Диссертации » Биологические науки » Микробиология

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуномагнитная сепарация с последующей АТФ-метрией в экспресс-индикации шигелл Зонне
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммуномагнитная сепарация с последующей АТФ-метрией в экспресс-индикации шигелл Зонне"

На правах рукописи

Латкин Александр Тимофеевич

Иммуиомагнитная сепарация с последующей АТФ-метрией в экспресс-индикации шигелл Зонне

(03.00.07 - микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -2005

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В.М. Бондаренко

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Афанасьев С.С.

доктор биологических наук Мещерякова И.С.

Ведущая организация:

Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича

Защита диссертации состоится « .» июня 2005 года в 11 ч. на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Е.В. Русакова

wi

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Шигеллезы относятся к числу острых кишечных инфекций, эпидемиологическая значимость которых возрастает как в развитых, так и в развивающихся странах (Бюлл. ВОЗ, 1994). Отмечен постоянный уровень количества случаев шигеллезов в мире, равный 165 млн случаев в год. В последнее десятилетие число смертельных случаев возросло с 660 тыс до 1 млн 100 тыс в год. В Российской Федерации отмечается сохраняющийся высокий уровень заболеваемости гаигеллезами среди населения, включая спорадические случаи и вспышки, в том числе впутрибольничные (Оншценхо Г.Г.,2000). В Москве (согласно данным Центра Госсанэпиднадзора) на протяжении 1993-1999 гт. возникло 310 эпидемических вспышек острых кишечных инфекций различной этиологии, при этом 81 вспышку (26,1%) вызвали шигеллы Зонне (Солодовников Ю.П.,2000).

На этом фоне в связи с возможной контаминацией молока и молочнокислых продуктов шигеллами Зонне значительно возросла потребность надежпого обнаружения возбудителя в исследуемом материале. Немаловажным остается обследование декретированных групп, в частности, работников пищеблоков, на носительство шигелл. Для определения шигелл в пробах предложено несколько различных методов индикации возбудителя, к которым относится классический бактериологический анализ, иммунофлюоресцентная микроскопия, реакция коагглютинации, иммуноферментный анализ, обнаружение ДНК возбудителя с помощью полимеразной цепной реакции и др.

Появившаяся в последние годы угроза биологического терроризма, периодическое возникновение чрезвычайных ситуаций природного или техногенного происхождения с последующим ухудшением санитарно-эпидемиологической обстановки, наличие природных очагов особо опасных инфекций диктует необходимость дальнейшего совершенствования методов экспресс-индикации возбудителей как одного из ведущих разделов специфической индикации с целью оценки степени опасности эпидемического очага и экспертизы подлежащих исследованию объектов. Высоко чувствительными методами обнаружения возбудителя является обнаружение ДНК с помощью различных модификацией ПЦР (Гинцбург А.Л.,1998; Шапгаян И.А., 2000; Шипулин Г.А. и др., 2002) и биолюминесцентой АТФ-метрии (Угарова II.H. и др., 2000; Sun W. et al.,

2002).

Практически все известные индикационные методы исследования предусматривают разовый отбор исследуемых проб ограниченного объема, не превышающего, как правило, 1-50 мл. При этом возбудители могут присутствовать в отобранных пробах в низких концентрациях, что требует проведения предварительного концентрирования патогенных микроорганизмов в исследуемых образцах с отделением их от сопутствующей микрофлоры.

Для этого могут быть использованы различные сорбенты, в том числе иммуномагнитные сорбенты, используемые ири выделении и идентификации различных патогенных микроорганизмов и их специфических антигенов (Ефременко В.И.,1997). Магнитные свойства носи!елей таких сорбентов делают их управляемыми в магнитном поле, что обеспечивает возможность автоматизации процесса при работе с ними. Выступая в качестве твердой фазы, иммуномагнитные сорбенты нашли применение в комплексе с иммунофлюоресцентным, биолюминесцентным и амплификационным методами индикации ряда возбудителей (Василенко Н.Ф. и др.,1995; Biais В W. и др.,1997; Тюменцева И.С. и др., 2003).

Традиционные микробиологические методы: микроскопия мазков и культуральное исследование даже центрифугированных образцов малоэффективны. Экспрессные системы культивирования, в которых используются жидкие питательные среды с радиометрической или флуоресцентной регистрацией результатов, позволяют определить рост бактерий, как правило, в течение 2-х дней. К тому же после регистрации положительного результата бактериального роста требуется еще 5-6 дней для идентификации таксономической принадлежности и молекулярно-биологической характеристики изолировапной культуры.

В последнее время внимание широкого круга специалистов привлекают

различные экспресс-методы индикации патогенных микроорганизмов как в

биологических пробах, объектах окружающей среды, так и в питьевой воде и

пищевых продуктах. В этом плане интерес представляет биолюминесцентный метод

индикации аденозинтрифосфата микробных клеток (биолюминесцентная АТФ-

метрия), в основе которого лежит взаимодействие АТФ, люциферазы и люциферина,

сопровождающееся выделением энергии в виде излучения фотона При этом время

анализа значительно сокращается по сравнению с рутинными методами, а высокая

его чувствительность позволяет определить 500-1000 микробных клеток в 1 мл

образца (Угарова H.H., Фрунджян В.Г., 2003; Кузиков А.Н. и др., 2003). Однако

биолюминеодедпщй, метод АТФ-метрии неспецифичен, так как и соматические ï • » .• ; •»»■• > <- *

; -». -«?f fv

' Г <* к * ь . -

клетки макроорганизма и микробные клетки сапрофитов и патогенов содержат АТФ В связи с указанным, актуальной является разработка экспресс-метода индикации возбудителя после специфической иммуносорбции микробных клеток

Цель работы - разработка комплексного экспресс-метода индикации Shigella sonnei I фазы в исследуемом материале на основе предварительной иммуномагнитной сепарации с последующим выявлением жизнеспособных клеток возбудителя с помощью биолюминесцентного метода определения бактериального аденозиетрифосфата (АТФ-мегрии).

Задачи исследования:

1. Разработать эффективный иммуномагнитный биосорбснт (ИМБС) с фиксированным на его поверхности специфическим у-глобулином против микробных клеток S.sonnei I фазы.

2. Отработать методику иммуномагнитной сепарации S.sonnei I фазы из образцов, содержащих смесь бактерий различных таксономических групп, и оценить чувствительность и специфичность метода.

3. Применить сочетанный способ иммуномагнитной сепарации для индикации микробных клеток S.sonnei I фазы путем измерения количества бактериального аденозинтрифосфата методом биолюминесцентной АТФ-метрии.

Научная новизна и практическая значимость работы.

- Впервые на модели дизентерийных бактерий показана принципиальная возможность использования ферромагнитных носителей, состоящих на 85% из железа, 10% оксида кремния и 5% оксида титана, для иммобилизации на композитных частицах специфического у-глобулина к S. sonnei I фазы. Примененная методика металлохелатного связывания белков сохраняет специфическую активность у-глобулинов, обеспечивая их прочную фиксацию.

Разработана технология обнаружения S.sonnei I фазы после предварительной концентрации микробпых клеток в исследуемом материале с помощью иммуномагнитного биосорбепта с последующим обнаружением возбудителя путем биолюминесцентной АТФ-метрии. Специфичность связывания биосорбентом клеток S.sonnei подтверждена в ГГЦР с праймерами, выявляющими последовательности плазмидного ipaH гена шигелл, контролирующего инвазию возбудителя.

- Иммуномагнитная сепарация в сочетании с биолюминесцентной АТФ-метрией позволяет обнаружить жизнеспособные микробные клетки в образце, содержащем 1000-1500 бактериальных тел в 1 мл, в то время как с помощью ПЦР выявляется ДНК как живых, так и нежизнеспособных клеток возбудителя.

Показана перспективность применения диметилсульфоксида для высвобождения АТФ из комплексов "ИМБС - бактерии".

Комплекспый подход, основанный на иммуносорбции S.sonnei I фазы с последующим проведением АТФ-метрии, позволяет увеличить производительность диагностического лабораторного анализа за счет сокращения времени его проведения. Разработанный экспресс-метод индикации может быть использован для определения микробных клеток возбудителя в клиническом материале, в образцах молока, молочно-кислых и других продуктах, а также в тест- пробах различных объектов окружающей среды и будет полезен при разработке аналогичного метода обнаружения других патогенных микроорганизмов.

Апробация работы: материалы диссертации были представлены на Московском обществе Эпидемиологов, Микробиологов и Паразитологов (21 февраля, 2003), ХП Международной конференции "Новые технологии в биологии и медицине" (Гурзуф,2004), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных болезней" (Москва, 19-21 октября 2004). Апробация диссертации состоялась на конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 16 марта 2005 г.

Материалы и методы.

Характеристика штаммов. В работе использованы эталонные штаммы 4-х видов шигелл: S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii и S.sonnei из музея лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН и свежевыделенные штаммы S.sonnei. Специфичность метода оценена при использовании коллекции различных видов патогенных энтеробактерий, включая изогепные штаммы S. sonnei I фазы 941 vir и авирулентный вариант S.sonnei NR-18, несущий плазмиду 120 MD с интегрированным транспозоном Тп5, обладающим маркером Km' При высеве бактерий на чашки с МПА, содержащим капамицип (50 мкг/мл), прорастают только колонии шигелл в 100% случаев синтезирующие антиген I фазы. Дополнительно использовали изогенные штаммы S.dysenteriae 1 SC500 inv* tox* SC501 inv* tox", SC502 inv" tox* и SC503 inv tox'; а также штаммы

S. flexneri ser 1-6, S. boydii 234, S. typhimurium 415; E. coli EDL 0157:H7 eae', stxl, stx2; E. coli 0124; E.coli H-10407 LT; трансдуктант E.coli K12 J62 аЗ,4 (приобретший группоспецифичесий фактор 3.4 S.flexneri); K.pneumoniae 5054; E aerogenes 3/43; H alvei a-773; S. marcescens 20-10; S. liquefaciens 14460 и P.aeruginosa PA-4 и др. При оценке разработанных диагностических тест-систем было использовано 59 диких штаммов S.sormei, в том числе 6 - любезно переданных проф. D.Agilar (Лабораторно-диагностический центр кишечных инфекций, Гвадалахара, Мексика), 10 - проф. Wu Gang (Уханский университет, КНР) и 23 - из баклаборатории Центра иммунодефицитных состояний и оппортунистических инфекций ЮАО г.Москвы (зав. Миткова C.B.) и 20 штаммов, изолированных во время вспышки ОКИ. Использованные в работе штаммы указаны в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Характеристика штаммов, использованных __в работе__

Род, вид Штамм* Происхождение

Shigella sonnei* 9411 фазы шу+ 9411 фазы N11-18 ¡пу" 941II фазы ту" 941 И форма 478 I фазы шу+ НИИЭМ им. Гамалеи

Shigella boydii 234 ту+ Юх+ НИИЭМ им. Гамалеи

Shigella dysenteriae 1 ЭС 500 шу+ и>х+ БС 501 Шх" ЭС 502 ту" Юх+ БС 503шу'Ш" ЯС 500 ШУ+ Юх" Институт Пастера, Париж

E.coli K-12 J62 a3,4+ Ыз+трансдуктант, приобретший антиген 3,4 в.Аехпеп НИИЭМ им. Гамалеи

Salmonella typhimurium 415 У1Г НИИВС им. Мечникова

EIEC 0124 348 шу+ НИИЭМ им. Гамалеи

ETEC 078:H11 Н-10407 ЬТ ЭТЪ НИИЭМ им. Гамалеи

EHEC 0157:H7 ЕЭЬ933 81x1 Э1х2 Институт вакцин и сывороток, Берн, Швейцария

Klebsiella pneumoniae 5054 К1 У1г НИИЭМ им. Гамалеи

Enterobacter aerogenes 3/43 ГИСК им. Тарасевича

Hafnia alvei а-773 ГИСК им. Тарасевича

Citrobacter freundii 377 НИИЭМ им. Гамалеи

Proteus mirabilis 260 НИИЭМ им. Гамалеи

Pseudomonas aeruginosa PA-4 НИИЭМ им. Гамалеи

Serratia marcescens 20-10 НИИЭМ им. Гамалеи

Serratia liquefaciens 14460 ГИСК им. Тарасевича

Staphylococcus aureus 209P НИИЭМ им. Гамалеи

* Дополнительно использовано 59 диких штаммов Я.яопгим, изолированных в г.г. Москве (23), Кропоткине (20), Мексике (6), КНР (10).

Таблица 2. Штаммы Shigella flexneri, использованные в работе

Вид Серовар № штамма и

антигенная формула

1 1298 1а (1:3,4)

1338 lb (1:3,4:6)

2 516 2а (И: 3,4)

1404 2b (II: 7,8)

3 1575 За Ш: 6:7 (8)

S.flexneri 717 ЗЬ III: (3,4):6

4 1354 4а IV: (3)4

5243 4b IV: 0) 4:6

5 233 5а V: 3,4

186 5b V:7,8

6 194 VI: -

"х" var 1592 - :7,8

"у" var 433 -:3,4

Выделение фракции у-глобулинов. Иммуноглобулипы выделяли из коммерческих агглютинирующих сывороток к З.эоппЫ I фазы (Санкт-Петербург) и лабораторной монорецепторной кроличьей сыворотки. Для иммунизации кроликов использованы бактерии штамма 8.зоппе1 N11-18, полученного в лаборатории генетики вирулентности бактерий Ю.М.Романовой. Фракцию у-глобулинов выделяли из лиофильно высушенной сыворотки, которую предварительно растворяли до прежнего уровня и добавляли по каплям 0.3% раствор риванола в колбе, помещенной на магнитную мешалку (40 мл сыворотки на 200 мл раствора риванола при постоянном перемешивании). Через 1 час суспензию помещали в холодильник и хранили при 5-8°С в течение ночи. Сформировавшийся осадок альбумина отделяли центрифугированием (3000 об/мин) и к супернатанту добавляли КаС1 (4 г) для удаления большей части риванола. Эту суспензию фильтровали и к полученному фильтрату добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 30%. Суспензию хранили в течение ночи в холодильнике и затем сформировавшийся

осадок у-глобулина осаждали центрифугированием (10 ООО об/мин в течение 20 мин). Преципитат растворяли в натрий-калий фосфатном буфере, рН 8.3 и полученный раствор пропускали через колонку с Сефадексом С-25 (2 х 50 см). Конечный раствор у-глобулина в объеме 20 мл содержал 6-7 мг белка/мл.

Постановка ПЦР. Праймеры, детектирующие наличие последовательностей генов патогенности шигелл, указаны в табл.3.

Таблица.З. Праймеры, использованные в работе

Ген Пары праймеров Т° отжига Размер Ампликона (п.н.) Эталонный штамм*

¿раН 5^<ОД>ааааас№а(>1§с<Я-3 5 -сса^сс^аааКсайй-З 55 424 З.воппе! I фазы 941 Б.аузайепае 1 вС 500

5-gaagagtccgtgggattacg-3 5-agcgatgcagctattaalaa-3 56 130 Е.соН ЕБЬ0157:Н7

5-ttaaccacacccaccggcag-3 5-gctctggatgcatctctggt-3 56 346 Е.соН ЕРЬ 0157:Н7

*В качестве отрицательного контроля использовали штаммы Е.соН НВ101 и Е.соН К-12 :б2 аЗ,4

Амплификацию проводили при использовании 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 10 ц1 пробы (прогретой при 94°С 10 мин для разрушения клеток и высвобождения ДНК), 0,1 мМ каждого из 4-х дезоксинуклеотидов, 0,45 ц1 каждого из праймеров, 1,5 и/ц! Тац нолимеразы. В стандартную реакционную смесь добавляли по 1 ед урацил-ДНК-гликозилазы для инактивации возможной контаминации ампликонами. ПЦР проводили по следующему протоколу: денатурация при 94°С - 4 мин с последующими 30 циклами денатурации при 94 °С 40 с, отжиг при 53 °С 40 с, полимеризация при 72°С 40 с, элонгация при 72°С 5 мин на термоциклере МС-2 («ДНК-технология», Россия). Продукты амплификации (20 мкл) анализировали электрофоретически в горизонтальном 1,6% агарозном геле в трис-боратном буфере при 120 V 40 мин. Продукты амплификации ДНК окрашивали бромидом этидия и визуализировали на трансиллюминаторе «Флуоскоп-2» («Биоком», Россия). В качестве маркеров-метчиков использовали 123 пн - лестницу

(«Рготе§а»,США) с наличием отрицательного контроля и оценкой реакции по подвижности положительного контроля.

Получение иммуномагнитного биосорбента (ИМБС). С целью предварительного обогащения (концентрации) клеток возбудителя в исследуемом материале нами была отработана система иммуномагнитной биосорбции (сепарации) Я.яоппе1 I фазы. Для приготовления иммуномагнитного сорбента применили магнитные феррочастицы размером 2-5 мкм, покрытые оксидом кремния (БЮг) и оксидом титана (Т1О2), связанные со специфическим у-глобулином, выделенным как из коммерческих сывороток, так и из иммунной кроличьей сыворотки к штамму в яоппе! N11-18 I фазы. Специфический у-глобулин фиксировали на поверхности феррочастиц посредстваом металлохелатной связи Включение в состав феррочастиц ^¡Ог обеспечивало высокую удельную загрузку сорбента у-глобулином, а ТЮ2 -прочную и стабильную фиксацию антител. Раствор у-глобулина смешивали с раствором комиозигного порошка и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. По истечении указанного времени удаляли из раствора неконъюгированные антитела с помощью щадящего центрифугирования. Как правило, достигалась фиксация 80 мг у-глобулинов на 1 г носителя В полученный раствор иммуномагнитного сорбента добавляли азид натрия (0,02%) и бычий сывороточный альбумин (0,2%) Препарат хранили при температуре +4°С не более 6 месяцев.

Результаты

1. Проведение иммуномагнитной сепарации шигелл. При разработке композиционного иммуномагнитного сорбента, необходимого для сепарации (концентрации) 8.зогщс1 из исследуемого материала, использована матрица, предложенная Филипповым В.И. с соавт.(1999г.). Работа с иммуномагнитными сорбентами проведена на магнитном сепараторе фирмы Е)упа1 (Норвегия).

Исследования иммуномагнитных антител (ИМА), проведенные на штаммах 12 видов бактерий семейства ЕШегоЬаЛепасеае, продемонстрировали их специфичность в отношении Б-вопле! I фазы. Далее ИМА были использованы в экспериментах по концентрации целевых микробных клеток, извлекаемых из образцов Прежде всего, было изучено влияние концентрации иммуномагнитных частиц на уровень сорбции микробных клеток из образцов и специфичность иммуносорбции при использовании набора эталонных штаммов, указанных в разделе "Материалы и методы". Для этого в 1 мл бактериальной суспензии вносили 0,02 мл (5%) или 0,1 мл (10%)

10

иммуномагнитных частиц, помещали на Sample Mixer (Dynal, Норвегия) и интенсивно перемешивали при 40 грш в течение различного периода времени. При инкубации на ротомиксе иммуномагнитные частицы связывали целевые микробные клетки с образованием комплексов "ИМБС - бактерии". Эти комплексы собирали на стенке пробирок Эппендорф с помощью магнитных концентраторов фирмы Dynal (Норвегия) MPC-S (для малых объемов) или MPC-L (для больших объемов) Комплексы "ИМБС-бактерии" ресуспендировали в 10 мл буферного раствора Магнитную сепарацию и отмывание незахваченных ИМБС бактерий повторяли трижды. После окончания промывки комплексы ресуспендировали в 1 мл буферного раствора и переносили в пробирку Эппендорф. После магнитной сепарации в MPC-S буферный раствор извлекали и к осадку добавляли 0,5 мл ДМСО для разрушения бактериальных комплексов с последующим освобождением проб от феррочастиц. На этой стадии АТФ, высвобожденный из бактериальных клеток с помощью ДМСО, сохранялся в жидкой фазе, которую переносили в кювету люминометра (0,02 мл).

Ори оценке характеристики полученного ИМБС в качестве контроля использовали коммерческий магнитный иммуносорбент "Anti-Salmonella Dynabeads", содержащий однородные магнитные полистироловые микроскопические частицы, с поверхностью которых ковалентно связаны антитела к наиболее часто встречающимся серогруппам сальмонелл Биомагнитную сепарацию сальмонелл осуществляли согласно инструкции фирмы-производителя.

2.Биолюминесцеитная АТФ-метрия. Детекцию жизнеспособных клеток S.sonnei в пробах, обогащенных с помощью иммуномагнитных сорбентов, проводили с помощью биолюминесцентной АТФ-метрии на люминометре.

При осуществлении биолюминесцентной АТФ-метрии в начале исследований рассчитывали калибровочную прямую путем измерения уровня биолюминесцентного сигнала приготовленных разведений стандартного АТФ в ДМСО (рис.1).

В качестве АТФ-реагента использовали люциферин-люциферазный реагент (ЛЛ-реагент), дополнительно содержащий соль магния и компоненты буфера (Химфак МГУ им. М.В.Ломоносова); АТФ (ICN, США); лизирующий агент -диметилсульфоксид (ДМСО) («Реахим», Россия), деионизованную воду, полученную на установке Milli-Q («Millipore», Франция). Калибровку по стандартным растворам АТФ проводили с помощью ЛЛ-реагепта на микролюминометре 3550i фирмы «New Horizons Diagnostic» (NHD, США). Для этого

лиофилизованный ЛЛ-реагент реконструировали деионизованной водой и инкубировали 40-60 мин при комнатной температуре перед использованием. Замороженный и хранившийся при -70°С раствор АТФ с концентрацией 10"6 моль/мл в деионизованной воде (0,5 мл) размораживали и разбавляли до концентрации 10"1О-Ю"7 моль/мл свежеперегнанным ОМБО.

Igl.RLU

Рис.1. Калибровка стандартного АТФ. По оси абсцисс - lg уровня биолюминесцентно! о сигнала в относительных люминесцентных единицах; по оси ординат - lg уровня АТФ (моль).

При проведении измерений в кювету Filtravette™ (NHD,CIILA) вносили 0,18 мл АТР-реагента и 0,02 мл пробы, помещали ее юоветное отделение люминометра и регистрировали фоновый сигнал (f,/,„»), как правило, не превышающий 8-12 RLU (Relative Light Unit). Затем в ту же кювету вносили 0,02 мл полученного стандартного раствора АТР с концентрацией 10"7-10*'° моль, быстро перемешивали реакционную смесь, трижды прокачивая жидкость через наконечник дозатора, и регистрировали биолюминесцентный сигнал (/«и) с помощью люминометра

Для приготовленных стандартных растворов АТФ в ДМСО получали градуировочную зависимость по уравнению: Ig(hest) =<» + «• lg[ATP] (моль)[1 J. Полученные значения содержания АТФ использовали в дальнейшем для расчета концентрации АТФ в анализируемых пробах. При определении количества

бактериальной ЛТФ, специальные кюветы (Filtravette™), на мембранах которых находились предварительно осажденные бактериальные клетки, помещали в иоветное отделепие люминометра и последовательно вносили 0,02 мл ДМСО и 0,18 мл ЛЛ-реагента, быстро перемешивали реакционную смесь, трижды прокачивая жидкость через наконечник дозатора, и регистрировали биолюминесцентный си тал ({образца)- Как указано выше, при проведении измерений в начале регистрировали фоновый сигнал, затем регистрировали биолюминесцентный сигнал пробы (1,гя), вычитая из него значения фона (1обртца - 1<рои = hen)- Расчет в образце количества АТФ, содержащегося в кювете, проводили по формулам [2 и 3], представляющих собой инверсную форму уравнения [1] в виде:

WATP, моль/кювета] =А +В lg(IleH) [2],

или [A TP, моль/кювета] = and IgfA +В lg(Itea)} = 10е [3], где: С = А+В lg(I*J[3J.

