Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ АТФ-МЕТРИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ И САНИТАРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ АТФ-МЕТРИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ И САНИТАРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ именн М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

Нащюлахруюшси

Фрунджян Валерий Гайкович

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ АТФ-МЕТРИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ И САНИТАРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Ш

Москва -1999

уф (Р Оссо ^СО ^и^ Б ш? т^кпо^сп-и-'Х *

—Работа выполнена на кафедре хнмическо

выполнена на кафедре химической этимологии Химического факультета Московского государственного университета им. МВ, Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор химических наук, профессор Н И. Угарова

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор химических наук Л.КХБромо

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

* **

доктор химических наук, профессор П. С Лыс ВНИИАнтибиотюсов

доктор биологических наук АДИсшилов Биологический факультет МГУ им.М. В.Ломоносова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Российский химико-технологический университет им. ДИМенделеева

" маит* состоится 15 нюня 1999 г. в 16 часов на заседания Диссертационного совета Д,053.05.76 при Московском государственном университете км. М.В.Ломоносова по адресу: ; 19899, г. Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Химический факультет, аудитория 202 кафедры *:-.мической энзнмологкн.

диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического, факультета МГУ им. ! В Ломоносова.

^лггорефеватразослан« 43 » .мл.у 1999 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, Биолюминесцентную АТФ-метрию в настоящее время широко используют для детекции жизнеспособных клеток (животных, растительных, микробных) в различных образцах, оценки энергетического статуса клеток, регистрации метаболических изменений на клеточном уровне. Ультрамалые концентрации АТФ, на уровне фмолей, определяют при помощи фермента люимферазы светляков, который катализирует окисление органического субстрата О-люциферина в присутствии АТФ, ионов Мв и кислорода до оксилюциферака и АМФ с излучением света в видимой облает. Фермент люцифераза светляков абсолютно специфичен по отношению к обоим субстратам, квантовый выход реакции близок к 1, а интенсивность биолюминесценции пропорциональна концентрации АТФ в реакционной смеси (Угарова НЛ.. Бровко Л.Ю., Лебедева ОМ., 1986, Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология).

Возможность количественно определять жизнеспособные клетки в образцах по содержанию АТФ обусловлена тем, что данный метаболит содержится в любых жизнеспособных клетках. Содержание АТФ в клетках достаточно высоко и относительно постоянно; однако после гибели клетки АТФ быстро разрушается. Универсальность АТФ как внутриклеточного метаболита в большинстве случаев обусловливает определенную сложность детекции клеток микро- " и макроорганизмов в биологических образцах, поскольку в них, как правило," одновременно" содержится соматический' {в составе соматических меток), микробный (в составе микробных клеток) и внеклеточный (свободный) АТФ. Причем в таких образцах как кровь, моча, молоко и тл содержание соматического и свободного АТФ во много раз превышает содержание микробного АТФ. В зависимости от природы образца и назначения анализа необходимо селективно определять только' микробный или немикробный АТФ (целевой АТФ). Правильная подготовка образцов для определения , целевого АТФ имеет решающее значение для успешного применения биолюминесцекгных методов АТФ-мегрии.

р^ли и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка методов бнолюминесцеитного ■■ определения целевого АТФ (соматического и микробного) в различных образцах в клинической и санитарной микробиологии при:

— исследовании влияния на содержание АТФ в -цельной крови и еС форменных элементах отдаленных во времени неблагоприятных внешних факторов;

- определении антибиотикочувствительности крови больных бактериемией ■ без

выделения ю образца микробных клеток;

¡'.с; ГО'лльная

I' - е^льскохоз. слад емки

1и II. А., Тк.»1рйзеаа

- определении обшей бактериальной обсемененности (ОБО) сырого молока;

— определении специфической обсемененности мороженого и поверхностей

■технологического оборудования бактериями группы кишечной палочки {БГКП).

Дм достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить в ходе модельных экспериментов как меняется содержание внутриклеточного АТФ в различных форменных элементах крови (эритроцитах и нейтрофилал) под воздействием различных, неблагоприятных факторов (ксенобиотиков н/или радиации) и оценить устойчивость во времени таких изменений. >

2. Изыскать способ разрушения форменных элементов крови, и деградации цемикробного АТФ, ке влияющий на рост микробных клеток в анализируемом образце.

3. Оптимизировать условия удаления из молока немикробного АТФ и концентрирования микробных клеток пугём фильтрования, через бактериальные мембранные фильтры при использовании отечественных реактивов и материалов, в том числе - АТФ-реагента ИММОЛЮМ.

4. Оптимизировать условия селективного выделения из смешанной микробной популяции клеток БГКП для их дальнейшего, количественного определения биолюминесцентным методом.

Рдучиая новизну и .ценность, Определено содержание АТФ в нейтрофилах и цельной крови у жителей из районов Алтайского края, наиболее пострадавших от ядерных взрывов на. Семипалатинском ядерном полигоне в 1949+1962 гг. Обнаружена статистически достоверная нелинейная зависимость между средним по группе содержанием - АТФ в нейтрофилах и уровнем радионуклвдного загрязнения местности (РЗМ). "

Показано,, что гемолиз в . оптимизированных условиях с последующим инкубированием анализируемого образца в питательной среде снижает концентрацию немикробного АТФ на несколько порядков, что позволяет определять в крови микробный АТФ биолюминесцентным методом с достаточной точностью. При этом в образце создаются условия для быстрого роста микробных клеток.

. „ Изучено, влияние различных ферментных препаратов, детергентов, повышенной температуры на фильтруемость сырого молока через бактериальные мембранные фильтры, а также, на . жизнеспособность клеток молочной микрофлоры и содержание в них АТФ. Определено содержание внутриклеточного АТФ у основных представителей молочной микрофлоры и проанализированы причины снижения точности определения ОБО сырого молока по сравнению С искусственно контаминированным молоком.

Научная и практическая значимость na^n-гы. Паляметр «ичп^рцяшш. АТФ в нейтрофилах» в отличие от параметра «содержание АТФ в цельной крови» совместно с другими биохимическими параметрами крови может быть использован при массовых обследованиях больших групп населения для выявления метаболических изменений на клеточном уровне.

Предложена оптимизированная. методика биолюминесцентного определения ангибнотикочувствительности крови при: бактериемии, позволяющая без выделении га образца микробных клеток оценивать в ходе 6-часового теста эффективность химиотерапии.

Разработаны методики Биолюминесцентного определения ОБО сырого молока с пределом обнаружения микробных ■ «легок 0,5x10' КОЕ/мл (30*3 S-минутный тест) и специфической обсемененности мороженого и поверхностей технологического оборудования БГКП с пределом обнаружения 1+10 КОЕ/мл (4+б-часовой тест). Методика определения ОБО сырого молока основана на использовании материалов и реагентов преимущественно отечественного производства и адаптирована к условиям производства молока и действующему ГОСТ 9225-84 с изменением N2 от 28.09.89. Данная методика была утверждена в виде МЕТОДИЧЕСКИХ РЕКОМЕНДАЦИЙ на заседании Отделения ветеринарной медицины РАСХН H.11.9S г.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на международной конференции по клинической хемклюминесцешши «1ССС-1в (Берлин, 1994), на международных конференциях по биолюминесценции и хемилюминесцеяции «Bioluminescence ''and Chemihuninescence» (Кембридж, 1994 и Болонья, 1998), на международных конференциях «БИОКАТАЛИЗ-95, -98» (Суздаль, 1995 и Пущино, 1998) и «Современные антибиотики: проблемы, перспективы,. безопасность» (Санкт-Петербург, 1996), на международной научно-практической: конференции «Медико-биологические проблемы экологической безопасности агропромышленного комплекса» (Сергиев Посад, 1996), на международном семинаре ВНИМИ «Новые экспресс-анализаторы, устройства технологического контроля и управления, компьютерные системы для предприятий перерабатывающих отраслей АПК (Москва, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

ОСьем и структура работы. Диссертация состоит из 3 глав: введения,- обзора литературы и экспериментальной частя, включающей материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, выводы и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 134 страницах, содержит 13 рисунков, 4 схемы и 24 таблицы. Список литературы включает 205 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ П МЕТОДЫ

Определение содержания АТФ в цельной крови и её форменных элементах у п ад опытных животных, подвергшихся поражающим воздействиям, и у человека. На самцов' белых крыс линии ВИСТ АР двухмесячного возраста весом 120+150 г на начало эксперимента в течение 70 суток воздействовали у-излучением 15,Сз в дозах 0,07+2 Гр на установке "Алмаз" (Россия) и/или скармливали им ксенобиотики (смесь 1:1 по весу 2,4-дихлорфенилуксусной кислоты и 2,2-бис-(3 -хлорфенил)-1,1,1 -тркхлорэтана в количестве 0,06 мг/кг массы животного). Артериальную теларинкзированкую кровь у крыс отбирали под эфирным наркозом через 5 суток после каждого поражающего воздействия и выделяли из нее эритроциты. Нейтрофнлы нз крови крыс выделяли через 20 и 50 суток после прекращения поражающих воздействий. На каждый опыт нз группы отбирали по 3+5 животных.

Венозную нитратную кровь у $3 женщин в возрасте 45+55 лет, родившихся и постоянно проживающих в селах Алтайского края со сходными социально-экономическими и климатическими условиями, отбирали через 3+4 ч после приема пищи. Обследования проводили в селах с расчетными уровнями РЗМ менее 0,35 Зв, 0,35+1 Зв и свыше 1 Зв, а также в селе, не попавшем в зону поражений от взрыва 20.08.1949 г (контроль).

Упакованные эритроциты выделяли из крови осаждением при помощи декстран-супьфата. Нейтрофилы выделяли из надосадочной жидкости при равновесном центрифугировании в градиенте плотности (фиколл-пак). Клетки крови, соосажденные с нейтррфилами, подвергали лизису водой и отделяли в ходе 2-кратного центрифугирования. АТФ из цельной крови, упакованных эритроцитов или нейтрофилов экстрагировали диметилсульфоксидом (ДМСО) и в полученных экстрактах определяли концентрацию АТФ при помощи АТФ-реагеэта ИММОЛЮМ (Химфак МГУ им. М.В.Ломоносова), содержащего иммобилизованную люииферазу светляков, Ц-люинферин, соль стабилизатор и компоненты буферной системы. Достоинствами АТФ-реагента ИММОЛЮМ являются: 1) высокая стабильность как в яиофилиэованном состоянии, так и в растворе, 2) постоянный в течение нескольких десятков секунд световой сигнал, что позволяет использовать метод внутреннего стандарта и тем самым повышает правильность анализа, 3) меньшая по сравнению с известными растворимыми АТФ-реагентами чувствительность к органическим растворителям и детергентам, которые используют при подготовке анализируемых образцов. Минимальная концентрация АТФ в исходном образце, определяемая с помощью АТФ-реагента ИММОЛЮМ, составляет 10 нмоль/л. Измерения проводили методом

внутреннего стандарта на лтоминометре ЛБ-4А («КЛИМБИ», Россия) в трех повторностжх, рассчитывали среднее арифметическое (х) и стандартное отклонение (о). Полученные результаты - содержание АТФ в 1 мл крови или упакованных эритроцитов, либо в 10® нейтрофияов - усредняли по группам. Различия между средним по группам содержанием АТФ считали достоверными при значении Р < 0,05.

' Определение антнбнотнкочувствительностм крови больных бактериемией. На

примере крови здорового донора изучали различные способы разрушения немикробного АТФ: 1) обрабатывали кровь свежеприготовленными . растворами. NaI04 различной • концентрации в тритоне Х-100, 2) инкубировали кровь в течение 5 ч в питательных средах различного состава для культивирования микробных клеток, 3) проводили гемолиз, после чего восстанавливали осмомолярность добавлением питательных сред различного состава * для культивирования микробных клеток и инкубировали полученные образцы в течение S ч,

В кровь больных крыс, содержащую «идентифицированную микрофлору, добавляли 2-х часовую бульонную культуру клеток Escherichia coli (штамм LE392) до содержания на уровне 10* КОЕ/мл. Кровь подвергали гемолизу, после чего восстанавливали осмомодярностъ добавлением среды 2xLB. В аликвоты полученного образца вносили 1 и 5 ■• терапевтических доз (25 и 125 мкг/мя соответственно) ампициллина (пробы), либо равный объем физиологического раствора (контроль) и инкубировали в течение 5 ч при 37°С. В контроле и пробах через 3 и 5 ч инкубирования селективно разрушали немикробные и микробные клетки при помощи тритона Х-100 и ДМСО соответственно и в полученных экстрактах определяли концентрацию немикробного и микробного АТФ, как описано выше, на люминометре 1250 fLKB Wallac", Финляндия), а также количество микробных клеток методом посева разведений. Рассчитывали величины относительного подавления роста, микробных клеток (W) под действием антибиотика по содержанию в пробе и контроле микробного АТФ (1) или количеетваКОЕ (2).

Определение ОБО молока. Сырое молока ^ (5+10 мл) инкубировали в смеси , с ферментным препаратом (панкреатином или трипсином различных марок, мегатериноы, щелочной протеиназой, субгилизином, либо крабовой коллагеназой) я детергентом (тритоном Х-100, твином 20, 80, лубролом РХ, суяъфанолом, синтанодом ДС-10, либо неонолом-10) в 0,1 М Na-фосфат-цитрагном буфере, рН 7,2-8,0, при 42+50°С в течение 10+30 мин. Полученные образцы фильтровали при помощи шприца и фильтрационных

ячеек SWINNEX ("MUlipore", Франция) через мембранные фильтры: (GS и НА - из смешанных эфиров целлюлозы, SMI13 - нитроцеллюлозные, Sinpor и МФАС-ОС-2 - ацетат-целлюлозные, глубинные, МФФК-3 и МФФК-4 - фторопластовые гидрофобные, МФФКГ-3 и МФФКГ-4 - фторопластовые гидрофильные) с диаметром диска 13, 25, 45 мм: и размером пор 0,22, 0,45, 0,60, 0,80 мкм. Мембранные фильтры промывали неонолом-10 в физиологическом растворе, затем наслаивали 50 мМ раствор глюкозы и инкубировали в течение 10 мин при ЗГС. АТФ из бактериальных клеток, сконцентрированных на мембранных фильтрах, экстрагировали ДМСО.

В этих же условиях обрабатывали образцы молока, искусственно коктаминированные 4-х часовыми бульонными культурами Staphylococcus aureus (коллекция культур

ВНШФСГЭ), БГКП и Streptococcus; группы D (выделены из молока), Streptococcus

- ■

thermopbilus (производственный штамм IKC),

В полученных экстрактах определяли концентрацию бактериального АТФ, как описано выше. Количество колонеобразуюших единиц (КОЕ) в образцах определяли согласно ГОСТ 9225-84. По экспериментальным данным рассчитывали коэффициенты А, В уравнения линейной регрессии (3), коэффициенты корреляции (R,) между двумя методами определения обсемененности молока и остаточные стандартные отклонения (S^).

• lg(KOHH-бактерий)-A+Bxlg(ttOH4. бактериального АТФ) (3)

' Определение специфической обсемененносга мороженого или поверхностей технологического оборудования ЕГКЦ. Образцы мороженого (1 г) или смывы с 100 см1 поверхности технологического оборудования, чистые бульонные культуры Е,соИ и S.therjnophilus, либо смешанные бульонные культуры, состоящие из клеток E.coli и Bacillus svbtilis или Pseudomonas spp., инкубировали а питательных средах Briia-boulüon либо Lectose broth (Gieret", Германия) в течение б ч при 37°С. В хазе инкубирования отбирали аликвоты образцов и последовательно вносили в них раствор NalO« в тритоне Х-100, через 1 мин -глюкозу,; через 10 мин - ДМСО (конечные концентрадии 1 мМ, 0,05%, 25 мМ и 80% соответственно). В полученных экстрактах измеряли концентрацию бактериального АТФ, как описано выше.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В большинстве биологических образцов присутствует АТФ ю различных источников: соматических и бактериальных клеток, свободный или внеклеточный АТФ (рис.1).

немикробный АТФ"

/ / (мкМ) \ \

1 [ внеклеточный АТФ ">, 1 1'

у 1 '....... (пЩ / — ^Ч /

/ (микробный АТФ) /

Ч \ /* соматический А ТФ

(мкМ)- /

пул АТФ

Рисунок 1. Примерное распределение АТФ в биологическом образце.

Дм клинической микробиологии шперес представляет содержание в образцах соматического и микробного АТФ, для санитарной микробиологии - микробного АТФ и пула АТФ. Определение соматического АТФ является наиболее простым случаем в АТФ-мстрии. При этом микробный и внеклеточный АТФ, как правило, не мешают определению соматического АТФ. Определение микробного АТФ требует более сложной подготовки образна, назначение которой • полное удаление или разрушение немикробного АТФ, поскольку его содержание на несколько порядков превышает содержание микробного АТФ, Способы подготовки различных биологических образцов для определения целевого АТФ в клинической и санитарной микробиологии; разработанные к оптимизированные нами, изложены ниже.

1. БПОЛЮМИПЕСЦШШОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ;

ЦЕЛЕВОГО АТФ В КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

1.1, Определение соматического АТФ (АТФ форменных элементов крови) как показатели отдаленных во времени воздействий неблагоприятных внешних факторов.

Соматический АТФ, а именно АТФ из форменных элементов крови, используют в клинической микробиологии как показатель воздействия неблагоприятных внешних

факторов (ксенобиотиков, радиации, высокочастотного электромагнитного поля, быстро меняющейся температуры окружающей среды и т.д) на организм в целом. В данной работе ■впервые исследовано, как меняется содержание АТФ в различных форменных элементах крови под воздействием одного и того же неблагоприятного фактора, и как долго в них сохраняется отличное от нормы содержание АТФ. В исследовании; проведенном в 1993 г. в рамках Государственной программы «Семипалатинский полигон - Алтай», нами было определено содержание в АТФ нейтрофилах у жителей Алтайского края, проживающих в районах с различным уровнем РЗМ, вызванного проведением наземных ядерных испытаний на Семипалатинском ядерном полигоне в 1949+ 1962 гг.'Определение АТФ в нейтрофилах проводили в соответствии со схемой 1.

Схема I. Определение соматического АТФ в образце.

Предварительные модельные эксперименты на крысах, на которых воздействовали 'радиацией и/или ксенобиотиками, показали, что содержание АТФ в упакованных эритроцитах (наиболее легко выделяемой фракция клеток крови) возрастает в 1,8+5 раз относительно контроля под действием поражающих факторов. Однако к концу эксперимента содержание АТФ в упакованных эритроцитах было близко к контролю, а через 20 и 50 суток после прекращения поражающих воздействий • уже не отличалось от контроля. Содержание АТФ в нейтрофилах (наиболее многочисленной фракции лейкоцитов) через 20 и 50 суток после прекращения воздействия радиацией было в 1,3+3,4 раза выше, чем в контроле. Поскольку в нейтрофилах отличное от нормы содержание АТФ сохранялось достаточно долго, при обследовании жителей Алтайского края содержание АТФ определяли именно в нейтрофилах.

В группах обследованных было обнаружено повышение нижних и верхних границ диапазона изменения содержания АТФ в нейтрофилах относительно контроля (рис.2). Среднее по группе содержание АТФ в нейтрофилах коррелировало с уровнем РЗМ, причем эта зависимость была нелинейной. Повышение среднего по группе содержания АТФ в нейтрофилах относительно контроля было во всех случаях статистически достоверным.

Провезенные эксперименты показали, что уровень ЛТФ в неГггрофилах можно рассматривать как показатель метаболических изменений, вызванных отдаленными во времени поражающими воздействиями.

ю

в А

.2 0

Среднее по группе содержание АТФ, нмоль/Ю* нейтрофилов

В чал.

10 чел.

10 чел.

I 1

ГЧ

Педсосмово, контроль

Саратовца, мене» 0,36

Зеленая Дубрава, 0,15-1

0,1+3,3

1,6+7,8

Ох

8 чел.

_ Населенный пункт Топольное, м уровень РЗМ, За

свыше)

2,4+9,9

1,1««,9

Диапазон изменения содержания АТФ в нейтрофилах в групп» обследованных, нмоль/10* кейтрофилов

Рисунок 2. Содержание АТФ в нейтрофилах у женщин, проживающих в селах Алтайского края с различным уровнем РЗМ.

1.2. Определение микробного АТФ для опенки актнбивтнкочувствительноста • крови при бактериемии. Бактериемия - тяжелое инфекционное заболевание, при котором содержание микробных клеток в крови находится на уровне 10* кдУмл. При подготовке крови для биолюминесцентного определения антибиотикочувствнтелыюсти необходимо создать такие условия, при которых в образце одновременно происходило бы разрушение немикробного АТФ и рост микробных клеток. На примере крови здорового донора, не содержащей бактериальных клеток, мы сравнивали различные способы разрушения немикробного АТФ (рис.3). Оптимальным методом обработки крови оказалось воздействие осмотическим шоком (гемолиз) с последующим инкубированием гемолизированной крови в течение 5 ч в питательной среде для культивирования микробных клеток. Это позволило снизить концентрацию АТФ почти на 2 порядка (рис.3, кривая 4). Дополнительная обработка образца перед измерением АТФ раствором периодата натрия в тритоне Х-100 (I мМ и 0,01% в образце соответственно) снижала концентрацию АТФ еще в 1,3+1,5 раз

(рис.3, кривая б). Причем в этих условиях, как нами было показано в специальном

Рисунок 3. Кинетика разрушения - АТФ крови здорового донора в различных ; ' условиях: 1 - инкубирование в срезе 13; 2 - инкубирование в среде 1ЛЗ с 0,01% тритона Х-100; 3 - обработка образца1; раствором N¿10« в тритоне Х-100 (1 мМ и 0,01% в образце соответственно); 4- гемолиз в 10 объемах воды (30 мин, 37®С) с последующим инкубированием гемолиз ированной крови в среде ЬВ; 5 - гемолиз в 25 объемах воды (30 мин, 37°С) с последующим инкубированием гемолиз ированной крови в среде 1Л; б • обработка образца 4. раствором ИаЮ» в тритоне Х-100 (1 мМ ; и 0,01% в образце соответственно).

эксперименте с культурой клеток Е.соИ, не происходило ингибирования роста микробных клеток.

- Оптимизированная методика биолюмимееиеитного определения:

антибиотикочувствигельности крови при бактериемии без выделения из образца микробных клеток показана на схеме 2, В модельном эксперименте в кровь больной крысы, исходно обсемененную кендектифишгрованной микрофлорой, добавляли клетки К сои до содержания на уровне 104 КОЕ/мл - и анализировали образец в оптимизированных условиях в соответствии со схемой 2. определяя чувствительность микробных клеток к 1 и 5 терапевтическим дозам (25 и 125 мкг/мл соответственно) ампициллина (рис.4).

Через 3 ч инкубирования величины и (%), определенные биолюминесцентным Методом и методом посева разведений,' не совпадали (тжбл.1). Известно, что под действием 'ампициллина, (З-лакгамного антибиотика, некоторые микробные клетки, в частности Есой, превращаются в сферопласты.Сферопласты содержат АТФ, но не способны образовывать колонии на агаризованных питательных средах н не могут быть определены методом посева разведений. Через 5 ч инкубирования сферо пласты, вероятно, погибали, и величины и (%), определенные двумя методами, практически совпадали.

Ю

Схема 2. Определение антнбиотикочувствительности крови при бактериемии. биолюминесцентным методом в оптимизированных условиях.

1000 800 есю-|

400 200 -о

АТФ, пмольГмл

□ ±о □X

^ л .

Инкубировали», ч

Рисунок 4. Биолюминесцентное определение чувствительности к ампициллину микробных клеток в крови бальных крыс (исходное содержание (4,5±0,б)х 10*КОЕ/мл).

И

Таблица 1. Величины относительного подавления роста микробных клеток под действием антибиотика (11,%), определенные двумя методами.

Инкубирование, Ч Ампициллин, мкг/кл и,%

Биолюминесцентный метод Метод посева разведений!

3 25 25±5 83 ±5

125 55±5 8616

5 25 93±9 98±9

125 97±7 99i9

Таким образом, разработанная нами методика позволяет определять в течение б ч антибиотик очувствительносгь крови при бактериемии без выделения из образца микробных клеток. Такой экспресс-метод может иметь не только важное диагностическое, но и терапевтическое значение,

2. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВОГО АТФ В САНИТАРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

2.1,. Определение микробного-АТФ как показателя обшей бактериальной обсемененное»!. молока.. ОБО молока - один из показателей качества продукта,. определяющий совместно с такими показателями как жирность и содержание белка его йену непосредственно пря-сдаче-приемке-Продолжительность анализа ОБО молока методом разведений соответствии с. ГОСТ 9225-84 составляет 72 ч, поэтому экспресс-методы. представляют большую практическую значимость.

Биолюминесцентный метод является одним из наиболее перспективных среди экспресс-методов определения ОБО молока. Однако в молоке высокого санитарного качества содержание небактериального АТФ на 4+5 порядков выше, чем содержание бактериального АТФ. Фильтрование молока через бактериальные мембранные фильтры после разрушения соматических клеток и казеин-цитратч^осфат-кальциевых мицелл молока смесью детергента и протеиназы при повышенной: температуре позволяет удалять кебактериальный АТФ из образца к концентрировать бактерии на фильтрах. В литературе описано несколько модификаций биолюминесцентного метода определения ОБО молока, позволяющих устанавливать его класс в соответствии с ЮР (International Dairy Federation). Стандартом.,.Однако из-за сложности и вариабельности физико-химического состава молока, зависимости состава молочной микрофлоры от региона и способа производства молока, времени года и величины ОБО применение этик методик, как неоднократно

отмечалось в литературе, без их предварительной адаптации к свойствам молока - из конкретного региона производства и к .чувствительности используемых АТФ*реагеягов не позволяет определять величину ОБО молока с требуемой точностью. Как было отмечено выше, минимальная концентрация. АТФ. в исходном образце, определяемая с помощью АТФ-реагент ИММОЛГОМ, составляет 10 нмоль/л, что соответствует. содержанию в образце, приблизительно, 10й КОЕ/мл. Согласно ГОСТ 9225-44 и ГОР Стандарту в молоке необходимо определять. ОБО на уровне 10® КОЕ/мл. Для достоверного определения такого уровня ОБО необходимо, чтобы _ предел обнаружения - бактерий биолюминесцентным методом составлял,, по меньшей мере, 0,5x10' КОЕ/мл молока. Поэтому нами были оптимизированы условия фильтрования молока, производимого в Московской области, которые позволяют выделять на бактериальных мембранных фильтрах бактерии из 5+10 мл анализируемого образца.

. Для. разругавши белковых. мниелл молока мы сравнивали действие различных ферментных препаратов в смеси с тритоном Х-100 (0,5+1%). Наиболее пригодным оказался панкреатин медицинский («Микомс», Россия), после обработки которым (3300 ед/мл смеси) при рН 7,2+7,4 фильтровалось 5+10 мл молока через бактериальные мембранные фильтры. Однако тритон Х-100, как мы показали, разрушает- не только соматические, но и бактериальные клетки молока, поэтому нами были испытаны различные детергенты в смеси с панкреатином медицинским (табл.2).

Таблица 2. Влияние природы детергента на фильтруемость сырого молока и на бактериальные и соматические клетки молока.

Детергент Конечная концентрация в образце, % Фильтруемость пробы*' Выживаемость бактериальных клеток, % Разрушение соматических клеток, %

Луброл РХ-' 1,0 0.5 +/- 100 .5) -

Неонол-10 1,0 0,5- + + 100 100 83 75

Сиктанол ДС-10 1.0 0.5 +А 100 100 «

Сульфанол 1,0 - -

Твнн 20 1.0 0.5 +/- 100

Твин 80 1,0 0.5 +А 100

Тритон Х-100 1.0 0.5 + + 40 55 90 82

■ ■ 4.1 ■ —

*' Фкльтруемосгь: (+) - хорошая, (-) - отсутствует, (+/-) - зависит от партии молока, " Не определяли.

Наилучшие; результаты были получены при использовании детергента иеонол-10 * • (НПО «Нижнекамск», Россия), который при концентрациях 0,5+IV» в образце эффективно "разрушал соматические клетки молока,.но в отличие от тритона Х-100 не.влиял на

■ бактериальные клетки. Оптимальная температура обработки протеиназой и детергентом, как ' мы показали, составляет 45°С. При этом сохранялся высокий уровень внутриклеточного

бактериального АТФ, а молоко хорошо фильтровалось. Большое значение имеет материал, из которого изготовлен мембранный фильтр. Нами были испытаны мембранные фильтры пз

■ различных 'материалов с пороз ностью 0,22+0,8: мкм. Независимо от размера ^ гор на мембранных фильтрах удерживалось 95+99% бактерий, исходно присутствующих в образце. Однако от порозности мембранного фильтра зависел объем фильтруемого молока. Наиболее пригодными оказались фторопластовые гидрофильные мембранные фильтры МФФКГ-4 («Полимерсинтез», Россия) с размером пор 0,6 мкм. Они позволяют фильтровать без

' большого механического усилия: 5+10 мл молока после обработки детергентом и протеиназой, а также устойчивы к действию - ДМСО. Последующее инкубирование мембранного фильтра с бактериальными клетками в 50 мМ глюкозе в течение 10-мин, как мы показали, восстанавливает содержание внутриклеточного АТФ' после стрессового воздействия на клетки, вызванного обработкой молока.

В результате проведенных исследований нами была предложена оптимизированная методика биолюминесцентного определения ОБО молока С пределом обнаружения бактерий 0,5x10* КОЕ/мл и продолжительностью 30+35 мин на один образец (схема 3). Данная методика была- апробирована на образцах; стерилизованного молока,- искусственно контаминированных чистыми культурами основных представителей молочной микрофлоры: (рис.5).

Полученные зависимости между содержанием бактериального АТФ и количеством КОЕ, определенным методом-посева разведений по ГОСТ 9225-84, хорошо описываются: уравнением линейной регрессии (3). В,'.во всех случаях близки к 1, а величины характеризующие точность косвенного метода определения ОБО молока относительно прямого, невелики (табл.3). Поскольку данные культуры в сумме составляют 82+95% величины ОБО, по полученным данным была рассчитана теоретическая зависимость между -содержанием - бактериального АТФ и количеством КОЕ в сыром молоке (табл.3 и рис.5, прямая. 5). Эта зависимость оказалась близка к зависимостям, подученным для стрептококков (табл.3 и рис.5, прямые 3, 4), поскольку именно стрептококки - наиболее многочисленная группа бактерий в сыром молоке. •

Схема 3. Оптимизированная - методика: определения ОБО сырого молока биолюмннесиентным методом в оптимизированных условиях.

• 1 10 . КОЕ/МЛ

7 ' 10 . 3\

5 -10 . 1 ^

2 ^^^^^

1оз: АТФ. пмольУмл

0,1 1 10 - 100 1000<

Рисунок 5. Зависимость между концентрацией бактериального АТФ и количеством КОЕ в образцах молока, искусственно контаминированных чистыми культурами: БПСП(1),Лоитеиг(2), X (Ьепяер/Шиз (3), & Группы О (4), теоретическая зависимость (5).

И

Таблица J. Коэффициенты А и В уравнения (3), коэффициенты корреляции между биолюминесцентным методом и методом посевов разведений (R,),' остаточные стандартные отклонения (S^) и величины удельного содержания АТФ для чистых культур, теоретической смеси культур и сырого молока.

Культура А В R. V АТФ, моль/КОЕ

БПСП б,15±0,13 1,06±0,0б 0,98 0,13 (О.&^ОхЮ"'1

S,crureus 4,84±0,09 1,31 ±0,04 0,99 0,09 (12,0±8,1)х10'м

S.thermophilus 4,29±0,16 1,19±0,12 0.97 0,16 {35^±16,9)xl0""

S. труппы£> 4,3б±0,30 1,01 ±0,24 0.89 0,29 (42,5±U)xl0M

Теоретическая смесь культур 4,33 ±0,01 1,15±0,02 0,99 0,11 (34,5±13,0)х 10'"

Сырое молоко 4,55±0,07 1,13±0,0б 0,33 0,54 . (22,7±7,4)х101'*

Разработанная нами методика была успешно испытана для анализа 140 проб сырого молока, отобранных из молокопроводов, молоковозов и вымени здоровых коров в хозяйствах Московской области (табл.5 и рис.6).

Рисунок б. Зависимость между количеством КОЕ и содержанием бактериального АТФ в молоке: теоретическая зависимость (1), сырое молоко (2).

Полученная зависимость для сырого молока также хорошо описывается уравнением линейной регрессии (3): К* равен 0,83 (табл.3 н рис.6, прямая 2), ио величина 5,, оказалась существенно выше, чем в случае искусственно контаминированного молока. Необходимо отметить, -что для сырого молока количество КОБ методом посева разведений определяется с достаточно большой погрешностью, превосходящей погрешность биолюминесцентного метода определения бактериального АТФ (табл,4).

Таблица 4. Вариабельность определения количества КОЕ (метод посева разведений) и содержания бактериального АТФ (биолюминесцентный метод) в образцах сырого молока.

Метод Коэффициент вариации (CV), %

Сырое молоко Искусственно конта-минированное молоко

Определение количества КОЕ/мл молока по 4+6 чашкам 6+51 5+42

Параллельные измерения концентрации АТФ в экстракте одной пробы (с одного мембранного фильтра) 2+25 2+23

Параллельные измерения концентрации АТФ а экстрактах одного образца (с трех мембранных фильтров) 4+32 8+28

Это объясняется тем, что в молоке бактерии находятся, главным образом, в виде ассошатов, на _ что косвенно указывают. и рассчитанные нами величины удельного содержания АТФ для основных представителей микрофлоры молока (табл.3). Метод посева разведений по существу определяет не количество клеток в молоке, а их способность образовывать колонии на - агаризованиой питательной - среде. Кроме того, правила усреднения экспериментальных данных при подсчете количества колоний на чашках, принятые в ГОСТ 9225-34, также вносят погрешности. Точность метода посева разведений для молока н мяса составляет ±0,3+0,5 логарифмического порядка (Littel KJ., Piketis S., Spurgash A., 1986, J. of Food Protection), Однако из-за отсутствия другого прямого метода подсчета количества бактерий в молоке метод посева разведений, несмотря на его явные недостатки, по-прежнему используют в качестве эталонного при разработке любых косвенных методов определения OSO молока, в том числе и биолюминесценгного.

По экспериментальным данным, полученным для сырого молока, были определены интервалы содержания бактериального АТФ в молоке различных классов и предложена градунровочная таблица для определения класса молока биолюминесцентным методом (табл.5). Для образцов молока, отнесенных к высшему классу (ГОСТ 9225-84 с изменением N2 от 28.09.89) или к первому классу (ГОСТ 9225-84), результаты определения ОБО молока биолюмюсесцентным методом и методом посева разведений хорошо совпадают. Дня образцов молока, отнесенных к 1 классу (ГОСТ 9225-84 с изменением N2 от 28.09.89Х совпадение результатов сравнительно небольшое. Однако действующая редакция ГОСТ не учитывает точность определения ОБО молока методом посева разведений. Поэтому нами предложена другая классификация образцов молока, приближенная к IDF Стандарту в

' Таблица Л. Градуировочная таблица для определения класса сырого молока биолюминесцентным методом и сравнение результатов определения класса сырого молока двумя методами - биолюмииесцектным и посева разведений.

Содержание бактериального АТФ « молоке, пмоль/мл - Класс молока (тыс. КОЕ/мл) Количество образцов Совпадение результатов, полученных двумя методами, %

. В соответствии с ГОСТ 9225-84 с изменением N2 от 28.09.89

до 7 Высший (до 300) 69 76

7+10 1(300+500) 14 29

10+65 II (500+4000) 51 ■ 74

65+270 га(4000+20000) 14 43 --. ■

В соответствии с ГОСТ 9225-84

до 10 I (до 500) " 75' '' 81

10+65 П(500+4000) 51 74-

65+270 Ш(4000+20000) 14 43

Возможный вариант классификации, учитывающий точность определения ■ . .. количества КОЕ методом посева разведений.

ДОЗ Высший (до 100) 34 73

3+10 1(100+500) 43 60

10+65 ■ П (500+4000) ■■■■51'-;- 74-

65+270 Ш(4000+20000) 14 43

учитывающая особенности метода посева разведений применительнок такому объекту ках молоко (табл.5).

Предложенная методика сокращает время анализа ОБО молока, переводя его в резким реального времени, и позволяет получать более объективные характеристики санитарного качества продукта.

2.2. Определение • микробного АТФ как- показателя; специфическойс обсемеиенностк образцов бактериями' группы; кишечной палочки, (на примере мороженого и поверхностей технологического оборудования). Для санитарной микробиологии представляет интерес определение не только ОБО образца, но и его специфической обсемененности санитарио-показательиыми ~ микроорганизмами. В частости, в производстве продуктов питания необходимо особо контролировать присутствие БГКП, содержание которых строго лимитируется. Для этих целей исследуемый образец в соответствии с классическими микробиологическими методами инкубируют в селективных питательных средах, на которых хорошо растут БГКП, а рост бактерий других трупп подавляется. Длительность такого анализа по ГОСТ составляет 32 ч. Для сокращения

его продолжительное™ нами был применен биолюминесценпплй метод детекции БГКП после инкубирования образцов в селективной питательной среде Вгйа-ЬоиШоп. Было показано, что культура молочнокислого стрептококка при инкубировании в Вйа-ЬоиШоп полностью погибает в течение 4 ч, » то время как клетки Е.СОЙ хорошо растут в дайной среде. При инкубировании в Вп|а-ЬоиШоп смешанных культур, состоящих из клеток КсоН и большого избытка клеток В.тЬЯЬз либо Рзеи4отогка ц>р., в высевах на агарюованную питательную среду обнаруживали только колонии Е.со11 и Р1еисЬтопа зрр. Причем количество колоний КсоН было на порядок больше, чем количество колоний Р$акк>топа$ хрр. В таблице б показано, как меняется содержание АТФ из клеток КсоА' в ходе инкубирования смешанной культуры клеток К сои и ВлиЪйИз в ВгВа-ЬоиШоп.

Таблица 4 Содержание АТФ в образце при инкубировании в ВгВа-ЬоиШоп смешанной культуры клеток В.жЬяШ (исходное содержание - ]0! КОЕ/мл) и Е.соИ.

Исходное содержание клеток £. coll, КОЕ./мл Brila-bouHion Концентрация АТФ в образцу пмоль/мл

'4ч бч

10 0,04±0,12 0,6410,10

100 0,18±0,21 3.2±1,0

1000 33±2 53О±10О

Через Л ч инкубирования погрешность измерения АТФ при исходном содержании в образце клеток Rcoli на уроне 3 СМ-100 КОЕ/мл была велика, но через б ч инкубирования концентрацию АТФ из клеток Rcoli в образцах уже можно было измерять с высокой точностью. ... ...

Предложенная нами методика биолюминесцентного определения специфической обсемененносги БГКП для таких объектов как мороженое или смывы с поверхностей технологического оборудования (схема 4) позволяет определять менее 10 клеток E.eoli в мл образца на фоне большого избытка клеток других групп в течение б ч вместо 32 ч по методу посева разведений на селективную питательную среду.

На рисунке 7 показаны результаты определения обсемененносги мороженого БГКП биолюминесцентным методом в соответствии со схемой 4. Содержание АТФ в образцах мороженого при инкубировании в неселективной среде Lactose broth, в которой хорошо растут все представители молочной микрофлоры, пропорционально исходной ОБО, а при инкубировании в селективной среде Brila-boullion - исходной обсемененносги БГКП.

Сеема 4. Определение специфической обсемененносги - мороженого или поверхностей технологического оборудования БГКП.

ДТФ через в ч

инкубирования.

60 ■ пмаль/мл -

50 • Онвсвпекгманая

- 40 • среда Lactosa Broth 4

'свлмлмвная среда1 г

30 • Bdla-bouHkm

20 ■ 5

10- i «сходная обсеы«- '

Л

ОБО мета 100' 100. 1000 катюсп» морд«», ного, КОВ г

БГКП «пнм 10 INWt 10 шт м 10

Рисунок 7. Определение: обшей и специфической {БГКП) обсемененносги мороженого биолюминесцентным методом.

Таким образом, даже в условиях, когда ОБО образца в 100 раз выше, чем содержание БПСП, биолгоминесиентный метод позволяет определять именно санктарно-показательные микроорганизмы.

В таблице 7 показаны результаты определения БГКП в смывах с поверхностей технологического оборудования биолюминесцентным методом в соответствии со схемой 4.

Таблица 7. Определение БГКП на различных участках поверхности технологического оборудования биолюминесцентным методом.

Количество клеток БГКП, собранных с поверхности, КОЕ/ЮО см1 Общее количество клеток, собранных с поверхности, КОЕ/ЮО см14 Концентрация АТФ в образце, пмоль/мл

4 ч инкубирования б ч инкубирования

10 2x10* 1.7*0,1 5,5±0,1

30 . «104 : 2,5±0,5 . .

100 1С4 3,4±0,2 41,3±б,0

170 3,1±1,0 32,012,0

790 «10* - 22,5±2,5 -

104 106 111.0±30,0 240,0±20,0

1> Определено методом посева разведений на \ТШ-Аваг.

й Определено методом посева разведений на Модифицированную агаровую среду для определения ОБО молока и молочных продуктов.

Содержание АТФ в образце после 4 и б ч инкубирования в ВгЗа-ЬоиШоп было пропорционально исходной обсемененностц поверхности БГКП, но не пропорционально исходной ОБО поверхности. Это показывает, что в данной селективной среде росли только БПСП, но не иные микроорганизмы. Погрешность измерения концентрации АТФ в образцах, полученных даже с участков оборудования с низкой обсемененностью БПСП, не превышала 20%, что является вполне допустимым при определении микробной обсемененносш.

Данная методика была успешно апробирована в производственных условиях на фабрике фирмы Шёллер (Германия), производящей мороженое. Биолюмпнесцентный метод оказался даже более чувствительным, чем метод посева разведений.

выводы

1. На основании результатов биолюминесцентного определения содержания АТФ в эритроцитах и нейтрофилах крыс, подвергавшихся действию ионизирующего излучения и/или ксенобиотиков, а также определения содержания АТФ в цельной крови и нейтрофилах женщин, проживающих на территориях Алтайского края с радионукяндным загрязнением местности, сделан вывод, что уровень АТФ в, нейтрофилах можно рассматривать как показатель метаболических изменений, вызванных отдаленными. во . времени поражающими воздействиями.

2. Разработан биолюминесцентный . экспресс-метод (6-ч тест) определения антибиотикочувсгвительности крови при бактериемии, который не требует выделения из образца чистой культуры микробных клеток. Метод основан на разрушении немнкробного АТФ в крови путем гемолиза с последующим инкубированием гемолизированной крови в течение 5 ч в питательной среде в присутствии (проба) и в отсутствии (контроль) антибиотика н сравнении содержания АТФ в пробе и контроле.

3. Оптимизирован биолюминесцентный экспресс-метод (30*35 мин на один образец) определения ' ОБО : сырого молока (предел обнаружения 0,5x105 КОЕ/мл молока) и предложена методика, которая основана: на использования реактивов и материалов преимущественно отечественного производства. Метод включает обработшу молока смесью детергента и ферментного препарата, неон ала-10 и панкреатина медицинского, при повышенной температуре, удаление небактериального. АТФ фильтрованием через бактериальный мембранный фильтр и. биолюмкнесцентное определение бактериального АТФ. Показана высокая степень совпадения результатов, полученных биолюминесцентным методом и методом посева разведений, как для чистых культур основных представителей микрофлоры молока (1*5=0,89+0,99, Е^О.ОЭД^Х так и для сырого сборного молока

. (Кз»0,83, 8^-0,54), Для молока, производимого в Московской области, получена трассировочная таблица, которая позволяет определять по содержанию бактериального АТФ в образце класс сырого молока в соответствии с ГОСТ 9225-34 с изменением N2 от 23.09.39. Данная методика была утверждена в виде МЕТОДИЧЕСКИХ РЕКОМЕНДАЦИЙ на заседании Отделения ветеринарной медицины РАСХН 11.11,93 г.

4. Показана возможность быстрого, в течение 4+6 ч, определения специфической обсемененности мороженого и поверхностей технологического оборудования БГКП (1+10 КОЕ/мл на фоне большого избытка микроорганизмов других трупп) при - помощи. биолюминесценции. Предложенная методика основана на использовании селективной

питательной среды Brila-bouffion, в которой развиваются преимущественно клетки БГКП, с последующим определением их количества в полученном образце биояюминесшнгным методом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Froundjian V.G. The influence of unfavorable factors (radiation and/or xenobiotics) on ATP* content in blood. // International Conference on Clinical ChemiJuminescence, 1994, Berlin: Abstracts, PB-13.

2. Froundjian V.G., Brovko L.Yu., Ugarova M.N. Determination of antibiotic susceptibility of bacteria in blood using bioluminescence. 8th International Symposium on Biotura. and ChemOum., 1994, Cambridge: Abstracts. // J. Bioluminescence Chemiluminescence. 1994. V.9. N.5 P.338,

3. Froundjian V.O., Brovko L.Yu., Ugarova N.N. Determination of antibiotic susceptibility of bacteria in blood using bioluminescence, la: Proceedings of the 8th International Symposium on Biolum. and Chemilum. «Bioluminescence and Chemiluminescence. Fundamentals and Applied Aspects», 1994, Cambridge. / Eds. Campbell A.K., Kricka L.J., Stanley P.I.; J.Wiley & Sons, 1994. P.431-433.

4. Romanova N.A., Froundjian V.G., Ugarova N.N. Selective detection of coff-form cells by bioluminescent method. 8th International Symposium on Biolum, and Chemilum., 1994, Cambridge: Abstracts. //J, Bioluminescence Chemiluminescence. 1994. V.9, N.5 P.338. '

5. Romanova N.A., Froundjian V.G., Ugarova N.N, Selective detection of coli-form cells by bioluminescent method In: Proceedings of the 8th International Symposium on Biolum. and Chemilum. «Bioluminescence and Chemiluminescence. Fundamentals and Applied Aspects», 1994, Cambridge, t Eds, Campbell AJL, Kricka L.J., Stanley P.L: J.Wiley & Sons, 1994. P.434-437.

6. Фрунджян В.Г., Бровко Л.Ю., Романова H.A., Угарова HJL. Биолюминесцентный микроанализ для нужд сельского хозяйства. Международная научно-практическая конференция «Медико-биологические " проблемы экологической безопасности агропромышленного комплекса», 1996, Сергиев Посад. // В сб. «Проблемы экологической безопасности агропромышленного комплекса». Вып.2.1996. С.77-85.

7. Бровко Л.Ю., Романова Н.А., Фрунджян ВТ., Угарова НЛ Способ количественного определения микробной обсемененности биологического жидкого образца. Патент РФ N2061045 от 27.05.96.

8. Фрунджян В.Г., Романова Н.А., Дементьева Е.И., Бровко Л.Ю., Угарова Н.Н, и др. Содержание АТФ в нейтрофилах и цельной крови у населения Алтайского края, проживающего в районах с радионуклидным загрязнением. // Радиационная биология радиоэкология. 1997. Т.37. Вып. 1.С. 13-19.

9. Фрунджян В.Г., Бровко Л.Ю., Угарова Н.Н, Б ко люминесцентный метод определения антибиотнкочувствигельности септической крови. И Прикладная биохимия микробиология. 1997. Т.ЗЗ. N.4. С.455-460.

10. Фрунджян В.Г., Бабунова B.C., Бровко Л.Ю., Карташова В.М., Угарова Н.Н. Биолюминесцентное определение общей бактериальной обсемененности сырого молока. И Молочная промышленность. 1998, N6. С.38-39.

11. Froundjian V.G., Brovko LiYu., Romanova N. A, Ugarova N.N. Biolunmescent express assay of microbial contaminations. // International Conference «BIOCATALYSIS-98», 1998, Puschino on Oka, Russia: Abstracts, P.34,

12. Froundjian V.G., Brovko L.Yu., Ugarova N.N, Bioluminescent assay of bacteriological quality of raw milk. 10th Internationa] Symposium on Biotum. am) Chemilma, 1998, Bologna: Abstracts. // I Btotuminescence Chemiluminescence. 1998. V.13. N.4. P.216.

1$. Froundjian V.G., Brovko L.Yu., Ugarova N.N. Biotuminescent assay of bacteriological quality of raw milk. In: Proceedings of the 10th International Symposium on Biolum. and СЬешОшп. «Bioluminescence and Chemiluminescence. Perspectives for the 21 Century», 1998, Bologna. / Eds. Campbell A.K., Kricka ]LJ., StanJey P.I.: J.Wiley & Sons, 1998. P. 161-164.

14. Фрунджян ВТ., Бабунова B.C., Б ровно Л.Ю., Карташоаа В.М., Угарова Н.Н. Биолюминесцентный метод определения обшей бактериальной обсемененности сырого молока.//Прикладная биохимия микробиология. 1999, Т.35. N.3.C.1-7.

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ■

АТФ аденоэинтрифосфат*

АЫФ - аденозинмонофосфат ....

БГКП - .бактерии группы кишечной палочки

ДМСО - диметилсульфохснд

Зв - Зиверт

КОЕ - колонеобразующая единица

ОБО ' ' - общая бактериальная обсемененность

РЭМ . радионуклидное загрязнение местности

Т.Д. - терапевтическая доза

СУ - ' коэффициент вариации

В. - коэффициент корреляции

> *' - остаточное стандартное отклонение

- величина относительного подавления роста микробных клеток под действием антибиотика '

Подписано в печать 1ШШ9 г. Заказ N 2109. Тираж 100 экз. Отпечатано на ризографе " ОНТИ ГЕОХВ РАН

, \