Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия в Bacillus subtilus фрагмента SPA-гена, кодирующего иммуноглобулинсвязывающий участок стафилококкового белка А

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия в Bacillus subtilus фрагмента SPA-гена, кодирующего иммуноглобулинсвязывающий участок стафилококкового белка А"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

на правах рукописи ИСАЕВА Светлана Витальевна

УДК 577.4:57.083.3:57.085.82

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В ВАС1Шге БиВ-ПЫв ФРАГМЕНТА 8РА-ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ИММУНОГЛОБУЛИНСВЯЗЫВАППИЙ УЧАСТОК СТАФИЛОКОККОВОГО

БЕЛКА А

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

¡1

Москва 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научном, центре молекулярной диагностики и лечения МЗ СССР.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация :

доктор биологических наук В,И.Киселав

доктор биологических наук Н.И.Матвиенко -

доктор физико - математических наук О.В.Коломыткин

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, Пущино

Защита состоится п/<7* ихЛ'уъЯ 199г. в час. на заседании специализированного ученого совета Д 074.51.01. ври Всесоюзном научном центре молекулярной диагностики и лечения ЫЗ СССР, 113149, Москва. Симферопольский бульвар, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного

ц

научного центра молекулярной диагностики и лечения МЗ СССР.

Автореферат разослан " £ 199 -£т.

Ученый секретарь специализированного ученого совета, кандидат биологических наук ¡ОЗО- '

с-

В.В.Отраднова

Актуальность_темы. Уникальное свойство стафилококкового белка A (SPA) - связывание с Ро-фрагментом иммуноглобулинов (Ig) различных видов млекопитающих позволяет широко использовать его в качестве иммунодиагностического реагенту в различных РИА и ЭЛИСА тест-системах. Обычно SPA выделяют из клеток s.aureus Cowan 1, однако данная процедура имеет определенные недостатки: а) небходимость использования специальной техники безопасности при работе с s.aureus; б) контаминация продукта токсинами S.aureus. Клонирование spa-гена в гетерологичных системах позволило бы, избежать перечисленных трудностей.

Использование клеток B.subtilis в роли бактериальных хозяев клонированной ДНК имеет потенциальные преимущества перед клетками Е.ооИ. Эти преимущества заключаются в их способности секретировать белки, которые обычно гораздо легче выделить и очистить, чем внутриклеточные. Кроме того секретируемый белок - это почти всегда интактный белок, имеющий уже сформировавшуюся третичную структуру.

Последние достижения в области генной инженерии позволили клонировать ген, ответственный за синтез spa, определить его нук-леотидную последовательность и выяснить структурно- функциональную организацию. Белок состоит из 5 гомологичных ig-связываюцих домена и области, ответственной за связывание с клеточной стенкой. Клонирование фрагмента spa-гена, кодирующего lg-связывающую область spa, имеет большие перспективы для использования в биотехнологии и послужит основой для создания гибридных ДНК-конструкций, объединяющих ig-связывающие домены бежа а. Подобные химерные белки, обладающие, например, lg-связывающими свойствами и энзимной активностью, можно рассматривать как перспективную замену традиционных ферментных коныогг|тов в иммуноферментном ме-

тоде анализа.

Другим интересным свойством SPA является его митогенная активность в отношении лимфоцитов, механизм которого в настоящее время окончательно не выяснен.

В связи с изложенным возникла целесообразность разработки приемов и методов клонирования фрагмента ера-гена, кодирующего Ig-связывавдую область SPA в Bacillus subtllis, очистки и характеристики его белкового продукта.

Ii

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось клонирование фрагмента spa-гена, ответственного за синтез lg-связыващего участка стафилококкового белка А в клетках E.coli и в.subtilis, изучение его экспрессии, выделение и характеристика его белкового продукта.

Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Создать библиотеку генов s.aureus FRI 722 (Н).

2. Клонировать фрагмент вра-гена, кодирующий Ig-связыванций участок белка А в E.coli.

3. Изучить экспрессию клонированного фрагмента ДНК в E.coli. используя различные векторные системы.

4. Разработать тест-систему для определения белка A s.aureus в биологических жидкостях.

5. Клонировать фрагмент зра-гена в B.subtilis и изучить его экспрессию.

6. Выделить и очистить продукт фрагмента spa-гена, клонированного В B.subtilis.

7. Исследовать свойства рекомбинантного продукта и определить его структурно-функциональную организацию.

2

Научная новизна и практическая значимость.Впервые клонирован фрагмент spa-гена, определяющего синтез lg-связывающего участка белка А из S.aureus PRI 722. (Н), изучены особенности его экспрессии в клетках E.coli и B.subtllis. разработана простая и эффективная тест-система для количественного определения белка . А s.aureus в биологических жидкостях. Впервые локализован участок spa, ответственный за митогенный эффект в отношении В-клеток.

Полученные данные свидетельствуют о возможности клонирования и экспрессии Арагмента ера-гена в гетерологичных системах, а также использования B.subtilis в качестве продуцента биологически активного рекомбинантного N - концевого участка spa, связывающего igG. Клонированный нами фрагмент spa-гена мокет быть широко использован для построения . гибридных ДНК-конструкций, определяющих синтез химерных белков, объединяющих lg-связывавдие и ферментные свойства. Кроме того, белковый продукт фрагмента spa-гена, может найти применение как иммуномодулятор.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации изложены в трех печатных работах, а также доложены на международной конференции "Биосинтез белка" ( г.Пущино, 1991). В целом работа обсувдена на межлабораторном коллоквиуме ВНВДДЛ МЗ СССР.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литература, экспериментальной части, в которой приводятся результаты собственных исследований и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 94 страницах машинописного текста. Содержит 14 рисунков и 5 таблиц. Библиография включает 142 наименования, из них 128 работ 3

иностранных авторов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЫМ ЧАСТЬ

Материалы и методы. В работе использованы следующие штаммы микроорганизмов: E.ooli HB 101, ОТ 14. то 1, ВНВ 2688, ВНВ 2690, J1Í 103, AB 1157, AB 1189 И Я ЭЭ50, Staphilooocous aureus FRI 722 (Н). Bacillus subtilis MC 5. В качестве векторов для клонирования использованы фазмида pSL 5, плазмиды: рыс 19, pTZ 19, рАСУС 184, pOLYA 14.

Библиотеку генов s. aureus FRI 722 (Н) создавали в фазмидном векторе pSL 5 по описанным ранее методикам (Ыаниатис и др.,1984) совместно с сотрудниками лаборатории доктора Янковского (ВНИИ генетика). Скрининг библиотеки генов S.aureus в рЗЬ 5. отбор клонов E.ooli и в.subtilis, содержащих рекомбинантные плазмиды со вставкой фрагмента spa-гена и анализ его продукта осуществляли иммувоферментным методом на нитроцеллюлозных фильтрах способом, предложенным Остерманом (ВНИИ генетика). Для анализа использовали IgQ кролика и человека (Sigma). Концентрацию SPA в куль-туральной жидкости определяли оригинальным твердофазным имкуно-ферментным методом. Суперскрученную , плазыидную ДНК выделяли из клеток E.ooli и В.subtilis по методу Бирнбоима и Доли (1979) в модификациях для каждого микроорганизма, хромосомную ДНК из клеток s.aureus выделяли по модифицированному методу Патти и Невельна (1975).

Трансформацию клеток E.coli плазмидной ДНК проводили по мо-,t дампированному методу Ыандела и Хига (1970); клеток в.subtilis ' по методу Спицайзена (1958). Трансфекцию клеток E.ooli фазмидными ДНК осуществляли по методу, описанному в руководстве Миллера 4

(1976). Рестрикцию плазмидной ДНК проводили в трис-ацетатном буфере. предложенном О'Фареллом и соавторами (1980), лигирование -по мода35ицированной методике Дугаизжука и соавторов (1975). Конкретные условия лигирования оптимизировали по Машко (1979).

Молекулы ДНК разделяли электрофоретически в агарозном геле и выделяли по методу Хогнесса (Ыаниатис и др.,1984). Ник-трансляцию ДНК^ осуществляли по модифицированному методу Ригби и соавторов

(1977). Гибридизацию ДНК проводили непосредственно в геле по Кронштадту и соавт.(1963) или по методу Саузерна на нейлоновых фильтрах.

Электрофоретический анализ белков осуществляли в 12 Ж поли-акриламидном геле по Лэммли (1970). Гель окрашивали кумасси брил-.', ■ лиантовым голубым G-250 или серебром с помощью набора Quiok -silver (Amersham). Белки переносили электрофоретически на нитро-цЭеллюлозные мембраны на приборе Mini Trans-Blot (Bio Rad) и анализировали на присутствие spa методом иммуноблотинга в модификации Остермана. Биологическое действие препаратов анализировали в митогенном тесте, используя в качестве клеток-респондеров сплено-циты и тимоциты 18-24 недельных плодов человека. Фракцию мононук-ла аров инкубировали в 96-луночных планшетах в течение 48 часов и после добавления 3Н-(метил)тимидина еще 18 часов, после чего переносили на фибростеклянные фильтры и определяли радиоактивность на ß-сцинцилляционном счетчике.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I.Конструирование библиотеки генов s.aureus PRI 722 (Н).

Хромосомную ДНК из S.aureus подвергали частичному расщеплению

рестриктазой EcoRl. Фрагменты ДНК длиной 5-15 т.п.н. лигировали с

• ДНК фазмидного вектора pSL 5, линеаризованного EooRl при равном соотношении фрагмента к фагу. Рекоыбинантные ДНК упаковывали in vitro в капсид фага, используя для этого экстракты E.ooli ВНВ 2688 и внв 2690. Титр фага, определенный путем подсчета фаговых бляшек во всех слуаях не был ниже I08 бляшек/мл.

2. Клонирование фрагмента spa-гена в клетках E.ooli.

Фаговую библиотеку высевали на чашки Петри и отбира!ли фаговые бляшки, продукты которых связывались с igQ кролика в дот-блот анализе. Отобранные фаговые клоны подращивали, выделяли фаги и использовали для трансфекции клеток E.ooli TG1. По данным Улема и соавторов (1984) и Шатлворса и соавторов (1967) spa-ген имеет приблизительно посередине сайт узнавания Hind ill. Поэтому, в целях получения фрагмента spa-гена, ответственного за синтез N-концевых lg-связываюдшс доменов, выделенную рекомбинантную фаз-миду (pSK 25)ч содержащую клонированный Boori фрагмент ДНК S.aureus, включающий spa-ген, рестрицировали эвдонуклеазой HindlII и лигировали с линеаризованной HindIII плазмидой pUO 19. Полученным материалом трансформировали клетки E.ooli JM103 и отобрали методом иммуноблотинга рекомбинантные клоны, продукты кото-

• рых связывались с igG. Выделенный из гибридной плазмиды. pSK26 клонированный Hindin фрагмент гибридизовался с хромосомной ДНК S.aureus, но не с ДНК E.ooli и фага Рестрикционный анализ выявил, внутри него сайт узнавания EooRl. После обработки эвдонуклеа-

. зой EooRÏ, получен EooRI-HindIII фрагмент ДНК S. aureus величиной 1,4 т.п.н. и определена его нуклеотидная последовательность. Сравнительный анализ с нуклеотидной последовательностью spa-гена 6

из S.aureus Cowanl NCTC 8530 (Шаттлворс,1987), показал. ЧТО клонированный нами Hindlll-EcoRl фрагмент ДНК s.aureus PRI 722 (Н) имеет высокую степень гомологии (уровень выше 95 %) и включает участок spa-гена, кодирующий промоторную область (Р), сигнальную пос.™тщательность (si) и четыре lgo-связыващих Домена spa

(E,d,a и частично в) (рис. i).

■ >

,_ I Р |Si | Е | D | А | В | С | X Ij а

Pst I EcoRI Hindin PstlEcoRY

• I

I-,-i Ъ

HindlH EcoRI HindlH

Рис Л Рестрикционная карта и конструкция фрагментов ДНК s. aureus, содержащих spa-ген. Схематическое представление spa-гена по Сьедалю включает промоторную область (Р), сигнальную последовательность (si), igg-связываодие домены (e.D.a.b и с), участок связывания с клеточной стенкой (X). а - из штамма cowan I (NCTC 8530); б - из шташа phi 722 (н).,

«

2л_^Шшессия_®а™еш_5В§=гена_в_|иетках Клетки в. coli JU юэ трансформировали ДНК PSK26 и рТС19. подращивали при 3-Я С в L-бульоне, озвучивали на дезинтеграторе Pritoh, центрифугировали и осаждали белки супернатанта 50« ацэто-1 ном. Белковые продукты анализировали с помощью иммуноблотинга. 1«о кролика связывался с белковыми продуктами клеток е.coli,

трансформированных гибридной плазмидой pSK26, но не р0С19 7

(рис.2).

I 2

Рис.2 Иммуноблотинг белковых продуктов, синтезируемых клетками

E.ooli JM юз, содержащими плазмиды: I. рио19; 2. pSK26.

Для определения концентрации SPA в различных биологических жидкостях был разработан твердофазный иммуноферментный метод, основанный на конкуренции связывания меченого пероксидазой белка A (Amersham) и белка А в пробе с igfl, человека, сорбированного на дне 96-луночных планшетов. В качестве стандартов использовали белок А из S. aureus (Pharmacia) и рекомбинантный белок А (А.П.Добрица, ВНИИПЫ) (рис.3). Разработанная тест-система позволяет определять содержание белка А в биологических жидкостях в диапазоне от 0,01 до I мкг/мл.

Для изучения особенностей экспрессии фрагмента вра-гена в клетках E.ooli определяли уровень продукции белка А, детерминиро-8

OD 405

2,0

1,5-

1,0"

0,5-

1:500

A

1:5ooo

I III« I I Ч ■■ I I I ' — 1 ' " " 1 1 '

10'5 10'" 10"3 10"2 10'1 10° 101 mr/M

03) 405

2,01

1J5-

1,0-

.0,5-

i: 500

V. 1000

1:5000

1Q5 10"" 10"3 10"2 10'1 10° 101 МКГ/МЯ,

Рис.3 Калибровочная кривая препаратов белка A S.aureus (Pharmaoia) (А) и рекомбинантного белка А (5). 1:500; 1:1000; 1:5000 - разведения коньюгата белка А с пероксидазой.

ванный низко- и высококопийными гибридными плазмидами в ion*" и Ion- ( мутантах со сниженной активностью протеиназы La) клетках E.ooli. Hindlll фрагмент ДНК s.aureus PRI 722 (Н), содержащий фрагмент spa-гена, субклонировали в клетках E.ooli JM ЮЗ в вы-

I

сококошйном (pTZi9) и низкокопийном (pACYCi84) векторах. Гибридные плазмиды обозначили соответственно pSK28 и pSK29. Ими трансформировали клетки E.coli АВ1157 (1оп+) и АВ1189 (Ion-), после чего определяли концентрацию продукта фрагмента вра-гена в лиза-тах клеток иммуноферментным методом.

Исследования показали, что фрагмент вра-гена в составе вы-сококопийного вектора в Ion--мутантах E.coli существенно ( в 4.8 раза) увеличивает продукцию рекомбинантного продукта. Общая схема экспериментов по клонированию и субклонированию фрагмента spa-гена приведена на рис.4 (а.б).

4._Клонирование фрагмента ара-гена_в_клетках__B.subtilis.

Поскольку бациллы способны эффективно секретировать белки во внеклеточную среду, мы использовали клетки B.subtilis в качестве хозяина для клонирования spa-гена.

фрагмент spa-генэ в составе 2,6 т.п.н. Hindlll фрагмента ДНК клонировали на бирешшконной плазмиде pOLYA 14, способной реплицироваться в клетках E.coli и B.subtilis. Трансформанты отбирали на среде с тетрациклином, 'после чего выявляли клоны, продукты которых связывались с igG в иммуноблотинге. Для обеспечения стабильности гибридной плазмиды pSK30, клетки B.subtilis проводили через стадию спорулляции, и отбирали клоны, положительно реагирующие с IgG кролика. Описанная процедура позволила получить стабильную форму рекомбинантной плазмиды и устойчивую экспрессию входящего в ее состав фрагмента spa-гена в клетках B.subtilis.

5. Экспрессия фрагмента__spa-гена___в__клетках___B.subtilis.

Клетки B.subtilis ме5. трансформированные гибридной плазмидой

рэкзо, содеркащей фрагмент вра-гена, выращивали в ь-среде в тече-**| ние ночи. Белки культуральной жидкости после осаждения клеток

ДНК Б.aureus FBI 722 (Н)

COS

EcoRI

ErnRI

1. Частичная рестрикция EooRi, лигирование, упаковка In vitro в фаговые частицы.

2. Фаговая библиотека генов s. aureus PHI 722 (Н).

3. Перепечатывание на NC фильтры и иммунодетекция на продукцию SPA.

4. Трансдукция E.ooli tg1 и выделение ДНК гибридного фага pSK25.

Рис.4 (а) Схема клонирования и субклонирования фрагмента вра-гена в клетках E.ooli.

преципитировали 10 % ТХУ и анализировали электрофоретически и в вестерн-блот анализе (рис.5,6). На уровне 26 кД обнаружена белковая полоса, положительно реагирующая ^ 1^0 и отсутствующая в культуральной жидкости клеток В.виьынв, трансформированных плазмидой рОЬУА н. ■

Для поиска режима наибольшей экспрессии клонированного фраг-

5. Рестрикция Hindin, лигирование, трансформация e.coli JM юз.

6. Рестрикция Ec'oRi,. лигирование, трансформация E.ooli JM 103.

7. Рестрикция Hin diu, лигирование, трансформация E.ooli JM 103.

8. Рестрикция Hin diu, лигирование, трансформация E.coli JM ЮЗ. Рис.4 (б) Схема клонирования и субклонирования фрагмента spa-гена в клетках E.ooli (продолжение).

мента spa-гена клетки B.subtilia культивировали в обогащенной

I

среде, содержащей 0,Iii гемоглобина, и исследовали кинетику синтеза общего белка по Бредфорду и продукцию рекомбинантного SPA иммуноферментным методом (табл.1).

Таблица I

Кинетика секреции общего белка и продукта фрагмента вра-гена клетками штамма B,subtilis ЫС5.

Время культиви- I 2 3 4 5 6 7 8 рования (ч)

Оптическая плот- 0,196 0,209 0,247 0,457 0,073 1,113 1,225 1,360 ность (550 нм)

Общий белок 650 660 700 690 630 580 580 550

(мкг/мл)

Продукт фрагмента 0,07 0,09 0,12 0.12 0.20 0,15 0,16 0,07 вра-гена

Таким образом, максимальные уровни секреции клетками B.subtilis клонированного продукта фрагмента spa-гена наблюдали на 5 час культивирования, что соответствует ранней стационарной фазе роста.

6. Выделение и очистка продукта__клонированного в клетках

B.subtilis фрагмента вра-гена. Клетки B.subtilis выращивали в обогащенной среде с добавлением ингибиторов протеаз (I мМ pmsp и 10 мМ ЭДТА). Клетки осаждали, культуральную жидкость смешивали с ионообменной смолой Bio Rex 70 (Bio Rad), уравновешенной 0,005 M натрий-фосфатным буфером (pH

5,6). Ионообменник промывали деионизованной водой на колонке и

Ii

элюировали 0,5 М натрий-фосфатным буфером (pH 6,2) с 0,5 М NaCl. Собранные фракции тестировали дот-блот анализом, фракции, дающие 13

94 ООО КД 6 7 000 КД

43 ООО КД

30 ООО КД

20 1 00 КД 14 400 КД

Рис.5 Электрофоретический анализ в 12 * SDS-ПААГ белковых продуктов, секретируемых клетками B.subtilis М05. несущих плазмвды: I.pOLYAH; 2.pSK30; з. Маркеры молекулярного веса. Стрелкой показано положение белкового продукта фрагмента spa-гена.

положительный ответ с igo кролика, объединяли, очищали вторым этапом на" колонке Mono Q (Phannaoia), уравновешенную 0,01 М натрий-фосфатным буфером (рН 6,0) и элюировали ступенчатым градиентом (0,10,40 и 100 %) компонента 2 - 0,01 М натрий-фосфатного буфера (рН 6,8) с 0,5 М Nací. Собранные фракции тестировали дот-блот анализом. На третьем этапе положительно реагирующие с IgO фракции очищали на колонке Superóse 12 (Pharmaoia), уравновешен-14

•ч

Рис.6 Иммуноблотинг секреторных белков клеток ВаоШиз виЪШ1з МС5. несущих рекомбинантные плазмиды: I. положительный контроль -

нативный БРА (РЬагтао1а); 2. рБКЭО 3.рОЬУА14.

»

ной 0,05 М натрий-фосфатным буфером с 0,15 М ЫаС1. Фракцию, реагирующую с в дот-блот анализе анализировали электрофоретичес-ки и с помощью иммуноблотинга (рис.7). Результаты свидетельствуют, что очищенный белковый продукт фрагмента' вра-гена, клонированного в В.аиМШв, выявляется в 12 % ПААГ на уровне 26 кД.

7. Биологическая__активность продукта фрагмента ара-гена.

Биологическую активность рекомбинантного препарата испытывали на спленоцитах и тимоцитах человека. Показано, что очищенный продукт фрагмента яра-гена, кодирующего з^я-связывающие домены бра, 15

а

б

• — зо ооо кд

ü^i .i i м imiifn-né i

Рис.7 Анализ белкового продукта, клонированного в B.subtilie MC5 фрагмента spa-гена после третьего этапа очистки - гель-фильтрации на колонке с Superóse 12. а. Электрофореграмма белков в 12 Я SDS-ПААГ. б. Иммуноблотинг.

стимулирует пролиферацию только спленоцитов человека и не активен в отношении тимоцитов, т.е. обнаруживает B-клеточную активность (рис.8,9). Следовательно, эпитоп белка А, ответственный за В-клеточную митогенную стимуляцию, локализован в области lgO-связывающих доменов.

Таким образом, в клетках E.ooli и B.subtilie нами клонирован фрагмент spa-гена из S.aureus FRI 722 (Н), кодирующий N-концевой участок spa, включающий lgo-связывающие домены, белковый продукт которого эффективно экспрессировался в окружающую среду. Рекомби-нантный белковый продукт представляет собой белок с молекулярной массой 26 кД, связывается с igG кролика и человека и обладает B-клеточной активностью. 16

Рис.8 Митогенный ответ спленоцитов ( • ) и тимоцитов ( о )

человека, индуцированный белком A S.aureus (Pharmacia) (-) и

очищенным продуктом фрагмента spa-гена (---). ,

ис

12- *

Б

f ю"* ю-* ю-' ю" 10'

мкг/ мл

Рис. 9 Стимуляция спленоцитов человека препаратами белка А S.aureus : ( # ) - белок A (Pharmaoia); ( О ) - рекомбинантный белок А; ( а ) - очищенный продукт фрагмента spa-гена. 17

выводы

1. Создана геномная библиотека s.aureus FRI 722(H) в фазмидном векторе pSL5.

2. Клонирован фрагмент гена стафилококкового белка А (spa-гена) в составе Hindin фрагмента ДНК величиной 2,6 т.п.н. (плазмида pSK26) и субклонирован в составе EcoRI-Hind III фрагмента ДНК величиной 1.4 т.п.н. (плазмида pSK27). Показано, что клонированный фрагмент spa-гена определяет синтез N-концевого участка белка

A, который включает 4 неполных lgG-связывавдих домена.

3. Разработан твердофазный иммуноферментный метод для обнаружения белка А, основанный на конкуренции связывания с ige в присутствии коныогата белок А - пероксидаза. 1

4. Изучены особенности экспрессии фрагмента spa-гена в клетках E.ooli в составе различных плазмид.

5. Фрагмент spa-гена клонирован в клетках B.subtilis MC 5 на бирепликонной плазмиде рОЬУА14. Продукт фрагмента spa-гена секретировался клетками B.subtilis во внеклеточное пространство. Максимальный уровень секреции наблюдали в ранней стационарной фазе культивирования клеток B.subtilis.

6. Выделен и очищен белковый продукт 1 с молекулярной массой 26 кД, кодируемый фрагментом spa-гена из культуральной жидкости

B.subtilis. Изучены его иммуйологические свойства. Рекомбинантный белок эффективно связывался с IgG человека и кролика и обладал B-клеточной митогенной активностью. Таким образом, за митогенную активность белка А ответственна его lgG-связываицая область.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Исаева C.B., Грабовецкий B.B., Киселев В.И., Ильин Г.П. Синтез рекомбинантного N-концевого участка белка A Staphilococcus aureus в клетках Bacillus subtilis. Тезисы Международной конференции "Биосинтез белка", г. Пущино, 1991.- С.74.

2. Исаева C.B., Грабовецкий В.В., Киселев В.И. Клонирование, экспрессия и нуклеотидная последовательность фрагмента spa-гена, кодируюцего N-концевой участок белка А из Staphilococcus aureus РЛ1 722 (H). Тезисы II Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладное аспекты молекулярной биологии", г. Самарканд, 1991.-С. 80.

3. Исаева C.B., Грабовецкий В.В., Киселев В.И. Клонирование и экспрессия фрагмента spa-гена, кодирующего N-концевой участок белка A Staphilooocous aureus в клетках Escherichia coli. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 1991.- в печати.