Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение мутантов RHODOBACTER SPHAEROIDES с дерепрессированным синтезом нитрогеназы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение мутантов RHODOBACTER SPHAEROIDES с дерепрессированным синтезом нитрогеназы"

. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н. И. ВАВИЛОВА

На праВах рукописи УДК 575. 113. 579. 8. 06.

ТЕВЗАДЗЕ Гела ГурамоВич

ИЗУЧЕНИЕ МУТАНТОВ ЯНСШОВАСТЕН ЗРНАЕЯОЮЕЗ С ДЕРЕПРЕССИРОВАННЫМ СИНТЕЗОМ НИТРОГЕНАЗЫ

03. 00. 15 - Генетика

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Биологического факультета Московского Государственного университета имени М.В.Ломоносова.

НОЧНЫМ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук, доцент В.М.Глазар

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В.В.Суходолац, кандидат биологических наук В.М.Андрианов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита состоится " <МХ1<$ 1992 Г. Ж часов

на заседании специализированного Ученого Совета Д002.49.01. при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва. В-333, уд. Губкина, 3).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теш исследования. Фиксация атмосферного азота является одним из глобальных биологических процессов. Способность к азотфиксации обнаружена у многих прокариотических организмов и обусловлена наличием консервативного ферментного комплекса - нитрогенвзы. Регуляция азотфиксации основана на репрессии синтеза белков, вовлеченных в этот процесс (Nix-белков), в присутствии кислорода или связанного азота, и наиболее подробно исследована у антеробактории Klebsiella pneumoniae. В клетках К.pneumoniae генетический контроль азотфиксации осуществляется на двух уровнях: уровне общей системы регуляции азотистого метаболизма (гены glnO, glnB, ntrA, ntrB, ntrC), и на уровне особой nifLA-системы, вовлеченной в контроль вкспрессии структурных генов нитрогевазного комплекса (nif-генов) (Hagaeanik, 1982; Dixon, 1988).

Другим модельным объектом для изучения регуляции азотфиксации является пурпурные фототрофше нэсерные бактерии рода Rhodo-bacter семейства Rhodoopirillaceae. Способность фотосинтезирующих микроорганизмов фиксировать атмосферный азот поднимает важный как в теоретическом, так и в практическом отношении вопрос - о наличии или отсутствии сопряжения двух фундаментальных биологических процессов: фотосинтеза и азотфиксации.

Фототрсфше азотфиксирупцие бактерии представляют интерес также в связи с возможностью их использования в биотехнологии для решения важных практических задач: получения аммиака, биотоплива, биологически активных соединений, очистки сточных вод и почв. Все сказанное определяет актуальность изучения регуляции азотфиксации у этих организмов.

У наиболее изученного представителя этого семейства -Miodobacter capeulatus экспрессия nli-генов контролируется не только геном nifA, но и ntr-подобннми генами: nifRl (гомолог ntrO K.pneumoniae), niiR2 (ntrB), nifR4 (ntrA), а также генами nifR4 и adgA с еще невыясненными функциями ( Avtges et al., 1985; Kranz, Haselkorn, 1985; Jones, Haeelkorn, 1989; Zinchenko et al., 1990).

Для исследования генетического контроля процесса азотфиксации необходимы мутанты с измененной регуляцией синтеза нитроге-назы. У R.capeulatus выделено несколько типов мутантов с дереп-

рессированным синтезом нитрогеназы (Kranz, Hacelkom, 1988). В таких клетках экспрессия структурных генов нитрогеназы не зависит от наличия источников связанного азота, но репрессируется при наличии кислорода. Молекулярно-генетический анализ полученных мутантов выявил, что часть из них дефектна по гену niiR5, гомологичному гэну glnB внтеробактерий (Kranz et al., 1990).

На кафедре генетики и селекции МГУ исследования азотфикса-ции ведутся на другом представителе рода Rhodobacter -R.ephaoroideo. Здесь был получен рад мутантов R.Bphaeroides с конститутивным (дерепрессированным) синтезом нитрогеназы (Dm-мутанты) СШестаков и др., 1Э88). Помимо конститутивного синтеза нитрогеназы, мутанты неспособны к фиксации азота в темноте, к поглощению аммония клетками и к росту на нитрате калия в качестве единственного источника азота (Зинченко и др., 1991). Комплексный фенотип этих мутантов указывает, что мутации затрагивают ген, продукт которого принимает участие не только в регуляции азогфиксации, но и азотистого метаболизма в целом.

Цель н задачи исследования. Цель» данной работы явилось получение и исследование новых типов мутантов R.ephaeroides с дарепрессированным синтезом нитрогеназы, а также клонирование гена, восстанавливающего регуляцию нитрогеназы в одном из мутантов - Drni2. Основные задачи исследования:

1. Создание банка генов дикого типа R.ephaeroides 2R и выделение из него рекомбинантной плазмиды, комплементирущей мутацию drn12.

2. Определение минимального фрагмента ДНК R.ephaeroides, способного к восстановлению нормального фенотипа у мутанта Dmi2.

3. Выделение новых мутантов R.Bphaeroides с дерепрессированным синтезом нитрогеназы.

4. Биохимический, физиологический и молэкулярно-генетический анализ выделенных Drn-мутентов и мутантов с дерепрессированным синтезом нитрогеназы, полученных ранее.

Научная новизна и практическая ценность. Выделены и охарактеризованы новые мутанты R.Bphaeroides с конститутивным синтезом нитрогеназы, отличающиеся от полученных ранее. Охарактеризованы также Drn-мутанты, полученные ранее. Из банка генов дикого типа R.sphaeroides 2R выделен фрагмент протяженностью 2,7 т.п.н., комшгементируадий мутации drnl2 и drn2i. Этот фрагмент восста-

навливает нормальную регуляцию синтеза нитрогеназы при росте на свету, а также способность к азотфиксации в темноте. Полученные данные о комплементации мутанта Drni2 позволяет сделать вывод о существовании этапа регуляции азотистого метаболизма, не исследованного ранее. На основании результатов физиолого-биохимического и комплементационного анализа мутанты с конститутивным синтезом нитрогеназы, исследованные в данной работе, разделены на три класса. Эти мутанты могут быть использованы для дальнейшего изучения регуляции азотистого метаболизма в клетках R.ephaeroidee.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного генетическому контролю азотфиксеции у пурпурных бактерий, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 116 стр. машинописного текста и содержит 12 рисунков и 12 таблиц. Список литературы включает 121 наименование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. В работе использован штамм R.ephaeroidee 2R дикого типа из коллекции каф. генетики и селекции МГУ и мутанты с конститутивным синтезом нитрогеназы Drni2, Dm13, Drn21, Drni76, Drn183, Drn187, полученные ранее (Шестаков и др., 1988). Dm-мутанты R.ophaeroideB, полученные в данной работе, описаны в разделе "Результаты и обсуждение". Штаммы В.coli из коллекции кафедры генетики и селекции МГУ: С600, С600 гесА, НВ101. Список плазмид, использованных в работе, приведен в табл.1.

Среды и культивирование микроорганизмов. Для культивирования клеток В. coli использовали среду LB (Cibco) или среду Адамса с необходимыми добавками витаминов и аминокислот (Миллер, 1976). Выращивание клеток R.ephaeroidee проводили в среде Ормерода (ОппегоА et al.. 1961). Для определения способности штаммов R.ephaeroidee к азотфиксации клетки выращивали в атмосфере азота в среде Ормерода, лишенной источников связанного азота.

Выделение и очистку влвзмидных ДНК, электрофоретический анализ в агарозных гелях, расщепление рестрикционными эндонук-леазами, лигирование фрагментов ДНК, трансформацию клеток в.coli проводили по описанным ранее методикам (Holmes, Quigley, 1981;

Таблица 1

Список плазмид, использованных в работе

Плазмида Фенотип и/или генотип Источник

pRGKO Km1* Тс1* nifH-lacZ (рис.1) R.C.Kranz

PVZ361 КшГ Sur каф. генетики МГУ

PAS8-121A3 Km1* Ар1* тот же

р229 Smr Sur Km1* niiR5 R.sphaeroides тот же

р2150 Smr Sur Km1* niiR5 R.capsulatuB тот жо

Маниатис и др., 1984; Babykin, Zinchenko, 1984). Банк генов R. sphaeroides 2R дикого типа на основе плазмида pVZ36i создавали по методике, описанной Маниатисом и др. (1984). Частичное расщепление тотальной ДНК R.sphaeroides проводили рестриктазой Sau3A.

Коныогационные трехродительскио скрещивания R.sphaeroides со штаммами E.coli проводили по методике, описанной ранее (Zinchenko et al., 1985). В качества конъюгативной плазмида использовали рАБ8-121ДЗ.

Активность нитрогеназы измеряли по восстановлению ацетилена (Ste«art et al., 1968). Активности глутаминсинтетазы и р-галвктозидвзы анализировали на полупроницаемых клетках. О трансферазной активности глутаминсинтетазн судили по образованию 7-глютамилгидроксамата путем спектрофотометричвского измерения при 540 им (Shapiro, stadtman, 1970). Активность р-галактозидазы определяли стандартным методом (Миллер, 1976). Содержание Се.жа в пробах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Ферментативные активности выражали в наномолях продукта, образовавшегося на 1 мг белка за 1 мин.

В опытах по изучению поглощения мотиламмония и глутамина клетки R.ephaeroides инкубировали при 32°С в среде с 14с-метиламмонием (20 цС1/ц«оль) или 14С-глу тамщюм (25,5 цс1/цмоль) в среде роста, не содержащей источник азота. Пробы отбирали q интервалом в 2 мин, и отмывали на фильтрах Uillipore-

HAWP раствором соотвэтствущего немэченного соединения. Радиоактивность на фильтрах определяли на сцинтилляционном счетчике Nuclear Chicago МагК'2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Получений мутантов R.ephaeroidosc дерепрессированныы (конститутивным) синтезоы нитрогеназы

Для выделения Drn-мутантов R.ophaeroidee, отличающихся от мутантов, полученных ранее на нашей кафедре (Шестаков и др. 1988) использовали штамм дикого тала R.ephaeroidee 2R, в который путем коньпгационного скрещивания была введена плазмида pRGKO (Kreuiz, Haselkom, 1985). Плазмида pRGKO содержит nifHDK гены R.capsulatus в конструкции niíH-laoZ в составе фага mini-HudII1734 (Caetilho et al., 1984) (рис. 1). В этой конструкции гены лактозного оперонв находятся под контролем промотора nlfH, одного из структурных генов нитрогеназы. Клетки штамма 2R(pRGKO)

nií н

D

HindiII

Sali

9,2т Г10,7Г11.7

lac

Y

Km1

15,9 15,1т

2,0

salí HindIII

Sal Hindlll

Рис. 1. Карта HLndill-фрагмента плазмида pRGKO, содержащей гены nifHDK R.capeulatuB с фагом mini-MuIId1734. встроенным в ген niíH.

Z

А

высевали в анаэробных условиях на среду, содержащую лактозу в качестве единственного источника углерода в условиях репрессии синтеза нитрогеназы (наличие в среде роста ионов аммония репрессирует активность нитрогеназы, а в присутствии глутамата фермент дерепрессиррван). Таким образом было получено несколько десятков клонов мутантов Я.врЬ&его1&ев. способных расти в этих условиях. Мутантные клоны очищали путем рассева на той же среде до отдельных колоний и проводили дальнейший анализ. Для первичного скри-

Таблица 2.

Активность р-галактозидазы у мутантов И. вр!гаего1(1ев , с доропремированным синтезом нитрогеназы.

Штамм* Активность в присутствии нй*. нмоль Активность при отсутствии ИН+, нмоль АКТИВНОСТЬ (,+Ж^) Активность )

мин. мг белка мин. мг белка

Г>гт)4 275 1596 0,17

ВгпЮ 207 682 0,30

Огп11 520 984 0,52

ЦгШб 253 2192 0,11

Огп76 612 774 0,80

Г)пг80 537 825 0,67

1>гп82 308 899 0,34

Огп91 975 1658 0,59

2Я 17 1053 0,01

*Все штаммы содержали плазмиду ргкжо.

нинга Сгп-мутантов определяли соотношение активности р-галактозидазы в клетках, выросших в условиях репрессии (в среде с ионами аммония) и дерепрессии (в среде с глутаматом) синтеза нитрогеназы, характеризующеее степень дерепрессии синтеза фермента. У спонтанных мутантов Егп76-1)гп91 (табл. 2. приведены результаты типичного опыта из 3-4 экспериментов) этот показатель резко превышает таковой для дикого типа.

Из таблицы 2 видно, что полученные мутанта можно условно разделить на две группы по степени дерепрвссии синтеза нитрогеназы. К первой группе можно отнести мутанты, для которых рассматриваемое соотношение варьирует в пределах 0,6 - 0,8. У второй группы мутантов его величина составляет 0,15 - 0,13.

Для получения индуцированных Бт-мутантов культуру гЩрйСКО) обрабатывали 9-аминоакридингидрохлоридом в конечной концентрации 5 мкг/мл (выживаемость - 1Ж). Анализ активности р-галактозидазы в клетках индуцированных Сгп-мутантов 0гп4-1>п116 выявил, что

уровень дерепрессии нитромйааи варьирует в пределах 0,1-0,5 (табл.2, приведены результаты типичного опыта из 3-4 экспериментов).

Применяя описанный метод отбора 1>гп-мутантов, нельзя исключить следувдув возможность: способность к росту на лактозе могут приобрести клетки И.вр11аего1аев, в которых акпрессия гена 1асг происходит не из-за мутации в геноме, а благодаря мутации в промоторе гена п1ГН» расположенного на плазмиде, в результате ( чого его транскрипция происходит независимо от концентрации I ионов аммония. Для проверки этого предположения выделяли плаз-мидную ДНК из исследуемых мутантов и вводили ее с помощью трансформации в клетки Е.соИ С600. Трансформанты, отобранные по устойчивости к канамицииу, скрещивали с и.врЬаего1<1ев 2й. Клоны 2И, содержащие плазмиду риско из Ьгп-мутантов, сохраняли нормальный фенотип, т.е. не росли на среде с лактозой и с аммонием. Таким образом, полученные нами Ют-мутанта проявляют1 И1*с-фенотип (способность к конститутивному синтезу нитрогеназы, независимо от присутствия ионов аммония в среде роста) благодаря мутации в хромосоме Р.врЬаег-о1аев, а не из-за измененной регуляции промотора в плазмидной конструкции п!ГК-1асг.

