Структурно-функциональная характеристика систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnei 47

Карягина, Анна Станиславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная характеристика систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnei 47
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnei 47"

На правах рукописи

КАРЯГИНА Анна Станиславовна

Структурно-функциональная характеристика систем рсстрикцин-модифнкацнн ДНК штамма Shigella sonnei 47.

03.00.03, - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биологической и медицинской химии РАМН и Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (г. Москва).

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Б. Ф. Ванюшин

доктор биологических наук, профессор Я. И. Бурьянов

доктор биологических наук С. X. Дегтярев

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт физико-химической биологии

им. А. Н. Белозерского, МГУ

Защита диссертации состоится "_"_ 1998 г. в_часов на заседании

Диссертационного Совета Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (127550, Москва, ул. Тимирязевская, д.42).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Автореферат разослан "_"_1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, /)

кандидат биологических наук (О /я^иг С. А. Меликова

1. ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Основная функция систем рестрикции-модификации (Р-М) ДНК Н типа, компонентами которых являются эндонуклеазы рестрикции (ЭР) и модифицирующие ДНК-метилтрансферазы (МТЛ), сводится, как принято считать, к защите бактериальной клетки-хозяина от проникновения чужеродной ДНК. Кроме того, имеются данные о том, что эндонуклеазы рестрикции принимают участие в рекомбинационном процессе in vivo. Показано, что ферменты рестрикции и метилирования могут оказывать влияние на такие важнейшие клеточные процессы, как репликация, транскршщня, транспозиция, ускорять мутационный процесс.

Эндонуклеазы рестрикции, а в некоторых случаях и ДНК-метилтрансферазы, широко применяют для получения рекомбинантных ДНК, проведения генетических и молекулярно-биологических исследований, в том числе исследований в области биомедицинской химии и сельскохозяйственной биотехнологии. Это определяет актуальность прикладного аспекта изучения систем рестрикции-модификации, заключающегося в широкомасштабном поиске новых природных продуцентов эндонуклеаз рестрикции и метилтрансфераз, получении высокоэффективных продуцентов ферментов геино-инженерпого комплекса на основе клонирования генов эндонуклеаз рестрикции и метилтрансфераз и разработке схем выделения высокоочищенных и стабильных ферментных препаратов.

Высокая специфичность ДНК-белкового связывания, определяемого ЭР и МТЛ. и огромное разнообразие последовательностей, узнаваемых ими в ДНК, делает актуальным исследование на основе этих ферментов специфического ДНК-белкового взаимодействия с использованием разнообразных биохимических, молекулярно-биологических и физико-химических подходов, а также рентгеноструктурного анализа ДНК-бедковых комплексов.

Необходимо также отметить медико-экологический аспект изучения систем рестрикции-модификации ДНК. Эти системы широко распространены в штаммах бактерий, естественной средой обитания которых является организм человека и животных. Многие из этих штаммов патогенны. Лечение заболеваний с помощью антибиотиков затрудняется тем, что среди бактерий легко происходит перепое плазмид, определяющих множественную лекарственную резистентность. Присутствие систем рестрикции-модификации, с одной стороны, предоставляет преимущество несущим их клеткам бактерий, придавая им повышенную устойчивость к инфекции бактериофагами. С другой стороны, системы рестрикции-модификации способны

ограничивать перенос факторов множественной лекарственной резистентности. Поэтому локализация генетических детерминант систем рестрикции-модификации и изучение способов их распространения в природных сообществах микроорганизмов имеют самостоятельное значение.

Присутствие в системе рестрикции-модификации рестрицирующего компонента делает систему рестрикции-модификации потенциально опасной для содержащей ее клетки из-за возможности фрагментирования клеточной ДНК в условиях дефицита метилтрансферазной активности. Это определяет актуальность проведения комплексных исследований систем рестрикции-модификации ДНК, включающих в себя, наряду с характеристикой отдельных компонентов системы, выявление специфических механизмов регуляции, обеспечивающих возможность существования и функционирования системы рестрикции-модификации ДНК в клетке бактерии.

В настоящей диссертационной работе на примере изучения структурно-функциональных особенностей систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnei 47 осуществлено комплексное исследование систем Р-М, включающее в себя характеристику природного штамма-продуцента, получение непатогенных и высокоэффективных продуцентов рекомбинантных ферментов, изучение генетической организации систем рестрикции-модификации и особенностей регуляции экспрессии генов, а также фундаментальные исследования специфического взаимодействия эндонуклеаз рестрикции и метилтрансфераз с ДНК.

Объекты исследования, цель и задачи работы. Системы рестрикции-модификации Ssol и SsoU штамма Shigella sonnei 47 были выбраны в качестве объектов исследования по нескольким причинам. Система Р-М Ssol представляла особый интерес для проведения сравнительных биохимических и молекулярно-биологических исследований с родственной ей, одной из наиболее хорошо охарактеризованных систем Р-М, системой ЕсоШ. Проведение такого рода сравнительных исследований казалось особенно важным в свете данных, полученных при сравнении систем ЕсоЮ. и Rsrl, позволивших пересмотреть интерпретацию рентгеноструктурного анализа комплекса эндонуклеазы рестрикции £coRI (R.b'coRI) с ДНК и существенно дополнить имеющиеся представления об организации, функционировании и возможных путях эволюции систем рестрикции-модификации. Система Р-М SsoII представляла собой наиболее интересный объект для проведения фундаментальных исследований. ЭР и МТЛ SsoII имеют участок узнавания (5'-CCNGG-3'), полностью вырожденный по центральной нуклеотидной паре. Это делает его похожим на участки узнавания многих

других ферментов и открывает широкие возможности для характеристики механизмов специфического ДНК-белкового взаимодействия на основе сравнительного анализа с близкими системами Р-М. При исследовании генетической организации системы Р-М SsoII были выявлены особенности, позволившие предположить наличие у этой системы специфического механизма регуляции активности генов, что в последующем было подтверждено экспериментально и исследовано. За последний год появились сведения о генетической организации еще двух систем Р-М, ферменты которых узнают последовательность 5-CCXGG-3' (Miyahaia et 2!., 1997; ГЬзпег et al., 1997). Генетическая организация этих двух систем практически идентична организации системы SioII, за исключением того, что в случае одной из них ген эндонуклеазы рестрикции содержит делецию и продукт этого гена неактивен (Tbanez et al., 1997). Высокий интерес исследователей к системам такого рода подтверждает актуальность выбора системы Р-М SsoU в качестве объекта исследований.

Цель работы заключалась в осуществлении комплексного исследования систем Р-М ДНК у бактерий на примере систем рестрикции-модификации штамма S. sonnei 47.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1. Фенотипически охарактеризовать штамм S. sonnei 47, природный продуцент ферментов S.tnX и &о11, и плазмидную систему штамма. Идентифицировать генетические детерминанты систем Р-М Ssol и

2. Клонировать гены ферментов Ssoil и Ssol! и определить нуклеотидные последовательности генов. Охарактеризовать генетическую организацию систем рестрикции-модификации Ssol и SsoII.

3. Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей всех известных к настоящему времени систем Р-М и аминокислотных последовательностей ЭР и МТЛ с целью выявления родственных систем Р-М и разработки последующей стратегии исследования систем Р-М Ssol и Soll.

4. Сконструировать непатогенные и суперпродуцирующие штаммы ферментов на основе рекомбннантных плазмид, трансформированных в Е. coli, и разработать схемы выдетения высокоактивных гомогенных препаратов ферментов, необходимых для проведения фундаментальных исследований специфического взаимодействия ЭР и МТЛ с ДНК.

5. Исследовать особенности взаимодействия ЭР и МТЛ с синтетическими ДНК-дуплексами, несущими узнаваемую последовательность 5'-CCNGG-3', в которых

модифицированы или удалены отдельные структурные элементы центральной нуклеотидной пары.

6. Изучить особенности регуляции экспрессии генов в системе Р-М £гоП.

7. Исследовать особенности ДНК-белковых взаимодействий, обусловленных регуляторным М-концевым доменом метилтрансферазы &оП (М.&оП). Идентифицировать остатки ДНК, которые могут образовывать контакты с этим доменом белка в ДНК-белковом комплексе метилтрансферазы £гоП.

8. На основе экспериментальных данных и компьютерного анализа разработать и теоретически обосновать модель ДНК-белковых контактов в комплексе МЛгоП с ДНК.

9. Обобщить собственные экспериментальные данные и результаты исследования других систем Р-М для выявления общих закономерностей функционирования систем рестрикции-модификации ДНК и регуляции активности генов в этих системах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Генетические детерминанты систем рестрикции-модификации &о1 и &оП имеют плазмидную локализацию, что определяет широкую распространенность Ssol- и &оИ-подобных систем среди представителей сем. Еп1егоЬас1епасеае.

1. Метилтрансфераза &о11 представляет собой бифункциональный белок, помимо метилирования последовательности б'-ССЫйО-З', осуществляющий регуляцию экспрессии генов в системе рестрикции-модификации &о11. Выявлен ряд других 5-метилцитозиновых ДНК-метилтрансфераз, имеющих структурную гомологию с М.&оН, с высокой вероятностью также способных выполнять регуяяторную функцию.

3. Контакты между остатками ДНК и белка в комплексе метилтрансферазы 5зой с регуляторным участком ДНК, расположенным в межгенной области системы рестрикции-модификации &о11, осуществляются в соответствии с предложенной схемой. Охарактеризована роль отдельных структурных элементов центральной нуклеотидной пары участка узнавания 5'-ССЫОО-3' во взаимодействии метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции £го11 с ДНК.

4. Регуляция, основанная на специфическом взаимодействии ДНК-метилтрансфераз с собственной промоторной областью, представляет собой новый способ регуляции экспрессии генов, характерный для многих систем рестрикции-модификации ДНК.

Научная новизна работы. В настоящей работе осуществлено комплексное исследование двух систем рестрикции-модификации ДНК. В процессе выполнения исследования получен ряд научных результатов, сформулировано несколько предположений, выводов и обобщений, имеющих приоритетное значение:

1. Впервые осуществлена характеристика уникального плазмидного комплекса штамма & .чоппе! 47, состоящего из 10 плазмид различного молекулярного веса. Локализованы плазмиды, определяющие системы Р-М &о1 и &о11, устойчивость к стрептомицину, колициногенность и иммунность к колицину Е1, а также копыогатпвпость (Каряпша и др., 1989; Кагуагта е» а1., 1990).

2. Впервые охарактеризованы генетические детерминанты систем рестрикции-модификации &о1 и &о11 (Кагуа£ша е! а1., 1993). Установлена практически полная идентичность генетической организации систем Р-М £иэ1 и £соШ. Осуществлен сравнительный анализ генов ЭР и МТЛ &оП с генами других ЭР и МТЛ.

3. В процессе исследования взаимодействия ферментов 5до11 с синтетическими аналогами субстратов, модифицированными по центральной нуклеотидной паре, впервые обнаружено появление нового места гидролиза ДНК эндонуклеазами рестрикции при введении ряда модификаций в участок узнавания (Кубарева и др., 1992; КиЬаге\аег а1., 1992).

4. Исследована регуляция экспрессии генов в системе Р-М &оП, опосредованная М.&о11 (Кагуа§та й а1., 1997). В М.ЖгоП и ряде других МТЛ с высокой вероятностью предсказано существование типичного для регуляторных белков модуля "спираль-поворот-спираль", по-видимому, вовлеченного во взаимодействие с ДНК в процессе связывания М.&о11 с собственной промоторной областью. На основании экспериментальных данных и теоретических расчетов предложена модель взаимодействия М.&оП с ДНК.

5. Высказано и обосновано предположение о том, что регуляция экспрессии генов, основанная на взаимодействии метилтрансфсразы с собственной промоторной областью, представляет собой новый способ регуляции экспрессии гепов в системах Р-М (Кагуадта е1 а]., 1997). Предложена модель "маятниковой" регуляции, основанная на колебании уровня синтеза метилтрансферазы в клетке.

6. Показано, что для МЛоИ характерно одновременное присутствие двух ДНК-связывающих доменов - одного, типичного для всего класса этих белков, расположенного в вариабельном участке и ответственного за взаимодействие со специфической последовательностью б'-ССЫОО-З', и второго, локализующегося в Ы-

концевой части M.&oII и обеспечивающего взаимодействие с межгенной регуляторной областью системы Р-М SíoII (Karyagina et al., 1997).

При выполнении исследования были разработаны оригинальные подходы, применимые для исследования других систем Р-М и ДНК-связывающих белков:

- разработан новый метод количественной оценки ферментативной активности метилтрансфераз in vivo, заключающийся в выделении препаратов плазмидной ДНК из клеток штаммов до и после индукции в стандартных условиях, проведении гидролиза эндонуклеазой рестрикции и анализе продуктов гидролиза в агарозном геле с последующей денситометрией (Kaiyagina et al., 1995).

- разработан новый подход для расчета констант диссоциации ДНК-белковых комплексов, основанный на графической интерпретации результатов неспецифического вытеснения ДНК из ДНК-белкового комплекса с известной константой диссоциации.

Научно-практическое значение работы. В результате раздельной трансформации плазмид S. sonnei 47 в клетки Е. coli и клонирования генов ферментов &о11 получены непатогенные продуценты R.&ol и M.SsoI, R.S.roII и M-SsoII и только M.&OII. Штаммы несут лишь одну систему Р-М, что автоматически снимает вопрос о необходимости разделения интерферирующих ферментных активностей в процессе выделения ферментов. Уровень продукции ферментов в штаммах Е. coli B834/d24 и /d33 в 10 раз превышает уровень продукции, обеспечиваемый S. sonnei 47. На штаммы Е. coli B834/d24 и Е. coli B834/d33, а также рекомбинантные плазмиды d24 и d33 получены авторские свидетельства на изобретение (Дебов и др., 1989 а и б).

Разработан новый метод выделения гомогенного препарата R.&oII с использованием колоночной хроматографии на основе современных сорбентов, исключающий стадии промежуточного диализа (Карягина и др., 1993). Метод может быть адаптирован для выделения аналогичных ферментов.

Сконструированы суперпродуцирующие штаммы R.&oII, M.ÄoII и M.NlaX, основанные на рекомбинантных плазмидах с индуцибсльными промоторами, трансформированных в Е. coli. Продукция M.&oII составляет 1,5%, R.SyoII - 20% и М.МаХ - 67% от суммарного белка клетки (Kaiyagina et al., 1995). Продукция R.SíoII и М.&оП, обеспечиваемая этими штаммами в тысячи и десятки тысяч раз превышает уровень продукции исходного штамма S. sonnei 47. Разработаны и оптимизированы схемы индукции и препаративного выделения ферментов (Karyagina et al., 1995). Степепь очистки препаратов ферментов составляет 90-98%, концентрация белка - более

1 мг/мл, активность - более 50 ед./мкл, что позволяет проводить на их основе биохимические и физико-химические исследования.

Личный вклад автора. В цикле исследований, включенных в диссертацию, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи, проведения молекулярно-биологических, биохимических и физико-химических экспериментов до обсуждения и литературпого оформления полученных результатов.

Апробация диссертации и публикации.

По материалам диссертации опубликовано 30 работ.

Результаты работы были доложены на Всесоюзном совещании "Гибридные плазмиды и экспрессия плазмидных генов" (Пущино-на-Оке, 1984), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино-на-Оке, 1986), на

международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: прогресс и границы практического использования" (Москва, 1991), на конференции FASEB "Эндонуклеазы рестрикции и модифицирующие метилтранеферазы: структура и механизм" (Сакстонс-Ривер, Вермонт, США, 1993), на XVI международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Нью-Дели, Индия, 1994), на 3-ей конференции IUBMB "Молекулярное узнавание" (Сингапур, 1995), на XI международной конференции по применению компьютеров в химтгеских исследованиях и обучении (Париж, Франция, 1995), на международной конференции по молекулярной структурной биологии (Вена, Австрия, 1995), на конференции FASEB "Ферменты, действующие на нуклеиновые кислоты" (Сакстонс-Ривер, Вермонт, США, 1996), на 3-ем и 4-ом рабочем совещании New England Biolabs по биологической модификации ДНК (Вильнюс, Литва, 1994; Инсбрук-Иглс, Австрия, 1997).

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа, общим объемом 331 стр., состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя (337 источников), содержит 19 таблиц и 44 рисунка.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Функциональная характеристика плазмид штамма Shigella sonnei 47.

При характеристике штамма S. sonnei 47 - продуцента ферментов рестрикции и метилирования Ssol- и &о11-типов - было показано, что штамм устойчив к высоким концентрациям тетрациклина (25 мкг/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл) и продуцирует колицин, идентичный или близкородственный колицину El. Такие признаки, как колициногенность, наличие систем рестрикции-модификации, а также антибиотикоустойчивость у бактерий сем. Enterobacteriaceae, как правило, определяются присутствующими в штамме плазмидами. Для функциональной характеристики отдельных компонентов плазмидного комплекса S. sonnei 47, в частности, генетических детерминант систем Р-М Srol и SsoII, были получены штаммы Е. coli, несущие лишь часть плазмид S. sonnei 47 (Рис. 1). Такие штаммы получали с помощью трансформации плазмид S. sonnei 47 в клетки Е. coli или конъюгации между

Рис. 1. Элекгрофореграмма препаратов плазмидной ДНК различных штаммов: (1) Т10, (2) S13, (3) XS6, (4) XS15, (5) Т7, (б) XS3, (7) XS13, (8) S. sonnei 47. Штаммы серии Т получены конъюгацией между S. sonnei 47 и Е. coli PS200 при отборе по признаку TcR, серии S -по признаку SmR, серии XS - трансформацией плазмидами S. sonnei 47 штамма Е. coli PS200 при отборе по устойчивости к логическому бактериофагу ХЬ221. Плазмвды ВМВ плазмиды высокого молекулярного веса. Анализ плазмидной ДНК проводили электрофорезом в 0,8% агарозном геле.

S. sonnei 47 и различными штаммами Е. coli. Сопоставление фенотипа производных штаммов и их плазмидного профиля (Табл. 1) позволило выявить однозначное соответствие между наличием в штаммах плазмиды Р7 и устойчивостью к стрептомицину, плазмиды Р5 и колициногенностью, плазмиды Р4 и системы Р-М SíoII, плазмиды Р6 и системы Р-М Ssol. Одна из высокомолекулярных плазмид (Р9), способна осуществлять соперенос низкомолекулярных плазмид и определяет конъюгативностъ клеток & sonnei 47. Кроме того, высокомолекулярные плазмиды Р8 и Р9 способны обеспечивать устойчивость к бактериофагу, не связанную с системами Р-М Ssol и ХгоИ. Результаты функциональной характеристики плазмид штамма S. sonnei 47 суммированы в Табл. 2.

Плазмидный состав и фенотип штаммов Е. coli, несущих плазмиды S. sonnei 47.

Таблица 1.

Название штимма

&о1Р

вмгг

S. sonnei 47

АКТ

АА10

НВ4

С600НВ4

Т10

S13

HS6

XSI5

Т7

2x10

XS3

XS13

XS2

XS4

5x10

Т2

ТЗ

Т12

S12

S16

XSU

1x10

XS9

2x10

'¿icH - присутствие R и M.&oll в клетках; СоГ -устойчивость к колицину El и способность продуцировать колицин El; 'Sxol - присутствие R и М&о! в клетках; rSmK - устойчивость к стрептомицину; 3TcR - устойчивость к тетрациклину; еВМП - присутствие высокомолекулярных плазм ид; *ЭГ1Б - эффективность посева бактериофага ХЬ221 на различных штаммах (за 1 принимали эффективность посева на штамме Е. coli PS200); 'В некоторых штаммах эффективность посева бактериофага не определяли.

Со!

Sso

Тс

-h

+■

Таблица 2.

Плазмиды и определяемые ими фенотипические признаки штамма 5. sonnei 47.

Плаз.мида Фепотипический признак

PI (1,9 т.п.н.) Криптическая

Р2 (2,4 т.п.н.) Критическая

РЗ (3,8 т.п.н.) Криптическая

Р4 (4,25 т.п.н.) Система Р-М &о11

Р5 (4,7 т.п.н.) Колициногенность и иммунность к колицину Е1

Рб (5,1 т.п.н.) Система Р-М &о!

Р7 (6,2 т.п.н.) Устойчивость к стрептомицину

Р8 (40 т.п.н.) и Р9 (65 т.п.н.) Устойчивость к инфекции бактериофагом ЯЬ221

Р9 (65 т.п.н.) Способность быть донором при конъюгации

1.2. Характеристика генетической организации системы рестрикции-модификации Яи»1.

ДНК плазмиды Р6, определяющей систему рестрикции-модификации &о1, была клонирована в векторе рОЕМ4г, осуществлено рестрикционное картирование клонированного фрагмента, получены производные плазмиды, несущие различные фрагменты плазмиды Р6 и локализована область, кодирующая гены и ио/Л/.

Рестрикционная карта плазмиды Р6, схемы производных рекомбинантных плазмид и фенотипы штаммов, определяемые этими плазмидами, представлены на Рис. 2.

р М HDB Р О А ЦК

I I I I I I—I ■■>—

р* рМ

ssoIR ssoIM

pSM2

pSNl

pSN2

pSN3

pSN4

pSNS

pSRM2

pSN5

pSMl

pSRMl

6 Т.П.Н.

Фенотип

R M

— +

— 1

+ +

Рис. 2. Рестрикционная карта плазмиды Р6, схемы производных рекомбинантных плазмид и фенотипы штаммов, определяемые этими плазмидами. За 0 принята точка начала координат области, кодирующей £coRl гены в плазмиде pMBl (Newman et al., 1981; Greene et al, 1981). Шкала в т.п.н. относится к верхней и нижней частям рисунка. А. Участки узнавания эндонуклеаз рестрикции: М, Mlul; Н, HindüV, D, Dräl; A, Aval; К, Крп\\ a, Accl; С, CfrI; с, C/al; р, Pvuil; Р, Pst1, В, Bgill. Звездочкой отмечены участки узнавания ЭР, расположенные одинаковым образом в плазмидах Р6 и ColEI; кружком - в Р6 и pMBl. Длшшыми стрелками обозначено относительное расположение и направленность генов ЭР и MTJI Ssol. Б. Стрелками обозначены места соединения ДНК вектора pGEM4Z с клонированными фрагментами в плазмидах pSMl и pSRMl. В правой части рисунка обозначены фенотипы, определяемые рекомбинантными плазмидами.

Нуклеотидная последовательность участка, кодирующего гены ферментов системы &о1, была определена (код в вепеВапк - М97479). Анализ нуклеотидной последовательности показал, что генетическая организация системы практически идентична организации системы ЕсоШ (узнаваемая последовательности ферментов обеих систем - 5'-ОААТТС-3'). Обнаруженные отличия в кодирующей области генов представляют собой замены одного иуклеотида в третьей позиции кодопов, и не

приводят к аминокислотам.! заменам. Область плазмиды Рб, расположенная вне фрагмента, кодирующего гены ssaIR и ssoIU, была проанализирована на основе сравнения рестрикционной карты этого участка с рестрикпионными картами плазмид ColEl (6,65 т.п.н.), определяющей продукцию колицина El, ц p.Yffll (9,5 т.п.к.), несущей гены ферментов £coRI (Рис. 2). Позиции большинства участков узнавания эндонуклеаз рестрикции в исследуемом фрагменте плазмиды Р6 с точностью до 1-2% совпали с позициями участков узнавания тех же эндонуклеаз рестрикции, во фрагментах ДНК плазмид ColEl и рМШ, соответствующих гот и mob функциональным областям этих плазмид. Это, вероятно, свидетельствует о высокой степени гомологии нуклеотидных последовательностей плазмид Р6 и рМВ1 также и в области, расположенной вне участка, определяющего системы рестрикции-модификации, и родственном происхождении этих двух плазмид и плазмиды ColEl. Таким образом, системы Ssol и £со R1, по существу, представляют собой одну и ту же систему Р-М, распространение которой среди бактерий сем. Enterobacteriaceae связано с переносом плазмид.

2.3. Характеристика генетической организации системы рестрикции-модификации iSfroII.

ДНК плазмиды Р4, кодирующей гены ssolIR и ssolIAi, была проклонирована в Е. coli. Фрагмент ДНК, несущий гены ферментов ХтоИ, был идентифицирован с помощью рестрикционного картирования и фенотипической характеристики штаммов, несущих производные плазмиды. Схемы производных рекомбинантных плазмид представлены на Рис. 3.

Размер генов ssolIR и ssolIM оценивали по молекулярной массе соответствующих белков, экспрессированных в бесклеточной системе сопряженной транскрипции и трансляции из клеток Е. coli (Рис. 4.).

Проводили сопоставление белковых профилей, определяемых плазмидами Р4 и pRMS 1, кодирующими гены ssolIR и ssolIM., и плазмидой pMS2, в которой ген ssolIR инактивирован (Рис. 4). Белок размером 43 кДа, экспрсссирующийся при использовании в качестве матричной ДНК всех трех вышеперечисленных плазмид, по-видимому, соответствует продукту экспрессии гена ssolIM, а белок размером 35 кДа, не синтезирующийся в случае плазмиды pMS2, соответствует продукту гена ssolIR.

S UEScCr I II I. I.

CEV

■ II.

R*M*pRMSl RM'pMSI RM-pNSlO . R M-pNSII

R"M" pNS2 (1-8)

R'M*pMS5 R"M*pMS6

R"M"pNS51 RM-pNS31.32.33

R1» 2

Рис. 3. Локализация генов ssoIIR и ssoIIM на рестрикционной карте плазмиды Р4 и схемы производных рекомбинантных плазмид. Прямоугольниками обозначена ДНК плазмиды Р4. Внизу рисунка изображено 4 плазмидных варианта, которые не удалось получить при клонировании. Выступающими линиями на концах

прямоугольников обозначена ДНК вектора pUC19. Стрелками обозначены места включения ДНК pUCI9 в последовательность плазмиды Р4. Звездочкой обозначено расположение участка узнавания £coR], находящегося в полилинкере pUC19, в рекомбинантных плазмидах. Плазмиды pRMSl и pMS2 получены в двух возможных вариантах расположения

клонированного фрагмента. Участки узнавания ЭР обозначены следующим образом: S, Sa/GI; М, Mlul; Е, £coRI; Sc, Sacl; Сг, Cjr 101; С, CM; EV, EcoKV, В, Bg№.

1 2 3 4 5 6 7 8

200 кДа ■ 92,5 кДа ■ 69 кДа 46 кДа ■

30 кДа -

I * М.5к>Н, 42 кДа

R.&oII, 35 кДа Р-лактамаза ~ ЗОкДа

Рис. 4. Анализ в ПААГ белков, синтезированных in vitro. Для анализа использовали 15% ПААГ, содержащий 0,1% SDS. Белки, меченные [м8]-метионином, синтезировались в бесклеточной системе сопряженной транскрипции и трансляции. Маркеры молекулярной массы представляют собой белки, меченные 14С (Amersham, Англия): лизоцим, 14,3 кДа, карбангидраза, 30 кДа; овальбумин, 46 кДа; бычий сывороточный альбумин, 69 кДа, фосфорилаза Ь, 92,5 кДа, и миозин, 200 кДа. 1 и 8 - меченные 14С контрольные белки; 2 - Р4 (R-SsolfMAolT); 3 - pRMSl (КАоГГМЛоГТ); 4 - pMS2 (RSsoimSsolt); 5 - pUC19; 6 -контроль, не содержащий ДНК; 7 - рАТ151.

Оценка размера генов ssoIIR и ssoIlM и анализ фенотипов, определяемых производными рекомбинантными шшмидами (Рис. 3), позволили локализовать фрагмент ДИК, определяющий систему Р-М ХвдП, и относительное расположение генов ssoIlR и ssoIIM на рестрикцношюц карте плазмиды Р4 (Рис. 3).

Нуклеотидная последовательность фрагмента, кодирующего гены ssoIIR и ssoIIM, представлена на Рис. 5. В этой последовательности присутствуют две длинные открытые рамки считывания (ОРС), ориентированные в противоположных направлениях. Согласно данным по локализации генов ssoIIR и ssoIIM в клонированном фрагменте, первая ОРС соответствует гену ssoIIM, вторая - гепу ssoIIR.

Первой ОРС соответствует белок длиной 379 а.к. с молекулярным весом 42,887 кДа, что хорошо коррелирует с молекулярным весом метилтрансферазы, установленным по подвижности белка в ПААГ - 43 кДа. На расстоянии 8 п.н. от стартового кодона AUG в гене ssoIIM идентифицирован предполагаемый участок связывания рибосом (РСУ) AATTCTGGTA (Рис. 5).

В ОРС, соответствующая гену ssoIIR. на расстоянии 39 п.н. от первого AUG расположен второй AUG кодон. При инициации трансляции на первом и втором AUG, длина аминокислотных последовательностей R.,S'.voH составляет 318 и 305 а.к., а молекулярный вес - 37,623 и 35.937 кДа, соответственно. Второе значение лучше соответствует молекулярному весу R.5ioII - 35 кДа. Кроме того, последовательность, похожая на канонический РСУ Е. coli присутствует только перед вторым AUG (Рис. 5). Поэтому, вероятно, в случае гена ssoIIR трансляция инициируется на втором инициаторном кодоне.

Терминирующим кодоном в случае обоих генов является UAA. Предполагаемые промоторные последовательности генов ssoIIM и ssoIIR расположены в межгенной области длиной 109 п.н. (Рис. 5) и частично перекрываются.

Два инвертированных повтора с внутренними GC-богатыми участками и 3'-концевым блоком оснований Т, похожие на типичные для Е. coli сигналы терминации транскрипции, были обнаружены после кодирующей области гепа ssoIIR (Рис. 5). Несколько инвертированных повторов различной длины выявлены в последовательности ДНК, следующей за кодирующей областью гена ssoIIM, один из них обозначен на Рис. 5. SsoIIR и ssoIIM тепы являются АТ-богатыми - 67,2% А+Т в гене ssoIIR и 63,3% А+Т в гене ssoIIM, причем, А+Т диспропорция наблюдается в основном по третьей позиции кодонов, в меньшей степени - по второй и первой позициям.

1 5' acqcqtttttccgqtttaccccOTaaaaaacatctctttttgcggtgttcgcggcaq 57 58 aatcgcgttcagcgcgttttagcggtgcgcgtaatgcgacgttatggtaaatccatatgg 117

* S D L T

118 ggggtaattggattctgggccgcattgtgtcctcatgacttagtTTATGAATCTAAGGTC 177

SIIKEAIANIVPVAVSNGFO 178 GATATGAÎTTTTTCTGCTATTGCATTGATMCAGGGACTGCGACTGAATTCCCAAATTGC 237

KYAQTDSVPIIFDSPFGQLR 238 TTATAAGCCTGTGTATCCGATACAGGGAÎAATAAAATCACTAGGAAACCCTTGAAGTCTT 297

SAERPTI KRPNSGKQEI LIE 298 GACGCTTCCCGCGGAGTTATTTTTCTTGGGTTACTTCCTTTTTGCTCTATTAATATTTCG 357

SGDKYYRASITNTYPSNENF 358 CTACCATCÎTTATAGTACCTCGCACTTATGGTATTAGTATATGGGCTATTTTCATÎAAAT 417

LGYGFGKGAAANVLKRRQHG 418 AAACCATACCCAAAGCCTTTACCGGCTGCTGCATTTACAAGTTTCCTGCGTTGGTGTCCA 477

NWLADSLTYKNCVSKELIDG 478 TTCCAGAGCGCATCTGATAGCGTATATTTATTGTCTACGCTCTTTTCAAGAATATCTCCA 537

VRTKTKLPTPFTFHEHNRVK 538 ACTCTTGTTTTTGTTTTTAATGGGGTTGGAAAAGTAAAATGTTCATGATTTCTTACTTTT 597

EKNFGVIYIRERNQPVGFDK 598 TCTTTATTAAAGCCTACAATGTAÎATGCGCTCTCTATTTTGTGGAACACCAAAGTCTTTT 657

AAFINYYVTYNLEELTNKII 658 GCAGCGAAGATATTGTAATACACAGTGTAATTCAATTCTTCAAGTGTGTTTTTTATTATT 717

SFTRGKDHGLLNKVNELLFA 718 GAAAAAGTTCTACCTTTATCATGÎCCTAGCAAGTTTTTTACATTÏTCAAGTAAAAAAGCA 777

HPKKEKI IRAIDFFLTGRTD 778 TGAGGTTTTTTTTCCTTTATTATCCTTGCTATATCAAAAAACAAAGTTCCTCTTGTATCA 837

NFGKKLGAQSFAVCPFGGVL 838 TTAAATCCTTTTTTGAGGCCTGCTTGAGAGAATGCTACACAAGGAAACCGACCGACAAGA 897

IEHDPIDKEDI KTIDGDPFD 898 ATTTCATGATCAGGAATATCTTTTTCATCGATTTTTGTTATGTCCCCATCAGGGAAATCA 957

G Y N A H Y T KQAFK DWES S FVV 958 CCATAATTTGCATGATATGTCTTTTGAGCAAACTTATCCCATTCGCTGGAAAAAACAACA 1017 NVANTQHFGLRTGGIGAFLD 1018 TTTACAGCGTTAGTTTGATGAAATCCAAGTCTGGTTCCACCGATTCCAGCAAATAAATCG 1077

IMRYGNENNFPY PPTDP FDI 1078 ATCATGCGATATCTGCCATTCTCGTTGTTTGGGTAAGGTGGTGTGTCTGGAAAGTCTATA 1137

VAKLEAGTPKTEGREWRRIT 1138 ACTGCTTTTAGTTCCGCCCCAGTAGGTTTTGTTTCCCCGCGCTCCCATCTTCTTATGGTT 1197

RDGYKSLGLADAFEKQTMHL 1198 CTGTCTCCATATTTTGAAAGACCAAGGGCGTCTGCAAACTCTTTTTGAGTCATATGAAGT 1257

RERKEKITAAIN DTM 1258 CTTTCTCTTTTTTCTTTGATIGTIGCTGCGATATTATCAGTCATgcatgtctaççagaat 1317

-35 -10 ssoIIM РСУ

1318 taaqtqttqqttttaqgacaatttqtcctqttttqattccaattatgaacqtqcatqaaa 1377

-10

MQRLS PGEF9 1378 aaactttcaagtagatataaaaqgttattttttATGCAAAGATTAAGTCCTGGTGAATTT 1437 -35 РСУ ssoIIR

KTLISKERKSH FITPFALVY29 1438 AAAACTCTAATTTCTAAAGAGAGAAAATCGCATTTTATTACGCCATTTGCTTTGGTTTAT 1497

30 KTFCDLGYDQKNSDYFLNNP49 1498 AAAACATTTTGTGATTTAGGGTATGATCAAAAAAATAGTGATTATTTTTTGAATAATCCA 1557

50 SEYIIAMRKNCWKEFEPFEK69 1558 AGTGAATATATAATTGCAATGAGAAAAAACTGTTGGAAAGAATTTGAACCATTTGAAAAA 1617

70EFTTRMLSYLI DEERI KDMS89 1618 GAATTCACAACAAGAATGTTATCATATCTTATTGATGAAGAAAGAATAAAAGATATGAGT 1677

90 PYDAI RDFTME YPTH I YDLA 109 1678 CCTTATGATGCCATTCGTGATTTTACGATGGAATACCCTACACACATATATGATTTGGCA 1737

110 LSNTQSRRSRAGKEFESILE 129 1738 CTGTCTAACACTCAATCCAGACGTAGCAGGGCAGGAAAAGAGTTTGAGTCTATTCTTGAG 1797

130 LLMMGAGIPVDVQGAIGKSF149 17 98 CTATTAATGATGGGGGCAGGAATTCCTGTTGATGTGCAGGGGGCTATTGGGAAGTCATTT 1857

150 FQKNQI GKLVDLVMPGVVQY 169 1858 TTTCAAAAAAACCAAATAGGTAAACTl'GTAGATCTTGTTATGCCAGGTGTAGTCCAGTAC 1917

170 TSNKRNTMLISAKTTLRERW 189 1918 ACATCTAACAAAAGAAATACAATGTXGATTTCCGCTAAAACAACGCTGAGGGAGCGATGG 1977 190 QEVPEEVNRTG IREMYLATL 209 1978 CAAGAAGTACCTGAAGAGGTTAATAGAACAGGAATTAGAGAAATGTATCTAGCTACACTA 2037

210 ООЗГЗЕЕТ1Ы1ЬУЕАМУУУ'./229

2038 САТСАТТСТТТ ГАСССАССАСАСААТАААТАТАТТСТАССАСССТААТСТССТССГТСТА 20 97

230 Т Т Г Е N К К Р К У К N N N Н V Т -Е - Е - 249

20 98 АССЛССАТАСАААЛТАААААТ'ГГСДААТЛГАААААГААТААТадПСГССТЛЛССТТГСАА 215 7

2 5 С О У. Ь О Э А К Е Г, 3 .4 К И NN V 5 У Т О 2 6 9

215 8 С-АТАТССТТСАСТСАС-САА?СС-ААТТАТСААСАА.АС.ТС-СААТААТСТ.ЗДО':ТАСАСАСАС 2217

270 ЗККЕЕТОКЭТТ. ко I Е К У Б П Г 299

2218 ТСТСААААССАССАААТТСААССОТСААТАТТААААСАААТАСАААААТАТАСТСАТТТС 2277

290 306

227 8 ССТТАТСТТСХТААТТАТТАТАЗАААТАОССТТАСТССТСТТТТТСАСХААаааасЬааа 2337

РНК1Х (начало) ,, | РНК1 (конец)

2338 aggatctct^gagatcctttttttctqcqcqtaatcttggatctGraaACGAAДДAACCA 2397

2 3Э8 СССТСаСАДСтеСГГГГТГСаЛ/уСеТТДССТААТССТСССАОАТТАТСТААСССАССТАА 2457

-«»—| РНК1 (качало)

2458 TCTGGCTTCДбCAGAGCACA'5ATAГCAAATAГTPTcí•ttc•caЛ5ta5C•cctгзtt;77г ?517

?518 catcacttcгagaactctgtaagc;at:t5gataaaгctcgc^c^gctйatccggi:toccc^ 2Ь77

2578 д tggctgctgccagtggcg'_ t,aaggcgtgtcttaccgggгtggactcaagacgatagtta 2637

2638 ссдда1аадд 3' 2647

Рис. 5. Нуклеотидная последовательность фрагмента длиной 2648 п.н., несущего гены х.юПМ и «оЯД. Последовательность начинается с участка узнавания М1ы1. Кодирующие области генов .чхоИМ и хлэНД выделены заглавными буквами. Аминокислотные последовательности М.Л!га11 и ЯАоП показаны над последовательностями соответствующих генов с использованием однобуквенных символов аминокислот. Метилтрансфераза (МАоЩ кодируется комплементарной цепью. Инициаторные кодоны генов мо//Л/ и ио//Л выделены жирным шрифтом, терминирующие кодоны выделены жирным шрифтом и отмечены звездочкой. Предполагаемые РСУ, -10 и -35 регуляторные области генов выделены жирным шрифтом и подчеркнуты снизу. Предполагаемые терминаторы транскрипции выделены жирным шрифтом, курсивом и подчеркиванием. Участок, кодирующий 1'НЮ, выделен заглавными буквами. Первый и последний нуклеотиды РНК1 и первый н\клеотид РЫКИ выделены более крупным жирным шрифтом к стрелками сверху последовательности, направление которых совпадает с направлением транскрипции.

Сравнение иуклеотидной последовательности фрагмента, кодирующего гены ферментов &о11 с другими нуклеотидными последовательностями, представленными в банках данных, выявило наличие протяженных областей гомологии с последовательностями некоторых илазмид. Максимальная гомология наблюдается с плазмидами р8Т¥В4 (М^уаЬага и а1., 1997) и рРМЗбб (1Ьанег е1 а1., 1397), кодирующими гены ферментов систем Р-М 5()ЛЭ41 и &лР1. Во фрагментах, кодирующих гены эндонуклеаз рестрикции и метилтрансфераз всех трех систем, обнаруживается лишь несколько отличий (замен и делеций одного нуклеотида). Единственное существенное отличие генетической организации системы Р-М 5с'ггР1 заключается в делении одного нуклеотида в 3'-концевой части гена $епРШ. приводящей к преждевременной терминации трансляции. Образующийся в результате продукт гена $епР1К неактивен (1Ьапег е1 а1., 1997).

Анализ последовательности, расположенной после кодирующей области гена эндонуклеазы рестрикции &о11, позволяет предположить, что эта область соответствует участку начала репликации плазмиды Р4. Один из транскриптов, инициируемых в этой

области соответствует РНК1, определяющей несовместимость бактериальпых плазмид. Нуклеотидные последовательности РНК1 трех плазмид, кодирующих &оП-подобные системы Р-М, практически идентичны между собой и, кроме того, имеют достаточно выраженную гомологию с соответствующим участком плазмиды Со1Е1 и некоторыми другими плазмидами Со1Е1-типа. Близость нуклеотидных последовательностей области, кодирующей РНК1, плазмид Р4, р8ТУП4 (М1уаЬага й а1., 1997) и рБМЗбб (1Ьапег е1 а!., 1997) может свидетельствовать о том, что они относятся к одной группе несовместимости. На основании того, что плазмида рБМЗбб совместима с плазмидами, имеющими Со1Е1-подобный репликон (ГЬапег е1 а1., 1997), можно предполагать, что вся группа плазмид, определяющих системы рестрикции-модификации &о11-типа, относится к другой группе несовместимости, чем плазмида Со1Е1. Это хорошо согласуется с данными по характеристике природного плазмидного комплекса & Боппе! 47, в котором плазмида Р4 стабильпо поддерживается в клетках вместе с плазмидой Р6, репликон которой, вероятно, относится к Со1Е1-типу.

Плазмиды Р4 (4,25 т.п.н.), рРМЗбб (5,6 т.п.н) и р8ТУ04 (5,4 т.п.н.), также как плазмиды Р6 (5,1 т.п.н.) и рМВ1 (9,5 т.п.н), вероятно, представляют собой семейства родственных плазмид, определяющих системы Р-М &о11- и &о1-типов, соответственно. По-видимому, распространение систем Р-М, в штаммах сем. ЕШегоЬаШпасеае, тесно связано с эволюцией плазмид и переносом плазмид между штаммами.

С целью определения дальнейшей стратегии исследования системы Р-М &о11 проводили поиск последовательностей, гомологичных нуклеотидным и аминокислотным последовательностям 11.&о11 и М.&о11. При этом, в случае Я.&оИ сколько-нибудь значительных гомологий с другими последовательностями ни на уровне ДНК, ни на белковом уровне обнаружено не было. В случае аминокислотной последовательности М.&оП было обнаружено наличие значительных областей гомологии с другими 5МЦ-метилтрансферазами.

2.4. Возможные пути молекулярной эволюции аминокислотных последовательностей 5-метилцитозииовых-ДНК-метилтрансфераз.

5-метилцитозиновые-ДНК-метилтрансферазы характеризуются одинаковым строением белковой молекулы, по длине которой расположено 10 консервативных блоков аминокислот. Аминокислоты, входящие в эти блоки участвуют в осуществлении общих стадий реакции метилирования ДНК, взаимодействуют с донором метальной группы - Б-аденозилметинином, существенны для правильной

укладки полипептидной цепи и функционирования ферментов. Между VIII и IX консервативными блоками расположена так называемая вариабельная область метнлтрансфераз, отвечающая за узнавание метилируемого участка ДНК. Общность эволюционного происхождения 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз, характеризующихся, помимо консервативности аминокислотных последовательностей, гомологией третичных структур, не вызывает сомнения. На примере этой группы ферментов интересно проследить, каким образом эволюция аминокислотных последовательностей вариабельных областей метилтрансфераз могла привести к наблюдаемому разнообразию последовательностей ДНК, узнаваемых и метилируемых этими ферментами.

Па

ИЬ

11с

1с Ib

cYCGRG cTNAG AGcT pGGWCC GGWCC GGWCC GGYRCC GGYRcC CifiKNCC GATc rGGNCC 't GGNcC LGGWcC RGcY (RGcY) CACGc GTCGAC GCW'GC

¡"GGcC ! GGcC GGcC I GGcC ; GGCC I GGcC LGGcC cGCG GcGC GcNGC GcGC CCcGG fCcWGC, CcWGG rCcNGG CcNGG CcNGG LCcNGG rcCGG LcCGG GcCGGC cG

GRCGYC CcNGG

Aqu\

Ddel

HgiBI

ДЙЕ1

HgiCW

Ban\

/feci

V7ÜIV

Л'етЗА

&47I 1

&ш961

Sin\

ГгШ

CviJJ

HtfiA1A

/feDlI

BÍVI

Xso

BspR\

BsuRi

/■m/Dl

Пае III

NgoZX

Л с op II

Bepl

/ИЧ1М

lispbl

Hha\

Hpall

Dcm

ftroRII

DsaV

ScrFIA

Ssoll

MaX

RraFI

Mspl

A'euMI

SBI

iigm S-rFtB

—Г

Рис. 6. График кластеризации аминокислотных последовательностей вариабельных областей scex бактериальных 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз. Кластеризацию проводили с использованием программы MULTALIN (Corpet, 1989) (тип матрицы - unit, коэффициент сдвига (gap penalty) -1).

Для анализа амипокислотных последовательностей всех охарактеризованных к настоящему времени 5МЦ-метилтрансфераз использовали программы MULTALIN (Corpet, 1988) и CLUSTAL (Higgins and Sharp, 1988, 1989), позволяющие проводить

множественное выравнивание последовательностей, а также программу PCOMPARE (PCGENE), основанную на алгоритме Нидлмана и Вунча (Needleman and Wunch, 1970), позволяющую количественно оценивать степень "родства" аминокислотных последовательностей. Типичный результат кластеризации аминокислотных последовательностей вариабельных областей 5МЦ-метилтрансфераз представлен на Рис. 6.

Анализ результатов множественного выравнивания, представленный на Рис. 6 и других полученных данных позволяет предположить, что эволюция вариабельных доменов, определяющих сайтспецифичность 5-метилцитозиновых ДНК-метилтрансфераз, привела к возникновению нескольких механизмов узнавания одинаковых последовательностей ДНК. Примером 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз с негомологичными вариабельными участками, реализующих альтернативные способы узнавания одинаковых последовательностей ДНК, могут быть М.&оП, М.Л7аХ, M.&tFIA и M.DsaV - с одной стороны и M.SVtFIB - с другой, узнающие последовательность CCNGG, или M.Hhal и MJ/wiPI, узнающие последовательность GcGC (Рис. 6). В пределах группы ферментов, реализующих похожий механизм узнавания (например, группы I на Рис. 6), максимальная степень гомологии аминокислотных последовательностей характерна для белков, узнающих одинаковые последовательности ДНК (группы la, lb, Ic). На основе сравнения аминокислотных последовательностей вариабельных участков метилтрансфераз в пределах групп I, Па и ПЬ видно, что накопление все большего количества отличий в аминокислотных последовательностях вариабельных участков 5-метилцитозиновых-ДНК-метилтрансфераз коррелирует с последовательной модификацией узнаваемого участка ДНК, заключающейся в изменении степени вырожденности центрального(ных) нуклеотида(ов), исчезновении центрального(ных) нуклеотида(ов) и изменении позиции метилируемого нуклеотида. Возможно, именно этим путем реализуется молекулярная эволюция аминокислотных последовательностей 5МЦ-метилтрансфераз, приводящая к появлению метилтрансфераз с наблюдаемым разнообразием метилируемых последовательностей ДНК.

2.S. Характеристика метилтрансферазы NlaX.

Одной из целей поиска в банках данных последовательностей, гомологичных ЭР и MTJI &о11 было выявление не охарактеризованных открытых рамок считывания, соответствующих белкам с похожими свойствами. Такие белки (эндонуклеазы

рестрикции или метилтрансферазы) планировалось использовать в дальнейшем для проведения сравнительных исследований с М.йоТТ и R.Sroll. Одна из таких ОРС, кодирующая гипотетическую 5-метилцитозиновую метилтрансферазу NlaX, была выявлена в GenBank (код - Х54485) при поиске последовательностей, гомологичных последовательности M.SsoII.

ОРС NlaX была обнаружена во фрагменте ДНК Neisseria lactamica, кодирующего M.A7aIII (Labbe et al., 1990). В полипептидной цепи, соответствующей ОРС NlaX, в правильной последовательности присутствовали все 10 консервативных блоков, характерных для 5-мегилцигозиновых ДНК-метилтрансфераз. На основании гомологии аминокислотных последовательностей М.NlaX и M.£coRII авторами было высказано предположение, о том, что М.NlaX представляет собой 5МЦ-ДНК-метилтрансферазу, узнающую последовательность CCWGG (Labbe et al., 1990). Оказалось невозможным определить активность M.NlaX в штамме Е. coli, несущем рекомбинантную плазмиду с ОРС NlaX, что объяснялось либо недостаточным уровнем экспрессии клонированного в Е. coli гена, либо тем, что ген nlaXM изначально мутирован и не способен синтезировать полноценный белок (Labbe et al., 1990). Однако, характер кластеризации (Рис. б) и результаты сравнения аминокислотной последовательности М.Л'/аХ с другими метилтрансферазами (Рис. 7), позволили предположить, что эта метилтрансфераза относится к группе метилтрансфераз, узнающих последовательность CCNGG (Karyagina et а!., 1993).

В том случае, если M.NlaX представляет собой мутантную метилтрансферазу с низкой ферментативной активностью, узнающую последовательность CCNGG, проведение сравнительного анализа с M.&oll было бы особенно интересно для выявления особенностей белковой молекулы, существенных для проявления активности этими метилтрансферазами.

Сравнение аминокислотной последовательности М.Л7яХ с последовательностями трех CCNGG-узнающих метилтрансфераз - M.S.roll, M.ScrFl и M.DsaV, выявило существенное отличие белковых молекул М.Л7дХ и M.DsaV от M.S.voII и M.ScrFl - отсутствие N-концевой области длиной около 70 а.к., предшествующей I консервативному блоку 5МЦ-метилтрансфераз (Рис. 7). Целью последующих исследований было выяснить, какую роль играет N-концевой участок у M.SioII и не является ли делеция соответствующей области причиной низкой ферментативной активности или отсутствия активности у ММаХ.

ЛгоИ .......КТБК1ААТ1КЕтаЕНШМТСК1:ГАСАЬСЬЗКУССКТ1ККИ£КСЕТКРТеА£ЬКЛ 54

БсгИ МТТ13ККТСТЕ131М1КЕККЬР.ЦМТ2КЕ1АПАУ(215КИСПНТ1!гВИЕЫСЕТСРЗа1,Е15А ШаХ .............................................................

СзаУ .............................................................

***** ** ***** *** * ** ********* *** * * *

5зо11 710ГРОТРРУРГт]Е^КУКМ1О1,ГАС1СОТ1и,Сга0ТЫАТО\Л7. ГБЗЕНОКГАОКТУШШУ 114 ЯсгГ! ХЬКРРЕГАРГЕ.ЫККТАКУКМЮЬГАСЮОТКЬСГНОТЕКтеЗУ.РЗЗЕЮКГАХКТУКАЫР ШаХ .................МРК11ВЬГАСХ6С1КЬСЕЕОАГВОУКСУГЗЗЕЮКУА\^ОХУОАМН

ОгаУ .............МЕККСЦ,КР1ВЬГА01СС(№1РЕЕЕЬ. .ОСКСТГЗЗЕЮКНСОКТУЕАЫР

** * * ********* * * **** ** ** **

i ii

БзоИ СИЕРО. С01ТКЮЕКС1РОНЕ1ЬУСОЕРСУАЕЗОАОЬККСгаПТНСТЬРРВ1АЕ11КЕККР 17 4 £сгП 6ОЕРН.СО1ТК1ОЕК01РСНО1ЬУССГРСОАЕЗОА6ККЬ6РООТаСТЬЕГЕ1АЯИКЕККР ШаХ ССЕТУСС01ТОТОУА01РОНП1ЬЗАСГРСОРГЗОАСЬККСГАСТЯСТЬЕГОХЕК1ЬЬАККР

ОгаУ СЕМРТ. СО1ТК1.3А1)31РУНВЪЫАСРРС0АР30ЕСЯК0ОЕ0СЕЯ60ЬГР(2УАК1иШНКР * **** ** * * **** *** ******* *** * *

iii iv v

53011 НАГЬЬЕОТКЫ1ЛСНВК6КТГ311КЭТЬЕЕЬИУТ7УУЫ1ГААК0ГСУРШКЕН1У1УВГ№КЕ 234 Зс1Т1 КАГЬЬЕМ-7ГО!ЬКТНБКСКТЕКТ1ШТЬЕЕЬВУЕУНТАЬЕКАКОГОЬРОНЕЕК1У1УаЕОКК ШаХ QAFLLENVKQLKGHDKGRTLQVILAHLQQAGУKVУTEVLKARDFGIPQNRERIYLVGF. . .

ОэаЧ QAII.LENVKGLRGHDKGRTLQMILYVLEKLNYWSWKIISATDFNLPQKRERIFIVGF.QD * ****** * ****** * * * * ***** **** ***

vi vii viii

ЯзоИ КУКЫНЕНГТГРТРЬКТ1П^УС01ЬЕКЗУПККУТ1,ЗОАИ'ГОСНОКРКЬУНАААСКСГОУСЬГ 294 ЗсгЕ! SISNYSDFQMPTPLQEKTRVGNILESWDDKYTISDKLWDGHQRRKTENKKNGKGFGYTLF ШаХ .LNHDVDFRFPQPIGQATAVGDILEAYPDEKYTISDKLWQGYQRRKAENRAAGKGFGYGLF

ОяаУ KNNKNLIFDFPKPIELTAKVGD^J.EKEVDEKYTITDRШEGHQNRKKAHRKRGNGFGFSLV * * * ** ** * *** ****** * *** *

вариабельная

ЯзоИ ЫЕЫЗРУТЫТ13АВУУКОСЗЕ1ЫЕОКОЗКРКК1Т?КЕАЗКЬОСГРЗОЕ11Е73СТОАУКОР 354 I Ы2ПЗЕУТМТЬЗАКУУКПеЗЕ1Ь1ЕОККККРКК1ТРНЕААЯЬОСГРЕЫШРУЗПТОАУКЕГ ШаХ NAESAYTNTISARYYKDGSEILIEQPGKNPRKITPPEAARLQGFPDSFQIPVSDAQAYRQF

СяаУ НЕМ35УТКТ13АВУУК1)СЗЕУ1Л/ЕОА1На^У1ЛтаЕСАК1,ОСГРЕЗЕУ1РУБПС!2АИВС2Р * * ** * ********** * ** *** ** * ****** * ***** ** *

область IX

ЯгоИ 6ЫЗ\^АУРУ^А1АЕКИЗТЬОЗ 379

ЯсгП СЫЗУАУРТ1НА1АЕКМЬЕУЬЕКЗКК ШаХ GNSVCVPVIRAIAEQMKAALSAVSDRKV

ПэаЧ ОЫЗУРУЗУХЙАХАОКМЬЗУЮЬТЕСОКЕЕККУМБОУИСКККОЬУРЕОУОЕОРЮКЕЬАЬЬ **** * * ***

Рис. 7. Выравнивание аминокислотных последовательностей ССКвС-узнающих метилтрансфераз ¿¿о11,5сгР1 и йгаУ с последовательностью М.МаХ. Звездочками обозначены консервативные аминокислоты. Пунктирной линией выделены консервативные блоки 1-Х и вариабельная область 5МЦ-МТЛ. Жирным шрифтом обозначены участки аминокислотной последовательности, соответствующие модулю "спираль-поворот-спираль", с высокой вероятностью предсказывающемуся в аминокислотной последовательности М АоП и М.5с/Р1.

Рекомбинантные плазмиды, определяющие повышенную продукцию М.&оП и М.МаХ, гибридной метилтрансферазы М&о/Ма, состоящей из И-концевой области М.&оП (длиной 70 а.к.) и полной аминокислотной последовательности М.МаХ, а также М.ДЗэоИ, с делегированной Ы-концевой областью, были получены на основе

вектора для экспрессии pQElO (QIAGEN, Германия). Схемы рекомбинантных плазмид показаны па Рис. 8.

С помощью специально разработанной методики (Табл. 3, Рис. 9) количественно

определяли активность метилгрансфераз ш vivo. Измеряли также удельную активность

очищенных до гомогенного состояния препаратов ферментов (Табл. 3).

Рис. 8. Рекомбинантные плазмиды для экспрессии генов ssoIIM, nlaXM и их производных. На рисунке приведет.! только клонированные участки. Во всех случаях в качестве вектора использовалась плазмида pQElO (QIAGEN, Германия). Плазмида pTNlaX (Labbe et al, 1990), использованная для переклонирования гена nlaXM., была любезно предоставлена для проведения исследований доктором Петером Лау (Институт биотехнологических исследований, Монреаль, Канада).

Таблица 3.

Определение активности метнлтрансфераз in vivo и удельной активности очищенных препаратов метилтрансфераз.__

Плазмида, In vivo активность" Удельная

метилтрансфераза До индукции (%) После индукции (%) активность (ед./мг)

pQMSsoll, M.ÄOII 100 100 90000

pQMNIaX, M.MaX 19 100 3000

pQMSsoNla, M.Sso/Nla 27 100 6600

pQMASsoII, M.ASsoII 7 46 _6

ssoIIM

nlaxM

sso/nlaM

1асЛГ5

pQMSsoll pQMNIaX pQMSsoNla

pQMáSsoll

'Активность метилтрансфераз in vivo определяли с помощью специально разработанной методики: ДНК рекомбинантных плазмид (для которых характерна одинаковая копийность) трансформировали в клетки одного и того же штамма - Е. coli М15 [pREP4J. В стандартных условиях проводили выращивание ночных культур (а 5 мл жидкой среды LB с Ар и Km) и индукцию ИПТГ в течение 2 часов. Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом из одинакового количества индуцированных и неиндуцированных клеток, после чего переводили ее в линейную форму с помощью гидролиза Ilináül. Полученную линеаризованную ДНК разделяли на две части, одну из которых оставляли для контроля, а вторую гидролизовали в течение 1 часа при 37°С 10 ед. R.íioII. После этого проводили электрофорез в 1% агарозном геле, фотографировали гель, окрашенный бромистым этидием и с помощью лазерной денситометрии количественно оценивали степень метилирования плазмидной ДНК, выделенной из клеток, как отношение площадей пиков, соответствующих фрагментам гидролиза R.&oII и негидролизованной линейной ДНК плазмид. бУдельную активность M.ASsoII не определяли.

Рис. 9. Защита плазмидной ДНК, выделенной из клеток до и после индукции, от гидролиза R.5joII. Плазмидную ДНК, выделенную щелочным

методом из клеток Е. cotí [pREP4], трансформированных рекомбинантными плаз-мидами, гидролизовали

RÄ'ndlll для того чтобы перевести в линейную форму. После этого опытные образцы подвергали в тече-иие 1 часа гидролизу 10 ед. RAsoD. Опытные и контрольные (не обработанные RAoII) образцы анализировали электрофорезом в 1% агарозпом геле.

Было обнаружено, что метилтрансфераза NläX защищает ДНК от гидролиза R.SsoII (Рис. 9). Это свидетельствует о том, что ММаХ представляет собой функционально активный белок и подтверждает предположение о том, что MJVtoX узнает и метилирует последовательность CCNGG. Окончательное доказательство одинаковой специфичности узнавания и метилирования ДНК М .NlaX и M.&oII было получено в экспериментах с модифицированными олигонуклеотидами, а также с помощью специально разработанной методики с применением урацил-ДНК-гликозилазы и бисульфитной реакции (работа выполнялась совместно со старшим научным сотрудником Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ) Кубаревой Е.А. и аспирантом Химического факультета МГУ Разумихиным М.В.).

Полная защита плазмидной ДНК ММаХ in vivo от гидролиза R^SioD наблюдалась лишь после индукции (Рис. 9). Удельная активность ЫМаХ примерно в 30 раз ниже, чем у MÄoII, а модифицирующая активность in vivo в неиндуцированных клетках Е. coli с плазмидой pQMNlaX в 5 раз ниже, чем в клетках с плазмидой pQMSsoII (Табл. 3).

Таким образом, M.NlaX представляет собой метилтрансферазу, имеющую ту же специфичность, что и М.&о11, но отличающуюся сниженной ферментативной активностью. Существенным структурным отличием M.NlaX является отсутствие N-концевого участка длиной в 70 а.к., характерного для MJ&oII. Необходимость N-концевой последовательности для обеспечения модифицирующей активности М.&оП иллюстрируется тем, что М.Д&оП с делегированными 71-ной N-концевыми аминокислотами обеспечивает очень низкий уровень модификации ДНК как до, так и после индукции (Рис. 9). Возможно, сниженная ферментативная активность ММаХ до

некоторой степени определяется отсутствием в этом белке N-концевой части, однако, поскольку присоединение N-коннсвых аминокислот M.SsoII повышает активность MJVVöX всего лишь в 2 раза (Табл. 3), снижение активности может быть связано также с более тонкими отличиями аминокислотных последовательностей M.&oII и М.Л'/аХ. В клетках Neisseria lactamica не обнаруживается активность эндонуклеазы рестрикции, соответствующей М.NlaX (Labbe et al., 1990). Возможно, именно отсутствие селективного давления могло привести к накоплению случайных точечных мутаций и более существенным перестройкам reua nlaXM, например, делецнп N-концсвой часта, отразившимся на активности фермента.

2.6. Получение штаммов-продуцентов ферментов рестрикции и метилирования.

Для проведения фундаментальных исследований, связанных с изучением ферментативных и ДНК-связывающих свойств ЭР и МТЛ требуется выделение больших количеств ферментов и очистка их до гомогенного состояния. Выделение ЭР

и МТЛ из природного штамма S. sonnei 47 связано с рядом трудностей практически о характера. Штамм патогенен, т.е., требует при работе выполнения особых требований техники безоиасносш. Кроме того, в штамме одновременно присутствуют ферменты двух систем Р-М, что усложняет процесс выделения белков в индивидуальном состоянии. Непатогенные штаммы - продуценты ферментов SsoI и Sroll - были получены с помощью раздельного переноса плазмид Р6 и Р4 в клетки Е. coli. Преимуществом этих штаммов было то, что они содержали лишь одну из систем Р-М S. sonnei 47, что снимало вопрос о необходимости разделения интерферирующих ферментных активностей при выделении. Однако, уровень активности ферментов, обеспечиваемый плазмидами Р4 и Р6 в Е. coli, в несколько раз снижен по сравнению с уровнем активности в S. sonnei 47.

Продуценты следующего поколения были полусны на основе клонирования генов ЭР и МТЛ в Е. coli. На штаммы Е. coli Б834, содержащий рекомбинантную плазмиду d24 (продуцент R.XtoII и M.XvoII), и Е. coli BS34, содержащий рекомбинантную плазмиду d33 (продуцент M.SsoII), получены авторские свидетельства на изобретение (Дебов и др., 1989, а и б). Уровень активности ферментов в этих штаммах на порядок превышал уровень активности в S. sonnei 47.

Для повышенной экспрессии R.&oII, М.&оП, M.NlaX и других метилтрансфераз в клетках Е. coli использовали систему векторов QIA (QIAGEN GmbH, Германия). Эта система позволяет получать высокий уровень синтеза нативных белков, или белков с

присоединенной концевой последовательностью аминокислот, содержащей 6 остатков гистидина (6xHis). Суперпродуцирующие штаммы R.SíoII, M.&0II и MJWaX, основанные на рекомбинантных плазмидах с индуцибельными промоторами, обеспечивают продукцию ферментов в тысячи и десятки тысяч раз превышающую уровень продукции исходного штамма S. sonnei 47. При индукции продукция R.&oII достигает 15-20% от суммарного белка клетки. Уровень синтеза M.&oII и M.Sso/Nla составляет 0,5-1,5%, продукция М.МаХ и M.MíoII - от 30 до 67% от суммарного белка клетки. При этом наблюдается корреляция между относительно низким уровнем продукции и присутствием длинной N-концевой части в молекуле М.&оП и M.Sso/Nla. При индукции синтеза этих метилтрансфераз наблюдается прекращение деления и потеря жизнеспособности клеток Е. coli. Одной из причин, вызывающей эти эффекты, и, как следствие, снижение уровня экспрессии генов метилтрансфераз, может быть повышенная способность M.&oII и MSso/Nla, обладающих N-концевой областью, предшествующей I консервативному блоку, к специфическому или неспецифическому взаимодействию с ДНК.

Для выделения рекомбинантных R.&oII, М.&0Ц и MjV7aX, несущих на N-конце последовательность из 6 остатков гистидина, была разработана двухстадийная схема выделения ферментов. На первой стадии проводили разделение белков на колонке с гепарин-сефарозой (элюцию осуществляли линейным градиентом NaCl (0,3 - 1 М)). На второй стадии использовали Ni-NTA-агарозу - аффинный сорбент, обеспечивающий взаимодействие через координированный атом никеля с блоком остатков гистидина рекомбинантных белков. Для элюции белков при этом использовали линейный градиент метилимидазола (0-250 мМ).

Ферментные препараты, выделяемые из суперпродуцирующих штаммов, характеризовались 90-98% степенью очистки, концентрацией белка более 1 мг/мл и активностью 50-300 ед./мкл. Эти препараты использовались в дальнейших экспериментах по исследованию особенностей специфического ДНК-белкового узнавания эндонуклеазой рестрикции и метилтрансферазой &о11.

2.7. Исследование особенностей взаимодействия Rosoli и M-SsoII с синтетическими аналогами субстратов, модифицированными по центральной

нуклеотидной паре.

Особенностью последовательности, узнаваемой ЭР и МТЛ SsoII в ДНК (5'-CCNGG-3'), является полная вырожденность центральной нуклеотидной пары.

Представлялось интересным выяснить, участвуют ли группы атомов центральной нуклеотидной пары в образовании специфических контактов с ферментами .%о11 и каким образом модификации центральной нуклеотидной пары влияют на функционирование ЭР я МТЛ &<?П. Эксперименты проводились совместно с сотрудниками кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ и Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ) Кубаревой Е.А., Бревновым М.Г., Пятраускене О.В. и Громовой Е.С. Синтез модифицированных олишнуклеотидов осуществлялся в группе Орсцкой Т.С. при участи Волкова Е.М., Романовой Е.А. и Ташлицкого В.Н.

Синтетические субстраты, использованные в работе, содержали 1,3-пропандиол (Prd), Г,2'-дидезокси-0-рибофуранозу (ddR), нуклеозидные аналоги с модифицированными углеводными остатками (2'-дезокси-2'-фторуридип (flU), 1-(P-D-2'-дезокси-/ярео-пентофуранозил)тимин (хТ), l-iP-D-З'-дезокси-отрео-

пентафуранозшг)уращгл (tU)) вместо одного ггз центральных нуклеозидов или 2-аминопурин (2АР) вместо аденина в участке узнавания CCNGG (Рис. 9). Результаты экспериментов по пзаимодействию R.SsolI, ее изошизомера, R.SctFI и M.&oII с набором синтетических субстратов представлены в Табл. 4 и 5.

Рис. 10. Модификации, вводимые в участок узнавания, при исследовании взаимодействия R.&oll и M.&oll с синтетическими ДНК-дуилек-сами.

R.Sroil и M.&oII по-разному реагируют на дестабилизацию структуры ДНК-дуплекса, появляющуюся в результате вводимой модификации. В случае R.&oII локальная дестабилизация структуры ДНК-дуплекса приводит к усилению активности фермента (ДНК-дуплексы 1б-1г, Табл. 4). В случае M.SsoIJ введение модификаций в один из остатков углеводного компонента центральной нуклеотидной пары приводит к снижению эффективности метилирования цитозина модифицированной цепи (ДНК-дуплексы Иб-Иг, Табл. 5). При этом нормальный

-ОЧСН0,-О-

-0->;

,,, М , -сЬр—О 5' . . fc-C-N-G-G. . .3'

,U-..ponW, О- О Г 3' . . . G—G-H-C-C. . .5'

-0-| _ | N31, *

Jjoll ScrFl

W ^ U1

рнбофураноза) ц

flU

(2'-дезокси-2' фторурндин)

T).v

(1 -<|VD-2 '-лс «>KCH-rj>e<>-: ic н гофч рано ¡нл )тн м и н)

(I-^W-.'ISVKCH-Ipeo-погтофуранозилйрацнл)

уровень метилирования немодифицированной цепи свидетельствует о том, что М.&о11 все же достаточно устойчива к локальным нарушениям конформации ДНК-дуплексов. Исследование метилирования и гидролиза ДНК-дуплексов, несущих вставку ненуклеотидной природы (Ргс!) вместо одного из центральных нуклеозидов, показало, что для метилирования обоих цитозинов узнаваемого участка М.&о11 важно образование контактов лишь с одним из нуклеозидов центральной пары - сЛ" (ДНК-дуплексы 11д и Нж, Табл. 5), в то время как Я.ХгоИ, по-видимому, не образует контактов

Таблица 4.

Гидролиз синтетических ДНК-дуплексов ЯАоН и НАтП.

№ ДНК-дуплекс Относительная степень гидролиза (%)

&оП &тИ

1а 5' АССТА|ССТ6С-ТС6Т 3' 3' ТССАТ-СвАССIАССА 5' 100 100 100 100

16 5' ...|с-с\Рга-б-с... з' 3' . . .С-С—А--С-С1 . . . 5' 220 118 51 100

1в 5' ... |С-С—-Т—в-С. . . 3' 3' .. .С-С-Ргс1\С-С| . . . 5' 211 136 106 17

1г 5' ...|С-С\сИН-С-С. . . 3' 3' ...С-й—А—С-С|... 5' 237 158 28 91

1д 5' СССАА|ССТвС-СТСТ 3' 3' СССГТ-ССАССЮАСА 5' 100 100 -

1е 5' ...|С-С~Т—СИЗ... 3' 3' . . ,С-С-2АР-С-С|... 5' 90 80 -

Индекс (1 (дезокси) в последовательностях ДНК-дуплексов опущен. В ДНК-дуплексах 1б-1г и 1е, несущих модификации, указана только центральная часть, фланкирующие последовательности идентичны ДНК-дуплексам 1а и 1д. Относительная степень гидролиза для модифицированных ДНК-дуплексов рассчитывалась как отношение степени гидролиза каждой из цепей дуплекса к степени гидролиза соответствующих цепей ДНК-дуплекса 1а или 1д в тех же условиях. В случае ДНК-дуплексов 1б-1г приведена суммарная относительная степень гидролиза субстрата как в каноническом (|), так и в неканоническом (\) положении.

с нуклеозидами центральной пары (ДНК-дуплексы 16 и 1в, Табл. 4). Это предположение подтверждается также исследованием взаимодействия Я.&оП с олигонуклеотидным дуплексом, содержащим 2-аминопурин вместо аденина в центре участка узнавания (ДНК-дуплекс 1е, Табл. 4). Такая замена не приводит к значительному снижению эффективности гидролиза 11.&о11. Это может быть связано с тем, что Л.&о11 не образует контактов в большой бороздке ДНК с атомами водорода М^-группы. Введение дополнительной аминогруппы во 2-ое положение пурина не препятствует функционированию фермента, что косвенно свидетельствует о том, что фермент не образует контакта по этому положению в малой бороздке ДНК. При взаимодействии Я.&оИ с ДНК-дуплексами, в которых удалено одно из гетероциклических основапий

центральной пуклеотидной пары (16 — 1г, Табл. 4), наблюдается повышение эффективности гидролиза модифицированной цени, а также изменение места гидролиза фосфодаэфирных связей. Неканонический гидролиз Я.ХтоП во всех случаях происходит по фосфоднэфирной связи, прилегающей к месту модификации. В случае К.&гН взаимодействие с ДИК-дуплексами 16 - 1г приводит лишь к снижению эффективности гидролиза модифицированной цепи. Я.^соЯН вообще не способна гидролизовать субстраты с подобного рода модификациями (КиЬагеуа й а1., 1992). Модификация, аналогичная введению Рга - замена любого из нуклеозпдпых остатков участка узнавания на остаток 1,3-бутандиола - приводила лишь к блокированию действия Я.^соЫ (М1к е1 а1., 1990). Таким образом, обнаруженные явления -повышение эффективности гидролиза и появление, паряду с каноническим, нового места расщепления ДНК при введении вставок ненуклеотидной природы в центральное положение участка узнавания, являются уникальными свойствами ЯЛо!!.

Таблица 5.

Метилирование синтетических ДНК-дуплексов метилтрансферазой XíoII.

№ ДПК-дуплекс Относительная степень метилирования (%)

Па 5' GCCAACCTGGCTCT 3' 100

3' CTCGGTTGGACCGAGACT 5' 100

116 5' . . .СС—AGG.. . 3' 65-95

3' ...GGflUCC... 5' 5-10

Пв 5' ...CC-ñGG... 3' 75-105

3' ...GGxTCC... 5' 20-40

11г 5' ...CC-AGG... 3' 55-80

3' . . .GGtUCC. . . 5' 0-5

Цц 5' 3' . . .CC-A-GG.. . . . .GGPrdCC.. . 3' 5' 0-5 0-5

Не 5' GAGCCAACCTGGCTCTGA 3' 100

3' CGGTTGGACCGAGA 5' 100

Иж 5' . . . CCPrdGG. . . 3' 65-95

3' ...GG-T-CC. . . 5' 65-95

Индекс Л (дезокси) в последовательностях ДНК-дуплексов опущен. В ДНК-дуплексах Иб-д и 11ж, несущих модификации, указана только центральная часть, фланкирующие последовательности идентичны базовым ДНК-дуплексам На и Не. Метилирование каждой из цепей ДНК-дуплексов определялось в соответствии со специально разработанной методикой, основанной на введении двойной 3Н и 32Р метки в ДНК-дуплексы (Вгеупоу е1 а1., 1995). Относительная степень метилирования для модифицированных ДНК-дуплексов рассчитывалась как отношение включения 3Н в каждую из цепей дуплекса к включению 3Н в соответствующую цепь канонического дуплекса, указанного выше.

2.8. Исследование регуляции экспрессии генов в системе рестрикции-модификации SsoII in vivo.

Для исследования регуляции экспрессии генов в системе рестрикции-модификации &оП in vivo были сконструированы две плазмиды - pACYC-SoIIM и pACYC-SroIIR, в которых межгенная область системы рестрикции-модификации &о11 была клонирована в обеих ориентациях непосредственно перед полноразмерным геном ß-галактозидазы (lacZ) (Рис. 11). В плазмиде pACYC-SjoüM ген ß-галактозидазы находится под контролем промотора метшпрансферазы SsoII (Рмет), а в плазмиде pACYC-ÄoIIR - под контролем промотора эндонуклеазы рестрикции &оП (Pre).

Колонии клеток Е. coli NW-22, несущих эти рекомбинантные плазмиды, имеют

различную окраску на агаризованной среде, содержащей 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-р-

D-галактопиранозид (X-gal). Клетки, содержащие плазмиду pACYC-SyoHM, образуют

темно-синие колонии, что свидетельствует о высоком уровне синтеза ß-галактозидазы с

Рис. 11. Рекомбинантные плазмиды, используемые для исследования регуляторной функции M-&0II в экспериментах in vivo. А. Плазмиды pACYC-ÄollM и pACYC-üoIIR, несущие репортер-ный ген lacZ под контролем промоторов метшпрансферазы SsoU (Рмет) и эндонуклеазы рестрикции SsoU (Pre), соответственно. Б. Плазмидные конструкции, содержащие производные генов ssoIIM и nlaX, используемые для трансформации клеток Е. coli, несущих плазмиду pACYC-XsoIIM или pACYC-XsoIIR: плазмида pMS2 содержит ген мегалтрансферазы &о11 под ко1ггролем собственного промотора; в плазмидах серии pQM гены метилтрансфераз находятся под контролем искусственного 1ас/Г5 промотора.

промотора M.&oII (Рмет)- И, напротив, клетки, содержащие плазмиду pACYC-SroIIR, образуют белые колонии, что свидетельствует о слабой экспрессии этого репоргерного гена, когда он находится под контролем промотора R.&oII (Pre). Количественная оценка уровня экспрессии (5-галактозидазы показала, что уровень активности р-галактозидазы в клетках, несущих плазмиду pACYC-SwIIM, в 540 раз выше, чем уровень активности в клетках с плазмидой pACYC-XroIIR (Табл. 6). Аналогичные результаты, свидетельствующие о том, что экспрессия, осуществляющаяся с промотора эндонуклеазы

рестрикции, гораздо слабее, чем экспрессия, осуществляющаяся с промотора метилтрансферазы, получены при характеристике межгенного участка системы Р-М SenPl. генетическая организация которой практически идентична генетической организации системы Soil (Ibanez et al., 1997). С точки зрения функционирования систем рестрикции-модификации в клетках бактерий такое соотношение активностей может отражать ситуацию, возникающую сразу после проникновения системы рестрикции-модификации в новую клетку. При этом избыточный уровень синтеза метилтрансферазы по отпоптетпгго к низкому уровню синтеза эндонуклеазы рестрикции обеснечинаег метилирование ДНК клетки-хозяина и предупреждает ее гидролиз соответствующей эпдонуклеазой рестрикции.

При введении в клетки дополнительной нлазмиды pMS2 (Рис. 11), обеспечивающей синтез метилтрансферазы Stall, уровень синтеза Р-галактозидазы увеличивается в 8 раз в клетках, несущих плазмиду pACYC-StallR, и уменьшается в 20 раз в клетках с плазмидой pACYC-StallM (Табл. 6), то есть, M.&oII вьщолняет функцию регуляторного белка, снижающего уровень синтеза М.&оП и повышающего уровень синтеза R.&oII в клетке. Такая ситуация, по всей видимости, соответствует последующим стадиям существования системы рестрикции-модификации в клетке. При этом ДНК клетки-хозяина уже прометилирована и возможно понизить синтез метилтрансферазы до уровня, который бы не препятствовал гидролизу неметилированной чужеродной ДНК эпдонуклеазой рестрикции, и, в то же время, был бы достаточен для поддержания полностью метилированного состояния хозяйской ДНК. Одновременное повышение уровня синтеза эндонуклеазы рестрикции должно приводить к более эффективной защите клетки от чужеродной ДНК. При экспрессии генов ssoIIAf и ssoIIR в составе природной плазмиды Р4 в бесклеточной системе сопряженной транскрипции и трансляции in vitro (которую в данном случае можно рассматривать как систему, моделирующую экспрессию генов в бактериальной клетке) через 3 часа после начала экспрссии, когда система уже находится в равновесии, наблюдается эквимолярный синтез метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции (Рис. 4). Эти данные, вероятно, свидетельствуют о том, что регуляция экспрессии генов, опосредуемая метилтрансферазой, приводит к тому, что при функционировании системы рестрикции-модификации ДНК в клетке происходит выравнивание диспропорции между повышенным синтезом метилтрансферазы и низким синтезом эндонуклеазы рестрикции и оба фермента синтезируются в эквимолярных количествах.

В отличие от М.&о11, экспрессия М.Л7аХ, лишенной К-концевой области длиной 70 аминокислотных остатков, предшествующей первому консервативному блоку аминокислот 5МЦ-метилтрансфераз, не влияет на уровень синтеза р-галактозидазы как в штамме с плазмидой рАСУС-&оПМ, так и в штамме с плазмидой рАСУС-йоГО. (Табл. 6). На основании этих данных можно предположить, что именно М-кондсвая область М&оП определяет способность этого белка взаимодействовать с промоторным участком системы рестрикции-модификации &оП и, тем самым, регулировать экспрессию генов.

Таблица 6.

Влияние генов ssoIIM и nlaXM и их производных на экспрессию (3-галактозидазы в модельной системе in vivo. ____

Активность

Штамм Введенные ß-галактозидазы Цвет колоний на

плазмиды в единицах Миллера (в процентах) чашках с Х-§а1

— 269(100) темно-синий

pMS2 13,5 (5) голубой

Е. coli NW-22 pQMSsoII 130,7(49) темно-синий

[pACYC-SsoIIM] pQMNlaX 288,6 (107) темно-синий

pQMSsoNlaX 232,7 (86) темно-синий

pQMASsoII 254,2 (95) темно-синий

— 0,5 (100) белый

pMS2 4,1 (820) голубой

Е. coli NW-22 pQMSsoII 10,8(2160) голубой

[pACYC-SsoIIR] pQMNlaX 1,2(240) белый

pQMSsoNlaX 12,2 (2440) голубой

pQMASsoII 0,61 (122) белый

Подтверждением этого служат данные, полученные при трансформации штаммов, содержащих конструкции pACYC-SioIIM или pACYC-ÄoIIR, плазмидами, обеспечивающими синтез гибридной метилтрансферазы Ssóñ/NláX, а также делеционного производного М.&оП, в котором отсутствуют первые 70 аминокислот (М.Д5!гоП) (Рис. 11). Экспрессия MSsolVNlaX имела эффект, сходный с действием, вызываемым М.&о11, в то время как М.Д&о11, также как и М.Л7аХ, не оказывала воздействия на уровень ß-галактозидазной активности в клетках (Табл. 6).

Таким образом, на основании исследования с использованием модельной системы in vivo было показано, что М.&о11 обладает регуляторной функцией - повышает уровень экспрессии эндонуклеазы рестрикции SsoII и снижает уровень экспрессии метилтрансферазы SsoII в клетках. За регуляторную функцию отвечает N-концевая область М.&оП.

2.9. Исследование равновесного связывания ДНК-мстилтрансферазы Ssoll с промоторной областью системы рестрикции-модификации SioII in vitro.

Для изучения взаимодействия М.&оП с фрагментом ДНК, содержащим тгромоторную область системы рестрикции-модификации был использован метод "торможения" в геле, позволяющий регистрировать образование ДНК-белковых комплексов с помощью радиоавтографии.

Фрагмент ДНК, содержащий промоторную область системы рестрикции-модификации Ssoll. был синтезирован с помощью ТТЦР. С учетом 5'- концевых областей праймеров, пекомплементарных участкам промоторной области системы рестрикции-модификации &о11, длина полученного фрагмента ДНК составляла 140 п.н. В ДНК вводили 32Р-метку, очищали в полиакриламидном геле и использовали для равновесного связывания с MS.voII in vitro. На Рис. 12, А приведена радиоавтограмма разделения реакционных смесей, полученных в результате равновесного связывания различных количеств М .Ssoll со 140-звенным фрагментом ДНК, содержащим промоторпуло область системы рестрикции-модификации Ssoll, методом "торможения" в геле.

Рис. 12. Анализ равновесного связывания M5.mll (А) и МЛ7аХ (Б) со 140-звенным фрагментом ДНК, содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации Ssoll методом "торможения" в геле. К фиксированному количеству (413 нМ) 32Р-меченого 140-звеиного фрагмента ДНК добавляли различные количества гомогенных препаратов М.ЛЧоП (А) и М.Л'/«Х (Б). ДНК-белковые комплексы обозначены как С1, С2, СЗ и С4, соответственно. Цифрами над каждой дорожкой обозначены молярные соотношения белка й ДНК.

В довольно широком диапазоне концентраций М.&оП - от 0,13 до 0,78 мкМ - наблюдается один основной ДНК-белковый комплекс, обозначенный на Рис. 12, А как комплекс С2. Если концентрация М.&о11 в реакционной смеси выше, чем 1,3 мкМ, то образуется, по крайней мере, шесть ДНК-белковых комплексов (Рис. 12, А).

Для доказательства специфической природы комплекса С2 были проведены эксперименты по конкурентному вытеснению 140-звенного фрагмента ДНК,

А Г

■Jit

- С4

- СЭ

- С2

ДНК (140 к п)

,_ С4 SS

3= СЗ 8 о

ДНК (140 н п )

о о

содержащего промоторную область системы рестрикции-модификации Slrall, из комплекса с М.&о11. В качестве конкурентных субстратов использовали фрагмент ДНК той же нуклеотидной последовательности, а также неспецифический фрагмент ДНК -140-звенный ДНК-дуплекс, содержащий промоторный участок вируса лейкоза коров (BJIK). Следует отметить, что в неспецифическом 140-звенном фрагменте ДНК не наблюдается сколько-нибудь выраженной гомологии нуклеотидной последовательности с промоторным участком системы рестрикции-модификации ¿Voll, а также отсутствуют участки узнавания М.&оП.

Рис. 13. Анализ конкурентного связывания специфического и

неспецифического ДНК-субстратов с MäoII методом "торможения" в геле. MäoE (40 нМ) и специфический 32Р-меченый 140-звенный фрагмент ДНК (25 нМ) инкубировали в присутствии различных концентраций немеченых специфического (А) и неспецифического (Б) 140-звенных фрагментов ДНК. Цифрами над каждой дорожкой обозначены соотношения меченого и немеченого фрагментов ДНК.

При использовании в качестве конкурентно связывающейся ДНК немеченого фрагмента той же нуклеотидной последовательности полное вытеснение меченой ДНК из комплекса С2 происходит уже при добавлении 16-кратного избытка субстрата-конкурента (Рис. 13, А). В то же время, даже 96-кратный молярный избыток неспецифического 140-звенного фрагмента ДНК не влияет на формирование комплекса С2 (Рис. 13, Б). Это позволяет говорить о том, что образование комплекса С2 обусловлено специфическим взаимодействием M.&oII с промоторной областью системы рестрикции-модификации SsoII.

Картины образования множественных комплексов, получающиеся при взаимодействии М.МаХ со 140-звенным фрагментом, содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации Ssoll, (Рис. 12, Б), а также при взаимодействии M.SsoII и М.Л7аХ с фрагментом промоторной области BJ1K очень похожи между собой и характерны для неспецифических ДНК-белковых взаимодействий (Taylor et al., 1991). Во всех этих случаях количество образующихся комплексов пропорционально зависит от количества добавляемого в пробу белка. Более того, концентрация белка, требующаяся

для формирования множественных комплексов лишь незначительно превышает концентрацию, требующуюся для образования первого комплекса (С 1).

Для определения константы диссоциации (К<|) комплекса МЛмИ со 140-звенным фрагментом ДНК, содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации &о11, в соответствии с методом Скэтчарда была изучена зависимость отношения связанной и свободной форм ДНК ([Е0]/'[0]) от концентрации ДНК фо) при

Рис. 14. График в координатах Скэтчарда для определения константы диссоциации (Kd) комплекса МЛгоП со 140-звенным фрагментом ДНК, содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации SsoII.

Величина 1/K<j соответствует

тангенсу утла, образуемого прямой, представляющей собой линейную аппроксимацию зависимости [ED]/[D] от [ED], и осью абсцисс. Рассчитанная таким образом величина K<i составила 15±7 нМ (Рис. 14).

Таким образом, результаты исследования связывания M&oII с различными фрагментами про,моторных областей in vitro свидетельствуют о том, что эта метилтрансфераза способна специфически связываться с фрагментом ДНК,

соответствующим промоторной области системы рестрикции-модификации &о11.

2.10. Локализация участка промоторной области системы рестрикции-модификации iftoll, вовлеченного в специфическое взаимодействие с М.ЛЧоТТ.

Участок ДНК, вовлеченный в специфическое взаимодействие с M.&oII, был идентифицирован методом футпринтинга ДНК-белкового комплекса ДНКазой I. Для этого 32Р-меченый по 5'-концу нижней или верхней цепи 140-звенный фрагмент ДНК, содержащий промоторную область системы рестрикции-модификации 5!уоП, инкубировали с M.SsoII. ДНК-белковый комплекс обрабатывали ДНКазой I так, чтобы этот фермент статистически вносил один разрыв на молекулу ДНК. Контрольную реакцию проводили без добавления M.SVoII. Полученные фрагменты ДНК разделяли

постоянной концентрации фермента (Ео).

[ED], нМ

Рис. 15. Футприптинг ДНКазой I комплекса МЛоП с промоторной областью системы рестрикции-модификации &о11. 140-звенный ДНК-дуплекс, меченный 32р по 5-, концу нижней (А) или верхней (Б) цепи, инкубировали с МЛоП, обрабатывали ДНКазой I и полученные фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в 10%-ном ПААГ, содержащем 7М мочевину (дорожки Б). Дорожки К соответствуют разделению продуктов статистического гидролиза ДНКазой I 140-звенного ДНК-дуплекса в отсутствие МЛоП; дорожки в, С5+А, А+С, С+Т и Т -продуктов реакций химической модификации исследуемого фрагмента ДНК методом Максама-Гнпберта. Области, защищенные М.&оН от гидролиза ДНКазой I, обозначены на рисунке вертикальными линиями.

-35 -10

5'-сатаааааатаассттттататстасттвааасттттттсатссасбттсат

з' -статтттттаттссаааататасатсаастттсаааааастасстсс^асгате

•*- ИЛиШ РСУ Тщ

М&оН—►

_ _..........,....... 3_3'

рсгадат^

Рис. 16. Межгенная область системы рестрикции-модификации &о11. Результаты футпринтинга ДНКазой I и диметилсульфатом. Серым фоном обозначена область, защищаемая МАоП от гидролиза ДНКазой I. Стрелками обозначены гуаниновые остатки, потенциально вовлеченные во взаимодействие с МЛоП; величина стрелок соответствует степени их защиты от метилирования диметилсульфатом. Треугольником обозначена позиция тиминового остатка, при замене которого на 5-бром-2'-дезоксиуридин получен максимальный выход ковалентно-связанного комплекса с МАо11 (см. ниже). Жирным шрифтом обозначены предполагаемые участки связывания с рибосомой (РСУ) и инициаторные кодоны генов аоШ и ноПМ.

электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) и определяли участки нуклеотидной последовательности, защищаемые М.&оН от гидролиза ДНКазой I (Рис. 15).

Из анализа полученных, радиоавтограмм видно, что М&о11 защищает участок ДНК размером 48 нуклеотидов в верхней цепи и 52 нуклеотида в нижней цепи ДНК. Область, защищаемая М.&о11 от гидролиза ДНКазой I, включает в себя предположительные участки связывания с рибосомой и, частично, -10 регуляторную последовательность гена .мо//Л/, а также -10 и -35 области гена мо//Д (Рис. 16).

2.11. Идентификация гуаниновых остатков ДНК, которые потенциально могут быть вовлечены во взаимодействие с МЛгоП.

Для того чтобы идентифицировать гуаниновые остатки ДНК, которые

потенциально могут быть вовлечены во взаимодействие с МАоП, был проведен

футпринтинг ДНК-белкового комплекса диметилсульфатом. Этот химический реагент

при определенных условиях метилирует гуаниновые остатки по атому N7.

экспонированному в большую бороздку ДНК. Защищенность этих остатков от

метилирования диметилсульфатом в ДНК-белковом комплексе свидетельствует об их

сближенности с аминокислотами белка и возможном участии в образовании контактов с

белком в ДНК-белковом комплексе.

Рис. 17. Футпринтинг диметилсульфатом комплекса М.&о11 с промоторной областью системы ресгрикции-модификации &оИ. 140-звенный ДНК-дуплекс, меченный 32Р по 5'-концу верхней (А) или нижней (Б) цепи, инкубировали с МАоН и обрабатывали диметилсульфатом. После гидролиза модифицированных цепей ДНК пиперидином полученные фрагменты ДНК разделяли электрофорезом в 10%-ном ПААГ, содержащем 7М мочевину (дорожки Б). Дорожки К соответствуют разделению продуктов гидролиза пиперидином 140-звенного ДНК-дуплекса, модифицированного диметилсульфатом в отсутствие МАоП. Гуаниновые остатки, потенциально вовлеченные во взаимодействие с М&оП, обозначены стрелками.

Комплекс М.йтЛТ с содержащим промоторную область системы рестрикции-модификации &оП 140-звенным фрагментом ДНК, меченным

32р

по 5'-концу

верхней или нижней цепи, обрабатывали диметилсульфатом так, чтобы статистически модифицировалось одно основание на молекулу ДНК. Контрольную реакцию проводили в

аналогичных условиях в отсутствие M.&0II. После гидролиза модифицированных цепей ДНК пиперидином фрагменты ДНК анализировали электрофорезом в денатурирующем ПААГ(Рис. 17).

MÄoII в различной степени защищает от метилирования семь гуапиновых остатков - четыре в верхней цепи и три - в нижней цепи ДНК (Рис. 17). Шесть из семи идентифицированных гуаниновых остатков расположены внутри 15-звенного инвертированного повтора, обозначенного на Рис. 16 сходящимися стрелками. Центром симметрии инвертированного повтора является центральная А-Т пара, причем гуаниновые остатки, потенциально вовлеченные во взаимодействие, расположены симметрично внутри повтора (Рис. 16). Идентифицированный повтор, вероятно, представляет собой участок ДНК, обеспечивающий максимальное количество специфических контактов с M.&oll при формировании комплекса.

2.12. Анализ равновесного связывания метилтрансфсразы Stoll с синтетическими ДНК-дуплексами, содержащими инвертированный повтор, выявленный в участке

взаимодействия.

Дальнейшие исследования особенностей взаимодействия М.&тоП с ДНК проводились с использованием коротких синтетических ДНК-дуплексов. Синтез ДНК-дуплексов проводился A.B. Кузубовым (ВНИИ СБ РАСХН) и ЯМ. Алексеевым (Институт физико-химической биологии им. А.Н, Белозерского, МГУ). В качестве исходного был выбран 31-звенный ДНК-дуплекс, последовательность которого включала в себя описанный выше инвертированный повтор и восемь фланкирующих нуклеотидов с каждой из сторон инвертированного повтора:

5' -ATCAAAACAGGACAAATTGTCCTAAAACCAA-3'

3'-TAGTTTTGTCCTGTTTAACAGGATTTTGGTT-5'

Седьмой гуанин, потенциально вовлеченный во взаимодействие с MAolI и расположенный за пределами инвертированного повтора (Рис. 16), не входит в состав 31-звенного ДНК-дуплекса. Константа диссоциации комплекса M-Sroll с этим ДНК-дуплексом, рассчитанная по методу Скэтчарда составила 9,4+1,9 нМ, что хорошо совпадает с величиной константы диссоциации, рассчитанной для комплекса MSsoII со специфическим 140-звенным фрагментом ДНК (15±7 нМ). Это свидетельствует об адекватности выбора этого 31-звенного ДНК-дуплекса для исследования взаимодействия M.&oII с регулягорной областью системы рестрикции-модификации 5!ю11, а также о том, что если M.&oII и образует контакт с седьмым гуанином, расположенным вне

инвертированного повтора, то этот контакт не вносит существенного вклада в обеспечение специфичности ДНК-белкового взаимодействия.

Рис. 18. Анализ ковалентного присоединения Ьг'сШ-содержаших ДНК-дуплексов к М.&о11 методом электрофореза в денатурирующем 12.5%-иом ПААГ. Дорожки 1 - 8 соответствуют разделению реакционных смесей, полученных в результате ковалешного присоединения МЛоП к ДНК-дуплексам 1 - УЩ, меченным 32Р по 5'-концу цегш, содержащей остаток ЬЛШ (Табл. 3); дорожки К и Б соответствуют свободным ДНК и белку, соответственно. Положение ковалентного ДНК-белкового комплекса, обозначено стрелкой.

Таблица 7.

Ковалентное присоединение Ьг^Ц-содержащих субстратов к М.Жте>11.

№ ДНК-дуплекс % ковалентного присоединения

I 5' - . . ,АССАСАААЪг5сШТСТССТ. . . - З'а 3' - . . .ТССТетТТ--А--ЛСАССА. . . - 5' 2,4 ±0,4

II 5' - . . .АССАСАААТЬгьаиСТССТ. . . - 3' 3' - ...ТССТСГТТА—А—СЖвк... - 5' 3,8 + 0,7

III 5' - . . . А66АСАААТТСЬгьсШССТ. . . - 3' 3' - ...ТССТСТТТААС--А--6СА... - 5' 2,7 ±0,5

IV 5' - . . .АССАСАА--А—ТТСГССТ... - 3' 3' - . . ,ТССТСТТЬг5аиААСАССА.. . - 5' 3,3+0,6

V 5' - . ..АССАСА—А—АТТ6ТССТ... - 3' 3' - . . .ТССТСТЬг5<ГОТААСАССА. . . - 5' 5,9 ± 0,8

VI 5' - . . .Р.ввАС--А—ААТТСГССТ... - 3' 3' - . . . ТССТС-Ьг5сШТТААСАССА . . . - 5' 5,6 ±0,8

VII 5' - ...АСв—А—САААТТбТССТ.. . - 3' 3' - . . .ТССЬг5<ШСТТТААСАССА. . . - 5' 9,4 ± 1,2

VIII 5' - ...—А--ССАСАААТТСТССТ. . . - 3' 3' - . . .Ьг5йиССТСТТТААСАССА... - 5' 4,9 ±0,7

IX 5' -ССАТАТАТАТАТАТАЬгьсШАТАТАТАТАТАТСС-3' 3' -СС X АТАТ АТАТАТАТ - -А- - ТАТАТАТАТАТАСС- 5' 0

^Показаны только 15-звенные центральные участки 31-звенных ДНК-дуплексов. Фланкирующие последовательности дуплексов 1-УШ такие же, как в базовом 31-звенном ДНК-дуплексе (см. выше).

С целью получения более подробной информации об особенностях взаимодействия М.Х?о11 с областью инвертированного повтора были проведены эксперименты по выявлению тиминовых остатков, пространственно сближенных с аминокислотами МЛоИ при образовании белково-нуклеинового комплекса. Для этого использовали метод ковалентного присоединения к МА-оП ДНК-дуплексов, в которых

<ЗТ в определенных положениях нуклеотидной последовательности был заменен на остаток 5-бром-2'-дезоксиуридина (Ьг5сШ) (Табл. 7). ДНК-белковые комплексы облучали ультрафиолетовым светом с длиной волны 302 нм и полученные реакционные смеси анализировали методом электрофореза в денатурирующем ПААГ (Рис. 18). В качестве контрольного использовали 31-звенный ДНК-дуплекс с чередующимися АТ-повторами, содержащий остаток Ьг'сШ вместо одного из остатков с1Т в центральной части одной из цепей (ДНК-дуплекс IX).

Образование продуктов ковалентного присоединения МАоП к ДНК наблюдалось во всех случаях (ДНК-дуплексы I - VIII), кроме контрольного (неспецифического) ДНК-дуплекса IX (Табл. 7). Это свидетельствует о том, что все исследованные тиминовые остатки сближены с М.&о11 в ДНК-белковом комплексе.

Интересным является тот факт, что для всех ДНК-дуплексов, содержащих модификацию в левой половине инвертированного повтора, характерна более высокая эффективность образования ковалентно-связанных комплексов по сравнению с остальными ДНК-дуплексами (Рис. 18). Кроме того, выход реакции ковалентного присоединения М.&оП к ДНК-дуплексу VII в 2-5 раз выше по сравнению с другими дуплексами, в частности, по сравнению с ДНК-дуплексом Ш, несущим симметричную модификацию (Рис. 18, Табл. 7). Возможно, это свидетельствует о том, что тиминовый остаток в этой позиции инвертированного повтора непосредственно вовлечен в образование контакта с М.&оН. Полученные данные по ковалентному присоединению М.&оП к ДНК-дуплексам I - VIII могут свидетельствовать о неэквивалентном характере взаимодействия фермента с разными половинами инвертированного повтора в участке связывания. Это подтверждается также наличием в верхней цепи ДНК седьмого несимметричного остатка гуанина, защищаемого от метилирования диметилсульфатом при образовании комплекса ДНК с М.Л'то11 и находящегося за пределами области инвертированного повтора (Рис. 16), и большей степенью защиты от метилирования диметилсульфатом гуаниновых остатков верхней цепи участка связывания М.&о11 (Рис. 16 и 17, А). В целом, при формировании специфического комплекса М.&оП с ДНК более прочные межмолекулярные контакты могут образовываться с левой половиной участка связывания. Возможно, некоторая асимметричность, наблюдаемая при взаимодействии М.&оЦ с инвертированным повтором, связана с влиянием фланкирующих последовательностей нуклеотидов.

В последующих экспериментах была исследована возможность специфического взаимодействия М.&о11 с каждой из половин участка связывания. Для этого был

разработан метод определения констант равновесного ДНК-белкового связывания, основанный на вытеснении специфического ДНК-дуплекса с известной константой связывания неспепифическими ДНК-дуплексами или ДНК-дуплексами с модифицированным участком связывания. Этот метод разрабатывался совместно со ci. научн. сотр. кафедры ХПС Химического факультета МГУ Ташлицким В.Н. Сравпепие величин констант диссоциации комплексов M.SioII с ДНК-дуплексами, содержащими только одну из половин участка связывания, полный участок связывания и ДНК-дуплексом, не содержащим участка связывания, показало, что ДНК-дуплексы, включающие в себя лишь одну из половин инвертированного повтора, представляют собой неспецифические субстраты для связывания с M.SsoII. Вероятно, необходимым условием для обеспечения специфического взаимодействия с M.&oII является одновременное присутствие в ДНК-субстрате обеих половин инвертированного повтора.

Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что связывание M.iSSolI с промоторной областью системы рестрикции-модификации Xwll, вероятно, осуществляется через контакты с основаниями ДНК, большинство которых входит в состав двух симметричных 4-х-нуклеотидных кластеров. При этом взаимодействие M.SjoII с левой и правой половинами этого участка связывания имеет несколько асимметричный характер.

2.13. Схема контактов между ДНК и белком в комплексе M-Ssoll с ДНК.

Для выявления участков белковой молекулы, которые могут определять специфическое взаимодействие с промоторной областью системы рестрикции-модификации SsoII, была проанализирована структура М.&оП. Использование специальной компьютерной программы (Dodd and Egan, 1990) позволило с высокой вероятностью предсказать присутствие модуля "синраль-поворот-спираль" в N-копцевой части M.,Say>R, которая, как было экспериментально доказано, существенна для проявления регуляторной функции этим белком. Можно предположить, что именно аминокислоты модуля "спираль-поворот-спираль" образуют контакты с остатками ДНК в комплексе МАоП с промоторным участком собственного гена. Используя стереохимические правила ДНК-белковых взаимодействий, разработанные М. Сузуки и сотр. (Suzuki et al., 1995; Suzuki and Yagi, 1994), была построена модель ДНК-белковых взаимодействий в комплексе M.&oll с ДНК (Рис. 19). Стереохимические правила базируются на статистических данных, полученных при анализе ДНК-белковых

комплексов с известной структурой. Кроме того, они учитывают возможность образования ДНК-белковых контактов исходя из фундаментальных принципов химического взаимодействия между молекулами, а также пространственного расположения контактирующих групп атомов ДНК и белка. Для каждого типа комплексов рассчитаны коэффициенты, различающиеся по величине в соответствии с вероятностью образования контакта между конкретными остатками ДНК и белка. Сравнение модуля "спираль-поворот-спираль", выявленного в M.&oII с аналогичными модулями других охарактеризованных к настоящему времени белков, позволило отнести этот модуль к наиболее распространенному типу I (Suzuki et al., 1995). К тому же типу относятся модули, обнаруженные в репрессорах бактериофага А, - белках его (Вгеппап et al., 1990) и CI (Jordan and Pabo, 1988). В этом типе ДНК-белковых комплексов в образовании специфических контактов могут принимать участие гетероциклические основания не более чем четырех последовательно расположенных нуклеотидных пар. Исходя из данных футпринтинга ДНК-белкового комплекса диметилсульфатом и ковалентного присоединения M.&oII к 5-бром-2'-дезоксиуридин-содержащим ДНК-дуплексам были выявлены нуклеотидные остатки, которые могут быть вовлечены во взаимодействие с белком, в комплексе M.£soII с ДНК (Рис. 19). Они входят в состав двух симметрично расположенных кластеров из четырех нуклеотидов.

I I „ «_1

5' -AGGACAAATTGTCCT-3'

I \Г\ I N

n-K Y R Т-с • с-Т R Y K-n

/\ / W /

3' -TCCTGTTTAACAGGA-5'

-р * 4-пг~

Рис. 19. Схема ДНК-белкового взаимодействия МЛоП с областью инвертированного повтора. ДНК-белковые контакты предсказаны с использованием стереохимических правил М. Сузуки (Suzuki et al., 1995). Наиболее вероятные контакты (согласно правилам Сузуки) обозначены на схеме сплошными линиями; менее вероятные контакты - пунктиром. Контакты, включающие нуклеотиды, для которых экспериментально была показана сближенность с аминокислотами M.&oII, выделены утолщенными линиями. Стрелками обозначены потенциально взаимодействующие с МЛоП гуаниновые остатки; треугольником обозначена позиция тиминового остатка, при замене которого на 5-бром-2'-дезоксиуридин получен максимальный выход коваленгно-связанного комплекса с M.&oII.

Симметричность участков связывания весьма характерна для ДНК-связывающнх белков этого типа. Белковый компонент, как правило, взаимодействует с ДНК в виде димера, причем каждая молекула белка взаимодействует с соответствующей половиной участка связывания. Аналогичный механизм взаимодействия был предположен для M.SioII. Аминокислотные остатки М.&о11, участвующие во взаимодействии (позиции 1, 2, 5 и 6 в "узнающей" спирали модуля "спираль-поворот-спираль" - К, Y, R и Т (Рис. 20, А)) были предсказаны на основании статистических данных по характеристике ДНК-белковых комплексов данного типа (Suzuki et al., ¡995). При специфических ДНК-белковых взаимодействиях такого рода "узнающая" спираль располагается в большой бороздке ДНК, причем ее ориентация вдоль цепи ДНК может быть двоякой, т.е., N-концевая аминокислота, в данном случае лизин (К), может располагаться как напротив 5'-концевого G в вовлеченной во взаимодействие последовательности GGAC, так и напротив З'-концевого С. Используя стереохимический подход, были предсказаны возможные контакты в обоих типах комплексов и рассчитаны коэффициенты взаимодействий. Наибольшая сумма коэффициентов взаимодействий была получена для комплекса, схематически представленного на Рис. 19.

В рассматриваемой модели представлены все возможные контакты в комплексе M.&oII с ДНК, предсказываемые с помощью стереохимического подхода (Рис. 19). Необходимо отметить, что в ДНК-белковом комплексе может реализоваться лишь часть из предсказываемых контактов, поскольку некоторые из них являются альтернативными. Полученные экспериментальные данные по выявлению остатков ДНК, потенциально способных взаимодействовать с M-SioII. хорошо соответствуют предложенной модели. Так, в соответствии с этой моделью, в образовании контактов с M.SsolI участвуют все нуклеотиды, для которых на основании экспериментальных данных была предсказана такая возможность. В левой части инвертированного повтора четыре нуклеотида контактируют с каждой из 4-х аминокислот M.&oII, потенциально участвующих во взаимодействии. В правой части инвертированного повтора все предсказываемые контакты симметричны контактам левой части, за исключением контакта, образуемого тимином, который, как следует из экспериментальных данных, вероятно, не взаимодействует с M.Sroll. Это вносит некоторую асимметричность в рассматриваемую модель. Нельзя исключить возможности участия в образовании контактов с M.&oll также аденина и цитозина противоположных цепей ДНК, находящихся в симметричных последовательностях участка взаимодействия, поскольку известны случаи, когда одна аминокислота способна своей боковой цепью взаимодействовать с двумя нуклеотидами, находящимися в одной или противоположных цепях ДНК.

2.14. Взаимодействие 5-метилцитозиновых-ДНК-метилтрансфераз с промоториыми участками собственных генов - новый механизм регуляции экспрессии генов в системах рестрикции-модификации ДНК.

В аминокислотных последовательностях девяти из 50-ти охарактеризованных к настоящему времени 5МЦ-метилтрансфераз имеется длинная N-концевая часть, предшествующая первому консервативному блоку аминокислот. В восьми из этих метилтрансфераз с высокой вероятностью предсказывается модуль "спираль-поворот-спираль", расположенный в N-концевой части аминокислотных последовательностей (Рис. 20, А). К этим мешлтраисферазам относятся, в частности, M.&oII, а также M.&oRII и ЪЛ.М$р\, для которых, как и для МЛуоП, была показана способность связываться с промоторной последовательностью собственного гена и репрессировать собственный синтез (Som and Friedman, 1994; Som and Friedman, 1997).

В консервативных и вариабельных областях этих и других 5МЦ-ДНК-мегилтрансфераз, а также в N4- и С6-адениновых метилтрансферазах и эндонуклеазах рестрикции, относящихся к системам рестрикции-модификации II типа, модуль "спираль-поворот-спираль" не идентифицируется. Можно предположить, что именно этот модуль ответственен за обеспечение специфического ДНК-белкового взаимодействия в комплексах M.&0II, MJJcoRII, M.MipI и, возможно, других метилтрансфераз этого типа с промоторными последовательностями. При анализе нуклеотидных последовательностей, предшествующих метилтрансферазному гену во всех восьми анализируемых системах рестрикции-модификации было выявлено наличие инвертированных повторов различной длины (Рис. 20, Б). По аналогии с данными, полученными для метилтрансферазы SsoE, можно предположить, что именно эти участки ответственны за взаимодействие с N-концевой областью соответствующей метилтрансферазы. Ранее было показано, что авторегуляторная функция M.£coRII определяется N-концевым доменом этого белка. Кроме того, инвертированный повтор, идентифицируемый в промоторной области гена M.£coRÜ, расположен в области, защищаемой этим ферментом от гидролиза ДНКазой I (Som et al., 1994). Сравнение аминокислотных последовательностей метилтрансфераз &о11 и ÄrFIA, узнающих и метилирующих один и тот же участок узнавания в ДНК, показало, что максимальная консервативность последовательностей N-концевых участков наблюдается именно в области предполагаемого модуля "спираль-поворот-спираль". Аналогичная ситуация выявилась при сравнении нуклеотидных последовательностей, предшествующих генам этих метилтрансфераз - максимальная степень гомологии наблюдается в области, соответствующей инвертированному повтору

(участку связывания М&оЦ) и все нуклеотиды, вовлеченные во взаимодействие с М.£к?П, инвариантны. Это с большой вероятностью указывает на то, что метилтрансфераза АтР1А, аналогично МЛо11, может осуществлять авторегуляцию экспрессии собственного гена, основанную на взаимодействии с промоторной областью, причем в обоих случаях во взаимодействие, скорее всего, вовлечены одни и те же структуры белков и промоторных участков.

Нпнш мс>л|рмифе|»1ыв jwiunua

1Н>,.1..Н1» »1 Г.Ч к|,<>«-'Ъ

П£1СДПОЛа!Ч1СМЫЙ МОД.И. "спираль-пиворот-сьирдль"

3 9SO 5 i SD

Sml

Sau 961

£co47II

Муз!

&vFIA

Sioll

Dcm

£coRJI

Спираль

tattsactataaaacgcacttgg

:асатааттттсг:

0 7 SD

0.6SD

"У^наклшя" спираль rccaattggaaacaaaaagaatgcaig .cttt.-.gtg

aaaaatagtgtttattatfitaataaactttggatacggttatgtgtataggaggta

ga?aaccatga;caatgtttgacaaagcacat3Taaacccatacagtagt.aacca:gactaatg

gaaagattgacttataatgtttattacggataattaggaaaattatagattttgaccgcaaatg

aattagtgtcaatcagaggacaaaaagtgcttataaaaacactttatgagaaaggatttatatg

ticataattggaatcaaaacaggacaaattgtcctaaaaccaacacttaattctggtagacatg tggccctaaatggctgtaaitatgttaacctgtcggccatctcagatggccggtgaaatctatg aacatrcaatctgggtcaaatgagtgatacagtttcacccataagacccaaiggaggcaatatg

Рис. 20. Потенципьные участки ДНК-белкового взаимодействия в комплексах метилтрансфераз с ДНК. А. Выровненные последовательности предполагаемых модулей "спирапь-поворот-спираль" в N-концевых частях 5МЦ-Д11К-мешпрансфераз, предсказанных методом Додца-Эгана (Dodd and Egan, 1990). Характеристические аминокислоты выделены жирным шрифтом и обведены в рамки. Метилируемые цитозины в узнаваемых последовательностях 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз обозначены прописными буквами. Б. Нуклеотидные последовательности промоторных областей генов различных 5МЦ-ДНК-метилтрансфераз. Обнаруженные в них инвертированные повторы различной длины обозначены сходящимися стрелками.

Сопоставление данных, касающихся всей группы 5МЦ-ДНК-мстилтрансфераз с выявленным модулем "спираль-поворот-спираль" в №концевой области, позволяет предположить существование общего механизма регуляции экспрессии гена метилтрансферазы в соответствующих системах рестрикции-модификации. Все рассмотренные метилтрансферазы, помимо выполнения функции метилирования специфических последовательностей ДНК, вероятно, представляют собой транскрипционные репрессоры, способные взаимодействовать с регуляторными

участками, расположенными непосредственно перед кодирующей областью собственного гена, тем самым подавляя его экспрессию.

2.15. "Маятниковая" модель регуляции в системах рестрикции-модификации ДНК, основанная на ауторепрессии синтеза ДНК-метилтрансфераз.

Эндонуклеазы рестрикции гидролизуют ДНК в том случае, если отсутствует

специфическое метилирование. В связи с этим присутствие системы Р-М может

вызывать гибель клетки-хозяина в случае нарушения скоординированной экспрессии

генов эндонуклеазы рестрикции и метилтрансферазы. Одним из способов защиты

хромосомной ДНК бактерии, несущей систему рестрикции-модификации ДНК, от

гидролиза эндонуклеазой рестрикции может быть регуляция экспрессии генов,

обнаруженная в системе Р-М ЛяП и других системах, в которых ДНК-

метилтрансфераза способна выполнять функцию репрессора собственного гена.

Предлагаемая "маятниковая" модель регуляции описывает "поведение" системы в

различных ситуациях, возникающих в клетке (Рис. 21).

Рве. 21. "Маятниковая" модель регуляции экспрессии генов в системе рестрикции-модификации 5!гоП. А. Стадия проникновения системы рестрикции-модификации в клетку. Б. Состояние системы, обеспечивающее эффективную защиту клетки от инфекции бактериофагом. В. Смещение равновесия в системе после временной остановки синтеза белка. Толщина горизонтальных стрелок соответствует уровню экспрессии генов эндонуклеазы рестрикции (Я) и метилтрансферазы (М) на различных стадиях. Колебания маятника (вверху каждой части рисунка) отражают изменение уровней экспрессии метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции в клетке, находящихся в противофазе. Серым прямоугольником обозначена МАоП, синтезирующаяся в клетке и взаимодействующая с межгенной областью системы Р-М &о11.

Особенно важным представляется контроль активности генов на стадии проникновения новой системы Р-М в клетку бактерии, хромосомная ДНК которой не модифицирована специфическим образом. Перенос систем Р-М в новые клетки, по-видимому, достаточно часто происходит в природных сообществах микроорганизмов как при внутри-, так и при межвидовом обмене плазмидами, кодирующими системы Р-

М. Кроме того, известны многочисленные примеры переноса систем Р-М в клетки новых гомо- и гетерологичных хозяев при клонировании фрагментов ДНК, определяющих системы Р-М. При проникновении ДНК, кодирующей систему Р-М в бактериальную клетку, транскрипция инициируется на промоторах генов ЭР и МТЛ в условиях отсутствия продуктов трансляции этих генов. В отсутствие метилтрансферазы в системе Р-М &о11 наблюдается избыточный уровень синтеза метилтрансферазы по отношению к низкому уровню синтеза эндонуклеазы рестрикции, что, вероятно, определяется различной "силой" промоторов (Рис. 21, А). Такое соотношение ферментативных активностей обеспечивает высокую скорость метилирования ДНК клетки-хозяина и предупреждает ее гидролиз соответствующей эндонуклеазой рестрикции.

В то же время, для успешного функционирования системы Р-М в качестве "иммунной" системы клетки, защищающей ее от проникновения чужеродной ДНК, соотношение внутриклеточной активности метилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции должно быть таким, чтобы эндонуклеаза рестрикции могла i идролизовать чужеродную ДНК до того, как она будет специфически модифицирована метилтрансферазой. Вероятно, наиболее эффективно это достигается в том случае, когда, наряду со снижением активности метилтрансферазы до минимального уровня (обеспечивающего поддержание специфического метилирования клеточной ДНК), происходит повышение акгивности эндонуклеазы рестрикции. Именно такая ситуация наблюдается в системе Р-М SsoU, когда в клетке накапливается определенное количество метилтрансферазы, которая, связываясь с межгенным участком системы Р-М Ss'oII, репрессирует собственный синтез и повышает уровень синтеза эндонуклеазы рестрикции (Рис. 21, Б). Однако, способность метилтрансферазы SroII оказывать воздействие на уровень активности эндонуклеазы рестрикции в клетке, возможно, представляет собой частный случай (этого не наблюдается ни в системе Mspl (Som and Friedman, 1997), характеризующейся, как и Äoll, дивергентным расположением генов, ни в системе £coRII (Som and Friedman, 1994), гены которой имеют конвергентное расположение). Приведенные данные свидетельствуют о том, что эффективная регуляция в системах рестрикции-модификации может достигаться только за счет варьирования уровня активности метилтрансферазы при фиксированном уровне синтеза эндонуклеазы рестрикции.

Вероятно, в связи с необходимостью быстрого изменения уровня синтеза метилтрансферазы в ответ на различные воздействия, диссоциация комплекса M.SsoII с

промоторным участком собственного гена должна происходить достаточно легко при снижении концентрации M.&oII в клетке. Регуляция активности MTJI и ЭР может быть важной для выживания клетки не только при проникновении системы Р-М в новую клетку и инфекции бактериофагом, но и в тех случаях, когда происходит временная остановка синтеза белка, например, при наступлении стационарной фазы роста, при строгом ответе на ограничение по аминокислотам (Cashel and Rudd, 1987), при холодовом и тепловом шоке (Ingraham, 1987), при SOS-ответе клетки на окислительный стресс и повреждения ДНК (Christman et al., 1985; Walker, 1987). Во всех этих случаях наряду с другими белками временно прекращается синтез метилтрансферазы, что должно приводить к сдвигу равновесия в сторону диссоциации комплекса М Ssoll со своей промоторной областью (Рис. 21, В). При возобновлении синтеза белка наблюдается ситуация, аналогичная первым моментам после проникновения системы Р-М в клетку, когда выраженная диспропорция между модифицирующей и рестрицирующей активностями обеспечивает защиту неметшшрованных или полуметилированных участков клеточной ДНК от деградации эндонуклеазой рестрикции. Диссоциация комплекса М.&о11 со своей промоторной последовательностью, приводящая к усилению синтеза метилтрансферазы, должна наблюдаться также и в тех случаях, когда большинство молекул метилтрансферазы оказывается "мобилизованным" для модификации клеточной и плазмидной полуметилированной ДНК при репликации. Известно, что бактериальные ДНК-метилтрансферазы имеют более низкое сродство к неметилированной ДНК по сравнению с полуметилированной ДНК (Dubey and Roberts, 1992). Возможно, это приводит к тому, что проникающая в клетку чужеродная неметилированная ДНК не вызывает существенного сдвига равновесия в сторону диссоциации комплекса М.&оП с ДНК и эндонуклеаза рестрикции "успевает" гидролизовать ее.

В некоторых системах рестрикции-модификации обнаружен другой механизм активной регуляции экспрессии генов, основанный на активации экспрессии эндонуклеаз рестрикции и, по крайней мере, в случае некоторых систем Р-М -репрессии синтеза метилтрансфераз, небольшими регуляторными белками (С-белками) (Tao et al., 1991; Ives et al., 1992; Rimseliene et al., 1995). Этот способ регуляции принципиально отличается от рассмотренного выше тем, что регулируемым фактором является уровень экспрессии эндонуклеазы рестрикции, а также тем, что регуляция осуществляется при участии отдельного регуляторного белка, входящего в состав системы рестрикции-модификации.

Таким образом, регуляция экспрессии генов, основанная на аутореггрессии

синтеза метилтрансферазы, представляет собой новый способ активной регуляции в системах рестрикции-модификации, по-видимому, характерный для многих систем, содержащих 5МЦ-метидтрансферазы с длинной N-концевой областью, предшествующей I консервативному блоку аминокислот.

ВЫВОДЫ

1. Функционально охарактеризован сложный плазмидный комплекс пггамма Shigella sonnei 47. Изучены особенности генетической организации систем рестрикции-модификации ДНК Ssol и &оЫ, гены которых имеют плазмидную локализацию.

2. Выявлены основные тенденции эволюции аминокислотных последовательностей вариабельных участков 5-метилцитозиновых ДНК-метилтрансфераз, приводящие к возникновению метилтрансфераз с различной специфичностью узнавания и метилирования.

3. Разработаны схемы вьщеления высокоактивных и практически гомогенных ферментных препаратов эндонуклсазы рестрикции Ssoll и метилтрансфераз Xvoil и МаХ из полученных генно-инженерным способом суперпродунирующих штаммов.

4. Исследовано взаимодействие эндонуклсазы рестрикции и метилтрансферазы &о11 с синтетическими ДНК-дуплексами, в которых удалены или модифицированы различные структурные элементы центральной нуклеотидной пары участка узнавания 5'-CCNGG-3'. Показано, что локальная дестабилизация структуры ДНК-дуплекса, возникающая при введении модификации, приводит к усилению активности эндонуклеазы рестрикции .S'aoII и, в ряде случаев, к появлению, наряду с каноническим, нового места гидролиза фосфодиэфирных связей. Для метилирования ДНК существенным является образование контактов метилтрансферазы ЖгоП лишь с одпим из остатков центральной нуклеотидной пары.

5. Исследована регуляция экспрессии генов в системе рестрикции-модификации .Ssoll, опосредуемая метилтрансферазой &о11. Показано, что метилтрансфераза 5>оН снижает экспрессию собственного гена и одновременно повышает экспрессию гена эндонуклеазы рестрикции S50II в клетке.

6. Показана существенная роль N-концевого домена метилтрансферазы SioII, содержащего потенциальный модуль "спираль-поворот-спираль", для активности фермента и выполнения регуляторной функции.

7. Охарактеризовано взаимодействие метилтрансферазы &оП с участком связывания, включающим два симметричных кластера нуклеотидов, расположенных в межгенной области системы рестрикции-модификации SsoII.

8. Предложена и теоретически обоснована схема, характеризующая контакты между остатками ДНК и белка в комплексе метилтрансферазы SsoII с промоторным участком собственного гена.

9. Предложена "маятниковая" модель регуляции экспрессии генов в системах рестрикции-модификации ДНК, основанная на ауторепрессии синтеза ДНК-метилтрансферазы. Такой способ регуляции характерен для систем рестрикции-модификации ДНК II типа, ДНК-метилтрансферазы которых, подобно метилтрансферазе &о11, помимо метилирования специфических последовательностей ДНК, выполняют функцию ряуляторных белков, репрессирующих экспрессию собственного гена.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Каряпша А.С., Лунин В.Г., Никольская И.И., Дебов С.С. Функциональная характеристика плазмид штамма 5. sonnei 47J/ Молекул. генеппса.-1986.-№10.-С.16-21.

2. Карягина А.С., Лунин В.Г., Грубер И.М., Поляченко В.М., Никольская И.И., Дебов С.С. Активность рестрикционной эндонуклеазы XsoII в штаммах Escherichia coli, трансформированных плазмидами Shigella sonnei 47.// Молекул, генетика.-1987.-№12.-С.26-29.

3. Дебов С.С., Карягина А.С., Лунин В.Г., Лопатина Н.Г., Грубер И.М., Поляченко В.М., Никольская-Санович И.И. Рекомбинантная плазмида d33, кодирующая синтез метилазы SsoII и штамм Е. coli В834, несущий плазмиду d33 - продуцент метилазы SsoU. Авт. св-во ВНИИГПЭ №1539205 от 1 октября 1989 г. (заявка №4394464 от 18 марта 1988 г.).

4. Дебов С.С., Карягина А.С., Лунин В.Г., Лопатина Н.Г., Грубер И.М., Поляченко

B.М., Никольская-Санович И.И. Рекомбинантная плазмида d24, кодирующая синтез рестриктазы и метилазы &оН и штамм Е. coli В834, несущий плазмиду d24 -продуцент рестриктазы и метилазы &оП. Авт. св-во ВНИИГПЭ №1532585 от 1 сентября 1989 г. (заявка №4394643 от 18 марта 1988 г.).

5. Карягина А.С., Лунин В.Г., Никольская И.И., Дебов С.С. Локализация генов рестриктазы и метилазы £$о11 на карте плазмида Р4.// Молекул. генетика.-1989.-№3.-

C. 16-20.

6. Карягина А.С. Исследование генетической детерминанты ферментов системы рестрикции-модификации &оП.-Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1989, ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ВАСХНИЛ.

7. Карягина А.С. Генетические детерминанты ферментов систем рестрикции-модификации у бактерий, (обзор)// Молекул, генетика.-! 990.-Xs7.-C.3-] 1.

8. Kubareva E.A., Pctrauskene O.V., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S. DNA duplexes with non-nucleotide inserts: interaction with restriction endonucleases.// Nucleic Acids Res. Symp. Ser.-1991.-P.308.

9. Кубарева E.A., Пятраускене O.B., Карягшта A.C., Никольская И.И., Громова Е.С. Изменение места расщепления синтетических субстратов эндонуклеазой рестрикции &о11 при введении ненуклеотидных вставок в участок узнавания.// Биоорган, химия. -

1992.-Т. 18 JVb8.-C.l 133-1136.

10.Kubareva Е.А., Petrauskiene O.V., Kaiyagina A.S., Tashlitsky V.N., Nikolskaya I.I., Gromova E.S. Cleavage of synthetic substrates containing non-nucleotide inserts by restriction endonucleases. Change in the cleavage specificity of endonuciease S.roll.// Nucleic Acids Res.-1992.-V.20.-P.4533-4538.

11.Karyagina A.S., Lunin V.G., Degtyarenko K.N., Uvarov V.Yu., Nikolskaya I.I. Analysis of the nucleotide and derived amino acid sequences of the &оП restriction endonuclcase and methy Itransferase.// Gene.-1993. -V. 124.-P. 13 -19.

12.Karyagina A., Lunin V., Nikolskaya I. Characterization of the Ssol and SsoII restriction and modification systems. Overproduction of the SroII endonuciease and methyltransferase. FASEB Summer Research Conference "Restriction Endonucleases and Modification methyltransferases: Structure and Mechanisms", Saxtons River, Vermont, U.S.A., July 3-8,

1993, Abstract Book, P.76.

13.Kubareva E., Sheflyan G., Brcvnov M., Kaiyagina A., Gromova E. Interaction of Swll and £coRII restriction enzymes with synthetic DNA duplexes containing structural anomalies into the recognition sequence. Change of endonucleases cleavage specificity. FASEB Summer Research Conference "Restriction Endonucleases and Modification methyltransferases: Structure and Mechanisms", Saxtons River, Vermont, U.S.A., July 3-8, 1993, Abstract Book, P.80.

М.Карягина А.С., Левченко И.Я., Никольская И.И. Новый метод выделения и очистки зндонуклеазы рестрикции S.voII.// Биохимия.-1993.-Т. 52.-С.908-912.

15.Brevnov M.G., Kubareva Е.А., Romanova Е.А., Volkov E.M., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S. Interaction of Mva\ and SVoTT DNA-methyltransferases with modified substrates. Third New England Biolabs Workshop on Biological DNA modification, Vilnius, Lithuania, May 22-28, 1994, Abstract Book, P.91.

16.Schmidt S., Petrauskene O.V., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S. and Cech, D. The interaction of DNA duplexes containing 2-aminopurine-2'-deoxyribose with restriction endonucleases £coRII and &»II. Third New England Biolabs Workshop on Biological DNA modification, Vilnius, Lithuania, May 22-28, 1994, Abstract Book, P.93.

17.Karyagina A., Lunin V., Kubareva E, Levtchenko I., Labb D., Brousseau R., Lau P.C.K. &?оП and A7aX methyltransferases: overproducing strains and hybrid proteins construction. Third New England Biolabs Workshop on Biological DNA modification, Vilnius, Lithuania, May 22-28, 1994, Abstract Book, P. 111.

18.Kaiyagina A., Lunin V., Nikolskaya I. DNA methyltransferase &0II: cloning, sequencing, overproduction, mutant and hybrid protein construction. 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, New Delhi, India, September 19-22,1994, Abstracts, Vol.III, P.48.

19.Brevnov M.G., Kubareva E.A., Romanova E.A., Volkov E.M., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S. Interaction of the Mval and 5!?оП methyltransferases with

DNAs altered at the central base pair of the recognition sequence J! Gene.-1995.-V. 157.-P.149-152.

20.Karyagina A.S., Lunin V.G., Levtchenko I.Ya., Labbe D., Brousseau R., Lau P.C.K., Nikolskaya I.I. The SroII and NlàX DNA metKyltransferases: overproduction and functional analysis.// Gene.-1995.-V.157.-P.93-96.

21.Petrauskene O.V., Schmidt S., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S., Cech D. The interaction of DNA duplexes containing 2-aminopurine with restriction endonucleases £coRII and Ssoïï.f/ Nucleic Acids Res.-1995.-V.23.-P.2192-2197.

22.Karyagina A., Khodoun M., Vasilev S., Lunin V. DNA-(cytosine-5)methyltransferases: computer approach for investigation the peculiarities of DNA-protcin recognition. International Conference on Molecular Structural Biology, Vienna, Austria, September 1720,1995, Proceedings, P.276.

23 .Karyagina A., Degtyarenko K. DNA-(cytosine-5) methyltransferases: molecular evolution of target recognition domains. Third IUBMB Conference "Molecular recognition", Singapore, 23-27 April 1995, Abstracts, P.140.

24.Brevnov M.G., Kubareva E.A., Romanova E.A., Volkov E.M., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S. Modified DNA duplexes as a substrates for Mval and Sioli DNA-methyltransferases. Third IUBMB Conference "Molecular recognition", Singapore, 23-27 April 1995, Abstracts, P. 155.

25.Karyagina A., Khodoun M., Vasilev S., Nikolskaya I. Computer approach for investigation the sequence-specific DNA-protein recognition in DNA-(cytosine-5)methyltransferases. Xlth International Conference on Computers in Chemical Research and Education (Xlth ICCCRE), Paris, France, 17-21 July, 1995, Abstracts, P.B-11.

26.Sheflyan G.Ya., Kubareva E.A., Kuznetsova S.A., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Gromova E.S., Shabarova Z.A. Cross-linking of Ssoll restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs.// FEBS Lett.-1996.-V.390.-P.307-310.

27.Karyagina A., Lunin V., Shilov I., Khodoun M. Study of the transcription regulation in restriction-modification system SfoII. FASEB Summer Research Conference "Enzymes that act on nucleic acids", June 15-20, 1996, Saxtons River, Vermont, U.S.A., Abstract book, P.24.

28.Kubareva E.A., Kuznetsova S.A., Kanevsky I.A., Karyagina A.S., Nikolskaya I.I., Shabarova Z.A. DNA dumbbells as substrates for studying restriction-modification and repair enzymes.// FASEB J.-l997.-V. 11 .-P.A1309.

29.Karyagina A., Shilov I., Kubareva E., Khodoun M., Vasil'ev S. Regulation of gene expression in restriction-modification system SioII. 4th New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, Innsbruck - Igls (Austria), September 2-7, 1997, Abstract Book, P. 17.

30.Karyagina A.S., Shilov I., Tashlitsky V.N., Khodoun M., Vasil'ev S., Lau P.C.K., Nikolskaya I. Specific binding of &<sll DNA methyltransferase to its promoter region provides the regulation of SsoII restriction-modification gene expression.// Nucleic Acids Res.-1997.-V.25.-P.2114-2120.

Информация о работе

Карягина, Анна Станиславовна
доктора биологических наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы