Fermentas. Белковые образцы анализировали в 15 % полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Очистку рекомбинантных белков, содержащих на N-конце стандартную последовательность из шести гистидинов (His'Tag), осуществляли аффинной хроматографией на NiJ+-NTA колонке (Qiagen). Связывание белков со специфическим фрагментом ДНК-изучали при. помощи метода замедления подвижности фрагмента ДНК в 5 % полиакриламидном геле в условиях нативного электрофореза. В качестве субстрата' для изучения ингибирования EcoKI - рестрикции in vitro использовали немодифицированную ДНК плазмиды pBR322. Активность репрессированного Т7 промотора измеряли в клетках E.coli, используя систему на основе вектора рКК232-8 (Brosius, 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Картирование области белка Аг<1А, существенной для его функционирования с помощью тонкого делециониого анализа.

На первом этапе исследования был проведен делеционный анализ белка АпЗА с целью выявить область, существенную для его функционирования. Все делении были сделаны при помощи нуклеазы Ва131 и содержали на своем 5* конце (в рамке считывания) стандартную короткую последовательность T7•Tag, которая может обеспечить хороший уровень синтеза многих гибридных белков. Было показано, что М-концевая часть белка Аг<1А длиной 81 аминокислотный остаток не существенна для его антирестрикционной активности и только следующая деления в 103 аминокислотных остатка полностью блокирует активность белка АпЗА (рис.1).

ВатШ Лсс1 Лла1 ЯаеП £соМ АнТИреСТрИКЦИОННаЯ

II 1 I II активность

■■■■■ЦВННН 2000

Д62 IT7Ш ■ННШНН 1600

дб7 гпша нманннн шо

А74 IT7gl ^^■навн 1400

ASI Д7НП ^ИНН! 1600

АЮЗ OS |нвнн 2

Д1П гтал i ■■■■■ 2

вектор 1

Рис.1 Делеционное картирование участков белка ArdA, ответственных за антирестрикционную активность с помощью нуклеазы Ва!31, Вверху приведена рестриктная карта гена ardA. Линии, расположенные ниже, показывают делеционные фрагменты гена ardA, полученные в результате делегирования его 5'-части. Справа приведены данные об антирестрикционной активности белка ArdA и его делеционных производных. Антирестрикционная активность белка ArdA in vivo определялась как отношение эффективности посева немодифицированного тест-фага X на ЕсоКЬрестриктирующем штамме AB2463(DE3)/pLysS, содержащем плазмиды, кодирующие ген ardA или его мутантные производные, к эффективности посева тест-фага X на том же штамме, содержащем векторную плазмиду pBluescriptII KS+. Антирестрикционная активность равная 1 означает отсутствие заметной ArdA активности.

Расстояние между концами делеций, где происходит потеря функциональной активности белка ArdA, составляет довольно протяженный участок длиной в 22 аминокислотных остатка. Поэтому с целью уточнения N-концевой функциональной области белка ArdA был проведен тонкий делеционный анализ с помощью ПЦР. Для этого были сконструированы делеционные производные белка ArdA, несущие делеции с шагом в 1-2 аминокислотный остаток на участке с

координатами 89-EAYRLWVE-96. Было показано, что функциональная активность сохраняется у делецирнного белка ArdA,' начинающегося с аминокислотного остатка А1а90 и исчезает при делеции двух последующих аминокислотных остатков А1а90 и Туг91 (рис.2).

В отличие от делений N-конца белка ArdA, его С-конец очень чувствителен к делетированию. На рис. 2 показано, что делеция 4-х С-концевых аминокислотных остатков, полученная путем введения стоп-кодона TGA в позиции 163, приводит к полной потере антирестрикционной активности белка ArdA.

Таким образом, при помощи тонкого делеционного анализа мы показали, что область белка ArdA, существенная для его антирестрикционной активности, локализуется исключительно в С-концевой части белка ArdA с аминокислотного остатка А90 по R166 включительно. Эту область мы назвали мини-ArdA (рис. 2).

2. Идентификация аминокислотных остатков белка ArdA, которые существенны для его функционирования.

Вышеприведенный делеционный анализ показал, что С-конец белка ArdA может быть существенен для его активности. Для подтверждения этой гипотезы каждая из пар VF и RR при помощи сайт-направленного мутагенеза была заменена на два аланина (АА). В отличие от замен R165A+R166A, двойная мутация V163A+F164A полностью подавляет антирестрикционную активность белка ArdA. Очевидно, что аминокислотный остаток F164 играет основную роль в этой паре, так как в отличие от одиночной замены VI63А, мутация F164А сильно подавляет ArdA активность (рис.2).

Отметим также, что замена этого ключевого аминокислотного остатка F164 на V умеренно снижает антирестрикционную активность белка ArdA. Эти результаты позволяют предположить, что высокая гидрофобность F164 может играть существенную роль при взаимодействии белка ArdA и системы рестрикции-модификации (R-M) 1-го типа.

Это предположение подкрепляется наблюдением, что активность белка ArdA толерантна к мутациям остатка F164 при его замене на гидрофобные или ароматические аминокислотные остатки и возрастает в ряду V, I, L, W и Y (рис.2). Так как эта пара гидрофобных аминокислотных остатков V163 и F164 существенна для антирестрикционной активности белка ArdA и консервативна среди 17 членов семейства ArdA белков, представленных на рис. 3, мы назвали этот участок VF-мотивом.

Мутации Эффектив- Антирестрик

ность ционная

посева тест активность6

фага J.'

MSWAPAVYVGTWHKYNCGSIAGRWFDLTTFDDERDFFAA ardA* 1.0 2000

CRALHQDEADPELMPQDrECFPíaJMASECHINWAWVEGFRQAKDBCC *

EEAYRLWVEDTGETDFDTFRDAWWGEADSEEAFAVEFASDTG

Е89-> ДЕ89 1.0 2000

А90-> (мини ArdA) ДА90 5х10-1 1000

R92-> ДН92 5х10"* 1

L93-> ДЬ93 5х10"4 1

Y91A SxlO"3 10

Антирестрикционкый S92A 5x1o"1 1000

мотив L93A ЗхЮ"1 600

<г........... V94A 1х10~а 200

** * V95A 8х10~1 1600

LLADVPETVAL.YFDYEAYAKDLFLDSFTFIDGHVFRR-166

<-H(tg«163) ТСА163 SxlO'4 1

АА KR->AA 5х10"1 1000

ДА VF->AA 1х10"3 2

А F164A 5х10~э 10

А V163A ЗхЮ-1 600

А Н162А ЗхЮ"1 600

А G161A 5х10-1 1000

А D160A 8х10-1 1600

V F164V lxlO*1 200

I PX64I Ixl0'J 200

L F164L 2xl0_1 400

W F164W 5xl0_1 1000

X F164Y 7xl0_1 1400

вектор 5xl0~4 1

Рис.2 Эффект делеций и мутаций белка ArdA на его антирестрикционную активность m vivo. Звездочками отмечены аминокислотные остатки, существенные для антирестрикционной активности, область мини-ArdA подчеркнута.

* Эффективность посева ^модифицированного тест-фага X определялась как величина отношения титра фага на рестриктирующем штамме к титру фага на изогенном нерестриктирующем штамме ВА556.

Антирестрикционная активность белка ArdA in vivo определялась как отношение эффективности посева немодифщщрованного тест-фага X на рестриктирующем штамме, содержащем плазмиды, кодирующие ген ardA или его мутантные производные, к эффективности посева тест-фага X на том же штамме, содержащем векторную плазмиду pBluescriptlI KS+. В качестве рестриктирующего штамма был использован штамм E.coli AB2463(DE3)/pLysS, кодирующий систему рестрикции-модификации 1-го типа EcoKI.

Роль других аминокислотных остатков, расположенных на С-конце ArdA (DI60, G161, Н162, R165 и R166) не так существенна для антирестрикционной функции, так как их аланиновые замены слабо влияют на активность белка ArdA (рис.2).

Мы также провели аланиновые замены каждого из пяти аминокислотных остатков региона 91-YRLWV-95, примыкающего к N-концевой границе мини-ArdA. Было показано, что из пяти мутаций только одна Y91A существенно влияет на ArdA активность (рис. 2). Можно

IncI 90-AgRLiVEDTGETjii:FDT. ,|>RDAiSiGlyi&SEEA|AVEiASii'TG

YERPE A|I^AEYTGEC|YDA. . ¡^DAjfaGS^SEEj^QE^IiNG

STAAU -WjgSSfiEELLENKiS......|>1НС0|3(^ЙЗМЕ®®«*Ш*е!|тв

LISMO WiSSpELLESKH......fellcSsgcgsMEbfAYY^i-G

ENTFA Hg*SSSEELSEHQK......¡jllBHSjgCftDMl^iftRyg^^TG

ENTFA FgNSlEEMVEHLS......$1VjSPSC^DMSjDj^YYjgESiiAG

clodi hgseieelsehqg......jpxips|jlcs?mei®lrv|l|gete

PSEPU AgAA^TAYHGGSVTEDD.lpAAgRGHYSsEKAfAEESCCg. .

XANAX AIDA|CEVEGEEJJ'VDT. .|RERSGlFilSW^:iAEHHAfti;TA

NITEU L|DH|3GDLEEARTAA. . .KENgCGCYSSLAljlAEEgTgii- •

LEGPH G£ALgCDYSVEDAQTM. .EiDHfQGCYftSEvijlARClgtj'jjcY

LEGPA LGAEgFSYYSIE|CiAERM.|iENiHGAY)BSEVgfARAggD5. Y

AGRTU DBAASVSHFGSV'EYAKEEIGNNI^GVH^SFRAIAEEKAPEML

SYNSP AjiAAgYKCYDNLgN. . . .EEDYHGEiYESEQjjgVYDKfE.QTG

ANASP AlAA^YEYDSSEASVED.KtH^S^SSEOlJEVYDOiiEQQG

Антирестрикционный мотив VF-мотив

inci ljjapjjpet.. ^^ш&хашз®» . .|tiiog----WSR.. R-166

IncN LfiNElPES . . JiARjaDlVAtABDliglGD ■ ■ SfSfiHfiG----HjggNMTC

IncFV LlgNfcgPgP. .iRS®e|>EIAiABDiaSSG. .gV^EgG----iYlgS. .N

YERPE I«St$PgP• • BRSi|M№S®ISSG. . gVfHgG.... XS38G. . N

STAAU eajGSSPSN. . EQN^afeSfiG^DlEgEG. N^LgTSH.... GJKEYCQ

LISMO ЧМ». .UQM5a®aAMGBMiE2NG.NMTSH. . . .GjffiEYCH

ENTFA ASGBSPAS. .|'QNiSDiQA5|GfepBDSSG.TgISTSH. .

entfa aggesjpth. .eqn^i;dx;ea5£gs.di|eieg. n^l^tsr____gj?gelce

CLODI A^GjEVPAS. •gQNifJiD|E;s|G|!lDSE|sG.TilSTSH----G^gEITH

T7 Ocr lOl-LjSjNiE^EE. .JfEE&Efc...............................

PSEPU . j5H^GDE^FHP®3g(50.AWiCI>JSH. TgvgQpG----YjSfgLSSW

XANAX LKEt>3?E6N. . KRR^lD^SgGgDgRTGG. EAYESRG____HjilW ■ SH

NITEU . TTOiPVN. . ^Y£iftfiR^RDfEgNGDVgTEETGWEEVHj.SW . NH

LEGPH . AHQJPbS . . gSC^f DfkA|Ai!D£|5sD. YCS^KFG. RQAYpgS . IY

legpa ymnasprd .. • yIs^eadg . qth^s . s y

AGRTU SAHp|KADHPgSQlSfDfEAvSAjsiDSRHSA. .AVELjPEG. .Vf&jfpV. .

SYNSP Q-SEA|EKAGLDSFXiD|'fiK4AHD№|ND. FgSAEISYNKVY|;f!S . RH

ANASP LjKNfiECMGIPSF^IjPl&lAiiDSitSjDS. X&BEiSYKKVYjis. RH

Рис.3 Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей семейства ArdA белков. Анализ проведен для С-концевой части белка с координатами 90-166 (область мини - ArdA), используя базу данных Pfam. Серым цветом выделены сходные (в однобуквенном коде (A, S, Т; V, I, L, М + F, W, Y; D, Е, N, Q; К, R, Н; Н, Y) и идентичные аминокислотные остатки антирестрикционных белков. Звездочками отмечены аминокислотные остатки существенные для антирестрикционнон активности. Подчеркнуты - антирестрикционный мотив (консервативный для всех известных плазмидных антирестрикционных Ard белков и для фагового антирестрикционного белка Осг) и консервативные аминокислотные остатки (VF-мотив), существенные для антирестрикционной активности. Виды бактерий и номера последовательностей в GenBank представлены ниже: Incll (Incll плазмида ColIb-P9, Q51598); IncN (IncN плазмида R46, Q52021); IncFV (IncFV плазмида F0lac, Z34467); YERPE (плазмида pMTl, Yersinia pestis, 068792); STAAU {Staphylococcus aureus, Q932I1); LISMO (Listeria sp., Q8Y811); ENTFA (коньюгативный транспозон Tn916, Enterococcus faecalis, Q47730 и Q833Q8); CLODI (коньюгативный транспозон Tn5397, Clostridium difficile, Q84F51); T7 Ocr (антирестрикционный мотив белка Ocr (0.3 ген), бактериофаг Т7, Р03775); PSEPU (Pseudomonas putida, Q88KJ5); XANAX (Xanthomonas axonopodis, Q8PNK0); NITEU (Nitrosomonas europaea, Q82XK5); LEGPH (Legionella pneumophila, штамм Philadelphia, Q5ZWV9); LEGPA {Legionella pneumophila, штамм Paris, Q5X2I1); AGRTU {Agrobacterium tumefaciens, Q8UG51); SYNSP (плазмида pSYSX, цианобактерия Synechocystis sp., Q6YRS0); ANASP (плазмида pCC7i20gamma, цианобактерия Л/иг2>аелд sp. Q8YK88).

предположить, что ароматические аминокислотные остатки могут играть важную роль во взаимодействии между ArdA и R-M системы 1-го типа. Поэтому в следующей серии опытов мы изучили эффект аланиновых замен всех ароматических аминокислотных остатков, локализованных в мини-ArdA области.

Таблица 1. Влияние замен ароматических и отрицательно заряженных аминокислотных остатков, локализованных в мини-ArdA области, на активность белка ArdA in vivo.

Плазмида Мутации гена ardA Эффективность посева тест-фага А, Антирест-рикционная активность

рАВ763 ardA+ 1,0 2000

вектор ardA" 5 х 10"* 1

His-ArdA his-ardA 1,0 2000

рАВ1749 F103A Зх 10"1 600

рАВ1787 F106A 1 х 10"' 200

рАВ1748 W110W111AA 2 х 10"' 400

PAB1751 F120 А 5 х 10"' 1000

рАВ1752 F124A 5 х 10'1 1000

рАВ1828 Y141A 4x10"' 80

рАВ1829 F142A 5 х 10"J 10

рАВ1788 Y144 А 5 х 10"' 1000

рАВ1640 Y147 А 3 х Ю-1 600

рАВ1830 F152 А 1 х 10"' 200

рАВ1790 F156A 3 х 10"' 600

рАВ1791 F158 А 2x10"' 400

рАВ1128 DI 27 V 7x10"' 1400

PAB1132 D133V 5 х 10"1 1000

рАВ1134 E136A 8х 10"' 1600

рАВ1138 D143A 7x10'' 1400

РАВ1139 DI 50V 7x10"' 1400

рАВ1140 DI 54 V 8 х 10"' 1600

Анализ этой серии аланиновых мутаций (13 ароматических аминокислотных остатков) показал, что только две мутации У141Л и особенно Р142Л в значительной степени подавляют

антирестрикционную активность белка ArdA (табл. 1). Возможно, что эффект этих мутаций связан с тем, что эти два ароматических аминокислотных остатка Y141 и F142 входят в состав "антирестрикционного", мотива который, как было показано ранее (Belogurov and Delver, 1995), консервативен для всех известных плазмидных антирестрикционных белков Ard и антирестрикционного белка Oer бактериофага Т7 и, по-видимому, может играть определенную роль во взаимодействии между антирестрикционными белками и R-M системами 1-го типа.

Так как белок ArdA, подобно антирестрикционному белку Oer, обладает избытком отрицательно заряженных аминокислотных остатков, и некоторые из них могут быть значимы для антирестрикционной активности, то в следующей серии экспериментов мы изучили эффект аланиновых замен шести отрицательно заряженных аминокислотных остатков (D127, D133, Е136, D143, D150, D154, D160), расположенных на С-конце и в "антирестрикционном" мотиве области мини-ArdA. Данные, приведенные на рис. 1 и в таблице 1, показывают, что аланиновые и валиновые замены этих отрицательно заряженных аминокислотных остатков не вызывают значительного ослабления антирестрикционной активности белка ArdA.

Таким образом, мутационный анализ белка ArdA обнаружил, что антирестрикционная активность зависит, как минимум, от четырех ароматических аминокислотных остатков Y91, Y141, F142 и F164, которые консервативны для ArdA белков (рис. 3) и расположены в мини-ArdA области. Однако заметное изменение подвижности мутантных ArdA белков Y91A, Y141A и F142A на электрофорезе в денатурирующих условиях в присутствии SDS и низкая растворимость мутантного белка Y91А по сравнению с нативным белком ArdA и его мутантом F164A может быть, по крайней мере, частично связано с влиянием этих трех замен (Y91A, Y141A и F142A) на фоддинг белка ArdA (рис.4).

kjma п64а f,64y v91a y14ia п42а v163a Рис.4. Идентификация 358-меченных

. : мутационных производных белка ArdA .■„■•- ■,.■,. вклетках E.coli с использованием сис-

:. - темы транскрипции фага Т7 (раство-

ArdA "* ". . -'"'" 1,11,1 . . '"I1"1 i.i »,. римые фракции). Гель-электрофорез в де-

натурирующих условиях. Визуализация : ' "fJi-'-r-1; при помощи авторадиографии. Стрелка указывает положение нативного белка ArdA.

3. Изучение взаимодействия [358]-меченных белка ArdA и EcoKI метилтрансферазы in vitro.

Можно предположить, что подобно хорошо изученному белку Oer бактериофага Т7 (Walkinshaw et al., 2002), плазмидный белок ArdA может" Икгибировать активность R-M системы 1-го типа путем прямого белок-белкового взаимодействия. Причем показано, что белок Oer способен специфически связываться с очень высокой эффективностью (Kj slO"10) не

только с полной К.-М системой 1-го типа (ТЬМзЗ), но и с метилтрансферазой (МгБ), которая в отличие от Я-М системы не содержит субъединиц рестрикции К, состоит из одной субъединицы узнавания Б и двух субъединиц модификации М и может функционировать в бактериальной клетке независимо от Я-М системы (Огуёеп ег а!., 1997).

(а)

Ni-NTA связанный His-ArdA His-ArdA His-Ocr His-Ocr

экстракт His-ArdA Мтаза Мтаза His-Ocr Мтаза

М-*. His-ArdA-*

(б)

-Осг

NI-NTA связанный His-Мтаза His-Мтаза His-Мтаза His-Мтазс

экстракт His-Мтазг ArdA TrxA-ArdA Oer ArdA TrxA-ArdA Oer

М-S-

TrxA-ArdA -ArdA-

Рис. 5. Взаимодействие антирестрикционных белков ArdA и Oer с метилтрансферазой EcoKI in vitro, (а) Связывание His-ArdA и His-Ocr с нативной метилтрансферазой (Мтаза) EcoKI. Ni-NTA колонки с иммобилизованными ["Замеченными His-ArdA (трек 2) и His-Ocr (трек 6) были загружены экстрактом, содержащим нативную ['^-меченную метилтрансферазу (трек 4) и промыты 5 мМ имидазолом. Связавшиеся белки элюировали 1М имидазолом, анализировали с помощью электрофореза в денатурирующий условиях и визуализировали при помощи авторадиографии (треки 3 и 7, соответственно), (б) Связывание His'Tag-содержащей метиятрансферазы EcoKI с ArdA и Oer, Ni-NTA колонки с иммобилизованной Г38]-меченной метилтрансферазой (трек 2) были загружены экстрактами, содержащими [ S]

-меченный

нативный ArdA (трек б), TrxA-ArdA (трек 7) и нативный Oer (трек 8) и промьггы 5 мМ имидазолом. Связавшиеся белки элюировали 1М имидазолом, анализировали с помощью электрофореза в денатурирующий условиях и визуализировали при помощи авторадиографии (треки 3, 4 и 5, соответственно). Стрелки указывают положение ArdA, His-ArdA, TrxA-ArdA, Oer белков, субъединицы модификации М и субъединицы узнавания S метилтрансферазы EcoKI.

Для подтверждения этой гипотезы мы исследовали in vitro взаимодействие между 35S-меченными белком ArdA и EcoKI метилтрансферазой, которая может играть в этом случае роль модели R-M системы 1-го типа. В этих опытах мы использовали белок ArdA (His-ArdA), содержащий стандартный N-концевой His«Tag, который способен связываться с Ni-NTA колонкой и активен in vivo (табл. 1). На рис.5а показано, что белок His-ArdA, предварительно связанный с Ni-NTA колонкой (трек 2), способен образовывать комплекс с нативной EcoKI метилтрансферазой (трек 3). В этих же условиях, активный in vivo белок His-Ocr, предварительно связанный с Ni-NTA колонкой (трек б), также связывался с нативной EcoKI метилтрансферазой (трек 7).

В обратной ситуации, нативный белок ArdA способен связываться с активной m vivo и in vitro EcoKI метилтрансферазой, содержащей короткий His'Tag на N-конце субъединицы метилирования М (рис 56, трек 3). Аналогично, мы зафиксировали взаимодействие нативного белка Oer с His•Tag-coдepжaщeй EcoKI метилтрансферазой (рис.5б, трек 5). Таким образом, подобно белку Oer, белок ArdA способен специфически связываться с EcoKI метилтрансферазой и, по-видимому, N-концевые His-Tag-модификации этих белков не влияют на их взаимодействие.

4. Определение агрегатного состояния белка ArdA.

Для определения агрегатного состояния ArdA в растворе, [358]-меченный нативный ArdA был проанализирован при помощи гель-фильтрации на Sephacryl SI00 колонке с последующим анализом фракций в денатурирующем электрофорезе. На рис.б показано, что ArdA элюируегся с колонки одним пиком с массой приблизительно 44 кДа, что примерно соответствует молекулярной массе димера белка ArdA. Эти данные свидетельствуют, что подобно белку Oer, белок ArdA даже при низкой концентрации 50 нМ, существует в растворе преимущественно как димер.

<• BSA

Рис.б. Определение агрегатного состояния белка АМА в растворе при помощи гель-фильтрации на Йер11асгу1 8 100. Образец, содержащий 338-меченный Агс!А и белки - маркеры, элюировался с линейной скоростью 13 см/ч. Собранные фракции анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях с последующей визуализацией окрашиванием Кумасси и при помощи авторадиографии.

М(цДа)

Soybean

trypsin

inhibitor

1100

1200

1300

1400

1500

1600

Объем элюента (мкл)

5. Белок ArdA блокирует способность R-M системы 1-го типа связываться со специфической немодифицнрованной ДНК.

Известно, что антирестрикционный фаговый белок Oer, содержащий избыток (34) отрицательно заряженных аминокислотных остатков, способен связываться с R-M системой 1-го типа и, мимикрируя ДНК, вытеснять ее из комплекса с R-M системой, тем самым подавляя как рестрикционную, так и модификационную активность системы (Atanasiu et al., 2002; Walkinshaw et al., 2002). Мы предположили, что белок ArdA, который также содержит большой избыток (25) отрицательно заряженных аминокислотных остатков, действует на R-M систему 1-го типа таким же образом, как и белок Oer.

Для проверки этой гипотезы мы использовали метод замедления подвижности ДНК в геле при взаимодействии с белками в условиях нативного электрофореза. Понятно, что эти эксперименты наиболее информативны в следующем диапазоне концентраций: [ArdA димер] или [Oer димер] » [метилтрансфераза] + [R-M комплекс] » [специфическая немодифицированная ДНК]. В качестве специфической немодифицированной ДНК использовался двухтяжевый ПЦР фрагмент длиной 257 п.н., содержащий сайт узнавания EcoKI R-M системы 5'-AACCCACTCGWC-3'.

На рис.7 (трек 2) показано, что в присутствии EcoKI метилтрансферазы и R-M системы примерно в эквимолярных концентрациях (50 нМ), которые близки к концентрациям этих белков ш vivo, радиоактивно меченный специфический фрагмент ДНК, содержащий сайт узнавания EcoKI R-M системы, локализуется в виде двух полос, которые соответствуют комплексам ДНК с метшпрансферазой (M2S) и с полной R-M системой (R2M2S).

В опытах по титрованию EcoKI метилтрансферазы и R-M комплекса белком ArdA было обнаружено, что белок ArdA способен блокировать замедление подвижности ДНК EcoKI метилтрансферазой (т.е. взамодействие метилтрансферазы со специфической ДНК) вплоть до концентрации 0,5 мкМ (рис. 7а, треки 3,4). Этот результат указывает на то, что, по-видимому, сродство белка ArdA к метилтрансферазе не так высоко, как в случае белка Oer (K43IOO пкМ). Однако белок ArdA демонстрирует высокую эффективность в отношении R-M комплекса и полЬса,"' соответствующая связыванию R-M комплекса со специфическим фрагментом ДНК, наблюдалась только в случае, когда концентрация ArdA была меньше либо равна концентрации R-M комплекса (примерно 50 нМ) (рис. 7а, треки 8-11). Эти наблюдения указывают на то, что сродство белка ArdA к R-M системе гораздо выше, чем к метилтрансферазе.

Концентрация белка ArdA, мкМ

О 2.0 1.0 OS 0.2S 0.12 0.06 0.03 0.02 0.0!

R-M ^ О» «* -¡о» Щ>

комплекс

1 2 3 4 5 6 18 9 ю 11 12

(б) Концентрация бетка His-Ocr, мкМ

О 20 1.0 0.5 0.23 0.12 0.06 0 03 0.02 0 01

I 2345 678 9 10 И

Концентрация белка ArdA(F 164А), мкМ

О 4.0 20 10 05 0.25 0.12

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 7. Действие белка ArdA, его мутанта ArdA(F164A) и белка Oer на взаимодействие EcoKI метилтрансферазы и R-M комплекса со специфической немодифицированной ДНК. [32Р]-меченный фрагмент немодифицированной ДНК (257 п.н.) инкубировали с К coli экстрактами, содержащими EcoKI метилтрансферазу и R-M комплекс в присутствии очищенных белков (а) ArdA, (б) His-Ocr и (в) ArdA(F164A) в диапазоне концентраций от 0 до 2 мкМ (димер). Смесь анализировали в условиях нативного электрофореза в 5 % полиакриламидном геле с последующей визуализацией при помощи авторадиографии. Стрелки указывают положения специфического фрагмента ДНК, связанного с метилтрансферазой и R-M комплексом.

В подобных экспериментах с фаговым белком Oer мы не наблюдали взаимодействия специфического фрагмента ДНК с метилтрансферазой и R-M комплексом в диапазоне концентрации 0,12-2 мкМ (димер) (рис. 76, треки 3-7). Эти результаты соответствуют известным данным, что белок Oer связывается с ЕсоК! метилтрансферазой и R-M комплексом с одинаковой эффективностью (Atanasiu et al., 2002).

В опытах по замедлению специфической ДНК в геле было также показано, что мутантный белок ArdA который содержит замену F164A и теряет способность к антирестрикционной активности in vivo (рис. 2), не способен также блокировать связывание R-М комплекса и метилтрансферазы со специфической ДНК in vitro. В этом случае взаимодействие специфической ДНК с R-M комплексом и метилтрансферазой наблюдается даже при высоких концентрациях мутантного ArdA (1,0-4,0 мкМ) (рис. 7в, треки 3-8).

Таким образом, эти данные свидетельствуют в пользу того, что антирестрикционная активность белка ArdA действительно связана с его специфическим взаимодействием с R-M комплексом 1-го типа и аминокислотный остаток Fl64 белка ArdA действительно играет ключевую роль в этом взаимодействии. В результате этого взаимодействия, по-видимому, как и в случае фагового белка Oer, нарушается связывание R-M комплекса со специфической ДНК.

6. Белок ArdA способен ингибировать EcoKI-рестрикцию немодифицированной ДНК in vitro.

Дополнительное подтверждение этим выводам были получены нами в опытах по изучению способности белка ArdA ингибировать EcoKI-рестрикцию специфической немодифицированной ДНК in vitro. Опыты были поставлены при тех же концентрациях EcoKI R-M комплекса, что и выше приведенные эксперименты по замедлению подвижности ДНК в геле. В качестве субстрата использовали немодифицированную ДНК плазмиды pBR322, содержащую два сайта узнавания EcoKI системы.

_ релвксированная р8Ю22 -ШНеПНаяр£Я322

сверхскрученкаярВ11322 -

Рис. 8 Рестрикция немодифицированной ДНК плазмиды pBR322 экстрактами E.coli, содержащими EcoKI R-M комплекс и кофакторы (SAM, ATP и Mg2+) в течение 20 секунд (трек 5) и в течение 1 минуты (трек б), при отсутствии: кофакторов, R-M комплекса, метилтрансферазы и субъединиц рестрикции R (треки 1,2,3 и 4, соответственно) в течение 10 минут. Трек 7, pBR322 расщеплялась до линейной. формы рестриктазой HindHI. Стрелки указывают на сверхскрученную и релаксированную формы pBR322.

На рис.8 показано, что в контрольном опыте в присутствии кофакторов полная ЕсоК1 К-М система расщепляет немодифицированную ДНК рВЮ22 до линейной формы за одну минуту (рис. 8, трек 6). В отсутствие кофакторов, Я-М комплекса, метилтрансферазы и субъединиц рестрикции реакция рестрикции специфической немодифицированной ДНК не наблюдалась даже через 10 мин (рис. 8, треки 1, 2, 3 и 4, соответственно).

В опытах по титрованию ЕсоК1 Я-М комплекса белком Аг<1А было показано, что Агс1А подавляет ЕсоК1-рестрикцию немодифицированной плазмидной ДНК при концентрации 0,25-2 мкМ (рис.9а, треки З-б). Как и ожидалось, мутант Р164А был не способен ингибировать рестрикционную активность Я-М комплекса даже при высоких концентрациях мутантного белка (1,0-4,0 мкМ) (рис. 96, треки 3-8).

Рис. 9. Действие белка ArdA и его мутанта ArdA(F164A) на ЕсоК1-рестрикцию немодифицированной ДНК плазмиды pBR322. Немодифицированную сверхскрученную pBR322 (трек 1) инкубировали в течение 1 минуты в реакционной смеси, содержащей R-M комплекс и кофакторы, в присутствии очищенных белков (a) ArdA и (б) ArdA(F164A) в диапазоне концентраций от О до 2 мкМ (треки 2-11). Реакции останавливали добавлением равного объема смеси фенол-хлофроформ. После экстракции водную фракцию анализировали при помощи электрофореза в 0,8 % агарозе, в присутствии бромистого этидия (0,5 мкг/мл).

Полученные результаты соответствуют результатам опытов in vivo и экспериментам по замедлению подвижности ДНК в геле и свидетельствуют о том, что в основе антирестрикционного действия белка ArdA по-видимому, лежит его способность блокировать взаимодействие R-M комплекса 1-го типа со специфической немодифицированной ДНК.

7. Белок ArdA более эффективно ингибирует рестрикционную, чем модификационную активность EcoKI-системы in vivo.

■ ■Следует отметить, в опытах по замедлению подвижности ДНК в геле наблюдается заметное отличие между действием антирестрикционных белков ArdA и Oer, так как в отличие от Oer, белок ArdA, по-видимому, обладает значительно более высоким сродством к EcoKI R-M комплексу, чем к метилтрансферазе. Подтверждение этого наблюдения мы получили в опытах in vivo. Было показано, что белок ArdA, в отличие от Oer, при низком уровне экспрессии их генов в Т7 системе (в присутствии плазмиды pLysS, кодирующей ингибитор Т7 РНК-полимеразы), эффективен только против ЕсоЮ-рестрикцяи, но не против EcoKI-модификации (табл. 2). В этих условиях белок ArdA незначительно снижал EcoKI модификацию (до 70% от исходного уровня), в то время как белок Oer практически полностью блокировал (до 0,1 %) эту активность. Таким образом, кодируемый трансмиссивными плазмидами белок ArdA способен значительно более эффективно ингибировать рестрикционную, чем модификационную активность R-M системы 1-го типа клетки-хозяина. Это свойство белка ArdA, связанное с его

Таблица 2. Эффект уровня экспрессии генов ardA и осг на эффективность EcoKI рестрикции и модификации._

Гены под контролем репрессированного Т7 промотора* Активность Т7 промотора (в 1ас единицах), контролируемого плазмидой рЬуяЯ6 Эффективность посева тест-' фагаХ Антирест-рикционная активность Эффективность модификации ДНК" (%)

ardA 0,03 (рЬуэБ) 1.0 2000 70

0,5 (вектор) 1.0 2000 0,5

осг 0,03 (рЬу58) 1,0 2000 0,1

0,5 (вектор) 1,0 2000 0,1

his-ocr 0,03 (рЬуэБ) 1,0 2000 0,1

pBluescriptlI KS 0,5 (вектор) 5 х 10"4 1 HT

* Использовались плазмиды, содержащие гены ardA и осг под контролем репрессированного Т7 промотора (в присутствии совместимой плазмиды pLysS, кодирующей ингибитор Т7 РНК полимеразы, и в отсутствии индуктора IPTG). Вектор pBluescriptlI KS(+) использовали как контроль.

6 В качестве вектора использовали совместимую плазмиду pACYC184.

'Эффективность EcoKI модификации (специфического метилирования) потомства немодифицированного фага X определяли при размножении фага в течение трех - четырех циклов на штамме AB2463(DE3), который кодирует EcoKI R-M систему и несет плазмиды, содержащие гены ardA, осг или his-ocr соответственно под контролем в разной степени репрессированного Т7 промотора (± плазмида pLysS и без индуктора IPTG). Эффективность EcoKI модификации полученного потомства определяли как отношение титра фага на способном к EcoKI рестрикции штамме АВ1157 к титру фага на безрестрикционном штамме ВА556. HT, не тестировалась.

способностью взаимодействовать с метилтрансферазой и полной Я-М системой с разной эффективностью, может дать вполне определенное преимущество трансмиссивным плазмидам, кодирующим Аг(!А белки, при вхождение в новую бактериальную клетку при конъюгации, так как эффективно подавляя рестрикцию 1-го типа, которая очень распространена среди бактерий, плазмида, тем не менее, сохраняет возможность модифицировать свою ДНК с помощью хозяйской метилтрансферазы и, следовательно, получить вполне определенную гарантию на стабильное существование в дальнейшем.

выводы

1. При помощи тонкого делеционного картирования антирестрикционного белка ArdA локализована его минимальная область (мини-ArdA), существенная для его функционирования. Эта область локализована в С-концевой части белка ArdA и состоит из 77 аминокислотных остатков (с 90-го по 166 аминокислотный остаток включительно).

2. При помощи сайт-направленного мутагенеза белка ArdA идентифицирован С-концевой участок антирестрикционного белка ArdA, содержащий аминокислотный остаток Phel64, который, по-видимому, играет ключевую роль в функционировании белка ArdA in vivo. Показано, что ароматические аминокислотные остатки Туг91 и Phel42, локализованные в мини-ArdA области, также существенны для активности белка ArdA in vivo.

3. Показано, что в основе антирестрикционного действия белка ArdA лежит его способность блокировать взаимодействие комплекса рестрикции-модификации 1-го типа со специфической немодифицированной ДНК.

4. В опытах in vitro показано, что аминокислотный остаток Phel64 белка ArdA играет ключевую роль во взаимодействии белка ArdA с комплексом рестрикции-модификации 1-го типа и его замена на аланин приводит к полной потере способности белка ArdA блокировать взаимодействие комплекса со специфической ДНК и ингибировать специфическую рестрикционную активность комплекса в отношении немодифицированной ДНК.

5. Показано, что белок ArdA значительно более эффективно ингибирует рестрикционную, чем модификационную активность системы рестрикции-модификации 1-го типа клетки-хозяина. Предполагается, что это свойство белка ArdA может иметь важное значение для успешной адаптации немодифицированной ДНК трансмиссивной плазмиды при вхождении в новую бактериальную клетку в процессе конъюгации.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Nekrasov, S. V., Agafonova, О. V., Belogurova, N. G., Delver, E. P. and Belogurov, A. A. (2006) Plasmid-encoded antirestriction protein ArdA can discriminate between type I methyltransferase and complete restriction-modification system. J. Mol. Bio!., 364

2. Дельвер E. П., Собенникова M. В., Белогурова H. Г., Некрасов С. В., Колесникова М. Д., Агафонова О. В., Белогуров А. А., (2002) Мутационный анализ консервативного мотива антирестрикционного белка ArdA, кодируемого трансмиссивной IncI плазмидой Со11Ь-Р9. Молекулярная биология, 36(6), 1062-1067.

3. Nekrasov, S. V., Kolesnikova, M. D., Agafonova, О. V., Belogurova, N. G., Delver, E. P., Belogurov, A. A. "Antirestriction protein Ard (type A) encoded by IncI plasmid ColIb-P9: Mutational analysis of its conserved domain", Abstr. book Int. Conf. Biocatalysis-2002, Moscow, Russia., 2002, p. 120

4. Некрасов C.B. "Изучение механизма действия антирестрикционного белка ArdA на системы рестрикции-модификации I типа", тезисы докладов международ, конф. студентов и аспирантов "Ломоносов-2004", отделение "Науки о живом", МГУ, апрель 2004, с. 105.

5. Nekrasov, S. V., Agafonova, О. V., Belogurova, N. G., Delver, E. P., Belogurov, A. A. "The C-terminal conserved motif of antirestriction protein ArdA is essential for its function", Abstr. book Int. Conf. Biocatalysis-2005, St.Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russia, 2005, p. 94.

Список сокращений

R-M система - система рестрикции-модификации

His*Tag - стандартная N-концевая последовательность из шести гистидинов T7»Tag - стандартная 5'-концевая часть гена 10 фага Т7 SDS - додецилсульфат натрия

Ni-NTA - смола, содержащая никель, удерживаемый на агарозе,

модифицированной нитрилотриуксусной кислотой IPTG - изопропил-р-Э-тиогалактопиранозид SAM - S-аденозилметионин ATP - аденозинтрифосфат

Принято к исполнению 16/11/2006 Исполнено 17/11/2006

Заказ № 937 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Некрасов, Сергей Вячеславович

Список сокращений.

I. Введение.

И. Литературный обзор.

ПЛ. Трансмиссивные плазмиды.

II.2. Системы рестрикции-модификации ДНК у бактерий.

11.2.1. Три типа систем рестрикции-модификации.

11.2.2. Системы рестрикции-модификации 1-го типа.

11.2.2.1. Субъединица узнавания.

11.2.2.2. Субъединица модификации.

11.2.2.3. Модифицирующий фермент.

11.2.2.4. Субъединица рестрикции.

11.2.2.5. Комплекс рестрикции-модификации 1-го типа.

11.2.3. Системы бактерий, гидролизующие специфически модифицированную ДНК.

П.З. Системы антирестрикции.

II.3.1. Антирестрикционная активность бактериофагов.

П.З.2. Антирестрикционные системы, кодируемые трансмиссивными плазмидами.

Щ. Материалы и методы.

III.1. Штаммы E.coli, использованные в работе.

111.2. Плазмиды и бактериофаги, использованные в работе.

111.3. Среды для выращивания бактерий и фагов.

111.3.1. Жидкие среды.

111.3.2. Твердые среды.

Ш.4. Антибиотики, растворы солей и реактивов.

111.5. Выращивание культур бактерий.

111.6. Выращивание бактериофагов.

111.7. Высев бактерий и бактериофагов. Опыты по изучению эффективности рестрикции.

111.7.1. Высев бактерий.

111.7.2. Высев бактериофагов.

111.7.3. Опыты по изучению эффективности рестрикции.

111.8. Методы работы с плазмидной ДНК.

III.8.1. Выделение ДНК малых плазмид для аналитических опытов.

Ш.8.2. Очистка плазмид в равновесном градиенте плотности CsCl.

111.8.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

111.8.4. Электроэлюция фрагментов ДНК из агарозного геля.

111.8.5. Рестрикционный аиализ плазмид.

111.8.6. Протокол клонирования фрагментов ДНК в вектор.

111.9. Получение однотяжевых ДНК-матриц.

ШЛО. Фосфорилироваиие синтетических олигонуклеотидов.

111.11. Сайт-направленный мутагенез.

II.12. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

III. 12.1.Проведение реакций секвенирования.

Ш.12.2.Приготовление сиквенсных гелей. Сиквенсный электрофорез.

III. 13. Получение делеций с помощью Bal 31 нуклеазы.

1П.14. Полимеразная цепная реакция.

III. 15. Мечение фрагмента ДНК при помощи реакции ПЦР.

111.16. Идентификация белков в системе экспрессии на основе Т7 РНК полимеразы.

ГП.17. Идентификация белков в системе экспрессии на основе

Т7 РНК полимеразы с включением S-Met.

Ш.18. Фракционирование клеточных белков.

111.19. Электрофорез белков в денатурирующих условиях.

III. 19.1.Подготовка образцов для анализа.

Ш.19.2.Проведение электрофореза.

111.20. Замедление подвижности ДНК в геле.

111.21. Измерение промоторной активности с использованием системы вектора рКК232-8.

111.22. Очистка белков при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA колонке.

111.23. Связывание белков in vitro.

111.24. Определение агрегатного состояния белка ArdA, с использованием метода гель-фильтрации.

1П.25. Ингибирование рестрикции немодифицированной

ДНК pBR322 in vitro.

IV. Результаты и их обсуждение.

IV. 1. Картирование области белка ArdA, существенной для его функционирования с помощью тонкого делеционного анализа.

IV.2. Идентификация аминокислотных остатков белка ArdA, которые существенны для его функционирования.

IV.3. Изучение взаимодействия [35Б]-меченных белка ArdA и

EcoKI метилтрансферазы in vitro.

IV.4. Определение агрегатного состояния белка ArdA в растворе.

IV.5. Белок ArdA блокирует способность R-M системы

1-го типа связываться со специфической немодифицироваппой ДНК.92 IV.6. Белок ArdA способен ингибировать ЕсоК1-рестрикцию модифицированной ДНК in vitro.

IV.7. Белок ArdA более эффективно ингибирует рестрикциониую, чем модификационную активность ЕсоК1-системы in vivo.

V. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антирестрикционный белок ArdA, кодируемый трансмиссивной плазмидой IncI группы: мутационный анализ и изучение механизма действия"

Согласно современным представлениям, в природе между различными, в том числе и филогенетически отдаленными, группами бактерий и даже таксономическими царствами (бактерии и дрожжи, бактерии и растения) постоянно осуществляется (посредством природных векторов трансмиссивных плазмид) фундаментальный биологический процесс обмен генетической информацией, который может оказать существенное воздействие на геном бактериальной клетки. Часто эти трансмиссивные плазмиды, а следовательно и объемы кодируемой ими информации, сравнимы по размеру с бактериальной хромосомой, что нозволяет классифицировать их как дополнительные мини-хромосомы клетки. С другой стороны, нередко такие плазмиды могут функционировать как эффективные доноры или, наоборот, акцепторы важных генетических факторов (вирулентности, резистентности к антибиотикам и др.), которые способны обмениваться между геномами плазмид и бактерий с помощью специальных рекомбинационных механизмов. В этой связи большую актуальность нриобретают исследования, направленные на изучение механизмов, контролирующих эти потоки генетической информации и способных тем самым играть важную роль в регуляции скорости и эффективности прохождения процессов адаптации и, возможно, эволюции бактерий. Один из таких уже известных регуляторных механизмов может осуществляться посредством систем рестрикции-модификации. Эти системы распознают "чужую" ДНК по специфическому метилированию, играющему роль своеобразного "молекулярного паспорта", а их активность ассоциируется в настоящее время с природным механизмом "иммиграционного контроля", который, по-видимому, осуществляет контроль потока генов между различными популяциями бактерий и способствует определенной генетической изоляции между отдаленными микроорганизмами. Тем не менее, известно, что многие большие трансмиссивные плазмиды способны с высокой эффективностью осуществлять перенос своей ДНК между бактериями с различными системами рестрикции-модификации 1-го типа. Этот феномен связан с тем, что трансмиссивные плазмиды кодируют антирестрикционные белки, названные Ard (alleviation of restriction of DNA) белками. Ноказано, что белки Ard способны эффективно ингибировать активность системы рестрикции-модификации 1-го типа [1, 2]. В настоящее время известны три типа Ard белков (ArdA, ArdB и ArdC), которые классифицированы на основании сходства их аминокислотных последовательностей и кодируются плазмидами IncI, IncFV, IncN и IncW групп [2, 3]. Кроме того, в результате определения полных нуклеотидных носледовательностей различных бактериальных геномов в настоящее время обнаружено целое семейство (около 50) ArdA-нодобных белков, которые, но-видимому.широко раснространены среди бактерий и плазмид и наряду с системами рестрикциимодификации 1-го типа играют важную роль в процессах регуляции обмена генетическим материалом между бактериальными клетками. Настоящая работа посвящена мутационному анализу антирестрикционного белка ArdA, кодируемого трансмиссивной плазмидой CollbР9 группы IncI, и изучению мехапизма его действия на системы рестрикции-модификации 1-го типа.II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР II.1. Трансмиссивные плазмиды. Плазмиды называются трансмиссивными или коныогативными, если они снособны автономно ренлицироваться в бактерии и переноситься из одной бактериальной клетки в другую в процессе коньюгации [4,5]. К "существенным" генам коньюгативных нлазмид относятся две групны генов, ответственных за репликацию плазмидной ДНК (гены области rep), и за коньюгативный перенос (гены области tra) [6]. Важнейшим свойством нлазмид является их способность к автономной ренликацни. Генетический контроль за этим процессом осуществляется нлазмидной областью гер. Плазмиды, имеющие сходные репликоны как правило обладают интенсивной нуклеотидной гомологией и в других своих областях, то есть являются генетнчески родственными. Поэтому припятая классификация плазмид оспована на сходстве их репликонов [7]. Экснернментальное сходство репликонов анализируется при помощи теста на совместимость. Известно, что плазмиды, имеющие сходный контроль репликации, несовметимы, в то время как нлазмиды с разными системами контроля репликации (репликонами) обычно совместимы. Отметим, что несовместимыми считаются нлазмиды, которые не снособны сосуществоввать в одной и той же клетке, и в ряду ноколений стабильно наследуется только одна из плазмид. Молекулярные основы механизма несовместимости, повидимому, основаны на том, что в случае сходства плазмидных репликонов система, контролирующая репликацию, "распознает" две разные плазмиды как идентичные. В этом случае реализация контроля конийности неизбежно нриводит к взаимному конкурентному ингибированию процессов репликации родственных плазмид, другими словами к ситуации их несовместимости. В клетке это состояние взаимного ингибирования является нестабильным, что в конце концов нриводит к тому, что в растущей клеточной популяции наследуется только одна из конкурирующих между собой нлазмнд. Взаимно несовместимые плазмиды объединяются в грунпы несовметимости "1пс" (Incompatibility) [8]. В семействе энтеробактерий известны около 30 различных групн несовместимости коньюгативных плазмид: FI, FII, Fill, FIV, FV, II, 12, N и т.д [7]. Несмотря на больщое разнообразие в строении плазмидных репликонов, среди них возможно выделить два основных тина. В одном из них ключевым элементом системы является ингибирование процесса инициации ренликации нлазмиды носредством небольшой молекулы антисмысловой (anti-sense) РПК [9]. Мишенью этой РНК-ингибитора является инициирующая репликацию РНК, которая синтезируется по противоположпой нити ДНК и имеет с антисмысловой РНК общую комплементарную область, кодируемую, соответственно, общей для этих транскриптов областью ДНК. Функция РНК в инициации репликации обычно состоит либо в формировании праймера, либо в кодировании существенных для репликации белков Rep (то есть как мРНК) [10]. В обоих случаях ингибиторный эффект антисмысловой РНК обусловлен формированием РНК-РНК дуплекса между антисмысловой РНК и частично комплиментарной ей РНК-мишенью, существенной для инициации репликации. Показано, что образование этого РНК дуплекса происходит между их вторичными структурами, неспаренными щпильками [11]. В случае СоШ1 плазмид антисмысловая РНК ингибирует репликацию посредством блокирования процессинга РНК-препраймера рибонуклеазой Н [12]. Второй тип регуляции репликации плазмид основан на двух основных моментах. Первый элемент, наличие в области rep серии небольших (около 20 н.н.) повторов, способных связывать и, тем самым, обратимо инактивировать существенный для репликации белок Rep [13, 14]. Отметим, что наблюдается определенный консерватизм этого типа репликогюв в локализации ингибирующих повторов относительно генов rep и размерах белков Rep (29-39 килодальтон). Второй элемент это способность Rep белка к авторегуляции. Это свойство обычно реализуется при помощи того, что Rep белок является репрессором экспресси своего гена. Такая система регуляции, по видимому, способна более жестко и в то же время деликатно контролировать репликацию плазмид, чем в случаях, характерных для регуляции при помощи только антисмысловой РНК. Важно отметить, что репликоны, в которых сочетаются идеи регуляции при помощи антисмысловой РНК и белка-активатора, позволяют осуществить более строгий контроль копийности плазмид (1-2 копии на клетку). "Существенные" гены занимают, как правило, более 50% длины плазмиды [15]. Оставшаяся часть ДНК заполнена как "случайными" элементами (IS-элементы, транспозоны, содержащие гены устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам, гены вирулентности и т.д.), так и "несущественными" генами. В отличие от "случайиых" последовательностей, свободно мигрирующих от генома к геному, "несущественные" гены сохраняют свою локализацию в ДНК плазмид столь же строго, как и "существенные" гены, а нуклеотидная последовательность этих генов высоконсервативна. Однако при введении в "несущественные" гены мутаций, нарушающих их активность, основные свойства коньюгативиых плазмид ни в коей мере не изменяются, т.е. они продолжают нормально реплицироваться в клетке и переходить в другие клетки в процессе коньюгации. Именно поэтому эта группа генов и получила пазвание "несущественных" генов [15]. Область коньюгативных плазмид, в которой располагаются "несущественные" гены, называется "лидерной", так как она примыкает к участку oriT, а ее гены первыми входят в клеткуреципиент при коньюгативпом переносе (рис. 1). Участок опТ начало (origin) коньюгативной репликации расположен на границе tra-onepoiia с остальной частью плазмиды. Гены "лидерной" области, которая обычно занимает 10-15 т.н.н. и заканчивается в связи с началом области rep (вегетативная репликация плазмиды), в разных нлазмидах расположены в разном порядке, причем их присутствие необязательно. Всего в состав "лидерной" области входит примерно 8-10 открытых рамок считывания (ОРС). Однако из них определены фенотипически и изучены подробно лишь четыре гена: ard, psiB,flm (hoksok) и ssb, природа остальных ОРС остается неизвестной. Гены ard (к настоящему времени обнаружено несколько разновидностей этого гена, ardA, ardB, ardC) кодируют небольшие, очень кислые белки (140-170 аминокислотных остатков с характерным суммарным зарядом (-7...-29), и, как показано в ряде работ, являются ингибиторами клеточных рестриктаз-метилтрансфераз 1-го тина [16-20, 2]. Ген psiB кодирует небольшого размера кислый белок, который ипгибирует RecA ключевой белок рекомбинации и SOS регулона [21]. Предполагается, что белок PsiB, инактивируя RecA, тем самым способствует снижению SOS-эффекта, который сопровождает коньюгативный перенос ДНК, так как плазмидная ДНК входит в клетку-рециниент в однопитевом состоянии (рис. 1). Ген ssb ответственен за синтез белка Ssb (Single strand binding protein). Ген flm/F (hok-sok/RlOO) отвечает за синтез белка-киллера, убивающего беснлазмидную (точнее, потерявшую коньюгативную плазмиду) клетку, и следовательно, способствует стабилизации состояния клетки с нлазмидой [22, 23]. Механизм летального действия продуктов этих генов на клетку основан на принципе "токсин-антитоксин" белоктоксин убивает клетку, антитоксин нейтрализует действие токсина [24]. В настоящее время известны два различных типа постсегрегационных киллерных систем, кодируемых генами коньюгативных плазмид: 1) антитоксин-белок, 2) антитоксин-антисмысловая РНК [22,23, 24-26]. Система flm (hok-sok) относится ко второй группе: ген sok определяет синтез короткой и нестабильной антисмысловой РНК (антитоксин) гена hok, ответственного за синтез стабильного белка-токсина Нок. II.2. Системы рестрикции-модификации ДНК у бактерий. Феномен рестрикции-модификации был открыт Бертани (Beertrani) и Вейгл (Weigle) более сорока лет назад в онытах с бактериофагами Р2 и X [27]. Они обнаружили, что 10 эффективность роста бактериофагов, выращенных на штаммах Е. соИ С и К-12, сильно отличалась при высеве фагов на штамм Е. соИ К-12, но не на щтамм Е. соИ Молекулярнобиологическое объяснение этому удивительному эффекту было дано позднее в опытах Арбером (Arber) с сотрудниками [28, 29]. ДОНОР РЕЦИПИЕНТ ДНК геликаза РНК праймер Ssb белок ТгаС прайм аза Tral релаксаза ДНК полимераза Рис.1. Схема коньюгативного переноса плазмидной ДНК из клетки-донора в клеткуреципиента. Белок Tral, обладающий активностью релаксазы/геликазы, осуществляет oriTспецифичное разрезание одной цепи ДНК. Затем белок Tral, ковалентно связанный с 5 концом в oriT сайте, осуществляет транслокацию (геликазная активность) одной нити ДНК из клетки донора в клетку реципиепта. 3-конец в "ник-сайте" реплицируется по механизму RC (rolling circle) в клетке-донора. Раскручивание ДНК в донорной клетке осуществляется посредством ДНК геликазы. Белок ТгаС праймаза (119 кДа) сопровождает переносимую нить в реципиентную-клетку и генерирует праймеры для прерывистого синтеза комлементарной нити. Было показано, что ДНК фагов, выращенных на бактериях Е. coli С, разрушается в клетках Е. соН К-12 посредством особой эндонуклеазы, узнающей специфические сайты в ДНК и 11 деградирующей ДНК, если эти сайты специфически немодифицированы. В клетках Е. соИ К-12 присутствует также модифицирующая активность, которая защищает свою ДНК от действия эндоиуклеазы, в то время как в клетках Е. соИ С обе активности (рестрикция и модификация) отсутствуют (рис. 2). е.о.р.=1 Рис.2. Феномен рестрикции и модификации. Штамм Е. соИ К-12 продуцирует EcoKI R-M систему 1-го типа, тогда как в щтамме Е. соЫ С данная система отсутствует. Фаг А, (.С), выращенный на клетках Е. соИ С, не защищен от рестрикции системой EcoKI и, следовательно, эффективностью посева (е.о.р) этого фага на штамме Е. coli К-12 составляет 2x10", Эффективность посева (е.о.р) фага А, определялась как величина отношения титра фага на соответствующем рестрицирующем Е. coli К-12 (или нерестрицирующем Е. соИ С) штамме к титру фага на нерестрицирующем штамме Е. coli Присутствие модифицированной ДНК указано штриховкой. II.2.1. Три типа систем рестрикции-модификации. Системы рестрикции-модификации довольно широко распространены среди бактерий и

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Некрасов, Сергей Вячеславович

V. выводы

1. При помощи топкого делеционного картирования антирестрикционного белка ArdA локализована его минимальная область (мини-ArdA), существенная для его функционирования. Эта область локализована в С-коицевой части белка ArdA и состоит из 77 аминокислотных остатков (с 90-го по 166 аминокислотный остаток включительно).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Некрасов, Сергей Вячеславович, Москва

1. Wilkins, В. M. (2002) Plasmid promiscuity: meteeng the challenge of DNA immigration control. Envir. Microbiol. 4,495-500.

2. Lanka, E., Wilkins, В. M. (1995) DNA processing reactions in bacterial conjugation. Annu. Rev. Biochem., 64,141-169

3. Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. (1994) Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol. Rev., 58(2), 162-210.

4. Couturier, M., Bex, F., Bergquist, P. L. and Maas, W. K. (1988) Identification and classification of bacterial plasmids. Microbiol. Rev., 52,375-395.

5. Novick, R. P. (1987) Plasmid incompatibility. Microbiol. Rev., 51, 381-39

6. Tomizawa, J. (1984) Control of ColEl plasmid replication: the process of binding of RNA1 to the primer transcript. Cell, 38, 861-870

7. Lacatena, R. M. and Cesareni, G. (1981) Base pairing of RNA1 with its complementary sequence in the primer precursor inhibits ColEl replication. Nature (London), 294, 623-626.

8. Lacatena, R. M. and Cesareni, G. (1983) Interaction between RNA1 and the primer precursor in the regulation of ColEl replication. J. Mol. Biol, 170, 635-650.

9. Itoh, T. and Tomizawa, J. (1980) Formation of an RNA primer for initiation and replication of ColEl DNA by ribonuclease H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,2450-2454

10. Scott, J. R. (1984) Regulation of plasmid replication. Microbiol. Rev., 48(1), 1-23.

11. Thomas, С. M., Cross, M. A., Hussain, A. K. and Smith, C. A. (1984) Analysis of copy number control elements in the region of the vegetative replication origin of the broad host range plasmid RK2. EMBOJ., 3, 57-63

12. Завильгельский, Г. Б. (2000) Аитирестрикция. Молекуляр. биология., 34, 854-862.

13. Delver, E. P., Kotova, V. U., Zavilgelsky, G. B. and Belogurov, A. A. (1991) Nucleotide sequence of the gene (ard) encoding the antirestriction protein of plasmid ColIb-P9. J. Bacteriol., 173, 5887-5892.

14. Belogurov, A. A., Delver, E. P., Rodzevich, О. V. (1992) IncN plasmid pKMlOl and Incll plasmid ColIb-P9 encode homologous antirestriction proteins in their leading regions. J. Bacteriol., 174, 5079-5085.

15. Belogurov, A. A., Delver, E. P., Rodzevich, О. V. (1993) Plasmid pKMlOl encodes two nonhomologous antirestriction proteins (ArdA and ArdB) whose expression is controlled by homologous regulatory sequences. J. Bacteriol., 175,4843-4850.

16. Завильгельский Г. Б., Бакалов Т. А., Дужий Д. Е., Котова В. 10. (1994) Ген arcl, кодирующий ингибитор рестрикции модификации 1-го типа, присутствует в коныогативиых плазмидах FII, В/О и К-групп несовместимости. Генетика, 30,1582-1592.

17. Chilley, P. М., Wilkins, В. М. (1995) Distribution of the ardA family of antirestriction genes on conjugative plasmids. Microbiology, 141, 2157-2164.

18. Gerdes, K., Poulsen, L. K, Thisted, Т., Nielsen, A. K, Martinussen, J., Andreasen, P. H. (1990) The hok killer gene family in gram-negative bacteria. New Biol., 2, 946-956.

19. Gerdes, K., Gultyaev, A. P., Franch, Т., Pedersen, K., Mikkelsen, N. D. (1997) Antisense RNA-regulated programmed cell death. Annu. Rev. Genet., 31, 1-31.

20. Jensen, R. В., Gerdes, K. (1995) Programmed cell death in bacteria: proteic plasmid stabilization systems. Mol. Microbiol., 17, 205-210.

21. Franch, Т., Petersen, M., Wagner, E. G., Jacobsen, J. P., Gerdes, K. (1999) Antisense RNA regulation in prokaryotes: rapid RNA/RNA interaction facilitated by a general U-turn loop structure. J. Mol. Biol., 294(5), 1115-1125.

22. Gerdes, K. (2000) Toxin-antitoxin modules may regulate synthesis of macromolecules during nutritional stress. J. Bacteriol., 182, 561-572.

23. Bertani, G., Weigle, J. J. (1953) Host-controlled variation in bacterial viruses. J. Bacteriol., 66,113-121

24. Arber, W. (1968) Host controlled restriction and modification of bacteriophage. Symp. Soc. Gen. Microbiol., 18,296-314.

25. Arber, W. and Dussoix, D. (1962) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J. Mol. Biol., 5,18-36.

26. Bickle, Т. A. and Kruger, D. H. (1993) Biology of DNA restriction. Microbiol. Rev. 57, 434-450.

27. Modrich, P. and Roberts, R. J. (1982) Type П restriction and modification enzymes. In Nucleases (Linn, S. M. and Roberts, R. J.,eds.), pp.109-154, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

28. Meisel, A., Mackeldanz, P., Bickle, T. A., Kruger, D. V. and Schroeder, C. (1995) Type III restriction endonucleases translocate DNA in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis. EMBOJ., 14,2958-2966

29. Meisel, A., Bickle, T. A., Kruger, D. H., Schroeder, C. (1992) Type III restriction enzymes need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage. Nature, 355,467 469

30. Janscak, P., Mac Williams, M. P., Sandmeier, U., Nagaraja, V. and Bickle, T. A. (1999) DNA translocation blockage, a general mechanism of cleavage site selection by type I restriction enzymes. EMBOJ., 18, 2638-2647

31. Murray, N. E. (2002) Immigration control of DNA in bacteria: self versus non-self. Microbiology, 148, 3-20.

32. Kulik, E. M. and Bickle, T. A. (1996) Regulation of the activity of the type 1С EcoR124I restriction enzyme. J. Mol. Biol., 264, 891-906

33. Raleigh, E. A. (1992) Organization and function of the mcrBC genes of Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol., 6, 1079-1086.

34. Gough, J. A. and Murray, N. E. (1983) Sequence diversity among related genes for recognition of specific targets in DNA molecules. J. Mol. Biol., 166,1-19

35. Murray, N. E., Gough, J. A., Suri, B. and Bickle, T. A. (1982) Structural homologies among type I restriction-modification systems. EMBO. J., 1, 535-539.

36. Murray, N. E. (2000) Type I Restriction Systems: Sophisticated Molecular Machines (a Legacy of Bertani and Weigle). Microbiol, and Mol. Biol. Rev., 64, 412-434.

37. Cowan, G. M., Gann, A. A. and Murray, N. E. (1989) Conservation of complex DNA recognition domains between families of restriction enzymes. Cell, 56,103-109.

38. Kneale, G. G. (1994) A symmetrical model for the domain structure of type I DNA methyltransferases. J. Mol. Biol., 243,1-5.

39. Argos, P. (1985) Evidence for a repeating domain in type I restriction enzymes. EMBO J., 4,1351-1355.

40. Kannan, P., Cowan, G. M., Daniel, A. S., Gann, A. A. and Murray, N. E. (1989) Conservation of organization in the specificity polypeptides of two families of type I restriction enzymes. J. Mol. Biol., 209, 335-344.

41. Abadjieva, A., Patel, J., Webb, M., Zinkevich, V. and Firman, K. (1993) A deletion mutant of the type 1С restriction endonuclease EcoR124I expressing a novel DNA specificity. Nucleic Acids Res., 21,4435-4443.

42. Thorpe, P. H., Ternent, D. and Murray, N. E. (1997) The specificity of StySKl, a type I restriction enzyme, implies a structure with rotational symmetry. Nucleic Acids Res., 25, 16941700.

43. Janscak, P. and Bickle, T. A. (1998) The DNA recognition subunit of the type IB restriction-modification enzyme EcoAI tolerates circular permutations of its polypeptide chain. J. Mol. Biol., 284, 937-948

44. Weiserova, M. and Firman, K. (1998) Isolation of a non-classical mutant of the DNA recognition subunit of the type I restriction endonuclease R.EcoR124I. Biol. Chem. 379, 585-589.

45. Sturrock, S. S. and Dryden, D. T. F. (1997) A prediction of the amino acids and structures involved in DNA recognition by type I DNA restriction and modification enzymes. Nucleic Acids Res., 25,3408-3414.

46. O'Neill, M., Dryden, D. T. F. and Murray, N. E. (1998) Localization of a protein-DNA interface by random mutagenesis. EMBOJ., 17, 7118-7127.

47. Winter, M. (1998) Investigation of de novo methylation activity in mutants of the EcoKI methyltransferase. Ph.D. thesis. University of Edinburgh, Scotland.

48. Kusiak, M., Price, C., Rice, D. and Hornby, D. P. (1992) The HsdS polypeptide of the type 1С restriction enzyme EcoR124 is a sequence-specific DNA-binding protein. Mol. Microbiol., 6, 3251-3256.

49. Mernagh, D. R., Reynolds, L. A. and Kneale, G. G. (1997) DNA binding and subunit interactions in the type I methyltransferase M. EcoR124I. Nucleic Acids Res., 25, 987-991.

50. Meselson, M. and Yuan, R. (1968) DNA restriction enzyme from E. coli. Nature, 217, 1110-1114.

51. Buhler, R. and Yuan, R. (1978) Characterization of a restriction enzyme from Escherichia coli К carrying a mutation in the modification subunit. J. Biol. Chem., 41,459-472

52. Loenen, W. A., Daniel, A. S., Braymer, H. D. and Murray, N. E. (1987) Organization and sequence of the hsd genes of Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol., 198,159-170.

53. Cheng, X. (1995) Structure and function of DNA methyltransferases. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 24, 293-318

54. Sharp, P. M., Kelleher, J. E., Daniel, A. S., Cowan, G. M. and Murray, N. E. (1992) Roles of selection and recombination in the evolution of type I restriction-modification systems in enterobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,9836-9840.

55. Willcock, D. F., Dryden, D. T. F. and Murray, N. E. (1994) A mutational analysis of the two motifs common to adenine methyltransferases. EMBOJ., 13, 3902-3908.

56. Dryden, D. T. F., Sturrock, S. S. and Winter, M. (1995) Structural modeling of a type I DNA methyltransferase. Nat. Struct. Biol., 2, 632-635

57. Cooper, L. P. and Dryden, D. T. F. (1994) The domains of a type I DNA methyltransferase: interactions and role in recognition of DNA methylation. J. Mol. Biol., 236, 1011-1021.

58. Klimasauskas, S., Kumar S., R. J. Roberts and Cheng X. (1994) Hhal methyltransferase flips its target base out of the DNA helix. Cell, 76, 357-369.

59. Roberts, R. J. and Cheng, X. (1998) Base flipping. Annu. Rev. Biochem., 67,181-198

60. Suri, B. and Bickle, T. A. (1985) EcoA: the first member of a new family of type I restriction modification systems. Gene organization and enzymatic activities. J. Mol. Biol., 186, 77-85.

61. Taylor, I., Patel, J., Firman, K. and Kneale, G. (1992) Purification and biochemical characterisation of the EcoR124 type I modification methylase. Nucleic Acids Res., 20,179-186.

62. Suri, В., Nagaraja,V. and Bickle, T. A. (1994) Bacterial DNA modification. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 180,1-9.

63. Taylor, I., Watts, D. and Kneale, G. (1993) Substrate recognition and selectivity in the type 1С DNA modification methylase M.EcoR124I. Nucleic Acids Res., 21,4929-4935.

64. Loenen, W. A. and Murray, N. E. (1986) Modification enhancement by the restriction alleviation protein (Ral) of bacteriophage lambda. J. Mol. Biol., 190,11-22.

65. Powell, L. M., Dryden, D. T. F., Willcock, D. F., Pain, R. H. and Murray, N. E. (1993) DNA recognition by the EcoKI methyltransferase: the influence of DNA methylation and the cofactor S-adenosyl-L-methionine. J. Mol. Bio., 234,60-71.

66. Velankar, S. S., Soultanas, P., Dillingham, M. S., Subramanya, H. S. and Wigley, D. B. (1999) Crystal structures of complexes of PcrA DNA helicase with a DNA substrate indicate an inchworm mechanism. Cell, 97, 75-84

67. Hall, M. C. and Matson, S. W. (1999) Helicase motifs: the engine that powers DNA unwinding. Mol Microbiol., 34, 867-877.

68. Davies, G. P., Powell, L. M., Webb, J. L., Cooper, L. P. and Murray, N. E. (1998) EcoKI with an amino acids substitution in any one of seven DEAD-box motifs has impaired ATPase and endonuclease activities. Nucleic Acids Res., 26,4828-4836

69. Davies, G. P., Martin, I., Sturrock, S. S., Cronshaw, A., Murray, N. E. and Dryden, D. T. F. (1999) On the structure and operation of type I DNA restriction enzymes. J. Mol. Biol. 290, 565579

70. Bird, L. E., Subramanya, H. S. and Wigle, D. B. (1998) Helicases: a unifying structural theme? Curr. Opin. Sruct. Biol., 8,14-18

71. Janscak, P., Sandmeier U. and Bickle T. A. (1999) Single amino acid substitutions in the HsdR subunit of the type IB restriction enzyme EcoAI uncouple the DNA translocation and DNA cleavage activities of the enzyme. Nucleic Acids Res., 27,2638-2643.

72. Powell, L. M., Dryden, D. T. F. and Murray, N. E. (1998) Sequence-specific DNA binding by EcoKI, a type IA DNA restriction enzyme. J. Mol. Biol., 283, 963-976.

73. Piekarowicz, A., Goguen, J. D. and Skrzypek, E. (1985) The EcoDXXl restriction and modification system of Escherichia coli ET7: purification, subunit structure and properties of the restriction endonuclease. Eur. J. Biochem. 152, 387-393

74. Burckhardt, J., Weisemann, J. and Yuan, R. (1981) Characterization of the DNA methylase activity of the restriction enzyme from Escherichia coli K. J. Biol. Chem. 256,4024-4032.

75. Chen, A., Powell, L. M., Dryden, D. T. F., Murray, N. E. and Brown, T. (1995) Tyrosine 27 of the specificity polypeptide of EcoKI can be UV crosslinked to a bromodeoxyuridine-substituted DNA target sequence. Nucleic Acids Res., 23,1177-1183

76. Mernagh, D. R., Taylor, I. A. and Kneale, G. G. (1998) Interaction of the type I methyltransferase M. EcoR124I with modified DNA substrates: sequence discrimination and base flipping. Biochem. J., 336, 719-725.

77. Makovets, S., Doronina, V. A. and Murray, N. E. (1999) Regulation of endonuclease activity by proteolysis prevents breakage of unmodified bacterial chromosomes by type I restriction enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9757-9762.

78. Davies, G. P., Kemp, P., Molineux, I. J and Murray, N. E. (1999). The DNA translocation and ATPase activities of restriction-deficient mutants of EcoKI. J. Mol. Biol., 292, 787-796.

79. Garcia, L. R. and Molineux, I. J. (1999) Translocation and specific cleavage of bacteriophage T7 DNA in vivo by EcoKI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96,12430-12435.

80. Horiuchi, K. and Zinder, N. D. (1972) Cleavage of bacteriophage fl DNA by the restriction enzyme of Escherichia coli B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3220-3224.

81. Yuan, R., Hamilton, D. L. and Burckhardt, J. (1980) DNA translocation by the restriction enzyme from E. coli K. Cell, 20,237-244.

82. Studier, F. W. and Bandyopadhyay, P. K. (1988) Model for how type I restriction enzymes select cleavage sites in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,4677-4681.

83. Ellis, D. J., Dryden, D. T. F., Berge, Т., Edwardson, J. M. and Henderson, R. M. (1999) Direct observation of DNA translocation and cleavage by the EcoK endonuclease using atomic force microscopy. Nat. Struct. Biol., 6,15-17.

84. Szczelkun, M. D., Dillingham, M. S., Janscak, P., Firman, K. and Halford, S. E. (1996) Repercussions of DNA tracking by the type 1С restriction endonuclease EcoR124I on linear, circular and catenated substrates. EMBOJ., 15, 6335-6347.

85. Janscak, P. and Bickle, T. A. (2000) DNA supercoiling during ATP-dependent DNA translocation by the type I restriction enzyme EcoAI. J. Mol. Biol., 295,1089-1099.

86. Dryden, D. T. F., Cooper, L. P. Thorpe, P. H. and Byron, O. (1997) The in vitro assembly of the EcoKI type I DNA restriction/modification enzyme and its in vivo implications. Biochemistry, 36,1065-1076.

87. Prakash-Cheng, A. and Ryu, J. (1993) Delayed expression of in vivo restriction activity following conjugal transfer of Escherichia coli hsdK (restriction-modification) genes. J. Bacteriol., 175,4905-4906.

88. Janscak, P., Dryden, D. T. F. and Firman, K. (1998) Analysis of the subunit assembly of the type 1С restriction-modification enzyme EcoR124I. Nucleic Acids Res., 26,4439-4445.

89. Prakash-Cheng, A., Chung, S. S. and Ryu, J. (1993) The expression and regulation of hsdK genes after conjugative transfer. Mol. Gen. Genet. 241,491-196.

90. Gottesman, S. (1999) Regulation by proteolysis: developmental switches. Curr. Opin. Microbiol., 2,142-147

91. Makovets, S., Titheradge, A. J. B. and Murray, N. E. (1998) ClpX and ClpP are essential for the efficient acquisition of genes specifying type IA and IB restriction systems. Mol. Microbiol., 28,25-35.

92. Thorns, B. and Wackernagel, W. (1984) Genetic control of damage-inducible restriction alleviation in Escherichia coli К12: an SOS function not repressed by I ex A. Mol. Gen. Genet. 197, 297-303.

93. Raleigh, E. A. and Wilson, G. (1986) Escherichia coli K-12 restricts DNA containing 5-methylcytosine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9070-9074.

94. Raleigh, E. A., Trimarchi, R. and Revel, H. (1989) Genetic and physical mapping of the mcrA (rglA) and mcrB (rglB) loci of Escherichia coli K-12. Genetics, 122, 279-296.

95. Kelleher, J. E. and Raleigh, E. A. (1991) A novel activity in Escherichia coli K-12 that directs restrition of DNA modified at GC dinucleotides. J. Bacteriol., 173, 5220-5223.

96. Kruger, D. H., Bickle, T. A. (1983) Bacteriophage survival: multiple mechanisms for avoiding the deoxyribonucleic acid restriction systems of their hosts. Microbiol Rev., 47(3), 34560.

97. Hattman, S. (1980) Specificity of the bacteriophage Mu mom+ -controlled DNA modification. J. Virol., 34(1), 277-279.

98. Hattman, S., Ives, J., Margolin, W., Howe, M. M. (1985) Regulation and expression of the bacteriophage mu mom gene: mapping of the transactivation (dad) function to the С region. Gene, 39(1), 71-76

99. King, G., Murray, N. E. (1995) Modification enhancement and restriction alleviation by bacteriophage lambda. Gene, 157, 225.

100. Studier, F.W., Movva, N.R. (1976) SAMase gene of bacteriophage T3 is responsible for overcoming host restriction. J. Virol., 19(1), 136-145.

101. Walkinshaw, M. D., Taylor, P., Sturrock, S. S, Atansiu, C., Berge, Т., Henderson, R. M., Edwardson, J. M. and Dryden, D. T. F. (2002) Structure of Ocr from bacteriophage T7, a protein that mimics B-form DNA. Mol. Cell, 9,187-194

102. Iida, S., Hiestand-Nauer, R., Sandmeier, H., Lehnherr, H., Arber, W. (1998) Accessory genes in the darA operon of bacteriophage PI affect antirestriction function, generalized transduction, head morphogenesis and host cell lysis. Virology, 251,49-58.

103. Kim, В. С., Kim, К, Park, Е. Н., Lim, С. J. (1997) Nucleotide sequence and revised map location of the am gene from bacteriophage T4. Mol. Cell, 7(5), 694-696.

104. Котова В. Ю., Завильгельский Г.Б., Белогуров А.А. (1988) Ослабление рестрикции 1-го типа в присутствии плазмид группы IncI. Общая характеристика и молекулярное клонирование гена ard. Молекуляр. Биология, 22,270-276.

105. Bates, S., Roscoe, R. A., Althorpe, N. J., Brammar, W. J, Wilkins, В. M. (1999) Expression of leading region genes on Incll plasmid ColIb-P9: genetic evidence for single-stranded DNA transcription. Microbiology, 145,2655-62

106. Masai, H., Arai, K. (1997) Frpo: A Novel single-stranded DNA promoter for transcription and for primer RNA synthesis of DNA replication. Cell, 89, 897-907.

107. Yanisch-Perron, C., Viera, J. and Messing, J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33, 103-119

108. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J. and Dubendorff, J. W. (1991) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzimol., 185, 60-89.

109. Technical manual of Promega "Altered Sites II in vitro Mutagenesis System", США, (1999)

110. Belogurov, A. A., Yussifov, T. N., Kotova, V. U. and Zavilgelsky, G. B. (1985) The novel gene(s) ard of plasmid pKMlOl: alleviation of EcoK restriction. Mol. Gen. Genet. 198, 509-513.

111. Chang, A. C., Cohen S. N. (1978) Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the pl5A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol., 134, 1141-1156.

112. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике: Пер. с англ. М.: Мир, 1976.

113. Адаме М. Бактериофаги: Пер. с англ. М.: Изд-во иностр. лит., 1961.

114. Birnboim, Н.С. and Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523.

115. Silhavy, T.J,, Berman, M.L. and Enquist, L.W. (1984) Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

116. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

117. Technical manual of Fermentas "Reader™ DNA Sequencing Kit", (2002)

118. Краев A.C. (1988) Простая система клонирования в фаге М13 и секвинирования ДНК с терминаторами. Молекуляр. Биология, 22,1164-1196

119. Atanasiu, С., Byron, О., McMiken, Н., Sturrock, S. S. and Dryden, D. Т. F. (2001) Haracterization of the structure of ocr, the gene 0.3 protein of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 29,3059-3068.

120. Atanasiu, C„ Su, T.-J., Sturrock, S. S. and Dryden, D. T. F. (2002) Interaction of the ocr gene 0.3 protein of bacteriophage T7 with EcoKI restriction/modification enzyme. Nucl. Acids Res. 30,3936-3944

121. Tork, M. R. and Dryden, D. T. F. (2005) The biology of restriction and anti-restriction. Curr. Opin. Microbiol. 8,466-472

122. Shaw, W. V. (1975) Chloramphenicol acetyltransferase from chloramphenicol-resistant bacteria. Methods Enzymol., 43, 737-755.

123. Thomas, А. Т., Brammar, W. J. and Wilkins, В. M. (2003) Plasmid R16 ArdA protein preferentially targets restriction activity of the type I restriction-modification system EcoKI. J. Bacteriol 185, 2022-2025

124. Завильгельский Г. Б., Летучая Т. А., Расторгуев С. М. (2004) Антирестрикционная активность белка ArdA, кодируемого трансмиссивной Incll плазмидой R64. Молекул. Биология, 38 (5), 901-906

125. Delver, Е. P. and Belogurov, А. А. (1997) Organization of the leading region of IncN plasmid pKMlOl (R46): a regulation controlled by CUP sequence elements. J. Mol. Biol. 271, 1330

126. Nasim, M. Т., Eperon, I. С., Wilkins, В. M. and Brammar, W. J. (2004) The activity of a single-stranded promoter of plasmid ColIb-P9 depends on its secondary structure. Mol. Microbiol. 53,405-417

Информация о работе

Некрасов, Сергей Вячеславович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Антирестрикционный белок ArdA, кодируемый трансмиссивной плазмидой IncI группы: мутационный анализ и изучение механизма действия - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Антирестрикционный белок ArdA, кодируемый трансмиссивной плазмидой IncI группы: мутационный анализ и изучение механизма действия - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы