Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Липиды и система антиоксидантных ферментов терморезистентных штаммов Shigella sonnei

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Липиды и система антиоксидантных ферментов терморезистентных штаммов Shigella sonnei"

/

^ I и

10 М1Р

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ШЕСТОПАЛОВ Александр Вячеславович

ЛИПИДЫ И СИСТСМА АИТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ ТЕРМОРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ

БЫдеНа эоппе/'

0100.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

РОСТОВ-НА ДОНУ 1995

Работ? выполнена в Ростовском государственном

медицинском университете

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки России, '

доктор медкцинсга*х наук, профессор Шепелев А.П.

Научный консультант: кандидат медициною« наук,

староий научный сотрудник Pbfflflh-J A.A.

Официальные оппоненты: действительный член Российской

Академии медицинских наук и Академии естественных наук, доктор медицинских наук, доктор биологических наук, профессор Домарадский И.В.

до!-тор биологических наук, старший научный сотрудник Микашнович Э.И.

Ведущая организация: Московский НИИ эпидемиологии и

микробиологии им. Г.Н.Габричевского

Защита состоится " РУ 1995 г. в Сгчасов на ааседании диссертационного совета Д 084.53.01 при Ростовском государственном медицинском университете (344022 г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета. •

Автореферат , азослан 0Л/ 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доцент Ксрганов Н.Я.

- г -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В этиологической структуре острых кишечных инфекций значительный удельный вес приходится на шигеллезы (Повняк С.Б. с соавт., 1992).

Ва*неклей чертой эпидемиологии дизентерии являются периодические и сезонные подъемы. Притены, обуславливающие газонные подъемы шигеллеза Зонне, до настоящего времени недостаточно изучены, а суждения о лих противоречивы. Большинство исследователей считзэт, что подъем заболеваемости в теплое время может быть связан с активизацией главного (пищевого) и дополнительного (водного) путей передачи индекнии (Солодовников Ю.П., 1992, 1994).

В последние годы появляются работы, указывающие на роль биологических особенностей возбудителей в динамике эпидемического процесса (Беляков В.Д., Каминский Г.Д., 1993). Из биологических свойств воьбудителей особое значение, наряду с вирулентностью, имеет его устойчивость к воздейстаию различных факторов внешней среды, в т.ч. к высокой температуре (Псжалостина Л.В. с соавт., 1985, Антонова H.H., ПершовВ.Е., 1991).

В литературе имеются сведения о том, что адаптация микроорганизмов к температурном условиям окружающей среды обеспечивается соответствующей перестройкой жирнокислотного состава липидов (Лях С.П., 1976, Russell N., 1984).

В последние годы с терморезистентносгью связывают существование "белков теплового шока',' играющих роль молекулярных шаперони--нов. Установлено, что белки теплового шока (БТШ) активно синтезируются при воздействии самых разнообразных неблагоприятных ректоров: "2C12. ультрафиолетового света, антибиотиков ( Jer.lclns D.E.et al.,1989, McCallum et al.,1989, Van Bo^elen R.A. et al., 1987).

В резистентности к окислительному стрессу и ряду антибиотиков большую роль играет система "адаптивного ответа на окислительный отресс", регулирующая синтез и активность антноксидантных ферментов (Kulilk I. tt al., 1994).

В настоящее время значительно возрос интерес к внутриядерным липидам, игроющим важную роль в регуляции генной .окспреосли (Але-сенко A.B., 1981, Романенко Е.П. с соавт., 1991, Стручков В.А., Стражевскал Н.В , 1993). Вероятно, что ДпК-ср/,ванные липиды, являясь регуляторами транскрипции, играют роль 4 реализации универсальных механизмов адаптации.

Однако, сведения, касающиеся особенностей состава клеточных и ДНК-связанных липидов, актиьности антиоксидантных ферментов терморезисте,.тных штаммов Shigella sonnei, в доступной нам литературе отсутствуют, что послужило основанием длч проведения настоящей работы. ■"

Целью настоящего исследования явилось выяснение биохимических механизмов фор?,дарования терыореаистентных штаммов Shigella sonnei. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Определить устойчивость циркулирующих на территории Ростовской области штаммов Shigella sonnei к высоким температурам.

2. Провести сравнительное изучение биологических свойств термолабильных и терморэзистентных штаммов Sh. sonnei.

3. Изучить составы нейтральных липидов, фосфолишдез, высших жирных кислот липидов термолабильных и терморезистентных штаммов Sh. sonnei.

4. Определить содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЯ) (диеновых кон-ыпгатов и шиффовых оснований) в термолабильных и терморезистентных штаммах Sh. sonnei при субгэтальном температурном воздействии.

5. Изучить активность антиоксид антных ферментных систс-м (су-пероксидцисмутазы и каталазы, глутатион-S-iрансферазы и глутатион-редуктазы) термолабильных и терморезистентных штаммов Sh. sonnei.

6. Охарактеризовать состав ДНК-связанных липидов термолабильных и терморезистентных штаммов Sh. sonnei.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований получены новые факты, имеющие существенное значение для понимания механизмов адаптации Shigella sonnei к высоким температурам. Впервые проведено систематическое исследование состава липидов и активности антиокси-дантных ферментов терморезистентных штаммов Sh. sonnei. Показано повышенное накопление продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конгюгатов и шиффовых оснований) при сублетальном температурном воздействии. Впервые исследован состав ДНК-связанных липидов Sh. sonnei. Охарактеризованы изменения в составе ДНК-свя-ванных липидов при адаптивных процессах прокариот. .

По ревультатам проведенных исследований на защиту выносятся следующие основные положения:

1. Штаммы Shigella sonnei характеризуются различной устойчивостью к действию высоких температур. Терюрезистентные штаммы Sn. sonnel характеризуются более высокой устойчивостью к действию ряда антибиотиков и перекиси водорода.

2. Сублетальное температурное воздействие вызывает выраженную активацию процессов перекисного окисления липидов, характер которой свидетельствует о значимости свободнорадикалы.эго окисления в процессах термоинактивации микроорганизмов.

3. Терморезистентность Shigella sonnei сопровождается значительной перестройкой состава клеточных липидов, ДНК-связанных липидов, повышением эффективности антиоксидантней защиты.

Научно-теоретическая и практическая значимость работы.

Работа вносит В1слад в углубленное понимание универсальных механизмов адаптации микроорт-чзмов к неблагоприятным факторам внешней среды. Установлена роль механизмов метилирования липидов и индукции синтеза антиоксидантпых ферментов в адаптации Shigella sonr. э1 к высоким температурам. Выявленные биохимические различия терморезистентных и термолаС шьпых штаммов шигелл могут быть использованы в качестве маркеров терморезистентности при разработке новых методов лабораторной диагностики шигеллезов и для совершенствования системы эпиднадзора за ними. Информационное письмо "О биологических и биохимических свойствах терморезистентных и термолабильных штаммов шигелл" направлено в проблемную комиссию ПНЦ-3 4.05.92 исх. N 470. Материалы к оценке липидного сос.ава терморезистентных шигелл напгавлены в проблемную комиссию ПНЦ 23.11.92т". исх. N ?48 для составления совместного методического документа.

Апробация работы.

Осночные положения рабсты доложены на научной конференции "День науки" студентов, молодых ученых и специалистов РГМУ (Ростов н/Д, 1989, 1990, 1992, 1994), на VI Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Н. Новгород, 1991) заседании Ростовского биохимического обществ? СЮ 03.1995г).

Публикации материалов исследования.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных ра^от, из них -4 в центральной печати.

Объем и структура диссертацич.

Диссертация иалгжена .¡а 142 страницах машинописного текста.

иллюстрирована 9 таблицами, 15 рисунками и 2 схемами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, сгиска литературы, включающего 105 отечественных и 171 зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ-

Материалы и методы исследования. Объектом настоящего исследования являлись 315 штаммов Shigella sonnei, выделенных от больных де^ей и взрослых при спорадически?; заболеваниях дизентерией.

Термореаистентность штаммов определяли согласно методическим рекомендациям (Пожалостина Л.В. с соавт., 1985). Определение био-варов проводили по методу Новгородской Э.М. (1945), основанному на вариабельной способности различных штаммов шигелл ферментировать рамнозу и ксилозу. Колицинотипироьание проводили по методу Кашановой Н.И. (1S70), основанному на способности шигелл продуцировать колщига с неодинаковым спектром действия на индикаторные штаммы. Изучали чувствительность шигелл к антибиотикам. Мигималь-ную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотиков определяли по общепринятой методике, используя концентрации от 0,5 до 100 мкг антибиотика ьа 1 мл слабощелочного агара. Чувствительность к Н2О2 термолабильных и терморезистентных штаммов Shigella sonnei определяли согласно Самойленко h.И. с соавт. (1983).

Биохимические исследования проводили с биомассой, полученной ив 30 разных по отношению к высокой температуре штаммов Sh. sonnei , выращенных на мясо-пептоньом агаре, находящихся в стационарной фазе роста.