1.2. Биохимическая и физиологическая характеристика мутантов В.врЬаего1йев с конститутивным синтезом нитрогеназы

С целью дальнейшего анализа полученных Югп-мутантов определяли активность глутаминсинтетазы. Мутанты с конститутивным синтезом нитрогеназы, 1)гп12, Г)гп13, Югп21, Шп17б, 1>гп183, 1)гп187, полученные ранее на кафедре генетики и селекции МГУ, характеризуются низким значением активности глутаминсинтетазы по сравнению с клетками дикого типа. Мутанты группы Вгп4, полученные в данной работе, при росте на среде с глутаматом в качестве источника азота по активности глутаминсинтетазы не отличаются от дикого типа.

У мутантов группы Рт4 анализировали способность к росту на различных средах, являющихся селективными для мутантов группы Ьгп\2, полученных ранее. Мутанты группы Огп12 неспособны к азотфиксации в темноте, а также к росту на средах с юга^ в качестве единственного источника азота. При этом они растут на средах с различными аминокислотами и фиксируют азот на свету.

С целью подбора селективной среды и дополнительной характеристики мутантов, полученных нами, определяли их способность к росту на среде с ию^, различными аминокислотами, а также в условиях азотфиксации в темноте и на свету. Обнаружено, что все мутанты растут на среде, содержащей КЛ0Э, а также в условиях азотфиксвции в темноте и на свету. Таким образом, мутанты группы Г)гп4 резко отличаются от мутантов группы 1>гп12.

Одной из возможных причин отсутствия регуляции синтеза нитрогеназы у мутантов с конститутивным синтезом этого фермента может быть неспособность глаток к включению аммония. Так, одним из свойств полученных ранее мутантов Г)гп12 и Югп21 является неспособность к поглощению аммония. Мутанты, полученные в данной работе, не отличаются от дикого типа по способности к поглощению метил акмония и глутамина.

1.3. Определение нитрогеназной активности в клетках

Бт-мутантов в условиях репрессии синтеза нитрогеназы

Высокий уровень, синтеза р-галактозидазы при росте на среде с (Ш4)2304, характеризующий мутанты группы Югп4, является лишь косвенным подтверждением М1с-фенотипа. С целью проверки была определена активность нитрогеназы у Ши-мутантов в условиях роста в среде с (Ш4)2504 методом ацетиленредукции. В качестве контроля использовали мутант 1)гп12, в клетках которого активность нитрогеназы при росте на 10 мМ (ш4)2бо4 составляет 80100% от той же величины при росте в условиях репрессии синтеза нитрогеназы.

У мутантов, полученных в данной работе, активность нитрогеназы при росте на 10мМ (Ш^БО^ сравнима с соответствующей величиной для дикого типа. Однако, при использовании концентрации 5 мМ (ш4)2304 и подбора стадии роста клеток для измерения активности фермента было выявлено, что некоторые мутанты проявляют высокий уровень синтеза нитрогеназы, значительно превышающий соответствующее значение для клеток дикого типа и сравнимый с таковым для 1>гп12 (табл. 3).

Необходимо отметить, что у мутанта Е)п112 высокая степень дерепрессии нитрогеназы наблюдается на разных стадиях роста культур, у мутантов группы 1)гп4 относительно высокие значения активности нитрогеназы наблюдали лишь на определенной стадии

роста - 36 ч. для Огп4, ЪхтЛЬ и 0гп91, 36 и 48 ч. - для Цгп1б.

Результаты сравнительного анализа 1)гп-мутантов, выделенных ранее и полученных в данной работе, суммированы в табл. 4. Все мутанты группы &гп4 отличаются от мутантов группы т-п12 по ряду признаков (в таблице приведены только несколько типичных представителей Цт-мутантов): меньшей степенью дерепрессии синтеза нитрогеназы, способностью к взотфиксации в темноте и к росту на среде с кио3, высокой активностью глутаминсинтетазы. При этом, полученные нами мутанты, как и мутанты, группы 1)т12, проявляют Ш^-фенотип независимо от содержания источника связанного азота в среде роста. Наличие кислорода приводит к репрессии синтеза нитрогеназы у всех мутантов.

Таблица 3.

Активность нитрогеназы у Вгп-мутантов Н.врЬаего1йев при росте на средах с различными источниками азота

Штамм Активность нитрогеназы, ^^ НН+ 4 *

«Ид глутамат глутамат • *

Сгп4 6,8 65,0 11

Вгп1б 33,3 48,0 69

Вгп7б 17,4 48,4 35

Вгп91 54,5 75,0 60

Пгп12 59,2 75,2 80

2П 0,58 37,5 1,5

2й(рНСКО) 1.5 50,0 3,0

■"отношение величины активности нитрогеназы в клетках И. врЬаего1(1ев, выросших на среде с ионами аммония в качестве источника азота, к той же величине для клеток, выросших на среде с глутаматом.

Таблица 4

Сравнительная характеристика различных Ши-мутантов И.вр11аего1йез

Мутант Активность ферментов: Рост на различных селективных средах**

p-галак-, тозидазы глутамин-синтетазы в Ж от дикого типа нитро--геназы

1х 2 3 4

Drn12 0,60 15 80 4 - 4

Drn21 0,28 15 55 4 - 4 -

Drnl7G 0,11 15 85 4 - 4 -

Drnl6 0,11 100 69 4 4 4 4

0rn76 0,8 100 11 4 - 4 4 4

Drn91 0,59 100 60 4 4 4 . 4

2R 0,02 100 1,5 - 4 4 4

*Приведено отношение (в %) активности фермента для культур, растущих в присутствии ионов аммония, к той ке величине для клеток, выросших в условиях дарепрессии синтеза нитрогена-зы - в среде с глутаматом в качестве источника азота).

**1 - способность к росту на среда с лактозой и (Ш^^О^, 2 - способность к росту на среде кло^ в качестве единственного источника азота.

3- способность к азотфиксации на свету 4 - способность к азотфиксации в темноте хДля определения способности к росту на среде с лактозой и (ын^^БОд, а танке .р-галактозидазной активности в клетки всех исследуемых мутантов вводили плазмиду ршжо.

2. Предварительная ыолвкулярно-генетическая характеристика Drn-иутантов, полученных в этой работе

С целью анализа Drn-мутантов в их клетки вводили плазмиду рВ150, содержащую ген niiR5 R.capeulatue, гомологичный гену glnB энтаробактерий. Известно, что мутации то гену nifR5 могут приводить к образованию мутантов с да репрессированным синтезом нитро-геназн (Kranz, Haeelkorn, 1988). Оказалось, что ген nifR5 не комплементирует ни одну из полученных drti-мутаций в штаммах с высокой степенью дерепрессии нитрогенаэы (Drn4, Drni6, Dm76 и Drn9l): все трансконыоганты сохраняют способность к росту на среде с лактозой и нн^. Аналогичные результаты были получены при введении в клетки перечисленных мутантов плазмида р229, содержащей ген R.ephaeroideo, гомологичный nifR5. Гены nlIR1, nilR2, niiR4 также не комплементирует мутации группы drn4.

Можно сделать предварительный вывод о природе генов, затронутых мутациями у птаммов R.Bphaeroidee Drn4, DrnlS, Drn76, Drn91, полученных в данной работе. Нутации в а тих штаммах влияют лишь на регуляцию нитрогеназы, на затрагивая способность к росту на среде о различными источниками азота, способность к озотфик-сации в темноте, процесс транспорта метиламмония и глутамина в клетки и пр. Таким образом, можно предполагать, что у этих птаммов мутировали гены, связанные лишь с регуляцией экспрессии структурных генов нитрогеназы. Возможно, что мутировавшими генами являются nifR4 или nifA. Проверка этого предположения требует дальнейших исследований.

3. Клонирование гена, комплементирукцего нутацию drn12

3.1. Виделешю фрагмента ДНК, коыплеыептарущаго иутацшэ

dm12, из банка генов R.ophaeroldes 2R

Как уха было отмечено, мутант Drai2 отличается неспособностью к росту на среде, содержащей кио^ в качестве единственного источника азота. Клетки дикого типа растут на этой среде в виде крупных ослизнвнных колоний белого цвета. Это обстоятельство было использовано для выделения плазмиды с фрагментом ДНК, комплементирупцим мутацию drnl2, из банка генов R.ephaeroides

SR. Банк был сконструирован на основе плазмиды pYZ36it несушей

маркер устойчивости к канашщину и восстанавливающей устойчивость к стрептомицину в результате встраивания фрагмента ДНК в

BamHI-caflr.

Конъюгацианные скрещивания мутанта Drnl2 проводили с 42 смесями клонов E.coli, содержащих плазмиды с фрагментами геномной ДНК R.sphaeroides 2R протяженностью 10-20 т.п.н. ("больше фрагменты") и с 40 смесями с фрагментами ДНК размером 6-10 т.п.н.("малые фрагменты"). Каждая смесь содержала по 100-200 шшзмидных клонов. В результате скрещивания со сйесями "больших фрагментов" А* 23 и 27 на средах с юю3 и с kno3 и стрептомицином выросли колонии, сходные по морфологии с колониями дикого типа. Из 20 независимых клонов комплементантов R.ephaeroidea выделили плазмидную ДНК и трансформировали полученными препаратами клетки E.coli С600 гесА. Трансформанты отбирали по устойчивости к стрептомицину. Полученные клоны E.coli снова скрещивали с R.sphaeroides Drn12. Конызгеционвую смесь высевали на селективные среда с КМ03, KMOj с стрептомицином, и на среду со стрептомицином, лишенную источников связанного азота (рост в атмосфере азота)! В качестве отрицательного контроля Вгп12 скрещивали с вектором PVZ361, содержащим фрагмент ДНК R.sphaeroides, заведомо не комвлементирупций эту мутацию. Для определения частоты скрещивания равный объем смеси высевали на среду с стрептомицином, содержащую сульфат аммония. От скрещивания трансформантов, содержащих исследуемый фрагмент, на всех средах выросло примерно равное число колоний (2-3 х 103), причем морфология клонов, выросших на среде с нитратом и выросших в условиях азотфиксации в темноте, полностью соответствовала морфологии колоний дикого типа. Это позволило заключить, что все клоны-комплементанты содержат плазмиду с фрагментом хромосомы .я.sphaeroides 2R, комплеменпфупцим мутацию drni2. Эти результаты были воспроизведены в трех независимых акспериментах. То обстоятельство, что вместе со способность» роста на KNO^ у комплементантов Dm* восстанавливается способность к азотфиксации в темноте, позволило сделать вывод о плэйотроином действии гена, комплементирупце-го мутацию №п12. Этот ген был обозначен нами linA (от Light-independent aitrogen fixation).

С целью предварительной нолекулярно-генетической характеристики выделенных фрагментов ДНК был проведен их рестрикционный анализ по эндонуклеазэ рестрикции BamHl. Все анализируемые плазмиды содержали одинаковые ВашНl-фрагмента хромосомы R.sphae-

roid.ee 2R протякенностью 5,3, 4,3. 2,0 и 1,1 т.п.н. Исключение составляла лишь плазкида, несущая фрагмент IA2. Этот фрагмент возник в процессе субклонирования (очистки) одного из первичных комплементантов R.ephaeroidea, обозначешюго LA1, в результате спонтанной делеции. Эта делеция привела к утрате участка протяженностью 6,3 т.п.н. из фрагмента LA1, а также к выщеплению участка длиной 0,2 т.п.н. из BamHI-фрагмента длиной 1,1 т.п.н. (рис. 2). В плазмиде pLA2 также утерян уникальный EcoRI-сайт в составе вектора pVZ36i. При этом фрагмент 1Л2 сохраняет способность к комплементации мутации drnl2.

Трансформанты В.coli С600 гееА, содержащие плазмиды pLAl и pLA2, использовали для скрещивания с мутантами Drnl3, Drn2l, Drnl76, Dml83, Drni87, выделенными ранее, а также с полученными в этой работе мутантами: Drn4, Drnl6, Dm 76 и Drn9l. Ни один из мутантов группы Drn4 не обнаружил комплементации.

Из Drn-мутантов, полученных ранее, плазмиды pLAl и рМ2 комплементируют только мутацию ¿п21. Таким образом, мутации t(mi2 и ttn2i относятся к одному и тому же гену - linA. Остальные Drn-мутанты - Drnl3, Drnl76, Dml83, Drnl87. несмотря на сходство фенотипов, очевидно, входят в другую группу (группы) комплементации и дефектны по другим генам, осуществляющим контроль регуляции нитрогеназы. Таким образом, мутанты группы Drnl2 можно разделить на два класса: мутанты группы 0гп12 (включает мутанты Dml2 и Drn21) и мутанты группы Dml76 (Drnl76. Drnl83, Drnl87).

Далее было проверено восстановление основных свойств, по которым мутант Drni2 отличается от дикого типа. У комплементантов восстанавливается регуляция нитрогеназы ионами аммония на свету, способность к фиксации азота в темноте и к поглощению метиламмония, нормальная активность глутаминсинтетазы, регуляция активности ß-галактрзидазы в составе конструкции lacZ-nifH, расположенной в плазмиде pRGKO, при росте на,свету и в темноте. Результаты анализа трансконыогантов R.ephaeroides Dml2, содержащих плазмиды pLAl и pLA2, комплбментирувдие исследуемую мутацию, суммированы в таблице 5 (приведены типичные результаты из 2-3 независимых экспериментов).

На основании этих результатов можно сделать вывод о природе гена, комплементирущего мутацию dmi2: очевидно, что этот ген

вовлечен не только в регуляцию азотфиксации, но и в регуляцию общего метаболизма азота. Полученные данные подтверадают предположение о существовании двух систем активации нитрогеназы -светозависимой и светонезависимой, сделанное ранее в нашей лаборатории (Зинченко-и др., 1991).

Наличие светозависимой активации процесса азотфиксации у фотосинтезирукщих организмов является, по-видимому, одним из первых указаний "на возможность существования систем сопряжения процессов фотосинтеза и азотфиксации. Изучение этих систем представляет большой интерес.

Таблица 5

Биохимическая и физиологическая характеристика

клеток В.вр1шег1ойев,-содержащих и не содержащих фрагменты ЬА1 или 1Л2

Штамм Активность нитро- * геназы Активность глутамин-синтетазы в % от дикого типа Активность р-галакто-«* зидазы Поглощение метил-аммония

2R 3 100 0,02 +

Вгп12 91 Ъ 0,60 -

Dm12(plAl) 7 100 0,06 +

Drn12(pLA2) Д 100 0,03 +

^Приведено отношение (в Я) активности фермента для культур, растущих в присутствии ионов аммония, к той жа величине для клеток, выросших в условиях дерепрессии синтеза нитрогеназы - в среде с глутаминовой-кислотой в качестве источника азота).

**Клетки й.вр1гаего1<1ев содержали плазмиду рШКО, несущую конструкцию п1ГН-1асг. Приведено отношение активности фермента для культур, растущих в присутствии ионов аммония, к той же величине для клеток, выросших в условиях дерепрессии синтеза нитрогеназы.

3.2. Локализация гена 11пА, коыплеиентарупцего мутацию йгп12

Плазмиду рЬА2 обрабатывали рвстриктазой ВатН! и проводили аутолигированив полученных фрагментов. Лигированной смесью

трансформировали клетки E.coli С600 гесЛ. Смеси клонов E.coli, содержащих различима фрагменты, скрещивали с клетками R.sphae-roidea Drnl2. В результате этого скрещивания на среде с KNO^ выросли колонии R.ephaeroldee, сходные по морфологии с колониями дикого типа. Показано, что эти колонии содержали плазмида с вamHi-фрагментом размбром 4,3 т.п.н. Таким ооразом, способность к комплементации мутации йгп12 сохраняет Вапй1-фрагмент протяженностью около 4,3 т.п.н. Ориентация этого фрагмента была одинакова во всех полученных плазмидах. Фрагмент, расположенный в обратной ориентации, удалось получить путем пэреклонирования в вектор pVZ36l. Переклонированный фрагмент также комплементирует мутации £¿1112.

Для дальнейшей локализации гена, комплементирующего мутацию drni2, использовали данные, полученные в результате рестрикцион-ного анализа плазмид pLAl и рЫ2 (рис. 2). Использовали плазмиду с ВакШ-фрагментом длиной 4,3 т.п.н., обозначенную рЬАЗ, полученную в результате BamHI-рестрикции и аутолигирования плазмида pLA2. Как указывалось выше, в этой плазмиде утерян уникальный EeoRl-сайт в составе вектора . pVZ36i. Благодаря этому обстоятельству , из фрагмента ЪАЗ можно удалить внутренние EcoRl-фрагменты общей протяженностью около 1,6 т.п.н. Плазмиду pLA.3 обрабатывали ресгриктазой EcoRI и аутолигировали. Получен- > ная плазмида, обозначенная pLA5, содержит Ватн1-фрагмент протяженностью 2,7 т.п.н. в составе вектора pVZ36l (рис. 2). Плазмида рьл.5 сохраняет способность к комплементации {frnl2. В результате пере клонирования фрагмента la5 в вектор pVZ361 была получена плазмида, обозначенная pLA5-l, содержащая фрагмент в ориентации, обратной исходной. Эта плазмида также комплементирует мутацию ¿и12.

Во фрагменте LA5 содержатся два EamHI-EcoRI фрагмента: LA6, длиной 2,5 т.п.н. и 1Л7 - 0,15 т.п.н., ни один из которых не способен комплементироветь мутацию drni2 (рис. 2). На основании полученных данных было сделано предположение, что во фрагменте LA7 содержится рогуляторный участок, необходимый для экспрессии гена linA, расположенного в пределах фрагмента протяженностью 2,5 т.п.н. Можно такжэ предположить, что во фрагменте LA3 содержится оперон: промотор, расположенный в пределах 0,15 т.п.н.-участка, отделен от структурного гена, комплементирующего мута-

цию «1гп12, EcoRl-фрагментом размером 1,5 т.п.н., который включает другой ген того же оперона. Возможно и другое объяснение: собственная регуляторная область гена linA расположена в EooRX-фрагменте; при конструировании плазмиды pLA5 она удаляется и ген linA попадает под контроль другого регуляторного участка, расположенного в пределах фрагмента LA7.

Из плазмиды pLA2 была получена еще одна конструкция, позво-лящая более точно определить граница фрагмента, в котором расположен ген linA: ВашН1-Н1п<1111-фрагмент LA4 размером 4,0 т.п.н., полученный после HindIH-рестрикции и аутолигирования pLA2, комплементирует мутацию Drni2. Можно сделать предварительный вывод, что ген linA, комплементирувдий мутацию drni2, расположен в пределах фрагмента EcoRl-Hindlli протяженностью 2,25 т.п.н. При этом для экспрессии linA необходимо наличие фрагмента LA7, расположенного на расстоянии примерно 1,6 т.п.н. от структурного гена.

Таким образом, нами охарактеризованы мутанты R.sphaoroides с дерепрессированным синтезом нитрогеназы, выделенные ранее и полученные в данной работе. Все мутанты проявляют М1£с-фенотип независимо от содержания источника связанного азота в среде роста. Повышенная концентрация кислорода приводит к репрессии синтеза нитрогеназы у всех мутантов. Можно выделить три класса исследованных Drn-мутантов. К первому классу относятся мутанты Drnl2 и DrnZl. Эти мутанты характеризуются высокой степенью дерепрессии нитрогеназы при росте на среде с 10 мМ NH^, неспособностью к азотфиксации в темноте, к росту на среде с kno3, к транспорту метиламмония в клетки, фрагмент геномной ДНК дикого типа, выделенный в данной работе и содержащий ген linA, комплементирует мутации Dml2 и Ьгп21. Полученные результаты позволяют предположить, что ген linA вовлечен в один из основных этапов азотистого метаболизма, не изученный ранее. Ко второму классу можно отнести мутанты Drnl76, Drnl83, Dml87. сходные по фенотипу с мутантами Dml2 и 22го21, однако, ген linA не комплементирует их. Очевидно,

Рис.2. Рестрикционные карты фрагментов LA1 и LA2 и их делеци-онных производных. ■ - фрагменты геномной ДНК R.ephaeroidee 2R;

- - ДНК вектора pVZ36i; ............... - участок, делегированный в

плазмиде pLA5. Условные обозначения сайтов узнавания рестриктаз: BI- - BamHI; B1I - Bglll; EI - BeoRI{ Hill - Hindill.

LAI , 12.a kb

BI Sail ?I

II,

BI

5,6 т.П.н.-фрагмент, "делегированный y LA2

Eï

UA?.. ZxS !ú>

II Sali

КОМПЛЕМЕНТАЦИЯ 0m12

LA4. 4.0 kb

комшшмэнтирует в обеих ориентациях

LA5. 3.7 kb

i EJtJT

комплемонтирует в обеих ориентациях

LAft. 3.S kb

EI

III

LA7. O.IS kfe

что мутанты второго класса д«фэктны по другому lin-гену (или генам), вовлеченным в щюцосс регуляции азотистого метаболизма. Третий класс составляют Drn-мутанты, выделенные в данной работе: Drn4, Drnl6, Em7S, Drn91. Эти мутанты характеризуются меньшей степенью дерепрессии нитрогеназы по сравнению с мутантами Епп12 и Drn21: щ*с-фенотип проявляется у них при концентрации ионов NH^ 5 мМ. По остальным признакам их фенотип сходен с таковым для дикого типа. Показано, что ген linA, а также гены niiRi, nifR2, niiR4 и niiR5 не восстанавливают дикий тип у этих мутантов. Возможно, что мутанты, отнесенные к третьему классу, дефектны по генам, вовлеченным только в регуляцию процесса азотфиксации. Показано, что Drn-мутанты, полученные в данной работе, существенно отличаются от мутантов R.capeulatus (Kranz, Haselkorn, 1988) и R.ephaeroidee (Шестаков и др., 1988; Zinchenko et al., 1990) С дерепрессированным синтезом нитрогеназы, полученных ранее.

ВЫВОДЫ:

1. Из банка генов R.sphaeroideB выделена рекомбинантная влазмида, восстанавливающая фенотип дикого типа у мутантов Drnl2 и Dm21, полученных ранее на кафедре генетики и селекции МГУ и характеризующихся плейотропными нарушениями в регуляции азотистого метаболизма и азотфиксации.

2. Структурная часть гена, комплементируюцего мутации у штаммов Dml2 и Dm21 и названного linA, локализована в пределах фрагмента ДНК размером 2,25 т.п.н. Продукт гена linA играет важную роль в регуляции азотистого метаболизма и абсолютно необходим для синтеза нитрогенази в отсутствие света.

3. Получена коллекция спонтанных и индуцированных 9-аминоакридином мутантов R.ephaeroidee Drn4, DrnlG, Drn7G И Drn91 и др., у которых, в отличив от выделенных ранее мутантов, не проявляется плейотропный фенотип и нарушена только регуляция синтеза нитрогеназы ионами аммония. Ген linA не комшюментярует этот дефект.

4. На основании изучения 'физиолого-биохимических свойств и результатов комплементационного анализа исследованные мутанты R.ephaeroides разделены на три группы. Первую группу составляют мутанты Drnl2 и Dm2l. Во вторую группу отнесены мутанты Drnl3, Dml76, Dml83, Dml87, по фенотипу идентичные первой группе,

однако не комплементируемые геном linA. В третью группу входят выделенные в этой работе мутанты Drn4, Drnl6, Dm76, Drn91 и др. Всо мутанты не компломонтируются генами Rhodobacter nifR1, niiR2, nirR4, niiR5.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Тевзадзе Г.Г. Получение и анализ мутантов Rhodobacter Dphaoroidee с дерепроссированным синтезом нитрогеназы. Труды 21 научной конференции молодых ученых МГУ, Деп. в ВИНИТИ, 23.09.91., Я 3763, В-91.

2. V.U.Glaser, A.V.Glaeunov, G.C.Tevzadze, J.R.Perera, S.V. Sheetakov. Genetic control of plaemid ША double-strand, gap repair in yeaot Saocharomycee cerevieiae. Current Genetics (1990)18: 1-5.