3. Характеристика препарата иммуномагнитного биосорбепта (ИМБС).

Полученные ИМБС тестировали на способность концентрировать клетки S.sonnei NR-18 в зависимости от времени его хранения. Тестирование проводили по следующей методике. В пластиковые конические пробирки обьемом 10 мл вносили суспензию клеток S.sonnei NR-18 с концентрацией 104 - 102 КОЕ/мл, В каждую пробирку добавляли по 50 мкл ИМБС. Пробирку помещали на ротатор и проводили инкубацию 30 мин при комнатной температуре. Бактериальные клетки, конъюгированные с иммунобиосорбентом, концентрировали в магнитном поле в специальном магнитном штативе. Результаты анализа с использованием свежеприготовленного ИМБС и со сроком хранения 3-6-9и 12 месяцев показали, что препарат сохраняет свои свойства в течение 6 месяцев. Исследования, проведенные с набором эталонных штаммов бактерий разных видов (см.табл.1), показали специфичность ИМБС в отношении бактерий Shigella sonnei I фазы.

Далее были отработаны условия проведения опытов при анализе величин КОЕ/мл в образцах и уровня биолюминесценшого сигнала при трех различных условиях измерения (рис.2).

Биолюминисцентный сигнал 1 -»- Биолюминисцентный

сигнал 2 —Биолюминисцентный сишалЗ

5,25 в,25

1д КОЕ/ж

Рис.2. Зависимость между количеством КОЕ/мл в образцах и величиной биолюмянесцеитного сигнала.

По оси абсцисс - ^ КОЕ/ мл; по оси ординат -уровня биолюминесцетного сигнала в ЯШ/кювету. Биолюминсцентный сигнал (1) - 0,19 мл ЛЛ-реагента + 0,01 мл тест-пробы, (2) - 0,09 мл ЛЛ-реагснта + 0,01 мл тест-пробы, 3- 0,18 мл ЛЛ-рсагента + 0,02 мл тест-пробы в ДМСО.

Как видно из данных рис. 2, оптимальным уровнем измерения является

соотношение (3) - 0,18 мл ЛЛ-реагента + 0,02 мл тест-пробы в ДМСО.

В последующих экспериментах при определении показателя оптической плотности бактериальной культуры (ОПззд) с помощью фотоэлектроколориметра (КФК-2МП, Россия) была подтверждена способность ДМСО разрушать клетки бактерий различных таксономических групп (табл.2). 16-18 часовые культуры отмывали от питательной среды путем трехкратного центрифугирования в физрастворе, затем концентрированную аликвоту разбавляли до значения ОД590, равного приблизительно 0,6. К аналогичной аликвоте добавляли ДМСО и затем равный объем физраствора (опыт) или двойной объем физраствора (контроль).

Этапы проведения иммуномагнитной сепарации шигслл с последующей биолюминесцентной АТФ-метрией указаны на схеме.

Схема проведения иммуномагнитной сепарации шигелл с последующей АТФ-метрией

Проба с разведенной суспензией бактерий и определением КОЕ/мл высевом на чашки с агаром

Внесение в 1 мл каждой пробы по 0,02 мл иммуномагнигных антител

i

Ротация на Sample Mixer (Dynal, NY) 20 мин при комнатной температуре

4

Иммуномагнитная сепарация на концентраторе MPC-S (Dynal, NY)

I

Промывка в буферном растворе с Twccn-20

I

Внесение 0,5 мл ДМСО

I

Внесение 0,18 мл Внесение 0,02 мл Расчет

ЛЛ-реагента и комплекса концентрации

измерение RLU фона ИМБС-бактерии, АТФ

измерение RLU

_4-_

Подсчет КОЕ/мл бактериальной суспензии до и после иммуномагнитной _сепарации (концентрации)_

_Учет и анализ результатов_

Таблица 4. Показатели литической активности ДМСО в отношении бактерий (0059о) различных видов

Штамм Показатели OD590 после добавления к бактериальной взвеси

Физиол.р-ра (контроль) ДМСО

S.dysenteriae 1 0,297 0,033

S.flexneri 2а 516 0,281 0,029

S.boydii 234 0,301 0,032

S.sonnei 1941vir 0,289 0,030

S.sonnei NR-18avir 0,298 0,026

E.coli 0157:H7 0,291 0,024

E.coli 0124 414 0,299 0,023

E.coli 0164 586 0,290 0,032

E.coli K12 J62 a3,4 0,285 0,029

K.pneumoniae5054 0,286 0,026

E.cloacae 1248 0,288 0,027

E.aerogenes 3/43 0,298 0,034

H.alvei a-773 0,294 0,033

S.marcescens 20-10 0,296 0,028

P.aeruginosa PA-4 0,294 0,024

4. Оценка специфического связывания ИМС S.sonnei, определяемый с помощью АТФ-метрии и подсчетом КОЕ/мл.

Для проведения опытов по иммунному связыванию готовили 10-кратные разведения ночной культуры в буферном растворе Из приготовленных серийных разведений были сделаны высевы на чашки с целью определения количества жизнеспособных бактерий в образце. В опытах использовали две различные серии ИМБС: (1) с концентрацией частиц 108/мл и (2) 109/мл. Иммуномагнитные часгицы суспендировали и встряхивали на вортексе. 0,02 мл (5% объемных) частиц 1-ой серии или 0,1 мл 2-ой серии (10% объемных) вносили в 1 мл каждой пробы бактериальной суспензии. Комплексы "ИМБС-бактерии" через различные промежутки времени сорбции (в диалозоне от 5 до 120 мин) при комнатной температуре в условиях ротации на миксере при скорости 40 об/мин, собирали с помощью соответствующего концентратора (MPC-S или MPC-L) из пробирок разных объемов (0,5-2 мл или 10-15 мл соответственно) в зависимости от объема пробы (1 или 15 мл). Суперна! анты каждой пробы удаляли, собранные комплексы отмывали путем ресуспендирования в буферном р-ре. Серийные разведения собранных комплексов "ИМБС-бактерии" в осадке и суперпатанты проб (не связанные частицами бактерии) использовали для определения КОЕ/мл. Подсчет вели из высевов 0,1 мл на чашках с МПА. Эффект связывания бактериальных клеток шигелл получепным нами ИМБС сравпивали с эффективностью связывания клеток сальмонелл коммерческими Anti-Salmonella Dynabeads согласно инструкции фирмы производителя (Dynal, Норвегия). Разрушение комплексов "ИМБС-S.sonnei" с помощью ДМСО и определение количества бактериального АТФ. В кювету (Filtravette™) с комплексом "ИМБС -бактерии" (0,02 мл), вносили ДМСО, добавляли 0,18 мл ЛЛ-реагента, кювету помещали в люминометр и измеряли уровень сигнала. Биолюминесцентпый сигнал определяли как в пробах осадка, содержащего захваченные бактерии, так и надосадка (оставшиеся несвязанные бактерии). Проводили сравнение уровня АТФ, высвобождаемого из бактериальной суспензии шигелл, до проведения иммуномагнитной сепарации и после. Влияние на уровень биолюминссцснтного сигнала внесения ИМБС и возраста микробных клеток. Серийные разведения ночной культуры S.sonnei готовили на основе буферного р-ра и замеряли уровень биолюминесцентного сигнала АТФ. Была подтверждена установленная ранее прямая зависимость уровня биолюминесцентного сигнала от количества жизнеспособных клеток S.sonnei и отсутствие влияния ИМБС на индекс бактериального АТФ (рис.3). Необходимо отметить, что значения RLU на ординате указаны из расчета 0,02 мл на кювету и для перерасчета па 1 мл их необходимо умножить на 50.

1д СРи/т1

Рис.3. Отсутствие ингибирующего действия ИМБС па жизнеспособность клеток

в-зоппет 9411 фазы.

По оси абсцисс — ^ КОЕ/мл без внесения ИМБС; по оси ординат - [ц биолюминесцентиого сигнала (ИШ/юовета в присутствии ИМБС.

Получешше данные показывают, что при концентрации бактерий 100-300 млн в 1 мл добавление ИМБС с последующим расчетом КОЕ в комплексе "ИМБС-бактерии" соответствует отношению 1:10, в тоже время при низкой концентрации 1500 - 3000 микробных клеток в 1 мл соотношение снижается до 1:1.

Для изучения влияния времени хранения бактерий на уровень АТФ суспензию суточной культуры З.БОппе! 941 I фазы помещали в рефрижератор при 4°С на 4 суток, уровень ЛТФ, измеряемого биолюминесцентным методом, определяли из вновь пригошвленных серийных разведений.

Показано, что содержание АТФ значительно снижается при увеличении срока храпения бактериалъпой суспензии' средний уровень биолюминесцентного сигнала для 16-18 час (суточных) микробных культур был 3760±520 КШ (разведение Ю"6 = примерно 2-ЗхЮ4 КОЕ/мл), для 2-х дневных биолюминесцентный сигнал был ниже и составлял 22601120 ЯШ на 104 клеток, для 3-х дневных клеток 1100±70 RI.II и для 4-х дневных клеток только 360±50 ЯШ. Сравнительная интенсивность связывания шигелл ИМБС исследована при использовании концентрации 16 ч культур Э.яоппе! 941 У1Г и Б.воппе! КЯ-18 из разведения 10"6. Концентрации бактериальных суспензий 6-ти разведений, определяемые чашечным

методом, позволяли контролировать количество клеток, соответствующее 106 - 103 КОЕ/мл.

К каждому разведению клеток добавляли ИМБС и оставляли на 2 часа при комнатной температуре в условиях интенсивного перемешивания. После сорбции эффект специфического связывания оценивали при тестировании 1 мл каждого разведепия осадка и супернатанта пух ем учета КОЕ/мл. Чашки с агаром инкубировали при 37°С в течение 18 часов. Подсчитывали колонии, выросшие из разведений до и после внесения ИМБС. Результаты определения количества клеток 8.зоппе11 фазы (КОЕ/мл), адсорбированных на иммуномагнитных антителах, и количества клеток в растворе без ИМБС (объем пробы 1 мл; объем суспензии ИМБС - 0,02 мл (2 х 106 частиц) приведены на рис.4.. Как видно из данных рис.4, существенных различий в показателях КОЕ/мл, определяемых при высеве исходной бактериальной суспензии и комплекса "ИМБС - бактерии", практически не наблюдалось.