Для экстракции липидов из бактериальных клеток использовали метод Bllgh E.L., Dyer W.J., (1959). Определение липидного фосфора проводили методом Shibuya et al.,(1967). Определение неэстери-фкцированных жирных кислот (НЭЖК) проводили методом Anstall et al., '1965), гл1щеридов - унифицированным методом Fletcher V. (1S66). Качественную реакцию на ..олестерол проводили по методу Либермана - Бурхарда в модификации С.Д. Балаховскогп и П.С. Бала-ховского (1953). Определение продуктов перекисного окисления липидов - диеновых конъюгатов (ДК) и шиффовых оснований (ШО) проводили до и после сублетального температурного воздействия (прогревание суспензии клеток на водяной бане при 60°С в течение 3 минут-». Содержание ШО определяли флюориыетрически (B.Fletcher et

al., 1973), ДК - спектрофотометрически методом R.O. Recknagel, A.K. Choshal, (1966). Препаративное разделение липвдов на классы соединений было выполненг методом тонкослойной хроматографии (ТCK) на оиликагеле Н. Состав высш.ж жирных кислот определял" путем хроматомасспектрометрии.

Надмолекулярные комплексы ДНК ("М ДНК) выделяли путем "мягкого" фенольного лизиса (Стручков В. Л. ,1962). Экстраки-яо ДНК-связанных липидов проводили по Bligh E.L., Dyer W.J., (1959) после инкубации НМ ДНК с ДНКазой!. Липиды разделяли с помощью ТСХ.

Для определение активности антиоксидантных ферментов клетки шигелл подвергали ультразвуковой дезинтеграции. Содержание в биологическом материале белка определяли методом О.Н. Lowry et al., (1952). Активность каталазы определяли по скорости утилизации пер-оксида водорода методом R.F. Beers, I.W. Sizer (1952). Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли методом M.Nishiklri et al., 1972) Активность глутатионредуктазы (Г?) определял., по накоплению окисленного НАДФН (R.E.Pinto, W.Bartley, 1SS9>. Активность глута-тион-Б-трансферазы (ГТ) определяли по накоплению конъюгата восстановленного глутатиона с 1-С>2,4-динитробензолом (W.H.Habig et al., 1974).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятыми методами ( Г.Ф. Лакин, 1990). 0 достоверности отличий учитываемых показателей исследуемых групл штаммов судили по величине t-кригярия Стыодента после проверки распределены ь группах на нормальность. Для анализа выборок с небольшим количеством наблюдений использовали непарамьтрические метод'i статис-ти^еской обработки. Статистически достозгрными считали отличия, соответствующие оценке ошибки достоверности р<0,05. Ста: истическую обработку' проводили с пометою программа "Stadia" на IBM PC Р86ХТ.

Результаты и их обсуждение. Все изученные штаммы были типичными по культуральным, Сиох'мическим и серологическим свойствам, не разлагали рамнояы и ксилозы (II биовар), лизировалис^ поливалентным дизентерийным бактериофагом. По способности продуцировать колицины штаммы бкли отнесены к 2, 5, 6 колигчногекэварам.

Определение устойчивости шигелл к воздействию еысокой температуры путем прогревания при температуре 69°С, 70°С, 75°С, ви°С и 90°С в течение 5, IG и 30 минут показало их неоднородность по от-ношец.и к равным темлературам. После прогревания при Б9°С в течь-

ние 5, 15, 30 минут из всех стаммов погиб только один. В то- же время 96,8% изученных штаммов сохраняли жизнеспособность при прогревании до 70°С в течение 5 минут, 73,9% - при прогревании до 80°С и 8,3% - до 90°С. Увеличение времени прогревания до 30 минут привело к тому, что жизнеспособными оставались 89,5% штаммов при температуре 70°l,19,3% - при 80°С и только при П0°С погибали все штаммы. Таким образом, по степени устойчивости к высоким температурам штаммы можно разделить на термолабильные (I группа) - погибали при тейьературе 70°С в течение 5-15 минут (3,2%), промежуточные (II группа) - погибали при температуре 80°С в течение 5 -15 мину"1 (78,5%) и термостабильные (14 группа) - сохраняли жизнеспособность при температуре 85-90°С в течение 5-15 м1:нут. (8,3%).

Сравнительной анализ биологических свойств изученных штаммов (принадлежность к определенному биовару, колициногеновару, фаго-лизабельность; не выявил различий между штаммами трех групп.

Определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) 6 антибиотиков по отношению к исследуемым штаммам. Использованы 2 группы антибиотиков, различающихся по механизму действия на микроорганизмы: 1) антибиотики, изменяющие проницаемость цитоплазма-тическсй мембраны и угнетающие синтез клеточной стенки микроорганизмов (полимиксин, ампициллин, карбенициллин), - "мембранотроп-HJe" и 2) антибиотики, нарушающие процессы синтеза белков микробной клетки (стрептомицин, тетрациклин, неомицин). В результате проведенных исследований установлено статистически достоверное различие МПК антибиотиков первой группы по отношению к термала-бильным и термостабильным штаммам - 2,35 + 0,21 и 15,07 + 2,03 мкг/мл. Антибиотики второй группы подавляли рост микроогранизмов только в существенно большей концентрации (порядка 40 мкг/мл). При этом как термолабильные, так и термостабильные штаммы угнетались близкими концентрациями антибиотиков - 38,44 + 4,63 и 43,6 +2,17 мкг/мл соответственно (таб. 1).

Результаты исследования по определению устойчивости клеток Shigella sonnel к различным концентрациям перекиси водорода показали, что 1М раствор Н2О2 обладает высокой бактерицидной активностью в отношении термолабильных штаммов. В то же время термо-ревистентные штаммы оказались устойчивы к раствору данной концентрации, и количество выживших клеток составило 6,6%. Результаты определения жизнеспособности Shigella sonnei в растворах пере-

Табл"ца 1.

Биологическая характеристика Sh. sonne i.

термолабильные шта»мы промежуточные птаммы тер; 'остаб ильные штаммы

Биовар II II II

Лизирование поливалентным бактериофагом + + +

Колициногековары 2, 5, 6 2, 5, 6 2, 5, 6

Содержание Б-форм(%) 16,20+ 6,40 10,85 + 4,08

МПК мембранотропных антибиотиков мкг/мл 2,35+ 0,21 15,07 + 2,03*

МПК антибиотиков, нарушающих синтез белка (мк^/мл) 38,44+ 4,63 43,60 + 2,17

ПРИМЕЧАНИЯ: * - ошибка достоверности разности показателей р<0,05

г

Концентрация растворов НгОг (М)

Рис. 1. Выживаемость Shigella sonnei в раотворрх НгО* А - терморезистентные штаммы В - термолабильные штзммы

киси водорода меньших концентраций показали,что терморезистентные штаммы характеризуются более высоким процентом выживаемости при инкубации в 0.03М и О.ЗМ растворах Н2О2 (рио. 1).

Таким образом, терморезистентнче штаммы Shigella sonnei характеризуются выраженной устойчивостью к действию "мембранотроп-них" антибиотиков и растворов перекиси водорода.

Количество свободнозкстрагируемых липидов в клетках Sh. sonnei составляет 5,03 - 5,21% и было практически одинаково во всех трех группах. Обращают внимание различия содержания фосфсшипидов в исследуемых группах штаммов. Терыореаистентные пиаммы содержат в 2 раза больше фосфолипчдов, чем термсдабильные штаммы (рис.2.).

Количество моно£";илглицеридов (МАГ) выше в термолабильных lгаммах, чем в промежуточных и терморевистентных штаммах. Содео-жание 1,2 - диацилглицеридов (1,2-ДАГ) достоверно выше в терморевистентных штаммах, чем в термолабильных и промежуточных штаммах<

Содержание симметричных 1,3 - диацилглицеридов (1,3 - ДАТ) выше в 1-й и 2-й группах, чгм в 3-й группе штаммов. Количество триацилглицепидов (ТАГ) значительно выше в термолабильных штаммах, чем в промежуточных и термостабиль ых. Промежуточные и термостабильные штаты характеризуются более высоким содержанием не-эстерифицированных жионых кислот (НЗЖК), чем термолайильные штаммы. В незначительных количествах в свободнозкстрагируемых лип ид ах Sh. sonnei обнаружен!' эфиры высших жирных кислот , содержание которых было выше в термолабильных и промежуточных штаммах в сравнении с термостабильными штаммами. Таким-ofразом, терморезистентные штаммы Sh. sonnei характеризуются высоким содержанием фосфо-липидов и низким содержанием основных фракций нейтральных липидов: моноацилглицерчдов, 1,3 - диацилглицеридов, триацилглицери-дов, зфиров высших жирных кисют. Однако, обращает внимание относительно высокое содержание в терморезистентных гтаммах 1,2 - диацилглицеридов и неЗстерифицированных жирных кислот, диссонирующее с содержанием остальных фракций общих липидов.

В свободнозкстрагируемых липидах клеток Sh. sonnei выявлено 7 фракций фосфолюпидов. Ив данных, представленных на рис. 3, видно, что фракция фосфатидилэтаноламинов является основной в фосфо-лшшдном составе клеточных липидов St.. sonnei. В значительных количествах обнаружена фракция полиглицерофосфатицов. Количество диео-фосфолилидов больше на 54% во второй груп..з штаммов и на 292

Рис. 2. Состав свободноэкстрагируемых'липидов Shigella sonnei.

1 - фосфолипиды, 2 - мпноацилглицериды, 3 - 1,2-диацил-глицериды, 4 - 1,3-диацилглицериды, 5 - триацилглицериды, 6 - неэстерифицированные жирные кислоты, 7 - эфиры жирных кислот. А - термолабильные штаммы, Б - промежуточные штаммы, С - термореаистентные штеммы. * - достоверность разности показателей в сравнении с 1-й группой (р<0,05).

Рис. 3. Состав фосфолипидов Shigella sonnei.

1 - лизофосфатидилсерины + лиБофосфатидилэтансигамшш,

2 - фосфатчдилсерины, 3 - фосфатидилэтаноламины, 4 - метил- + диметилфосфатидилэтаноламины, 4 - фосфатидилглице-рины, 5 - полиглицерофосфатиды, 6 - фосфатидные кислоты. А - термолс-Зильные штаммы, В - промежуточные штаммы, С -терморезистентные штаммы. * - достоверность разьости показателей в сравнении с 1-й группой штаммов ср<С,05).

в 3-й группе, чем в первой группе штаммов ИЬ. зоппе!. Количество фосфатидилсеринов практически одинаково во всех группах исследуемых штаммов и составляет 6,03 - 6 9-*%. Обращает внимание тот факт, что на фоне незначительного сниг.ения уровня фс^фатидилэтанолами-. нов : на 7,8% во второй группе и на 3,9% в 3-й группе в сранении с первой группой, достоверно возрастает количество метилированных производных фосфатидилэтаноламинов - Н-^осфатидилметилэтанолами-нов и N,1) -фосфатидилдиметилэтаноламинов на 36,2% во 2-й группе и на 422 в 3-й группе в сравнении с 1-й группой. Количество фосфа-тидилглицеринов в 3-й группэ снижено на 30% в сравнении с первой группой. Незначительно возрастает ¡лличественное содержание полит лщерофосфатидов: на 26% и на 10% соответственно во 2-й и 3-й группах в сравнении с 1-й группой исследуемых шааммов. Количество фосфатидных кислот также выше в терморезистентных штаммах на 22%,. чем г термолабиль"ых.

Нали данные, касающиеся содержания отдельных фракций фосфо-липидов клеток БЬ. аоппе!, позволяют сделать вывод, что спектр клеточных фоефолипидов шигелл обладает рядом свойств, характерным и для других грамотрицательных бактерий: основными фосфолипидами являются фосфатидилэтаноламины, полиглицерофосфатиды, отсутствуют Лосфатидклхолины м лилоаминокислоты. Особенностью терморезистентных штаммов шигелл является более высокое содержание метилированных производных фосфатидилэтаноламинов - метил- и диметилфосфа-тидилэтаноламинов.

В общих свободноэкстрагируемых липидах клеток Бп.гоппе! обнаружено 14 высших жирных кислот. Основной по количеству жирной кислотой является пальмитиновая. Ее количество практически одинаково во всех трех группах изучаемых штаммов. Суммарное содержание насыщенных неразветвленных жирных кислот в 1-й, 2-й и 3-й группах составляет соответственно 61,0%, 57,2%, 58,8%. В следовых количествах обнаружены разветвленные лсрные кислоты. Содержание 16-ме-тилгептад:кановой кислоты в липидах термолаб:льных штаммов составляет 0,17%, в липидах промежуточных штаммов - 0,13%. В липидах термореБистектных штаммов Бй. эоппе1 эта кислота не обнаружена. Обращает внимание значительное различие содержания ненасыщенных и циклопропановых жирных кислот в сравниваемых группах штаммов. По мере выраженности терморезистентности уменьшаются количества геге-садеценовок и октадеценовой жирных кислот, и повышаются уровни

Рис. 4. Суммарное содержание насыщенных (I), цикдопропановых (II), и моноеновых (III) жирных кислот в термолабилгных (А), промежуточна (В) и терморезистентных (С) штаммах Shigella sonnei.

ГЛУТАТИОН- ГЛУТАТИОН-S-С О Д КАТАЛАЗА РЕДУКТАЗА ТРАНСФЕРАЗА

ES - термолабильные штаммы ШШ - терморезистентные

Рис. 5. Активность антиоксидантных ферментов

терче-пбилъных и терлсревистентных штаммов Sn. sonnei пга!ЕЧАНИЯ: * - огагта достоверности разности показателей р<0,05

Рио. , 6. Содержание ДК в липидах ЗГь зоппе1 до (К) и после

(О) сублетального температурного воздействия. Рис. 7. Содержание 11Ю в липидах БЬ. гоппе! до (К) и после (0) сублетального температурного воздействия.

ыетиленгекодцекановой и метилпоктадекановой жирных кислот. Анализ с>лшрного содержания различных групп жирных кислот позволяет говорить о том, что терморезистентность ЭЬ. ьоппе1 характеризуется низким содержанием ненасыщенных и высоким содержанием цчклопропа-новых жирных кислот (рис. 4.).

Таким образом, ьеро:.по, модификиЦ"я фосфолипидного и жирно-кислотного составов терморезистентных штаммов Бй. Боппе1 осуществляется одним и тем же механизмом - метилированием.

Установлено, что продукты метилирования фосфатидилэтанол-аминов обладают стабилиэкрулщим эффектом на льлвдныи бислой бактериальных мембран (ОоШПпе 1984). Дополнительные метильные группы в "головке" зтаноламина, по-видимому, способствуют созданию гидрофобного окружения, необходимого для защиты уязви.лых ли-пидных молекул от активных форм кислорода. Метилированием моное-новых жирных кислот обеспечиваемся своеобразная "стабилкзация" двойной связи. Из данных литературы известно, что при старении бактериальных популяций, возникновении чнтибиотикорезисгэнтности в клеточных липидах повышается содержание циклопропановых жирных кислот, фосфатидилхолинов (Расюренко З.П. с соавт., 1979, Пеголн А.З. с соавт., 1993).

Таким образом, можно сделать вызод, что механизм метилирования мембранных липидов являемся универсальным механизмом в адаптации микроорганизмов к неблагоприятным (изменяющимся) условиям сре.-,ы.

На рис. 6,7 представлены данные о содержании продуктов переписного окисления липидов в штаммах БЫ^11а эслпе! до и после сублетального температурного воздействия. Установлено, чт«" содержание ДК в липидах термолабиль.шх штаммоч составляет 3,074 х 10~5 нм/мг общих липидов, а в липидах терморевистектных шта»люв -4,344 х Ю-5 нм/мг; содержание НЮ составляет 232,08 и 260,14 стн.ед./мг общих липидов соответственно. Однако, после субдетального температурного воьдеиствия уровень ДК I ШО в липидах термолабильных штаммов вгоос на 89,7% и 49,5% сооаветвенно, в то время, как в липидах термолайгльных штаммов гти показатели уъел;'чи-лись на 38,7% и 21,8%. Ив этого следует, что процессы ПОЛ при-часткы к термоинактлвации и термог. бели шигелл; регулиция процессов ПОЛ "ро- и антиок":идантныыи системами в терморезистентных штаммах перехсдит на более высокий уровень.

Результаты по определению активности антиоксидантных ферментов представлены на рис. Б. Активность супероксвддисмутааы в клетках терморезистентных штаммов достоверно выше на 31,4%, чем в клетках термолабильных штаммов. Терморезистентные штаммы характеризуются высоким уровнем активности каталазы, превышающим таковой термолабильных штаммов на 206,8%. Активность гяутатионредуктааы в термореаистентных штаммах выше, чем термолабильных на 15,5%. Активность глутатион-S-трансферааы в тэрморезистентных и термолабильных находится на одном уровне. Таким образом, терморезистентные штаммы Sh. sonnei характеризуются высокой активностью супероксвддисмутааы и каталазы, которые, вероятно, вносят определенный ьклад в толерантность шштлл к высоким температурам, "мембрано-' тропным" антибиотикам, растворам перекиси водорода.

Установлено, что в термоповрежденных бактериальных клетках накапливается Н2О2 (Mackey В.М. et al., 1982), что бактериальные клетки характеризуются высоким содержанием свободного Ре2+ (Кур-банов И.С. с соавт., 1990). Таким образом, при тепловом воздействии в бактериальной клетке возникает ситуация, которая может разрешиться Ге2+-индуцированным образованием гидроксильного радикала (ОН'), являющимся наиболее реакционно-способной АФК (Van Asbeck B.S., 1990).

Нашими исследованиями показано, что терморезистентные штаммы Sh. sonnei обладают "олее мощными антиоксидантными защитными механизмами, чем термолабильные штаммы, которые проявляются высокой активностью супероксмддисмутааы и каталазы, метилированием моно-еновых жирных кислот и фосфатйдилэтаноламинов.

Установлено, что повышенная активность антиоксидантных ферментов обуславливает толерантность микроорганизмов ко многи" неблагоприятным факторам, в т.ч.: к воздействию антибиотиков, ионизирующему излучению (Самойленко И.И., 198Ь, Area P. rt al., 1990) и др. Таким образом", активация ферментов антиоксидантной вациты также является универсальным механизмом в адаптации бактерий к неблагоприятным факторам. Показано, что окислительный стресс является индуктором синтеза антиоксидантных ферментов (Farr S.B. et al., 1991), но он же является и индуктором экспрессии генов белков теплового шока (Christmari M.F. et al., 1985). Это указывает на вероятную связь процессов синтеза антиоксидантных ферментов и белков теплового шока.

Индукция приспособительных механизмов не может быть полностью оценена без рассмотрения вопросов, касающихся регуляторов генной активности, в частности, ДНК-связанных липидов.

Результаты по определению состава ДНК-связанных липидов показали, что терморезистентные штаммы отличлы от термолабильных составом НМ ДНК (рис. 8.). Снижено на 12,7% количество обших ДНК-связанных липидов за счет более низкого содержания нейтральных липидов. Процентное содержание нейтральных липидов от общих в терморезистентных штаммах достоверно ниже, чем в термолабильнчх, и составляет 90,5 и 84,4% соответственно. Также снижены уровни основных фракций нейтральных липидов: диацилглицеридов, эфиров высших жирных кислот, неэстерифицированных жирных кислот, однако количество холестерина увеличено на 32,5% (в процентном отношении к общим и нейтральным липидам на 63,8% и 77,4% соответственно). Вместе с трм, количество фосфолипидов в НМ ДНК терморезистентных штаммов Sh. sonnei увеличено на 44,3% (в процентном отношении к общим липидам на 65,5%). Фракция полиглицерофосфатидов повышается на 85,1% (в пргцентном отношении к общим и фосфолипидам на 107,7% и 23,6% соответственно).

Как следует из результатов наших исследований, в НМ ДНК терморезистентных штаммов Sh.sonnei на фоне уменьшения количества общих ДНК-связанных липидов достоверно понижено содержание нейтральных липидов и увеличено количество полиглицерофосфатидов и холестерина.

Данные литературы свидетельствуют о важной роли полиглицерофосфатидов в процессах релаксации ДНК, активации ДНК-псш*мераз II, III, PilK-полимераз, dna А белка (Стручков В.А., Стражевская Н.Б., 1993). Учитывая, что холестерин, езязанный с ДНК, также активирует процессы репликации, можно сделать вывод, что профиль ДНК-свяванных липидов терморезистентных штаммов Shigella sonnei будет определять функционально-активную конформацию ДНК.

Так как при термошоке возникают одно- и двухцепочечные разрывы ДНК (Pierson M.D. et al., 1978, Hanlin J.H. et al., 1981), профиль ДНК-связанных липидов будет определять "активное" состояние ДНК, необходимое не только для .биосинтетических процессов, но и для эффективной репарации ДНК.

Таким образом, ДНК-связанные липиды по своему составу ревко отлшаются от липидов мембран.- ДНК-связанные липиды терморезис-

Рис. 8. Состав нейтральных ДНК-связанных липидов Shigella sonnei термолабилькых (А) и терморезистентных (В) штаммов. 1 -общие липиды, 2 - нейтральные липиды, 3 - диацилглицериды, 4 - неэстерифицированные жирные кислоты, 5 - эфиры жирных кислот, 6 - холестерин.

Рис. 9. Состав ДНК-свяаанных фосфолилкдоа термолабильных (А) и терморезистентных (В) штаммов Shigella sonnei. 1 - Лосфо-липиды, 2 - полит "ицерофосфатиды, 3 - фосфатидилэтанол-одины.

тентных штаммов Sh. sonne1 характеризуются высоким содержанием общих фосфолипидов, полиглицерофосфатидов, холестерина, что необходимо для сохранения нативной конформации ДНК, а также для реализации приспособительных механизмов (синтез БТШ, метилирование липидов, синтез антиоксидантных ферментов) в масштабе целой клетки в условиях гипертермии.

Для жизнедеятельности организмов и сохранения популяции необходимы: сохранение генетического материала, постоянное возобновление структурных элементов, надежная регуляция метаболизма, обеспечивающая его адекватное изменение в ответ на сигналы внешней среды.

По-видимому, в бактериях при воздействии самых различных неблагоприятных факторов срабатывает адаптационный механизм, причем, при различных стрессорах этот механизм не приобретает какие-либо качественные особенности, а характеризуется лишь количественным соотношением его слагаемых, одними из которых, по-видимому, являются метилирование мембранных липидов и ДНК, индукция синтеза БТШ, индукция синтеза антиоксидантных ферментов.

Универсальность этого адаптационного механизма доказана нами на примере терморевистентных штаммов Shigella sonnel, которые, характеризуясь конститутивно высокой активностью антиоксидантных ферментов и высоким уровнем метилированных форм липидов, обладают выраженной толерантностью не только к высоким температурам, но и к "мембранотропным" антибиотикам, и к растворам перекиси водорода.

ВЫВОДЫ. ,

1. Штаммы Shigella sonnei характеризуются различной устойчивостью к действию высоких температур: 3,22 штаммов погибают при температуре 70°С в течение 5-15 минут (термолабильные); 8.3Z штаммов сохраняют жизнеспособность при температуре 90°С ~ течение 5-15 минут (терморезистентные). Терморезистентные штаммы характеризуются более выраженной устойчивостью к действию "мембраао-тропных" антибиотиков и растьоров перекиси водорода.

2. Терморевистентные штаммы характеризуются высоким содержанием фосфолипидов, НЭЖ, 1,2-диацилглицеридов и низким содержанием основных фракций нейтральных липидов: моноацилглицеридов, 1,3-диацилглицеркдов, триацилглицеридов, эфиров высших жирных кислот по сравнению с термолабильными штаммами.

3. Спектр клеточных фосфолипидов Shigella sonnei обладает рядом свойств, характерным и для других грамотрицательных бактерий: основным" фосфолипидами являются фосфатидилэтаноламины, полит лицерофосфатиды ; отсутствуют фосфатидилхолины и липоаминокис-лоты. Особенностью терморезистентных штаммов Sh.sonnei является более высокое содержание метилированных производных фосфатидил-зтаноламинов - N-фосфатидилметилэтаноламинов и N.N -фосфатидилди-метилэтаноламинов.

4. Спектры высших жирных кислот липидов терморевистенткых -штаымив Sh. sonnei характеризуются низким содержанием ненасыщенных и высоким содержанием циклопропановых жирных кислот по сравнению с термолабильными штаммами.

5. Терморезистентные штаммы Sh. sonnei характеризуются высокой активностью антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы и катадазы.

6. Липиды терморезистеных штаммов Sh. sonnei характеризуются более высоким содержанием диеновых конъюгатов и шиффовых оснований, чем липиды термолабильных штаммов. При суОлетальном температурном воздействии уровень диеновых конъюгатов и шиффовых оснований резко возрастает в липидах термолабши чых и практически не изменяется в липидах терморезистентных штаммов.

7. В составе ДНК-связанных липидов Sh. sonnei преобладают нейтральные липиды. Фосфолипиды представлены фосфатидилэтанолами-нами и политлицерофосфатидами. Терморезистентные штаммы характеризуются более высоким содержанием полиглицерофосфатидов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Жирнее кислоты бактерий Shigella sonnei.//Анн. докл. 43-й итоговой научной конференции студентов, молодых ученых и специалистов РОДНМИ, 1989г. - Ростов-на-Дону, 1989. - С. 87.

2. Изменение состава жирных кислот как фактор повышения устойчивости шигелл Зонне к воздействию высокой температуры / Гаса-нова Л.И., Рындич A.A./. // Tee. докл. научно-практической конференции посвященной 60-летюо Ростовского ордена Дружбы народов медицинского института. - Ростов-на-Дону, 1990. - С. 167 - 168.

3. Изменение состава жирных кислот ка фактор повышения устойчивости микроорганизмов к температурным воздействиям. //Анн. докл. 44-й итоговой научной конференции студентов, молодых ученых и специалистов РОДНМИ, 1990г. - Ростов-на-Дону, 1990. - С. 79.

4. Термоустойчивость шигелл Зонне и ее роль в реализации пищевого пути передачи инфекции / Гасанова Л.И., Рындич A.A./. // Тез. докл. VI Всероссийскою сьезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов, т.1. - М., 1991. - С. 150.

5. Роль липидов в формировании механизмов термоустойчивости Sh.sonnei / Кублашвили Д.Д./. // Анн. докл. 46-й итоговой научной конференции студентов, молодых ученых и специалистов РОДЧМИ,1992г.

- Ростов-на-Дону, 1992. - 0. 33.

6. О терморезистентности шигелл Зонне / Шепелев А.П., Рындич A.A./. // Актуальные проблемы инфекционной патологии чЛ Кишечные и респираторные инфекции. - С.-Петербург, 1993. - С. 90.

7. О механизме устойчивости Shigella sonne1 к воздействии высоких температур / Шепелев А.П., Рындич A.A., Рабинович В.Д., Гасанова Л.И., Сухарь В.В./. // Яурн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 1993. - 6. - С. 16 - 17.

8. ДНК-свяванные липиды шигелл Зонне. //Аня. докл. 48-й итоговой научной конференции студентов, молодых ученых и специалистов РМИ, :994г. - Ростов-на-Дону, 1994. - С. 18.

9. Антиоксидантная защита терморезистентных штаммов шигелл Зонне //Анн. докл. 48-й итоговой научной конференции студентов, молодых ученых и специалистов РМИ, 1994г. - Ростов-на-Дону, 1994.

- С. 18.

10. ДНК-свяаанные липиды терморе8истентных штаммов Shigella sonne! /Шепелев А.П., Рындич A.A., Ставиский И.М., Яговкина В.Э./. // "Бюллетень экспериментальной биологии и медицины". - 1995. - С.

Подписано к печати ОЪ.

Формат бумаги Ш х 84. 1Д64 Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. лист - У

Заказ -Уб8 • тира* 00 Ц