Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и изучение дерепрессированных мутантов фактора генетического переноса рАР43

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и изучение дерепрессированных мутантов фактора генетического переноса рАР43"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КО'ЛИТЕТ СССР ПО НАРОДНОЛ\У ОБРАЗОВАНИЮ

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ имени ПАТРИСА ЛУМУМБЫ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ДЕРЕПРЕССИРОВАННЫХ Л\УТАНТОВ ФАКТОРА ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПЕРЕНОСАрАР43

(03.00.15 — генетика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

МЯНДИНА Галина Ивановна

УДК 579.25 : 579.252.5

Москва—19 9 0

Работа выполнена в ордена Дружбы народов Университете дружбы народов имени Патриса Лумумбы.

доктор биологических наук, профессор А. Г1. Пехов.

доктор биологических наук В. Д. Филиппов, кандидат биологических наук Н. Е. Березкина.

Ведущая организация — Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи АМН СССР.

Защита диссертации состоится 1990 года

в 15*>С0часов на заседании специализированного совета К 053.22.16 в ордена Дружбы народов Университете дружбы народов имени Патриса Лумумбы по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Университета дружбы народов имени Патриса Лумумбы по адресу: Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Научный руководитель —

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан « " »

1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук, доцент

л. ф. левина

ОЕЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Бпктериальнке плязмида прэдставлгаг собой экстрахрочосоглные генетические элементы, способные к собственному поддержанию и воспроизводству в клетках бактерий. Они широко распространены i природе, льетесь обитателями бактерий многих видов, прикадлвйащх к pasjia-i;;ir« оготематичеокта групппм, включая архебактерии. *1е являясь яизнешю необходимыми элементами бактериальных клеток, плг.т г.иды, тем не t/enee, определяют ряд их ванных свойств я служат мощным фактором эволюции микроорганизмов. Наиболее изученной плазмггдой является фактор генетического пораноса ъ' , который впервые был идентифицировав в б.coli (lederberg et al. , 1952) и который длительное время считался единственной плазгяэдоЯ птзго типа. Поскольку познание основных сеойств факторов гекегичэского переноса имеет первостепенное значение для пошш-мня механизмов плаекад-ного переноса и его регуляции, а также для покидания эволта_и аонъюгативних коинтегративных плазмад, гжуальнорть тем диссертации определяется необходимостью всестороннего изучения других Р -подобных ф£ торов генетического пзлеиоса.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось изучение свойств дерепрессированных мутантов.F -подобного фактора генетического переноса рАР43 • обнаруженного в клетках услоено-патогенного серологически типируеиого штагяла е.coli и классифицированного в пределах группы несогместимссти incFVili (Е.В. 1убарь, 1985). Для достижения этой дали были сформулированы следующие задачи:

1. Получить экспериментальные данше с целью молекулярно-генетической характеристики фактора генетического переноса

2. Осуществить поиски мутантов фактора переноса рАР^з, дерепрессированных по переносу и, в случае успеха изучить молекулярные размеры, конъюгативность, типы регуляции 1га -функций, а та":з способность drd-мутантов мобилизовать на перенос хромосомное тены, включая образование клеток типа Hfr.

3. Изучить способность фактора переноса pAP^jdrd мобилп-зовать на перенос неконъюгативные плазмиды и осуществить позоп коинтегративных плазмидных структур, формлруда'зсся в процэосе мобилизации.

4. Б случае идентификации плазмидных коинтегратов изучить

их свойства.

Раб та "чполнена в соответствии со Всесоюзной программой "Плазмвда" по научно-техническо' проблеме 0.74.05 (й госрегист-рацшгтемы - 8II0247I 01.86.0013658).

Научная новизна работы заключается в том, что в результате выполнениях исследований впервые идентифицированы и изучены drá -мутанты фактора генетического переноса рАР4? . Показано, что мутан: ый фактор генетического переноса pAP42drd характеризуется повышенной конъютативностыэ, значительным диапазоном переноса, способностью мобилизовать па перекос хромосомные геш и включаться в бактериальную хромосому, что ведет к образованиз клеток-доноров типа Hfr . Установлено, что перенос drd -мутакт-ного фактора рАР43йх^ не чувствителен к ингибиторам функций переноса, детерминируемым всеми'известными системами регуляции переноса. Наконец, доказано, что в процессе мобилизации на перзноо drd-: /тантным фактором i>AP45drd:.Те5 неконьюгативных шгзмид ■ могут формироваться структуры, сходные с типичными коныогативны-мн кокнтегративными плазмидаш. Полученные результаты являются ■ фундаментальными и значительно расширяют преде1явления о плазми-дах типа факторов генетического переноса.

Практическая ценность полученных результатов заключается в том, что в процессе выполнения иссл сований сконструированы плазмидные структуры, которые могут быть использованы в качестве окспериментальной модели при решении ряда проблем современной плазмидологии (kj ссификапдя плазмид, тишрование систем регуляции плазмидного переноса и др.).

Апробация работы..Материалы диссертации докладывались на научных семинарах кафедры биологии и общей генетики УДИ иы.П.Лу-мумбы, а такг-е на Всесоюзных совещаниях по програ?,ме "Плазмцца" (1983, 1984, 1986).

Пубтакэчии. По ?^атериалагл диссертации опубликовано 5 работ.

£труг'ура и обьеч робота. Диссертация состоит из введения, обзора литератур результатов исследований, их обсуждения и выводов. Матергал на 179 страницах машинописного текста, содерат 46 таблиц, "0 рисунков. Список цитированной литератур;; вклечаог 32¿ usîii'jhobfcjniiî.

«лтеяшш и метода

В работе копользегалк гт^.м.а. е. toll api Я) not vis leo, Ai'lií? et thi Inc Kal", .l'.lOó try. his; lac rpeL гоаА, API32 lac 2

Nalr, ABII57 thr leu thi proA his argE lac gal ara.xyl mal Т6Г jfrpsL, J600 thr leu thi lac TIr^3 rpcL, C600 thr lau thi lac TI^Hif1, JE257I thr lev fia pil rpsL, GAI2I trp dnaA(ts), K3I324 thr leu org his str 2шг,КБ8ГЛ ггз trp pur thi lac xyl recA HPI(Tn9),UBI636 trp his lys lac nal gal T6"^rspc rpsL polAÎ HfrC serA, E.coli I^ (прототроф), PA256 pro his a-çE purA thi' mal xyl lac gal srlialr,PA373 thr leu his thi !.. ~yl lac gal SrNalr E.coliH35(086K"H23) lac cys,E.o^IiB/r'.',V36 fcyr,E.coliB (npOTO-троф) Salmonella typhimurium IŒ2 tyr cys , а "акяе КОНЪЮГаТИВ-НЫВ И неконъюгативные рАР43, F'lac, H62 Тс, HI00 Тс, R455 Ар Cm Тс,НВД5 Su,JH66a Km,pSCI0I Тс,рВЕ322 Ар îo,pMR5 АрКМГс, ' PACYCI84- Тс Cr.,pHSFI0I0 SuSa,pESF2I24 Ар ColEI ,CloDFI3cop3 Cío.

В качестве докорспевдфяческкх фагов использовали фаги MS2, QjJ и PERI , чувствительность бактерий к которым определяли методом агаровых слоев (Gratia , 1936).

Снрещиваш-i донорских и рецилкентных клеток проведали по стандартным методикам (Clowes, Hayes , 1968) с модификациями (А.П.Пехов и др., 1980).

Препараты для изучения бактериальных пплей» дстср;,;ннйруе~ мнх плне^да:^!, roío^-uni по методике негативного контрастирования (Crawford, '.Gesteland, 1964) и просматривали в электронном микроокопе JEM-iooB.

Изучение способности бактерий продуцировать колиция определяли методом укола (Д.Г.КУдлай, 1969). УО-облучение клеток E.coli проводили по методике Tacón a. Sherratt (1976). Транс-позо1Ш Tni, тп5 и Тп9 вводили в плазмидг рАР^з в "трехроди-тельеккх" скрещиваниях бактерий (Бо et al. , 1978). Совместп-мость (несовместимость) плазмид определяли по Eatta (1977)» Спонтанную элиминации плазмид изучали по стандартной методике, индуцированную бромистым этидием - по методике Bonanchand ot al. (1968), акридиновым орангевым-- по Hirota (I960). Обработку бактериальных клеток нитрозогуаниданом проводили по Миллеру (1976). Идентификацию hfr -клеток пооводлли по Nishimura et al. (1973).

Ингибирование функций переноса плазмид определяли по Ges-son a. Vrilletts (1975) о модификациями (В.П.Щипков, 1982).

Плазмидную ДНК выделяли по Meagher et al. (1977). Рестрикцию плазмидной ДНК проводили, используя ферменты Eco.rT, Sali HindiiI, BanHl , с пооледуюшим горизонтальным slab -электрофорезом в 0,8$ araрозном геле.

Статистическую обработку полученных данных проводили по ~ метолу арк-циониой статистики (П.В.Терентьев, Н.С.Ростова, 1977).

Г^ЗГЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Осковныз свойства фактора рАР43 и его транспозонсодер-жащих вариантов

Изу-^нпе основных свойств фактора рДР43 ыы начали с определения активности системы перекоса (конъютативности) его транспозонсоде рзкаикх вариантов pAP4-3:s~.iI, pAP4j>::Tn5 и рЛРА-3: :Тп9 . С этой целью определяй:! ччстоту плазмидного пера-носа в скрещиваниях клеток Б.coli АР115 , содержащих один из вариантов фактора р..Р43, клетками-реципиентами е.coli С 600, а также исследовала чувствительность пл. лмидосодернацих клеток E.coli к донорспецкфзческим фагам MS2, и fi.

Результаты.этих экспериментов показали, что клетки "¡.coli, содержащие один из вариантов фактора рШЗ, не обладают чувствительностью к докорспецифическим фатам, а частота переноса изу чаемых факторов бьла низкой, в частности, на Г-3 порядка ниже частота переноса эталонной drd -плазмиды F'lac . Полученные результаты свидетельствуют о том, что фактор переноса рАР43 и его транспозонсодеркащце варианты представляют собой типичные rd. -плазмиды (репрессированные по функциям переноса).

В дальнейших экспериментах мы изучали способность фактора рАР43:: Тп5 икп 'ировать функции переноса эталонной плазмиды P'lac , Определеше частоты переноса плазмиды F'lac из диплаз-мидных клеток позволило выявить эффект ингибирования ее переноса, обусловленный фактором рАР43:: Тп5 (и.и.частоты переноса составлял 12-150). Поэтому исследуемый фактор переноса был отнесен к плазмидам тепе £1+ » Кп основании полученных данных мы предположили наличие в Тйио-ve фактора рАР43 гонов негативной рвгуляцш; переноса.

Для голуч^шд о молекулярных размерах фактора

рАР43 Ovjt гфОЕедгл ресчривцаонный анализ его ДНК с помощью ферментов к< -' 11 Sali и ninüIII . Результата рестрикцнонното анализа показсли» что ДНК жучаемстг фактора кмоет 12, сайтов узнавания ресгршсгазы EcohI , 7 с«йтов - рестрг'.гл-чзц Sali и 22 саЦто - poci'jr.;.yas:i Mndiii . Молояулчрная к.: сса фактора рАР43 составляет 77 т:™с --. .•теет':?вузт 115,5 т.п.';, Охр данные по-

зволям заключить, что фактор рАР43 является относительно крупной плапмидой.

2. Идентификация drd -wjtehiob фактора рАР43

Для идентификации дере^ресслрованных по переносу мутантов (drd ) фактора рАР43 мы осуществляли эксперименты по выявлении спонтанных и индуцированных drd-мутащй. Для ""'дукции drd -мутаций использовали инсерцшо трзнспозонов в .топом исслодуемо-го фактора или клетки е.--ill APII5 (рАР43) обрабатывали N -метпл-N'-ffiiTpo-if -нитрозогуатщином. Селекц^по drd-tiyTaHTOB _ вела на чувствительность бактериальных клеток, содеряздях drd -мутантны!5 фактор рАР43, к донорспецифичзским фатам.

Экоперимонты по идентификация спонтанных л индуцированных транспсаонами мутантов фактора переноса рАР43 показали, что частот« ал-d-мутаций в етих случаях остаточно низкая. Напротив, среда клеток APII5 СрАР43), обработанных мутагеном, было выявлено 2 клона клеток, чувствительных к доноре пецэ±оте~ оким фагам, причем по эффекта юоти посева фага 'KS2 они не отличались от клеток "?П5, содеркащцг эталонную drd -плазмгг-ду F'lac . Мч предпсло:^л5, чхо клетк. идентифицированных клонов оодераат мутантный фактор переноса рА?43, дерепресоирован-нкй по функциям переноса, который бал обозначен оимволом pAP43drd . Для генетпчзского «аркировакия в г/утвнттй фактор бил взздан трэнспозон ад , в результате чогс был получен трэнспозонсодергав;*;! вариант pAP43drd»iTn5.

3. Основные свойства факторов пореноса p.£P43dxd И pAP43drds ;Тп5

Рестрикционный анализ ДНК мутпнтного Фактора рАР43. Изу-ченив свойств идентифицированного ard -мутанта pAP43drd бнло начато о определения его молекулярной кассы. Оказалось, что она составляет 58,7 ВД. Для того, чтобы выяснить молекулярт; основы дерепрессии по функдаям переноса фактора рАР43, ш пг,с~ *> вели сравнительное изучение Eco;ti, Hindin я §sli -рэотрх: -тов ДНК факторов рАР43 (дикого типа) и pAP43drd . Рсзультл:: ■ рестрикциошюго анализа показали, что дерепрессия по переноса фактора рАР43 связана о индуцированной нятрогогувни-дином делецией части его тенома, составляющей (24,3+1,3)£. В частности, в геном? фактора рАР43 произошла индуцированная де-2-6 Of

леция EcoRl-фрагментов f^(7,7 ВД), f7(3,4 гш, ís(3,I МД), f9 (3 МД' , ±7~)(2 ВД)-и fii(I,7 МД). Сравнение электрофореграмм продуктов Sali- и HindlII-pec.рикций ДНК факторов рАР43 и pAP43drd тоже показа ■> наличие делеции части ге"ома фактора рАР43, индуцированных нитрозогуаниданом.

Для определения локализации транспозона Тп5 в геноме фвк-тора pAP43drd: :Тп5 было проведено сравнительное изучение Sall-и HindlII -рестриктов ДНК факторов pAP43drd и pAP43drd: :Та5. Результаты этих исследований показали, что произошло включение 2-х. копий транспозона Тп5 в геном фактора pAP43drd.

Конъютативность сбактора pAP43drd:. Уровень конъюгати-вности этого фактора мы исследовали в скрзщиваниях Е.coli . Полученные результаты ^оказали, что частота собственного переноса фактора pAP43drd::Тп5 в клетки различны:, штаммов E.coli Е-12 в 10-60 раз превышает частоту переноса фактора рАР43::Тп5 . Ана-лизир^л данныеполученные в этих экспериментах, мы заметили, что дерепрес.сия по функциям переноса к пилвобразования исследуемого drd-мутантного фактора pAP43drd*. :Тп5 проявляется "выборочно" (в зависимости от штаммовой принадлежности клеток-хозяев) и проявляется лишь в клетках E.coli APII5, APII0 и C600Hlf, но не в клетках штаммов Е.coli API06, ABII57, API32 и je 2571. Чтобы выяснить причины это'^о явления, мы провели электронно-микроскопическое исследование клеток E.coli APII5 и JE 2571 ("лысого" штамма), содержащих фактор pAP43drd::Тп5 . В качестве контроль использовали клетки APII5, содержащие фактор рАР43 (дикого типа).

Результаты электронно-микроскопических исследований показали, что на поверхности клеток APII5 (pAP43drd::Txi5 ) синтезируются пили "гибкого" типа, характерные для F -подобных плазмид, на которых адсорбируется фаг KS2 , тогда как на поверхности фа-гоустойчивкх клеток .ТЕ 2571 (pAP43drds :Та5 ) шли обнаружены не были, так как и на поверхности клеток APII5, содержащих фактор рАР43 (доткого типа). Поскольку отсутствие чувствительности к фагу клеток je 2571'(рАР43 drd: :тп5 ) корродировало со ohhejhi'.-ем т"'0Т0ТК п&р'-носа ¿актора pAP43drd::Тп5 на одан порядок, по сравнении с частоюп переноса этого фактора из фагочувствителъ-ных клеток APII5, m сделали вывод о влиянии генома клетки-хозяина но ькспреоста tra -генов 'фактора рАР43

Fin-активность фактора pAP43drd и ^.мид.чт» pAP43¿fA üJEsJL V далью определения Па-актигйоо i* rffcpa рАР43 Ггл5

и ето варианта рАР43 drd::Тп5 были проведены опыты по изучению влияни.* drd -мутантных факторов на частоту переноса плазмада • F'lac . Результаты прове' "шшх экспериментов показали, что drd -варианты р-учаемого фактора сохранит способность ннгиби-ровать перенос плазмиды F'lac Си.и. составляет величину от 300 до 33), т.е. являются илеамидами типа £i+. Таким образом, дерепрессия по функции переноса фактора рАР4"!, возможно, связана с потерей сайта чувствите..ьностн к собственному ингибитору переноса (фертильности), синтез которого не был затронут мутацией, т.к. фактор рА^43 drd проявляет Fin-активность в отношении плазмиды F'iac.

Чувствительность система переноса шактора рАР43 drd.;:Тп5 к Fin-системам. Как известно, к настоящему времени выявлено 6 систем ингибирования ( Fin -систем), тонированных в отношении регуляций функций переноса плазмиды F'lac (vail.stts, Skurray, 1980). С целью изучения чувствительности системы переноса фактора рАР43 drd::Tn5 к ингибиторам переноса, контролируемым Fin -системами, были сконструированы циплазмидные клетки C600Rif , содержащие изучаемый фактор и огну из эталонных плазмид, кодирующую оарсдсленный тип ингибитора. Ингибирующее влияние эталонных плазмид на систему переноса изучаемого фактора исследовали по трем показателям: конъюгационному переносу, пилеобразованию и поверхностному исключению. Результаты этих экспериментов показали, что продукты разных Fin-систем не влияют на функции переноса и поверхностного исключения фактора рАР43 drd: :Тп5 , т.к. величины и.и. частоты переноса ио-следуемого фактора колеблются в пределах от 0,3 до 2,5 во всех случаях, а и.и. поверхностного исключения но превышает значения 2,0, Менду тем, в этих экспериментах было установлено влияние эталонных плазмид JR66a(FinU), R485(F1xlV) и R4-55 ( Finïï ) на функцию пилеобразования, определяемую фактором рАР43 drd: :Тп5 . Оценивая полученные результаты, ш заключили,-что механизм регуляций функций переноса фактора рАР43 drd::Тп5 и типовой плазмиды F характеризуются различиями.

4. Мобилизация на перенос хромосомы

Способность фактора рАР43 drd мобилизовать на перенос хромосомные гены в.coli . Исследуя способность изучаемого фактора переноса мобилизовать на перенос хромосомные гены в скрэщзва-ниях E.coli APII5 (рАР43drd::Tn5 )xABII57, мы установили, что'

7

он обладает такой способностью, но частота формирования роксм-бинанто. par !ых классов не превышает величину С2Д+0,8)х10""^. По этому свойству фактор переноса pAP43drds :Тп5 не отличается от фактора F и друг. : F -подобных факторов пер-носа.

Селекция клеток E.coll нгг с интегрированным Фактором те-нетичеокото переноса pAP43drd: ;tng . Основываясь на имеющихся • представлениях о том, что ff -подобные конъюгативные плазмиды су-прессируь. мутацию гена dnaA , включаясь в хромосому клетки-хо~ вяина, мы осуществляли эксперименты с целью интеграции фактора pAP43dxd::5n5 в хромосому E.coli методам интегратнвной супрессии и селекции клеток-доноров типа iifr . С этой целью в 2-х ча-оовых скрещиваниях. И.coll APII5 (pAP43drd: :Tn5 )xE.col± GA 121 dnaAts селекционировали пдэзмадосодержащке клетки GA 121 (pAP43dxds :Тп5 ), которые проверили на Ьу$екгпвность посева при 40°С. Результаты этих экспериментов показали, что способность формировать колонии при кепершссивной температуре у пле лидо-содернацщх клеток GA 121 (pAP43drd::Тп5 ) значительно ваша, чем у клеток бесплазмвдкого пташэ GA 121. Частота интегративной оупрессщ йпоШз -«'„ггацяк фактором pAP43drd:s'_n5 составляет величину I.lxicr® (на ЫПА) и 3,8x10"® (на минимальной среде). Эти данные свидетельствуют о том, что изучаемый фактор частично супрессирует поврзвдзиия гена dna^.

Температуроустойтавые клоны клеток GAI2I (pAP43drd:sTn5) проверяли на их способность передавать хромосомные гены в скре-,-щиваниях с клетк—ли полиауксотрофного штамма E.coli ABII57. В результате были отобрана 2 клона', обозначенное символами g AI2I-4B и GAI2I-IB- к характеризующиеся хорошо выракенными донорскими свойствами, т„е. свойствами типа Hfr. Для определения частоты и направления переноса хромосомных генов, осуществляемых сконструированными донорами g А121-1з и g Л121-4в типа Hfr , клетки послздаих скрещивали с клетками штаммов Е.соИ РА256, РАЗта, E.coli l:/rWV36 я Salnonella typhinuriua И2. Полученные з этш; эксмримектех данные позволили заключить, что .вдоктдфицароьашшо ^мкратуроуг-гойчивые клоны клеток G/t2I-Ib е Ш2Т- „bi яелйзисгпся мшичигеа клетками Bfj? , эту-В5Э0ТВЛШР ораоктарог^нный перенос граллскгпя гс::гв в направления по часовой С1'рзлке. Озончатгшшс ;;•>:• азагегьстк» продщояо-гения о том, «мо г-танов саш~Зв и g/J2I-4e дзйстгите-

и-чо яалязкгол гслкмэ' ' -1 , били полутени в опытах по изуче;ш> мсши чада фак^(Л>> p.tf-I."<uxl:<?n5 к? щ-ос кладок после их

е

ботга акридиновым оранжевым при 30°С и 40°С, а так~о при попытке наделения плазмидной ДНК из клеток gaI2^.-4b.

5. Мобилизация на перенос неконшгативпых плазмид

Изучение способности фактора pAP43drd и его транспозонсо- • деркащего варианта pAP43dxd: :0)п5 мобилизовать на печное не-коныогативнце плазмида осу:. гствляли в "трехродкт е ль с к.чх" скрещиваниях, в которых донорами слутали клетки APII5, содержащие один из факторов переноса рАР43, промел-уточными реципиентами -клетки ив 1636, содержащие неконъюгативнуа плазг/лду или

pscioi , и клетки Е.coli ceoostr, содергащзе одну из неконъюга- ' ТИВНЫХ плазмпд рВВ322, p'7YCI84, pRSFIOIO или pRSF2I24 , а окончательны.':! реципиентами - бесплазмидные кл$тки E.coliCSOO Rif . Влияние гена PolA на мобилизации плэзмлды pH» '2124- фактором pA~î3drd: :Тп5 изучали в "т; ^хродательеккх" скрещиваниях, где в качестве окончательного рецаплста использовали пат-пи Б.coli UB2272 polA" . Селекцию трансконысгатов проводили на средах, позволяющих выявить клетки Е.соП, содержащие моби-лззующуа (кснъюгатлвную) м мобилизуемую (покок-;~гати^чз) Е^аз-

МПДЦ.

Эти окоперименты показали, что фактор переноса рАР43 и с э ard -варианты pAP43clrd и pAP43drd:sTn5 мобилизуют на перепоо неконъюгативные плазмиды р.'Ж5» pRSFIOIO и pR3?2i24 , но не мобилизуют плаз'миды pBR322, pSCioi, pacyci84 , причем дерепрессия по ф,гчкциям переноса исследуемого фактор не сопровождается увеличением его мобилизующей способности. Анализ результатог опытов по мобилизации гчазкиди pHSF2I24 фактором pi\?43drd:s Тп5 пол использовании в качестве конечного реципиента клеток UB2272 (polA") показал, что для эффективной мобилизации цла-змидо pHSF2I24 исследуемым фактором необходимо наличке фулл-цке юльной ДНК - полисе рааы 1 пак в- клетках-донорах, так :i ь юмтках-рзцапиентга.

Активность "сб-лиза^ш, шрагышая частотой мобилизации иоконъюгатизныя: плазхтд, у псследуе.мих фезлторев переноса сказалась ргзлзчной в зависимости от типа мобилизуемой гтазлдт^ .Наиболее к-:гокся мобилизуюцая активности характерна для фактора переноса pAI'43dr¿: тп5 в отзошеита плазкдди ркзтгч. (^¡с-уота мэбилдзагяи см; гпзляет {1;3+0,4)уНГ2), наиболее шикал ~ для ¿Jaií-roj-u лзрокооп в ох'пошзшкх pus?юю

S

(частота мобилизация - (1,2+0,3)х10~®).

Анг из транско'-.ютатов, идентифицированных в "трехродите-льсккх" скрещиваниях, позволяет заключить, что все исследуемые трансконъюг tiTH содержат одновременно маркеры факторы переноса неконъюгативной плазмиды. L„тановлено, что г билизация исследуемыми факторами неконъюгативной плазмиды рШ5 во всех случаях сопровождается инактивацией маркера устойчивости к тетрациклину, принадлежащыо неконъюгативной плазмиде.

6. Поиски и идентификация коинтг""ративннх

структур в транскокъ.гатах, селекционированных в "трехродительских" скрещиваниях

Для изучения характера связи меэду мобилизующей и мобилизуемо^ плазмидами (агрегат или коинтеграт) из х.акдого "трехро-дательского" скрещивания отбирали по 3-4 траноконыо^та, характеризовав^, jcch наличием гаркеров обеих плазмид, и исследовали их донорскую активность (частоту и характер передачи плаз-ыадных маркеров), стабильность поддержания содержащихся в них плазмидных структур, поверхностное исключение и несовместимость последних и исходным фактором переноса.

Результаты эти^ экспериментов показали, что плазмидные структуры, образующиеся при мобилизации плазмиды pRSFlOlO факторами переноса pAP43drd и piP43cLrd:sln5 , представляют собой агрегаты. Этот вывод мы сделали на основании следуют данных:

1. Частоты передачи мобилизующей и мобилизуемой плазмид клетками-трансконъюгантами Е.coli 2-15, 2-21 (pAP43dxd + pKSFIOIû ) И 10-6, 10-17 (рАР43 drd:sTn5 + pESFIOXO ) оказались различными и составили для неконъюгативной пл^чмиды величину порядка IxIO"6 - IxIO"7, а для фактора переноса - IxIO"2.

2. Об}, .ботка культур клеток-трансконъюгантов 2-15, 2-21, 10-6 и 10-17 бромистым этидием сопрововдалась удалением только неконъюгативной плазмиды pHSFlOlO о частотой 1-4%.

3. Введение в клетга-трансконъгганты 10-6 и 10-17, содер-кащщс шгавмидный агрегат рАР43 cLrd: :Tn5 + pHSFlOlO , фактора переноса рА?43 : «Тп9 , сопрововдается удалением только резидентного фактора рАР43 dxd; :Тп5 . И.и. поверхностного исключения, определяемый плазмидной структурой pAP43drd: :Tn5 + pRSFlOlO , практически не отличается от такового, определяемого исходным фактором ¡переноса.

Кевуяьтаты изучения донорской активности трансконъюгантов,

ШО

содержащая один из исследуемых факторов переноса и неконъюгати-вную плазмиду рМН5 (трансконьюгэнты ИКа-2, IIXa-2 IIAp-2, I2Ap-I2 и I2A.-I5), показали, jto при скрещивании с рециппент-ными клетками Е.coli APII5 формируются трансконъюганты "ззли-чных типов с разной частотой (трансконъюганты II порядка) : трансконъюганты Ap+Km+Tc+ и Ар+Кш+Тс~ с частотой по- дка 10""® (мобилизующая плазмида pAF-fT ird: ) и Ю-7 (мобилизующая плазмида рА?43 drd ). Появление фенотипа Ар+Хт+тс+ у трансконъ-югантов II порядка вопреки тому, что все исходные доноры были тетрациклзпгчуЕствительныш ( Тс"), позволило нам предположить, что в процессе мобилизации на перенос плазмида p"~R5 исследуемыми факторами происходит временное физическое объединение мобилизующей и мобилизуемой плазмид. Это приводит к временной инактивации маркера Тсг и образованию нестабильных "оинтегра-тивных структур. В пользу данного предположения служат зудения о восстановлении устойчивости к тетрациклину части транс-конъюгантов II порядка, а такго идентификация плазмидных структур, отличающихся от исходных плазмид. Напржер, в клетках- . трансконъюгантах I2Ap-I2, I2Ap-I5, лш-2 и IIAp-I были гдеп-ткфицированн структуры. ппг»лстйвлягщ::2 собой (¡актор перекоса (pAP43drd или pAP43drd: :Тп5 ), который характеризовался н^лз-лем маркера Арг неконъюгатнвной плазмида рМЛ5 . Напротив, в клетках-трансконъигантах IlKn-I и IIAp-2 продукты диссоциации плазмидных структур не отличались от исходных плазмид. Результаты изучения переноса ндентифицярованн: . плазмидных структур и их спонтанной элиминации из клеток-трансконъюгантов 11Ки-1. IIEe-2 , IIAp-I, IIAp-2, IIAp-I2 и I2Ap-I5 подтвердили hscs предположение о природе сосуществования мобилизующей и глобализируемой плазмид в клетках указанных трансконъюгактов. '

Изучение донорской активности тр-чнеконъюгантов.

Изучение донорской активности трзнсконъютантов е.coli 5-23 (рАР43 drd/pESF2124 ) , 8-9 и 8-II (pAP43'ird: :Tni,/pHSF2I24 показало, что эти клетки-:рансконы гантк передают содоргащаеоя в них фактор переноса и неконъюгативную шшзмиду с с;г-чаяовз5 частотой. Анализ плазмидного содержимого трансконьюхантов показал, tío из клеток-трянсконъвгаптов 5-23 фактор рА?л.З<5хй аэрздавался соетестно о /.^--маркером пгкотаогаткЕясЗ плазма-дн (1002 лсслалоЕзнныг уреиекг'гьхгантов ямзю? фопочж Ар+СоЗ.~ i*C2s ), Напроти»', res «солодовакиаз трансконъюганты 8-9 а 0-11

П

наследовали маркеры обеих плазмид. Полученные данные свидетельствовал! з пользу предположения о возможности транслокации транспозона ЗД с неконъюгативной плазмиды рйЗР2124 в генсм фактора рАР434г<" и формирования структур! рАР43<1г<1::ТпЗ, о также о формировании коинтс грагивной структуры рАР43агси :Тп5/ рЕ5Р212^ при мобилизации плазмиды рКБР2124 фактором переноса рАР43йгй::Тп5.

Резуль^ты Експериментов по изучению элиминации плазмзд из трансконъюгантов 8-9 и &-П показали, что фактор переноса и нек^чьюгативная плазмида элиминируютс : совместно под воздействием додедалсульфата натрия, что свидетельствует в пользу предположения о слитном характере существования мобилизующей и мобилизуемой плазмид в этих клетках.

Завершающим доказательством коинтегративк 3 структура плазмиды рАР43йг<1::Тп5/рНЗР2124- и механизма формирования пла-8мзды рАР43й.тЛ! :ТпЗ в процессе мобилизации на переноо фактором рАР43йг<1 нег "нъюгативк 2 плазмиды РЙЗР2124- явилось изучение поверхностного исключения, определяемого этими плазмид-ными структурами, и их совместимости (несовместимое л) с исходным фактором переноса. В результате проведенных исследований был обнаружен высокий уровень поверхностного .включения (и.п.и. составляет 1700) да., клеток-трансконъюгантов 5-23, содернапшх плаэмиднуи структуру рАР43ах<1:¡Тпз. для коинтегрзтивных структур в клетках клонов 8-9 и 8~_1 (рАР43с1г<1: :Тп5/рЕ£Р~124 ) было отмечено значительное снижение и.п.и., который оказался 50 и 46, соответственно. Высокий уровень поверхностного исключения, определяемый плазмидной структурой рАР43ахй!:ТаЗ по отношению к фактору рАР43<1г<1лТп9 свидетельствует о том, что эти плаа-миды обладают родственными сиотемами переноса. Как и следовало ожидать, низкий уровень поверхностного исключения, определяемый пльзмидндаи структурами в клетках 8-9 и 8-11, подтверждает коиктегративную природу плазмидной структуры рАР434г<1:: Тп5/рНБг2124.

Результаты экспериментов по изучению несовместимости идентифицированных плазмидных отруктур о исходным фактором переноса показали, что в случае клеток клона 5-23 независимо от от порядка введения в них фактора рАР43<1гй! »Тп9 отмечалась полная (100£) несовместимость плазмидной структуры рАР43йг<1:: ТаЗ о исходным фактором переноса. Напротив, изучение клонов, селекционированных в результате введения фактора рАР43Чгс1 12

::Тп9 в клетки культур 8-9 ж 8-II, содержащих коинтегративную плазмиду pAP43dxd: pRSF2l24 , показало 1и0^-ую или частичную совместимость с исходны:-! ä-кгором переноса. Полученные дан-ше явились завершающим доказательством коинтегративной г '¡ироди идентифицированной плазмидной структуры рАР43 drd: :Tn5/pRSP2l2^.

7. Свойства коинтегративной плазкдды рА

pAP43drd::Tn5/pRSF2I24 И плазмхды pAP43drd: :ТпЗ

Изучение свойств идентифицированных плазмидных структур, образующихся при мобилизации исследуемыми факторзгли переноса яекоиьюгативной плазмады pBSF2l24 , было начато с выделения плазмидннх ДНК, их рестр ционного анализа и последующего опро-деления молекулярных масс. Сравнительное изучение электрофоре-грамм продуктов рестрикция ДНК плазмхды pAP43drd: :1ц., и pAP43drc показало, что включение -ранспозона Тп? в геном фактора pAP43drd привело к увеличению м.м. Sali-фрагмента i"3. фактора рАР43dxd::ТпЗ на 3,2 МД по сравнение с г.,м. Sali -фрагментом £2 фактора переноса рАР43 drd . Д;;;1Г'0 Г_\аН1 -рестрикций тоже свидетельствовали об изменениях в тспс:.:с фактора рАР43drd::£пЗ по сравнению с фактором рАР43. Хм. идентифицированной плазкядной структуры составляет 61,9 ГЛД, что пра) -тпческп равно сумме м.м. фактора pAP43drd (58,7) и трзкспсзопа ТпЗ (3,2 ВД).

Результаты EcoRl-, BaaHl-, Sali-и Hindlll -рестракцстонно-го анализа ДНК коинтегративной плазмиды j^P43drd: :Tn5/pBSP2i2^ показали, что она представляет собой рекомбннантнугэ молекулу содержащую реплнкон pKSF2l24 и лишь часть генома фактора переноса рЛР43 drd: :Тп5 . гЛ.м. коинтегративной шгазмвди составляет 39,5 МД.

Исследование трансмиссивной способности лдентпфхттарозап-Н1Е плазшдких структур показало, что они способны подаваться ок; клеток сдшсс прс;п~.одпн:-: штаммов E.coll K-I2 в клэтгте друтих производил этого jjtcjtas, а от последних - к клетка« В.coli в и s.typhimurivaQ ЗД2 . Такта образом, нахоздзигэ £зк-то^.з перзноса в ксинтеграте не повлияло на er:- способность прз-■одолевать мегвпдоше и межродовые барьер::.

Осаожзяеь на п- тученных наш деязнх;о том, то с&дтор перзноса чА?43 drd: :5а? стабильно существует з клсгь»: пе>1'з:аш: по функции гэдя poiA , хзучаля стайх,а>нооть по.г-.и г '«»/л коик"Г!ТС.-тиг'лу:,1 ллаз?с!ДЬ1 р1Р43 drd: v

плазмиды pAP43cird: :ТпЗ в клетках UB2272(polA~ ). Результаты этих г'";периментов показали, что коинтеграт либо полиостью элиминировался из клеток PolA" , либо диссоциировал в этих клетках, приче" продукты диссоциации коинтегративной плаз.-.ада отличались от исходных ш. змид, формирующие коинтеграт. На оо-иованяи полученных данных, мы заключили, что для поддерваная . и репликации коинтегративной плазмидт: pAP43dxd: :Tn5/pESi?2i24 необходима PolA-функция клетки-хозяина. Поскольку для репликации плазмиды CoiEl (репликой плазмиды pRSF2i24 ) необходима PolA -функция клетки-хозяина ( к: igsbury, Holinak,i, 1973), мы предположили, что реплик-^дя коинтегративной плазмиды осу-. щеои лется за счет включившейоя неконъютативной плазмиды PES52I24 . Напротив, проведенные исследования показали, что но происходит элиминации плазмиды pAP43dxdj s'J з из клеток . UB2272 polA" Стабильный характер наследования плазмиды pAP43drd:в клетках PolA" свидетельствует об идентичности характера ¡гтликации г-ой плазмидной структуры и походного фактора pAP43drd::Тп5 .

Изучая влияние гена гйсА кле.тки-хозяина на с ойства коин-тегративной плазмиды pAP43drdl:Tn5/pKSF2I24 , мы выяснили, • -что последняя либо полностью элиминируется i j клеток RecA , либо продукты ее j спада отличаютоя от исходных плазмид, составляющих коинтеграт. Оценивая полученные результаты, мы заключили, что для стабильногс поддержания коинтегративной плазмады в клетках-хозяевах необходима также НесА -функция клетки-хозяина.

Обсуждая результаты изучения мобилизации фактором перено-оа pAP43ird и pAP43drd: :Тп5 неконъюгативных плазмид и результаты изучения свойств образующихся при этом плазмидных структур, можно заключить, что они свидетельствуют в пользу существования двух путей эволюции коинтегративных плазмид, один из которых связан о объединением (коинтеграодей) фактора переноса и неконъюгативной плазмиды, а второй с транслокацией в геном фактора переноса транспозонов (А.П.Пехов, 1986).

ВЫВОДЫ

I. Фактор генетичеокого переноса рАР43 является F-подобной плазмидой E.coli , характеризующейся молекулярной массой 77 ВД, способностью детерминировать синтез репрессора функций

переноса, активного в отношении как собственной системы переноса, так и системы переноса плазгады F'lac (свойство Fin), и принадлежащей группе несовместимости fviii (incFviil).

2. Фактор рАР43 подвержен мутагенезу. В результата г 'работки клеток Е.coli APII5 (рАР43) нитрозогуанидином идентифицированы делеционные drd-мутанты этого фактора, дотершшрув» щне синтез специфических F подобных бактериальных пилей "гибкого" типа и сохраняющие Fin-свойство. Репликация данного фактора переноса не зависит от PolA-функции клетки-хозяина.

3. Проявление дерепрессии фактора рАР43 drd по функциям . переноса и пилеобразования зависит от генотипа клетки-хозяина и среди проверенных штаммов Е. coli проявляется лишь з клетках штаммов APII5, APII0 и C600Hi£.

4. Транспозонсодержащий вариант исследуемого фа; тора рАР43 ( pWtjdx-d: :Тп5 ) не чувствителен к ингибиторам ф^.шций конъюгативного переноса, синтезируемым под контролем генетических ОИОТем регуляции FinOP, FinQ, FinU, FinV, Finïï и FinG , однако, ингибиторы, синтезуруемые под контролем систем FinU , • FinV и Fixiïï , подавляют бактериальное F-подобное пилеобразо-вание, детерминируемой иселплуем^м фактором.

5. Фактор рАР43 drds :Тп5 способен осуществлять собствен--лй перенос среди клеток штаммов в.coli к-12 и от клеток е. coli К-12 к клеткам E.coliB с высокой частотой, а такгэ преодолевать в скрещиваниях меародовые барьеры в пределах семейства Enterotacteriaceae.

6. Фактор переноса рАР43 drd и его транспозонсодергсащий вариант, находясь в клерках E.coli в автономном состоянии, способны мобилизовать к^ переноо хромосомные гены с частотой порядка Ю-7 - I0"8. Фактор рА?-13 drd: :Тп5 способен включаться '' з хромосому E.coli в pnSoiîo pur-his , в результате чего формируются клэ î'cî—доноры 5.-яла Hfr , осуществлякгде одноиапрявгзя-чий (по часовой стрелке) перенос хромосомных генов.

7. Фактор рАР43 drd ' его тран"позсксодер:глщ:,:п тсглант pAP43drd: :Тп5 мобилизуют на перенос неконызгатавныв шшзкцда

PÎ.1R5, pR3FI0I0 И pESP2I24 , НО НО ПЛазмиды pSCJOI, pI>HJ22 Л PACÏCI34. .Мобилизация на перенос иоконыогатпвной ялязмидщ pESFioio ведет к формированию плазмиднкх агрегатов з E.coli . тогда гак мэбилизацкк плаздгпд pMR5 и pESi'ai24 нрчйодт? г разовакга я^охайильркг ксг.я?егратов, продукты'днссодацил которых отличаются о? исходит: шюзмэд.

8. Мобилизация фактором pAP43ârd::Тп5 ллазмидо pESF2I24 на пер' ос сопровождается формированием стабильной копнтегра-тивной плазшдной структуры, которая по своим свойствам сходна с типичными R • иазмидами.

Список работ, опубжкованных по теью диссертации

I. towa Г.И., Щипкова Н.И., т хов А.П. Дерепрессирован-ный мутант фактора генетического переноса рАР43 е.coli// Молекулярные механизмы генетических процессох Тез.докл. У Все-сс з.симпоз. 26-29 декабря т983 г. - М.: Наука, I983.-C.I63-164.

с. Мяцциаа Г.И., Щипкова Н.И., Пехов А.П. Идентификация и изучение дерепрессированных мутантов плазмида рЛР43 // Молекул. генет., микробиол. и вирусол. - 1983.-Ш^.-С.30-33.

3. Щипков' В.П., Буянова Н.И., Мяндина Г.И., Пгсов А.П. Способность эг; •онкых плазмид ингибироЕать функции генов области tra дерепресси! ^ванных Р -лодобных плазмид // 1йбридныэ плазмида и экспрессия плазмидных генов: Тез.докл. IX Всесоюз.совещ. по прогр. "Плазмида" 18-21 ноября 1984 г. - М., I9o4.-C.I65-166.

4. Щипков В.П., Буянова Н.И., Мяндина 1.И., Пехов А.П. Изучение систем регуляции tra -генов дерепрессированных ? -подобных плазмид // Бюлл.эксперим.биол. и мед.-1985.-Ш5.-С. 226-227.

5. Мяндина Г.И. Интеграция плазмида рАР43 s :Tn5-drd в хромосому E.coli// Молекулярная биология и генетика плазмид ("Плазмида-ХГ'): Тез.докл. XI Всесоюз.совещ. 11-13 ноября ^^ 1986 г. - Москва, I986.-C.89. ' s-Jlf/? ¿ '

Тематический план 1990 г., J&

Подписано к печати 31.05,90. Л-34362. Формат 60x90/16. Рота-принтная печать. Уел.пач.л. 1,0. Уч.-изд.л, 0,9а. Усл.кр,-отт. 1,125. Тираж 100 экз. Зак. 604 . Бесплатно Издательство Университета другсбы народов _II79¿ó. ГСН-I. Москва, ул.Орджоникидзе.о_

Типография Издательства УДН 117923, ГСП-I, Й

осква, ул.Орджоникилзе,3