Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование генов, кодирующих синтез лизоцима Staphylococcus aureus и лизостафина Staphylococcus simulans, их экспрессия в гетерологичных хозяевах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование генов, кодирующих синтез лизоцима Staphylococcus aureus и лизостафина Staphylococcus simulans, их экспрессия в гетерологичных хозяевах"

/h-З з Ч1Ь

На правах рукописи

ЖАДА1ГОВА ЛЮДМИЛА ВЛАДИМИРОВНА

КЛОНИРОВАНИЕ генов, КОДИРУЮЩИХ СИНТЕЗ ЛИЗОЦИМА Staphylococcus aureus И ЛИЗОСТАФИНА Staphylococcus simulans, ИХ ЭКСПРЕССИЯ в ГБТЕРОЛОГИЧНЫХ ХОЗЯЕВАХ

03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертант! на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва - 2004

■ Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Романова Юлня Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Еланская И.В.

кандидат биологических наук Дмитренко O.A.

Ведущая организация - Государственный научшлй центр' Институт биофизики ФУ «Медбиоэкстрем» МЗ РФ

Защита состоится » января 2004 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001,007.01 в ГУ 11ИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН по адресу; 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18.

СдиссерТ'. ti: :(гться ь ■ г ГУ Науч-

110'ИССЛвДС L* : ^'.»."С-":•>.,иг л и микробио-

логии им. > ■ ■! Автореферат р. ■ v

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

'Русакова Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Стафилококки представляют собой большую гетерогенную группу грамположительных микроорганизмов. Они широко распространены в окружающей среде, и некоторые виды являются возбудителями ряда заболеваний человека и животных. В настоящее время все описанные виды стафилококков делятся на две основные группы - коагулазопол ожитсльные и коагу л аз оотрицате л ьные. Самым же известным среди всех коагулдзоноложительных видов стафилококков .является -золотистый стафилококк- Staphylococcus aureus, который ла протяжении всего XX века был одним из наиболее значимых оппортунистических патогенов в медицинской практике. Основной экологической нишей S, aureus являются апокриновые железы, расположенные в передних отделах носовых ходов человека, а также в подмышечных ямках и паховых складках, что связано с высокой степенью сродства данного вида микроорган) омов к расположенным там этгтелиоцнтам. Условием для освоения S. aureus данной экологической ниши является способность бактерий противостоять действующим в ней механизмам противоннфекшюииой резистентности организма хозяина (Дерябин Д.Г., 2000). S. aureus способен вызывать широкий спектр заболеваний - от «малых» кожных инфекций до тяжелых септических состояний с возможным летальным неходом (Grosserodc М.Н., Wenzd R.P., 1991, Бухарин О-В. и др., 2001).

Золотистый стафилококк характеризуется многообразием факторов паггогенности, к которым относятся экзотоксины, факторы адгезии., инвазии и я м м у i юрезисте! пностн. Среди многочисленных эксграцеллюлярных продуктов стафилококков наибольший интерес представляет бактерполитический лизонимподобный фермент /ЛПФ/_ относящийся к аутолитическим ферментам-гидролазам. и стафилококковый бактериоцин /лизостафим-'' Эти два фермента отличаются по механизму действия, спектру и структуре. Если лизоцпм стафилококков, представляющий р /1—4/ цегил глюкозам; гнид азу, разрывает fl /1—4/ глюкозщшые связи в полисахарпдиой составляющей пептидом) и кана, входящего в состав клеточной стенки, то лнзостафип. представляющий глинилглициновый комплекс, воздействует на белки клеточной стенки (Бухарин О.В., Васильев Н В,. Усвяиев В.Я. 19851

Лизостафин могут синтезировать только стафилококки, а л шоп им является широко распространенным в природе белком, который способны синтезировал» не только микроорганизмы, к которые относя;ся стафглококкн, по и высшие оргг.ннзмы. Ич всех известных лизоцимов ii

i цйБ МСХА

настоящее время в Латвии налажено промышленное производство только куриного лизоцима из белка куримых яиц. Основное отличие яичного лизоцима от лизодаша бактериального происхождения заключается в том, что несмотря на общий субстрат действия этих ферментов — пептидогликац (мурейн) клеточной стенки бактерии - они расщепляют его на различные конечные продукты.

У бактериального лизоцима, по сравнению с яичным, выше степень и шире спектр литйчсского действия. Куриный лизоцим не действует на грамположительные .бактерии (в частности стафилококки) в отличие от лизоцима S. aureus, который разрушает клеточные стенки коагулазоотрицательных видов стафилококков (Акатов А.К., Зуева B.C., 1983). Кроме того, микробные лизоцимы в отличие от яичного взаимодействуют с другими группами гидролитических ферментов, что приводит к большему суммарному логическому эффекту (Афанасьева Т.И.; Леоненко В.А., 1975). В настоящее время промышленное производство препаратов, содержащих стафилоккокковый лизоцим, лизирующий клеточные стенки грамотрицательных видов стафилококков, не разработано, хотя не вызывает сомнения, что во многих случаях практическое применение микробных ферментов гораздо' экономичнее, чем применение яичного лизоцима.

Известно, что резкое снижение уровня эндогенного лизоцима свидетельствует о серьезных дефектах систем регуляции гомеостаза, неблагоприятно . отражается на морфогенезе и функционировании иммунной системы организма.

Многие условно-патогенные бактерии могут снижать концетрацию лизоцима за счет продукции антилизоцимного фактора (Бондареюсо В.М., Романова ЮМ, Яблочков А.Я., 1988). Поэтому восполнение дефицита лизоцима является патогенетически вполне оправданным в лечении и профилактике многих заболеваний, в том числе дисбактериозов, тесно взаимосвязанных со вторичными иммумодефи цит н ы м и состояниями, ослабляющими колонизационную резистентность открытых полостей организма хозяина (Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Г.В., 2003), Разработка нового препарата-пробиотика, в основе которого могут быть молочнокислые бактерии, продуцирующие лизоцим, весьма перспективна и нова.

Что касается другого фермента стафилококкового происхождения -лизостафина, который разрушает как грамотрицательные вилы стафилококков, так и ipaw положительные, то он необходим в генетических исследованиях стафилококков для получения протопластов

этих микроорганизмов. В настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих этот фермент, и работа в данном направлении также является актуальной и перспективной. Особенно эффективным и экономичным было бы создание препарата, содержащего: оба вышеуказанных. фермента стафилококкового происхождения (лгооцим и яизостафин).

Одним из подходов к решению этой проблемы является клонирование гена, детерминирующего - синтез стафилококкового лизоцима, и передача его представителям нормальной микрофлоры человека, например лактобациллам, и создаше таким образом новых видов пробиотнков. В настоящее время существуют единичные работы по клонированию гена стафилококкового лизоцима и лизостафина в клетках Б. coli, характеризующихся слабым уровнем экспрессии этих генов. Практически отсутствуют данные о клонировании и экспрессии генов стафилококкового лизоцима и лизостафина в других видах бактерий (сенной палочке, лактобащилах), поэтому данное направление в генетике стафилококков является актуальным и перспективным.

ЦЕЛИ РАБОТЫ - клонирование гена, кодирующего синтез лнзощша Staphylococcus aureus, и гена, кодирующего синтез лшостафина Staphylococcus simulans, и изучение экспрессии клонированных генов в гегерологичных хозяевах,

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1) изучение коллекции штаммов Staphylococcus aureus с целью выявления штаммов с наибольшей лизоцимной и лизостафииовой активностями;

2) создание геномной библиотеки (банка генов) Staphylococcus aureus tt Staphylococcus simulans при помощи вектора pLF]4 в клетках Bacillus subtilis AJ73;

3) отбор рскомбкнантных клонов с лнзоцимкой и лизостафииовой активностями на специально разработанных селективных средах, выделение рекомбинантных шшмид, содержащих вставки стафилококковых генов, кодирующих спита лизоцима и лизостафина соответственно;

4) перенос гена лизоцима S. aureus, клонированного в клетках В. subtilis в составе вектора pLFu. в клетки Lactobacillus fennentum методом электропорации и создание потенциального штамм а-продуцента стафилококкового лизоцима;

5) разработка тест-системы на основе ПЦР для идентификации лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов стафилококков.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в качестве реципиента для клонирования генов стафилококкового лизоцима (ЛПФ) и лизостафина был использован нротеазодефицитный мушгг В. subtilis AJ73.

Показано, что гены, кодирующие сшггез лизоцима и лизостафина стафилококков, стабильно наследуются в клетках'В. subtilis AJ73 в составе вектора pLFJ4 и экспрессируются. Уровень продукции лизоцима в клетках бацилл в 2,5 раза превышал таковой в исходном штамме S. aureus 118, тогда как уровень продукции лизостафина был сравним с уровнем продукции фермента у исходного родительского штамма S," simulans.

Показана экспрессия гена, кодирующего сшггез лгооцима стафилококков в клетках оггамма Lactobacillus plantamm 8R-A3, не обладающего собственной лизоцимной активностью. Продукция лизоцима в клетках других гибридных штаммов Lactobacillus fermentum 90Т-С4 и L. fermentum 81Т-В5, характеризующихся различным уровнем собственной лизоцимной активности, превышала исходный уровень продукции фермента.

Впервые получены гибридные штаммы лактобацилл, несущие ген, кодирующий синтез стафилококкового лизоцима, наряду с повышенным уровнем лизоцимообразования, обладали также повышенной антагонистической активностью по сравнению с родительскими штаммами, особенно в отношении клеток золотистого стафилококка и кишечной палочки. Гибридные штаммы лактобацилл подавляли рост практически всех клинических изолятов S. aureus.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В настоящее время активно разрабатываются новые виды пробиотнков, включающие в себя генноинженерные штаммы сенной палочки, дрожжей, лактобацилл, кшпечной палочки. Сконструированные нами штаммы лактобацилл и сенной палочки, обладающие повышенным уровнем лизоцимообразования и антагонистической активностью против условно патогенных бактерий, могут быть рекомендованы в качестве потенциальных штаммов для создания высокоэффективных пробиотиков.

Сконструированы штаммы B.subtilis, стабильно наследующие ген, кодирующий синтез лизоцима и лизостафина стафилококков и характеризующиеся повышенным уровнем его продукции, которые могут быть использованы для промышленного получения фермента.

Разработана тест-система на основе ПЦР для идентификации и выявления лизоиимактивных штаммов золотистого стафилококка среди

■ клинических изолятов, выделенных от - больных, а также из окружающей среды (смывы с медицинских инструметов, мебели, белья, медицинской одежда в поликлиниках, больницах и роддомах). По сравнению с более трудоемкими, требующими больших затрат времени и средств традиционными-чашечными методами определения лизоцнмной активности, разработанная ПЦР-тест-система.'значительно ускоряет и упрощает процедуру отбора люоцимактивиых штаммов стафилококков.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертационной работы • доложены на III международной конференции по восстановительной медицине (Москва, 2000г.) и на II Российской конференции молодых ученых с международным участием "Фундаментальные . науки и прогресс клинической медицины" (Москва, 2001г,). Диссертация апробирована па конференции отдела молекулярной биологин и генетики НИИЭМ им. Н,Ф,Гамалеи РАМН 10 апреля 2003 г.

ПУБЛИКАЦИИ. Результаты исследований представлены в 3-х публикациях,

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ, Работа изложена иа 139 страницах, иллюстрирована 9 таблицами, 16 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, выводов и списка литературы (104 отечественных и 108 зарубежных источников).

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии патогенных бактерий и лаборатории генетики вирулентности бактерий. Специфические праймеры для тест-системы на основе ПЦР синтезированы научным сотрудником лаборатории генной инженерии Аляпкиной Ю.С. Эксперименты по трансформации и электропорацин компетентных клеток Bacillus subtilis AJ73 и различных штаммов l^actobacillus feimentum сконструированными нами цлазмидами выполнены совместно с ведущим научным сотрудником ВНИИ генетнки и селекции промышленных микроорганизмов Шевелевым А.Б. и старшим научным сотрудником лаборатории химии белка этого же института Константиновой Г.Е. Клонирующий вектор pLF|4, а также праймеры, фланкирующие область полилинкера в векторе, предоставлены вышеуказанными сотрудниками ВНИИ генетнки и селекции промышленных микроорганизмов.

МАТЕРИАЛЫ А МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы, Лнзостафинактивный штамм S. simulans RN3239 был получен от старшего научного сотрудника лаборатории стафилококковой

инфекции ТУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН Дмитренко О.А< Протеазодефицигны й мутант В, subtil is AJ73 получен от ведущего научного сотрудника лаборатории химии белка ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов Шевелева А Б., и два штамма лактобацилл (Lactobacillus fermentum 81Т-В5 и Lactobacillus planlarum 8R-: A3) получены от старшего научного сотрудника этой же лаборатории Константиновой Г.Е. Производственный пгтамм Lactobacillus, '.fermentum 9GT-C4 получен от руководителя лаборатории генетики вирулентности бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАКШ БовдаренкоВ.М.

В работе использованы 150 клинических штаммов-'золотистого стафилококка Большая часть штаммов была выделена от детей, находящихся на лечении в городской клинической больнице "№12 г. Казани и детской городской поликлиники №121 г. Москвы, и была предоставлена в наше распоряжение старшим научным сотрудником лаборатории генетики вирулентности бактерий Коноваловой Г.Н.

Среды. Для выращивания бактериальных культур использовали мясопептокный агар (МПА) или бульон (МПБ) производства ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва), Nutrient- агар и минимальный агар Дейвиса ("Difco", США), жидкие среды MR5-1, MRS-4 и MRS-5 (производство ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).

В генетических экспериментах использовали L-arap и L-бульон (Миллер, 1976). Для селекции рекомбинантных клонов Bacillus sutrtilis в среду выращивания добавляли X-Gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-£Н> галактопиранозвд), что позволяет отбирать клоны рекомбинантов, содержащие клонирующий вектор pLF^ со вставкой чужеродной стафилококковой ДНК, отличающиеся по цвету от нерекомбинантных клонов. Данный реактив и ферменты для клонирования входят в состав набора для клонирования «DNA cloning Kit#13U» (производство фирмы "Fermentas", Литва).

Использованные методики. Основными методами исследования являлись микробиологические метода - метод прямого и отсроченного атагонизма, качественные и количественные методы определения лнзошшной и лизостафиновой активностей с использованием соответствующих индикаторных штаммов (Micrococcus luteus var. lysodeifcticus. Staphylococcus aureus 59).

В работе также использовали молехулярно-генетические метода — выделение хромосомной и плазмидной ДНК, трансформация компетентных клеток В. subtilis, электропорация компетентных клеток L. fermentum, цитирование хромосомной и векторной ДНК с ДНК-лигазой фага Т4, рестрикция хромосомной и гшазмидной ДНК рестриктазами Sau ЗА. Bam HI, электрофорез в агарозном геле с трис-ацетатным буфером и бромистым этидием, очистка и элюирование фрагментов ДНК из

агарганого геля .с помощью системы DNA Extraction Kit „КО 513 ("Fermentas", Литва) и в соответствии с описанными в руководствах по молекулярной биологии рекомендациями (Bimboim, Doly, 1979; Маниаггис, 1989;. Дэвис, 1990). Подбор специфических праймеров для проведения ГТЦР- осуществляли при использовании компьютерных программ "Oligo" и "DNASIS". Синтез праймеров осуществляли фосфоамидНым методом на генсингезагторе "AS M-I02 Syniesize Biosset LTD Cö" (Новосибирск) в ГУ 1ШИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Лизоцимная активность клинических изолятов S.aureus и лизостаФяиовая активность S.simulans.

150 клинических штаммов S. aureus, полученных из лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и выделенных от больных с различными инфекционными заболеваниями, были подразделены на 4 группы по локализации инфекционного процесса. У исследуемых штаммов S. aureus изучали лизоцнмную активность, которая наглядно выражалась в образовании зон просветления (лизиса) индикаторного штамма М. lysodeiktieus 2669 на чашках с агаризованнон средой, содержащей газон живой выращенной в течение суток культурой микрококка или взвесь убитого автоклав иров аиие м или высушенного в ацетоне порошка этого микроорганизма. Лизоцимная активность была обнаружена только в двух группах клинических изолятов золотистого стафилококка, выделенных у больных с инфекциями верхних дыхательных или мочевы водящих путей (соответственно 46,6% и 38,8%). Лишь единичные штаммы, выделенные от больных с кишечной инфекцией, обладали лнзоцимной активностью. У штаммов S. aureus, образующих контрольную группу и выделенных с поверхности кожи или нз фекалий клинически здоровых людей, лизоцимная активность отсутствовала. Таким образом, среди 150 штаммов было выявлено 42 штамма (28%), обладающих лнзоцимной активностью, причем почти все они были выделены от больных с инфекциями мочевы водящих или eepximx дыхательных путей (табл. 1).

Изучение продукции лизоцима этими штаммами при помощи количественного (фотометрического) метода покато, что наибольшее количество выделяемого лизоцима наблюдалось у 6-ти штаммов S, aureus, выделенных от урологических больных и у 3-х штаммов, выделенных от больных с инфекцией верхних дыхательных путей. Самым люоцимактивным среди них оказался штамм S, aureus 118, клетки которого образовывали до 9,0 мкг/мл лизоцима при выращивании культуры в течение 24 час. в МПБ при t=37°C и рН=7,5. Этот штамм и был выбран нами в качестве донора для последующего клонирования гена лизоцима

золотистого стафилококка.

Таблица 1

Частота встречаемости лиэоцнмной активности у клинических штаммов S. aureus

№№ группы Штаммы, изолированные при воспал итель пых процессах Кол-во изученных штаммов %% Количество нзолятов, лидирующих клеточную стенку М. lysodeiktieus

абс. %%

I Верхних дыхательных путей 30 20 . И 46,6

И Мочевыводящих путей 72 48 28 - 38,8

III кишечника 28 18 1 4,5

IV контрольные 20 14 0

Всего 150 100 42 28,0

JIизостафккактивный штамм S.simulans RN 3239, полученный нами го коллекции лаборатории стафилококковых инфецый НИГОМ им. Н.Ф. Гамалеи, был выделен Novick R.P. в 1967 году on урологического больного и подавлял рост практически всех клинических нзолятов S,aureus. Количественный метод определения лизостафиновой активности практически ничем не отличался от соответствующей методики определения лизоцимной активности у стафилококков за тем лишь исключением, что в качестве индикаторного тест-штамма использовался не микрококк, a S. aureus 59, Лизостафинактивный штамм S.simulans RN 3239 также был выбран нами в качестве донора для последующего клонирования гена лизостафниа,

У отобранных для дальнейшей работы штаммов S.aureus 118 и S.simulans RN 3239 была нзучена антагонистическая активность но отношению к клиническим шолятам различных видов бактерий, полученных из московских городских больниц. Результаты данного исследования показали, что лизостафин S.simulans задерживает рост только стафилококков (как коагулазоположитсл ь н ых так и коагулазоотрицательных) и не действует на другие визы бактерий (клебсисллы, сальмонеллы, иерсинии, кишечную палочку, сенную палочку). Напротив, лгооцимактивный штамм S.aureus 118 задерживает рост только коагулазоотрицательных видов стафилококков (S.epidcrmidis,

S.saprophyticus) и не действует на коагулазоположигсльные виды стафилококка (S.aureus), а также на другие виды бактерий (клебсиеллы, сальмонеллы, иерсннии, сенную палочку), за исключением кишечной палочки, которая была чувствительна к лизоциму S.aureus.

Клонирование гена, дсгеомнннруницего синтез лнзоцима у

S. aureus

Основным этапом этого раздела исследований был выбор векторной системы и реципиента для клонирования гена люоцима S. aureus.

В качестве вектора был выбран одпорепликонный многокопийный челночный векгор pLFn. созданный на основе природного репликона Lactobacillus fermcntum 1311 и ранее хорошо зарекомендовавший себя для высокоэффективной экспрессии генов в Bacillus subtilis (Шевелев А.Б., 2000) (рис.1).

Рисунок 1

Схематическое изображение вектора pLFt4 и структура клоннрующс-экспреесируютей единицы вектора pLFu.

ta» ¿«иг)

fe&ill

tí сайтов S** рестрик-

-raj

адвдг

Sua íbil*. fliíl Ш »"I im

xaiWtr

«fj«- Tup(c„n.

ц-

lW(fa<I

wsael pie/яв Ht|> 17 tp

ОФотначсння; □ - праймеры, синтемроминые к определенным оАяястям вектора. Данная пар* правмер«в фланкирует область полнлннжер* »re-гора pLF,4 и позволяет определить размер вставки Sau3\-5nu3A фрагмента чужеродной хромосомной ДНК при клонкрованнн по Ват ИI сайгу.

Преимуществами этого вектора по сравнению с другими челночными векторами является то, что он сочетает мультикопийность (до 200 копий на клетку) с высокой стабильностью в клетках хозяев. Особенностью этого вектора является то, что он маркирован геном устойчивости К хлорамфениколу (ген caí), содержит два сильных промотора (рКап, pBt) и нолилинкер, включающий сайты для 11

рестриктш. Соавтором данной работы, Шевелевым A.B., были также-синтезированы праймеры, фланкирующие область этого полилинкера, которые позволяли определять размер вставки фрагмента чужеродной стафилококковой ДНК в полилинкер этого вектора. Вектор pLF» способен включать вставки 'гужеродной хромосомной ДНК размером до 15 т.гт.н. и при этом стабильно наследоваться в клетках хозяев.

В качестве реципиента для клонирования был выбран протеазодефицитный бесплазмидный мутантный штамм Bacillus subtil is AJ73, который был сконструирован на основе природного штамма Bacillus subtiHs 168, выделенного ю окружающей среды (Jomantas J.V., Torban Е.В., Rumer LM, 1989). Важной особенностью Bacillus subtilis AJ73 является способность выделять большое количество синтезируемых ею чужеродных белков в культуральную жидкость без разрушения за счет отсутствия протеазной активности. Нами было проведено тестирование штамма Bacillus subtilis AJ73 на лизоцимную активность при помощи используемых чашечных методов и показано ее отсутствие, что позволяло использовать данный штамм в качестве реципиента для последующего клонирования геналгооцима S.aureus 118,

В качестве донора был использован отобранный вами ранее штамм S.aureus 118, обладающий наибольшей лизоцимной активностью (9 мкг/мл) среди других исследованных клинических изолятов. Клонирование генов лшоцима осуществляли по представленной схеме (рис. 2).

Для создания банка генов хромосомную ДНК S. aureus 118 частично расщепляли при помощи мелкощепящей рестрикгазы Bsp 143 (изошизомер Sau ЗА), После этого методом препаративного электрофореза в 1% агаротиом геле были получены фракции фрагментов хромосомной ДНК S. aureus от 1 т.п.н. до 15 т.п.н. Очищенные фрагменты размером от наименьших до 8 т.п.н. элюировали го агарозного геля и лигировали с линеаризованной по сайту BamHI ДНК вектора pLFjj Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Bacillus subtilis A J 73 по методу Спицайзена (1987). При скрининге 2000 хлорам фени кол устойчивых клонов, полученных после трансформации и образующих геномную библиотеку S. aureus 118, на способность продуцировать лизоцим удалось выявить несколько клонов, которые давали зоны лизиса индикаторного штамма микрококка на диагностических средах и соответственно обладали лизоцимной активностью. Из трех лизоцимактивных клонов были выделены рекомбинантные плазмиды, обозначенные pLFm.yi+i» pLFHLyi,+2, pLF^^ (рис.3).

Рисунок 2

Схема клонирования гена, кодирующего синтез .шзоцима в, аигеш 118.

Вектор

рВТ

про ¿¡мер В$1

вил&из Н3 Л Частичная реет-

£ ВНК-/шго$а дзога Та Трон с срорма и и я Хлетек В.зиГиеа АЗ 73.

{.0т5ор хгааиоб с пла*мидани несущими гены лиз&цина £вя-КЛОНЫ 7гй5 путж айве нос-

тическиг средах, ыЭержаших индикаторный и>гапг*М{&д ОечЛисиь ц/26$9. у

^ПЦРепро йперана £$Т и взЕ, Фланкирующими яолшмкеЬ и $В~пее*сдо6от+льнасть и

АТ& *и чуяеецаЬняй стаЬильхекго. - В&рЦЗ 5 а ем Тар ^

^ гк> Ват Н1 сайту.

5таI

" РегонЪинантнъш £ехтор

ЗиЭеленныч <14 /Ш^оцип-снг клона в. ВивИСсй.

Обозначения. Двойной линией обозначена векторная часть плазмшы рЬр!4, треугольником - полнлшнеер рЫ'т тонкой линией - область, к которин синтезированы п рай меры.

С целью определения размеров вставок в сконструированных нами рекомбинангных плазм идах была осуществлена ГТЦР с соответствующими олигонуклеотиднымн праймерамн, фланкирующими полилинкер в векторной плазмиде рЬР^. Анализ продуктов ПЦР, проведенной на ДНК трех клонов В. БиЫШЧ, содержащих рекомбннантные илазмиды ри^/Ч: рЬБмьуг+з, показал, что вставки стафилококковой ДНК в них

различны и имеют следующие размеры: 1,2 т.п.н., 1,5 т.п.н. и более 1,5 т.п.н. соответственно (рис. 4).

Рис.4. Электрофореграмма

продуктов ПЦР с" праймерами, фланкирующими область полилинкер! в векторе pLFw.

Дорожки: 2- вектор pLF^,

3 - pLF|4Lyr»3t

4 - pLFl4LjTf2t

5- pLFuLjyu,

6 - маркер

PhcJ. . Электрофореграмма плаз м иди ых ДНК, выделенных из рекамбннантиых кланов В. »ubtitts.

Дорожки:

1 - маркер,

2 - pLFj4 (вектор), 3- pLFuLiT+b

4 - pLFnLn+й

5 - pUl4Lj»Ji

Было показано, что отобранные клоны обладали различными уровнями лизоцимной активности. При этом лизошшная активность рекомбинантных клопов выявлялась в условиях, оптимальных для экспрессии чужеродных белков в штамме B subtilis AJ73, то есть при инкубации культур при t= 30°С и рН 5,5. Так, л изоцим активный клон В. subtilis с плазмидон pLF]4Lyz+3, содержащей вставку размером 2,5 т.п.н., образовывал зону лизиса индикаторного штамма микрококка диаметром до 17 мм, клопы с плаз мидами pLFniyiu и pLFuLyi+i, содержащими вставки стафилококковой ДНК меньшего размера (1,2 т.п.н. и 1,5 т.п.н.), образовывали зоны лизиса диаметром от 3,5 до 7 мм. Исходный л изо ци мактивны й донорныи штамм S. aureus 1 ] 8 образовывал зону лизиса микрококка на той же диагностической среде диаметром не более 7,5 мм, но при Г=37°С и рН 7,5 (рис. 5). Таким образом, можно заключить, что различия в уровнях . лизоцимной активности полученных клопов свидетельствуют о том, что экспрессия клонированных генов в них вдет с собственных промоторов, а не с промотора вектора, условия же экспрессии зависят от реципиентного штамма. Продукция лизоцима, определяемая по зонам лизиса индикаторного штамма, в одном из подученных клонов значительно превышает продукцию последнего в исходном штамме, а продукция в двух других - меньше или приблизительно соответствует продукции лизоцимактивного природного

штамма S.. aureus 118 (рис. 5). Продукция, бактериального стафилококкового люоцима рекомбинантным клоном В. . subtilis, обладающим наибольшей лизоцимной активностью, содержащим плазмвду pLFi4Lyi+3> была определена фотометрически при выращивании клеток в L-бульонс в течение 3 суток при i=30°C, рН 5,5, и составила 20,5 мкг/мл. Исходный люоцимактивный штамм S.. aureus продуцировал лизоцнм при температуре 37°С, рН 7,5 в количестве 9 мкг/мл. Таким образом, рекомбинанткый лизоцимактивный клон сешюй палочки, содержащий плазмиду pLFj4Lyi+s со вставкой стафилококковой ДНК (2,5 т,п.н.), по лизоцимной активности в 2,5 раза превысил исходный природный штамм S. aureus 118. Продукцию лизоцима в "клетках В. subtilis наблюдали при температуре 30°С3 рН 5,5, то есть в условиях, оптимальных для экспрессии генов в данном реципиенте, тогда как клетки S. aureus 118. оптимально продуцировали лизоцим при температуре 37°С, рН 7,5 (рис. 6,

7).

Рисунок 5

Зоны лизиса индикаторного штамма М, 1у$ойс1к11си$, образуемые лизонимактивнымн рсклмбинаншыми клонами В. при

условиях:

а) Ь-агар, (=30°С, рН=5,5,3 суток;

б) Ь-агар, 1=3 7°С, рН=7,5, 3 суток.

1 - клон В, $ub(ilis с pLFuLrt+i, 2 - клон Й. subtilis, с рЬРнитти.З- клип В. subtil», с pLFuLjift,4 ~ S. aureus 118,5 - В. subtilis Л J73, 6 - В. subtilis, с pLFu-

Рисунок б

Зоны лизиса порошка индикаторного штамма M. lysodeikticiis 2669, образуемые рекомбннантнммн лнзоннмэктивнымн клонами В. subtilts при 1=30°С, рН=5,5,

а) В, subtilb с pLFhlju-j.

б) & subtil» с pLFuLrr«!.

в) В. subtilb с pLFnb,Tf].

Рисунок 7

Зоны лнзаса порошка индикаторного штамма M. lysodcikticus 2669, образуемые лизоцимактивным рекомбинзнтным клоном В. subtilis pLFi4„+3 и исходным штаммом S. aureus 11$ при условиях:

1) t=30°C,pH=5r5f3cyT.;

2) t=37°C, pH=7,S, I сут.

а) В. subtiiis AJ73 (контроль)

б) клан В. subtil», содержащий плазмнду pLFuljt+j.

в) S. aureus IIS (контроль)

В настоящее время ген лшоцима золотистого стафилококка S. aureus полностью секвенирован и имеет длину 1446 н.п. Результаты данных исследований показали, что вставки фрагментов чужеродной стафилококковой хромосомной ДНК в рекомбинантных плазмидах pLFMLyz+1, pLFmlyttb pLFmlm+j, выделенных нами из лизоцимактивных клонов В, subtilis AJ73 соизмеримы с размером гена лизоцкма S. aureus. Поэтому можно заключить, что нам удалось полностью клонировать ген лшоцима в клетках В. subtilis AJ73.

Для изучения стабильности ллазмиды pLF|4Lytn в клетках В. subtilis была осуществлена повторная передача данной плазмиды в клетки В. subtilis методом трансформации. Около 1000 проверенных клонов В. subtilis, полученных после трансформации данной штазмидой, также обладали высокой лизоцимной активностью при условиях, создающих наибольшую экспрессию клонированного гена лизоцима S.aureus в данном реципиенте. Результаты эксперимента показали, что плазмида pLFuLyi+з, содержащая ген лизоцима S.aureus 118, стабильно наследуется в клетках В. subtilis после десяти последовательных пассажей.

Клоннроваиис гена, кодирующего синтез лизостафина

S, simulans RN 3239.

В качестве донора для клонирования гена лизостафина был использован штамм S. simulans RN 3239, который был получен id коллекции лаборатории стафилококковых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф, ГамалеиРАМН. Клетки этого штамма обладали относительно высокой продукцией лизостафина (до 9 мкг/мл), которая феногипически выражалась в способности лизировать клеточную сгенку индикаторного штамма S. aureus 59. В качестве реципиента и вектора для клонирования также использовали штамм. B.subtilis AJ73 и вскгор pLFu. Все основные этапы клонирования гена лшостафина S. simulans RN 3239 в принципе ничем не отличались от экспериментов по клонированию гена лизоЕщма S. aureus 118 за исключением того, что при поиске лизосгафинакгнвных клонов среди рекомбинантных в качестве индикаторного штамма использовали не микрококк, a S. aureus 59 (рис.2).

Клонирование гена, кодирующего лизостафин, было осуществлено с помощью скрининга геномного банка S. simulans RN 3239 в клетках В. subtilis AJ73 методом чашечного функционального теста на лизостафиновую активность с использованием взвеси убитого автоклавированием индикаторного штамма S. aureus 59. При проверке около 2000 клонов В. subtilis, выросших после трансформации, удалось выявить всего один клон, который образовывал зону лизиса индикаторного штамма S. aureus 59 на соответствующей среде н следовательно обладал лизостафиновой активностью (рис. 8).

Рисунок 8

Зоны лнзнса индикаторного штамма S. aureus 59, образуемые рскомбивянтным лнзостафннактнвным клопом В. subtilis при условиях: . -

1) |-J0°C, рН=5,5,Зсут.

2) t=37°Ct рН=7»5-7,8,1 сут.

а - В, subtilis AJ73 (контроль),

б - В. subtilis, с рекомбинанпюй плазмндой pLF^^»*, в - S, simulaos RN3239 (контроль).

Количественная фотометрическая проверка лизостафшювой активности клона В. subtilis, содержащего плазмиду, обозначенную pLF]4Lyif+i, показала, что он обладает примерно таким же уровнем продукции лизостафина, как и исходный природный штамм S. simulans RN 3239 (9 мкг/мл). Также как и в случае лизоцим активных клонов, продукция лизостафина рекомбинантным клоном В. subtilis наблюдалась при условиях, оптимальных для экспрессии чужеродных генов в клетках бацилл, то есть инкубации культуры в течение 3-х суток при t=30°C и рН 5,5, тогда как природный штамм-пр оду цент S. simulans RN 3239 образовывал лизостафин при других условиях (t= 37°С, рН 7,5, сутки инкубации).

Результаты гсль-элекгрофореза плазмидной ДНК, выделенной из этого клона, и сравнение ее размера с соответствующими маркерами ДНК, имеющими широкий набор фрагментов от 1 до 10 т.н.н. (маркер Gene Ruler 1 кв DNA Ladder производства фирмы "Fermentas") и плазмндамн, выделенными из лнзоцимакгивных клонов, показали, что плазмида pLF^Lvif+i имеет достаточно большую вставку, размером более 4,5 т.п.н. Выявить наличие такой большой вставки в плазмиде методом ПЦР не представлялось возможным, поэтому судить о размере вегавки стафилококковой ДНК в рекомбинаптной плазмиде pLF^tyrf+i мы могли только по результатам гель-электрофореза (рис. 9).

, Рисунок 9

Электрофореграмма плазмндных ДНК, выделенных из рекомбнаантных клонов В.зиЬШк, полученных в результате клонирования гена лнзоцнма аиге«8'118 н лазостафнна 8, 5шш1ап$ КК3239.

1,9 - маркер Gene Ruler 1 кв DNA Ladder 3,11-pLFu

4 - pLFwLjr+i

5 - PLFhljtj

6 - pLFi4LjitJ 12 - pLF]4LMfM>

В настоящее время ген лнзостафина S. simulans клонирован в клетках Е. coli, полностью секвенирован и имеет длину 1825 н,н. Результаты наших исследований показали, что вставка фрагмента чужеродной стафилококковой ДНК в рекомбинантной плазмиде pLF]4Lyif+i была не только соизмерима, но и намного больше размера гена лнзостафина S. simulans RN 3239 (более 4500 н.п.). Это свидетельствует о том, что рекомбинантная плазмида действительно полностью содержит ген лнзостафина S, simulans RN 3239 в составе вектора pLFn в клетках В. subtilis. По-видимому, и в этом случае экспрессия клонированного гена лнзостафина S. simulans RN 3239 осуществляется под контролем собственных промоторов, и условия экспрессии (темперэтура, pH и время инкубации) зависят от штамма реципиента.

В заключение можно сказать, что в результате проведенных исследований были клонированы гены лизощтма S. aureus 118 и лизостафняа S. simulans RN 3239, и показана их экспрессия в клетках В. subtilis. У одного из полученных нами рекомбннантного лизоцимактивного штамма уровень продукции лизоцима в 2,5 раза превысил продукцию этого фермента у исходного природного родительского штамма.

Конструирование лнчоцимак-гввних штаммов Lactobacillus fermentum.

В настоящее время активно разрабатывают новые виды пробиотиков, которые широко используются для лечения и профилактики днебактериозов и содержат живые культуры бактерий, входящие в состав нормальной (индигенной) микрофлоры человека. Чаще всего в состав пробиотиков входят различные культуры лактобацилл, бифидобактерий. Для создания штаммов " лактобацилл, обладающих лизоцимной активностью, был предпринят следующий этап работы.

Для выполнения этой .задачи были отобраны три штамма лактобацилл, два из которых обладали природной естественной лизоцимной активностью различного уровня (L. fermentum 90Т-С4 и L, fermentum 8IT-B5), и один не, обладал естественной лизоцимной активностью (L. piantarum 8R-A3). Лизоцимпая активность штамма L. fermentum 81Т-В5 была примерно того же уровня, что я у S. aureus 118 (около 9 мкг/мл), а штамм L. fermentum 90Т-С4 обладал довольно высоким уровнем лгооцимной активности (более 9 мкг/мл), что соответствовало данным литературы (Лещнер A.A., 1987).

При передаче методом электропорацин рекомбинантной цлазмиды pLFn^T+j в клетки этих трех штаммов удалось подучить клоны, по уровню лизоцимной активности превышающие исходные штаммы-реципиенты. Наличие гибридной плазмиды pLF^Lyz+j с геном лизоцима S. aureus 118 в клетках лактобацилл было подтверждено положительными результатами ПЦР, проведенной с праймерами, фланкирующими область полилинкера в векторе рЦ?м, Особенно важно отметить, что клетки нелизоцимактивного штамма L. fermentum 20R-A3 после передачи им плазмиды рЬЕн^з приобретали способность продущфовагь лизоцим на том же уровне, который наблюдался у исходного штамма S, aureus 118 (до 9 мкг/мл) (рис. 10), а в клетках лизоцимактивных штаммов L. fermentum 90Т-С4 и L, fermentum 81Т-В5 с плазм идо и pLFuLy^j уровень лизоцимной активности увеличивался почти в 2,5 раза (рис. 11, 12). Таким образом, на примере штамма L. piantarum 8R-A3 показано, что ген, кодирующий лизоцимную активность стафилококков может экспрессироваться и в клетках лактобацилл и, более того, возможен кумулятивный эффект экспрессии генов лизоцима стафилококков и лактобацилл. В отличие от B.subtlis оптимальные условия экспрессии гена лизоцима S. aureus в лактобациллах совпадают с физиологическими условиями, существующими в желудочно-кишечном тракте человека (t=37°C, рН=6,8). Именно это и позволяет нам предлагать сконструированные гибридные штаммы лактобацилл в качестве потенциальных пробиотиков, которые могут быть использованы в медицине для лечения и профилактики дизбактериозов. В дальнейшем целесообразно было бы продолжить исследования с целью внедрения фрагмента гибридной плазмиды pLF»^«« в хромосому лактобацылл.

Рисунок 10. Зоны люкса порошке индикаторного штамм* М. (узойеЕМкиз, образуемы« клетками гибридного штамма Ь. ¡сгтепШт 2011-ЛЗ с плазм ндой рЫчл*^ при инкубации в течение суток при рН=б,7:

а)Ь,1егтеп 1и тЗОИ-АЗ (контроль),

б)1Леппетит20К-АЗ с рЦРм!,»*»

Рисунок II. Зоны лнзиса порошка индикаторного шгамма М. 1ум(1е1Ьнси«, образуемые клетками гибридного штамма Ь. Геггаео(ит 90Т-С4 с плазмилой рЦ^ут^ при инкубации в течение 3-х суток при (=37*0; рИ"=б,7:

а)Ь.Гегтеп(иш9ПТ-С4 (контроль);

б)Ь.Гегтеп(ит 90Т-С4 с

Рнсупок 12

Золы лизиса порошка индикаторного штамма М. (уво^^к^ш, образуемые клетками гибридного штамма Ь. ГегтепШт 81Т-В5 с плазмндой рЬКн^+з при инкубации в течение 3-х суток при 1=37"С, рН=6,7:

а) Ь. СегтепСиш 81Т-В5 (контроль);

б) Ь. Гегтепшш 81Т-В5 с плазмилой

Как указывалось выше, штамм L. fermentum JIB 290 был создан на основе наиболее лизоцимактивного штамма L. fermentum 90Т-С4. Далее нами была изучена антагонистическая активность рекомбинангного штамма L. fermentum ЛВ 290 и исходного штамма L. fermentum 90Т-С4.

Для этого были .использованы б индикаторных тест-штаммов, полученных в ГИСК им. JÏ.A. Тарасевнча: Shigella flexneri 337, Shigella sonnei-2802, S. aureus «Ф», Proteus vulgans 177, E. coli 026 B6 №157, Proteus mirabilis 1^73. Антагонистическую активность рекомбинантного штамма L. fermentum JIB 290 и исходного штамма L, fermentum 90T-C4, используемого в качестве котттроля но отношению к вышеуказанным шести тест-штаммам, определяли при помощи метода отсроченного антагонизма. Результаты данных исследовании показали, что рекомбинантный штамм L. fermentum JIB 290, обладающий высоким уровнем лизоцимобразования, был более антагонистически активен по сравнению с контрольным штаммом L. fermentum 90Т-С4, особенно относительно E', coli и S. aureus, поскольку зоны угнетения роста этих штаммов рекомбинанптым штаммом были намного больше, чем у исходного контрольного штамма (табл. 2),

Таблица 2

Антагонистнчсская активность рекомбинантного штамма L.

fermentum JIB 290 относительно индикаторных тест-штаммов условно-патогенных бактерий в тесте отсроченного антагонизма.

J* Индикаторные тсст-штаммы условно-пагогеныых бактерий Ингибнцня индикаторных условно-патогенных тест-штаммов лактобацилламн (диаметр зон лизиса, мм)

L. fermentum 90Т-С4 (контроль) L. fermentum ЛВ 290 (оиьтг)

I Escherichia coli 026 В6 № 157 30+3,5 60±2,2

2 Staphylococcus aureus "Ф" 28±3,2 58,5±2,2

3 Shigella sonnei 2802 28+1,7 56,5+3,2

4 Shigella flcxneri 337 27±1,1 54,5 ±6,0

5 Proteus vulgaris 177 25±3,2 40,5 ±2,3

6 Proteus mirabilis 1^37 25±3,2 40,7+2,2

Далее были проведены исследования по изучению антагонистической активности рекомбинантного штамма L, fermentum JIB 290 и игтамма L, fermentum 90Т-С4 относительно 130 клинических изолятов S. aureus, которые ранее были исследованы нами на лизоцимную активность. Все 130 штаммов S. aureus были выделены у детей раннего возраста с гнойно-

воспалительными заболеваниями респираторного и урогегагтального трактов, причем 42. из них обладали лизоцимной активностью. Данный эксперимент проводили также при помощи чашечного метода отсроченного антагонизма, при t=37°C в течение 3 суток инкубации на среде MRS-5.

Результаты экспериментов показали, что промышленный штамм-пробиотик L. fermentum 90Т-С4, обладающий повышенным уровнем лизоцимобразовання, и рекомбинантный штамм L. fermentum ЛВ 290, превышающий его по уровню продукции лшоцима в 2,5 раза, задерживали рост практически всех 130 штаммов S. aureus (как лнзоцимактивных, так и нелизоцимактивных), однако зоны угнетения роста стафилококка у рекомбинантного штамма лактобацилл были значительно больше по сравнению с природным штаммом. .

Таким образом, было показано, что сконструированные штаммы лактобацилл, наряду с повышенным уровнем лизоцимобрззовшшя по сравнению с исходными родительскими штаммами, обладали и повышенной антагонистической активностью, особенно против золотистого стафилококка и кишечной палочки. Полученные гибридные штаммы лактобацилл подавляли рост практически всех клинических изоляточ S. aureus. Использование полученных гибридных штаммов Lactobacillus fermentum, обладающих повышешюй антагонистической активностью, особенно прошв стафилококков, для профилактики н лечения гнойно-воспалительных процессов, вызываемых стафилококками, является целесообразным и противопоказаний не имеет.

В заключение следует подчеркнуть, что созданные гибридные штаммы лактобацилл выгодно и рационально сочетают в себе полезные бактерицидные свойства бактериального лгооцима и иммуностимулирующие свойства лактобацилл, что позволяет предложить их для создания высокоэффективных пробиотиков, особенно при последующем внедрении клонированных генов из векторных плаз мил в хромосому данных микроорганизмов.

Выявление гена IvtA, колирующего синтез лнзоцима в клетках

S. aureus с помощью полнмеразной цепной реакции.

За время выполнения работы в литературе были опубликованы данные о нуклеотшшой последовательности гена fyt А, детерминирующего синтез лизоцима у S. aureus. Поэтому с целью идентификации клонированного нами фрагмента хромосомы S. aureus, а также с целью идентификации лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка нами были подобраны праймеры, позволяющие с помощью ГПДР выявлять ген lyt А в клетках стафилококков. Для проверки специфичности выбранных праймер<"в были исследованы геномные ДЬПС различных

штаммов S. aureus к штамма H.coli К12 JM109, клетки которого не обладают лизоцимной активностью. Как следует из полученных результатов, специфичный продукт пояимеразнон реакции (амплнкон) регистрировали при постановке ПЦР только с лизоцимакгивиыми штаммами S. aureus и не регистрировали в случае - штаммов S. aureus, лизоцимная активность которых не выявлялась и при использовании чашечных функциональных тестов с индикаторным штаммом микрококка. Таким образом, результаты ПЦР совпадали с результатами чашечных методов (рис, 13). Наличие положительного ответа в ПЦР с геномной ДНК штамма S. aureus 118 свидетельствует о том, что клетки этого штамма содержат ген lyt Л и поэтому можно считать, что клонированные нами фрагменты стафилококковой ДНК также содержат этот ген.

Рисунок 13

Электрофореграмма продуктов ПЦР, проведенной на геномной ДНК клинических изолятов S. aureus, с иразмерами к гену lyt A S.

aureus.

1 - S. aureus 118 (положительный kohtikuh»),

2-Е. coli JM109 («прицательны» кош роль),

3 - S. aureus 114 (лшоинмактнвный).

4 -S. aureus 128 (л нзоцн мактив н ы й),

5 - S. aureus 59 (ислшоцнмактнвный),

6- S. aureus 19 (неянзоии »активный).

Поскольку данные ПЦР по выявлению гена lytA, кодирующего лдаонимнуто активность у стафилококков, совпали с данными по выявлению этой активности более трудоемкими и дорогостоящими чашечными функциональными тестами с использованием индикаторных штаммов микрококка, разработанную тест-систему на основе ПЦР можно рекомендовать для практического использования.

ВЫВОДЫ

1. У 150 клинических штаммов S. aureus изучена лизоцнмная активность с помотью метода отсроченного антагонизма и лизиса убитых ацетоном микробных клеток Micrococcus lutetis var. lysodeikticus. Лизоцнмная активность обнаружена у 42 (28%) изолятор, большинство из которых выделено от больных с инфекцией мочевыводящкх путей.

2. Получены геномные банки S. aureus штамма 118 и S. simulans в реципиентном штамме В. subtilis AJ73.

3. Тестирование лизоцим- и лизостафин активности полученных рекомбинантных клонов В. subtilis в чашечных функциональных тестах с индикаторными штаммами позволило выявить три клона с приобретенной лизоцим активностью и один клон с приобретенной лизостафинактивностыо.

4. Размер вставок ДНК S. aureus и S. simulans в составе клонирующего вектора в выявленных клонах соизмерим с размером генов, кодирующих лизоцим и люоетафин, соответственно.

5. Осуществлена передача гибридной плазмиды, несущей ген синтеза лизоцима в реципиентные штаммы Lactobacillus fermentum и показана экспрессия этого гена в лактобзшшлах.

6. Диаметр зон угнетения роста тест-штаммов (Escherichia сой, Staphylococcus aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis) клетками гибридного штамма Lactobacillus fermentum, несущего плазмиду с геном синтеза лизоцима, превышает диаметр аналогичных зон, образуемых клетками исходного штамма Lactobacillus fermentum, в 2,0 — 2,5 раза.

7. Разработана тест-система на основе ПЦР, позволяющая выявлять фрагменты гена Lyt А в штаммах S. aureus.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Романова Ю.М.. Бопдзренко В.М.. Жаданова Л. В. -Клонирование гена бактериального лизоцима Staphylococcus aureus и его экспрессия в клетках Lactobacillus fermentum 90Т-С4. - В кн.: Материалы Ш Международной конференции по восстановительной медицине (реабилитологяи), Москва, 2000. с.4()7.

2. Жаданова Л. В., Романова Ю.М, Бондарснко В.М. -Конструирование антагонистически активного в отношении клинических изолятов стафилококков штамма Lactobacillus fermentum, продуцирующего люошм. - В кн : Материалы. П Российской конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клшнЕческоЙ медицины», Москва, 2001, с.329,

3, Жаданова Л.В.,. Романова Ю.М., Бондареико В.М., Константинова Г.Е., Шевелев А.Б. - Клонирование генов лшоцима и дизостафина Staphylococcus aureus и их экспрессия в клетках Bacillus subtilis. Журнал микробиол. и эпидемиологии, 2001, №4, с,7-9.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жаданова, Людмила Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Биологическая характеристика и лизоцимная активность различных видов стафилококков.

2. Основные биологические свойства бактериального лизоцима, отличительные особенности бактериального лизоцима по сравнению с яичным, механизм его антимикробного действия и методы выделения.

3Биологическая роль лизоцимного фактора у микроорганизмов и практическое использование лизоцима в медицине.

4. Лизоцимная активность грамположительных микроорганизмов.

5. Факторы межмикробного взаимодействия стафилококков в бактериальном биоценозе.

6. Генетические механизмы контроля факторов межмикробного взаимодействия.

7. Клонирование генов литических ферментов грамположительных бактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клонирование генов, кодирующих синтез лизоцима Staphylococcus aureus и лизостафина Staphylococcus simulans, их экспрессия в гетерологичных хозяевах"

Стафилококки представляют собой большую гетерогенную группу грамположительных микроорганизмов. Они широко распространены в окружающей среде, и некоторые виды являются возбудителями ряда заболеваний человека и животных. В настоящее время все описанные виды стафилококков делятся на две основные группы - коагулазоположительные и коагулазоотрицательные. Самым же известным среди всех коагулазоположительных видов стафилококков является золотистый стафилококк- Staphylococcus aureus, который на протяжении всего XX века был одним из наиболее значимых оппортунистических патогенов в медицинской практике. Основной экологической нишей S. aureus являются апокриновые железы, расположенные в передних отделах носовых ходов человека, а также в подмышечных ямках и паховых складках, что связано с высокой степенью сродства данного вида микроорганизмов к расположенным там эпителиоцитам. Условием для освоения S. aureus данной экологической ниши является способность бактерий противостоять действующим в ней механизмам противоинфекционной резистентности организма хозяина (Дерябин Д.Г., 2000). S. aureus способен вызывать широкий спектр заболеваний - от «малых» кожных инфекций до тяжелых септических состояний с возможным летальным исходом (Grosserode, Wenzel, 1991, Бухарин О.В. и др., 2001).

Золотистый стафилококк характеризуется многообразием факторов патогенности, к которым относятся экзотоксины, факторы адгезии, инвазии и иммунорезистентности. Среди многочисленных экстр ацеллюлярных продуктов стафилококков наибольший интерес представляет бактериолитический лизоцимподобный фермент /ЛПФ/, относящийся к аутолитическим ферментам-гидролазам, и стафилококковый бактериоцин /лизостафин/. Эти два фермента отличаются по механизму действия, спектру и структуре. Если лизоцим стафилококков, представляющий р /1—4/ ацетилглюкозаминидазу, разрывает р /1—4/ глюкозидные связи в полисахаридной составляющей пептидогликана, входящего в состав клеточной стенки, то лизостафин, представляющий глицилглициновый комплекс, воздействует на белки клеточной стенки (Бухарин О.В., Васильев Н.В., Усвяцев В.Я., 1985).

Лизостафин могут синтезировать только стафилококки, а лизоцим является широко распространенным в природе белком, который способны синтезировать не только микроорганизмы, к которым относятся стафилококки, но и высшие организмы. Из всех известных лизоцимов в настоящее время в Латвии налажено промышленное производство только куриного лизоцима из белка куриных яиц. Основное отличие яичного лизоцима от лизоцима бактериального происхождения заключается в том, что несмотря на общий субстрат действия этих ферментов -пептидогликан (муреин) клеточной стенки бактерии - они расщепляют его на различные конечные продукты.

У бактериального лизоцима, по сравнению с яичным, выше степень и шире спектр литического действия. Куриный лизоцим не действует на грамположительные бактерии (в частности стафилококки) в отличие от лизоцима S. aureus, который разрушает клеточные стенки коагулазоотрицательных видов стафилококков (Акатов А.К., Зуева B.C., 1983). Кроме того, микробные лизоцимы в отличие от яичного взаимодействуют с другими группами гидролитических ферментов, что приводит к большему суммарному литическому эффекту (Афанасьева Т.И., Леоненко В.А., 1975). В настоящее время промышленное производство препаратов, содержащих стафилоккокковый лизоцим, лизирующий клеточные стенки грамотрицательных видов стафилококков, не разработано, хотя не вызывает сомнения, что во многих случаях практическое применение микробных ферментов гораздо экономичнее, чем применение яичного лизоцима.

Известно, что резкое снижение уровня эндогенного лизоцима свидетельствует о серьезных дефектах систем регуляции гомеостаза, неблагоприятно отражается на морфогенезе и функционировании иммунной системы организма.

Многие условно-патогенные бактерии могут снижать концентрацию лизоцима за счет продукции ангилизоцимного фактора (Бондаренко В.М., Романова Ю.М., Яблочков А .Я., 1988). Поэтому восполнение дефицита лизоцима является патогенетически вполне оправданным в лечении и профилактике многих заболеваний, в том числе дисбактериозов, тесно взаимосвязанных со вторичными иммунодефицитными состояниями, ослабляющими колонизационную резистентность открытых полостей организма хозяина (Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Г.В., 2003). Разработка нового препарата-пробиотика, в основе которого могут быть молочнокислые бактерии, продуцирующие лизоцим, весьма перспективна и нова.

Что касается другого фермента стафилококкового происхождения — лизостафина, который разрушает как грамотрицательные виды стафилококков, так и грамположительные, то он необходим в генетических исследованиях стафилококков для получения протопластов этих микроорганизмов. Но в настоящее время не существует промышленного производства препаратов, содержащих этот фермент, и работа в данном направлении также является актуальной и перспективной. Особенно эффективным и экономичным было бы создание препарата, содержащего оба вышеуказанных фермента стафилококкового происхождения (лизоцим и лизостафин).

Одним из подходов к решению этой проблемы является i J клонирование гена, детерминирующего синтез стафилококкового лизоцима, и передача его представителям нормальной микрофлоры человека, например лактобациллам, и создание таким образом новых j видов пробиотиков. В настоящее время существуют единичные работы по клонированию гена стафилококкового лизоцима и лизостафина в клетках л

Е. coli, характеризующихся слабым уровнем экспрессии этих генов. Практически отсутствуют данные о клонировании и экспрессии генов стафилококкового лизоцима и лизостафина в других видах бактерий (сенной палочке, лактобациллах), поэтому данное направление в генетике стафилококков является актуальным и перспективным.

Цель работы - клонирование гена, кодирующего синтез лизоцима Staphylococcus aureus, и гена, кодирующего синтез лизостафина Staphylococcus simulans, и изучение экспрессии клонированных генов в гетерологичных хозяевах.

Задачи исследования

1) изучение коллекции штаммов Staphylococcus aureus с целью выявления штаммов с наибольшей лизоцимной и лизостафиновой активностями;

2) создание геномной библиотеки (банка генов) Staphylococcus aureus и Staphylococcus simulans при помощи вектора pLFi4 в клетках Bacillus subtilis AJ73;

3) отбор рекомбинантных клонов с лизоцимной и лизостафиновой активностями на специально разработанных селективных средах, выделение рекомбинантных плазмид, содержащих вставки стафикокковых генов, кодирующих синтез лизоцима и лизостафина соответственно;

4) перенос гена лизоцима S. aureus, клонированного в клетках В. subtilis в составе вектора pLFj^ в клетки Lactobacillus fermentum методом t t электропорации и создание потенциального штамма-продуцента стафилококкового лизоцима;

5) разработка тест-системы на основе ПЦР для идентификации лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов стафилококков.

Научная новизна

Впервые в качестве реципиента для клонирования генов стафилококкового лизоцима (ЛПФ) и лизостафина был использован протеазодефицитный мутант В. subtilis AJ73.

Показано, что гены, кодирующие синтез лизоцима и лизостафина стафилококков, стабильно наследуются в клетках В. subtilis AJ73 в составе вектора pLFi4 и экспрессируются. Уровень продукции лизоцима в клетках бацилл в 2,5 раза превышал такавой в исходном штамме S. aureus 118, тагда как уровень продукции лизостафина был сравним с уровнем продукции фермента у исходного родительского штамма S. simulans.

Показана экспрессия гена, кодирующего синтез лизоцима стафилококков в клетках штамма Lactobacillus plantarum 8R-A3, не обладающего собственной лизоцимной активностью. Продукция лизоцима в клетках других гибридных штаммов Lactobacillus fermentum 90Т-С4 и L. fermentum 81Т-В5, характеризующихся различным уровнем собственной лизоцимной активности, превышала исходный уровень продукции фермента.

Впервые были получены гибридные штаммы лактобацилл, несущие ген, кодирующий синтез стафилококкового лизоцима, которые наряду с повышенным уровнем лизоцимообразования, обладали повышенной антагонистической активностью по сравнению с родительскими штаммами, особенно в отношении клеток золотистого стафилококка и

Гибридные штаммы лактобацилл подавляли рост практически всех клинических изолятов S. aureus.

Практическая значимость работы

В настоящее время активно разрабатываются новые виды пробиотиков, включающие в себя генноинженерные штаммы сенной палочки, дрожжей, лактобацилл, кишечной палочки. Сконструированные нами штаммы лактобацилл и сенной палочки, обладающие повышенным уровнем лизоцимообразования и антагонистической активностью против условнопатогенных бактерий, могут быть рекомендованы в качестве потенциальных штаммов для создания высокоэффективных пробиотиков.

Сконструированы штаммы B.subtilis, стабильно наследующие ген, кодирующий синтез лизоцима и лизостафина стафилококков и характеризующиеся повышенным уровнем его продукции, которые могут быть использованы для промышленного получения фермента.

Разработана тест-система на основе ПНР для идентификации и выявления лизоцимактивных штаммов золотистого стафилококка среди клинических изолятов, выделенных от больных, а также из окружающей среды (смывы с медицинских инструментов, мебели, белья, медицинской одежды в поликлиниках, больницах и роддомах). По сравнению с более трудоемкими, требующими больших затрат времени и средств традиционными чашечными методами определения лизоцимной активности, разработанная ПЦР-тест-система значительно ускоряет и упрощает процедуру отбора лизоцимактивных штаммов стафилококков. и

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Жаданова, Людмила Владимировна

ВЫВОДЫ.

1. У 150 клинических штаммов S. aureus изучена лизоцимная активность с помощью метода отсроченного антагонизма и лизиса убитых ацетоном микробных клеток Micrococcus luteus var. lysodeikticus. Лизоцимная активность обнаружена у 42 (28%) изолятов, большинство из которых выделено от больных с инфекцией мочевыводящих путей.

2. Получены геномные банки S. aureus штамма 118 и S. simulans в реципиентном штамме В. subtilis AJ73.

3. Тестирование лизоцим- и лизостафинактивности полученных рекомбинантных клонов В. subtilis в чашечных функциональных тестах с индикаторными штаммами позволило выявить три клона с приобретенной лизоцимактивностью и один клон с приобретенной лизостафинактивностью.

4. Размер вставок ДНК S. aureus и S. simulans в составе клонирующего вектора в выявленных клонах соизмерим с размером генов, кодирующих лизоцим и лизостафин, соответственно.

5. Осуществлена передача гибридной плазмиды, несущей ген синтеза лизоцима в реципиентные штаммы Lactobacillus fermentum и показана экспрессия этого гена в лактобациллах.

6. Диаметр зон угнетения роста тест-штаммов (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis) клетками гибридного штамма Lactobacillus fermentum, несущего плазмиду с геном синтеза лизоцима, превышает диаметр аналогичных зон, образуемых клетками исходного штамма Lactobacillus fermentum в 2,0 - 2,5 раза.

7. Разработана тест-система на основе ПЦР, позволяющая выявлять фрагменты гена Lyt А в штаммах S. aureus.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Большое значение в настоящее время придается созданию новых видов антибиотиков, замене устаревших и утративших свой лечебный эффект химиотерапевтических препаратов новыми, более эффективными. Исследователей привлекает поиск недорогих источников получения лизоцима, отбор штаммов-продуцентов, регуляция его синтеза и основные характеристики препаратов микробных лизоцимов. Особенно большой интерес вызывает бактериальный лизоцим и генетические механизмы его биосинтеза, регуляция этих процессов в бактериальной клетке. В настоящее время необходим поиск штаммов-продуцентов микробных лизоцимов и лизостафинов, создание на их основе с помощью методов генной инженерии промышленных суперпродуцентов с максимальным уровнем образования этих ферментов и их внедрение в биотехнологию.

Первым этапом исследования был отбор естественного штамма-продуцента лизоцима. Нами было исследовано на лизоцимную активность 150 штаммов S. aureus, являющихся клиническими изолятами, которые были выделены от больных с различной локализацией инфекционного процесса в детской городской поликлинике №121 г. Москвы и клинической больнице №12 г. Казани. Среди этих бактерий лизоцимная активность была обнаружена у 42 штаммов, которые, в основном, были выделены от больных с уроинфекцией, причем наибольшей лизоцимной активностью из них обладали 6 штаммов, среди которых самым активным оказался штамм S. aureus 118. Последний и был выбран нами для последующего клонирования гена, кодирующего продукцию лизоцима.

Вторым этапом исследования был выбор векторной системы и соответствующего реципиента для клонирования. В качестве реципиента для будущего клонирования был выбран протеазодефицитный штамм В. subtilis AJ73. Важной особенностью В. subtilis AJ73 является способность выделять большое количество синтезируемых ею белков в культуральную жидкость. В. subtilis широко распространена в окружающей среде и не является представителем нормальной микрофлоры человека, поэтому не может быть использована для создания новых видов пробиотиков. Разнообразие метаболических процессов в В. subtilis и отсутствие патогенности послужили причиной того, что представители этого вида стали широко использоваться в различных отраслях промышленности для получения ферментов, антибиотиков, инсектицидов и пищевых добавок.

В. subtilis уже на протяжении более 30 лет успешно используется в экспериментах по трансформации, и в этом направлении накоплен большой опыт (Spizizen, 1983). В настоящее время В. subtilis является наиболее изученной грамположительной бактерией как в генетическом, так и в физиологическом аспекте. С учетом вышеуказанных свойств, использование промышленного штамма В. subtilis наиболее перспективно для клонирования генов лизоцима и лизостафина золотистого стафилококка. По данным литературы отмечались случаи выделения сенной палочки с лизоцимной активностью (Okada, Satomura, 1968). Нами также было осуществлено тестирование штамма В. subtilis AJ73, выбранного в качестве реципиента для клонирования, на лизоцимную активность и показано, что он не обладает таковой, что соответствует данным литературы (Jomantas, 1989).

Основным этапом исследования было клонирование гена лизоцима S. aureus 118 и лизостафина S. simulans RN3239, которое было осуществлено при помощи бациллярного вектора pLFi4 в клетках В. subtilis AJ73. Оказалось, что в клетках сенной палочки продукция лизоцима превысила продукцию у исходного штамма S. aureus 118 почти в 2,5 раза. Диаметр зоны лизиса индикаторного штамма М. lysodeikticus клетками рекомбинантного клона В. subtilis AJ73 был намного выше, чем клетками s I исходного штамма S. aureus 118. Однако продукция чужеродного белка в

В. subtilis AJ73 наблюдалась при температуре 30°С и рН 5,5 на L-arape, тогда как исходные штаммы S. aureus 118 и S. simulans RN3239 продуцировали лизоцим при рН 7,5 и температуре 37°С.

Таким образом, нам удалось получить определенный уровень продукции лизоцима S. aureus 118 и лизостафина S. simulans RN3239 в клетках В. subtilis AJ73. Из трех лизоцимактивных и одного лизостафинактивного клона В. subtilis нами были выделены рекомбинантные плазмиды, которые были обозначены соответственно pLFi4Lyz+i, pLF14Lyz+2, pLFi4Lyz+3 и pLFi4Lzf+1. С целью определения размеров вставок в этих рекомбинантных плазмидах была осуществлена ПЦР с соответствующими праймерами, фланкирующими полилинкер в векторной плазмиде pLFi4, в которой производилось клонирование.

Анализ продуктов ПЦР из ДНК выделенных клонов показал, что в плазмидах pLFi4L^+i, pLFi4Lyz+2, pLFi4Lyz+3 и pLF14Lzf+i имеются вставки чужеродной стафилококковой ДНК размером 1,2 т.п.н., 1,5 т.п.н., 2,5 т.п.н., 4,5 т.п.н, соответственно. Фенотипические характеристики полученных лизоцимактивных штаммов и размеры вставок в полученных гибридных плазмидах позволяют сделать предположения о том, что в работе удалось клонировать уже описанные в литературе гены lytA и lss. Об этом свидетельствуют и данные о выявлении в штаммах S. aureus 118 фрагмента гена lytA с помощью разработанной нами ПЦР-тест-системы. Однако для доказательства клонирования нами генов lytA и lss следует осуществить секвенирование клонированных фрагментов гибридных плазмид и сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с последовательностями указанных генов. Кстати, разработанная нами ПЦР тест-система для выявления гена lytA S. aureus может быть рекомендована для использования в практике, так как результаты выявления этого гена совпали с данными микробиологического выявления лизоцимактивности.

Следующим этапом наших исследований была передача плазмиды pLFi4Lyz+3, несущей самую большую вставку стафилококковой ДНК и обладающей высокой стабильностью в клетках В. subtilus представителям нормальной микрофлоры человека (лактобациллам). Передача гибридной плазмиды pLFi4Lyz+3 была осуществлена с помощью метода электропорации в клетки трех потенциально-производственных штаммов L. fermentum 90Т-С4, L. fermentum 81Т-В5 и L. plantarum 8R-A3. Все эти штаммы обладали различной степенью собственной лизоцимной активности. L. plantarum 8R-A3 не обладал этим признаком, а у L. fermentum 90Т-С4 и L. fermentum 81Т-В5 она была почти на таком же уровне как у лизоцим активного штамма S. aureus 118. Лизоцимной активностью обладали и фильтраты указанных культур.

После электропорации соответствующей гибридной плазмидой pLFi4Lyz+3, pLFi4Lzf+i были получены рекомбинантные штаммы лактобацилл, причем наследование лактобациллами гибридных плазмид было подтверждено положительными тестами в ПЦР. При исследовании лизоцимной активности фильтратов генно-инженерных штаммов L. fermentum, полученных нами после электропорации, было определено, что зоны лизиса индикаторного штамма М. lysodeikticus 2669 и зоны угнетения стафилококкового роста были намного больше, чем у исходных культур лактобацилл. Сконструированные штаммы лактобактерий подавляли рост практически всех клинических изолятов золотистого стафилококка, а лизоцимная активность их превышала исходные штаммы в 2,5 раза (как у В. subtilis AJ73).

Важным является также то, что рекомбинантные штаммы, полученные в данной работе обладали повышенным уровнем лизоцимообразования, продуцировали лизоцим при условиях, которые являются оптимальными условиями роста лактобацил, т.е. условиями, которые существуют в кишечнике человека (t=37°C, рН=6,6-7). Именно это позволяет применять их как пробиотики. Полученные штаммы обладали также большей антагонистической активностью в отношении стафилококков по сравнению с исходными штаммами.

Известно, что под влиянием лактобактерий усиливается активность клеток моноцитарно-макрофагальной системы. Особенно важно сейчас не только отобрать из природной среды штаммы-продуценты микробных лизоцимов, но также создать на их основе с помощью методов генной инженерии промышленные суперпродуценты с максимальным уровнем продукции этих ферментов, а на их основе создать новые препараты-пробиотики.

В настоящее время интенсивно разрабатываются новые виды препаратов-пробиотиков, включающие в свой состав те или иные штаммы L. acidophilus, L. plantarum, L. fermentum, L. casei и другие. Разные виды лактобактерий, в частности L. acidophilus, стимулировали противоинфекционный иммунитет, а также стимулировали иммунные реакции при остром ретровирусном гастроэнтерите у детей (Ритова В.В., Мурашева Н.С., 1985). Следовательно лактобактерии, являющиеся неотъемлемой частью микрофлоры пищеварительного тракта в норме, стимулируют как системный так и местный иммунитет, препятствуя распространению патогенных штаммов в кишечнике. В настоящее время является перспективным создание новых пробиотиков, содержащих живые культуры лактобацилл.

Одной из задач работы и было создание такого препарата, который бы выгодно сочетал в себе лечебные свойства стафилококкового лизоцима и лактобактерий. Сконструированные нами генно-инженерные штаммы лактобактерий выгодно сочетают в себе антимикробную ' и иммунностимулирующую активность. Использование полученных рекомбинантных штаммов L. fermentum, обладающих повышенной антагонистической активностью в отношении стафилококков, для профилактики и лечения гнойно-воспалительных процессов, вызываемых стафилококками, является целесообразным и противопоказаний не имеет. I

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жаданова, Людмила Владимировна, Москва

1. Акатов А.К., Хатеневер М.Л., Выгодчиков Г.В. Лизоцим как критерий патогенности стафилококков. — Журнал микробиологии, 1975, №9, с.77-80.

2. Акатов А.К.,Журавлев И.А. Количественные показатели лизоцимной активности стафилококков. — Журнал микробиологии, 1975, №8, с.67-71.

3. Акатов А.К., Зуева B.C. Стафилококки. Москва "Медицина", 1983, с.120-125.

4. Акатова Е.А., Schumachtr-Perdreau F., Pulverer G. Молекулярно-генетический подход к видовой идентификации коагулазоотрицательных стафилококков. — Журнал микробиологии, 1993, №3, с.3-6.

5. Акимкина Т.В., Косовская Е.А., Костров С.В. Клонирование и экспрессия гена нейтральной протеиназы Bacillus cereus в клетках Bacillus subtilis. Молекулярная биология, 1992,26/2/, с. 418-425.

6. Алешин В.В., Семенова Е.В., Тараканов Б.В., Лившиц В.А. Семейство челночных векторов для молочнокислых и других грамположительных бактерий, основанных на репликоне плазмиды pLF 1311. Микробиология, 2000, 69/1/, с. 75-80.

7. Артемьев М.И. Тонкая структура лизоцимного гена бактериофага Т4: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1979, 24с.

8. Афанасьева Т.И., Леоненко В.А., Бердзулишвили Э.М., Богданова Л.Ф., Соловьева В.Е., Кравченко И.А., Черкасов И.А., Соболев В.Р. О значении лизоцимподобного фермента стафилококков в их патогенности. -Журн. микробиол., 1976, №12, с. 43-47.

9. Афанасьева Т.И., Леоненко В.А., Бердзулишвили Э.М. Продукция лизоцимподобного фермента различными представителями рода Staphylococcus. -Журн. микробиол., 1975, №1, с. 97-101.

10. Ю.Афанасьева Т.И., Леоненко В.А. Антибактериальная активность лизоцимподобного фермента стафилококков. Антибиотки, 1975, №10, с.907-911.

11. И.Акопкина И.Г., Бутова Л.Г., Фомкина И.П., Блинкова Л.П. Штамм Bacillus subtilis продуцент фунгицидного вещества. - Журн. микробиол., 1995, №1, с. 91-92.

12. Баженов Л.Г., Бондаренко В.М., Лыкова Е.А., Огай Д.К. Изучение антагонистического действия лактобацилл на Helicobacter pilori. -Журн. микробиол., 1998, №5, с.89-91.

13. З.Бабич Е.М. Дифференциальная экспресс-диагностика бактериальных и вирусных менингитов с помощью лизоцимного теста. Журн. микробиол., 1992, №5/6/, с. 25-27.

14. М.Богданова Л.Ф., Афанасьева Т.И. Пигментообразование и другие биологические свойства стафилококков. — Журн. микробиол., 1976, №5, с.37-41.

15. Богданова Л.Ф., Соловьева В.А. О значении лизоцимподобного фермента стафилококков в их патогенности. Журн. микробиолог., 1976, №11, с.43-47.

16. Бондаренко В.М., Рубакова Э.И., Лаврова В.А. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков. Журн. микробиол., 1987, №5, с. 107-111.

17. Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Корягина И.П., Голубев А.В. Плазмида, контролирующая синтез лизоцима, обнаруженная у клинических штаммов эшерихий. В кн.: Факторы естественного иммунитета. Куйбышевский медицинский институт, 1983, с. 101-103.

18. Бондаренко В.М., Рубакова Э.И., Лаврова В.А. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов антибиотиков. Журн. микробиол., 1975, №5, с. 107-111.

19. Бондаренко В.М., Белявская В.А. Клонирование и экспрессия генов в молочнокислых бактериях. Журн. микробиол., 2000, №2, с.69-73.

20. Бухарин О.В., Васильев Н.В., Усвяцев В.Я. Лизоцим микроорганизмов. Томск, 1985, с.25-27.

21. Бухарин О.В. Экспериментально-клиническое изучение лекарственной регуляции антилизоцимной активности возбудителя оппортунистической инфекции. Антибиотики и химиотерапия., 1991, 2/36/, с. 14-17.

22. Бухарин О.В. Антилизоцимные признаки стафилококков в диагностике и санации бактерионосительства. Журн. микробиол., 1993, №6, с.32-33.

23. Бухарин О.В., Васильев Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. Томск: Изд-во ТГУ, 1974, с.207-208.

24. Бухарин О.В., Малышкин А.П., Немцева Н.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. Журн. микробиол., 1984, №2, с.27-29.

25. Бухарин О.В., Бутовецкий Л.Д. К характеритике биологических гонококков. В кн.: Вопросы экспериментальной и клинической урологии, Оренбург, 1976, с.32-36.

26. Бухарин О.В., Прянишникова Л.И. Лизоцимная активность пневмококков. Антибиотики, 1975, №12, с. 1094-1097.

27. Бухарин О.В., Герасимов А.В. Использование лизоцима для дифференциации зеленящих стрептококков. Антибиотики, 1972, №11, с. 1039-1040.

28. Бухарин О.В., Усвяцев Б.Я., Матияш И.Н. Экспериментальное изучение антимикробного эффекта лизоцима в комбинации с антибиотиками. -Антибиотики, 1996, №11, с.997-1002.

29. Бухарин О.В., Борисов С.Д. Определение лизоцимной активности у Lactobacillus fermentum методом лунок. Журн. микробиол., 1978, №2, с. 18-20.

30. Бухарин О.В., Борисов С.Д., Езепчук Ю.В. Антилизоцимная активность менингококков. Журн. микробиол., 1991, №7, с. 17-20.

31. Буланцев А.А. Возможности генетического обмена между родственными бациллами с помощью трансдукции. В кн.: Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особоопасных инфекций, Волгоград, 1992, с. 56-59.

32. Воронина Л.Г. Лизоцимная активность гонококков: Автореф. Дис. . канд. мед наук. Челябинск, 1982,20с.

33. Вялкова А.А. Клинико-бактериологическая характеристика инфекции мочевой системы у детей. Журн. микробиол. 1994, №6, с.77-79.

34. Гаврилова Е.В., Мехедов С.Л., Прозоров А.А. и др. Ген гес 223 Bacillus subtilis. Молекулярное клонирование и предполагаемые функции его белкового продукта. Генетика. 1992,28/5/, с.29-32.

35. Габрилович И.М. Лизоцимная и антилизоцимная активность у условнопатогенных энтеробактерий. В кн.: Тезисы XVII съезда Всесоюзного общества эпидемиологов и микробиологов, паразитологов им. ИИ. Мечникова, Алма-Ата, 1980, с. 19.

36. Габрилович И.М. Гетерогенность антилизоцимной активности в популяциях условнопатогенных энтеробактерий. Журн. микробиол.