Метаболизм азота и водорода у гетероцистных цианобактерий

Трошина, Ольга Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболизм азота и водорода у гетероцистных цианобактерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм азота и водорода у гетероцистных цианобактерий"

На правах рукописи

РГб од

-о

ТРОШИНА Ольга Юрьевна

МЕТАБОЛИЗМ АЗОТА И ВОДОРОДА У ГЕТЕРОЦИСТНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

03. 00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2000 г.

Работа выполнена в Институте фундаментальных проблем биологии Российской Академии Наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук,

профессор

Гоготов И.Н.

доктор биологических наук Доронина Н.В.

доктор биологических наук,

профессор

Львов Н.П.

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится на заседании Совета

/ года в Л ча

та по защите диссертаций Д 002.69.

ГГ часов 01 в Институте

защите диссертаций Д ( биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: пр. Науки 5, г. Пущино Московской области, 142290 Россия

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Автореферат разослан " & " С-К И'/лкШ) года

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций,

доктор биологических наук В.М. Вагабов

Актуальность проблемы. Гетероцистные цианобактерии -многоклеточные цианобактерии, способные к дифференцировке специализированных клеток - гетероцист, в которых осуществляется азотфиксация. Уникальный метаболизм этих бактерий характеризуется способностью осуществлять в одном организме два фундаментальных процесса - оксигенный фотосинтез и фиксацию азота, крайне чувствительную к 02. Цианобактерии широко используются как модельные объекты при исследовании фотосинтеза, азотфиксации, онтогенетической дифференциации и других биологически важных процессов. Благодаря простоте условий культивирования и высокой продуктивности эти микроорганизмы находят широкое практическое применение как источники белков, полисахаридов, связанного азота, органических и физиологически активных соединений. Цианобактерии рассматриваются также как перспективные продуценты аммиака и молекулярного водорода - топлива будущего. Оба процесса -азотфиксации и образования Н2 - происходят в гетероцистах при участии нитрогеназы за счет световой энергии. Однако в естественных условиях роста цианобактерии почти не образуют или образуют мало Н2, что обусловлено функционированием в гетероцистах активной Н:-поглощающей гидрогеназы.

Многие цианобактерии синтезируют уникальное запасное азотсодержащее вещество - цианофицин, представляющий собой полимер аргинина и аспартата. Недавно показано, что мутант-ауксотроф цианобактерии А'о.чСос еШрьозрогит по аргинину не образует цианофицин, не проявляет дифференцировку гетероцист и, соответственно, азотфиксацию (Ье^апеэ е1 а1., 1998). Это подтверждает важную роль аргинина в азотном метаболизме цианобактерий. Однако его биосинтез у цианобактерий практически не исследовался.

Практическому использованию цианобактерий как продуцентов аммиака и Н2 препятствует слабая изученность ферментных систем метаболизма азота и водорода и их регуляции у этих микроорганизмов. Исходя из вышеизложенного и были сформулированы следующие цели и задачи данной работы.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было исследование регуляции синтеза основных ферментов азотного и водородного метаболизма гетероцистных цианобактерий, а именно: 1) нитрогеназы, катализирующей начальный этап ассимиляции молекулярного азота, 2) аргининосукцинат-лиазы, катализирующей конечный этап образования аргинина, и 3) водородпоглощающей гидрогеназы, рециклизирующей молекулярный водород, выделяемый нитрогеназой. Конкретные задачи работы состояли в следующем: 1. Выяснить факторы, влияющие на скорость фотообразования аммония у дикого штамма АпаЬаепа тоШк и у его мутантов с деренрессированным синтезом нитрогеназы.

2. - Изучить взаимосвязь между синтезом нитрогеназы и

внутриклеточным соотношение^ C/N, а также особенности регуляции активности нитрогеназы ионами аммония у цианобактерии АпаЬаепа variabilis.

3. Провести сравнительное исследование индукции синтеза нитрогеназы и Нг-поглощающей гидрогеназы у A. variabilis при лимитировании аммонием в присутствии молекулярного водорода и органического субстрата. Изучить распространение обратимой гидрогеназы у разных штаммов цианобакгерий АпаЬаепа spp. и Nostoc spp.

4. Показать наличие аргининосукцинат-лиазы (ACJI) в клетках цианобактерии Nostoc sp. РСС 73102, исследовать регуляцию синтеза ACJI, клонировать и охарактеризовать argW, кодирующий АСЛ Nostoc sp. РСС 73102.

Новизна работы. Установлено, что мутанты A. azollae с дерепрессированным синтезом нитрогеназы способны к фотообразованию аммония со скоростью, определяемой активностью нитрогеназы и глутаминсинтетазы. Впервые показано, что у фотоавтотрофно растущих культур A. variabilis снижение содержания азота в клетках (увеличение отношения C/N) приводит к индукции синтеза нитрогеназы. Выяснено, что ингибирование нитрогеназной активности аммонием у цианобактерий обусловлено снижением транспорта органических соединений в гетероцисты вследствие ассимиляции аммония. Установлено, что синтез нитрогеназы и Н2-поглощающей гидрогеназы у A. variabilis происходит координирование, причем синтез последней не репрессируется органическими соединениями. Наличие обратимой гидрогеназы не является обязательным для гетероцистных цианобактерий. Показано наличие активной аргининосукцинат-лиазы в клетках Nostoc sp. РСС 73102 и установлено, что ее синтез не репрессируется аргинином. Впервые клонирован и охарактеризован цианобактериальный argW, кодирующий аргининосукцинат-лиазу, и получена его функциональная экспрессия в клетках Escherichia coli.

Научная и практическая значимость работы. Полученные в работе данные расширяют имеющиеся представления о метаболизме азота и водорода у гетероцистных цианобактерий и могут служить научной основой для создания разнообразных штаммов-продуцентов, в частности Н2 и NH3. Совокупность полученных данных о фотообразовании NH3 мутантами А. azollae позволяет рекомендовать их для использования в качестве биоудобрения.

конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущи но, 1992), на X международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на V международной конференции по молекулярной биологии гидрогеназ (Франция, Albertville, 1997), на международной конференции по биологическому образованию Н2 (США, Hawaii, 1997), на XI конференции северных стран по азотфиксации (Швеция, Стокгольм, 2000).

Публикации. По материалам диссертации представлено в печати 8 публикаций.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает /¿С страниц, содержит рисунка и 8 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

АпаЪаепа azollae выделена из симбиотической ассоциации Azolla pinnata. Мутантные штаммы ЕД-12, 17, 21, 31, устойчивые к этилендиамину, были получены на кафедре генетики МГУ. Anabaena variabilis АТСС 29413 получен из коллекции США (American Туре Culture Collection), Nostoc sp. PCC 73102, Anabaena-Nostoc sp. PCC 7120 и Synechocystis sp. PCC 6803 получены из Пастеровской коллекции Франции (Pasteur Culture Collection), Nostoc muscorum Agardh CCAP 1453/12 из коллекции Великобритании (Culture Collection of Algae and Protozoa). Культуры выращивали в периодических условиях на безазотистых средах Аллен-Арнона (1/4) или BG-110 при 25°С, освещении люминесцентными лампами (25 Вт/м2), с продуванием смесью 99% воздуха и 1% С02 (0,3-0,5 л/мин). Мутантные штаммы выращивали на среде Аллен-Арнона (1/4) с добавлением 4 мМ фосфата и 5 мМ фруктозы в колбах, без перемешивания. В качестве источников связанного азота (где указано) использовали NH4CI (2 мМ), NaN03 (10 мМ), L-глутамин (2 мМ), L-аргинин (5 мМ), L-орнитин (5 мМ) или L-цитруллин (5 мМ). Для индукции синтеза обратимой гидрогеназы культуры продували в течение 24-30 часов смесью аргона (Ar) и 0,5-1% С02 или только аргоном.

Нитрогеназную активность измеряли методом газовой хроматографии по восстановлению С2Н2 на свету (50 Вт/м2) и в темноте с добавлением (где указано) 02 или Н2, а также по реакции фотовыделения Н2 (Косяк и др. 1978). Активность глутаминсинтетазы определяли в условиях in situ по трансферазной и биосинтетической реакциям (Farnden, Robertson, 1980). Поглощение Н2 определяли амперометрически с Hansatech DWI 02/Н2 электродом. Активность обратимой гидрогеназы в клетках и экстрактах определяли по выделению Н2 из метилвиологена, восстановленного дитионитом, методом газовой хроматографии.

Электрофорез проводили в 10-15% ПААГ в неденатурирующих и денатурирующих условиях, используя оборудование Pharmacia-™ PhastSystem. Гели окрашивали Comassie blue R-350 и гидрогеназные зоны в ПААГ проявляли инкубированием гелей в 0,05 М Tris-HCl-буфере, pH 8,0, содержащем МВ2+ (1 мМ), в атмосфере Н2. Проявление активности аргининосукцинат-лиазы (ACJI) в геле проводили как описано (Troshina et al., 1997). Активность ACJ1 определяли спектрофотометрически по образованию мочевины из аргинина при избытке аргиназы (Troshina et al., 1995). Так как Nostoc sp. РСС 73102 имеет активную уреазу, экстракты клеток предварительно инкубировали (15 мин, 38°С) с ацетогидроксамовой кислотой - специфическим ингибитором уреазы. Активность уреазы определяли по потреблению мочевины, содержание которой определяли по методу Арчибальд (1945). Белок определяли по Лоури и Брэдфорду, NH4+- гипохлоритным методом (Solorzano, 1969), хлорофилл - спектрофотометрически в метаноловых экстрактах клеток (Mackinney, 1941). Содержание общего углерода и азота анализировали согласно методу Климовой (1975). Выделение геномной ДНК проводили согласно Tamagnini et al. (1997). Плазмидную ДНК выделяли по протоколу фирмы Promega. Гидролиз ДНК рестриктазами и лигирование осуществляли по рекомендациям Pharmacia. Очистку ДНК из гелей агарозы проводили с помощью Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Фрагменты ДНК метили 32Р с помощью Rediprime DNA Labeling System (Amersham-Pharmacia-Biotech) или с дигоксигенином с помощью "Dig DNA Labelling and Detection Kit" (Roche Molecular). Электрофорез в агарозном геле, трансформацию, блот-гибридизацию по Саузерну и другие процедуры выполняли согласно стандартным методам (Sambrook et al, 1989). Нуклеотидные последовательности анализировали секвенированием с флуоресцентными терминаторами с использованием BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kit и ABI PRISM™ 310 Analyzer ("Perkin-Elmer", CIIIA). Поиск гомологий с известными нуклеотидными последовательностями проводили по программе BLAST. Вектор для экспрессии argñ Nostoc РСС 73102 конструировали на основе экспрессионного вектора pQE30 (Qiagen), содержащего индуцибельный вирусный Т5 промотор и несущего последовательность, кодирующую кластер из 6 гистидинов, на 5'-конце клонируемой области, argil Nostoc РСС 73102 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics), геномной ДНК Nostoc РСС 73102 и специфичных праймеров, фланкирующих кодирующую часть argY\ Nostoc РСС 73102 с 5'- и З'-конца. Экспрессию гена в Е. coli и очистку рекомбинантной ACJ1 осуществляли с помощью афинной хроматографии на Ni-NTA (Ni-нитрилтриуксусная кислота) агарозе согласно рекомендациям Qiagen.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Рост культур и активность ферментов азотного метаболизма у АпаЬаепа саоНае и ее дерепрессированных по нитрогеназе мутантов.

Сравнительное изучение мутантов А. агоНае, устойчивых к этилендиамину (ЕД-мутанты), и исходного свободноживущего штамма А. аю11ае показало, что у мутантов, вследствие нарушения ассимиляции аммония, синтез нитрогеназы им не репрессируется, и значительное количество ЫН4+ выделяется в культуральную жидкость. По скорости роста в условиях азотфиксации изученные мутанты А. слоНае можно разделить на две группы: медленнорастущие (ЕД-12, ЕД-31) и быстрорастущие (ЕД-17, ЕД-21) (табл. 1). Они различались и по влиянию связанного азота на их рост, по степени дерепрессиии нитрогеназы связанными формами азота, по активности глутаминсинтетазы (ГС) и скоростям накопления аммония в культуральной жидкости.