Далее были проведены исследования по количеству шигелл, захваченных ИМБС, рассчитываемых прем подсчета КОЕ/мл. Была выявлена прямая корреляция между концентрацией микробных клеток, захваченных ИМБС, и количеством КОЕ/мл. Удавалось сорбировать до 80% клеток 8 зоппе! I фазы из бактериальной суспензии, содержащей 3x103 КОЕ/мл Уровень сорбции бактерий снижался до 60%, если ИМБС вносили в суспепзию с концентрацией 104 и до 40% с концентрацией 105 КОЕ/мл, что возможно связано с увеличением соотношения микробных клеток к ИМБС. Влияние времени инкубации на сорбцию ИМБС клеток в.воппе! 941 Т фазы. Влияние времени инкубации на сорбцию шигелл ИМБС исследовано путем подсчета количества захваченных бактерий из суспензии 1 х106 КОЕ/мл из 1 мл суспензии клеток, ресуспендированных в буферном растворе (соотношение частиц ИМБС к бактериям 100:1) Процент захваченных ИМЬС клеток в течение разных промежутков времени (2040-60-80-100-120 мин) в 1 мл образца определяли с помощью метода биолюминесцентной АТФ-метрии. Процент захваченных клеток достигал 30% в течение 20 мин, увеличивался до 60% через 30 мин и достигал 75-80% через 100-120 мин экспозиции при комнатной температуре.

Эффект температуры и обогащения глюкозой. Иммуномагнитная сепарация была проведена при комнатной температуре (18-19°С) и 37°С. Существенных различий в показателях И XI, рассчитанных для иммуносорбции, происходящей при комнатной температуре и 37°С, выявить не удалось. Следующая серия экспериментов была проведена при использовании суспензии бактерий, ресуспендированных в буферном растворе, обогащенном глюкозой(0,2; 0,5 и 1,0%). В каждое разведение бактериальной

суспензии (1 мл) смешивали с 0,02 мл ИМБС и инкубировали при разных температурах в течение 0.5, 10, 1.5, 2 0 и 3 0 ч при интенсивном встряхивании. Показатели уровпя биолюминесцентного сигнала, пропорционального количеству высвобождаемого бактериального АТФ, было в 1,5-2 раза выше у клеток шигелл, ресуспендированных в растворе с 1% глюкозой.

Эффект объема пробы, из которой извлекаются ИМБС клетки S.sonnei 941 I фазы. В этом эксперименте об уровне сорбции шигелл из 1-мл и 15-мл объемов бактериальной суспензии судили на основании величины биолюминесцентного сигнала захваченных клеток. Были приготовлены серийное разведение суспензии S.sonnei на буферном р-ре. ИМБС в объеме 0,02 мл были добавлены в 1 мл каждого разведения. После 2 ч экспозиции при комнатной температуре при интенсивном перемешивании из пробы извлекали комплексы "ИМБС-бактерии" с помощью магнитной сепарации, их промывали и добавляли ДМСО. После внесения ЛЛ-реагента измеряли уровень АТФ. Использование 15-мл объема не повысило чувствительность метода. Более того, извлечение микробных клеток из 15-мл объема происходило значительно медленнее (рис.4).

Сорбция S.sonnei I фазы из смешанной бактериальной суспензии с помощью ИМБС. Исследования проведены в трех аранжировках: (1) на 2-компопетной смеси бактерий, содержащей и S.sonnei NR-18 (I фазы) и E.coli К-12 J62 аЗ,4 в соотношении 1:1, (2) - на 3-компонентной смеси, содержащей S. sonnei NR-18, E.coli К-12 J62 аЗ,4 и Staphylococcus aureus 209Р в соотношении 1:1:1, и (3) - содержащей S. sonnei NR-18, E.coli К-12 J62 аЗ,4, Staphylococcus aureus и Salmonella typhimurium 415/18 r соотношении 1:1:1:1. Контрольное содержание АТФ, высвобождаемого с помощью ДМСО из бактериальной суспензии каждой монокультуры, приведено в табл.5.

Рис.4. Соотношение между уровнем биолюминесцентного сигнала и количеством захваченных ИМБС из различного объема проб клеток З.зоппеь По оси абсцисс - ]$ КОЕ/мл, по оси ординат - АТФ в ЯШ, объем пробы- (и-1)-1 мл и («-2) - 15 мл.

Таблица 5. Количество АТФ, высвобождаемого с помощью ДМСО из клеток монокультуры.

Суспензия Объем Биолюминесцетный

бактерий образца сигнал

RLU/юовета)

Shigella sonnei NR-18(I фазы) 0,02 ml 1890+ 120

Escherichia coli K-12 J62 аЗ,4 0,02 ml 1620±110

Salmonella typhimurium 415/18 0,02 ml 1690+ 115

Staphylococcus aureus 209P 0,02 ml 1080±150

В табл. 6, 7 и 8 приведены данные по количеству АТФ, высвобождаемого из комплексов "ИМА - бактерии" из 2-х, 3-х и 4-х компонентной бактериальной суспензии.

Табл. 6. Количество АТФ, высвобождаемого с помощью ДМСО из комплексов "ИМБС - бактерии", извлеченных из 2-х компонентной смеси (в.яоппеН- Е.соН)

Серия ИМБС Объем пробы и соотношение бактерий разных видов в смеси Биолюминесцентный сигнал (I, RLU/кювета)

№ 1 (концентрация 108 частиц/мл) 0,02 ш1 (1:1) 905± 90

№2 (концентрация 109 частиц/мл) 0,02 т1 (11) 980± 85

* Смесь содержала 1 мл Я. зоппе! N11-18 + 1 мл Е.соН 06:К5 (разведение 1:100)

Табл. 7. Количество АТФ, высвобождаемого с помощью ДМСО из комплексов "ИМБС- бактерии" 3-х компонентной смеси (в.зоппа +Е.еоН + в.аигеш).

Серия ИМБС Объем пробы и соотношение бактерий разных видов в смеси* Биолюминесцентный сигнал (I,RLU/кювета)

№ 1 (концентрация 10* частиц/мл) 0,02т1 (1:1:1) 630 ± 65

№2(концентрация 10у частиц/мл) 0,02т1 (1:1:1) 690 ± 60

* Смесь содержала + 1 мл S.sonnei NR-18 +1 мл E.coli К-12.162 аЗ,4 +1 mji St aureus 209Р (разведение 1:100).

Табл.8. Количество АТФ, высвобождаемого с помощью ДМСО из комплексов "ИМБС- бактерии", извлеченных из 4-х компонентной смеси (S. sonnci + E.coli + S. aureus +S.typhimurium)

Серия ИМБС Объем пробы и соотношение бактерий разных видов в смеси* Биолюминесцентаы йсигнал (I,RLU/кювета)

№1 (концентрация 10* частиц/мл) 0,02 ш1 (1:1-1:1) 420±40

№2 (концентрация 10* частиц/мл) 0,02т1 (1:1:1:1) 430±45

* Смесь содержала по 1 мл каждого бактериального компонента (разведение 1:100).

Как видно из представленных в таблицах 6-8 данных, полученные ИМА способны извлекать из бактериальной смеси в основном в .чоппе! I фазы.

Подтверждение сорбции ИМБС клеток S.sonnei I фазы с помощью ПЦР.

В связи с тем, что с ИМБС мог сорбировать как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки шигелл интерес представляло использование ПЦР для детекции ДНК в комплексах "ИМБС-бактерии". Прежде всего, были проведены исследования по отработке ПЦР и выбору оптимальных праймеров, детектирующих ДНК S.sonnei I фазы, указанных в табл.3. При использовании 59 штаммов S.sonnei I фазы различного происхождения последовательности гена инвазии ipaH были обнаружены у 100% культур, в то время как оперон stxl был выявлен только у 24 (40,7%) культур, а нуклеотилные последовательности stx2 не выявляли вообще. В дальнейшем при проведении ПЦР использовали только праймеры, амплифицирующие последовательности ipaH гена. Для опытов готовили свежие суспензии клеток с концентрацией 105, 104, 103, 102 КОЕ/мл. Для каждой концентрации брали 3 пробирки. К 1 мл суспензии клеток добавляли 0,02 мл ИМБС. Пробирку помещали на миксер и проводили инкубацию в течение 2 ч при комнатной температуре. Клетки, захваченные ИМБС, концентрировали в магнитном поле, промывали, ресуспендировали в буферном р-ре и прогревали при 100° в течение 15 мин. Положительный результат обнаружения искомого ipaH гена (размер ампликона 424 н.н.) был получен при наличие в пробе 100-1000 клеток S.sonnei. Образцы, содержащие менее 100 клеток S.sonnei, и негативный контроль (прогретые при 100°С 15 мин суспензии клеток E.coli, S aureus и S typhimurium) при постанове ПЦР давали отрицательный результат. Положительные результаты были получены при тестировании комплексов "ИМБС - шигеллы", извлеченных из 4-х компонентной смеси клеток (S sonnei + Е coli + S.aureus +S.typhimurium), содержащей не менее 500-1000 КОЕ/мл шигелл. При расчете КОЕ и АТФ-метрии выявляются только жизнеспособные микробные клетки. При работе с чистыми прогретыми культурами шигелл положительный результат ПЦР регистрировали в случае наличия в образце 103 микробных тел.

Ложно-отрицательные и ложно-положительные результаты.

Иммуномагнитный диагностикум может давать ложноотрицательные результаты в 4-5% случаев в зависимости от уровня инокуляции, антигенных перекрестов, количества фоновой флоры и наличия в диагностикуме блокеров (бычьего сывороточного альбумина и декстрана лейконостка), снижающих уровень неспецифической сорбции) В том же образце при исследовании бактериологическим методом на селективных средах уровень ложноотрицательных результатов составляет 10-15%. Следовательно, использование ИМД снижает количество ложноотрицательных результатов по сравнению с бактериологическим. Ложноположительные результаты можно избежать при последущем проведении подтверждающего бактериологического анализа.

Специфичность и чувствительность.

ИМД позволяет определить наличие или отсутствие одной жизнеспособной клетки шигелл Зонне в 25 мл кисло-молочного продукта при условии, что эта одна клетка способна к росту и размножению при внесении материала в жидкую питательную среду и не ингибируется конкурентно резидентной фоновой флорой. ИМД позволяют обнаружить видимый рост колоний на чашке со средой из аликвоты предварительно обогащенного образца содержащего 102 целевых клеток при наличии большого количества фоновой флоры (104 - 105 клеток на мл). ИМД значительно концентрируют микроорганизмы, содержащиеся в смешанной культуре. Начальное соотношение шигелл Зонне и конкурирующей кишечной флоры 1:20 снижается до 1:2 и более, позитивная концентрация при этом составляет 15-20 раз. Имеющийся уровень неспецифического связывания не влияет на общую способность ИМД связывать микробные клетки шигелл Зонне I фазы.

Точность и воспроизводимость.

Воспроизводимость метода дискутабельна, так как иммуномагнитное выделение является качественным, а не количественным методом. К одной частице ИМД может присоединиться несколько бактерий, но они дадут начало голько одной колонии на агаризованной питательной срсдс. Точность метода зависит от степени извлечения частиц из различных образцов.

Таким образом, в процессе исследований разработана методика иммуномагнитной сепарации и показано, что при использовании металлохелатного связывания очищенных у-глобулинов сохраняется специфическая активность антител и обеспечивается их прочная фиксация. Продемонстрирована принципиальная возможность использования иммуномагнитного биосорбента с антителами к в вопле! I фазы, иммобилизованными на феррочастицах, для специфической сорбции шигелл. Специфичность сорбции шигелл Зонне показана при использовании в микробных клеток эталоппых штаммов 17 видов бактерий различных таксономических групп и пошверждена в ПЦР с праймерами, амплифицирующими последовательности гена инвазивности (¡раН). Использование АТФ-метрии позволяет определять в материале только жизнеспособные клетки возбудителя, в то время как ПЦР выявляет специфические последовательности ДНК возбудителя как инактивированных, так и жизнеспособных клеток, что выгодно отличает АТФ-метрию, выявляющей только живые микроорганизмы. Изучение влияния на иммуносорбцию температуры, обогащение проб глюкозой, времени сорбции и возраста бактериальных клеток на результаты биолюминесцентной АТФ-метрии позволили определить оптимальные условия для проведения иммуномагнитной сепарации с последующей

детекцией S sonnei I фазы биолюминесцентной АТФ-метрисй Иммуномагнитная сепарация не только концентрирует и ускоряет, но и обеспечивает специфичность метода обнаружения возбудителя при последующем использовании метода АТФ-метрии. Эксперименты на поликомпонентных бактериальных суспензиях при использовании иммуномагнитной сепарации позволили выявлять S.sonnei I фазы из проб, содержащих 500-1 ООО клеток в 1 мл, в то время как стандартная методика определения АТФ позволяла обнаруживать жизнеспособные клетки из микробной суспензии с концентрацией не менее 2-ЗхЮ4 КОЕ/мл.

ВЫВОДЫ

1. Разработан иммуномагнитный биосорбент, полученный на основе иммобилизованных у-глобулинов к S. sonnei I фазы на композитных феррочастицах размером 2-5 мкм, состоящих на 85% из железа, 10% оксида кремния и 5% оксида титана.

2 Для получения иммуномагнитного биосорбента использован металлохелатный способ связывания у-глобулинов, обеспечивающий фиксацию до 80 мг иммуноглобулинов на 1 г носителя. Использованная методика связывания иммуноглобулинов сохраняет специфическую активность антител и обеспечивает их прочную фиксацию. Срок хранения препарата до 6 месяцев.

3. Иммуномагнитный биосорбент позволяет сконцентрировать микробные клетки S.sonnei I фазы из образца, содержащего не менее 10-15 х 102 КОЕ в 1 мл, что в дальнейшем обеспечивает определение возбудителя в материале с помощью биолюминесцентой АТФ-метрии..

4. Использование диметилсульфоксида для извлечения бактериального АТФ из комплексов "иммуномапштпый биосорбент-бактерии" обеспечивает быстрое высвобождаемого аденозинтрифосфата и его стабильное сохранение в образце, что значительно ускоряет последующий этап АТФ-метрии.

5. Разработанная методика иммуномагнитной сепарации в сочетании с биолюминесцентной А'ГФ-метрией обеспечивает концентрацию целевых клеток в 15-20 раз и индикацию шигелл Зонне I фазы в смеси с другими видами бактерий в гечение 5-6 часов.

6.Специфичность связывания иммуномагнитным биосорбентом шигелл Зонне I фазы подтверждена в ПЦР с праймерами, амплифицирующими последовательности плазмидного ipaH гена, контролирующего инвазию возбудителя в эпителий кишечника.

Список опубликованных работ

1. Кузиков А.Н., Латкин А.Т., Бондаренко В.М. Применение биолюминесцентного метода определения бактериального аденозинтрифосфата (АТФ-метрии) в микробиологии.//Журн. микробиол.- 2003.- №1.-С. 80-89.

2 Мавзютов А.Р., Бондаренко В.М., Латкин А.Т. Ингибиторы полимеразной цепной реакции. //Журн. микробиол.- 2003.- № З.-С. 93-98.

3. Бондаренко В.М., Латкин А.Т. Адаптация метода 1'еноспецифической идентификации возбудителя к задачам бактериологического мониторинга.// Сборник трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского. Москва, 2000, часть 2.-С. 218-223.

4 Бондаренко В.М., Латкин А.Т. Экспресс-индикация с помощью ПЦР или АТФ-биолюминесценции пгагелл Зонне, сорбированных на иммуномагнитпых антителах.// Успехи современного естествознания. - 2004,6 (прилож.1).- С.146.

5. Бондаренко В.М., Латкин А.Т. Экспресс-индикация шигелл Зонне. Информационный бюллетень.// Здоровье населения и среда обитания,- 2004,- №4 -С.

6 Бондаренко В.М., Латкин А.Т., Фиалкина C.B. и др. Экспрссс-геноиндикация шигелл Зонне, сорбироваппых на магнитных антителах.// Сборник трудов "Генодиагностика инфекционных болезней". Москва, 2004.-Том 2.- С.6-8.

42-46

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ

ДМСО

КОЕ

ИМБС

RLU

ПЦР

ДНК

IpaH

Stx-1

Slx-2

F,НЕС

EIEC

ETEC

МД

Аденозинтрифосфат Диметилсульфоксид Колониеобразующая единица Иммуномагнитный биосорбепт

Related Luminescent Units (относительные люминесцентные единицы)

Полимеразная цепная реакция Дезоксирибонуклеиновая кислота Invasion plasmid antigen Shiga toxin-1 Shiga toxin-2

Энтерогеморрагические E.coli Эптероинвазивные E.coli Эшеротоксигенные E.coli Мега Дальтоны

»12697

РНБ Русский фонд

2006-4 9702

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Латкин, Александр Тимофеевич

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ 9 ШИГЕЛЛЕЗОВ

ГЛАВА 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА

ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ БАКТЕРИЙ В ОБРАЗЦАХ С ПОМОЩЬЮ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТФ

ГЛАВА 3. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ КАК 3? МЕТОД ГЕНОИНДИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 2. ИММУНОМАГНИТНАЯ СЕПАРАЦИЯ ШИГЕЛЛ

ГЛАВА 3. ЭФФЕКТ СПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ 64 ИМБС в.80ШЕ1, ОПРЕДЕЛЯЕМЫЙ С ПОМОЩЬЮ АТФ-МЕТРИИ И ПОДСЧЕТОМ КОЕ/МЛ

ГЛАВА 4. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СОРБЦИИ ИМБС КЛЕТОК 76 в.вОГШЕ!1 ФАЗЫ С ПОМОЩЬЮ ПЦР

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммуномагнитная сепарация с последующей АТФ-метрией в экспресс-индикации шигелл Зонне"

Актуальность темы. Шигеллезы относятся к числу острых кишечных инфекций, эпидемиологическая значимость которых возрастает как в развитых, так и в развивающихся странах [5]. Отмечен постоянный уровень количества случаев шигеллезов в мире, равный 165 млн случаев в год[81]. В последнее десятилетие число смертельных случаев возросло с 660 тыс до 1 млн 100 тыс в год. В Российской Федерации отмечается сохраняющийся высокий уровень заболеваемости шигеллезами среди населения, включая спорадические случаи и вспышки, в том числе внутрибольничные [5,20]. В Москве (согласно данным Центра Госсанэпиднадзора) на протяжении 1993-1999 гг. возникло 310 эпидемических вспышек острых кишечных инфекций различной этиологии, при этом 81 вспышку (26,1%) вызвали шигеллы Зонне [25].

На этом фоне в связи с возможной контаминацией молока и молочнокислых продуктов бактериями З.эоппе! значительно возросла потребность надежного обнаружения возбудителя в исследуемом материале. Немаловажным остается обследование декретированных групп, в частности, работников пищеблоков, на носительство шигелл. Для определения шигелл в пробах предложено несколько различных методов индикации возбудителя, к которым относится классический бактериологический анализ, иммунофлюоресцентная микроскопия, реакция коагглютинации, иммуноферментный анализ, обнаружение ДНК возбудителя с помощью полимеразной цепной реакции и др.

Появившаяся в последние годы угроза биологического терроризма, периодическое возникновение чрезвычайных ситуаций природного или техногенного происхождения с последующим ухудшением санитарно-эпидемиологической обстановки, наличие природных очагов особо опасных инфекций диктует необходимость дальнейшего совершенствования методов экспресс-индикации возбудителей как одного из ведущих разделов специфической индикации с целью оценки степени опасности эпидемического очага и экспертизы подлежащих исследованию объектов. Высоко чувствительными методами обнаружения возбудителя является обнаружение ДНК с помощью различных модификаций ПЦР и биолюминесцентой АТФ-метрии [10,11,14,15,22,103,127,141].

Практически все известные индикационные методы исследования предусматривают разовый отбор исследуемых проб ограниченного объема, не превышающего, как правило, 1-50 мл. При этом возбудители могут присутствовать в отобранных пробах в низких концентрациях, что требует проведения предварительного концентрирования патогенных микроорганизмов в исследуемых образцах с отделением их от сопутствующей микрофлоры.

Для этого могут быть использованы различные сорбенты, в том числе иммуномагнитные сорбенты, используемые при выделении и идентификации различных патогенных микроорганизмов и их специфических антигенов [14,15]. Магнитные свойства носителей таких сорбентов делают их управляемыми в магнитном поле, что обеспечивает возможность автоматизации процесса при работе с ними. Выступая в качестве твердой фазы, иммуномагнитные сорбенты нашли применение в комплексе с иммунофлюоресцентным, биолюминесцентным и амплификационным методами индикации ряда возбудителей [17,28,127]. Традиционные микробиологические методы: микроскопия мазков и культуральное исследование даже центрифугированных образцов малоэффективны. Экспрессные системы культивирования, в которых используются жидкие питательные среды с радиометрической или флуоресцентной регистрацией результатов, позволяют определить рост бактерий, как правило, в течение 2-х дней. К тому же после регистрации положительного результата бактериального роста требуется еще 5-6 дней для идентификации таксономической принадлежности и молекулярно-биологической характеристики изолированной культуры.

В последнее время внимание широкого круга специалистов привлекают различные экспресс-методы индикации патогенных микроорганизмов как в биологических пробах, объектах окружающей среды, так и в питьевой воде и пищевых продуктах. В этом плане интерес представляет биолюминесцентный метод индикации аденозинтрифосфата микробных клеток (биолюминесцентная АТФ-метрия), в основе которого лежит взаимодействие АТФ, люциферазы и люциферина, сопровождающееся выделением энергии в виде излучения фотона. При этом время анализа значительно сокращается по сравнению с рутинными методами, а высокая его чувствительность позволяет определить 500-1000 микробных клеток в 1 мл образца [17,28,127]. Однако биолюминесцентный метод АТФ-метрии неспецифичен, так как и соматические клетки макроорганизма и микробные клетки сапрофитов и патогенов содержат АТФ. В связи с указанным, актуальной является разработка экспресс-метода индикации возбудителя после специфической иммуносорбции микробных клеток. Цель работы - разработка комплексного экспресс-метода индикации З.БОппе! I фазы на основе биолюминесцентной АТФ-метрии после предварительной иммуномагнитной сепарации для идентификации возбудителя в исследуемом материале.

Задачи исследования:

1. Разработать эффективный иммуномагнитный биосорбент (ИМБС), пригодный для иммобилизации сывороточных у-глобулинов против микробных клеток З.БОппе! I фазы.

2. Отработать методику иммуномагнитной сепарации З.Боппе! I фазы из образцов, содержащих смесь бактерий различных таксономических групп, и оценить чувствительность и специфичность метода.

3. Применить сочетанный способ иммуномагнитной сепарации с последующей индикацией микробных клеток З.эоппе! I фазы путем измерения количества бактериального аденозинтрифосфата (АТФ-метрии).

Научная новизна и практическая значимость работы.

- Впервые показана принципиальная возможность использования ферромагнитных носителей, состоящих на 85% из железа, 10% оксида кремния и 5% оксида титана, для иммобилизации на композитных частицах у-глобулинов к 8. 80ппе1 I фазы. Примененная методика металлохелатного связывания белков сохраняет специфическую активность у-глобулинов, обеспечивая их прочную фиксацию.

- Разработана технология обнаружения З.БОппе! I фазы после предварительной концентрации микробных клеток в исследуемом материале с помощью иммуномагнитного биосорбента с последующим обнаружением возбудителя путем биолюминесцентной АТФ-метрии. Специфичность связывания биосорбентом клеток З.БОппе! подтверждена в ПЦР с праймерами, выявляющими последовательности плазмидного ¡раН гена шигелл, контролирующего инвазию возбудителя.

