Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммуноглобулинсвязывающий белок 83 КД внешней мембраны возбудителя теляремии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Иммуноглобулинсвязывающий белок 83 КД внешней мембраны возбудителя теляремии"

РГВ од

гойщдрсгаённыя жшхьт смшарш-ЭыЩь^юлошесш'с

НАДЗОРА росам

российский научно-исс^ДОа^тельскил протиючу;<шя институт "микроб»

На правах р> .описи

КОРОВИНА. Ольга Викторовна

ждмуноглзБУЛ-нсвяаыадщия белок &з кд вншнат ыенераш

ВОЗБУДИТЕ!" ТУЛЯРЕМИЯ 0?.00«04 - Биохимия

Автореферат

диссертация на соискание ученой степени кандидата медмцшскюс наук.

Саратов - 1993

Работа выполнена в Институте иммунологии Государственного концерна "Биопрепарат",

Научные руководители - доктор биологических наук, старший

научный сотрудник MEBHi'JiOB B.C. доктор биологических наук, профессор, академик биотехнологиче^кой академии РФ -ЗАВЬЯЛОВ В.П.

Официальные оппоненты: доктор медипияских каук, профессор

Наумов А. Б.

кандидат медицинских наук, старший щушщй сотрудник Адамова Г.В.

Ведущая организация: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Автореферат разослал 1993 т.

'Защита диесеэтдцип состоится " 1993 т.

б "У? • часов на заседании специализированного совета К 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "¿Ьжроб(410071, г.Саратов, ул.Университетская, 46)*,

■I

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института. "М^кррб".

Ученый cpfcpsTapb специализированного совета Девдаряанк 3.1.

АКТУАЛЬНОСТЬ ЛРОЕЛ£.!Ы. Создание и совераенствование новых средств специфической профилактики и диагностики занимает важное мосто з борьбе с туляремией• Основу разрабатываем«:: современных молекулярных ваяши и диагностикууов составляют протективныв компонента микробоз и зысокоспецифичные чоноклональк-'е антитола.

однако отсутствие нсчер.туза-адлх сведений о важней -лих антигенах Fraacisella tulareas±3 является ОДНОЙ из ОСНОВНЫХ причин, сдер*иза&цлх исследования в этом направлении. Многолетнее изучений гуляремлйных бактерий не привело к выявлению факторов латогенности и не позволило выяснить механизмы внутриклеточного паразитирсаания.■При этом до настоящего времени остается дискуссионным вопрос о природе защитного иммунитета при туляремии.

К числу наиболее изученных антигенов F.tuiarensis относятся мембранные белка, пр^легсаяхие ани;.'ая: < исследовател?й з связи с их ведущей ролью з формировании Т-к точного иммунитета ( Sandstrom, 1987, ^ЭЭС; Sure el, 1*990; Sjost-dt, 1990). Основ-ними имыунорзагстивнымл белками вне'лнеЯ ?.;емб; аны тулярэм' "того микроба являются протеины с молекулярными массами 10-14 кД, 17-20 кД, 41-43 кд С Fop а), 47 кЛ л 63 кД (Родионова, 1989; ^oatedt, 1990; 3evanger, 1983; гТасо, 1433).

В настоящее время у тулярешйнсго микроба обнаружено три белковых компонента с молекулярными массами 40 кД, 63 кД, 67 гсД, эзаимодействудаих с и:.ку: «глобулинами. человека (Некляе'в, 1990; Хлебников, Коровина 1990, 1992). Известно, что белки 40 кД и 67 :сД конкурируя? с протонном A Staphylococcus aureus за область связывания с ?с -фрагментом IgG. Значение туляремийкых IgS -оецептсров з формировании специфического иммуните/ia че »нченено.

Ц£«Ь PJU5CTJ. Изучение фигико-зсзгаческих и биологических озойсуа имкуноглобуллкезязыва чего белка 63 кД внешней .мембраны F.tularc-asis.

ЗДДА-И ¡Г-ХСДОВАНЖ.

■ Г, Разработать эффективные способа звд ления и очистха '¿елка ¿2 -д ?н«жс-Й ^t-lareaais.

Пояуччуь чсиолгсирл^ные антитела, специфичные к белку ?J сд ■•h-'ihc'! -J?.tularcnsia.

3. Определите осл;5ь:-.и ¿иэихо-зааагассюю

4. Вэдсл^ть 1л:тодЬ..; иромаясгрсфв! на белек 63 кД -сифарознах сорЗсгздх ¿¿о «элскшса и изучить зодхлассовув

ПриНОДЛикЛСС'ГЬ. '

.6. ейпеахшил «а ыслекуле человека для белка 63 кД. •

6. йейлсдошхть с2сЛат!;а''бслха 63 рД гкешей ш'-

Орси.-и -

ШУЧШЯ ШЕ1Н2А. Йаерьаг определена егхт^адьше условия получения 6ел;:а 63 -¿1[ « изучена его осноьг^й фкзйго-аишцческие к ¡аз.унским:гтаск.»:о сьо^стг.а, зкетшкции белка в макск-

п/ио аорлеченйя при 275,5 кл сост.гзгллет 0,35 г'-л^-см"^. 5 его состав еходнт -около 600 гдашказслс-щк' остатков. .Балок не содержит уршгофака» Содео^сзго Д» ~гакрадеГ. в белке составляет 55+5

Поксзшю, ча'О бело;: 63 кД избирательно .связывается с хбсц человека. Сбк&кркеко два участка сгязызыша для белка. 63 кД на молекуле -2а5 • человеке., Исшагай .Еоаасхыоссь использования белка. 53 кД У.глалхеас18 . длл в^елеьия Дб<Ц человека.

Полуш««: '¿рп гсбр^дс!:-:» -дредудакгкг^э 12СА. к белку 63 «Д. Уста-но&аеыа возкоза-юать использссгн'.ц: для оЗийрунсеадгя к оч»:стни белка 63 кД, . •

Впервые проведена оцени» /зЕ^-ета« • сзо?.оав бежсь 63 яД 15 кс«а-гексоо ИДС-бвгсц 63 кД яр:, ^^океря^тмьной туляремии.

- ЦрШ'^СДЬ. .. Пэг^аагк-г ¿гссгзрциеитальнке д&гкзг

-ба'.'ь длл ^зз^-гс;«:« п.Чго-- я вкц/нл>енеэь

Хагедсхс, ц^.дста сп^цийлчбс^са Лаагнсагя-

кк ж ¿у.гяргйзии - тс::><.- да»; ьад&ленкл 55 .йоследога-

нкк саоЯссб • '2с«з* -.сслссггв..

До резулъга?.'^ рсботц Г1гдгстсчл-;н^ йч??£гукцил м> каготездекк; :« коктролр .' Зв • ^сгжа 63 кД ВЦ г.ъаХагеигаЕ., ,уг-

£2р£де;шсц: дйрихторо%. ¿'агкгуа-^ 22 дзка5рлД535 г.

• На гкбрвдеуу П* ¿-4, продув^.уюцув келонлок&лькые антитела, специфичнкб к белку 63 кД ¿•»^иХьхьаз!»., дслучипс г.&терсксь евидетельс'г.бэ. . -

С ксцзльаоааш;ск иоисиястакьшс: :';ггд:тс-л • совигетко -г ШН лрк-":ледкой иякробкоасгхк! • врезеден« .рай'.;.а зо кденткфг.каи,;:;; и кьу**-

нке тзс-есу6кя5н7йог-о уелга «;д

АПРОБАЦИЯ РАБС1Ы И ПУБЛИКАЦЩ.' Материалы диссертации доложегщ на конференции-конкурсе молодых ученых "Актуальные проблемы биотехнологии" апрель 1988 г., п.Кольцово; на. 20-ои Европейском биохимическом съезде ( ГВВЗ), август Г990 г. Будппеягг;.на 11-ом . Европейском иммунологическом съезде, ишь 1991 Хельсинки; на Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы профилактики туляремии" , ноябрь 1991 г. Симферополь; на Российской научней конференции "Генетика и биохимия вирулентности особо опасных инфекций", октябрь 1992 г. Волгоград; на традиционных ежегодных конференциях Института иммунологии Г385-1990 гг.; на иежлабораторном сени-наре института, апрель 1993 г.

Материала диссертации вопли в 3 научных отчета по законченным НИР, выполнявшимся в соответствии с плановвии заданиями Госконцерна "Биопрепарат". По теме диссертации опубликовано б печатных работ.

СТРУКТУРА РАБОТА. Диссертация состоит от -зеденнл, литературного обзора, глаза,, отрау.асцей результаты сосатвеннгсс исследований, заключенияу выводов и списка литературы, Работа изл~жна Г36 страницах мааикописного та:', с та, шипоетрирэзана 2 таблицами и 25 рисунками. Библиографический указатель содержит 231 источник • литература, в том «геле 47 сгечсстЕекнщ: и 184 шсстра-'гн^от. -

Автор БЕгрзлсает благодарность и искренняя- признательность за плодотворное сотрудничество и полззчке обсуждения:своим коллегам. Наеерааш соавторам (указаян пвкионио з дясссртедиа э соответствии с разделами работа)- яряиэдязгг? порогу.

ЯА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ аЩЗгТС.Ш ЖЙЗШИ:

Г. Способа • вздедения и нойьк дзкеге, гарег-терхэувдие физитсо-завтачеехке, ихкувехзмячвеккэ я биологически» сдойства белка 63 чД внешней мекбргмк 7.*11сг*зз1а*

2. 8а?«фиагы па кояструи^озагг-гэ- гибрядег». а осяосанэ -езойетга ЖА, свзцй&гавсс к белку 63 кД

3. Илт«р:;ахы по гыделениз ¡йтодем атфзетеД .хроиагзгра^ии яа белек 63 лД сефароз'псх сорбтюгах иммуноглобулинов «теловгка.

4. Деяние о жмиа^аца:*. утайка сзжзгйэяйя на ?."Олк?ул-г человека для белка 63 г.ъ&чг-зг Чт-

• соесгажыс: исол^озяк^

Ь'-атерпялы и мзтодц кссл-.-дованик. Б работе- использовали сле-дуицие птамх; Р-1и1егес.з1&: в.:рулектгс;е 503 голарктического подвида, А'со1е ЕсЬи неархткческого подвида; вакцинный

15 НИИЗГ и его аЕирулентны"; ь-вариант.

Культура 0актерий выращивали в течение 24.часов при 3? иС на плотной среде производства прикладной г-лкроопологии (эрптрит-агар с цистенгж, глюкозой, витаминами с тпиитическим гидролпза-том "черного альбумина"). Глубинное культивирование клеток вакцинного штамма выполнял* е ¿еруентере фирщ "¿лектролвкс" Сизе-ция). Культуру выращивали в течение 16-16 часов пр:: 37 °С, используя среду на основе сернокнсхстнсго гадролизата рыбэкосткэй уукк. с добавлением солей, витаминов, аистеина и глехози (Н'/ЛПй) .

Ацеток-высуаениые клет::и получали из взэеси С актер»::":, о;гж-декшд. центрифугированием при 15000 5 в течение 40 кинут, осадок ресуспенцировал:: в трехкратно« объеме охлат^екногэ ацетона. Суспензию тщательно перебеливали и выдерхглЕали при 4 °С б течение двух суток периодически встряхивал. £гте;.: цантсифугнрсвЕлп-прк 15000 б б течение 40 кгнуг. Цикл повторяли дваглы. Сзадок -клеток после последней обработки ьыеуЕ/.Еалк при Г8 °С.

Водно-солевой окетр&х? (БСЭ) получал;-, из ацетон-высулен^ьзх клеток, рзсуспендпрованннх ь физиологическом растворе С100 м" сухих клеток » I мл), жкубироза^гних 6 часов яря 37 °С у 16 часов при 4 °С. После центрифугирования суспензии при 105000 ¡г в течение I часа, капосадо« использовали в качестве 508.

Бактериальные вкеанне :;зг.:5рока СЮ получали иэ клеток кнак-тквкрованнцх фенолом .(конечная концентрация 0,5 %) б течение 20 часов. Бактерии осаздвак центрифугирование:.:, ресуспешшпозалн г соотношении 1:5 в забуфергдао&з фосй&тамн физиологическое растворе рК 7,2 (2ФР), обрабатывали ультразвуком при шшости 200 Вт 3 паза по I мин в ледяной Сане и {здервивали 15 часог при постоянном перемешивании. Неразрушенные клетки удаляли центрифугированием пси 15000 в, 40 да, С-упернатант центрифугировали лр:: 105000 в. Верхний светлый слой осадка, представ лягэдй собой фракцию В£, триеды црокываяи деиокизовашой ведой в соотношении 1:50, пеозосаждая ка%Д№ раз I час. при 105000 Оселок рееус-пендкрогали в минимальной объеме к лиофильно высупивзли.

Липололнсахарпи ШС) получали ло «езЬрЬа! (1973).

Конструирование гибридом и получение мсноклональных антнтзл проводили классическим методом { КоЫэг» -1975) с некоторыми модификациями. МьглеЯ л;агли ВАХ.В/с и^м-л по провали баллом 63 кД Г.ги1агспз1з. Клонирование и реклонирозание положительных культур осуществляли методом предельно разведений. Очистку МКА из асцитной жидкости проводил!:, обрабатывая- ее калрило-л<гЛ кислотой «ля сульфатом акмония при £0 % и.чсыц' ши с последуй--еЛ- аффинной хроматографией на белок 1-ссфарсэе но методу .Зу л Ш. (1973). ' ■

!?,-й1унофер;.-екгн'-1Й анализ (ИФА). для определения серологической активности препаратов проводили в примем п "сснцвяч" вариантах :а полпетироловых пластинах по методу 7о11ег (1977). Котгэгя-'„1,13 иммуноглобулинов с псронсидазс:! осуществляли методом перио-датисго окисления по Задало 097*).

Определение белка-э препаратах ссудастзллли по методу Ьо-лгу ; <Х:51), Гл'-гао^рст-э^нч определяй с л .дне:? кислотой (I 7>

;*.1стиор я 3 у растперэ уксусной хислстц} с г: лягдеящии окрепшга-,;'!см рйактивем (0,5 % раствор -истой гаслота).

СЫктрофор«}' г лол;?акр!!лэ:,годном гелз (ГШГГз '1рисутс-2ни до. 'зи^тсульф-гта .чгтрлп (ДСН) по 1»м1?г <Ю70) лроэодаяи з СО Ч 12,5 г-злэ."

гс?цо <У-3)' слзхтсу ^пктрирззадя с по:«3!Цьа> сло:ст-~?.с«аг4 М-40 Ш2?) э •асет-?.1: с ддиней оптлчзст.сго .ту.:! С КругсзсЯ д:псроизм.<ВД)- тегмеграровадпг .в кварцевых

т-зт."-:: а длине:'; оптического- пути - X ;-:м с дихрогргфа-

•Ул'Л .¡азео (Япс?ия). Расчет колглеегга- епарааэЗ э белках проводили но методу 5олот'.шсй, {19с0>'1 •'1'Ь.тзр:^л-гр;:пг?с:сце измерения ярозодиля па схааярущем гщюхалоггг.ггтрэ .{СШаБП АН СССР,.

Путине) в даг-лзаоне 0-100 Спектра фдусргстде;пда белка регп— смриро"й.-щ яа спег-;2рсфлуор'..й:5грз ССЗА) з

явзйтэ с длине .1 опт:гчосного: пути 10 Я.т.а»а, полки возбуждения 250 нм, алрГ'Лз 'дели хшала. воэ'узденвя б' им, излучения - 5 ащ -сксрсстъ а.чакмрзгэя-гя 15 ¡ш/геи. • .

АызюкисдсгаыЯ анализ белгг 63 кД ¡треведпли яа анализдторэ. ВЮггопАс 720 'й?Г), •

дзозлзнтрсфохусироиачке белка б? гД'прозодклн согласна руяс-седстзу по- ахзяшячосъат/ Еяоэлеятр^сзусярсБгшго- з МАГ «риркзг ЕВ. В качестве маркеров использовала стандартный набор-- йелкоз с ;:зэе.?тнн:л;; изэто»««« (?Х 2-10 >- ' • . .

{•к^иозлсктрсфорез СПИ) преходили на стеклах Эх 12 см, кс-, пользуя в качестве аоядерташзх-дз!5. среды 0,9 ^.агарозу на 0,01 и ьздикал-аце'та.тксм буфере рН 9,6 пра силе тока 25

Игсиуноблотта-п1 ставки по ксгсду Тс*.-Мп (1939) с 12,5 % ДСН-Я.нАГ-.элехтрс^орезсл по лги постоянней токе 20 кА.

Перенос на кгггрсцедяслазкуз буавгу осуществляли в течение ноч;: при тске 6 яд,. Для продьдеиия шероцеллзлозкых ретлпк использовались хонъгзг&ты ситигидогых -иимунегдобулинов и Ш£Л с перокси-дазой. Для определения связывая:« белка 63 гД с человека

и его фрагьзнтами бал получен ;:он1&гат беляа 63 кД с пероксида-зой. Субстратен лзлдлеп 0.0025 % ертодианмзвдин в 10 трио-ЕС! рН 7,5 з-прасу.-стз1К1 0,01 %■ перекипи водорода.

обработку результатов проводили по ¿эмар;му

(2852).

''рызлыш иссльд^злнля' ' ■

АнтигекныЗ кокпенен? • Г. гих^геисха, образущлй преципитат!: с• иьыуногяобулшаки.интактных кролика человека, зпзрвые бил обнаружен ндцп при кчцуноэлеятро^орег;:ческом исследовании препаратов БСЭ из аце.токшсуаснннх' 1;ле?ск кск вакцинного* так и »яру-аентных 203, ' £сЬи а . Д'сохй. 3 далькейпе-л сн баз

выявлен в экстрактах кз азаругеш-к-гх клеток а -варианта. вахтенного атагалй 15. ••

Ксмлозшнт, Езиш.сде;1ст27сц:и5 с керкальггым;: л^с- человека ц кролика, был та^е сс'^гругхь и в концентратах культураяьной кедкойтк, подученной при глубикнок культивировании т.гахагеавхе, что иожет -сЕядетсдьстзовать о ьго секреции бактериальными кает-ками: -.

§рейцион»:ров8Кие" на софарозе~6£ '.иедно-солек-п; экстрактов из ецо-тш-внеузеньнх клеток тулпрг-кйцют'о микробе. с аоследусцик использованием ионообменной хроматографии позволило получить очкцекшй препарат антигена, ззахкодс^ствукдего с псриалъглхж

1ва 'человека. Ем оказался глинозилироваиньй белох, молекулярная масса которого по данным ДСН-ПААГ-слактрсфореза - 63 а г.о далньы гель-фильтрации - 450 кД. -

При анализе аатисыворсгоя, получешагл против препаратов Ш. Р;ги1агеа81в,бьшз обнаружено, что в «их прлсутсл-:" :-т гк?»:?ел&, «згшаюйейс?гувдке с бел»ои 63 вД. Причь«/ Ь^ти 63

п,;лз1яяся л^гг-.о иглуноэлоктрсфоретяческп п препарата;: аодгаа: г,-страктоп пэд?ергакг;гсс? кс-алгжфе'л'с.'.п' здмор2я"ван.ч« и огт.чивпяко. По-з^л^мсллу, с:: кл не являете:- !:птз?рнльна:1 ¡'странным о&ляо» ;> его сскоз.":? :э уд^лтетег с Е'. а

прг.ц.гссе их г.рдасгвкк еольъи.*:: ,7 •зтгте-.-..

! спользе-гниг з::стрз>;7л •,>:- г.г-гта:-:.

ультразвуке-:. »место '¡5СЭ т-л г-'-ч.з: кЛ'У.о-;. пэзйол:.-

.<:.:■ суачстЕ-гн.чо уреличкть г-то;, т.' ¿1.. С-нсттс-ч?

с ■. '.г'.тп:! п'-'лгиигхт" 1 с

Л'-с.''Эдукм:.-.. рг; ,..\~птркгг: .': ^■'■'-¡"Ч"-" г . СЬ-Ьо

;:алц:г.-. пс-дсхт~тд.-.ч с .Г ."Г с-"::-- 61- г!

с - 1;0Г;;: :" :■- .::• 1 .. -.<'_■-.и'. .' г.: •• ". '...:" ссзть-ьл;—

"." ^чЗЬ+Оп. • ,"-г-* • с ;гл.-

1 ■ .. ЛЛЛМПТ:* ппгь гг.' • . . : согт^лг -: го^-сг:"''

■••ль""-. ; :с -ьсло;:тро:. IX'

гая?--- г-угсг:. о;-,;::;■.'.■:сг' •:7:::-.з\ч>"::.~ ■. згл 6: кл ^гтело:; ;Л':'!---ЭггН1Г'';."_-г-'п'' и-?'. эй:: г; -гге

с.ггр:; :.с: -¡у:-;плгу,т;: Е'г^сг^—ен1.'^

■'ГЬ!;:ос с.::':-... гг-.: с'- ; о- Ч^сзнз^чог ^ е::-

-еллз С рхуг-л к^элугдг.этзя

п.: '"'С 7,3). Ьзгс^^а^лтг;'!.; рллруглзп-:-:;'' •

.■;•-:' поело крггрзгг. 1 '." 101; аС ьч-

;.ло.т.одс-.х-:::-"- бол-г; ЬЗ -д :*зодлегет. р

ПЛдГ полез алз, он ггрчл'^г.злз-н дшукя с Фзквд-ла

глоте*» м*::. яеповазг и области Р1 4.5-

дспит&тэгкдо олр дэлогп, что ^ ссзсаз пепса 53 ::Д

плодит окслз сОО агжяокйслот-га:-: со?сг;ссп.. 2елок нз содэрги^ 5 • елсссзтезе триптофг-с-гг, Осо^тотзсз тр1шгоба»й яодгаергсано ргзульгатю-д Уй п ресцэнт^гД спег;грос'-:Рчй:-и Пр-.; Бозбутгдонки (Ьлуорзсценд-гл светом с зопп .280 нм нансету:.! изл^енпл

йай'лхшазтат при 303 «,1, 'ггэ соосватсгауз-г бяуерэгцеигднй тнро-

Ркс. Хроматография Ca) is 'рехраттографгя (б) at. ссззрозо .С1г-6В . !датерл&5£, содер?.;ацгго бело:: 63-к?, ' P.tultxcasis. .•

Колонке: 2,6 x'ICû с:.:; зхзевг: BSP pH 7,4; .скорость слгл;км: SO гл/час ■

1-Е - фрекциа, пзлучешщс при гель-фльтрацшг экстракта клеток" F. tularecsic (птег.ол ЛЬ)

ipexp""Epe3:p âpa:-.iyiK5 получению' при .рехроггатографа- фргкцкд Б.

В ДСН-ПААГ-злектрофорезе по Леьглли в редуцирующих и нереду-циругацих условиях молекулярная масса белка составляла 62 кД.

В препаратах, белка, подвергнутых замораживанию-оттаиванию, кроме основного компонента можно наблюдать появление, дополнительных белковых полос с меньвей молекулярной массой. ■

Очищенные препараты белка 63 кД сохраняли способность преци-литировать ижуноглобу л ияы иктактных кролика и человека. При анализе очищенного белка 63 кД методом ИЭЗ с использованием сыворотки против низшс клеток вакцинного птакна 15, было, обнаружено, что кроне оскоекого преципигирутазего когятонеота» являющегося белкой 63 кД, иногда выявлялся:слабовыр&ненный катодный компонент - ¿ПС.

Присутствие ЛПС в препарате очищенного белка 63 кД было подтверждено окрашиванием ДШ-ПААГ-олег-сгрофорэграьм нитратом серебра и методом кллуноблоттглга, с -использоззняеи 50КА' РВ 11-й, . специфичных к ЛПС, /

С -поиощьп гкбрццогяой технологи:: к'-белку 63 кД йъхгл получены . три клона гкбргщок, продуцируете. КНА, прилагуккащие к 1бб 2а подклассу. Методом ик%гки5лоте!Г:1га с щяаанениеи подученных !'-КА бело подтверждено, цгг, по крайне?, герз» два'пз .трсг» сыявляеклх г ДСН-ШДГ-зхскур«?форег'3 п;,.чт:п:-''-:?-:та с ггньге?? ксгсхуллрвоЯ мас-соГ.{ явдязтся фраг>.!г;па,:г- ос,—63 кодV»атагзегося заноргхп-

Еолс:: 63 к,Д с К31- г- !•£.'. с* чггг^агк. "¿разует »стгшг линии ппсцчцитац;^: при езпккодс'гзте-:;: со тлплф к. негу ¡СКА. На-

блтдаов н в ш^уноологтинх--? гзсигдлсйгтгйо бш:а 63 кД с сасц;:фп'л:1гс1 к б£Ц;:у 33 КЦ и с гпсу-Л^г?:':.';: у. Е'С, уиздозоэт ва взадзоэтзп агесж^уг: £3 ;»Д с •„.глеьуяс.'г. Ж.

' Г. ьелм; гг;льн;Ллаги сту^'-ур-:' л лра;'с,"ц.тп его

р::.с»;-плеитге ¿фепя&т;• с брг.'са;котигу?! в п;алсь

с;уцс сг.сцн.'З'Ччески рас'.уплгг? пели л сигну по К'.тпо-.нно-

т:.-.г. остат;:::". И резульг?'^ расцепления удсхогь пъзрияь

с. о;- 12 до •гз.г.ч»' сепсхасцпэ спосг-кгаиго^гйст'.о-езть с к кк^'кобдогг&т--::. ;ууук?о;: г..по-

йдя бежа 63 кД брокг>'.~:к< с 11{А №*&гес:*>ет -крсдсблагась, "¿о • ?.!оле:ула белка еодсрлиг поъторя^знься .асслз^охзахзлг пасти акичс-киз&от, сбрагуют^с дгтсржнгнт-.ч г-лт^суе^тулстпе с

лг'Са агл'^лнтд рао-ьлгУ-'.'^лслуллгЧо г ас^-лглм.у участг.? г^г-г^Уу-'-^:- - - '

На основе ЩА, специ&гчкъпг к белку 53 кД T'.Uünreasis на?,., получен иавмукосорбект, с помещаю которого методов етс^чной хра-катографии удалось »деять бело;с 63 кД. Афйшновэделзкньй аппарат белка 63 нД проявлух агташосль прк взаккэдейстзкк с нар-шлькыми ¡MCjHcrnotyjzíiiixj.: человека. Па дянна^. ДСК-ПААГ-)докт?с-йореза в вэд&ленао:; шгз?р£Л5 обьаруй-лвадск- основной кокяонвка с к.к. 63 еД. йетсггж сяэйтроскопаи не выявлено отличий в спо.-г.-раяьных хгфзктеркстаках иейду njenapaTatu». бзлка 63 (Д. видело.-.-кь&тл еффинко.') хро>,:атог*рк:г.--ъ:-. или гельфлльтрац5.еГ; на сефароаь Cíj-'бъ. Методов Из». псказйнз, что гф£иннсьыкелзвнн& apwiap<r. веска 63 кД Vfii; v.v, ке:: к С?ло:с, поху*сш£' агь-гроа-.а;: а-

сефдрозе С1.~£.з, сикус-тязг способность св.чс-нуатъея с 1Ш.

Данные ДСН-ПАдТ-одвк**?зйсрззе, НЭй к Юпууь'ООгэттвнга г к а -псхдзование*- как ЬЯл t'e/ку 63 кД, так' и llih., свггд'&ггпа О-депк ХПС, СЕдаеасгДъстЕуп" об асесдлад;::: J1XI-Í г

бег««: 63 кД с Хгр»где-;::А.- 0а.ткая£Г гаг.;:;екас^ (JL'.bri). геааоч&тогра.рщ в?. сефара;:- CI-6B, миграчнл оае/г. fee ir I, i гела агароза' под да^отапа: улектричесяси-о то,,;.;, а акаг афф:.. -нал хроиагограгг.я с прздсас-пиж SáS/i, ешцв&ввье; i бед:-;» i.:t на приводит к ncaacay отигпданя» £22 от ю^гку: Cea.: a-

Дня- азучешд структурно;. .с^гаякзаири igr гала бедг"-. 6Z г.., r.tulareaais (IgH -бела.-:) rea ГсН-бзлка, Ъцк кгзнкреъа:. г . клетках B»coii Е5 Чо-t (Павлов, ©21). Сраанаделаа:^ природного е ракоубккжкзге балдев аккгязЙ мзаЗрана; r.tuitr«.-síe показал» «о icX-desert, ввделегачий ir, кдото: г.ее ¿г, raí: iie, как а неправда: Селзк ыйтетдействевал с ч^зде^а

а ккйогкш:» По данник ДСК-аЬАГ-злектрофорса по д paay:a-

руццих и нзр^дуцярузцж усяэзмях колэкудлраая ыасаг. зрг'рогдеге рекамбиагитнеге ZsE-tfasaos оказалась аддотоаог и сосгазлкдд 63 еД. Рекоибкнаятгшй белок '6j кД ¡¡шгет изогяехтркч'зсиул точду PI прпредшай - 4,5. Вследствие стого раком5;:ааг$тк-:'.1 tíaaa::

5«еет оольг^а аяоднук ол&ктрйфррвтйЧ241^ kore^srcccs. яс с?вэ«о-с природном Озлхом 63 кД, ■ '

Срззнь*:ас>кь& аиддиз сл^-;трод по::алал, что coa препарата представяетт ссбой ¿.-спирадьинп бедкя с ыадсиг^уай»; нсстд прк 203 к 222" k¿. Одкадс, рассчитакаоэ из саеатров гД со-дзрзгаиз -сширзлей. дяа рц<гокбмнаатиаго. npecapara состашгялс

.'10+2 %, s го время как для препаратов природного белка 63 кД ->:о ссгтаэляло 55+5

3 отличие от природного белка 63 лД, способного взаимодействовать с I.5KA с сбразсзакием Ерецшгогатов» у рекомблнантного бел-

63 кД лрецнпнткру^деЯ активности не сбнг.руаеко, Связывание с-т.-а ШСА с рекоыбикантным белком показано кетсдоа юстуноблоттпн-га. Нужно отметить, что препарата рехсг.'Лингкского белка, з отли-

от природного, з 115л не взаимодействуй? с ¿ЗА ГВ11-х, что естественно свидетельствует об отсутствии в :*-% составе ЛПС va-iaratisis. Специальных не следований по определен;» ЛПС S.eoli з препаратах сменного белка 53 :<Д не проводилссь. Выявленные стпчая ъ ^¡глхо-дкмйчесшес спойеггвгч IgH -белхсз, вероятно, гггедзлдэтел ассоциацией ЛПС 'Fitulürcasis с природным бел-:-;см 63 кД.

С цельи изу:;ен:а механизма взалмаделстлил белка 63 кД с Ho~zc6ymmsim на сорбенте белок 63 »Д - -че^эроза 43 были получе-■аз с- человека"По дгнмм ДСН - ¡ШГ-здегстрофсреза еф^икнозк-дедекнай 2gG '-елезеха был яредстаглзя двумя полосами, соотзет-сггу:оцнмл легло;": г: тггелоЗ целям у^а. Пел анализе указанного препарата с ск'ггснгсрс'ггаки z подклассам х.тО человека и ап-т;'.смвсрот:;а:,1-; л X -цеплм бкло усггноплеио, что. IgG,

сгяг'-зггцкйс.т с Седкеч 53 тсЦ 'Г.1:и1пге:?ь1з, сс:«гедлетага к IgG-i • подклассу и з его ее стазе зняблскл «;-1-"улеглобул:з-:н, ¡сиекщие как тал г: л -леглна цепи. Данная особенность белка 63 кД F.tu-xa«isci3 предполагает гезмехпееть непельзогания его для ездс-$: хз;/ч0":1л ' I^G'j. а 10 раз сдтлвиссти в для

IgG"., «явленного г^фгаасЗ жематег^елмь» свидетельство-

вать в псг-т.-зу голо, t-.ro бэлон 53 дЛ, . ?.tular«oi5 ' содержит пе-рггресг-л-оргсгнрукжо аятиг-ьн-'Гя'е детеу'.гглгшн другяа грш;отр«ца-ггдьшк. c'raraei и8. Наличие зо внешнем дсмш-ктчьк

бадкез с пере;:рсстнореагкруггм!Э1 дегерезангакп спи-

сано дгй ::;;poiccro спектра баглергаЦ Ухагекгнз"по даннмм' ДСН-ПДАГ-олектрофсреза имеют мслокулярк» маесн ъ диапазоне иО-65 кД. Для очкцеккюс бедяоа 60 гД "X.eaterocelitica; к 60-62 гД, 62-05 кД р.pers»sinose ' по донкам гельфильтрадни такте, :;£:; и в случае о бэлксы 63 дЦ -J-tulcrcasis, молекулярная-са сказалась ра-нс;1 400-500 кД (Hofs+ra, -!9?3; 19?-" i

Pliknji;'^, 1337; ÄKpcliaste-, ^E-^chlj

Биологическое значение белков с пзракрестнореагиругациш антигенными детерзлинантаиа еще не ясно. & то ае время ькжсно предположить, что на начальных стадиях инфекционного процесса для пс-луоблигаткых пнутсиклсточных микроорганизмов, к которым относятся и тудяремайньй микроб»'иадичае перйкрзстасреагиругацих мембран яых белков долнкэ слссссстэог&ть усиленао сорбции бактерий иа поверхноста фагоцитоз,.• Причем, яза<шис:шо от того, является ли белек 63 кД 1§--рецвпгорсм sum ц.грекрестнореагирузсщда! белком, KtBHO рассчитызе>ть на е-го -учас-еко з усиления процессов сорбции и проникновении F.tuaaressis • з фагоциты» так как з обоих случаях юлуноглобулкиз, црякреаивзйсся к поверхности бактерям, будут способствозать з конечном глогв лроцзссу проамгяовениа,

Из-за стеутстаяя в ч-злем распард.*лен! ¡ епзцяфжесхих гнтисьъа-роток, ita Н2 ¡иеяя зос-лс ¿сети подтвердить причастность баяна 63 кД F.-tul^sasis з упемянугда ьизе перезрестнореатиругцл-л белкам г.шкрйоргйл.чззю'з, 3 tq ьр-лыг, зздедйниа . IgO, саязч.-закци^ся с йгх&ьа ьЗ ,-Д :tci яо?ед>п<яда сайта сшснлодия на молекуле длл вмьа S3 хД -шводидА бы дополнительно прсин-герлретярезлть участло косадаего з роли пзрзкрветне?^агирух^гсо белка ила реерптерд длд

С s-sc'rt цввьэ кэш- r¿4-í пспользсгг-ч v-зтсд. якауноблеттинта. Вайс я3 зД, а&ченшлй перчкод-ас* грсыз, чллй^одалстаоггл с иодекуяг^.. •IgG, -ero íícb')-,-» •£ • Л:-чручгмеатамл (ДС^-ШШГ-злеК'Г

рофорез баз 3 -¿.'¿р.<а.птс&гшола); с датоаа и таззльедд цепии ¡ Ig<% остаткам лергж л тякглнг rensá Fa'o"" и -jpar

иентов (ДСЙ-41ААГ ~зД9:<арсфор£3' с .1 -:.:=рхаптаотанатсм), Все это поззадаст нзд едзлг^ь гавед, ¡лхтактндя кслекула r^G- человека \~.iC8T дна саЛта езязнвзяая белка 63 ¿Д F.tularsasisí на

?а> -фагпектз и трахчкжо.

' ■ Связывание белка ¿3 кД с я Н-цеплми, яричза для лоследнп а области 7с -фсагцеитй. (Ch'.j—CIí^), лагчот свидетельствовать о -тем, ч а сайты езязазанкя иа молзц ле • igs долякн представлять «обой гшсгрватнзиуп ажяоаисяотйузз последовательность, арисут-стаукнуя как з Е-а. таа ti I. -целях. Для уточнения отото лслола-ная•требувтея . едз. дсисянмелькыэ засаеридаг-галькна аэдтверх ' денлд-'í '.'... - " '

лрэнз того, м; кс рслмяиг'гя- ""кк;;.::' с бчг.".:одс,:с7в:у: белка СЗ ;;Д с зарглСсл» ны.\п учаоткггл г.- н Ь -цспэя, форк^-рута»:^: ах-апрны?. центр колгсула- 1г,с, лрелстазлякс.гЯ собой антитела к пе-рекрсстнореагирупгапн ант^генн-г' цотерм;«.кгктй>' гр^".о?р;:цательк:?. бчктеркй. Скорее всего ввг::.'.*сие:'ст-вки белке 63 кД с Тез соу-сестЕляется ко затрагивая активна?. цзетр антител, образований Еар;:аоельч1в.с{ участками Ь- и К-цепе?. Подтрертлеиием зтз;.-; является з&зктг.рнэе связывание белка с ь- и К-цепяш:, пелучен» нък;: е условиях разрушения актксного центра гтуте.у. восстяноеле;г-.т межцепочечна: Э-З связей обработкой & -иеркаптоэтаноло:.«..

При изучении поверхностных структур р. иц агет^в пекззачо, что препарата Ел проявляют ввр«&гас:е саци.тные своРс-ва для гн-лей и корекк свинок, зарагсекних вирулентна';.: штаммом 503 возбудителя туляремии (.Хлебников, 1991). Сеноачывд компонента-« вчел-нпх мембран гра^отрицательных бактерий являются лилояолисахз.р;:да' и |.:з:'бранные белки. Причем, препарата -ШС, выделзштые как не £1, так ч из ацетон-змзусекных клеток не закидают ¡жей Л1зи:и СВА от гибели при заражении Еирулентньа: сгсскмэг. 503. В то время было показано, что к.аукчзация ПШ, сод-зркацнмх белки с 17-20 кД приводит к развитие залитного ту.тярег.'.нйлюго имунитет-а. Функциональная роль других оенэвнкх белко? (62, 47, '43, 12 кД) ВЙ Г.ги1аггпв18 е формировании насупите?а окончательно не изучена.

Проведенное нами определение заметках свсйстр препаратов белка 63 й показало, что ренокбинантннл и еасокоачгаеааьй белгге протективной активностью не облапан«.. Незначительны!.*.:: загичкатл свойствам: (увеличение а лва раса предолкктальксстп жизни уяьот-ккх) облапали лклополисьхаркд-белковые ког-ллехен белха 63 е.. ваделешпе пг Р.га1аг»еаз1в. Конструирование ЛЕК (ЛЛС + ое-лок 63 кД; с различным соотнесением ссдеу:а.ч;;л XX и бэлка но возводило получить препараты с защитными свойствами.

Ш1ЗОЛЫ

1. У возбудителя туляро!,;ин обнаружен ¿- -епиральшй, глико.-и-лировачнын оелок с молекулярной массой 63 кЦ, вяаимодоЯстгу.пип с иьо.-.уноглобулнпаь:;; человека и кролика.

2. Определена оскознчс фазлко-хикичесиие я им.'унох.нглчаекпе характеристики белка 63 «д Р.ги1агеп81с.

о

га

3. Показано избирательное взаимодействие белка 63 кД с IgG-( человека. Белок 63 кД связывается с,: lg& человека в области Fab и Fc -фрагмента-,

4» Предложен способ получения очищенного белка 63 кД с использованием колоночной гель-фильтрации, на сефарозе сгг-6в.

5. Иммуншз.-ция очищенным белков 63 кД или ЛПС - белковыки комплексами Ш2С - бедок 63 кД) не приводит к формированию защитного иммунитета у 'шЕей при рксперимант зльной туляремии.

6. Получены три шталаш. культивируемых гибридных клеток, продуцирующие ионоклональные'антитела, специфичные к белху 63 кД i'.tularen.sis-

Ш(Ж Pi\E0T, ОПУВШОВАННЫХ Ш ШЕ даСОТЭДйй

1. Хлебников B.C., Ве.-чинин С.С., Коровина О.В. // А.с. 326.048 СССР УКИ4 С 12 Н I/IOO; Л 6IK'39/42 (II.12.39 г.) // Гибридная клеточная линия Г? 2-4, продуцирующая моноклональные антитела к йшу4»оглобул1Исвязцзаю:!;еыу белку 63 кД Fraacisells. tuiarenais , (СССР), - 3 с.

2. Haletaisov V», Eororina О., Goloviiov I., Vetchtsis S., Zheissliugov V., lasers. 0., £uleviiisL~ D., Uraoov JT. Purification and inanascheaical cbarasteristics of the 63 fcDa pt-otoini'rorr. Txsaaciaslla.. tulaxoasis •//" ¿0 th 1'oaiix.s i££S: Abstracts. - Budapest, 1990. - P. 173.

; 5. £ulsvat25cy ¡3. , Goloviiov I., SciOTina 0., KhleoaicovV., te-cov У. Gc&fcnzaticzoX rceisstesct or 65 Ы5а protein irsa the outer яешЪгеав Psojaoiaell& t-abureasis // 20 tb. Eectiag FBBSs Abstracts« - Bideyast,. 19»0. ■ - 1?'4-."-

ь. Eiletaiir.oi? V.i Sklevatsk? •!).£. » Goi Jvler I.S., ?o<sh.tsay~ cfcava ff.V., Jvcria С.?., КогслгХгл. C.7., Chueuaor i.U» Ztvilc,p-•beat of Boleculec uatilularcaic. vacciass aj^iv-acijas ml:i prospect // Utt Heet3B£ Buxop. ^TlAsrat^ йжеао!» Sacieetic: Alstxaets. -Finle: i, £3-22,

•5. Хлебников Еуа&с&иккй Д.Я,, Гсдоаясн И.Р., Техтамьке-ва И.В.» £еичугез Б.2., Ааиркя .С.?»., Коровина О.В., ¿¿аказ&зг С.С. Иерелелтнаа цезд&пил яроуиготудярсм:1Г;нк/ вакцид дазегс поде-леннц .'/ Аг?уадз»н. пробл.' проф. тудг^ах-н: Тес. долл. Зсассаа. конф. 15-Г? okiv IS3I. г:, Сшоарспол*.' - У.., IS3L. — С. Ей-18а-,' ; - -

5. Хлобникоа 3.0., Корспкиа О.В.. Кулев:::;нкл Д.Л., лег лугоз 1.2. &-:.гуноглсбул!п:епя.-шв£ет51й белел 63 тудлречг^него микре-/а /У Генетика а бко».-шя в;грулентпсс?л возбудителен особо епас-

:с5фскций: Тез. дскл. РосспЛсксП чяупюЯ кс«^. 2.1-22 out. 19v2. Голгоград. - Волгоград, 1992. - С. 143.