Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новые системы генетической регуляции конъюгационного переноса F-подобных плазмид

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Новые системы генетической регуляции конъюгационного переноса F-подобных плазмид"

На правах рукойиси«

ГИГАНИ ОЛЬГА ОЛЕГОВНА

НОВЫЕ СИСТЕМ. ЧЧЕСКОЙ

РЕГУЛЯЦИИ КОНЫОГАЦ 3 ПЕРЕНОСА

Р-ПОДОБНЫХ 1Ь 1Д

03.00.15 -генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена па кафсарс биологии и обшей генетики медицинского факультета Российского университета дружбы народов.

Научный руководитель:

академик МЛН ВШ,

доктор биологических наук, профессор Л.И. Иехов.

Официальные оппоненты:

академик РАМН и РАЕН,

доктор медицинских и биологических наук.

профессор И.В. Домарадский

доктор медицинских наук, профессор А.Н. Чеботарев

Ведущая оргашгация:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Г&малеи РАМН.

Защита диссертации состоится 1998 г. в 'О час.

на заседании диссертационного совета К 053.22.16 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.в.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов.

Автореферат разослан

Ш/ 'Г 1998г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

доирнт / О.Б. Гигани

Актуальность темы. Бактериальные плазмиды, несущие гены лекарственной устойчивости, токсигенности, гемолитической активности и других свойств, широко распространены среди бактерий естественных популяций, занимающих разные экологические ниши, причем в распространении плазмид среди бактерий разных видов важную роль играют генетические системы регуляции конъюгационного переноса. В настоящее время известны 6 различных генетических систем (fin-систем), участвующих в контроле переноса плазмиды F и F-подобных плазмид. Однако, учитывая чрезвычайное разнообразие плазмид нельзя не предполагать, что в геномах плазмид бактерий из естественных популяций могут встречаться и другие генетические системы регуляции плазмидного переноса. Поэтому актуальность темы диссертации определяется необходимостью дальнейших поисков других генетических fin-систем и их классификацией.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явились поиски (идентификация) и характеристика новых систем генетической регуляции конъюгационного переноса F-подобных плазмид Е. coli, обнаруженных в бактериях этого вида из природных популяций. Для достижения этой цели был сформулирован ряд задач исследований, а именно:

1. Изучение способности F-подобных плазмид ингибировать функции переноса плазмиды Flac и отдельных дерепрессированных F-подобных плазмид с известными типами чувствительности к ингибиторам переноса, продуцируемым под контролем fm-генов ранее изученных плазмид (эталонных ¡ плазмид).

2. Получение дерепрессированных (сЫ) мутантов исследуемых Р-подобных плазмид и их характеристика. г

3. Идентификация систем генетической регуляции переноса у изучаемых плазмид с использованием полученных ёгё - мутантов в качестве тест - систем.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые были идентифицированы н изучены новые системы регуляции конъюгационного переноса плазмид, идентифицированных в клетках условно-патогенных штаммов Е.соН. Открытые йп-системы регуляции были классифицированы в качестве новых групп йп-систем (йпА, йпВ, йпЕ), йпЕ и ГтР).

Научно — практическое значение работы заключается в том, что полученные результаты являются фундаментальными и значительно углубляют представления о генетической регуляции плазмидного переноса. Созданная в процессе выполнения работы оригинальная коллекция плазмид с различными типами систем регуляции генетического переноса и мутантных плазмид может быть использована для создания новых тест - систем при изучении контрольных механизмов переноса плазмид, являющихся обитателями различных экологических ниш, а также для конструирования новых генетических векторов.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на семинарах кафедры биологии и общей генетики Российского университета дружбы народов (1995, 1996, 1997, 1998 гг.) и на научно-практической конференции молодых ученых медицинского факультета РУДН (1996г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи, перечень которых представлен в конце автореферата.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 125 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения экспериментальных исследований, выводов и библиографического указателя, включающего 216 источников. Работа проиллюстрирована I рисунком и 17 таблицами.

Материалы и методы Об-&ектами исследований служили плазмиды бактерий, которые были идентифицированы на кафедре биологии и общей генетики РУДН Л клетках E.coli, выделенных из различных экологических ниш (pAPl l-2::Tnl Ар Col, pAPll-2::Tn5 Km Col, рАР18-1 Тс Col, рАР18-1::Тп5 Тс Km Col, рАР18-1::Тп9 Тс Lm Col, pAPl9-l::Tnl Ар Col, рАР19-1::Тп9 Lm Col, pAP20 Hlycc, pAP20::Tn9 Lm Hlya, pAP22-l::Tnl Ap, pAP22-l::Tn9 Lm, pAP22-2, pAP22-2::Tnl Ap, pAP22-2::Tn5 Km, pAP27 Ap Km Sm Te Su, рАР42;:Тл5 Km, pAP53::Tn5 Km Col, pAP68-l Te, pAP69 Ap Km Sm Te, pAP83 Sm, pAP85-2 8т).Ряд плазмид маркирован транспозонами (pAPll-2::Tnl, pAPl l-2::TnS, pAP18-l::Tn5, pAP18-l::Tn9, pAP19-l::Tnl, pAP19-l::Tn9, pAP20::Tn9, pAP22-l::Tnl, pAP22-l::Tn9, pAP22-2::Tnl, pAP22-2::Tn5, pAP42::Tn5, pAP53::Tn5). Кроме того, использовали также эталонные плазмиды из международной коллекции N- Willetts (Англия) (Flac, Rl Ар Km Lm Sm, R100 Тс Lm Sm, R62 Тс Ap, JR66a Km Тс, R455 Тс Ap Lm, R485 Ар Su, R124 ¡Te). В качестве хозяев плазмид служили клетки штаммов, производных Е. coli К-12 (АР 106 His Trp Lac RecA Sm, API15 Thi Lac Met Nal, API 32 Lac Nal, C600 Sm Thr Leu Thi Lac T1R Xs, C600 RifThr Leu Thi Lac T1E ks, E.coli Hfr С Met Tls (Я.)1ас, E.coli ф прототроф). В качестве донорспецифических фагов использовали фаги MS2, fl и Qß.

Для культивирования бактериальных клеток использовали мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), полученные из ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, а также агаризованную среду из рыбного гйдролизата. Для определения способности бактериальных клеток утилизировать лактозу использовали среду Эндо (Дагестанский институт питательных сред). Питательные среды готовили по обычной методике. Для работы с бактериофагами готовили "мягкий" (0,75%) агар. Использованные антибиотики и другие реактивы были отечественного и импортного производства.

Способность бактерий продуцировать колицин изучали по стандартной методике [Кудлай, 1969]. Чувствительность бактериальных клеток, несущих F-подобные плазмиды в drd-состоянин, к F-донорспецифическим фагам изучали методом агаровых слоев [Gratia, 1936]. При изучении пилей F-типа, формируемых плазмидосодержащими бактериальными клетками, контролем служили посевы клеток, несущих эталонную плазмиду Flac. По результатам опытов считали относительную эффективность посева (ОЭП) фагов (fi, MS2 и Qß). Для скрещивания клеток донорских и реципиентных штаммов Е. coli пользовались стандартной методикой [Clowes, Hayes, 1968]. Исследования Tra-функций конъюгативных F-подобных плазмид проводились в соответствии с методикой Gasson, Willetts [1975], модифицированной В П. Щипковым [1982]. Определение реакции нарастания титра донорспецифического фага (РНТФ) проводили по разработанной ранее схеме [Щипков и др., 1977]. Индекс нарастания титра фага (ИНТФ) определяли как отношение среднего числа фаговых зон лизиса к числу таких ЗОН) ¡обнаруженных в контрольных посевах до начала инкубации. Для обработки плазмидосодержащих бактериальных клеток К-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидином использовали

стандартную методику [Миллер, 1976]. Поверхностное исключение изучали путем сравнения частот переноса вводимых плазмид в реципиентные бесплазмидные клетки штаммов E.coli или плазмидосодержащие клетки того же штамма в прямых и обратных скрещиваниях. Индекс поверхностного исключения (ИЛИ) определяли как отношение числа плазмидных трансконъюгантов, полученных при использовании бесплазмидных клеток к числу плазмидных трансконъюгантов, сформированных в случае плазмидосодержащих клеток. Выделение плазмидной ДНК проводили по методу Meagfrer et al. [1977] с модификациями. Полученную осажденную ДНК растворяли в буфере ТЕ (5 мМ ЭДТА; 30 мМ трис рН8,0) и в этом виде препарат использовали для дальнейшего исследования. Рестрикцию плазмидной ДНК осуществляли эндонуклеазой EcoKl ("Sigma"). В качестве контроля использовали ДНК фага А- Эксперимент проводили в соответствии с методикой Manias et al. [1982]. Электрофорез проводили в 0,75% агарозном п«ге в Трис-ацетатяом буфере ( 40мМ Трис-HCl, 20мМ ацетата натр**, 2мМ ЭДТА) в горизонтальном слаб-электрофорезе при 20мА и 50V в течение 10-14 часов. После окончания электрофореза гелевуто пластинку окрашивали в растворе этидиум бромида (10 мкг/мл) и фотографировали в УФ-излучении, продуцированном ; ■рансиллюминаторной системой ("Desaga") с длиной волны Х-^Онм на фотопленку "Свема" с чувствительностью 100 единиц. Дл* определения молекулярных размеров плазмидных рестршггов стоили калибровочные кривые в плоской декартовой системе координат. В качестве стандарта значений молекулярного веса использовав EcoRl - фрагменты ДНК фага X [ Daniels et al.,1980].

Результаты исследований и их обсуждение

1. Изучение исходных свойств бактериальных плазмид. используемых в работе.

Начальный этап исследований был связан с изучением свойств, контролируемых плазмид ами, отобранными для поисков, идентификации и характеристики новых систем . рефляции генетического переноса у бактерий. Результаты этой серии экспериментов показали, что все изучаемые плазмиды характеризуются спо.собностыо придавать клеткам-хозяевам чувствительность к фагу МБ2 (т.е. все они являютсяр-ррдобными). Кроме ,тогр,. каждая из плазмид содержит гены резистентности к соответствующим антибиотикам, а некоторые из плазмид - и гены колициногенности.

2. Изучение способности исследуемых гб-плазмид ингибировать функции переноса плазмиды Р1ас.

Таблица 1.

Способность г<1-плазмиды ингибировать функции переноса и

пилеобразования плазмиды Flac.

.Состав двойных трансконъюгантов Частота передачи плазмиды Flac в клетки бесплазмадного штамма API 32 ИИП Flac Чувст-витель-ность к фагу ' МБ2

drd-плазмида rd-плазмида

Flac pAP19-l ::Tn9 (1,0-2,5)х10"1. 0,7.1,7 +

Flac pAP20::Tn9 (1,1-1,2)х10-> .,, 0,8-0,9 +

Flac pAP22-l::Tnl (2,3-3,4)х10"1 0,3-0,5 +

' Flac pAP27 '(1,2-1,^ИГ1 '0,6-0,9 +

■ Flac pAP68-l (0,55-0,ejxlQ-1 Р,6-

Flac pAP69 (0,36-0,58)Х10;! 0,^-1,0 +

Flac pAP83 • (0,78-0,8)х10'1 0,75- +

Flac pAP8S-2 ■ (1,0-1,4)х10-' ! 0,43'- +

Следующий этап исследований был связан с выявлением плазмид,

являющихся возможными носителями новых йп-систем. Для этого в

стандартных конъюгационных скрещиваниях были сконструированы диплазмидные трансконъюганты, в состав которых входила плазмида Flac и одна из плазмид rd-типа. По результатам изучения способности rd-плазмид ингибировать синтез плазмидой Flac функционально активных плазмидоспецифических пилей и анализа установленных индексов ингибирования переноса эталонной плазмида (которые колебались в пределах 0,3-1,7) было выявлено 8 rd-плазмид (табл.1), не отличающихся способностью негативно влиять на перенос плазмида' Flac. Поскольку Flac чувствительна ко всем известным ингибиторам переноса плазмид, синтезируемым под контролем генов fin ОР, Q, U, V, W, С, то был сделан вывод о том, что исследуемые rd-плазмиды не являются носителями этих fin-систем, а, вероятно, могут быть носителями других (новых) систем fin.

3. Изучение способности исследуемых rd-плазмид ингибировать Тга-функции drd-плазмид с известными типами чувствительности. Для проверки этого предположения были предпринять! эксперименты, связанные с изучением способности rd-плазмид;рАЯ19-1::Тп9, рАР20::Тп9, рАР22-1::Тп9, рАР27 ингибировать Тт-фунйдаи отдельных drd - плазмид с известными типами чувствительности; "

В результате проведенных исследований было показано, что репрессированные плазмиды рАР19-1::Тп9, рАР20::Тп9 и pAP22-l::Tnl не способны ингибировать связанные с конъюгативностыо функции всех drd-плазмид (ни частоту передачи, ни синтез пилей F-типа) исследованных rd-плазмид (табл.2). Другими словами, указанные drd-плазмиды не чувствительны к действию ингибиторов, синтезируемых под контролем fin-генов исследованных rd-плазмид.

Напротив, плазмида рАР27 rd может оказывать подавляющее действие на функции петлеобразования и на частоту переноса drd-плазмиды рАР11-2::Тп5, не ингибируя при этом Tra-функции других drd-плазмид (pAPll-2::Tnl и рАР53::Тп5) (табл.2). Таким образом, исследованные rd-плазмиды были не способны, во-первых, ингибировать Tra-функции плазмиды Flac, а во-вторых, подавлять аналогичные функции отдельных drd-плазмид с известными типами чувствительности. Из этого следует, что неэффективность ингибиторов исследуемых в этой работе rd-плазмид по отношению к плазмиде F и другим drd-плазмидам зависит от наличия определенных генов fin в геномах id-плазмид, которые существенно отличаются от fin-систем, ранее описанных в литературе.

Таблица 2.

Способность rd-плазмид ингибировать функции переноса и пилеобразования drd-плазмид.

Состав двойных Чувстви- Частота передачи ИИП

трансконъюгантов тельность drd-плазмиды в drd-

drd-плазмида rd-плазмида к фагу MS2 клетки бесплазмидного штамма АР 106 плазми -ды

рАРП-2::Тп1 + (1,0-2,0)х10"' 0,5-0,3

рАРИ-2::Тп5 рАР19-1::Тп9 + (1,2-2,4)хЮ'1 0,7-1,0

рАР53::Тп5 + (2,0-4,2)х10"1 0,2-0,4

pAPll-2::Tnl + НО НО

рАР11-2::Тп5 рАР20::Тп9 + (2,0-2,1)х10'1 0,4

рАР53:.Тп5 + (3,1-3,7)х10'1 2,0-2,3

pAPll-2::Tnl + НО НО

рАР11-2::Тп5 рАР22-1 ::Тп1 + (1,0-2,0)х10"' 0,4-0,9

рАР53::Тп5 + (0,3-2,l)xl О"1 0,3-2,5

pAPll-2::Tnl + НО НО

рАР11-2::Тп5 рАР27 - (0,4-1,ЦхКГ1 1,6-7,8

рАР53::Тл5 + (1,0-2,8)х10-} 2,6-7,5

Примечание: НО - не определяли.

4. Получение дерепрессированных мутантов плазмид рАР19-1: :Тп9. рАР20::Тп9. РАР22-1::Тп1. рАР27.

В соответствии с целями и задачами настоящей работы следующий этап исследований был связан с изучением конъюгативных свойств гс!-плазмид рАР19-1::Тп9, рАР20:;Тп9, рАР22-1::Тп1, рАР27. С этой целью получали мутантные варианты плазмид, идентифицируемые как йтй по функциям генов плазмидного переноса. В результате обработки плазмидосодержащих бактериальных клеток нитрозогуанидином (в концентрации 40 мкг/мл) были .селекционированы мутантные клоны клеток Е.соП, несущие плазмиды рАР19-1::Тп9 и рАР20::Тп9, характеризующиеся сМ-характером синтеза пилей Б-типа. Принадлежность мутации геному плазмиды, а не хромосоме бактериальной клетки-хозяина, подтверждалась в дополнительных экспериментах.

5. Влияние клетки-хозяина на экспрессию йа-генов плазмид.

В процессе экспериментальной работы было обнаружено, что в клетках штамма Е.соН АР132 мутантные варианты плазмид утрачивали способность обеспечивать синтез пилей Б-типа. Это позволило судить о проявлении влияния со стороны генов хромосомы бактериальной клетки-хозяина на экспрессию йв-генов своей плазмиды.

6. Конъюгативные свойства дерепрессированных мутантов Р-подобных плазмид рАР19-1::Тп9 и рАР20::Тп9.

Дальнейшие эксперименты были связаны с исследованием конъюгативных свойств полученных сЫ-мутантов.

В процессе изучения изменений в эффективности передачи <3гс1-мутантов по сравнению с плазмидами клеток оригинальных штаммов было показано, что воздействие мутагена на плазмиды не

сопровождалось изменением частоты переноса плазмид. Следовательно, можно полагать, что под влиянием химического агента произошла индукция изменений в структуре только того района tra-области, который контролирует функцию пилеобразования.

В ходе экспериментов по определению чувствительности плззмидосодержащих бактериальных клеток к различным F-пилеспецифическим фагам (MS2, fl, QP) путем подсчета относительной эффективности посева фага и ее сравнительного анализа было показано, что для клеток E.coli, содержащих одну, из drd-плазмид наблюдался высокий уровень чувствительности ко всем трем фагам, эталонным для разных групп (табл.3). Руководствуясь литературными данными можно сделать вывод о принадлежности пилей исследованных drd-мутантных вариантов rd-плазмид к пилям I группы согласно классификации Willetts- Maule [1985].

Таблица 3.

ОЭП F - пилеспецифических фагов на клетках E.coli, несущих плазмиды.

Плазмида ОЭП фагов (в %)

fl MS2 QP

Flac 100 100 100

pAP19-l::Tn9 drd 100 76 100

pAP20::Tn9 drd 100 60 100

Индексы поверхностного исключения, полученные в соответствующих экспериментах, оказались ниже 20. Это не позволило считать их достоверными для того, чтобы отнести исследуемые плазмиды к какой-либо группе Six из 4 эталонных. Однако, можно предполагать принадлежность данных плазмид к другим группам Six.

7. Чувствительность drd-плазмид pAP19-l :;Tn9, рАР20::Тп9 и pAP22-2::Tnl к ингибиторам функций tTa-генов.

Следующий этап выполненных исследований был связан с изучением чувствительности мутантных плазмид к различным ингибиторам переноса как одного из основополагающих факторов, влияющих на эффективность переноса в процессе конъюгации.

Поскольку частота передачи drd-плазмид в данном случае не являлась достоверным критерием оценки в определении влияния ингибиторов тех или иных fin-систем, то степень ингибируемости Тга-функций исследуемых drd-плазмид плазмидами rd-типа изучали путем определения активности "половых" пилей, адсорбирующих донорспецифические фаги. В качестве rd-плазмид использовали плазмиды то коллекции Willetts, детерминирующие синтез ингибиторов известных типов (FinOP, FinQ, FinU, FinV, FinW), a также плазмиды, под контролем выявленных нами fin-систем которых синтезируются ингибиторы новых типов (табл. 4).

Полученные результаты .(табл.4) можно оценивать с разных точек зрения. Во-первых, каждая из drd-плазмид приобрела резистентность к ингибитору переноса Собственного типа. Это свидетельствует о том, что индуцированная иитрозогуанидином мутация, видимо, затронула сайт чувствительности к действию^ репрессора. Во-вторых, выявлен негативный эффект на функции пилеобразования плазмид рАР19-1 ::Тп9 drd и рАР20::Тп9 drd со стороны эталонных rd-плазмид и pAP22-l::Tnl. Последняя же подвержена репрессивному воздействию ингибиторов типа Fin Q, U, V. Таким образом, исследованные drd-плазмиды были идентифицированы как обладающие поливалентным характером чувствительности к ингибиторам плазмидного переноса разных генов.

Таблица 4.

Способность (+) гс1-плазмиды ингибировать

функции пилеобразования иа-генов сЫ-плазмиды.

гсЬплазмида с1г ¿-плазм ида

рАР19-1::Тп9 рАР20::Тп9 рАР22-2::Тп1

11485 (йпУ) + + +

Жбба(йпи) + +

Л62 (йпО) + + +

11455 (Гт\У) + 4- -

ЮОО (ГтОР) + + -

рАР19-1::Тп1 - - но

рАР19-1::Тп9 НО но -

рАР20 - - но

рАР20::Тп9 но но -

рАР22-1::Тп1 + + но

рАР22-1::Тп9 но но -

рАР27 - - -

Примечание: НО - не определяли. 8. Идентификация новых систем генетической регуляции плазмидного переноса.

Изучалась способность выявленных в начале гс1-плазмид ингибировать функции пилеобразования 10 сЫ-плазмид из коллекции кафедры, куда вошли и селекционированные мугадты. Анализируя Итоги проведенных исследований, можно сказать, что они свидетельствуют о функциональной неоднородности ингибиторов переноса, синтезируемых в клетках бактерий под контролем йп-генов исследованных М-плазмид. Налицо различия в способности отдельных гё-плазмид ингибировать Тга-функции тех или иных плазмид дерепрессированного типа. Например, гсЬплазмиды рАР19-1::Тп1, рАР19-1::Тп9, рАР20, рАР20::Тп9 и рАР83 проявляют себя

совершенно одинаково и способны ингибировать функцию пилеобразования плазмиды рАР18-1::Тп5. Саморепрессируемая плазмида рАР22-1::Тп1 также ингибирует упомянутую функцию сМ-плазмиды рАР18-1 ::Тп5, но в то же время оказывает такое же действие и на плазмиды рАР19-1::Тп9 <Ы, рАР20::Тп9 <кй и рАР42::Тп5 <М Вообще, (М-плазмида рАР18-1::Тп5 отличается множественным характером чувствительности к ингибиторам, синтезируемым под контролем йп-генов плазмид рАР19-1:.Тп9, рАР20::Тп9, рАР22-1::Тп1, рАР83 . и рАР69. Последняя также характеризуется широким кругом действия, куда попали и сМ-плазмиды рАР18-1, рАР42::Тп5, рАР53::Тп5. В отличие от плазмиды рАР69, гё-плазмида рАР27 способна ингибировать функцию образования плазмидоспецифическнх "половых" пилей (Ы-плазмвды рАР11-2::Тп1. Плазмиды рАР68-1 и рАР85-2 не влияют на конъюгативность ни одной из используемых (1гс1-плазмид. : .. .

Учитывая эти различия, мы классифицировали йп-системы 8 исследованных плазмид и их транспозонсодержащих вариантов на 5 групп. К группе йпА отнесли йп-гены плазмид рАР19-1::Тп1, рАР19-1 ::Тп9, рАР20, рАР20::Тп9, рДР83; к группе йпВ - Ап-гены плазмид рАР22-1::Тп1 и рАР22-1::Тп9; к йпО - йп-гены плазмиды рАР27; к йпЕ - йп-гены плазмиды рАР69; к йпР - йп-гены плазмид рАР68-1 и рАР85-2.

9. Определение молекулярных масс факторов переноса рАР19-

1::Тп9 гё. рАР20;;Тп9 тй и их дерепрессированных мутантных вариантов.

Поскольку молекулярно-генетический анализ плазмидной ДНК является важным моментом характеристики плазмид, были предприняты эксперименты по выделению ДНК изучаемых плазмид и

обработке их рестриктазой EcoRl с последующим электрофорезом. На основании анализа полученных- рестриктограмм установлены молекулярные массы факторов.переноса pAP19-l::Tn9 rd, рАР20::Тп9 rd. и их drd-вариантов (табл.5). Кроме того, были выявлены значительные структурные перестройки в геномах rd-плазмид под влиянием мутагена, приведшие к делении EcoR l -фрагмента f5 исходной плазмиды и появлению нового Eco R1 Б-фрагмента у ее мутантного варианта в случае плазмиды pAP19-l::Tn9, а также к делеции EcoRl-фрагмента f4 ДНК плазмиды pAP20::Tn9 rd.

Таблица 5.

Количество и размеры рестрикционных EcoRl-фрагментов

исследуемых плазмид (в МД).

Фрагменты ¡V'! ! I ' . Плазмиды

рАР19-1::Ти9 rd рАР19-1::Тп9 drd рАР20::Тп9 rd рАР20::Тп9 drd

1 15,8 15,8 16,8 18,1

2 12,5 12,5 15,7 15,7

3 4 4,9 ' 8,8 11,9 12,5

4 3,5 - ■ 4,9 7,0 6,0

5 2,9. . 3,5 . 5,7 ■ 3,5

6 2,2 2,2 ., .3,4 3,0

7 2,1 2,1 3,1 2,6

8 2,5

Общая

молекуляр- 43,9 49,8 66 Д 61,4

ная масса (МД)

Выводы

1. Выявлено 8 плазмид E.coli ( рАР19-1::Тп9, рАР20::Тп9, рАР22-1::Тп"1, рАР27, рАР68-1, рАР69, рАР83, рАР85-2), которые

оказались не способными ингибировать Тга-функции эталонной drd-плазмиды Flac, что указывало на наличие в их геномах регулирующих систем fin, отличных от известных (описанных) систем fin. ! 1 ,,,,-,■.„

2. Репрессированные плазмиды рАР19-1::Тп9, рАР20::;Тл9 и рАР22-1::Тп1 не способны также ингибировать конъюгативные. функции drd-плазмид pAPll-2::Tnl, рАР11-2::Тп5 и рАР53::Тп$. Напротив, плазмида рАР27 оказывает подавляющее действие на функции пилеобразования и частоту переноса drd-плазмиды рАР11-2:;Тп5, т.е., плазмида рАР11-2::Тп5 чувствительна , к ингибитору, контролируемому системой fin rd-плазмиды рАР27. ^

3. Исследованные rd-плазмиды и их транспозонсодержащие варианты оказались неодинаковыми по ингибирующей активности в применении к разным плазмидам drd, что позволило классифицировать их fin-системы на 5 групп, отличающихся от известных. К группе finA принадлежат fin-гены плазмид рАР19-l::Tnl, рАР19-1:.Тп9, рАР20, рАР20;:Тп9 и рАР83; к группе finB -fin-гены плазмид рАР22-1::Тп! и рАР22-1::Тп9; к группе finD - fin-гены плазмиды рАР27; к группе finE - fin-гены плазмиды рАР69; к группе finF- fin-гены плазмид рАР68-1 и рАР85-2.

4. Обработка плазмид рАР19-1::Тп9, pAP20::Tn9, pAP22-l::Tnl и рАР27 К-метил-К'-нитро-Н-нитрозогуанидином позволила выделить мутанты плазмид рАР20::Тп9. и рАР19-1::Тп9, характеризующиеся дерепрессированным,.синтезом пилей F-типа. В соответствии с существующей классификацией F-подобных пилей пили мутантных плазмид были отнесены к группе I. •

5. Хромосомные гены E.coli оказывают влияние на экспрессию tra-генов мутантных drd-плазмид рАР19-1::Тп9 и рАР20::Тп9, что

выражается в потере ими способности детерминировать синтез F-пилей, причем эта потеря зависит от штамма бактерий, в клетках которого находятся плазмиды.

6. Плазмиды drd рАР19-1::Тп9, рАР20::Тп9 чувствительны к ингибиторам, контролируемым fin-системами finOP, finQ, finU, finV, finW и fin-системой плазмиды pAP22-l::Tnl, тогда как drd-плазмида pAP22-2::Tnl оказалась чувствительной к ингибитору, контролируемому системами finQ, finU и finV.

7. Обработка шпрозогуанидином бактериальных клеток, содержащих исходные rd-гшазмиды рАР19-1::Тп9 и рАР20::Тп9, сопровождалась значительными структурными перестройками в геномной организации этих плазмид. Индукция drd-мутанта плазмиды рАР19-1::Тп9 сопровождалась делецией EcoRl - фрагмента f5 исходной плазмиды и появлением нового фрагмента f3, тогда как индукция плазмиды рАР20::Тп9 сопровождалась делецией EcoRl -фрагмента f4 исходной плазмиды.

Публикации:

1. Гигани О. О. Конъюгативные свойства дерепрессированных F-подобных плазмид Escherichia coli с новыми системами регуляции переноса // Вестник РУДН. Серия "Медицина". - 1998. - N 2. -С.33-35.

2. Гигани О.О., Буянова Н.И., Щипков В.П., Пехов А.П. Идентификация и характеристика новых систем регуляции генетического переноса плазмид //Бюл. экспер. биол. и мед. - 1998. - N 4. - С.440-442.

Гигани Ольга Олеговна (Россия)

"Новые системы генетической регуляции коныогаинонного сноса Р-подобнмх плазмнд".

Работа посвящена изучению регуляции конъюганионного переноса 5мид, идентифицированных в клетках условно-патогенных штаммов >!i. В результате исследований были выявлены 5 новых систем /ляции плазмидного переноса. С^ги системы обозначены как finA, I, t'mU, finE, tin!-.

11олучены дерепрессированные мутанты двух ['"-подобных плазмид )li с новыми системами регуляции переноса и изучены их ъюгативные свойства

Молекулярно-генетический анализ исходных rd-плазмид и их drd-ант'ов показал значительные структурные перестройки в геномах ашных вариантов.

Olga О. Gigani (Russia)

"The new genetic control systems of the K-like plasmids' njugational transfer".

The thesis is dedicated to the plasmids' conjugational transfer systems' :cial features, identified in the conditionally pathogenic E.coli strains' lis. As a result of the research 5 new plasmids' conjugational transfer items were discovered. These systems are denoted as: finA, finB, finD, E, finF. The derepressive mutants of two F-like plasmids E.coli with w conjugational transfer systems were received and their conjugative jperties were studied. The moleculary - genetic analysis of the starting rd-ismids and their drd-mutants showed considerable structural reorganisation the mutant variants' genoms.

I4.09.98r,_Объем In. л. Тир. 100_Зак. 601

Тип. РУДН, Орджоникидзе, 3