- Иммуномагнитная сепарация в сочетании с биолюминесцентной АТФ-метрией позволяет обнаружить жизнеспособные микробные клетки в образце, содержащем 500-1000 бактериальных тел в 1 мл, в то время как с помощью ПЦР выявляется ДНК как живых, так и нежизнеспособных клеток возбудителя.

Комплексный подход, основанный на йммуносорбции Б^оппе! I фазы с последующим проведением АТФ-метрии, позволяет увеличить производительность диагностического лабораторного анализа за счет сокращения времени его проведения. Повышение чувствительности и специфичности метода экспресс-индикации бактерий играет важную роль как при тестировании возбудителей в образцах, так и при оценке контаминации патогенными микроорганизмами объектов окружающей среды.

Апробация работы: материалы диссертации были представлены на Московском обществе Эпидемиологов, Микробиологов и Паразитологов (21 февраля, 2003), XII Международной конференции "Новые технологии в биологии и медицине" (Гурзуф, 2004), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных болезней" (Москва, 19-21 октября 2004). Апробация диссертации состоялась на конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 16 марта 2005 г.

Объем и структура работы. Работа изложена на 106 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 30 отечественных и 111 зарубежных авторов. Содержит 11 рисунков и 11 таблиц.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Латкин, Александр Тимофеевич

У. выводы

1. Разработан иммуномагнитный биосорбент, полученный на основе иммобилизованных у-глобулинов к Э. 50ппе1 I фазы на композитных феррочастицах размером 2-5 мкм, состоящих на 85% из железа, 10% оксида кремния и 5% оксида титана.

2. Для получения иммуномагнитного биосорбента использован металлохелатный способ связывания у-глобулинов, обеспечивающий фиксацию до 80 мг иммуноглобулинов на 1 г носителя. Использованная методика связывания иммуноглобулинов сохраняет специфическую активность антител и обеспечивает их прочную фиксацию. Срок хранения препарата до 6 месяцев.

3. Иммуномагнитный биосорбент позволяет сконцентрировать микробные клетки 8.80ппе1 I фазы из образца, содержащего не менее 0,8+0,2 х 103 КОЕ/мл, что в дальнейшем обеспечивает определение возбудителя в материале с помощью биолюминесцентой АТФ-метрии.

4. Использование диметилсульфоксида для извлечения бактериального АТФ из комплексов "иммуномагнитный биосорбент-бактерии" обеспечивает быстрое высвобождение аденозинтрифосфата и его стабильное сохранение в образце, что значительно ускоряет последующий этап АТФ-метрии.

5. Разработанная методика иммуномагнитной сепарации в сочетании с биолюминесцентной АТФ-метрией обеспечивает концентрацию целевых клеток в 15-20 раз и индикацию шигелл Зонне I фазы в смеси с другими видами бактерий в течение 5-6 часов.

6.Специфичность связывания иммуномагнитным биосорбентом шигелл Зонне I фазы подтверждена в ПЦР с праймерами, амплифицирующими последовательности плазмидного 1раН гена, контролирующего инвазию возбудителя в эпителий кишечника.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в процессе работы разработана методика иммуномагнитной сепарации и показано, что при использовании металлохелатного связывания очищенных гамма-глобулинов сохраняется специфическая активность антител и обеспечивается их прочная фиксация. Последующее использование биолюминесцентной АТФ-метрии завершает обнаружение жизнеспособных целевых микробных клеток, захваченных иммуномагнитным биосорбентом. На модели шигелл подтверждено, что величина светового потока в происходящей реакции биолюминесценции прямо пропорциональна количеству бактериальных клеток, из которых высвобождается АТФ. Продемонстрирована принципиальная возможность использования иммуномагнитного биосорбента с гамма-глобулинами к 8.Б0Ппе1 I фазы, иммобилизованными на феррочастицах, для специфической сорбции шигелл. Специфичность гамма-глобулиновой фракции показана отсутствием реакции агглютинации на стекле с бактериями эталонных штаммов 16 видов бактерий различных таксономических групп. Эффект специфической сорбции клеток 8.зоппе1 I фазы подтвержден результатами постановки ПЦР с праймерами, амплифицирующими последовательности гена инвазивности (¿раН). Иммуномагнитный биосорбент извлекает также и нежизнеспособные клетки шигелл. В этом случае использование АТФ-метрии позволяет определять в материале только жизнеспособные клетки возбудителя. Применение ПЦР, выявляющей специфические последовательности ДНК возбудителя в данном случае не позволяет дифференцировать в пробе жизнеспособные клетки от инактивированных, что выгодно отличает АТФ-метрию от использованного в работе амплификационного метода. Изучение влияния на иммуносорбцию температуры, обогащение проб глюкозой, времени сорбции и возраста бактериальных клеток на результаты биолюминесцентной АТФ-метрии позволили определить оптимальные условия для проведения иммуномагнитной сепарации с последующей детекцией З.БОппе! I фазы биолюминесцентной АТФ-метрией. Иммуномагнитная сепарация не только концентрирует и ускоряет, но и обеспечивает специфичность метода обнаружения возбудителя при последующем использовании метода АТФ-метрии. Эксперименты на поликомпонентных бактериальных суспензиях при использовании иммуномагнитной сепарации позволили выявлять З.БОппе! I фазы из образцов, содержащих 500-1000 клеток в 1 мл, концентрируя их в 10-20 раз, что подтверждалось регистрацией биолюминесцентного сигнала АТФ-метрии, статистически значимая величина которого соответствовала концентрации 2,5±0,5 х 104 КОЕ/мл. Иммуномагнитный биосорбент позволяет сконцентрировать микробные клетки З.БОПпе! I фазы из образца, содержащего не менее 0,8±0,2 х

1(Г КОЕ/мл, что в дальнейшем обеспечивает определение возбудителя в материале с помощью биолюминесцентой АТФ-метрии.

Было показано, что предел концентрационной чувствительности метода иммуномагнитной сорбции с последующей индикацией шигелл Зонне с помощью биолюминесцентной АТФ-метрии практически идентичен чувствительности ПЦР, значительно превосходящих чувствительность других известных экспресс-методов индикации возбудителей. Как нами отмечено выше, может возникать ситуация, когда образец для лабораторного анализа значительно разводится, например, при экстракции бактериальных возбудителей из твёрдых пищевых продуктов или из консервированных субстанций. В этом случае возникает проблема с предварительным концентрированием микробов из большого объёма водной фазы. Используемое в ряде подобных случаях центрифугирование является достаточно сложной (необходимы большие ускорения для больших объёмов), опасной (значительный контакт с потенциально загрязнённым материалом) и малоэффективным (осадок может содержать подавляющее количество посторонних примесей, ингибирующих АТФ-метрию).

С теоретических позиций достаточно просто предсказать, что данную проблему легко решить с использованием селективных сорбентов. Вот почему наши исследования были направлены на изыскание методов селективной сорбции.

Было сочтено целесообразным отработать метод иммуномагнитной сепарации. В этом методе используются магнитоносители с ковалентно связанными антителами (гамма-глобулинами). В данном исследовании использован иммуномагнитный биосорбент (ИМБС), несущий антитела к 8.Боппе1 I фазы. После этапа антиген-антительного взаимодействия, искомые бактериальные клетки плотно сорбируются на магнитоносителе. Собрать из объёма сорбированный на ИМБС материал не представляется сложным с помощью наружного постоянного магнитного поля у дна пробирки.

С позиций нашего интереса, индикация шигелл в молоке требовала решения ряда сложных проблем. Во-первых, сам биоматериал по составу относится к числу наиболее сложных. Во-вторых, это достаточно многокомпонентная и агрессивная среда (наличие гидролитических энзимов, способных разрушать образуемые антиген-антительные комплексы). Наконец, условия подготовки образца к исследованию предполагают значительные разведения, что приводит к снижению титра клеток возбудителя, в данном случае, 8.зоппе1 I фазы. Вот почему установление принципиальной возможности селективного концентрирования шигелл в образце актуально для практической бактериологии в целом.

Собранный магнитно-сорбционный материал, освобожденный от молока путем отмывания в магнитном поле, подвергался лизису с помощью ДМСО.

Установлено, что только при концентрации S.sonnei I фазы в магнитно-сорбционном материале порядка 103 - 104 клеток в мл подобранные условия АТФ-метрии позволяют отчётливо детектировать присутствие возбудителя. Следует отметить, что биолюминесцентная АТФ-метрия все же несколько более чувствительна, хотя и неспецифична. Однако ее постановка осуществляется намного быстрее, чем ПЦР, и в отличие от последней детектирует только жизнеспособные микробные клетки.

Известно, что классический бактериологический анализ трудоемок и длителен. Ответ на присутствие в пробе S.sonnei может быть получен после изоляции культуры и ее последующей идентификации по биохимическим и серологическим свойствам. Разработанный комплексный подход, основанный на иммуносорбции S.sonnei с помощью специфических магнитных антител с последующим проведением АТФ-метрии или ПЦР позволят улучшить лабораторный анализ, увеличив его производительность и сократить время исследования. Предварительное обогащение пробы и последующее использование ПЦР или АТФ-метрии позволят осуществить индикацию S.sonnei в течение 5-6 часов. В работе продемонстрирована принципиальная возможность использования магнитоносителей с иммобилизованными антителами для индикации шигелл. В плане адаптации метода к требованиям практики санэпидслужбы максимально упрощена методика подготовки образцов к исследованию и показана принципиальная возможность детекции инвазивных штаммов S.sonnei. Вместе с тем, для широкого внедрения апробированных подходов в практическую деятельность бактериологических служб, предстоит решить проблему организации производства магнитоносителей с иммобилизованными специфическими антителами и обеспечения лабораторий люминометрами.

90

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Латкин, Александр Тимофеевич, Москва

1. Бондаренко В.М. "Острова" патогенности бактерий. Журн. микробиол. 2001, 4, 67-74.

2. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. Журн. микробиол. 1999, №5, с.34-39.

3. Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условнопатогенных бактериях. Журн. микробиол., 1997, №4, с.20-26.

4. Бровко Л.Ю., Трдатян И.А., Угарова H.H. Оптимизация биолюминесцентного метода определения микробной биомассы. Приклад, биохим. 1991,27(1): 134-140.

5. Бухарин О.В., Бондаренко В.М., Малеев В.В. Шигеллы и шигеллезы. Екатеринбург.,2003.

6. Воробьев A.A., Гинцбург А.Л., Бондаренко В.М. Мир микробов. Вестник РАМН. 2000, 11:11-14.

7. Воробьев A.A., Бондаренко В.М.,Шабанова H.A., Фиалкина C.B. ПЦР тест-системы для геноиндикации энтерогеморрагическихэшерихий. Журн. микробиол., 2000, №6, с.90-94.

8. Гинцбург А.Л. Генодиагностика инфекционных заболеваний. Журн. микробиол. 1998, 3:86-95.

9. Государственный доклад "О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2001 году". М., 2002.

10. Греков Л.И., Владимцева И.В., Ефременко В.И. и др. Способ получения сорбента. A.C. 1643073 от 23.04.91.

11. П.Дементьева Е.И.,Угарова Н.Н.,Кобболд П.Х. Измерение АТР в интактных клетках Eschèrichia coli, содержащих рекомбинатную люциферазу светляков. Биохимия.1996,61(7):1285-1293.

12. Духович А.Ф., Ефимов А.И., Щеголев A.A. и др. Инактивация люциферазы светляков длинноцепочечными производными холина. Биохимия. 1993,58(4):648-654.

13. Егорова Т.Н., Бондаренко В.М., Зверев Д.В. и др. Роль бактериальных токсинов в патогенезе гемолитико-уремического синдрома, вызываемого энтерогеморрагическими эшерихиями. Журн. микробиол. 2001, №1, с.82-89.

14. Ефременко В.И. Магнитоуправляемые иммобилизованные системы в микробиологическом мониторинге природных очагов и объектов внешней среды на наличие возбудителей опасных инфекционных болезней. Журн. микробиол. 1997, 2:102-106.

15. Ефременко В.И., Кальной С.М. Способ получения сорбентов. A.c. SU. 2070439 от 20.12.96.

16. Карцев А.Д. Цикличность и прогнозирование заболеваемости шигеллезами в России. Журн. микробиол. 2000, 1:57-60.

17. Кузиков А.Н., Бондаренко В.М., Латкин А.Т. Применение биолюминесцентного метода определения бактериального аденозинтрифосфата (АТФ-метрии) в микробиологии. Журн. микробиол. 2003, 1:80-89.

18. Мавзютов А.Р., Латкин А.Т., Бондаренко В.М.Ингибиторы полимеразной цепной реакции. Журн. микробиол. 2003, 3:93-98.

19. Орлова К.А., Мазепа В.Н., Махова М.А. и др. Выявление генов факторов патогенности в клинических изолятах энтеробактерий методом ПЦР. В сборнике "Генодиагностика инфекционных болезней". М.,2004.Том.2. С.96-98.

20. Савицкая К.И., Миронов А.Ю., Аваш Ю.Б. и др. Мониторинг возбудителей острых кишечных инфекций в регионе Московской области. Журн. микробиол. 2002, 6:10-13.

21. Солодовников Ю.П., Волкова H.A., Зайцев Б.Е. и др. Динамика нозологической структуры эпидемических вспышек кишечных инфекций в Москве в последние годы. Журн.микробиол. 2001, 2:120-122.

22. Шабанова H.A., Бондаренко В.М., Кузиков А.Н. и др. Биомагнитная сепарация с последующей ПЦР-индикацией энтерогеморрагических эшерихий. В сб. материалов "Генодиагностика инфекционных болезней". М., 2004. Том.2. С.141-143.

23. Шагинян И.А. Идентификация и типирование патогенных бактерий: современные подходы. Вестн.РАМН. 2000,1:22-28.

24. Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Кутузова Г.Д. Биолюминесценция и биолюминесцентный анализ (Обзор). Биохимия. 1993, 58 (9):1352-1372.

25. Филиппов В.И., Владимирский М.А., Андросова М.В. Мартрица иммуносорбента. Патент РФ № 2140084.-1999.

26. Фрунджян В.Г., Бабунова B.C., Бровко Л.Ю. и др. Биолюминесцентный метод определения общей бактериальной обсемененности сырого молока. Прикладная биохимия и микробиол. 1999,35(3): 1-7.

27. Alamanos Y., Maipa V., Levidiotou S.,Gessouli E. A community waterborne outbreak of gastro-enteritis attributed to Shigella sonnei. Epidemiol.Infect.2000, 125(3):499-503.

28. Amicosante M., Richeldi L., Trenti G., Paone G., Campa M., Bisetti A., Saltini С. Inactivation of polymerase inhibitors for Mycobacterium tuberculosis DNA amplification in sputum by using capture resin. J.Clin.Microbiol. 1995, 33: 629-630.

29. Beckers В., Lang H.R. Rapid diagnosis of bacteriemia by measuring bacterial ATP in blood culture bottles using bioluminescence.Med.Microbiol.Immunol. 1983,172(2): 117-122.

30. Blais B.W., Booth R.A., Philippe L. et al. Polymacron™ Enzyme Immunoassay system for detection of Escherichia coli 0157 inoculated into foods. J. Food Protection. 1997, 60: 98-101.

31. Blostein J. Shigellosis from swimming in park pond in Michigan. Publ.Health Rep. 1991,7(5):317-322.

32. Bossuit R. A 5-minute ATP platform test for judging the bacteriological quality of raw milk. Neth.Milk Diary J. 1982,36:355-364.

33. Calvert R.M.,Hopkins H.C.,Reilly M.J. et al. Caged ATP-an internal calibration method for ATP bioluminescence assays.Lett.Appl.Microbiol.2000,30(3):223-227.

34. Chen M., Delpech V.,0'Sullivan B.,Donovan B. Shigella sonnei: another cause of sexually acquired reactive arthritis. Int.J.STD AIDS. 2002, 13(2):135-136.

35. Chen K.T., Chen C.J., Chiu J.P. A school waterborne outbreak involving both Shigella sonnei and Entamoeba histolytica. J Environ. Health. 2001, 64(4):9-13.

36. Codita I., Popesku C. Rapid test for the detection of methicilline-resistance of staphylococci by ATP-dependent bioluminescence. Roum.Arch.Microbiol.Immunol. 1996, 55(4):323-331.

37. Corbitt A.J.,Bennion N.,Forsythe S J. Adenylate kinase amplification of ATP bioluminescence for hygiene monitoring in the food and beverage industry.Lett.Appl.Microbiol.2000,30(6):443-447.

38. Davidson C.A.,Griffith C.J.,Peters A.C. et al. Evaluation of two methods for monitoring surface clean-line ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing.Luminescence.l999,14(l):33-38.

39. De Filippes F.M. Decontaminating the polymerase chain reaction. BioTechniques. 1991, 10: 26-30.

40. De Lomas J.G., Sunzeri F.J., Busch M. P. False-negative results by polymerase chain reaction due to contamination by glove powder. Transfusion. 1992, 32: 83-85.

41. Deneer H.G., Knight I. Inhibition of the polymerase chain reaction by mucolytic agents. Clin.Chem. 1994, 40: 171-172.

42. DiMichele L.J., Lewis M.J. Rapid, species-specific detection of lactic acid bacteria from beer using the polymerase chain reaction. J.Am.Brew.Chem.Soc. 1993, 51: 63-66.

43. Dorward D.W., Garon C.F. DNA is packaged within membrane-derived vesicles of gram-negative but not gram-positive bacteria. Appl.Environ.Microbiol. 1990, 56: 1960-1962.

44. Espy M.J., Smith T.F., Persing D.H. Dependence of polymerase chain reaction product inactivation protocols on amplicon length and sequence composition. J.Clin.Microbiol. 1993, 31: 2361-2365.

45. Fleet J.C. A new role for lactoferrin: DNA binding and transcription activation. Nutr.Rev. 1995, 53: 226-227.

46. Fleming C.A., Caron D., Gunn J.E. et al. An outbreak of Shigella sonnei associated with a recreational spray fountain. Am.J.Public Health.2000, 90(10):1641-1642.

47. Fluit A.C., Widjojoatmodjo M.N., Verhoef J. Detection of Salmonella species in fecal samples by immunomagnetic separation and PCR. J.Clin.Microbiol. 1995, 33: 1046-1047.

48. Furrer B., Candrian U., Wieland P., Luthy J. Improving PCR efficiency. Nature. 1990, 346: 324.

49. Gannon V.P.J., King R.K., Kim J.Y., Goldsteyn Thomas E.J. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction. Appl.Environ.Microbiol. 1992, 58: 3809-3815.

50. Garcia-Fulgueiras A., Sanchez S., Guillen J.J. et al. A large outbreak of Shigella sonnei gastroenteritis associated with consumption of fresh pasteurised milk cheese. Eur J Epidemiol. 2001;17(6):533-538.

51. Gastrin B.,Gustafsson R.,Lundin A. Evaluation of bioluminescence assay for the detection bacteriuria.Scand.J.Infect.Dis. 1989,21 (4):409-419.

52. Gibson J.R., Sutherland K., Owen RJ. Inhibition of DNAse activity in PFGE analysis of DNA from Campylobacter jejuni. Lett.Appl.Microbiol. 1994, 19: 357-358.

53. Gericke B., Liesegang A., Reissbrodt R. Analysis of foodborne Shigella sonnei outbreak in Northern Europe by conventional and molecular methods. Med.Microbiol.Lett. 1995, 4:165-172.

54. Girotti S., Ferri E., Cascione M.L.et al. Methodological problems of direct bioluminescent ATP assay in platelets and erythrocytes. Analyt. Biochem. 1991,192:350-357.

55. Gracia E.,Fernandez A.,Conchello P. et al. In vitro development of S.aureus biofilms using slime-producing variant and ATP-bioluminescence for automatic bacterial quantification.Luminescence.l999,14(l):23-31.

56. Grif K., Diench M.P., Allerberge, F. Dynabeads plus 3M petrifilm HEC versus Vitek immunomagnetic assay system for detection of E. coli 0157 in minced meat. Lett.Appl. Microbiol. 1998, 26: 199-204.

57. Griffiths, M.W. The role of ATP bioluminescence in the food industry: new light on old problems. Food Technol.1996, 50: 62-73.

58. Griffiths M.W. Bioluminescence and the food industry. J. Rapid Methods and Automation in Microbiology. 1995, (4):65-75.

59. Griffiths M.W. Application of bioluminescence in the dairy industry. J. Dairy Science. 1993,76(10):3118-3125.

60. Jacobsen C.S., Rasmussen O.F. Development and application of a new method to extract bacterial DNA from soil based on separation of bacteria from soil with cation-exchange resin. Appl.Environ.Microbiol. 1992, 58: 2458-2462.

61. Hallander H.O., Kallner A., Lundin A. et al. Evaluation of rapid methods for the detection of bacteriuria in primary health care. Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.l986,33(Sect.B):39-49.

62. Himba A.M., Jassim S.A., Griffiths M.W. In vivo bioluminescence to detect the attachment of L-form of Listera monocytogenes to food and clinical contact surfaces. Int.J.Food Microbiol. 1996, 33(2-3): 157-167.

63. Höjer H., Nilsson L., Änsehn S. et al. Evaluation of a rapid semiautomated bioassay of antibiotics. Curr. Chemother. 1978,1:523-525.

64. Huang S.W., Chang T.C.Specific identification of Escherichia coli 0157:H7 by an immunostick method using commercially available antibodies. J. Food Protect. 1996, 59: 670-674.

65. Jung R., Lubeclce C., Wagener C., Neumaier M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. BioTechniques. 1997, 23: 24-28.

66. Kapperud G., Rorvik L.M., Hasseltvedt V. et al. Outbreak of Shigella sonnei infection traced to imported iceberg lettuce. J.Clin.microbial.1995, 33(3):609-614.

67. Katcher H.L., Schwartz I. A distinctive property of Tth DNA polymerase: enzymatic amplification in the presence of phenol. BioTechniques. 1994, 16: 84-92.

68. Katzman M. Use of oil overlays in "oil-free" PCR technology. BioTechniques. 1993, 14: 36-40.

69. Keene W.E., McAnulty J.M., Hoesly F.C. et al. A swimming-associated outbreak of hemorrhagic colitis caused by Escherichia coli 0157:H7 and Shigella sonnei.N.Eng.J.Med.1994, 331(9):579-584.

70. Khan G., Kangro H.O., Coates P.J., Heath R.B. Inhibitory effects of urine on the polymerase chain reaction for cytomegalovirus DNA. J.Clin.Pathol. 1991, 44: 360-365.

71. Kim D.W. Real-time quantitative PCR. Exp. Mol.Med. 2000, 21:101109.

72. Koba T., Arisawa K., Ryu S. et al. An epidemiological study on Shigella sonnei outbreak associated with contaminated drinking water— Nagasaki, Japan, 1998. Nippon Koshu. Eisei. Zassi.2001, 48(11): 903-913.

73. Kotloff K.L., Winickoff B., Ivanoff B. et al. Global burden of Shigella infection: implication for vaccine development and implementation. Bull.WHO.1999, 77:651-656.

74. Kreader C.A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32: protein. Appl.Environ.Microbiol. 1996, 62: 1102-1106.

75. Lang H.R., Beckers S.B. Rapid detection of positive blood cultures with bioluminescence assay in comparison to Gram staining. Zbl.Bakteriol.Mikrobiol.Hyg.(A).l 984,25 8(4):464-471.

76. Lantz P.-G., Tjerneld F., Borch E. et al. Enhanced sensitivity in PCR detection of Listeria monocytogenes in soft cheese through use of an aqueous two-phase system as a sample preparation method. Appl.Environ.Microbiol. 1994, 60:3416-3418.

77. Lappalainen J., Loikkanen S., Havana M. et al. Microbial testing methods for detection of residual cleaning agents and disinfectants-prevention of ATP bioluminescence measurements errors in the food industry. J.Food Prot.2000, 63(2): 210-215.

78. Lau J.Y.N., Qian K., Wu P.C., Davis G.L. Ribonucleotide vanadyl complexes inhibit polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2777.

79. Lee J.Y., Deininger R.A. Detection of E.coli in beach water within 1 hour using immunomagnetic separation and PCR ATP bioluminescence. Luminescence.2004, 19:31-36.

80. Lima A.A., Sidrim J.J., Lima N.L. et al. Molecular epidemiology of multiply antibiotic-resistant Shigella flexneri in Fortaleza, Brazil. J.Clin.Microbiol. 1997,35:1061 -1065.

81. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 1993,362: 709-715.

82. Lindqvist R., Norling B., Lambertz S.T. A rapid sample preparation method for detection of food pathogens based on buoyant density centrifiigation. Appl.Microbiol. 1997, 24: 306-310.

83. Lin C.S., Wang T.K., Tsai J.L. et al. Relatedness of Shigella sonnei isolates from six outbreaks in Tao-Yuan area, Taiwan. J.Micobiol.Immunol.Infect.l999,32(4):278-282.

84. Litwin C.M., Leonard R.B., Carroll K.C. et al .Characterization of endemic strains of Shigella sonnei by use of plasmid DNA analysis and pulsed-gield gel electrophoresis to detect patterns of transmission. J.Infect.Dis.1997,175:864-870.

85. Liu P.Y., Lau Y.J., Shyr J.M. et al. Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different molecular typing methods. J.Clin.Microbiol.1995, 33:1779-1783.

86. Lundin A. Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass enzymes and metabolites. Methods Enzymol. RT C. 2000,305:346-370.

87. Maguire H.C., Seng C., Chambers S. et al. Shigella outbreak in a school associated with eating .canteen food and person to person spread. Common Dis.Public.Health. 1998, 1(4): 279-280.

88. Matsumoto M., Suzuki Y., Saito M. et al. Epidemiologic study of Shigella sonnei from sequential outbreaks and sporadic cases using different typing techniques. Microbiol.Immunol.1998, 42(4):259-264.

89. McCall B., Stafford R.,Cherian S. et al. An outbreak of multi-resistant Shigella sonnei in a long-geriatric nursing centre. Commun.Dis.Intell.2000,24(9):272-275.

90. Meier A., Persing D.H., Finken M., Bottger E.C. Elimination of contaminating DNA within polymerase chain reaction reagents: implicationsfor a general approach to detection of uncultured pathogens. J.Clin.Microbiol. 1993,31: 646-652.

91. Mermel L.A., Josephson S.L., Dempsey J. et al. Outbreak of Shigella sonnei in a clinical microbiology laboratory. J.Clin.Microbiol. 1997, 35(12):3163-3165.

92. Monteiro L., Bonnemaison D., Vekris A. et al. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helicobacter pylori model. J.Clin.Microbiol. 1997, 35: 995-998.

93. Nataro J.P.,Seriwatana J.,Fasano A. et al. Identification and cloning of a novel plasmid-encoded enterotoxin of enteroinvasive E.coli and Shigella strains.Infect.Immun.l995,63(12):4721-4728.

94. Nilsson L.E., Molin Ö., Ansehn S.et al. Bioluminescent assay of bacterial ATP for rapid detection of bacterial growth in clinical blood cultures. J. Biolumin.Chemilumin. 1989, 3(3): 101-104.

95. Niroomand F., Lord C. Comparison of rapid technique for the detection of Escherichia coli 0157:H7. J. Rapid Method. Automat. Microbiol. 1994,3:85—96.

96. Oleen P., Lantz P.-G., Backman A., Radstrom P. Rapid diagnosis of bacterial meningitis by a seminested PCR strategy. Scand.J.Infect.Dis. 1995, 27: 537-539.

97. Pass M. A., Odedra R. Batt R. M. Multiplex PCRs for identification of Escherichia coli virulence genes. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(5): 20012004.

98. Partis L., Newton K., Murby J., Wells R.J. Inhibitory effects of enrichment media on the Accuprobe test for Listeria monocytogenes. Appl.Environ.Microbiol. 1994, 60: 1693-1694.

99. Paton A. W., Paton J.C. Detection and characterization of shiga toxigenic Escherichia coli by using multiplex PCR assays for stxl, stx2, eaeA, enterohemorrhagic E.coli hlyA, rfbOlll, and rfb0157. J. Clin. Microbiol. 1998; 36(2): 598-602.

100. Persing D.H, Cimino G.D. Amplification Product Inactivation Methods. Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington: ASM Press; 1993: 105-21.

101. Pollard P.R., Johnson W.M., Lior H. et al. J.clin.microbiol.1990,28:540-545.

102. Powell H.A., Gooding C.M., Garrett S.D., Lund B.M., McKee R.A. Proteinase inhibition of the detection of Listeria monocytogenes in milk using the polymerase chain reaction. Lett. Appl. Microbiol. 1994, 18: 59-61.

103. Prince A.M., Andrus L. PCR: how to kill unwanted DNA. BioTechniques. 1992, 12: 358-360.

104. Raina K., Chandlee JJVi. Recovery of genomic DNA from a fungus (Sclerotinia homoeocarpa) with high polysaccharide content. Bio-Techniques. 1996,21: 1030-1032.

105. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K., Rasmussen O.F. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions. Int.J.Food Microbiol. 1992, 17: 37-45.

106. Sarkar G., Sommer S.S. Shedding light on PCR contamination. Nature. 1990, 343: 27.

107. Saulnier P., Andremont A. Detection of genes in feces by booster polymerase chain reaction. J.Clin.Microbiol. 1992, 30: 2080-2083.

108. Simon M.C., Gray D.I., Cook N. DNA extraction and PCR methods for the detection of Listeria monocytogenes in cold-smoked salmon. Appl.Environ.Microbiol. 1996, 62: 822-824.

109. Stambach M.N., Falkow S., Tomkins L.S. Species-specific detection of Legionella pneumophila in water by DNA amplification and hybridization. J.Clin.Microbiol. 1989, 27: 1257-1261.

110. Sakakibara T., Murakami S., Nattori N.et al. Enzymatic treatment to eliminate the extracellular ATP for improving the detectability of bacterial intracellular ATP. Analyt.Biochem.1997, 250:157-161.

111. Sarkis G.J., Jacobs W.R., Hatfull G.F. L5 luciferase reporter mycobacteriophages: a sensitive tool for the detection and assay of live mycobacteria. Mol. Microbiol. 1995,15(6): 1055-1067.

112. Schifman R.B., Wieden M., Brooker J.et al. Bacteriuria screening by direct bioluminescence assay of ATP. J. Clin. Microbiol. 1984, 20(4):644-648.

113. Selan L., Berlutty F., Passariello C. et al. Reliability of bioluminescence ATP assay for detection of bacteria. J. Clin. Microbiol. 1992, 30(7): 1739-1742.

114. Sobel J., Cameron D.N., Ismail J. et al. A prolonged outbreak of Shigella sonnei infections in traditionally observant Jewish communities in North America caused by a molecularly distinct bacterial subtype. J.Infect.Dis.1998, 177(5): 1405-1409.

115. Stewart G.S., Denyer S.P., Lewington J. Microbiology illuminated: gene engineering and bioluminescence. Trends Food Sci.Technol. 1991,2(1):7-10.

116. Stewart G.S., Williams P. Lux genes and the application of bacterial bioluminescence. J. Gen.Microbiol. 1992,138:1289-1300.

117. Sun W., Khosravi F.,Albrechtsen H.et al. Comparison of ATP and in vivo bioluminescence for assessing the efficiency of immunomagnetic sorbents for live E.coli 0157:H7 cells.J.Appl.Microbiol.2002,92:1021-1027.

118. Talcenaka T. An ATP bioluminescence assay for the analysis of bacteria biofilms. Kansenhogaku Zasshi.l994,68(6):759-766.

119. Tornieporth et al. J.Clin.Microbiol.1995, 33: 1371-1374.

120. Tsai Y.-L., Olson B. H. Detection of low numbers of bacterial cells in soils and sediments by polymerase chain reaction. Appl. Environ.Microbiol. 1992,

121. Tu S.I., Patterson D., Briggs C. et al. Detection of immunomagnetically captured Escherichia coli 0157:H7 by antibody-conjugated alkaline phosphatase. J.Industr.Microbiol.2001, 26:345-349.

122. Vaneechoutte M., Van Eldere J. The possibilities and limitations of nucleic acid amplification technology in diagnostic microbiology. J.Med.Microbiol. 1997, 46: 188-194.

123. Vesley D., Hartman H.M. Laboratory-acquired infections and injuries in laboratories: a 1986 survey. Am.J.Publ.Health.l988, 78:1213-1215.

124. Walker A.J., Holah J.T., Denyer S.P. et al. The antibacterial activity of Virkon measured by colony growth and bioluminescence of lux recombinant L.monocytogenes. Lett. Appl.Microbiol. 1992,15:80-82.

125. Wernars K., Delfgou E., Soentoro P.S., Notermans S. Successful approach for detection of low numbers of enterotoxigenic Escherichia coli in minced meat by using the polymerase chain reaction. Appl.Environ.Microbiol. 1991,57: 1914-1919.

126. Wheat P.F., Spenser R.C., Hastings J.G. A novel luminometer for rapid antimicrobial susceptibility tests on gram-positive cocci by ATP bioluminescence.J.Med.Microbiol.1989, 29(4):277-282.

127. Wilson I.G. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl.Environ.Microbiol. 1997,. 10: 3741-3751.

128. Wilson I.G., Cooper J.E., Gilmour A. Some factors inhibiting amplification of the Staphylococcus aureus enterotoxin CI (sec 1) by PCR. Int.J.Food Microbiol. 1994, 22: 55-62.

129. Yamada S.,Ogata K.,Rato R. et al. Outbreak case caused by different colicin type of Shigella sonnei in a day nursery in Tokyo (1998). Kansenshogaku Zasshi. 1999,73(11):1130-1139.

130. Young C., Burghoff R.L., Keim L.G. et al. Polyvinylpyrrolidone-agarose gel electrophoresis purification of polymerase chain reaction-amplifiable DNA from soils. Appl.Environ.Microbiol. 1993, 59: 1972-1974.

131. Yu N., Bruno J.G, Immunomagnetic-electrochemiluminiscent detection of Escherichia coli 0157:H7 and Salmonella typhimurium in foods and environmental water samples. Appl. Envir. Microbiol. 1996 62: 587-592.

Информация о работе
  • Латкин, Александр Тимофеевич
  • кандидата медицинских наук
  • Москва, 2005
  • ВАК 03.00.07
Диссертация
Иммуномагнитная сепарация с последующей АТФ-метрией в экспресс-индикации шигелл Зонне - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Иммуномагнитная сепарация с последующей АТФ-метрией в экспресс-индикации шигелл Зонне - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы