Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение мутантов RHODOBACTER SPHAEROIDES с депрессированным синтезом нитрогеназы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение мутантов RHODOBACTER SPHAEROIDES с депрессированным синтезом нитрогеназы"

. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им." Н. И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи УДК 575. 113. 579. 8. 06.

ТЕВЗАДЗЕ Гела ГурамоВич

ИЗУЧЕНИЕ МУТАНТОВ ННСЮОВАСТЕР БРНАЕРОШЕБ С ДЕРЕПРЕССИРОВАННЫМ СИНТЕЗОМ НИТРОГЕНАЗЫ

03. 00. 15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кэтфОДвтй /5иологичвских*наук

■МОСКВА - 1992

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Биологического факультета Московского Государственного « университета имени М.В.Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук, доцент В.М.Глазер

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В.В.Суходолец, кандидат биологических наук В.М.Андрианов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита состоится 1992 г. в _часов

на .заседании специализированного Ученого Совета'Д002.49.01. при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва, В-333, ул. Губкина, 3).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Фиксация атмосферного азота - является одним из глобальных биологических процессов. Способность к азотфиксации обнаружена у многих прокариотических организмов и обусловлена наличием консервативного ферментного комплекса - нитрогеназы. Регуляция азотфиксации основана на репрессии синтеза белков, вовлеченных в этот процесс (Nir-белков), в присутствии кислорода или связанного азота, и наиболее подробно исследована у энтаробактарии Klebsiella pneumoniae. В клетках К.pneumoniae генетический контроль азот{иксации осуществляется на двух уровнях: уровне общей системы регуляции азотистого метаболизма (гены glnD, glnB, ntrA, ntrB, ntrC), и на уровне особой nifiiA-систены, вовлеченной в контроль экспрессии структурных генов нитрогеназного комплекса (nif-генов) (Magaeanik, 1982; Dixon, 1988).

Другим модельным объектом для изучения регуляции азотфиксации являются пурпурные фототрофные несерные бактерии рода Rhodo-bacter семейства Rhodoopirillaceae. Способность фотосинтезирую-щих микроорганизмов фпссировать атмосферный азот поднимает важный как в теоретическом, так и в практическом отношении вопрос - о наличии или отсутствии сопряжения двух фундаментальных биологических процессов: фотосинтеза и азотфиксации.

Фототрофные азотфиксируэдие бактерии представляют интерес также в связи с возможностью их использования в биотехнологии для решения важных практических задач: получения аммиака, биотоплива, биологически активных соединений, очистки сточных вод и почв. Все сказанное определяет актуальность изучения регуляции азотфиксации у этих организмов.

У наиболее изученного представителя этого семейства -Rhodobacter capsulatus экспрессия nif-генов контролируется не только геном nifA, но и ntr-подобннми генами: niiRi (гомолог ntrO К.pneumoniae), nifR2 (ntrB), nifR4 (ntrA), а также генами nifR4 и adgA с еще невыясненными функциями ( Avtges et al., 1985; Kranz, Haselkorn, 1985; Jones, Hagelkorn, 1989; Zinchenko et al., 1990).

Для исследования генетического контроля процесса азотфиксации необходимы мутанты с измененной регуляцией синтеза нитроге-назы. У R.capsulatus выделено несколько типов мутантов с дереп-

рессированным синтезом нитрогеназы (Kranz, Haseikom, 1988). В таких клетках экспрессия структурных генов нитрогеназы не зависит от наличия источников связанного азота, но репрессируется при наличии кислорода. Молекулярно-генетический анализ полученных мутантов выявил, что часть из них дефектна по гену nitR5, гомологичному гену glnB внтеробактерий (Kranz et al., 1990).

На кафедре генетики и селекции МГУ исследования азотфикса-ции ведутся на другом представителе рода Rhodobacter -R.Bphaoroid.ee. Здесь Оыл получен ряд мутантов R.Bphaeroides с конститутивным (дерепрессированным) синтезом нитрогеназы (Drn-мутанты) (Швстаков и др.. 1988). Помимо конститутивного синтеза нитрогеназы, мутанты неспособны к фиксации азота в темноте, к поглощению аммония клетками и к росту на нитрате калия в качестве единственного источника азота (Зинченко и др., 1991). Комплексный фенотип этих мутантов указывает, что мутации затрагивают ген, продукт которого принимает участие не только в регуляции азотфиксации, но и азотистого метаболизма в целом.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось получение и исследование новых типов мутантов R.ephaeroideB с дерепрессированным синтезом нитрогеназы, а также клонировшто гена, восстанавливающего регуляцию нитрогеназы в одном из мутантов - Drnl2. Основные задачи исследования:

1. Создание банка генов дикого типа R.Bphaeroides 2R и выделение из него рекомбинантноЯ плазмиды, комплементирующей мутацию drn12.

2. Определение минимального фрагмента ДНК R.ephaeroideB, способного к восстановлению нормального фенотипа у мутанта Drnl2.

3. Выделение новых мутантов R.Bphaeroides с дерепрессированным синтезом нитрогеназы.

4. Биохимический, физиологический и молекулярно-генетический анализ выделенных Drn-мутантов и мутантов с дерепрессированным синтезом нитрогеназы, полученных ранее.

Научная новизна и практическая ценность. Выделены и охарактеризованы новые мутанты R.Bphaeroides с конститутивным синтезом нитрогеназы, отличающиеся от полученных ранее. Охарактеризованы также Drn-мутанты, полученные ранее. Из банка генов дикого типа R.ephaeroideB 2R выделен фрагмент протяженностью 2,7 т.п.н., комплементирувдий мутации drnl2 и йгп21. Этот фрагмент восста-

вавливает нормальную регуляцию синтеза нитрогеназы при росте на свету, а также способность к азотфиксации в темноте. Полученные данные о комплементации мутанта Dmi2 позволяет сделать вывод о существовании этапа регуляции азотистого метаболизма, не исследованного ранее. На основании результатов йизиолого-биохимического и комплементационного анализа мутанты с конститутивным синтезом нитрогеназы, исследованные в данной работе, разделены на три класса. Эти мутанты могут быть использованы для дальнейшего изучения регуляции азотистого метаболизма в клетках R.ephaeroides.

Структура в объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного генетическому контролю азотфпссации у пурпурных бактерий, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 116 стр. машинописного текста и содержит 12 рисунков и 12 таблиц. Список литературы включает 121 наименование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. В работе использован штамм R.ephaeroides 2R дикого типа из коллекции каф. генетики и селекции МГУ и мутанты с конститутивным синтезом нитрогеназы Drni 2, Dm13, Dm2l, Dmi76, Drnl83, Dm187, полученные ранее (Шестаков и др., 1988). Drn-мутанты R.ephaeroidee, полученные в данной работе, описаны в разделе "Результаты и обсуждение". Штаммы В.coll из коллекции кафедры генетики и селекции МГУ: С600, CGOO recA, НВ101. Список плвзмид, использованных в работе, приведен в табл.1.

Среды и культивирование микроорганизмов. Для культивирования клеток в.coli использовали среду LB (Glbco) или среду Адамеа с необходимыми добавками витаминов и аминокислот (Миллер, 1976). Выращивание клеток R.ephaeroidee проводили в среде Ормерода (Ormerod et al., 1961). Для определения способности штаммов R.ephaeroidee к азотфиксации клетки выращивали в атмосфере азота в среде Ормерода, лишенной источников связанного азота.

Выделение и очистку плазмидных ДНК, элоктрофоретинееккй анализ в агарозных гелях, расщепление рестрикцконными эндонук-лоазами, лигирование фрагментов ДНК, трансформацию клеток в.coll проводили по описанным ранее методикам (Holmes, Quigley, 1981;

Таблица 1

Список плазмид, использованных в работе

Плазмида Фенотип и/или генотип Источник

pRGKO Kmr Тсг niiH-lacZ (рис.1) R.C.Kranz

PVZ361 Кшг Sur каф. генетики МГУ

pAS8-121A3 Кшг Арг тот же

р229 Smr Sur Кшг nifR5 R.Bphaeroidee тот же

pE150 Smr Sur Km1* nliR5 R.capeulatus тот жо

Маниатис и др., 1984; Babykin, Zinchenko, 1984). Банк генов R. sphaeroides 2R дикого типа на основе плазмиды pYZ36l создавали по методике, описанной Маниатисом и др. (1984). Частичное расщепление тотальной ДНК R.sphaeroides проводили рестриктазой ЗаиЭА.

Коыыогвциокныо трехродительскио скрещивания R.sphaeroides со штаммами E.coli проводили по методике, описанной ранее (Zinchenko et al., 1985). В качестве конъюгативной плазмиды использовали рАБ8-121АЗ.

Активность нитрогеназы измеряли ио восстановлению ацетилена (Stewart et al., 1968). Активности глутаминсинтетазы и р-галактозидазы анализировали на полупроницаемых клетках. О трансферазной активности глутаминсинтетазы судили по образованию 7-глютамилгидроксамата путем спектрофотометрического измерения при 640 им (Shapiro, Stadtman, 1970). Активность ß-галактозидазы определяли стандартным методом (Миллер, 1976). Содержание Се.оса в пробах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Ферментативные активности выражали в наномолях продукта, образовавшегося на 1 мг белка за 1 мин.

В опытах по изучению поглощения метиламмония и глутамина клетки R.ephaeroideu инкубировали при 32°С в среде с 14с-метиламмонием (20 цС1/цмоль) или 14С-глутамином (25,5 lici/цмоль) в среде роста, не содержащей источник азота. Пробы отбирали q интервалом в 2 мин, и отмывали на фильтрах Millipore-

НАТО раствором соответствующего немеченного соединения. Радиоактивность на фильтрах определяли на сцинтилляционном счетчике Nuclear Chicago МагК 2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.1. Получение мутантов R.ephaeroidoB с дерепрессированным (конститутивным) синтезом нитрогеназы

Для выделения Drn-мутантов R.ophaeroidec, отличающихся от мутантов, полученных ранее на нашей кафедре (Шестаков и др. 1988) использовали штамм дикого типа R.Bphaeroidee 2R, в который путем конъюгационного скрещивания была введена плазмида pRGKO (Kranz, Haeelkom, 1985). Плазмида pRGKO содержит nifHDK гены ' R.Capsulatue в конструкции nifH-laoZ в составе фага mini-MudII1734 (Oaetilho et al., 1984) (рис. 1). В этой конструкции гены лактозного опэрона находятся под контролем промотора nifH, одного из структурных генов нитрогеназы. Клетки штамма 2R(pRGKO)

nif н

Sali 1,8-1

9,2т г10,7 Г11.7

—..Í

15,9

¿indIII

lac

Km1

2,0

all'HindIII

15.1-j

sai:

Hin dl 11

Рис. 1. Карта ШпйШ-фрагмента плазмида риско, содержащей гены п1ГШ)К Н.сарви1аиш с фагом т1п1-Ми11Л1734, встроенным в ген п1ХН.

н

ъ

Y

А

высевали в анаэробных условиях на среду, содержащую лактозу в качестве единственного источника углерода в условиях репрессии синтеза нитрогеназы (наличие в среде роста ионов аммония репрессирует активность нитрогеназы, а в присутствии глутамата фермент дерепрессирован). Таким образом было получено несколько десятков клонов мутантов н.врПаего1йев, способных расти в этих условиях. Мутантные клоны очищали путем рассева на той же среде до отдельных колоний и проводили дальнейший анализ. Для первичного скри-

Таблица 2.

Активность р-галактозидазы у мутантов Л.врЬяего1йев с доропрессированным синтезом нитрогеназы.

Штамм* Активность в присутствии ИН*. нмоль Активность при отсутствии НН+. нмоль Активность (+тф Активность )

мин. мг оелка мин. мг оелка

1>гп4 275 1596 0,17

1>гп10 207 682 о.зо

Г)гп11 520 984 0,52

Ш-п1б 253 2192 0,11

Сгп7б 612 774 0,80

Бто80 537 825 0,67

Сгп82 308 899 0,34

йгт191 975 1658 0,59

гп 17 1053 0.01

*Все штаммы содержали плазмиду рНСКО.

нинга Ито-мутантов определяли соотношение активности р-галактозидазы в клетках, выросших в условиях репрессии (в среде с ионами аммония) и дерепрессии (в среде с глутаматом) синтеза нитрогеназы, хорактеризупдоее степень дерепрессии синтеза фермента. У спонтанных мутантов 1)гп76-1)гт191 (табл. 2, приведены результаты типичного опыта из 3-4 экспериментов) этот показатель резко превышает таковой для дикого типа.

Из таблицы 2 видно, что полученные мутанты можно условно разделить на две группы по степени дерепрессии синтеза нитрогеназы. К первой группе можно отнести мутанты, для которых рассматриваемое соотношение варьирует в пределах 0,6 - 0,8. У второй группы мутантов его величина составляет 0,15 - 0,13.

Для получения индуцированных ти-мутантов культуру 2Щр1КЖО) обрабатывали 9-аминоакридингидрохлоридом в коночной концентрации 5 мкг/мл (выживаемость - 1%). Анализ активности р-галактозидазы в клетках индуцированных Ют-мутантов Ргп4-Впи6 выявил, что

уровень дерепрессии нитрог-бйааи варьирует в пределах 0,1-0,5 (табл.2, приведэны результаты типичного опыта из 3-4 экспериментов).

Применяя описанный метод отбора Drn-мутантов, нельзя исключить следующую возможность: способность к росту на лактозе могут приобрести клетки R.ephaeroidee, в которых экпрессия гена lacZ происходит не из-за мутации в геноме, а благодаря мутации в промоторе гена nirü, расположенного на плазмиде, в результате чого его транскрипция происходит независимо от концентрации ионов аммония. Для проверки этого предположения выделяли плаз-мидаую ДНК из исследуемых мутантов и вводили ее с помощью трансформации в клетки E.coll С600. Трансформанты, отобранные по устойчивости к канемицину, скрещивали с H.Bphaeroides 2R. Клоны 2R, содержащие плазмиду pRCKO из Dm-мутонтов, сохраняли нормальный фенотип, т.е. не росли на среде с лактозой и с аммонием. Таким образом, полученные нами Dm-мутанты проявляют Нз.1°-фонотш1 (способность к конститутивному синтезу нитрогеназы, независимо от присутствия ионов аммония в среде роста) благодаря мутации в хромосоме R.ephaeroidee, а не из-за измененной регуляции промотора в плазмидной конструкции niiH-lacZ.

1.2. Биохимическая и внзиологическая характеристика мутантов R.opbaeroides с конститутивным синтезом нитрогеназы

С целью дальнейшего анализа полученных Drn-мутантов определяли активность глутаминсинтетазы. Мутанты с конститутивным синтезом нитрогеназы, Drn12, Drnl3, Drn21, Drn176, Drn183, Drnl87, полученные ранее на кафедре генетики и селекции МГУ, характеризуются низким значением активности глутаминсинтетазы по сравнению с клетками дикого типа. Мутанты группы Drn4, полученные в данной работе, при росте на среде с глутаматом в качестве источника азота по активности глутаминсинтетазы не отличаются от дикого типа.

У мутантов группы Drn4 анализировали способность к росту на различных средах, являпцихся селективными для мутантов группы Drnl2, полученных ранее. Мутанты группы Вгп12 неспособны к азотфиксации в темноте, а также к росту на средах с кж>3 в качества единственного источника азота. При этом они растут на средах с различными аминокислотами и фиксируют азот на свету.

С целью подбора селективной среда и дополнительной характеристики мутантов, полученных нами, определяли их способность к росту на среде с кло^, различными аминокислотами, а также в условиях азотфиксации в темноте и на свету. Обнаружено, что все мутанты растут на среде, содержащей КНО^, а также в условиях азотфиксации в темноте и на свету. Таким образом, мутанты группы Вгп4 резко отличаются от мутантов группы Г»гп12.

Одной из возможных причин отсутствия регуляции синтеза нитрогеназы у мутантов с конститутивным синтезом этого фермента может быть неспособность клеток к включению аммония. Так, одним из свойств полученных ранее мутантов Ги-п12 и 1>гп21 является неспособность к поглощению аммония. Мутанты, полученные в данной работе, не отличаются от дикого типа по способности к поглощению метилашония и глутамина.

1.3. Определение нитрогеназной активности в клетках

1)гп-мутантов в условиях репрессии синтеза нитрогеназы

Высокий уровень синтеза р-галактозидазы при росте на среде с (Ш^^БО^, характеризующий мутанты группы 1>гп4, является лишь косвенным подтверждением т1с-фенотипа. С целью проверки была определена активность нитрогеназы у Ют-мутантов в условиях роста в среде с (Ш4)2504 методом ацетиленредукции. В качество •контроля использовали мутант Вгп12, в клетках которого активность нитрогеназы при росте на 10 мМ (Ш^БО^ составляет 80100% от той же величины при росте в условиях репрессии синтеза нитрогеназы.

У мутантов, полученных в данной работе, активность нитрогеназы при росте на 10мМ (Ш^БО^ сравнима с соответствующей величиной для дикого типа. Однако, при использовании концентрации 5 мМ (1га4)280д и подбора стадии роста клеток для измерения активности фермента было выявлено, что некоторые мутанты проявляют высокий уровень синтеза нитрогеназы, значительно превышающий соответствуйте значение для клеток дикого типа и сравнимый с таковым для Бгп12 (табл. 3).

Необходимо отметить, что у мутанта 1)гп12 высокая степень дерепрессии нитрогеназы наблюдается на разных стадиях роста культуры, у мутантов группы Вгп4 относительно высокие значения активности нитрогеназы наблюдали лишь на определенной стадии

е

роста - 36 ч. для Вгп4, 1)гп76 и 0гп91. 36 и 48 ч. - для ЦгтаЧб.

Результаты сравнительного анализа 1)гп-мутантов, выделенных ранее и полученных в данной работе, суммированы в табл. 4. Все мутанты группы 1)гп4 отличаются от мутантов группы Г>гп12 по ряду признаков (в таблице приведены только несколько типичных представителей Шп-мутантов): меньшей степенью дерепрессии синтеза нитрогеназы, способностью к азотфиксации в темноте и к росту на среде с кло3, высокой активностью глутаминсинтетазы. При этом, полученные нами мутанты, как и мутанты, группыигп12, проявляют М*сн$енотип независимо от содержания источника связанного азота в среде роста. Наличие кислорода приводит к репрессии синтеза нитрогеназы у всех мутантов.

Таблица 3.

Активность нитрогеназы у &гп-мутантов й.вр11аего1(1ев при росте на средах с различными источниками азота

Штамм Активность нитрогеназы, ¡^¡^щ К

К глутамат глутамат • *

1>гп4 6,8 65,0 11

1»гтг1б 33,3 •43,0 69

ГГгп7б 17,4 48,4 35

Втп91 54,5 75,0 60

Вгп12 59,2 75,2 80

2И 0,58 37,5 1.5

гЩрЖЖО) 1.5 50,0 3.0

'отношение величины активности нитрогеназы в клетках и.8р11аего1<1ев, выросших на среде с ионами аммония в качестве источника азота, к той ге величине для клеток, выросших на среде с глутаматом.

Таблица 4

Сравнительная характеристика различных 1)гп-мутантсв й.врЬаегсайез

Мутант Активность ферментов: Рост на различных селективных средах**

р-галак-, тозидазы глутамин-синтетазы в X от дикого типа нитро-, геназы

1х 2 Э 4

Сгп12 0,60 15 80 - + -

Вгп21 0,28 15 55 + - + -

1)гп176 0,11 15 85 + - + -

1>гп1б 0,11 100 69 + + + +

1>гп7б 0,8 100 И + + + +

Огп91 0,59 100 60 + + + +

2И 0,02 100 1.5 + + + +

'Приведено отношение (в %) активности фермента для культур, растущих в присутствии ионов аммония, к той же величине для клеток, выросших в условиях дерепрессии синтеза нитрогена-зы - в среде с глутаматом в качестве источника азота).

**1 - способность к росту на среде с лактозой и (Ш^)2БОд. 2 - способность к росту на среде кло^ в качестве единственного источника азота.

3- способность к азотфжсации на свету 4 - способность к азотфиксации в темноте хДля определения способности к росту на среде с лактозой и (ЫН^БО^, а также р-галактозидвзной активности в клетки всех исследуемых мутантов вводили плазмиду рНСКО.

2. Предварительная молекулярно-генетическая характеристика Вгп-мутантов, полученных в этой работе

С целью анализа Drn-мутантов в их клетки вводили плазмиду рЕ150, содержащую ген niiR5 R.capsulatus, гомологичный гену glnB онтаробакторий. Известно, что мутации по гену niiR5 могут приводить к образованию мутантов с дерепрессированным синтезом нитро-геназы (Kranz, Haselkorn, 1988). Оказалось, -что ген niiR5 не комплементирует ни одну из полученных dm-мутаций в штаммах с высокой степенью дерепрессии нитрогеназы (Drn4, Drnl6, Drn76 и Drn9i): все трансконъюганты сохраняют способность к росту на среде с лактозой и NH^. Аналогичные результаты были получены при введении в клетки перечисленных мутантов плазмида р229, содержащей ген R.ephaeroidee», гомологичный nifR5. Гены nifRl, niiR2, nilR4 также не комплементируют мутации группы dm4.

Можно сделать предварительный вывод о природе генов, затронутых мутациями у штаммов R.ephaeroidee Drn4, Dml6, Drn76, Drn91, полученных в данной работе. Мутации в этих штаммах влияют лишь на регуляцию нитрогеназы, не затрагивая способность к росту на среде о различными источниками азота, способность к азот<1ик-сацпи в темноте, процесс транспорта метиламмония и глутамина в клетки и пр. Таким образом, можно предполагать, что у этих штаммов мутировали гены, связанные лишь с регуляцией экспрессии структурных генов нитрогеназы. Возможно, что мутировавшими генами являются nifR4 или nifA. Проверка этого предположения требует дальнейших исследований.

3. Клонирование гена, комплементирупцего мутацию dm12

3.1. Выделенно фрагмента ДНК, коыплементирущего мутацию

drn12, из банка генов R.Bphaeroideß 2R

Как ужа было отмечено, мутант Drni2 отличается неспособностью к росту на среде, содержащей кно^ в качестве единственного источника азота. Клетки дикого типа растут на этой среде в виде крупных ослизненных колоний белого цвета. Это обстоятельство было использовано для выделения плазмиды с фрагментом ДНК, комплементируюцим мутацию drnl2, из банка генов R.ephaeroidea

SR. Банк 0нд сконструирован на основе плазмиды гУ31б1, несущей

маркер устойчивости к канамицину и восстанавливающей устойчивость к стрептомицину в результате встраивания фрагмента ДНК в

ВатН1-сайт.

Конъюгационные скрещивания мутанта Drnl2 проводили с 42 смесями клонов е.coli, содержащих плазмиды с фрагментами геномной ДНК R.ephaeroidee 2R протяженностью 10-20 т.п.н. ("большие фрагменты") и с 40 смесями с фрагментами ДНК размером 6-10 т.п.н.("малые фрагменты"). Каждая смесь содержала по 100-200 плазмидных клонов. В результате скрещивания со смесями "больших фрагментов" Я* 23 и 27 на средах с KNO^ и с KNO^ и стрептомицином выросли колонии, сходные по морфологии с колониями дикого типа. Из 20 независимых клонов комплементантов R.Bphaeroidee выделили плазмидную ДНК и трансформировали полученными препаратами клетки В.coll С600 гесА. Трансформанты отбирали по устойчивости к стрептомицину. Полученные клоны е.coli снова скрещивали с R.Bphaeroidee Dml2. Конъюгационную смесь высевали на селективные среды с KNOj, KNOj с стрептомицином, и на среду со стрептомицином, лишеннуп источников связанного азота (рост в атмосфере азота). В качестве отрицательного контроля Drn12 скрещивали с вектором pTZ36l, содержащим фрагмент ДНК R.sphaeroides, заведомо не комплементирупций эту мутацию. Для определения частоты скрещивания равный объем смеси высевали на среду с стрептомицином, содержащую сульфат аммония. От скрещивания трансформантов, содержащих исследуемый фрагмент, на всех средах выросло примерно равное число колоний (2-3 х 103), причем морфология клонов, выросших на среде с нитратом и выросших в условиях азотфиксации в темноте, полностью соответствовала морфологии колоний дикого типа. Это позволило заключить, что все клоны-комплементанты содержат плазмиду с фрагментом хромосомы •R.Bphaeroidee 2R, комплементирупцнм мутацию drni2. Эти результаты были воспроизведены в трех независимых акспериментах. То обстоятельство, что вместе со способностью роста на KNOj у комплементантов Dm* восстанавливается способность к азотфиксации в темноте, позволило сделать вывод о плейотропном действии гена, комплементирупце-го мутацию Dml2. Этот ген был обозначен нами llnA (от Light-independent nitrogen fixation).

С целью предварительной молекулярно-генетической характеристики выделенных фрагментов ДНК был проведен их рестрикционный анализ по андонуклеазе рестрикции BamHI. Все анализируемые плазмиды содержали одинаковые BamHl-фрагменты хромосомы R.ephae-

roidea 2R протяженностью 5.3, 4,3, 2,0 и 1,1 т.п.н. Исключение составляла лишь плазмида, несущая фрагмент LA2. Этот фрагмент возник в процессе субклонирования (очистки) одного из первичных комплементантов R.ephaeroidee, обозначенного LA1, в результате спонтанной долеции. Эта делоция привода к утрате участка протяженностью 6,3 т.п.н. из фрагмента LA1, а также к выщеплению участка длиной 0,2 т.п.н. из ВагаШ-фрагмента длиной 1,1 т.п.н. (рис. 2). в плазмиде pLA2 такте утерян уникальный EcoRI-сайт в составе вектора pVZ36i. При этом фрагмент LA2 сохраняет способность к комплементации мутации drnl2.

Трансформанты E.coli СБОО гесА, содержащие плазмиды pLAl и pLA2, использовали для скрещивания с мутантами Dmi3, Drn2i, Drni76, Drni83, Drni87, выделенными ранее, а также с полученными в этой работе мутантами: Drn4, Drni6, Drn 7G и Drn9l. Ни один из мутантов группы Drn4 но обнаружил комплементации.

Из Drn-мутантов, полученных ранее, плазмиды pLAl и pLA2 комплементируют только мутацию Dm2i. Таким образом, мутации Drni 2 и Drn2l относятся к одному и тому же гену - 11пА. Остальные Dril-мутанты - Drnl3, Drnl76, Drni83, Drn 107, носмотря на сходство фенотипов, очевидно, входят в другую группу (группы) комплементации и дефектны по другим генам, осуществляющим контроль регуляции нитрогеназы. Таким образом, мутанты группы Drni2 можно разделить на два класса: мутанты группы Drni2 (включает мутанты Drnl2 и Dm21) и мутанты группы Drnl76 (Drni76. Dml83, Drnl87).

Далее было проверено восстановление основных свойств, по которым мутант Drni2 отличается от дикого типа. У комплементантов восстанавливается регуляция нитрогеназы ионами аммония на свету, способность к фиксации азота в темноте и к поглощению метиламмония, нормальная активность глутаминсинтетазы, регуляция активности ß-гвлактозидазы в составе конструкции lacZ-nitH, расположенной в плазмиде pRGKO, при росте на,свету и в темноте. Результаты анализа трансконыогантов R.sphaeroides Drnl2, содер^ жащих плазмиды рШ и р1Л2, комплементирупцие исследуемую мутацию, суммированы в таблице 5 (приведены типичные результаты из 2-3 независимых экспериментов).

На основании этих результатов можно сделать вывод о природе гена, комплементирупцего мутацию drni2: очевидно, что этот ген

вовлечен не только в регуляцию азотфиксации, но и в регуляцию общего метаболизма азота. Полученные данные подтверждают предположение о существовании двух систем активации нитрогеназы -светозависимой и светонезависимой, сделанное ранее в нашей лаборатории (Зинченко-и др., 1991).

Наличие светозависимой активации процесса азотфиксации у фотосинтезирущих организмов является, по-видимому, одним из первых указаний-'на возможность существования систем сопряжения процессов фотосинтеза и азотфиксации. Изучение этих систем представляет большой интерес.

Таблица 5

Биохимическая и физиологическая характеристика

клеток R.ephaeriodee,-содержащих и не содержащих фрагменты LA1 или LA2

Штамм Активность нитро- * геназы Активность глутамин-синтетазы в % от дикого типа Активность р-галакто-зидазы** Поглощение метил-аммония

2R 3 100 0,02 +

Drn12 91 5 0,60 -

Drn12(pLAl) 7 100 0,06 +

Drn12(pLA2) 4 100 0,03 +

"приведено отношение (в %) активности фермента для культур, растущих в присутствии ионов аммония, к той же величине для клеток, выросших в условиях дерепрессии синтеза нитрогеназы - в среде с глутаминовой-кислотой в качестве источника азота).

**Клетки Н.вр1шего1йев содержали шшзмиду рЯСКО, несущую конструкцию п1ГН-1асг. Приведено отношение активности фермента для культур, растущих в присутствии ионов аммония, к той же величине для клеток, выросших в условиях дерепрессии синтеза нитрогеназы.

3.2.Локализация гена 11пА, комплеыентирущего нутацию йгп12 Плазмиду рЬА2 обрабатывали рестриктазой ВатН1 и проводили аутолигирование полученных фрагментов. Актированной смесью

трансформировали клетки E.coli С600 гесА. Смеси клонов E.coli, содержащих различнуа фрагменты, скрещивали с клетками R.sphae-roidee Dm12. В результате этого скрещивания на среде с KNO^ выросли колонии R.sphaeroideB, сходные по морфологии с колониями дикого типа. Показало, что эти колонии содержали плазмида с BamHl-фрагментом размером 4,3 т.п.н. Таким образом, способность к комплементации мутации dmi2 сохраняет ВатН1-фрагмент протяженностью около 4,3 т.п.н. Ориентация этого фрагмента была одинакова во всех полученных плазмидах. Фрагмент, расположенный в обратной ориентации, удалось получить путем переклонирования в вектор pVZ36l. Переклонированный фрагмент также комплементирует мутацию Drnl2.

Для дальнейшей локализации гена, комплементирующего мутацию <1гп12, использовали данные, полученные в результате рестрикцион-ного анализа плазмид pLAl и pLA2 (рис. 2). Использовали плазмиду с ВатН1-фрагмонтом длиной 4,3 т.п.н., обозначенную pLA3, полученную в результате BamHl-рестрикции и аутолигирования плазмиды pLA2. Как указывалось выше, в этой плазмиде утерян уникальный EeoRI-сайт в составе вектора pVZ36l. Благодаря этому обстоятельству, из фрагмента LA3 можно удалить внутренние EcoRI-фрагмента общей протяженностью около 1,6 т.п.н. Плазмиду pLA3 обрабатывали рестриктазой EcoRI и аутолигировали. Получен- > ная плазмида, обозначенная pLA5, содержит ВатШ-фрагмент протяженностью 2,7 т.п.н. в составе вектора pVZ36i (рис. 2). Плазмида pLA5 сохраняет способность к комплементации Dml2. В результате переклонирования фрагмента LA5 в вектор pVZ36l была получена плазмида, обозначенная pLA5-l, содержащая фрагмент в ориентации, обратной исходной. Эта плазмида также комплементирует мутацию Qml2.

Во фрагменте LA5 содержатся два BamHI-EcoRI фрагмента: LA6, длиной 2,5 т.п.н. и LA7 - 0,15 т.п.н., ни один из которых не способен комплементировать мутацию Drni2 (рис. 2). На основании полученных данных было сделано предположение, что во фрагменте LA7 содержится регуляторный участок, необходимый для экспрессии гена linA, расположенного в пределах фрагмента протяженностью 2,5 т.п.н. Можно также предположить, что во фрагменте ЬАЗ содержится оперон: промотор, расположенный в пределах 0,15 т.п.н.-участка, отделен от структурного гена, комплементирупцёго мута-

цию <1гп12, EcoRl-фрагментом размером 1,5 т.п.н., который включает другой ген того же оперона. Возможно и другое объяснение: собственная регуляторная область гена linA расположена в EcoHl-фрагменте; при конструировании плазмида pL¿5 она удаляется и ген linA попадает под контроль другого регуляторного участка, расположенного в пределах фрагмента LA7.

Из плазмида pLA2 была получена еще одна конструкция, позволяющая более точно определить границы фрагмента, в котором расположен ген linA: BamHl-Hindlll-фрагмент LA4 размером 4,0 т.п.н., полученный после HindIII-рестрикции и аутолигирования pLA2, комплементирует мутацию Drni2. Можно сделать предварительный вывод, что ген linA, комплементирупдий мутацию drnl2, расположен в пределах фрагмента EcoRl-Hindlii протяженностью 2,25 т.п.н. При этом для акспрессии linA необходимо наличие фрагмента LA7. расположенного на расстоянии примерно 1,5 т.п.н. от структурного гена.

Таким образом, нами охарактеризованы мутанты R.Bphaoroideo с дорепремированным синтезом нитрогеназы, выделенные ранее и полученные в данной работе. Все мутанты проявляют т1с-фенотип независимо от содержания источника связанного азота в среде роста. Повышенная концентрация кислорода приводит к репрессии синтеза нитрогеназы у всех мутантов. Можно выделить три класса исследованных Drn-мутантов. К первому классу относятся мутанты Drnl2 и Drn21. Эти мутанты характеризуются высокой степенью дерепрессии нитрогеназы при росте на среде с 10 мМ nh^, неспособностью к азотфиксации в темноте, к росту на среде с КМ03, к транспорту метиламмония в клетки. Фрагмент геномной ДНК дикого типа, выделенный в данной работе и содержащий ген linA, комплементирует мутации Drnl2 и Drn21. Полученные результаты позволяют предположить, что ген linA вовлечен в один из основных этапов азотистого метаболизма, не изученный ранее. Ко второму классу можно отнести мутанты Drnl76, Drol83, Dml87, сходные по фенотипу с мутантами Drnl2 и Dra21, однако, ген linA не комплементирует их. Очевидно,

Рис.2. Рестрикционные карты фрагментов IA1 и LA2 и их делеци-онных производных. ■ - фрагменты геномной ДНК R.Bphaeroidea 2R;

- - ДНК вектора pYZ36i; -............. - участок, делегированный в

шшзмиде pLA5. Условные обозначения сайтов узнавания рестриктаз: BI- - BaoHI; BII - Bglll; ы - BcoRI; HUI - HindIII.

LAI . 12.8 kb

WÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊÊtK^^^ÊÊÊÊ}

5,6 т.п.н.-фрагаент.

4 деле тированный у LA2

ЬА9». 2x5 kb El

Щ »тМТ п

НИ

II Sali

V lï1 I 1 У1

КОМПЛЕМЕНТАЦИЯ drill 2

LA3. 4.3 leb

III

комплементирует в обеих ориентациях

LA4. 4.0 kb

1А5, 3.7 кЬ

f W fi?

комплемонтирует в обеих ориентациях

-А7. 0.15 kfe

что мутанты второго к-ласса Д&фвКТНЫ ПО Другому lin-гену (ИЛИ генам), вовлеченным а процесс регуляции азотистого метаск>лизма. Третий класс составляют Dm-мутенты, выделенные в данной работе: Dm4, Dral6, Drn7S, Drn91. Эти мутанты характеризуются меньшей степенью дерепрессии нитрогеназы по сравнению с мутантами Dml2 и Drn21: Ш^-фенотип проявляется у них при концентрации ионов NH^ 5 мМ. По остальным признакам их фенотип сходен с таковым для дикого типа. Показано, что ген linA, а также гены nifRi, niiR2, ni!R4 и nilR5 не восстанавливают дикий тип у этих мутантов. Возможно, что мутанты, отнесенные к третьему классу, дефектны по генам, вовлеченным только в регуляцию процесса взотфиксации. Показано, что Drn-мутанты, полученные в данной работе, существенно отличаются от мутантов R.capeulatua (Kranz, Haselkorn, 1988) и R.ephaeroideв (Шестаков И др., 1988; Zinohenko et al., 1990) С дерепрессироввнным синтезом нитрогеназы, полученных ранее.

вывода-.

1. Из банка генов R.Bphaeroidee выделена рекомбинантная плазмида, восстанавливающая фенотип дикого типа у мутантов Dml2 и Drn21. полученных ранее на кафедре генетики и селекции МГУ и характеризующихся плейотропными нарушениями в регуляции азотистого метаболизма и азотфихсации.

2. Структурная часть гена, комплементируицего мутации у штаммов Drnl2 и Dm21 и названного linA, локализована в пределах фрагмента ДНК размером 2,25 т.п.н. Продукт гена linA играет важную роль в регуляции азотистого метаболизма и абсолютно необходим для синтеза нитрогеназы в отсутствие света.

3. Получена коллекция спонтанных и индуцированных 9-аминоакридином мутантов R.Bphaeroidee Drn4, Dtti16, Drn76 и Drn91 и др., у которых, в отличие от выделенных ранее мутантов, не проявляется плейотропный фенотип и нарушена только регуляция синтеза нитрогеназы ионами аммония. Ген linA не комплементирует этот дефект.

4. На основании изучения 'физиолого-биохимических свойств и результатов комплементационного анализа исследованные мутанты R.Bphaeroidee разделены на три группы. Первую группу составляют мутанты Drnl2 и Dm21. Во вторую группу отнесены мутанты Drnl3, Dml76, Dml83, Drnl87, по фенотипу идентичные первой группе.

однако не комплементируемне геном linA. В третью группу входят выделенные в этой работе мутанты Drn4, Dml6, Drn76, Drn91 и др. Все мутанты не комплементируются генами Rhodobaoter nifRl, niXR2, nifR4, ni!R5.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Тевзадзе Г.Г. Получение и анализ мутантов Rhodobacter ophaeroidee с дерепрессированным синтезом нитрогеназы. Труды 21 научной конференции молодых ученых МГУ, Деп. в ВИНИТИ, 23.09.91., * 3763, В-91.

2. V.M.QlaBer, A.Y.Claeunov, G.C.Tevzadze, J.R.Perera, S.Y. Sheotakov. Genetic control of plaemid DNA double-etrand gap repair in yeast Saccharonyceo cerevieiae. Current Genetics (1990)18: 1-5.