Таблица 1

Характеристика ЕД мутантов и исходного штамма А, а:о11ае

Штамм Время Активность Активность

генерации, ч нитрогеназы глутаминсинтетазы

Ы2 * N14/ * N. * ЫН/ * Т Б БАГ

А.агоЦае 12 11 31,5 0 1,04 0.037 0.035

ЕД-21 14 15 26,5 6,6 0,46 0.014 0,030

ЕД-17 22 24 118,0 98,1 0.25 0.006 0.024

ЕД-12 52 102 163,4 147,0 1.08 0,006 0,006

ЕД-31 48 97 123,6 143,8 1.45 0,004 0.003

Б - биосинтетическая активность; Т- трансферазная активность глутаминсинтетазы клеток, выросших в условиях азотфиксации. Активность ГС выражена в мкмоль у-ГГК мин"' (мг белка)"'. Активность нитрогеназы - в нмоль С;Н4' мин"'' (мг белка)"'. ""Источник азота в среде роста.

Скорость роста медленнорастущих мутантов А. сиоНае значительно снижалась в присутствии аммония (2 мМ), тогда как глутамин (2 мМ) и нитрат (10 мМ) стимулировали их рост. В отличие от этого связанные формы азота не оказывали существенного влияния на рост мутантов ЕД-17 и ЕД-21, как и в случае дикого штамма А. а:о11ае. Для изученных мутантов А. агоИае (за исключением ['71-21) характерен значительно более высокий, по сравнению с диким штаммом, уровень нитрогеназной активности при их росте в условиях азотфиксации, а также устойчивость синтеза нитрогеназы к подавляющему действию связанного азота (табл. 1). Аммоний (2 мМ) полностью подавлял синтез нитрогеназы клетками дикого штамма А. а:о11ае, тогда как глутамин и нитрат лишь частично. Нитрат и глутамин оказывали более сильное, по сравнению с аммонием, репрессирующее действие на синтез нитрогеназы

мутантами ЕД-12, ЕД-17 и ЕД-31. Следует отметить, что глутамин и нитрат стимулировали рост мутантов ЕД-12 и ЕД-31. Это указывает на то, что данные мутанты способны ассимилировать эти источники азота при одновременном выделении в среду >1Н4+, образованного в процессе азотфиксации.

Ключевым ферментом ассимиляции. ЫН4+у цианобактерий является глутаминсинтетаза. У мутантов ЕД-17 и ЕД-21 трансферазная и биосинтетическая активности глутаминсинтетазы были ниже, чем у исходного штамма (табл. 1). Мутанты ЕД-12 и ЕД-31 проявляли высокую трансферазную активность глутаминсинтетазы, сравнимую с таковой у дикого штамма, но крайне низкую активность в биосинтетической реакции. Соотношение активностей глутаминсинтетазы в биосинтетической и трансферазной реакциях для мутантов ЕД-12 и ЕД-31 было значительно ниже, чем у дикого штамма (табл. 1).

Соотношение биосинтетической и трансферазной активностей глутаминсинтетазы в клетках мутантов А. агоНае определяло интенсивность выделения ими >1Н4+ в среду в процессе роста. Наиболее высокие скорости накопления ЫН4+ в среде проявляли штаммы ЕД-12 и ЕД-31, обладающие самым низким среди изученных А. аго11ае мутантов соотношением активностей глутаминсинтетазы. Так, мутант ЕД-12 выделял ЫН/ со скоростью 480-600 нмоль >Ш4+/ч на 1 мг белка не менее 5 суток. Мутанты ЕД-17 и ЕД-21, обладающие более высокими скоростями роста и соотношением активностей глутаминсинтетазы, выделяли NH4+ непродолжительное время (2-3 суток) и с более низкой скоростью (90-200 нмоль ЫН4+/ч на 1 мг белка). Экзогенный аммоний не оказывал существенного влияния на выделение МН4+ клетками мутанта ЕД-12, тогда как нитрат заметно стимулировал этот процесс (примерно в 2 раза), что свидетельствует о значительном вкладе нитратредуктазной системы в образование >Ш4+ в этих условиях.

Скорость выделения ЫН4+ у мутантов А. агоНае зависела и от фазы роста периодических культур. У мутанта ЕД-12 максимальное накопление ЫН4+ в среде происходило в экспоненциальной фазе роста и совпадало с высокой активностью нитрогеназы. Снижение скорости выделения ЫН4+ в конце экспоненциальной и начале стационарной фаз роста обусловлено уменьшением нитрогеназной активности клеток, но не увеличением активности глутаминсинтетазы (рис. 1).

280 -240 -200 160 -120 -80 -40 0

CI 0,4 -О

Т~I-1-1-1-г

0 24 48 72 96 120 144 Время (час)

0,5

- 0,4 0.3

- 0,2 - 0.1

0,0

- 1

L- 0

ЧГ

Рис. 1. Рост (1), фотообразование NH4+ (2), нитрогеназная (3) и глутаминсинтетазная (4) активности мутанта ЕД-12.

Таким образом, степень дерепрессии нитрогеназы и максимально возможная способность изученных мутантных штаммов A. azollae секретировать NH4+ определяются свойствами глутаминсинтетазы, в частности низким соотношением биосинтетической и трансферазной активностей фермента, а реальные скорости выделения NH4+ в разные фазы роста культур зависят от уровня их нитрогеназной активности.

2. Влияние внутриклеточного соотношения C/N на синтез нитрогеназы Anabaena variabilis.

Углерод и азот являются основными биогенными элементами, соотношение которых регулирует метаболизм организмов. Предполагают, что синтез нитрогеназы у ряда хемо- и фотогетеротрофных бактерий зависит от обеспеченности азотом и регулируется соотношением C/N в клетках. Есть данные, что у растущих как в природных, так и в лабораторных условиях цианобактерий соотношение C/N является достаточно постоянной величиной (Ernst et al., 1985; Nagata et al., 1990). В то же время известно, что нитрогеназная активность цианобактерий изменяется весьма значительно во время их роста в периодических условиях. Поэтому, важно было выяснить взаимосвязи между изменениями нитрогеназной активности и соотношением C/N у фотоавтотрофно растущих культур A. variabilis. Проведенные исследования показали, что у фотоавтотрофных периодических культур A. variabilis уровень нитрогеназной активности претерпевал значительные изменения во время роста (рис. 2).

0,2 g IV

Рис. 2. Рост (1) и изменение нитрогеназной активности (2) периодической культуры A. variabilis в условиях азотфиксации

20 40 60 80 100 120 час

0 20 40 60 80 100 120 час

Рис. 3.. Изменение соотношения C/N в клетках A. variabilis при росте в периодической культуре в условиях азотфиксации.

Максимум активности фермента наблюдался на 22-27 час культивирования. Наши данные показали также, что в период возрастания нитрогеназной активности в первые 6-12 часов после инокуляции среды происходило резкое снижение (в два раза) содержания азота в клетках и одновременно увеличивалось С/Ы соотношение, достигающее максимальных значений к 18-20 часам (рис. 3). Низкое содержание азота и повышенное С/Ы-соотношение приводили к индукции синтеза нитрогеназы, максимальная активность которой наблюдалась на 20-30 ч роста культуры. С этого времени начинался и

активный рост A. variabilis за счет азотфиксации. В результате функционирования нитрогеназы происходило быстрое восстановление пула азотсодержащих соединений и уменьшение соотношения C/N (до 5). что, по-видимому, приводило к резкому снижению уровня нитрогеназной активности (в 2 раза к 40 ч роста). При дальнейшем росте внутриклеточное C/N отношение не изменялось (около 5), а активность нитрогеназы медленно уменьшалась. Таким образом, полученные результаты показывают, что соотношение C/N у A. variabilis не является постоянной величиной, а изменяется во время роста культуры. При увеличении соотношения C/N наблюдается повышение нитрогеназной активности, приводящее к увеличению содержания в клетках азота, а уменьшение C/N вызывает снижение нитрогеназной активности культур.

3. Влияние аммония на активность нитрогеназы A. variabilis.

Аммоний ингибирует не только синтез, но и активность нитрогеназы у многих диазотрофных бактерий. Наши исследования показали, что на свету при рН 7 ионы аммония в концентрации до 5 мМ не оказывали ингибирующего влияния на активность нитрогеназы А. variabilis (рис. 3). Однако при рН 8 наблюдалось существенное (до 50%) снижение скорости фотовосстановления С;Н:, а при рН 9-10 фотовосстановление С2Н2 ингибировачось аммоМем почти полностью

(рис. 4).

мин

Рис. 4. Влияние ТЧН/ (5 мМ) на фотообразование С;Н4 (в атмосфере аргона) клетками .-1. \4iriabilis при

различных значениях рН: 6 (1); 7 (2); 8 (3); 9 (4); 10 (5).

Таким образом, подавление активности нитрогеназы аммонием у А. variabilis имеет место не только при рН 10, как было показано ранее, но и при более низких значениях рН (8-9). Зависимость ингибирующего эффекта от pll указывает на то, что на него влияет скорость пассивной диффузии аммиака в клетки. Ингибирование нитрогеназной активности

зависело от концентрации аммония, развивалось медленно и полностью проявлялось лишь через 15-20 минут после его добавления (рис. 4). Исходная скорость образования С2Нд не восстанавливалась через 4-5 часов после добавления >Щ4+. При, снижении интенсивности света ингибирование нитрогеназы ЫН4+ наблюдалось также при нейтральных значениях рН и было практически полным при интенсивности света 0,6-1 Вт/м2 (рис. 5). Ингибирование нитрогеназы аммонием при снижении интенсивности света и в темноте проявлялось лишь в присутствии 02.

0 20 40 60 80 100 120 140

мин

Рис. 5. Влияние NH4+ (5 мМ) на образование С2Н4 клетками А.

variabilis (рН 7; 20% 02) при разной интенсивности света (Вт/м2): 1 -24; 2 - 7; 3 - 2,5; 4 - 1; 5 - 0,6.

Метионинсульфоксимин (0,1-0,35 мМ) - ингибитор глутаминсинтетазы и системы транспорта NH4+ - ослаблял в некоторой степени (20-30%) ингибирующее действие NH4+ на нитрогеназную активность A. variabilis на свету и в темноте, особенно после предварительной инкубации с ним в течение 2-3 ч. Фруктоза (10 мМ) увеличивала на 15-20% скорость восстановления С2Н2 автотрофными клетками A. variabilis на свету и в темноте и уменьшала в такой же степени ингибирующее действие NH4+ на этот процесс. В отличие от фруктозы Н2 (10%) не стимулировал нитрогеназную активность A. variabilis, но уменьшал в 2 раза степень ингибирования ее аммонием на свету (рН 10).

Таким образом, ионы NH4+ подавляют не только синтез нитрогеназы клетками цианобактерий, но и ее активность на свету и в темноте. Это ингибирование обусловлено, по-видимому, уменьшением транспорта органических соединений в гетероцисты в результате ассимиляции NH4+, что вызывает лимитирование нитрогеназы донором электронов. Кроме того, снижение обеспеченности гетероцист органическими соединениями

может приводить к инактивации нитрогеназы кислородом в результате ее модификации (Ernst et al., 1990).

4. Взаимосвязи синтеза нитрогеназы и водородпоглощающей гидрогеназы у A. variabilis. Влияние водорода и органического субстрата.

Нитрогеназа и Н2-поглощающая гидрогеназа образуют тесную функциональную ассоциацию в гетероцистах цианобактерий. Н2-поглощающая гидрогеназа окисляет Н2, образуемый как побочный продукт нитрогеназной реакции. Н2 и органические соединения являются важными факторами регуляции синтеза гидрогеназы у хемо- и фотогетеротрофных бактерий. Известные данные о влиянии органического субстрата и Н2 на активность Н2-поглощающей гидрогеназы у различных цианобактерий чрезвычайно противоречивы. Мы исследовали индукцию Н2-поглощающей и нитрогеназной активностей в клетках A. variabilis, выращенных на среде с 5мМ NH4+ и затем (t=0) перенесенных в среду с 0,5 мМ NH4+ ("shift down"). Эти эксперименты показали, что как и у других изученных гетероцистных цианобактерий NH4+ подавлял дифференцировку гетероцист, синтез нитрогеназы и Н2-поглощающей гидрогеназы у A. variabilis. После исчезновения NH4+ из среды (рис. 6А) культуры начинали дифференцировку гетероцист с одновременной индукцией нитрогеназной и Н2-поглощающей гидрогеназной активностей (рис. 6Б).

Рис. 6.

Индукция нитрогеназной и Н2-поглощающей гидрогеназной активностей в клетках A. variabilis при лимитировании аммонием. (А)

Содержание NH4+ (1) в среде и рост (2). (Б) Активность нитрогеназы (3) и Н2 -поглощающей гидрогеназы (4)

Активности ферментов выражены в мкмоль C2Ri (нитрогеназа) или мкмоль поглощенного Н2 (гидрогеназа) на мг Хл в час.

культивирования

1 I Г 20 40 60 80 100 120 140 160

Обе активности достигали максимальных уровней после 24-30 часов инкубации в безазотистой среде. Примерно в то же время наблюдалась максимальная частота гетероцист (8,5%) в культуре.

Для изучения влияния экзогенного Н2 на индукцию его поглощения неазотфиксирующие клетки A. variabilis, выросшие на среде с 5 мМ NH4+, переносили в среду с 0,5 мМ NH4+ и в период потребления остаточного NH4+ из среды (t=0) культивировали с продуванием смесью воздух + Н2 (93:7). Небольшой стимулирующий эффект Н2 (30-40%) на индукцию Н2-поглощающей активности наблюдался только в первые 2430 часов после его добавления (рис. 7А). Экзогенный Н2 не влиял на развитие нитрогеназной активности (рис. 7Б). Хлорамфеникол (30 мкг ' мл"1) ингибировал индукцию как Н2-поглощающей гидрогеназы, так и нитрогеназы (рис. 7А, Б). Таким образом, экзогенный водород незначительно стимулировал индукцию Н2-поглощающей гидрогеназной активности, что может быть обусловлено тем, что он или не индуцирует синтез Н2-поглощающей гидрогеназы у A. variabilis, или то количество эндогенного Н2, выделяемого нитрогеназой, достаточно для индукции синтеза гидрогеназы. Для выяснения роли Н2 в индукции Н2-поглощающей гидрогеназы необходимо получение мутантов не способных к синтезу нитрогеназы и эндогенному образованию Н2.

«У

о О

I " I * I О 10 20 30 40 50 60 70

Время культивирования, ч

Рис. 7. Влияние экзогенного Н2 на индукцию Н2-

поглощающей гидрогеназы (А: 1, 2, 3) и нитрогеназы (Б: Г, 2', 3') в клетках A. variabilis. В период исчезновения NH4+ из среды (t—0) культуру стерильно делили на три части и инкубировали в разных условиях: воздух (1, Г); воздух:Н2 (93:7; 2, 2'); воздух:Н2 +

хлорамфеникол (30 мкг мл'1). Активности

ферментов выражали как на рис.6.

Добавление органического соединения (10 мМ фруктозы) к культурам, находящимся на ранних стадиях дифференцировки гетероцист, не влияло на индукцию ни Нг-поглощающей гидроГеназной, ни нитрогеназной активности. Аналогичные результаты были получены и при исследовании азотфиксирующих клеток. Во время дальнейшего роста, как Н2-поглощение, так и активность нитрогеназы были выше в фотогетеротрофных культурах, которые проявляли и более высокую частоту гетероцист.

Таким образом, синтез нитрогеназы и Н2-поглощающей гидрогеназы A. variabilis репрессируется аммонием. При лимитировании клеток азотом происходит координированная индукция синтеза обоих ферментов. Ни органические соединения (фруктоза), ни Н2 не оказывают существенного влияния на индукцию Н2-поглощающей гидрогеназы А. variabilis. Отсутствие репрессии ^-поглощающей гидрогеназы органическими соединениями согласуется с высоким внутриклеточным C/N отношением в клетках во время индукции синтеза нитрогеназы и Н;-поглощающей гидрогеназы.

5. Распространение обратимой гидрогеназы у разных

штаммов Anabaena spp. и Nostoc spp.

Гетероцистные цианобактерии могут синтезировать еще одну гидрогеназу, катализирующую как выделение, так и поглощение Н:. -обратимую гидрогеназу. Ранее предполагали, что обратимая гидрогеназа является более универсальной гидрогеназой, так как обнаружена не только у гетероцистных, но и у негетероцистных цианобактерий. Общепринятых представлений о роли обратимой гидрогеназы в метаболизме цианобактерий нет. Наиболее распространенными являются следующие гипотезы: 1) обратимая гидрогеназа необходима для удаления избытка восстановительных эквивалентов, образуемых при фотосинтезе или во время роста в анаэробных условиях; 2) диафоразный димер обратимой гидрогеназы входит в состав дыхательного комплекса I цианобактерий.

Наши данные показали, что среди четырех проверенных гетероцистных цианобактерий штамм Nostoc sp. РСС 73102 не проявлял активность обратимой гидрогеназы при измерении как в клетках (табл. 2) или экстрактах (по выделению Н; из восстановленного метилвиологена), так и в специфическом окрашивании на гидрогеназу после элекгрофореза экстрактов в неденатурирующих условиях (поглощение Н;) (рис. 8). Полосы на электрофореграммах, соответствующие гидрогеназной активности, имели Мм ® 560, 130 и/или 117 кДа.

Таблица 2.

Гидрогеназная активность клеток, измеренная по выделению Н2 из восстановленного дитионитом метилвиологена

Организм Гидрогеназная активность (нмоль H2" ч"1' мкг(Хла)'1)3

A.variabilis 18,5

Nostoc sp. PCC 73102 0

Anabaena sp. PCC 7120 26,2

N. muscorum 6,2

а Среды для выращивания цианобактерий содержали 5 мМ NH4CI, 1 мкМ NiS04 и 10 мМ HEPES буфер (рН 7,5).

Рис. 8. Электрофорез в неденатурирующих условиях и специфическое окрашивание на гидрогеназу частично очищенных экстрактов A. variabilis (Avar), Anabaena sp. PCC 7120 (A7120), N. muscorum CCA? 1453/12 (Nmus) и Nostoc sp. PCC 73102 (N73102), M - белки-маркеры

Данные физиологических экспериментов были подтверждены и молекулярно-генетическими методами. Саузерн-гибридизация ДНК с использованием hox зондов (hoxY и hoxH - структурные гены, кодирующие малую и большую субъединицы обратимой гидрогеназы) показала наличие комплементарных последовательностей к hoxY (не показано) и hoxН (рис. 9а) зондам у Anabaena PCC 7120, A. variabilis, Nostoc muscorum, но не у Nostoc sp. PCC 73102. Контрольная гибридизация ДНК на этой же мембране, но проведенная с hup зондом (,hupL - ген, кодирующий большую субъединицу Н2-поглощающей гидрогеназы), показала наличие комплементарной к hup зонду последовательности у всех четырех исследованных цианобактерий, включая Nostoc sp. PCC 73102 (рис. 96).

Таким образом, как физиологические, так и молекулярно-генетические методы свидетельствуют, что обратимая гидрогеназа не является обязательным ферментом для гетероцистных цианобактерий.

М Avar А7120 Nmus N73102

Avar

N73102

A7120 Nmus

E H E+H E H E+H E H E+H E H E+H

0.56_

Avar N73102 A7120 Nmus Б----

E H E+H E H E+H E H E+H E H E+H

0.56-

Рис. 9. Саузсрн-гибридизация геномной ДНК A. variabilis (Avar), Nostoc sp. PCC 73102 (N73102), Anabaena sp. PCC 7120 (A7120) и N. muscorum (Nmus), расщепленной EcoRl (E), HindlYl (H) или EcoRl и Hindlll (E+H) с зондами (a) Av3 (hoxH) или (6) hup2 (hupL). Положение маркеров длины указано слева.

5. Биосинтез аргинина у Nostoc sp. РСС 73102: Аргининосукцинат-лиаза.

Особое место в метаболизме азота цианобактерий занимает аргинин, который является не только составной частью белков, но и входит в состав уникального для цианобактерий запасного азотсодержащего соединения - цианофицина. Биосинтез аргинина и его регуляция у цианобактерий практически не исследовались. Нами был изучен один из ключевых ферментов синтеза аргинина - аргининосукцинат-лиаза (ACJI) у Nostoc sp. РСС 73102. АСЛ катализирует образование аргинина и фумарата из аргининосукцината. При электрофорезе экстрактов клеток Nostoc sp. РСС 73102 в ПААГ в неденатурирующих условиях с последующим специфическим окрашиванием на активность АСЛ проявлялась одна полоса с Мм «240 кДа. Колориметрическое определение активности АСЛ, основанное на измерении мочевины, образуемой из аргинина в присутствии избытка аргиназы, было использовано в дальнейшем для изучения цианобактериальной АСЛ. Однако, при измерении активности АСЛ данным методом в экстрактах цианобактерий, в отличие от других организмов, необходимо учитывать наличие у них активной уреазы. Действительно, клетки Nostoc sp. РСС 73102 проявляли высокую активность уреазы (3,1-6,6 нмоль мочевины мин"1 (мг белка)"1. Ее активность полностью ингибировалась при инкубировании экстрактов с ацетогидроксамовой кислотой (10 мМ, 15 мин). Поэтому перед измерением активности АСЛ экстракты Nostoc sp. РСС 73102 инкубировали с этим ингибитором. Уровень АСЛ значительно изменялся у культуры в разных фазах роста, (рис. 10). Максимальные активности АСЛ совпадали с проявлением в клетках максимальной нитрогеназной активности.

"I-Г

1 2 3 4 5 Время (дни)

X S 2

с о ю

-о с о 5

Рис. 10. Рост (1) И

активность АСЛ (2) у Nostoc РСС 73102. Рост измеряли по сухому весу (мкг'мл'1).

Культуры М«/ос ер. РСС 73102, выросшие на средах с добавлением аргинина или интермедиатов биосинтеза аргинина (орнитина, цитруллина) не проявляли различий в активности АСЛ по сравнению с клетками, выросшими без добавления аминокислот. Это свидетельствует об отсутствии регуляции синтеза АСЛ путем репрессии. Аргинин, цитруллин и орнитин стимулировали рост Мшос эр. РСС 73102 незначительно (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние аминокислот на рост и активность АСЛ Nostoc sp. РСС 73102

Аминокислота Рост (мг с.в. мл'1) Активность АСЛ (нмоль' мин'1 .(мг белка)'1)

Нет 0,17 2,9

Аргинин 0,24 2,5

Орнитин 0,23 3,0

Цитруллин 0,26 2,3

6. Клонирование и характеристика argН. кодирующего АСЛ. у Nostoc sp. РСС 73102.

Зонд argH для скрининга космидной библиотеки Nostoc sp. РСС 73102 получили с помощью ПЦР. Праймеры для ПЦР конструировали на основе сравнения и выявления консервативных участков в аминокислотных последовательностях АСЛ разных организмов с использованием базы данных EMBL и GenBank. Нуклеотидная последовательность клонированного гена зарегистрирована в банке данных GenBank (No AF 143209). Функция гена Nostoc sp. РСС 73102, как кодирующего аргининосукцинат-лиазу, была подтверждена комплементацией мутации argH у Е. coli. Ген из Nostoc sp. РСС 73102, полученный при помощи ПЦР и специфичных праймеров, фланкирующих кодирующую часть гена с 5'- и 3'- конца, клонировали в экспрессионный вектор pQE30 (Qiagen) под контроль сильного вирусного Т5-промотора индуцируемого изопропил^-О-тиогалактозидом (IPTG). Полученный вектор, содержащий argH Nostoc sp. РСС 73102, способен к трансформации мутантного Е. coli C600AargH штамма и комплементации argH мутации. Трансформированные C600AargH Е. coli росли на минимальной среде М9 без добавления аргинина в присутствии индуктора IPTG. Е. coli C600AargH клетки, трансформированные плазмидой со вставкой argH Nostoc sp. РСС 73102 и индуцированные IPTG, имели удельную активность АСЛ 16,2 нмоль мочевины/ (мин ' мг белка), в то время как клетки, не индуцированные IPTG, проявляли активность АСЛ 6,9 нмоль мочевины/ (мин ' мг белка). Е. coli, содержавшие вектор pQE30 без вставки, не проявляли активность АСЛ. Таким образом, полученные результаты подтверждают, что цианобактериальный белок, синтезируемый с рекомбинантной плазмиды, обладает активностью АСЛ и функционален в клетках Е. coli. Вектор

р(}Е30 несет последовательность нуклеотидов, кодирующую 6 гистидинов к 5' концу области клонирования. Таким образом, синтезируемый рекомбинантный белок имеет на Ы-конце кластер из 6 гистидинов, наличие которого позволило очистить его с помощью афинной хроматографии на №-ЫТА-агарозе. Электрофорез в денатурирующих условиях бесклеточного экстракта из индуцированных с 1РТй клеток, а также фракций, элюированных с колонки с №-ЫТА-агарозой, продемонстрировал наличие одной доминантной полосы с молекулярной массой около 53 кДа (рис. 11).

1 2 3 4 5 6 7 М

ЩФ* 43

30 * 20.1 14.4

Рис. 11Б

Рис. IIA

Рис. 11 (А) Электрофорез в денатурирующих условиях белков лизата Е. coli, трансформированных плазмидой pQE30 с argH Nostoc РСС 73102, на разных этапах очистки. 1 - неиндуцированные клетки; 2 -индуцированные с IPTG; 3 - экстракт индуцированных клеток; 4 -неадсорбированный на Ni-NTA агарозе элюат; 5, 6 и 7 - первая, вторая и третья фракции, элюируемые с колонки 250 мМ имидазольным буфером. (Б) Электрофорез в неденатурирующих условиях. 1 - экстракт индуцированных клеток; 2 — неадсорбированный на Ni-NTA агарозе элюат; 3 - фракция элюируемая с колонки 250 мМ имидазольным буфером. М - маркерные белки.

Идентичность 53 кДА полипептида аргининосукцинат-лиазе была подтверждена определением ^концевой аминокислотной последовательности. Электрофорез в неденатурирующих условиях как экстракта из индуцированных клеток, так и фракции, элюированной с №-NTA-aгapoзы проявил единственную доминантную полосу размером около 215 кДа (рис. 11 Б), что соответствует гомотетрамерному оли гомеру.

Полный размер рамки считывания гена ащН Nostoc ер. РСС 73102 составляет 1386 п.н.. Н Мю/ос эр. РСС 73102 кодирует полипептид из

461 аминокислоты с рассчитанной молекулярной массой 51349 Да. Сравнение предсказанной аминокислотной последовательности ArgH Nostoc sp. РСС 73102 с аналогичными белками других организмов в базе данных SWISS-PROT с использованием программы BLASTX показало, что максимальной гомологией с ArgH Nostoc sp. РСС 73102 обладает предполагаемый ArgH филогенетически наиболее близкого организма Synechocystis sp. РСС 6803 - 78% по идентичности и 86% по сходству класса аминокислот. ArgH Nostoc sp. РСС 73102 проявляет высокую степень сходства с ArgH многих других организмов, как прокариот, так и эукариот (40-50% идентичности и 60-65% сходства). Предсказанная аминокислотная последовательность ArgH Nostoc sp. РСС 73102 проявляет также 20-25% идентичности и около 40% сходства с другими ферментами семейства фумаразы, такими как, фумараза класс II, аспартаза, аденилосукцинат-лиаза, 3-карбокси-цис,цис-муконат циклоизомераза, 811 кристаллин. Все ферменты суперсемейства фумаразы, к которому принадлежит и ACJI, являются гомотетрамерами с Мм «200 кДа и катализируют образование фумарата в результате реакции Р-элиминирования, включающей расщепление Са - N или Са - О связи. ArgH Nostoc sp. РСС 73102, как и все ферменты семейства фумаразы, содержит специфичную для этого класса ферментов консервативную последовательность G-S-x-x-M-x-x-K-x-N.

Саузерн гибридизация геномной ДНК Nostoc sp. РСС73102 с зондами на argV, argB, argU и arg] гены показала, что исследованные arg гены расположены в разных местах генома Nostoc sp. РСС73102.

ВЫВОДЫ

1. Рост, степень дерепрессии нитрогеназы и способность изученных мутантных штаммов A. azollae к выделению NHt+ определяются соотношением биосинтетической и трансферазной активностей глутаминсинтетазы, а реальные скорости выделения NH4+ клетками растущих культур зависят от уровня их нитрогеназной активности.

2. Показано, что синтез нитрогеназы у фотоавтотрофных культур А. variabilis определяется внутриклеточным отношением C/N. Ионы аммония подавляют не только синтез нитрогеназы у цианобактерий, но и ингибируют активность фермента при физиологических значениях рН на свету и в темноте.

3. Синтез нитрогеназы и Н2-поглощающей гидрогеназы у A. variabilis происходит координирование. Органические соединения не репрессируют синтез Н2-поглощающей гидрогеназы A. variabilis. Наличие обратимой гидрогеназы не является обязательным для гетероцистных цианобактерий.

4. Доказано наличие активной аргининосукцинат-лиазы в клетках Nostoc sp. РСС 73102. Установлено, что ее синтез не репрессируется аргинином.

5. Клонирован и. охарактеризован argH, кодирующий аргининосукцинат-лиазу Nostoc sp. РСС 73102. Получена сверхпродукция рекомбинантной ACJI Nostoc sp. РСС 73102 в клетках Е. coli.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Трошина О.Ю., Якунин А.Ф., Гоготов И.Н. (1992) Рост и активность ферментов азотного метаболизма у свободноживущих культур Anabaena azollae и ее мутантов, устойчивых к этилендиамину. Микробиология, Т. 61, N. 2, стр. 1004-1010.

2. Якунин А.Ф., Трошина О.Ю., Дха М., Гоготов И.Н. (1992) Влияние аммония на нитрогеназную активность гетероцистной цианобактерии Anabaena variabilis. Микробиология, Т. 61, N. 3, стр. 377-383.

3. Якунин А.Ф., Трошина О.Ю., Гоготов И.Н.(1995) Взаимосвязь между синтезом нитрогеназы и соотношением C/N у азотфиксирующей цианобактерии Anabaena variabilis. Микробиология, Т. 64, N. 1, стр. 10-12.

4. Troshina O.Yu., Serebryakova L.T., Lindblad P. (1996) Induction of H2-uptake and nitrogenase activities in the cyanobacterium Anabaena variabilis ATCC 29413: Effects of hydrogen and organic substrate. Current Microbiology, V. 33, pp. 11-15.

5. Tamagnini P., Troshina O., Oxelfelt F., Salema R., Lindblad P. (1997) Hydrogenases in Nostoc sp. strain PCC 73102, a strain lacking a bidirectional enzyme. Applied and Environmental Microbiology, V. 63, N. 5, pp. 1801-1807.

6. Troshina O., Jansson E., Lindblad P. (1997) Ornithine cycle in Nostoc PCC 73102: presence of an in vitro functional argininosuccinate lyase. FEMS Microbiology Letters, V. 152, pp. 75-81.

7. Lindblad P., Hansel A., Oxelfelt F„ Tamagnini P., Troshina O. (1998) Nostoc PCC 73102 and H2. Knowledge, Research, and biotechnological Challenges. BioHydrogen, ed. by Zaborsky et ah, Plenum Press, New York, pp. 53-63.

8. Troshina O., Hansel A., Lindblad P. Cloning and characterization argH, a structural gene encoding argininosuccinate lyase, in the heterocystous cyanobacterium Nostoc sp. PCC 73102. XI Nordic nitrogen fixation conference. (Stockholm, 27-29 January, 2000). Abstracts, p. 47.

Гпнсок сокращений:

'-ГГК у-глутамилгидроксамовая кислота

ЧСЛ аргининосукцинат-лиаза

"С глутаминсинтетаза

ИВ метилвиологен

1ААГ полиакриламидный гель

1ЦР полимераз^ая цепная реакция

^¡-Г^ТА М-нитрш^гриуксусная кислота

РТО изопропил-р-О-тиогалактозид

Им молекулярная масса

Научное издание Автореферат О.Ю.Троцпшой

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции СЖ-005-93, том 2; 953000 - книги и брошюры

19.10.2000 г. Заказ 8907Р. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,25.

Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации Путинского научного центра РАН

142290 г.Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Трошина, Ольга Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ 4 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Общая характеристика цианобактерий

Глава 2. Ферменты, участвующие в метаболизме азота у цианобактерий

2.1. Нитрогеназы и их распространение среди цианобактерий

2.1.1. Состав, структура нитрогеназы и «г/гены

2.1.2. Источники АТФ и восстановителя

2.1.3. Регуляция синтеза и активности

2.2. Ферменты, участвующие в ассимиляции аммония, и их регуляция

2.3. Метаболизм аргинина у цианобактерий

Глава 3. Свойства и функции гидрогеназ цианобактерий

3.1. Нг-поглощающая гидрогеназа и ее распространение у цианобактерий

3.1.1. Биохимические свойства

3.1.2. Физиологические функции

3.1.3. Регуляция синтеза

3.1.4. Взаимосвязь Нг-поглощающей гидрогеназы и нитрогеназы

3.2. Обратимая гидрогеназа 27 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Объекты и методы исследования

4.1. Объекты исследования и условия культивирования

4.2. Определение активности ферментов

4.2.1. Активность нитрогеназы

4.2.2. Активность обратимой гидрогеназы

4.2.3. Активность Нг-поглощающей гидрогеназы

4.2.4. Активность глутаминсинтетазы

4.2.5. Активность аргининосукцинат-лиазы

4.2.6. Активность уреазы

4.3. Электрофорез

4.4. Другие определения

4.5. Молекулярные методы

4.5.1. Выделение ДНК и электрофорез

4.5.2. Гидролиз ДНК рестрикционными эндонуклеазами, дефосфорилирование и лигирование в вектор

4.5.3. Создание праймеров, полимеразная цепная реакция и мечение зондов

4.5.4. Секвенирование ДНК

4.5.5. Саузерн гибридизация

4.5.6. Удаление ДНК-зондов с мембран

4.5.7. Получение компетентных клеток Е. coli 39 *

4.5.8. Трансформация компетентных клеток

4.5.9. Скрининг космидной библиотеки Nostoc sp. РСС

4.6. Гетерологичная экспрессия argH Nostoc sp. РСС 73102 и очистка рекомбинантной аргининосукцинат-лиазы

4.7. Определение N-концевой аминокислотной последовательности

4.8. Точность и воспроизводимость измерений 43 РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 5. Регуляция азотфиксации гетероцистных цианобактерий

5.1. Рост и активность ферментов азотного метаболизма у дерепрессированных по нитрогеназе мутантов цианобактерии A. azollae

5.2. Фотообразование аммония мутантами A. azollae

5.3. Влияние соотношения C/N на синтез нитрогеназы у A. variabilis

5.4. Влияние аммония на активность нитрогеназы A. variabilis

Глава 6. Метаболизм водорода у гетероцистных цианобактерий

6.1. Взаимосвязи синтеза нитрогеназы и водородпоглощающей гидрогеназы 54 у A. variabilis. Влияние водорода и органического субстрата

6.2. Распространение обратимой гидрогеназы у разных штаммов р. АпаЬаепа Брр. 57 и Мэ^ос эрр.

Глава 7. Биосинтез аргинина у Мю/ос ер. РСС 73102: Аргининосукцинат-лиаза

7.1. Демонстрация активности аргининосукцинат-лиазы у Nostoc sp. РСС

7.2. Клонирование и функциональная экспрессия argH Nostoc sp. РСС 73102 65 в Escherichia coli

7.3. Организация arg генов у Nostoc sp. РСС73102 69 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 71 ВЫВОДЫ 83 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Мм - относительная молекулярная масса км - константа Михаэлиса

К| - константа ингибирования

- додецилсульфат натрия

МВ - метилвиологен

НАД(Ф) - никотинамидадениндинуклеотид (фосфат)

ПААГ - полиакриламидный гель

Трис-НС1 - трис (гидроксиметил) аминометан хлорид

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭТЦ - электронтранспортная цепь

ФС - фотосистема

Еь - окислительно-восстановительный потенциал

- никель-нитрилотриуксусная кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

АСЛ - аргининосукцинат-лиаза

ГС - глутаминсинтетаза

ГОГАТ - глутаматсинтаза гдг - глутаматдегидрогеназа

АДГ - аланиндегидрогеназа

7-ГГК - у-глутамилгидроксамовая кислота

ФМС - феназинметосульфат

1РТС - изопропил-р-Б-тиогалактозид

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболизм азота и водорода у гетероцистных цианобактерий"

Актуальность проблемы. Гетероцистные цианобактерии - многоклеточные цианобактерии, способные к дифференцировке специализированных клеток - гетероцист, в которых осуществляется азотфиксация. Уникальный метаболизм этих бактерий характеризуется способностью осуществлять в одном организме два фундаментальных процесса - оксигенный фотосинтез и фиксацию азота, крайне чувствительную к Ог-Цианобактерии широко используются как модельные объекты при исследовании фотосинтеза, азотфиксации, онтогенетической дифференциации и других биологически важных процессов. Благодаря простоте условий культивирования и высокой продуктивности эти микроорганизмы находят широкое практическое применение как источники белков, полисахаридов, связанного азота, органических и физиологически активных соединений. Цианобактерии рассматриваются также как перспективные продуценты аммиака и молекулярного водорода - топлива будущего. Оба процесса -азотфиксации и образования Нг - происходят в гетероцистах при участии нитрогеназы за счет световой энергии. Однако в естественных условиях роста цианобактерии почти не образуют или образуют мало Нг, что обусловлено функционированием в гетероцистах активной Нг-поглощающей гидрогеназы.

Многие цианобактерии синтезируют уникальное запасное азотсодержащее вещество - цианофицин, представляющий собой полимер аргинина и аспартата. Недавно показано, что мутант-ауксотроф цианобактерии N03¡ос еШрзоярогит по аргинину не образует цианофицин, не проявляет дифференцировку гетероцист и, соответственно, азотфиксацию (Ъе§апез ег а1., 1998). Это подтверждает важную роль аргинина в азотном метаболизме цианобактерий. Однако его биосинтез у цианобактерий практически не исследовался.

Практическому использованию цианобактерий как продуцентов аммиака и Нг препятствует слабая изученность ферментных систем метаболизма азота и водорода и их регуляции у этих микроорганизмов. Исходя из вышеизложенного и были сформулированы следующие цели и задачи данной работы.

Глутамат

Рис. 1. Этапы ассимиляции азота и метаболизма Н2, исследуемые в данной работе (выделены красным и синим цветом).

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

1. Выяснить факторы, влияющие на скорость фотообразования аммония у дикого штамма Anabaena azollae и у его мутантов с дерепрессированным синтезом нитрогеназы.

2. Изучить взаимосвязь между синтезом нитрогеназы и внутриклеточным соотношением C/N, а также особенности регуляции активности нитрогеназы ионами аммония у цианобактерии Anabaena variabilis.

4. Показать наличие аргининосукцинат-лиазы (ACJI) в клетках цианобактерии Nostoc sp. РСС 73102, исследовать регуляцию синтеза АСЛ, клонировать и охарактеризовать argH, кодирующий АСЛ Nostoc sp. РСС 73102.

Новизна работы. Установлено, что мутанты A. azollae с дерепрессированным синтезом нитрогеназы способны к фотообразованию аммония со скоростью, определяемой активностью нитрогеназы и глутаминсинтетазы. Впервые показано, что у фотоавтотрофно растущих культур A. variabilis снижение содержания азота в клетках (увеличение отношения C/N) приводит к индукции синтеза нитрогеназы. Выяснено, что ингибирование нитрогеназной активности аммонием у цианобактерий обусловлено снижением транспорта органических соединений в гетероцисты вследствие ассимиляции аммония. Установлено, что синтез нитрогеназы и Нг-поглощающей гидрогеназы у A. variabilis происходит координирование, причем синтез последней не репрессируется органическими соединениями. Наличие обратимой гидрогеназы не является обязательным для гетероцистных цианобактерий. Показано наличие активной аргининосукцинат-лиазы в клетках Nostoc sp. РСС 73102 и установлено, что ее синтез не репрессируется аргинином. Впервые клонирован и охарактеризован цианобактериальный argW, кодирующий аргининосукцинат-лиазу, и получена его функциональная экспрессия в клетках Escherichia coli.

Научная и практическая значимость работы. Полученные в работе данные расширяют имеющиеся представления о метаболизме азота и водорода у гетероцистных цианобактерий и могут служить научной основой для создания разнообразных штаммов-продуцентов, в частности Нг и NH3. Совокупность полученных данных о фотообразовании NH3 мутантами А. azollae позволяет рекомендовать их для использования в качестве биоудобрения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VII Международном симпозиуме по фотосинтезирующим прокариотам (США, Amherst, 1991), на VIII симпозиуме стран восточной Европы по биологической азотфиксации (Саратов, 1992); на всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), на X международном конгрессе по азотфиксации (Санкт-Петербург, 1995), на V международной конференции по молекулярной биологии гидрогеназ (Франция, Albertville, 1997), на международной конференции по биологическому образованию Нг (США, Hawaii, 1997), на XI конференции северных стран по азотфиксации (Швеция, Стокгольм, 2000).

Публикации. По материалам диссертации представлено в печати 8 публикаций.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает 100 страниц, содержит 23 рисунка и 8 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Трошина, Ольга Юрьевна

выводы

1. Рост, степень дерепрессии нитрогеназы и способность изученных мутантных штаммов A. azollae к выделению NH4" определяются соотношением биосинтетической и трансферазной активностей глутаминсинтетазы, а реальные скорости выделения NH4+ клетками растущих культур зависят от уровня их нитрогеназной активности.

2. Показано, что синтез нитрогеназы у фотоавтотрофных культур A. variabilis определяется внутриклеточным отношением C/N. Ионы аммония подавляют не только синтез нитрогеназы у цианобактерий, но и ингибируют активность фермента при физиологических значениях pH на свету и в темноте.

3. Синтез нитрогеназы и Нг-поглощающей гидрогеназы у A. variabilis происходит координированно. Органические соединения не репрессируют синтез Нг-поглощающей гидрогеназы A. variabilis. Наличие обратимой гидрогеназы не является обязательным для гетероцистных цианобактерий.

5. Клонирован и охарактеризован argH, кодирующий аргининосукцинат-лиазу Nostoc sp. РСС 73102. Получена сверхпродукция рекомбинантной АС Л Nostoc sp. РСС 73102 в клетках Е. coli.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Трошина, Ольга Юрьевна, Пущино

1. Громов Б.В. Включения. // Функциональная структура цианобактерий. Ред. Громов Б.В. Л: ЛГУ, 1986, С.108.

2. Климова В.А. Основные микрометоды анализа органических соединений. // М: Химия, 1975,223С.

3. Кодратьева Е.Н., Гоготов И.Н. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов. //М: Наука. 1981. 343С.

4. Серебрякова Л.Т., Зорин Н.А., Гоготов И.Н. Гидрогеназная активность нитчатых цианобактерий. Микробиология, 1992,61,175-182.

5. Серебрякова Л.Т., Трошина О.Ю., Гоготов И.Н. Очистка и формы обратимой гидрогеназы Anabaena variabilis АТСС 29413. Биохимия, 1995, 60, 508-514.

6. Серебрякова Л.Т., Шереметьева М, Линдблад П. Гидрогеназная активность одноклеточной цианобактерии Gloeocapsa alpicola CALU 743 при лимитировании азотом. Микробиология, 1999,68; 249-253.

7. Цыганков А.А., Васильева Л.Г., Зорин Н.А., Гоготов И.Н. Индукция синтеза гидрогеназы молекулярным водородом у Rhodobacter sphaeroides. Микробиология, 1989, 58, 544548.

8. Чан Ван Ни, Якунин А.Ф., Гоготов И.Н. Способность свободноживущей цианобактерии Anabaena azollae к синтезу альтернативных нитрогеназ- Докл. Акад. Наук, 1989, 309, 1480-1482.

9. Якунин А.Ф., Чан Ван Ни, Гоготов И.Н. Образование альтернативных нитрогеназ у гетероцистной цианобактерии Anabaena variabilis. Докл. Акад. Наук, 1989, 307, 12691271.

10. Якунин А.Ф., Трошина О.Ю., Гоготов И.Н. Свойства и регуляция синтеза флаводоксина азотфиксирующей гетероцистной цианобактерией Anabaena sphaerica. Микробиология, 1993,62,83-89.

11. Appel J., Schulz R. Hydrogen metabolism in organisms with oxygenic photosynthesis: hydrogenases as important regulatory devices for a proper redox poising? J. Photochem. Photobiol., 1998, 47, 1-11.

12. Appel J., Phunpruch S., Steinmiiller K., Schullz R. The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis. Arch. Microbiol., 2000,173, 333-338.

13. Albracht S.PJ. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim. Biophys. Acta, 1994,167-204.

14. Archibald R.M. Colorimetric determination of urea. J. Biol. Chem., 1945,157, 507-518.

15. Axelsson R., Oxelfelt F., Lindblad P. Transcriptional regulation of Nostoc uptake hydrogenase. FEMS Microbiol. Lett., 1999,170,77-81.

16. Auchincloss, A.H., Loroch, A.I., Rochaix, J.-D. The argininosuccinate lyase gene of Chlamydomonas reinhardtii: cloning of the cDNA and its characterization as a selectable shuttle marker. Mol. Gen. Genet., 1999, 261,21-30.

17. Bagchi S.N., Ernst A., Boger P. The effect of activated oxygen species on nitrogenase of Anabaena variabilis. Z. Naturforschi., 1991,46c, 407-415.

18. Bauer C., Scappino L., Haselkorn R. Growth of the cyanobacterium Anabaena on molecular nitrogen: NifJ is required when iron is limited. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 88128816.

19. Batt T., Brown D.H. The influence of inorganic nitrogen supply on amination and related reactions in the blue-green alga, Anabaena cylindrica Lemm. Planta, 1974, 29, 339-342.

20. Benemann J.R., Weare N.M. Nitrogen fixation by Anabaena cylindrica. III. hydrogen-supported nitrogenase activity. Arch. Microbiol., 1974, 101, 404-408.

21. Bergman B., Gallon J.R., Rai A.N., Stal L.J. N2 fixation by non-heterocystous cyanobacteria. -FEMS Microbiol. Rev., 1997,19,139-185.

22. Bergman B., Lindblad P., Rai A.N. Nitrogenase in free-living and symbiotic cyanobacteria: immunoelectron microscopic localization. FEMS Microbiol. Lett., 1986, 35, 75-78.

23. Bishop P.E., Joerger R.D. Genetics and molecular biology of alternative nitrogen fixation systems. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1990,41,109-125.

24. Black L.K., Fu C., Maier RJ. Sequence and characterization of hupU and hupV genes of Bradyrhizobium japonicum encoding a possible nickel-sensing complex involved in hydrogenase expression. J. Bacteriol., 1994,176, 7102-7106.

25. Böhme H., Haselkorn R. Molecular cloning and nucleotide sequence analysis of the gene coding for heterocyst ferredoxin from the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. -Mol. Gen. Genet., 1988, 214, 278-285.

26. Boison G., Bothe H., Schmitz O. Transcriptional analysis of hydrogenase genes in the cyanobacteria Anacystis nidulans and Anabaena variabilis monitored by RT-PCR. Curr. Microbiol., 2000, 40, 315-321.

27. Boison G., Schmitz O., Mikheeva L., Shestakov S., Bothe H. Cloning, molecular analysis and insertional mutagenesis of the bidirectional hydrogenase genes from the cyanobacterium Anacystis nidulans. FEBS Lett., 1996, 394,153-158.

28. Bothe H., Tennigkeit J., Eisbrenner G. The utilization of molecular hydrogen by the blue-green alga Anacystis nidulans. Arch. Microbiol., 1977,114, 43-49.

29. Bottomley P.J., Grillo J.F., Van Baalen G., Tabita F.R. Synthesis of nitrogenase and heterocysts by Anabaena sp. CA in presence of high levels of ammonia. J. Bacterid., 1979, 140, 938-943.

30. Bradley R.L., Reddy K.J. Cloning, sequencing, and regulation of the global nitrogen regulator gene ntcA in the unicellular diazotrophic cyanobacterium Cyanothece sp. strain BH68K. J. Bacterid., 1997, 179, 4407-4410.

31. Brass S., Ernst A., Boger P. Induction and modification of dinitrogenase reductase in the unicellular cyanobacterium Synechocystis BO 8402. Arch. Microbiol., 1992,158, 422-428.

32. Brusca J.S., Hale M.A., Carrasco C.D., Golden J.W. Expression of the Anabaena sp. strain PCC 7120 xisA gene from a heterologous promoter results in excision of the nif D element. J. Bacteriol., 1990, 172, 3925-3931.

33. Bühler T., Monter U., Sann R., Kuhla Y., Dingler C., Oelze Y. Control of respiration and growth yield in ammonium-assimilating cultures of Azotobacter vinelandii. Arch. Microbiol., 1987,148,242-246.

34. Carrasco C.D., Buettner J.A., Golden J.W. Programmed DNA rearrangment of a cyanobacterial hupL gene in heterocysts. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995,92, 791-795.

35. Carrasco C.D., Ramaswamy K.S., Ramasubramanian T.S., Golden J.W. Anabaena-xisF gene encodes a developmentally regulated site-specific recombinase. Genes Develop., 1994, 8, 7483.

36. Castenholz R.W. Culturing methods for cyanobacteria. Methods enzymology, 1988, 167, 6983.

37. Chakraborty, A.R., Davidson, A. and Lynne Howell, P. (1999) Mutational analysis of amino acid residues involved in argininosuccinate lyase activity in duck 8 II crystallin. Biochemistry 38, 2435-2443.

38. Chavez S., Candau P. An NAD-specific glutamate dehydrogenase from cyanobacteria. Identification and properties. FEBS Lett., 1991, 285, 35-38.

39. Chavez S., Reyes J.C., Chauvat F., Florencio F.J., Candau P. The NADP-glutamate dehydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis 6803: cloning, transcriptional analysis and disruption of the gdhA gene. Plant Mol. Biol., 1995, 28, 173-188.

40. Chen C., Van Baalen C., Tabita F.R. DL-7-azatryptophan and citrulline metabolism in the cyanobacterium Anabaena sp. strain IF. J. Bacteriol., 1987, 169,1114-1119.

41. Chow T-J., Tabita R. Reciprocal light-dark transcriptional control of nif and rbc expression and light-dependent posttranslational control of nitrogenase, activity in Synechococcus sp. strain RF-1. J. Bacteriol., 1994,176, 6281-6285.

42. Cohen-Kupiec R., Gurevitz M., Zilberstein A. Expression of glnh in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942 is initiated from a single «//-like promoter under various nitrogen conditions. J. Bacteriol., 1993, 175, 7727-7731.

43. Cunin R., Glandsdorff N., Pierard A., Stalon V. Biosynthesis and metabolism of arginine in bacteria. Microbiol. Rev., 1986, 50, 314-352.

44. Daday A., Mackerras H., Smith G.D. The effect of nickel on hydrogen metabolism and nitrogen fixation in the cyanobacterium Anabaena cylindrica. J. Gen. Microbiol., 1985,131,231-238.

45. Dean D.R., Bolin J.T., Zheng L. Nitrogenase metalloclusters: structures, organization, and synthesis. J. Bacteriol., 1993,175, 6737-6744.

46. Dean D.R., Jacobson M.R. Biochemical genetics of nitrogenase.- In: Biological Nitrogen Fixation. Eds. Stacey G., Burns R.H., Evans H.J., 1992, 763-834, Chapman & Hall, New York.

47. Doyle C.M., Arp D.J. Regulation of H2 oxidation activity and hydrogenase protein levels by H2, O2, and carbon substrates in Alcaligenes latus. J. Bacteriol., 1987, 169, 4463-4468.

48. Eisbrenner G., Bothe H. Modes of electron transfer from molecular hydrogen in Anabaena cylindrica. Arch. Microbiol., 1979, 123, 37-45.

49. Elhai J., Wölk P. Developmental regulation and spatial pattern of expression of the structural genes for nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena. EMBO J., 1990, 9, 3379-3388.

50. Elmorjani K., Liotenberg S., Houmard J., Tandeau de Marsac N. Molecular characterization of the gene encoding glutamine synthetase in the cyanobacterium Calothrix sp. PCC 7601. -Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 189, 1296-1302.

51. Elsen S., Colbeau A., Chabert J., Vignais P.M. The hupTUV operon is involved in negative control of hydrogenase synthesis in Rhodobacter capsulatus. J. Bacteriol., 1996, 178, 51745181.

52. Ernst A., Böger P. Glycogen accumulation and the induction of nitrogenase activity in the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena variabilis. J. Gen. Microbiol., 1985, 131, 3147-3153.

53. Ernst A., Black T., Cai Y., Panoff J-M., Tiwari D.N., Wölk C.P. Synthesis of nitrogenase in mutants of the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120 affected in heterocyst development or metabolism. J. Bacteriol., 1992, 174, 6025-6032.

54. Ernst A., Reich S., Böger P. Modification of dinitrogenase reductase in the cyanobacterium Anabaena variabilis due to C starvation and ammonia. J. Bacteriol., 1990, 172, 748-755.

55. Farnden K.J.F., Robertson J.G. Methods for studying enzymes involved in metabolism related to nitrogenase. -In: Methods for evaluating biological nitrogen fixation, Ed. Bergersen F.J.,1980, p.265-314, N.Y. etc. A Wiley Intersci. Publ.

56. Fay P. Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev., 1992, 56, 340373.

57. Fisher R., Tuli R., Haselkorn R. A cloned cyanobacterial gene for glutamine synthetase functions in Escherichia coli, but the enzyme is not adenylylated. Proc. Natl. Acad. Sei. USA,1981, 78, 3393-3397.

58. Florencio F.J., Marques S., Candau P. Identification and characterization of glutamate dehydrogenase in the unicellular cyanobacterium Synechocystis PCC 6803. FEBS Lett., 1987, 223,37-41.

59. Flores E., Herrero A. Assimilatory nitrogen metabolism and its regulation.- In: The molecular biology of cyanobacteria, Ed. Bryant D.A., 1994, 487-517, Kluwer Academic Publishers.

60. Floriano B., Herrero A., Flores E. Isolation of arginine auxotrophs, cloning by mutant complementation, and sequence analysis of the argC gene from the cyanobacterium Anabaena sp. 7120. Mol. Microbiol., 1992, 6, 2085-2094.

61. Floriano B., Herrero A., Flores E. Analysis of expression of the argC and argD genes in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol., 1994, 176, 6397-6401.

62. Forchhammer K., Tandeu de Marsac N. Functional analysis of the phosphoprotein Pn (glriB gene product) in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. J. Bacteriol., 1995, 177, 2033-2040.

63. Forchhammer K., Tandeu de Marsac N. The Pn protein in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942 is modified by serine phosphorylation and signals the cellular N-status. J. Bacteriol., 1994, 176, 84-91.

64. Frias J.E., Merida A., Herrero A., Martin-nieto J., Flores E. General distribution of the nitrogen control gene ntcA in cyanobacteria. J. Bacteriol., 1993, 175, 5710-5713.

65. Frias J.E., Flores E, Herrero A. Nitrate assimilation gene cluster from the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol., 1997, 179, 477-486.

66. Garrard L.J., Que Thi Ngoc Bui, Nygaard R., Raushel F.M. Acid-base catalysis in the argininosuccinate lyase reaction. J. Biol. Chem.,1985, 260, 5548-5553.

67. Georgiadis M M., Komiya H., Chakrabarti P., Woo D., Kornuc J.J., Rees D.C. Crystallographic structure of the nitrogenase iron protein from Azotobacter vineladii. Science, 1992, 257, 16531659.

68. Golden J.W., Carrasco C D., Mulligan M.E., Schneider G.J., Haselkorn R. Deletion of a 55-kilobase-pair DNA element from the chromosome during heterocyst differentiation of Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol., 1988, 170, 5034-5041.

69. Golden J.W., Robinson S.J., Haselkorn R. Rearrangement of nitrogen fixation genes during heterocyst differentiation in the cyanobacterium Anabaena. Nature, 1985, 314, 419-423.

70. Golden J.W., Whorff L.L., Wiest D.R. Independent regulation of nifHDK operon transcription and DNA rearrangement during heterocyst differentiation in the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol, 1991, 173, 7098-7105.

71. Golden J.W., Wiest D.R. Genome rearrangement and nitrogen fixation in Anabaena blocked by inactivation ofxisAgene. Science, 1988,242, 1421-1423.

72. Gupta M., Carr N.G. Enzymology of arginine metabolism in heterocyst-forming cyanobacteria. FEMS Microbiol. Lett., 1981, 12, 179-181.

73. Gupta M., Carr N.G. Enzyme activities related to cyanophycin metabolism in heterocysts and vegetative cells of Anabaena spp. J. Gen. Microbiol., 1981, 125, 17-23.

74. Haas D., Holloway B.W. The genetic organization of arginine biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.-Mol. Gen. Genet., 1977,154, 7-22.

75. Hallenbeck P.C., Benemann J.R. Characterization and partial purification of the reversible hydrogenase of Anabaena cylindrica. -FEBS Lett., 1978, 94, 261-264.

76. Haselkorn R. Organization of the genes for nitrogen fixation in phototrophic bacteria and cyanobacteria. Ann. Rev. Microbiol., 1986, 15, 29-33.

77. Helber J.T., Johnson T.R., Yarbrough L.R., Hirschberg R. Effect of nitrogenous compounds on nitrogenase gene expression in anaerobic cultures of Anabaena variabilis. -J. Bacterid., 1988, 170, 558-563.

78. Hillmer P., Gest H. H2 metabolism in the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas capsulata: H2 production by growing cultures. J. Bacteriol., 1977, 129, 724-731.

79. Hindle Z., Callis R., Dowden S., Rudd B.A.M., Baumberg S. Cloning and expression in Escherichia coli of a Streptomyces coelicolor A3 (2) argCJB gene cluster. Microbiology, 1994,140,311-320.

80. Hoare D.S., Hoare S.L. Feedback regulation of arginine biosynthesis in blue-green algae and photosynthetic bacteria. J. Bacteriol., 1966, 92, 375-379.

81. Hood W., Carr N.G. Apparent lack of control by repression of arginine metabolism in blue-green algae. J. Bacteriol., 1971, 107, 365-367.

82. Hood W., Leaver A.G., Carr N.G. Extracellular nitrogen and the control of arginine biosynthesis in Anabaena variabilis. Biochem. J., 1969, 114, 12-13P.

83. Hoover T.R., Ludden P.W. Derepression of nitrogenase by addition of malate to cultures of Rhodospirillum rubrum grown with glutamate as the carbon and nitrogen source. J. Bacteriol., 1984, 159, 400-403.

84. Houchins J.P., Hind G. Pyridine nucleotides and H2 as electron donors to the respiratory and photosynthetic electron transfer chains and to nitrogenase in Anabaena heterocysts. Biochim. Biophys. Acta, 1982, 682, 86-96.

85. Houchins J.P. The physiology and biochemistry of hydrogen metabolism in cyanobacteria. -Biochim. Biophys. Acta., 1984, 768, 227-255.

86. Houchins J.P., Burris R.H. Occurrence and localization of two distinct hydrogenases in the heterocystous cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. J. Bacteriol., 1981, 146, 209214.

87. Houchins J.P., Burris R.H. Comparative characterization of two distinct hydrogenases from Anabaena sp. strain PCC 7120,1981,146,215-221.

88. Howarth D.C., Codd G.A. The uptake and production of molecular hydrogen by unicellular cyanobacteria. J. Gen. Microbiol., 1985,131,1561-1569.

89. Huang T.-C., Lin R.-F., Chu M.-K., Chen H.M. Organization and expression of nitrogen fixation genes in the aerobic nitrogen-fixing unicellular cyanobacterium Synechococcus sp. strain RF-1. Microbiology, 1999,145, 743-753.

90. Huang T.-C., Grobbelaar N. The circadian clock in the prokaryote Synechococcus sp. strain RF-1.- Microbiology, 1995,141,535-540.

91. Jansson E., Lindblad P. Cloning and molecular characterization of a presumptive argF, a structural gene encoding ornithine carbamoyl transferase (OCT), in the cyanobacterium Nostoc sp. PCC 73102. Physiol. Plantarum, 1998, 103, 347-353.

92. Jansson E., Martel A., Lindblad P. Ornithine cycle in Nostoc sp. PCC 73102: stimulation of in vitro ornithine carbamoyl transferase activity by addition of arginine. Curr. Microbiol., 1993, 26,75-78.

93. Jensen B.B., Cox R.P., Burris R.H. Isolation of cyanobacterial heterocysts with high and sustained dinitrogen-fixation capacity supported by endogenous reductants. Arch. Microbiol., 1986,145,241-247.

94. Juttner F. 14C-labeled metabolites in heterocysts and vegetative cells of Anabaena cylindrica filaments and their presumptive function as transport vehicles of organic carbon and nitrogen. -J. Bacteriol., 1983,155, 628-623.

95. Kentemich T., Danneberg G., Hundeshagen B., Bothe H. Evidence for the occurrence of the alternative, vanadium-containing nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis. -FEMS Microbiol. Lett., 1988, 51,19-24.

96. Kentemich T., Haverkamp G., Bothe H. The expression of a third nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis. Z. Naturforsch., 1991,46c, 217-222.

97. Kim J., Rees D.C. Nitrogenase and biological nitrogen fixation. Biochemistry, 1994, 33, 387" 397.

98. Kim J., Rees D.C. Crystallographic structure and functional implications of the nitrogenase molybdenum-iron protein from Azotobacter vinelandii. Nature, 1992, 360, 553-560.

99. Kleihues L., Lenz O., Bernhard M., Buhrke T., Friedrich B. The H2 sensor of Ralstonia eutropha is a member of the subclass of regulatory NiFe. hydrogenases. J. Bacterio!., 2000, 182, 2716-2724.

100. Kuchel P.W., Nichol L.W., Jeffrey P.D. Physicochemical and kinetic properties of beef liver argininosuccinase. Studies in the presence and absence of arginase. Biochem Biophys. Acta, 1975, 397, 478-488.

101. Kumar A.P., Perraju B.T.V.V., Singh H.N. Carbon nutrition and regulation of uptake hydrogenase activity in free-living and symbiotic Ancibaena cycadeae. New Phytol., 1986, 104, 115-120.

102. Lambert G.R., Smith G.D. The hydrogen metabolism of cyanobacteria (blue-green algae). -Biol. Rev., 1981, 56, 589-660.

103. Lammers P. J., Golden J.W., Haselkorn R. Identification and sequence of a gene required for a developmentally regulated DNA excision in Anabaena. Cell, 1986, 44, 905-911.

104. Lea P.J., Miflin B.J. Glutamate synthase in blue-green algae. Biochem. Soc. Trans., 1975, 3, 381-384.

105. Lee H., Chiou S., Chang G. Staining of argininosuccinate lyase activity in polyacrylamide gel. J. Biochem. Biophys. Methods, 1992, 24, 205-214.

106. Lindblad P., Atkins C.A., Pate J.S. N2-fixation by freshly isolated Nostoc from coralloid roots of the cycad Macrozamia riedlei (Fisch. Ex Gaud.) Gardn. Plant Physiol., 1991, 95, 753-759.

107. Linko P., Holm-Hansen O., Bassam J. A., Calvin M. Formation of radioactive citrulline during photosynthetic 14C02-fixation by blue-green algae. J. Exp. Bot., 1957, 8, 47-156.

108. Liotenberg S., Campbell D., Castets A-M., Houmard J., Tandeu de Marsac N. Modification of the Pn protein in response to carbon and nitrogen availability in filamentous heterocystous cyanobacteria. FEMS Microbiol. Lett., 1996, 144, 185-190.

109. Llama M.J., Serra J.L., Rao K.K., Hall D.O. Isolation and characterization of the hydrogenase activity from the non-heterocystous cyanobacterium Spirulina maxima. FEBS Lett., 1979, 98, 342-346.

110. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, 193, 165-175.

111. Luque I., Flores E., Herrero A. Molecular mechanism for the operation of nitrogen control in cyanobacteria. -EMBO J., 1994, 13, 2862-2869.

112. Mackinney G. Absorption of light by chlorophyll solutions. J. Biol. Chem. 1941, 140, 315322.

113. Marques S, Merida A, Candau P, Florencio F.J. Light-mediated regulation of glutamine synthetase activity in the unicellular cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 6301. Planta, 1992, 187, 247-253.

114. Marques S, Florencio F.J, Candau P. Purification and characterization of the ferredoxin-glutamate synthase from the unicellular cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 6301. Eur. J. Biochem, 1992, 206, 69-77.

115. Martel A, Jansson E, Garcia-reina G, Lindblad P. Ornithine cycle in Nostoc sp. PCC 73102. Arginase, OCT and arginine deiminase, and the effects of addition of external arginine, ornithine, or citrulline. Arch. Microbiol, 1993, 159, 506-511.

116. Maryan P.S, Eady R.R, Chaplin A.E, Gallon J.R. Nitrogen fixation by Gloeothece sp. PCC 6909: respiration and not photosynthesis supports nitrogenase activity in the light. J. Gen. Microbiol, 1986, 132, 789-796.

117. Meeks J.C, Wolk C.P, Thomas J, Lockau W, Shaffer P.W, Austin S.M, Chien W.S, Galonsky A. The pathways of assimilation of 13NH4+ by the cyanobacterium, Anabaena cylindrica. J. Biol. Chem, 1977, 252, 7894-7900.

118. Meeks J.C, Wolk C.P, Lockau W, Schilling N, Shaffer P.W, Chien W.S. Pathways of assimilation of 13N.N2 and 13NHLt+ by cyanobacteria with and without heterocysts. J. Bacterid, 1978, 134, 125-130.

119. Merida A, Candau P, Florencio F.J. Regulation of glutamine synthetase activity in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by the nitrogen source: effect of ammonium. J. Bacteriol, 1991, 173, 4095-4100.

120. Merrick M.J. Regulation of nitrogen assimilation by bacteria. In: The nitrogen and sulfur cycles. Eds. Y.A. Cole, S.Y. Ferguson, 1988, 331-361, Cambridge Univ, Press.

121. Merrit M.V., Sid S.S., Mesh L., Allen M.M. Variations in the amino acid composition of cyanophycin in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6308 as a function of growth conditions. Arch. Microbiol., 1994,162,158-166.

122. Mikheeva L.E., Schmitz O., Shestakov S.V., Bothe H. Mutants of the cyanobacterium Anabaena variabilis altered in hydrogenase activities. Z. Naturforsch., 1995, 50C, 505-510.

123. Mountain A., Mann N.H., Munton R.N., Baumberg S. Cloning of a Bacillus subtilis restriction fragment complementing auxotrophic mutants of eight Escherichia coli genes of arginine biosynthesis. Mol. Gen. Genet., 1984,197, 82-89.

124. Moreno-Vivian C., Caballero F.J., Cardenas J., Castillo F. Effect of the C/N balance on the regulation of nitrogen fixation in Rhodobacter capsulatus E1F1. Bioch. Biophys. Acta, 1989, 977, 297-300.

125. Mulligan M.E., Buikema W.J., Haselkorn R. Bacterial-type ferredoxin genes in the nitrogen fixation regions of the cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120 and Rhizobium meliloti. -J. Bacterid., 1988, 170, 4406-4410.

126. Nagata T., Watanabe Y. Carbon- and nitrogen-to-volume ratios of bacterioplankton grown under different nutritional conditions. Appl. Envir. Microbiol., 1990, 56,1303-1309.

127. Nagatani H.H., Haselkorn R. Molybdenum independence of nitrogenase component synthesis in the non-heterocystous cyanobacterium Plectonema. J. Bacteriol., 1978, 134, 597-605.

128. Nakamura Y., Kaneko T., Hirosawa M., Miyajima N., Tabata S. CyanoBase, a www database containing the complete genome of Synechocystis strain PCC 6803. Nucleic Acids Res., 1998, 20, 63-67.

129. Navarro F., Chavez S., Candau P., Florencio F.J. Existence of two ferredoxin-glutamate synthases in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Isolation and insertional inactivation ofg//B and gltS genes. Plant Mol. Biol., 1995, 27, 753-767.

130. Neilson A.H., Doudoroff M. Ammonia assimilation in blue-green algae. Arch. Microbiol., 1973,89,15-22.

131. O'Reilly M., Devine K.M. Sequence and analysis of the citrulline biosynthetic operon argC-F from Bacillus subtilis. Microbiology, 1994,140, 1023-1025.

132. Riccardi G., De Rossi E., Milano A. Amino acid biosynthesis and its regulation in cyanobacteria. Plant Sci., 1989, 63,135-151.

133. Orr J., Haselkorn R. Kinetic and inhibition studies of glutamine synthetase from the cyanobacterium Anabaena 7120. J. Biol. Chem., 1981, 256,13099-13104.

134. Oxelfelt F., Tamagnini P., Salema R., Lindblad P. Hydrogen uptake in Nostoc sp. strain PCC 73102: effects of nickel, hydrogen, carbon and nitrogen. Plant Physiol. Biochem., 1995, 33, 617-623.

135. Oxelfelt F., Tamagnini P., Lindblad P. Hydrogen uptake in Nostoc sp. strain PCC 73102. Cloning and characterizarion of a hupSL homologue. Arch. Microbiol., 1998,169,267-274.

136. Padan E., Cohen Y. Anoxygenic photosynthesis. In: The biology of cyanobacteria, Eds. Carr N.G., Whitton B.A., 1982,215-235, Blackwell, Oxford.

137. Papen H., Kentemich T., Schmulling T., Bothe H. Hydrogenase activities in cyanobacteria. -Biochimie, 1986, 68,121-132.

138. Peschek G.A. Evidence for two functionally distinct hydrogenases in Anacystis nidulans. -Arch. Microbiol., 1979,123, 81-92.

139. Peschek G. A., Villgrater K., Wastyn M. Respiratory protection of the nitrogenase in dinitrogen-fixing cyanobacteria. Plant Soil, 1991,137,17-24.

140. Peterson G.L. Determination of total protein. Methods Enzymol., 1983,91, 95-119.

141. Pienkos P.T., Bodmer S., Tabita F.R. Oxygen inactivation and recovery of nitrogenase activity in cyanobacteria. J. Bacteriol., 1983', 153,182-190.

142. Potts M., Angeloni S.V., Ebel R.E., Bassam D. Myoglobin in a cyanobacterium. Science, 1992,256,1690-1692.

143. Przybyla A.E., Robbins J., Menon N., Peck Jr. H.D. Structure-function relationships among the nickel-containing hydrogenases. FEMS Microbiol. Rev., 1992, 88,109-136.

144. Quintero M.J., Muro-Pastor A.M., Herrero A., Flores E. Arginine catabolism in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 involves the urea cycle and arginase pathway. J. Bacteriol., 2000,182,1008-1015.

145. Rai A.N., Bergman B. Modification of NO3" metabolism in heterocysts of the N2-fixing cyanobacterium Anabaena 7120 (ATCC 27893). FEMS Microbiol. Lett., 1986, 36,133-137.

146. Ratner S., Auslow W.P., Petrack B. Biosynthesis of urea. VI. Enzymatic cleavage of argininosuccinic acid to arginine and fumaric acid. J. Biol. Chem., 1953,204,115-125.

147. Reich S., B6ger P. Regulation of nitrogenase activity in Anabaena variabilis by modification of Fe-protein. FEMS Microbiol. Lett., 1989, 58, 81-86.

148. Reich S., Almon H., Boger P. Short-term effect of ammonia on nitrogenase activity of- Anabaena variabilis (ATCC 29413). FEMS Microbiol. Lett., 1986, 34, 53-56.

149. Reyes J.C., Florencio F.J. A new type of glutamine synthetase in cyanobacteria: the protein encoded by the g/nN gene supports nitrogen assimilation in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriol., 1994,176,1260-1267.

150. Reyes J.C., Florencio F.J. A mutant lacking the glutamine synthetase gene (glnA) is impaired in the regulation of the nitrate assimilation system in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriol., 1994,176, 7516-7523.

151. Riccardi G., De Rossi E., Milano, A. Amino acid biosynthesis and its regulation in cyanobacteria. Plant Sci., 1989, 63, 135-151.

152. Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B., Herdman M., Stanier R.Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol., 1979, 111, 1-61.

153. Rowell P., Enticott S., Stewart W.D.P. Glutamine synthetase and nitrogenase activity in the blue-green alga Anabaena cylindrica. New Phytol., 1977, 79,41-54.

154. Rowell P., Kerby N.W. Cyanobacteria and their symbionts. In: Biology and Biochemistry of Nitrogen Fixation, 1991, Eds. Dilworth M.Y., Glenn A.R., Studies in Plant Science, 1, Elsevier, The Netherlands.

155. Rowell P., Sampaio M.J.A.M., Ladha J.K., Stewart W.D.P. Alteration of cyanobacterial glutamine synthetase activity in vivo in response to light and NH/. Arch. Microbiol., 1979, . 120,195-200.

156. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd edn. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

157. Schneegurt M.A., Sherman D.M., Nayar S., Sherman L.A. Oscillating behavior of carbohydrate granule formation and dinitrogen fixation in the cyanobacterium Cyanothece sp. strain ATCC 51142. J. Bacteriol., 1994,176,1586-1597.

158. Schmitz O., Boison G., Hilscher R., Hundeshagen B., Zimmer W., Lottspeich F., Bothe H. Molecular biological analysis of a bidirectional hydrogenase from cyanobacteria. Eur. J. Biochem., 1995,233, 266-276.

159. HI. Schrautemeier B., Bohme H. A distinct ferredoxin for nitrogen fixation isolated from heterocysts of the cyanobacterium Anabaena variabilis. FEBS Lett., 1985,184, 304-308.

160. Schrautemeier B., Böhme H. Coding sequence of a heterocysts ferredoxin gene (fdxH) isolated from the nitrogen-fixing cyanobacterium Calothrix sp. PCC 7601. Plant Mol. Biol., 1992, 18, 1005-1006.

161. Serebriakova L.T., Zorin N.A., Lindblad P. Reversible hydrogenase in Anabaena variabilis ATCC 29413; presence and localization in non-N2-fixing cells. Arch. Microbiol, 1994, 161, 140-144.

162. Serebryakova L.T, Medina M, Zorin N.A, Gogotov I.N, Cammack R. Reversible hydrogenase of Anabaena variabilis ATCC 29413: catalytic properties and characterization of redox centers. FEBS Lett, 1996, 383,79-82.

163. Simon R.D. Inclusion bodies in the cyanobacteria: Cyanophycin, polyphosphate, polyhedral bodies. In: The cyanobacteria, Eds. Fay P., Van Baalen C, 1987, 199-225, Elsevier, Amsterdam.

164. Smith A.J. Modes of cyanobacterial carbon metabolism. In: The biology of cyanobacteria. Ed. by Carr N.G., Whitton B.A.Blackwell, Oxford, UK, p. 47-85.

165. Smith R.V, Noy R.J, Evans M.C.W. Physiological donor systems to the nitrogenase of the blue-green alga Anabaena cylindrica. Biochim. Biophys. Acta, 1971, 253,104-109.

166. Smith R.L, Van Baalen C, Tabita F.R. Alteration of the Fe-protein of nitrogenase by oxygen in the cyanobacterium Anabaena sp. strain CA. J. Bacteriol, 1987,169, 2537-2542.

167. Solorzano L. Determination of ammonia in natural waters by the phenolhypochlorite method. -Limnology and Oceanology, 1969,14, 799.

168. Spence D.W., Stewart W.D.P. Heterocystless mutants of Anabaena PCC 7120 with nitrogenase activity. FEMS Microbiol. Lett, 1987, 40,119-122.

169. Stacey G, Tabita F.R, Van Baalen C. Nitrogen and ammonia assimilation in the cyanobacteria: purification of glutamine synthetase from Anabaena sp. strain CA. J. Bacteriol, 1977, 132, 596-603.

170. Stacey G., Van Baalen C., Tabita F.R. Nitrogen and ammonia assimilation in the cyanobacteria: regulation of glutamine synthetase. Arch. Biochem. Biophys., 1979,194,457-467.

171. Stal L.J., Bergman B. Immunological characterization of nitrogenase in the filamentous, non-heterocystous cyanobacterium Oscillatoria limosa. Planta, 1990, 182, 2887-2891.

172. Stal L.J., Heyer H. Dark anaerobic nitrogen fixation (acetylene reduction) in the cyanobacterium Oscillatoria. FEMS Microbiol. Ecol., 1987, 45, 227-232.

173. Stal L.J., Moezelaar R. Fermentation in cyanobacteria. FEMS Microbiol. Rev., 1997, 21, 179211.

174. Stewart W.D.P., Rowell P. Effects of L-methionin-D,L-sulphoximine on the assimilation of newly fixed NH3, acetylene reduction and heterocyst production in Anabaena cylindrica. -Biochim. Biophys. Res. Commun., 1975, 65, 846-856.

175. Summers M.L., Wallis J.G., Campbell E.L., Meeks J.C. Genetic-evidence of a major role for glucose-6-phosphate dehydrogenase in nitrogen fixation and dark growth of the cyanobacterium Nostoc sp. strain ATCC 29133. J. Bacteriol., 1995,177, 6184-6194.

176. Suzuki I., Sugiyama T., Omata T. Regulation by cyanate of the genes involved in carbon and nitrogen assimilation in the cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942. J. Bacteriol., 1996,178, 2688-2694.

177. Tabita F.R. Carbon dioxide fixation and its regulation in cyanobacteria. -In: The cyanobacteria. Ed. by Fay P., Baalen C.V., 1987, Elsevier, p.95-117.

178. Tabita F.R. The biochemistry and molecular regulation of carbon dioxide metabolism in cyanobacteria. In: The molecular biology of cyanobacteria. Ed. by Bryant D.A., 1994, Kluwer Academic Publishers, p. 437-467.

179. Tamagnini P., Oxelfelt F., Salema R., Lindblad P. Immunological characterization of hydrogenases in the nitrogen-fixing cyanobacterium Nostoc sp. strain PCC 73102. Current Microbiol., 1995,31,102-107.

180. Tamagnini P., Costa J.L., Almeida L., Oliveira M.J., Salema P., Lindblad P. Diversity of cyanobacterial hydrogenases, a molecular approach. Curr. Microbiol., 2000,40, 356-361.

181. Thiel T. Characterization of genes for an alternative nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis. J. Bacteriol., 1993,175, 6276-6286.

182. Thiel T., Lyons E.M., Erker J.C., Ernst A. A second nitrogenase in vegetative cells of a heterocyst-forming cyanobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 9358-9362.

183. Tredici M.R., Margheri M.C., De Philippis R., Materassi R. The role of hydrogen metabolism in photoheterotrophic cultures of the cyanobacterium Nostoc sp. strain Cc isolated from Cycas circinalis L. J. Gen. Microbiol., 1990,136,1009-1015.

184. Tsai L.B., Mortenson L.E. Interaction of the nitrogenase components of Anabaena cylindrica with those of Clostridium pasterianum. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1978, 81, 280-287.

185. Turner N.E., Robinson S.J., Haselkorn R. Different promoters for the Anabaena glutamine synthetase gene during growth using molecular or fixed nitrogen. Nature, 1983, 306, 337-342.

186. Vallee F., Turner M.A., Lindley P.L., Lynne Howell P. Crystal structure of an inactive duck 8 II crystallin mutant with bound argininosuccinate. Biochemistry, 1999, 38, 2425-2434.

187. Van der Oost J., Kanneworff W.A., Krab K., Kraayenhof R. Hydrogen metabolism of three unicellular nitrogen-fixing cyanobacteria. FEMS Microbiol. Lett., 1987, 48, 41-45.

188. Van der Oost J., Cox R.P. Hydrogenase activity in nitrate-grown cells of the unicellular cyanobacterium Cyanothece PCC 7822. Arch. Microbiol., 1989, 151, 40-43.

189. Vega-Palas M.A., Flores E., Herrero A. NtcA, a global nitrogen regulator from the cyanobacterium Synechococcus that belongs to the Crp family of bacterial regulators. Molec. Microbiol., 1992, 6,1853-1859.

190. Volbeda A., Charon M.-H., Piras C., Hatchikian E.E., Frey M., Fontecilla-Camps J.C. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas. Nature, 1995, 373, 580587.

191. Wagner S.J., Thomas S.P., Kaufman R.I., Nixon B.T., Stevens S.E. The glnA gene of the cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum PR-6 is nonessential for ammonium assimilation. J. Bacteriol., 1993,175,604-612.

192. Weathers P.J., Chee H.L., Allen M.M. Arginine catabolism in Aphanocapsa 6308. Arch. Microbiol., 1978,118,1-6.

193. Wei T-F., Ramasubramanian T.S., Pu F., Golden J.W. Anabaena sp. strain PCC 7120 bi/A gene encoding a sequence specific DNA-binding protein cloned by in vivo transcriptional interference selection. J. Bacteriol., 1993, 175, 4025-4035.

194. Wei T-F., Ramasubramanian T.S., Pu F., Golden J.W. Anabaena sp. strain PCC 7120 ntcA gene required for growth on nitrate and heterocyst development. J. Bacteriol., 1994, 176,4473-4482.

195. Winkenbach F., Wolk C.P. Activities of enzymes of the oxidative and reductive pentose phosphate pathways in heterocysts of a blue-green alga. Plant Physiol., 1973, 52, 480-483.

196. Wolk C.P., Thomas J., Shaffer P.W., Austin S.M., Galonsky A. Pathway of nitrogen metabolism after fixation of 13N-labeled nitrogen gas by the cyanobacterium, Anabaena cylindrica. J. Biol. Chem., 1976, 251, 5027-5034.

197. Wolk C.P., Ernst A., Elhai J. Heterocyst metabolism and development. In: The molecular biology of cyanobacteria, Ed. Bryant D.A., 1994, 769-823, Kluwer Academic Publishers.

198. Wood, S.A., Miles, J.S. and Guest, J.R. (1988) Sequence homologies between argininosuccinase, aspartase and fumarase: A family of structurally-related enzymes. FEMS Microbiol Lett 51,181 -186.

199. Wu L.-F., Mandrand M.A. Microbial hydrogenases: primary structure, classification, signatures and phylogeny. FEMS Microbiol. Rev., 1993, 104, 243-270.

200. Yakunin A.F., Hallenbeck P.C., Troshina O.Y., Gogotov I.N. Purification and properties of a bacterial-type ferredoxin from the nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena variabilis ATCC 29413. Biochim. Biophys. Acta, 1993,1163, 124-130.

201. Yakunin A.F., Hallenbeck P.C., Troshina O.Y., Gogotov I.N. Purification and properties of a flavodoxin from the heterocystous cyanobacterium Anabaena sphaerica. Biochim. Biophys. Acta, 1993,1164,305-310.

202. Yakunin A.F., Hallenbeck P.C. Short-term nitrogenase regulation in Rhodobacter capsulatus: multiple in vivo nitrogenase responses to NH/ addition. J. Bacterid., 1998,180, 6392-6395.

Информация о работе

Трошина, Ольга Юрьевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2000
ВАК 03.00.07

Диссертация

Метаболизм азота и водорода у гетероцистных цианобактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы