Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение плазмидной ДНК и изучение плазмидного набора возбудителей дизентерии Зонне и Флекснера

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение плазмидной ДНК и изучение плазмидного набора возбудителей дизентерии Зонне и Флекснера"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАНК • НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И

Р Г Б ОД сывороток им. и.и. Мечникова

• 3 МАЙ ГСМ

На правах рукописи

Ба Тьерно Амаду Тинка

улк 618.935 576.8.095.5.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК И ИЗУЧЕНИЕ ПЛЙЗМИДН0Г0 НАБОРА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ДИЗЕНТЕРИИ ЗОННЕ И ФЛЕКСНЕРА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной эпидемиологии Московской медицинской академии им. U.M. Сеченова

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Г.Д. Каминский

Научный консультант:

академик РАМН и ЙЕН. доктор медицинских наук, профессор В.Д. Беляков

Официальные оппоненты: профессор, доктор медицинских наук

В.Г. Лиходед, доктор медицинских наук Ю.А. Ратинер

Ведущая организация: Московский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Защита состоится "26" мая 1994 г. в "14" часов на заседании Диссертационного совета Д-001.38.01 в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

С диссертацией моано ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан "26" апреля 1994 г.

Вченый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Н.Г. Кудрявцева

обцйя характеристика работы

Актуальность темы. Иигеллезы, вызванные бактериями Зонне и Флекснера, являются опасными инфекционными заболеваниями, распространенными в странах Европы, Америки и Африки, Они характеризуются разнообразием клинических Форм и значительной частотой осложнений. Данные инфекции представляются слабоуправляемыми, трудно поддающимися как эпидемиологическому контролю, так и эпидемиологическому наблюдению.

Не достаточно решены вопросы, связанные с обнаруаением штаммов иигелл в высевах из организма людей. Очень высока потребность в разработках диагностических реагентов нового типа, позволяющих как обнаруживать колонии иигелл на средах, так и определять присутствие бактериального материала в полимеразной цепной реакции.

В последние годы проведен ряд работ по изучению микробиологии и эпидемиологии яигеллезов на основании анализов выделенных штаммов по профилю плазмидной ДНК. Однако до сих пор не ясно, присутствие каких плазмид обязательно для мигелл Зонне и Флекснера как биологических видов, а какие плазмиды характеризуются вариабельностью и могут быть использованы как эпидемиологические маркеры. Не решена задача эффективного выделения плазмиды вирулентности размером 180 тысяч пар оснований Ст.п.о.).

Прояснение этих проблем имеет существенное значение как для молекулярной эпидемиологии, так и для диагностики иигеллезов.

Цель работы: оптимизация методов выделения и изучение плазмидной ДНК возбудителей дизентерии Зонне и Флекснера, обнаружение закономерностей и выявление особенностей в отноиении состава их плазмид.

Задачи работы: 1) сравнительный анализ эффективности выделения крупномолекулярной плазмидной ДНК из неочиценннх и очинённых це-лочных лизатов,

2) получение плазмидограмм коллекционных штаммов иигелл Зонне и Флекснера, выделенных в различных географических зонах и в различные сроки,

3) группировка плазмид шигелл Зонне и Флекснера на основании схожести их молекулярных масс,

4) сопоставление штаммов шигелл Зонне и Флекснера по состава их плазмид,

5) выявление штаммов Зонне и Флекснера с "минимальным" плазмидным набором как возможных источников плазмидного материала с цельи получения зондов для обнаружения шигелл.

Научная новизна. Впервые определен профиль коллекционных штаммов Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. fl.fi. Тарасевича, в том числе эталонных штаммов различных подтипов шигелл Флекснера. Подтверждено потенциальное сходство плазмидного состава штаммов, выделенных в разные десятилетия.Охарактеризованы диапазоны колебания количества плазмид на клетку, описаны группы плазмид по степени близости их молекулярных масс, дифференцированы полиплазмидные и од-ноплазмидные втаммы. Доказана возможность гибридизации малой плазмиды шигелл Флекснера 3,5 т.п.о. с тотальной ДНК штаммов шигелл Зонне. Оптимизированы условия для выделения крупномолекулярных плазмид вирулентности шигелл.

Практическое значение. Работа имеет значение для понимания принципов организации генома шигелл Зонне и Флекснера, выявления его стабильных и вариабельных частей. Оптимизированные условия для выделения плазмид вирулентности важны для генно-инженерных работ и работ по генетическому типированию. Обнаруженные одноплазмидные штаммы шигелл Зонне и Флекснера являются удобными источниками получения плазмидного материала для подробного изучения и применения в диагностике.

Результаты работы определяют направления дальнейших исследований плазмид в ракурсе клональной концепции в качестве эпидемиологических маркеров.

Положения, выносимые на защиту:

- существование в клетках шигелл Зонне и Флекснера 4 групп плазмидной ДНК на основании степени близости их молекулярных масс: плазмиды малой, средней, большой и очень большой молекулярной массы;

- существование полиплазмидных и одноплазмидных изолятов шигелл

Зонне и Флекснера;

- наличие штампов шигелл Зонне II фаза Linde и шигелл Флекснера 232078 с одной плазмидой малой молекулярной массы, которая мояет быть получена классическими методами выделения ДНК:

- отнесение иигелл Зонне и Флекснера к биологическим видам с постоянным присутствием плазмид, а плазмид малой молекулярной массы на основании их существования у всех изученных изолятов, в том числе одноплазмидных штаммов, - к категории "обязательных" плазмид;

- возмовность использования "обязательных" плазмид в качестве потенциальных источников для получения зондов, гибриди-эующихся с ДНК иигелл.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 20 оригинальными фотографиями, отравающими плазмидные портреты штаммов шигелл Зонне и Флекснера, полученными с использованием различных методов выделения ДНК.

Апробация работы. Работа доловена на совместном заседании научных сотрудников и преподавателей подразделений ММЙ им. И.М. Сеченова и НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. Плазмидограммы коллекционных штаммов шигелл Зонне и Флекснера сданы в Государственный институт стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.ñ. Тарасевича и демонстрируются на лекциях по молекулярной эпидемиологии в MMft им. И.М. Сеченова. Оформлено и сдано в ГИСК им. Л.й. Тарасевича "Приловение к методическому письму по определению колицинагенных типов шигелл Зонне". Опубликована 1 статья в Нурнале микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Исследованы коллекционные штаммы шигелл Зонне и Флекснера Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов СГИСК) им. Л.А.Тарасевича, Московского научно-исследовательского института вакцин и сывороток (НИВС) им. И.И.Мечникова, а также иэогенные штаммы шигелл Зонне I фазы I-94I-HP (вирулентный в кератоконъюнктивальной пробе) и

I-94I-HP-I8 Кв (авирулентный в кератоконъвнктивальной пробе). Кроне того, использовали штаммы кишечной палочки, несуцие плазмиды RP4 и R40A, а также безплазмидные втаммы С600 и КЗ?, Характеристики втаммов даны в таблицах 1 и 2.

Использовали L-бульон, L-arap, бульон Хоттингера и агар Хоттин-гера. 1таммы вигелл Зонне I фазы I-94I-HP-I8 Кж культивировали в присутствии SO мкг/мл канамицина. Выращивание бактерий в жидкой питательной среде осуществляли без встряхивания (аэрации).

Iтаимы хранили в лиофильно высуженном состоянии и "оживляли" по стандартной методике. Для этого разведенную в 0,83% растворе хлорида натрия лиофильную культуру засевали на 2,5 часа в 5 мл бульона и делали висев на чавки, которые инкубировали 18 часов. Типичную колонию S-формы отбирали и засевали в 5 мл бульона на 18 часов. Из верхнего слоя 0,5 мл переносили в новую пробирку с бульоном. которую инкубировали б часов, после чего из верхнего слоя делали высев в чаики. Полученную таким образом культуру считали полностью восстановленной,

Чавки просматривали в косопроходящем свете. Типичные колонии (характерные для нигелл Зонне или Флекснера) отбирали, засевали на 0 часов в 5 мл бульона, после чего делали высев на чавки. Материал с чавек использовался сразу для лизиса бактериальной массы или для получения жидких бульонных культур с последующим осаждением и лизисом.

Скрининг плазмидной ДНК в втаммах вигелл Зонне и Флекснера проводили по методу С. Kado, S.T. Liu (1981). Для лизиса использовали бактериальную массу, выращенную на плотной питательной среде. Б каждом втамме определяли присутствие плазмид малой (2-4 т.п.о.), средней (4-15 т.п.о.), больвой (15-150 т.п.о.) и очень больвой ( более 150 т.п.о.) молекулярных масс.

Для более детального изучения малых плазмид в итаммах вигелл Зонне и Флекснера их выделяли по 3. godson, D. Vapnek (1973), а также по С. Kado, S.T. Liu (1981) с последующим осаждением спир-V том. Препаративное получение мелких плазмид осуществляли по Н. BirnboiB (1983).

Получение крупных плазмид в неочищенных и частично очищенных щелочных лизатах проводили по разработанной нами с участием

О.В.Емианова модифицированной методике. Достигали эффективного лизиса бактерий вне лднок агарозного геля щелочной лизирующей смесью, содеряащей неионный детергент Тритон X 100. Лизат вносили в лунки агарозного геля.

Исследовали аналогично полученные лизаты, однократно обработанные смесью фенол-хлороформ, а также лизаты, очищенные двухкратной обработкой этой смесью с последующим переосаядением спиртом.

Для получения неочищенных и частично очищенных лизатов использовали ранне-стационарные яидкие бульонные культуры.

Электрофорез проводили в течение 45 минут при напряжении 10 В/см и 5 часов при напряжении 20 В/см в 0,72 агарозном геле (тип 2, Sigma). Окрашенные бромидом этидия гели фотографировали в УФ сете трансиллюминатора с использованием красного светофильтра.

В качестве внутреннего контроля и для получения реперных плаз-мид применяли штаммы шигелл Зонне 1—941—HP II фаза (2.5; 4,9: 6,0; 90 т.п.о.), I фаза (дополнительно 180 т.п.о.), штаммы кишечной палочки, содержащие плаэмиды RP4 (57 т.п.о.). R40A (150 т.п.о.). Молекулярную массу плазмид определяли по формуле:

Мол. масса плазмиды = мол. масса репера

Для вычисления использовали ближайший к плазмиде репер. Определение молекулярных масс плазмид производили по результатам двух независимых выделений. Итоговую молекулярную массу плазмиды находили как среднюю квадратическую по двум форезам, равную корню квадратному из произведения двух молекулярных масс, полученных при каадом из форезов:

пробег репера

пробег плазмиды

1/2

Введение в плаэмидную ДНК биотиновой метки проводили по H.H. Вейко ( 1989 ) и В.П. Вейко (1991).

Тотальную ДНК из клеток шигелл Зонне, Флекснера и кишечной па-

j

лочки выделяли после предварительной обработки осадков бульонной культуры протеиназой К (Merk) в присутствии ионного детергента 1 X додецилсульфата натрия.

Дот- гибридизацию меченой плазмидной ДНК с тотальной ДНК вигелл Зонне и Флекснера ставили, как описано в работе Л.В. Урываева и др. (1930) в условиях малой и больной жесткости. Использовали нитроцеллвлозные фильтры "Schleicher and Schuele" ВА-83 с диаметром пар 0,2 мкм. Для детекции применяли конъвгат стрептавидин-ще-лочная фосфатаза, обработку которым проводили в течение 15 минут. Оценку гибридизации осуществляли визуально. В качестве контроля использовали ДНК бесплазмидных штаммов Е, coli С600 и К37.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ЩЕЛОЧНЫХ ЛИЗАТОВ

Показано, что крупномолекулярные плазмиды ыигелл Зонне представляют собой ДНК-белковые релаксационные комплексы, чрезвычайно чувствительные к различным воздействия*, применяемым для разрушения хромосомальной ДНК С Г.Д.Каминский. М.А. Крупенко, 1989). Представлялось необходимым проверить возможность высвобождения крупномолекулярных плазмид вигелл Зонне под действием электрического поля без предварительного избавления от бактериальной хромосомы.

В литературе описано несколько методов лизиса бактерий в лунках агарозного геля с последующим электрофорезом Eckhardt Т. (1978), Bldwell 2.1. et. al. (1981). Зстановлено, что применительно к нигеллам Зонне данные методы малоэффективны, так как получить хороший лизис в лунках геля не представляется возможным. Поэтому были подобраны химические и физические условия для проведения лизиса бактерий вне лунок. Наиболее критическими факторами, способствующими увеличению выхода ДНК, были: 1) использование неионного детергента Тритона-ХЮО концентрация 1X; 2) доведение pH лизирувией смеси строго до 12,6. Полученный таким образом лизат мог быть спокойно перенесен в лунку агарозного геля. Последующий электрофорез показывает отсутствие дополнительного фрагментирования ДНК и появления полос хромосомальной ДНК в районе молекулярных масс 20-30 т.п.о. (рис.1).

ЯМА рБЗ 2,5

рББ 4.9 РЙ5 б.О

рБЭ 90 180

Рис. 1 Схематическое изображение электрофореграммн тотальной плаз-мидной ДНК. 31ое11а зоппе1 1-Э41-НР-18 Кш I Фаза

1 - неочищенный

лизат

2 - очищенный

лизат СЬг - хромосома

Проведено сравнительное изучение выхода крупномолекулярной плазмидной ДНК шигелл Зонне I—941-HP и I-Э4I—HP—I8 Кш 1 фазы при нанесении неочищенных и частично очищенных лизатов. Видно, что очистка лизатов приводит к тому, что полосы плазмидной ДНК становятся более ровными, что связано, по-видимому, с депротеинизацией плазмид. Однако молярное соотношение ДНК плазмид различной молекулярной массы несколько изменяется (рис.1). В неочищенных лизатах по интенсивности флюоресценции отчетливо доминирует плазмида боль-вой молекулярной кассы 180 т.п.о. В очищенных лизатах обнаруживаются плазмиды малого размера и плазмида 90 т.п.о., уменьшается количество РНК.

Установлено также, что при проведении лизиса вне лунок, объем вносимого лизата может быть значительно увеличен без заметного ухудшения выхода плазмидной ДНК. Показано, что электрофорез неочищенных лизатов позволяет получить высокий выход плазмиды вирулентности 180 т.п.о. В то же время подобранные условия лизиса даит возможность получать стабильные результаты с высоким выходом крупной плазмиды как в неочищенных лизатах.так и в условиях частичной очистки, причем прогревания лизатов (в отличии от метода С. Kado и S.T. Liu, 1981) не требуется. В предложенном варианте крупномолекулярная плазмидная ДНК подвергается минимальному набору факторов повреждающего воздействия.

Впервые доказаны преимущества осуществления контролируемого лизиса бактериальных клеток с оценкой эффективности лизиса непосредственно по электрофорезу. При достижении удовлетворительных результатов в неочищенных лизатах может быть осуществлена их дополнительная очистка с целью получения препаратов, используемых для рестрикции.

Полученные данные важны как для изучения свойств плазмиды вирулентности 180 т.п.о., так и ее анализа и гибридизации.

ИЗУЧЕНИЕ НАБОРА ПЛАЗМИД ШТАММОВ ШИГЕЛЛ ЗОННЕ.

К настоящему времени опубликован ряд работ по изучению плазмид-ного профиля штаммов шигелл Зонне. Предприняты попытки классификации типов плазмидных профилей. И.А. Настичкин (1988) предлагает

Таблица 1.

Штаммы нигелл Зонне, использованные в работе

NN Наиме- Номера тех яе Нчремдение или страна. Год

пп нование втаммов в других из которой получен выде-

втаммов коллекциях. итамм *) ления

(ГИСК) характеристики птамма

1 233181 750 колициногенотип 1 ГИСК. Москва 1969

2 233162 501 колициногенотип 2 ГИСК, Москва 1969

3 233163 9271 колициногенотип 3 ГИСК, Москва 1969

4 233164 552 колициногенотип 4 ГИСК, Москва 1969

5 233165 575 колициногенотип 5 ГИСК. Москва 1969

6 233166 17868 колициногенотип 6 ГИСК. Москва 1969

? 233062 30 ГИСК, Москва 1962

8 233030 3221 ГИСК. Москва 1963

9 233031 35/2 ГИСК. Москва 1963

10 233169 Sfora НИИВС, Москва 1971

И 233015 5116 НИИЭМ, Хабаровск 1957

12 233015 20045 Венгрия НИИЗМ, Москва 1982

13 233067 9090 1962

14 233002 2941 Институт Листера,Лондон 1969

15 233130 1188 НИИВС, Тбилиси 1964

16 233005 396 ГИСК. Москва 1944

1? 1-941- HP I Фаза НИИЭМ. Москва -

18 _ 1-941- HP 11 фаза НИИЗМ. Москва -

19 1-941 — HP 18 Ки НИИЗМ. Москва -

20 Linde II Фаза НИИВС. Москва -

*) ГИСК. Москва - Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасе-вича.

НИИВС. Москва -НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН НИИЗМ, Москва -НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

подразделять их на основании анализа количества крупномоликулярных плазмид (штамми с одной, двумя и тремя крупномолекулярными плаэми-дами). В иностранной литературе отмечена вариабельность набора плазмид малых молекулярных масс (LUuin С.M., 1991). Однако типы плазмидных профилей по результатам исследования малых и средних плазмид не достаточно ясны. Представится заманчивым выяснить , моает ли анализ малых и средних плазмид обеспечить детальную дифференциацию штаммов, однотипных по содерианию крупных плазмид. Не установлено, какие мелкие плазмиды являются ооязательными для нигелл Зонне как биологического вида.

Изучение плазмидных профилей штаммов шигелл Зонне проводили на трех группах штаммов: 1) коллекция для колициногенотипирования ши-гелл Зонне Н.И. Кошановой. 2) коллекционные штаммы шигелл Зонне ГИСК, 3) штамм Shigella sonne i Linde l! Фаза. Shigella sonnei 1—941-HP I фаза, I-94I-HP II Фаза. I-941-HP -18 Km 1 фаза (см. табл. 1).

У всех штаммов S. Sonnei типов 1 - 6 (коллекция Н.И. Кошановой, ГИСК) достигнута четкая визуализация суперскрученных форм плазмид-ной ДНК различной молекулярной массы (штаммы 1 - 6 ) на рис.2. Исключение составил штамм S. sonnei тип 2, у которого отсутствовали малые плазмиды, но закономерно выявлялись минорные полосы в области 4,5 т.п.о. Поэтому из данного штамма плазмидную ДНК выделяли такяе по методу Godson, D. Uapnek (1973). что позволило визуализировать плазмиду 2,5 т.п.о. Минорные полосы, наиболее четко представленные на "ночных" электрофореграммах, следует считать ее открытыми формами.

У итамма Shigella sonnei тип I найдены плазмиды 115; 6,8; 2,3 т.п.о. У итамма S. sonnei тип 2 - 115; 5,1; 2,5 т.п.о. 9 итамма S. Sonnei тип 3 - 115; 7,7; 5,1; 2,6 т.п.о, У штамма S. sonnei тип 4 - 5,7; 5.1; 2,3; 2,1 т.п.о. У отанма S. sonnei тип 5 - 115; 5,1; 2.3 т.п.о. 9 итамма S. sonnei тип 6 - 6,3; 2,3 т.п.о.

Таким образом, все 6 видов исследованных штаммов, характеризую-*их спектр популяции по способности к продукции бактериоцинов, отличаются по плазмидному набору. Данные штаммы имеют шероховатые колонии, у них отсутствует плазмида вирулентности 180 т.п.о. Обцим свойством всех исследованных культур является наличие плазмид в

Р.!1-, I

1?4вА I II I

I

1 I I I

г I I \

ъ I I I I

\ II I I

5 I I I

е I I

-4-(-»-(-М-»--(-1-

л (Л -о > го 71Г1Г)

3 ° О Ьа о л ^ 1-ч.и.

Рис. 2. Плазмидный профиль коллекции Н. И. Кошановой, ['ИСК. IЧР.Р

1-э41-иф 1 ! 1 1

Й40Й 1 II

233062 1 I 1

233030 1 1 11 !'

233031 1 1 11 1

233169 1 1! , 1

233015 1 1 III . I П

20045 I 1 1 |

233067 1 | 1 1 1 1 1

233002 | ' , 1 1

233130 | | 1

233005 | 1 | 1 1 1

[*Р 1 1 1 ■ 1 '

1-941-1 ф 1 1 1 1 1

I-»—I-1-V-»-«-■-1-1-1-»—1-1-1-1-

О 180Ю0 60 9 8^6 '3 4 I * и ¡5 И И И т. по

Рис. 2. Плазмидный профиль коллекционных штаммов шигелл Зонне.

области 2.1 - 2,5 т.п.о. Можно полагать, что эта группа плаэыид характерна для вида шигелл Зонне в целом.

В штаммах S. sonnei типа 1. 2, 3, 5 имеется плазмида 115 т. п.о., то есть плазмида большой молекулярной массы. Эта плазмида может являться фрагментом плазмиды вирулентности 180 т.п.о. или представлять собой трансмиссивный репликон. доминировавший в популяции в момент сбора штаммов.

Обнаружено, что штамм S. sonne! тип 6, не продуцирующий тестируемых бактериоцинов, имеет всего две плазмиды 6,3 т.п.о. и 2,3 т. п.о. Подобный плазмидный набор являлся минимальным для изученных итаммов. Позтому данный штамм был рекомендован в качестве реципи-ентного для передачи различных плазмид, в том числе бактериоцино-генности в клетки шигелл (Прилояение к методическому письму по определение бактериоцинотипов шигелл Зонне (ГИСК), 1993). Изученные итаммы являются охарактеризованными природными источниками плазмид Зактериоциногенности.

Таким образом, по результатам анализа набора штаммов для коли-динотипирования шигелл Зонне установлено, что в пределах данного исследования "минимальный" плазмидный профиль включает 2 плазмиды. 5азмер наименьшей из плазмид моает равняться у разных штаммов 2,1; 2,3; 2.5; 2,6 т.п.о. Подтверждено, что популяция шигелл Зонне в 5онце 60-х годов была представлена штаммами, соответствующими по :труктуре плазмидного набора наблюдаемый ныне изолятам.

Схематическое изобраяение плазмидного профиля штаммов коллекции 1.И.Кошановой дано на рис.2.

Исследованию подвергались коллекционные штаммы ГИСК разных мест ! времени выделения. Эти штаммы по времени выделения распадались ia 3 группы: 1) штаммы 40-х - 50-х годов (Лондон - 233002, Москва • 233005, Хабаровск - 233015); 2) штаммы 60-х годов (233062, 133030, 233031, 23306?, 233130); 3) итаммы ?0-х - 80-х годов 233169, 20045). Распределения плазмид этих штаммов даны на рис.3.

В штамме 233002 (Лондон) найдены плазмиды 100; 6,0; 2,6; 2,2 .п.о., а в штамме 233005 (Москва) - 100; 60; 5,5; 5.0; 2,55; 2,3; .2 т.п.о. Эти итаммы 40-х годов не отличаются суиественно по труктуре плазмидного профиля от штаммов 70-30-х годов. В то ае ремя штамм 233015 (НИИЭМ, Хабаровск, 1357) имел плазмиды 180;

100; 7,2; 6,0; 5.1; 4.3; 2.5; 2,4; 2.3 т.п.о., то есть имел- 9 плазмидных полос. Существенно, что данный штамм несет сохраненную плаэмиду вирулентности 180 т.п.о.

Штаммы 60-х годов, выделенные в г. Москве, имеют близкую плаз-миднуга структуру, которая представлена 1-2 мелкими плазмидами, 2 плазмидами средней молекулярной массы и 2 крупномолекулярными плазмидами. Видно, что плаэмидный профиль этих штаммов близок профилю штамма НИИЗМ им. Н.Ф. Гамалеи СI-941—HP ), полученного из итамма 1-941 Горьковского НИИ микробиологии и эпидемиологии (г. Нивний Новгород). Несколько отличный плазмидный профиль имеет штамм 233130, выделенный в г. Тбилиси в 1964 году, не несущий второй плазмиды средней молекулярной массы - 2.3; 4,9; 100; 180 т.п.о.

Штаммы 70-х - 80-х годов (233169 и 20045) имеют принципиально ту же плазмидную структуру, что и штаммы 40-60-х годов. Однако у данных изученных штаммов отсутствовала плазмида вирулентности 180 т.п.о.

Анализ всех 20 коллекционных штаммов разных мест и времени выделения показывает принципиальную общность шигелл Зонне в отношении структуры плазмидного профиля. Чстановлено наличие плазыид малой. средирй, болыой и очень большой молекулярной массы. Количество индивидуальных плазмидных полос может варьировать от 2 до 9. Вопрос о наличии одноплазмидных штаммов шигелл Зонне в рамках данного исследования остается открытым.

ИЗУЧЕНИЕ НАБОРА ПЛАЗМИД ВТАММ0В ШИГЕЛЛ ФЛЕКСНЕРЯ

Исследованная коллекция штаммов (табл. 2) обнаруживает как сходства, так и отличия в организации плазмидного набора шигелл Флекснера и шигелл Зонне. Общим является наличие плазмид малой, средней, большой и очень большой молекулярной масс (рис.4 ). Однако, если плазмиды большой и средней молекулярной масс хорошо разграничены областью, в которой отсутствует плазмидная ДНК, то между плазмидами малых и средних молекулярных масс эта область выражена слабо.

9 шигелл Флекснера плазмиды малой молекулярной массы представ-

- 1Ь

Таблица I.

¡таимы шигелл Флекснера. использованные в работе

NN Наиме- Номера тех яе

пп нование штаммов в других

штаммов коллекциях,

(ГИСК) характеристики

1 232051 5237 1:6:2,4 подтип I в

2 232100 54248/25 1:6:2.4 подтип 1 в

3 232102 8683 1:6:2,4 подтип I в

4 232105 2319 11:3,4 подтип 2а

5 - 1562 11:3,4 подтип 2а

6 - 1605 п:з,4 подтип 2а

7 232115 527 п:3.4 подтип 2а

8 232116 516 и :3,4 подтип 2а

9 232053 5238 11:3,4 подтип 2а

10 232078 538 н :3,4 111:6:7. подтип 2а

11 232108 1741 8 подтип За

12 2321 1 0 1791 111:6:3, 4 подтип Зв

13 232113 1675 111:6 подтип Зс

14 232121 3364 111:6 подтип Зс

15 232123 3367 111:6 подтип Зс

16 232124 3376 111:6 подтип Зс

17 232012 4838 У1:(2),4 тип 6

18 232016 11745 У1:(2),4 тип 6

19 232030 Сергеев У Г, ( 2 ), 4 тип 6

20 232049 148/57 - 7,8 тип X

21 23205В 5234 - 7.8 тип X

22 232050 149/57 - 3,4 тип V

23 232057 5235 - 3,4 тип У

Учреядение или страна, из которой получен штамм * )

Год выделения штамма

Р2Н, Польша

ГИСК. Москва

ГИСК, Москва

ГИСК, Москва

НИВС, Москва

НИВС, Москва

НИИЭМ,Москва

ППБП, Днепропетровск

РгН , Польша

НИИЭМ. Ленинград

НИИВС, Томск

НИИВС. Томск

ГИСК, Москва

НИИЭМ, Казань

НИИЭМ, Казань

НИИЗМ, Казань

Институт Листера.Лондон

ГИСК, Москва

НИИВб, Москва

ППБП, Днепропетровск

Р2Н, Польша

ППБП, Днепропетровск

Р2Н. Польша

1957

1953

1954 1954

1954 1956 1357 1953 1953 1953

1953 1956 1956

1956 1946

1954 1943 1963

1957 1963 1957

) ГИСК. Москва - Государственный институт стандартизации и контроля

медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасе-вича.

НИИВС, Москва -НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН НИИЭМ. Москва -НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Р2Н - Коллекция института гигиены. Варшава, Польша

ППБП - Предприятие по производству бакпрепаратов, Днепропетровск

Б.Зоппе1-1-941-1 фаза 1,1 11 1

!И0А I 1, I

232105 подтип 1в 11|

232102 подтип 1в 1 1

¿32051 подтип 1в I I 1

232100 подтип 1в ,1 1

1562 подтип 2а 1

1605 подтип 2а 1 1

232116 подтип 2а 1 1

23207В подтип 2а 1,1 1

232053 подтип 2а 1.

232115 подтип 2а , 1,

232110 подтип Зв 1

232108 подтип За 1 1 г

232124 подтип Зс Г ,1,1

¿32121 подтип Зс 1

232123 подтип Зс 1 г,

232113 подтип Зс и 1 ,

232012 тип 6 1 11

232030 тип 6 1 , 1

232016 тип 6 II 11 1 1

232049 тип X II 1 1

232058 тип X 1, 1 1

232050 тип У 1 1 1 1

232057 тип У 1

Б.йогте!-[-941-11фаза 11 1 1 1

НР

о 100 30 7 6 5 ^ /5.5 Ыг-ЪИИЦ г,0 т.п-О.

Рис. 4. Плазмидный профиль коллекционных отаммов вигелл Флек

1яются гетерогенной группой.Они включают плазмиды 2.0-2,3;2.5-2.7; 3,3-4,0 т.п.о. Диапазон колебаний размеров малых плазмид выше у [игелл Флекснера, чем у шигелл Зонне.

Сравнительный анализ плазмидного профиля штаммов шигелл Флексора (см. рис.4) показывает гетерогенность штаммов по плазмиде набольшей молеклярной массы. Данный вид гетерогенности мо«ет быть бусловлен как исходными различиями штаммов по молекулярной массе (анной плазмиды, так и геномными перестройками, возникающими при ультивировании микроорганизмов после длительного хранения. Нали-ие плазмиды очень большой молекулярной массы отмечено у штаммов игелл Флекснера 2а (1562, 1605, 232116), шигелл Флекснера типа 6 32012 (институт Листера, Лондон. 1946) и 232016 (ГИСК, 1954). а акяе тип У (232050, Днепропетровск. 1963).

В штаммах шигелл Флекснера 1в ойнарумены следующие плазмиды: 32105 - 69; 4.0; 2.7; 2.1 т.п.о.; 232102 - 97: 6.4: 4.5: 4.0; .5; 2.1 т.п.о.; 232051 - 2.6: 2.3: 2.02 т.п.о.; 232100 - 80; 3.9; 2,6; 2.0 т.п.о. Таким образом, для всех штаммов ¡в, изученных в зботе. характерно наличие одновременно плазмид 2- 2,1 т.п.о.и 2,5 1.1 т.п.о.

В штаммах шигелл Флекснера 2а обнаружены следующие плазмиды; 562 - 150; 3.8; 2.6 т.п.о.; 1605 - 172; 3.9; 2,7 т.п.о.; 232116 -[0; 3.3; 2,6 т.п.о.; 232078 - 3.5 т.п.о.;232053 - 134; 6,2; 3.6; 5; 2,1 т.п.о.;232115 - 107; 3,9; 2,7 т.п.о. Таким образом, толь-I в одном штамме найдена мелкая плазмида 2,1 т.п.о. Таким обра-1М, для штаммов шигелл Флекснера 2а характерен более простой ¡азмидный набор, чем для штаммов шигелл Флекснера 1в. Для штаммов гелл Флекснера 2а наиболее специфично присутствие одной крупно-лекулярной плазмиды, соотвтетствующей плазмиде вирулентности, огда одной плазмиды средней молекулярной массы и плазмид малой лекулярной массы. Таким образом, шигеллы Флекснера 2а выделяются еди других разновидностей шигелл Флекснера "компактным" способом ганизации генома.

Резко отличным представляется профиль штаммов шигелл Флексне-типа 6 (Ньюкастл). В штамме 232012 найдены плазмиды 261; 117: ; 4,5; 4,0; 2,6; 2,08 т.п.о.; 232030 - 127; 2,5 т.п.о.; 232016 -5; 118; 4,4; 3,9; 2,7; 2.5; 2.2 т.п.о. Плазмидные наборы штаммов

232012 и 232016 являются максимальными в данной коллекции и составляют 7 плазмидных полос на клетку. Наиболее характерной особенностью шигелл Флекснера типа Ньюкастл является присутствие 2 крупномолекулярных, 2 средних и 2 малых плазмид. Зто сближает устройство генома штаммов шигелл Флекснера типа 6 (Ньюкастл) с ши-геллами Зонне (см. рис. 3 и 4). Известны также некоторые сходные черты эпидемиологии этих инфекций.

В штамме 232049 типа X имеются плазмиды 210; 90; 4,9; 2,6 т. п.о.: 232058 типа X - 4,9; 2.6 т.п.о.; 232050 типа У - 229; 4,?: 3,8; 2,6; 2,2 т.п.о.; 232057 типа У - 90; 2.6 т.п.о. Таким образом плазмидный набор этих штаммов близок к плазмидному набору шигелл Флекснера 2а.

Все исследованные штаммы типа 3 (а, в, с) имели наряду с малыми плазмидами (2,5-2,7 т.п.о.) плазмиды очень малой молекулярной массы (менее 2,3 т.п.о.). Кроме того, отмечено, что 4 из 6 изученных штаммов этого типа не несли крупномолекулярной плазмиды. что по-видимому, связано с достаточной легкость!! ее утраты у данной группы иэолятов. Следует отметить, что вопрос о существовании плазмиды вирулентности у штаммов типа 3 в литературе остается практически не изученным.

Обращают на себя внимание штаммы 232124 (подтип Зс). имеющие плазмиды 3,5; 2.8; 2.1 т.п.о. и штамм 232123 (подтип Зс). имеющий плазмиды 4,0; 2.7; 2,0 т.п.о. В этих двух штаммах содержатся все три варианта малых плазмид, причем других плазмид данные штаммы не содержат. В то яе время такой плазмидный портрет не является закономерностью для типа 3, поскольку два других изученных штамма имеют отличный набор плазмид. Так. в штамме 232113 (подтип Зс) найдены плазмиды. 238: 80; 4.6; 3.5; 2,6: 2.2 т.п.о.. а в штамме 232123 - 4,3; 2,6; 2,2 т.п.о.

Штаммы подтипа За и Зв, полученные ГИСКом в 1953 году, характеризовались плазмиднкм составом, сходным с остальными штаммами типа 3. В штамме 232108 (подтип За) имелись плазмиды 4,9; 3,4; 2,9; 2,4 т.п.о., а в штамме 2321 10 (подтип Зв) - плазмиды 202; 4,9; 3,7; 2,7,

2.2 т.п.о.

ВЫБОР ОДНОПЛАЗМИДНЫХ ШТАМЫОВ ШИГЕЛЛ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЛАЗМИД КАК ЗОНДОВ ДЛЯ ГИБРИДИЗАЦИИ

На основании анализа плазмидного состава шигелл Зонне и Флекснера выдвинута гипотеза о наличии 4 групп плазмид: малой, средней, большой и очень большой молекулярной массы.

Плазмиды средней и большой молекулярной массы гетерогенны по структуре и функциям. Плазмиды средней молекулярной массы включают Со1-факторы и факторы антибиотикорезистентности. Часть из плазмид больной молекулярной массы могут иметь в своем составе дерепресси-рованные репликоны 1га. Участие всех этих плазмид в осуществлении функции вирулентности является дискуссионным. Плазмиды очень большой молекулярной массы - это плазмиды вирулентности . Они обязательны для всех половительных в кератоконъюнктивальной пробе штаммов шигелл.

Самыми неизученными с точки зрения Функции являются плазми-цы малой молекулярной массы. Между тем, именно эти плазмиды представляют особый интерес. С одной стороны, они характеризуются опре-;еленной степенью вариабельности, то есть некоторыми возмояными пличиями молекулярных масс от штамма к штамму. С другой стороны, пмечается их постоянное присутствие у всех изученных изолятов.

В силу своей малой молекулярной массы малые плазмиды не могут !ести протяженные участки вариабельной от штамма к штамму генети-[еской информации. Можно полагать, что имеется достаточно обширная ;онсервативная часть этих плазмид. Поэтому малые плазмиды, возыоя-о, являются более родоспецифичными, чем плазмиды средних и боль-их молекулярных масс.

Наконец, малые плазмиды содержатся как в вирулентных, так и вирулентных штаммах шигелл. Другими словами, генетический материл этих плазмид сохраняется при утрате штаммом плазмиды вирулент-ости или отдельных ее Фрагментов.

Поэтому представляло интерес выделение малых плазмид и про-ерка их гибридизации со штаммами шигелл и эшерихий.

Проводили поиск одноплазмидных штаммов шигелл для извлечения алых плазмид классическими методами выделения ДНК без вырезания эдивидуальных плазмидных полос из агарозного геля.

Ндовлетворительныы источником плазмид 2,5 - 1,1 т.п.о. у ви-

- 2b -

гелл Флекснера следует считать итамм 232030 (Сергеев . тип б), несущий наряду с плазмидой 2,5 т.п.о. плазмиду 12? т.п.о., а тате 23205? (тип Y), несущий одновременно с плазмидой 2,6 т.п.о. плаз-миду 90 т.п.о. В данных случаях вместе с малой плазмидой в штаммах присутствует одна крцпномолекулярная плазмида, которая, как известно, разрувается при выделении ДНК no H. Birnbole (1983). Следует также обратить внимание на штамм 232051 подтип 1в (2.0; 2,3; 2,7 т.п.о.), содержащий 3 низкомолекцлярных плазмиды и ни одной крупномолекулярной плазмиды, причем необходимо проверить гипотезу, не являются ли данные полосы вариантными формами одной плазмиды.

Обнаружен итамм, содержащий только одну полосу низкомолекулярной плазмиды. Это итамм 232078 подтип 2а, несущий плазмиду 3.5 т.п.о. Данная плазмида выявлялась четкой полосой интенсивной флюоресценции на злектрофореграмме, что свидетельствовало о ее достаточной копийности и устойчивости к повреждающим воздействиям. По всем штаммам как шигелл Флекснера. так и Зонне. отмечена отчетливая гетерогенность в интенсивности флюоресценции полос, что монет говорить о неодинаковом устройстве рекпликативного аппарата и разной копийности плазмид. Плазмида 3,5 т.п.о. из штамма 232078 была использована в дальнейшем в опытах по гибридизации.

Анализ плазмидного профиля шигелл Зонне позволил предполагать. что минимальный плазмидный набор для данного вида бактерий составляет 2 плазмиды (штамм 233166 колицинотип 6 по Н.И. Кошано-вой). Исследованию подвергали также штамм Sigella sonnei П фазы Linde. Данная часть работы выполнена совместно с В.В. Сергеевым, С.И. Елкиной (НИВС им. И.И. Мечникова) и Т.В. Соколовой (ММА им. И.М. Сеченова). В штамме S. sonnei II фазы Linde обнаружена только одна плазмида малой молекулярной массы. Таким образом, найден штамм S i се 1 la sonnei, также явялющийся доступным источником плазмидного материала.

Представлялось необходимым выяснить возмояность использования указанной выше плазмиды 3,5 т.п.о. шигеллы Флекснера 232078 подтип 2а для выявления вирулентных и авирулентных штаммов шигелл.В частности, предтавлялось существенным, "узнает" ли плазмида шигелл Флекснера 3,5 т.п.о. соответствующие последовательности ДНК в геноме шигелл Зонне I и I! фаз.

Градации гибридизации

©ош

SSI SSII PSF3.5 С600 К37 TDF селедь

2

SSII TDF С600 FSF3,5 К37

100И 20И 4И 0,8/

Рис. 5 Гибридизация биотин-меченой плазмиды pSF 3. 5 232078 в мягких (2) и жестких (1) условиях гибридизации.

SSI - тотальная ДНК S. sonnei I-94I-HP-I8 Km I фаза

TDF - тотальная ДНК S.flexneri 232078

pSF3. 5 - немеченый препарат плазмиды PSF3, 5 |

С600 - тотальная ДНК безплазмидного штамма Е. coll С600 i

К37 - тотальная ДНК безплазмидного штамма Е. coll КЗ? ;

селедь - носитель (ДНК сельди)

SSII - тотальная ДНК S. sonnei I-94I-HP

Ж Фаза

Эксперимент по гибридизации проводили следующим образом. Получали тотальную ДНК эталонных штаммов иигелл Зонне (I-941-HP-18 Km I фаза и I-941-HP II фаза), а такяе тотальную ДНК 232078 иигелл Флекснера. из которой была получена плазмида -зонд. Использовали нерадиоактивную биотиновую метку. В качестве контроля применяли тотальную ДНК бесплаэмидных штаммов кивечной палочки С600 и К37.

Результаты опыта даны на рис. 5. Видно, что и в мягких, и яест-ких условиях гибридизации имеются высокодостоверные отличия меяду интенсивностью связывания плаэмиды pSF 3,5 с геномом шигелл и геномом зверихий. Установлено такяе, что указанная плазмида шигелл Флекснера "узнает" штаммы шигелл Зонне I и II фаз. Это позволяет предполагать, что данная плазмида. действительно, несет в себе родовые детерминанты иигелл, присутствующие не только у различных видов, но и вирулентных и авирулентных штаммов. Чем обусловлен данный эффект "узнавания" - связыванием с хромосомой ДНК, плазми-дой вирулентности или низкомолекулярными плазмидами - предстоит выяснить в последующих исследованиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Произведено изучение штаммов шигелл Зонне и Флекснера, выделенных в разных географических зонах и в разное время. Изучено распределение их плазмидной ДНК различной молекулярной массы. Полученные данные дополняют имеющиеся в литературе сведения о плазмидном профиле бактерий Зонне и Флекснера (Lltuln С.М. et. al.. 1981, Helder К. et. al. 1989, Tacket С. et. al. 1984).

Во всех исследованных штаммах обнаружено присутствие плазмидной ДНК. Это свидетельствует о том, что иигеллы Зонне и Флекснера являются видами с постоянным наличием плазмид. Однако встречаемость плазмид различных типов характеризуется неравнозначностью.

Из 40 исследованных штаммов плазмиды очень большой молекулярной найдены у 15 (38Z). большой молекулярной массы - у 25 (637.), средней молекулярной массы - у 27 (687.). В то se время малые плазмиды присутствовали у всех 40 (100Х) штаммов.

Наличие малых плазмид у всех изученных штаммов шигелл Зонне и Флекснера дает основания полагать, что они играют ваяную роль в сохранении шигелл в ествественных условиях . их циркуляции и реко-

мендовать обозначать их как pS Obligatoire.

Причины постоянства существования малых плазмид нуждаются в дополнительном изучении. В частности, присутствие малых плазмид может быть обусловлено и их формированием из плазмид вирулентности шигелл и являться закономерным способом организации генома этих микроорганизмов. Это открывает перспективы использования генетического материала плазмид для создания зондов по выявлению аигелл и шигеллоподобных зшерихий.

Представляет интерес вопрос о вариабельности малых плазмид. Она моает быть обусловлена присутствием небольших инсерционных последовательностей или различными типами устройства репликативно-го аппарата. Показано, что диапазон колебания размеров малых плазмид выше у шигелл Флекснера, чем у шигелл Зонне. Малые плазмиды, наряду со средними, по-видимому, можно использовать для дополнительной эпидемиологической дифференциации штаммгЯ или выделения независимых клональных линий внутри видов шигелл.

Реальная дифференциация малых плазмид затруднена тем обстоятельством, что в препаратах могут содержаться так называемые вариантные формы плазмид С денатурированные суперскрученные, денатурированные релаксированные, линейные, с различным числом супервитков). Проведенные исследования указывают на необходимость применения дополнительных методов выделения ДНК, адаптированных специально для скрининга и получения малых плазмид шигелл.

Необходимым является рестрикционный анализ малых плазмид, для оценки их физической природы и поиска уникальных сайтов для клонирования. Следует также провести электронномикроскопическое изучение контурных длин, дабы исключить влияние суперскрученности и релаксации ДНК на процедуру определения молекулярных масс. Подлежит выяснению реальное число независимых плазмид в малой области измерений. Целесообразно использование малых плазмид в экспериментах по дуплексному анализу и гибридизации как с тотальной ДНК различных штаммов, так и с индивидуальными плазмидами. Наконец, необходимо разрешить вопрос о существовании консервативных и вариабельных частей в пределах данной группы плазмид и возможно провести определение нуклеотидной последовательности (секвенирование ) наиболее важных фрагментов.

- 2Â -

Моано надеяться, что в скорой времени детальное изучение ма лих плазмид составит самостоятельную главу микробиологии и эпиде миологии шигеллезов и существенно дополнит имеющиеся материалы i природе и свойствах плазмид шигелл.

ВЫВОДИ

1. Разработана модификация метода анализа плазмидной ДНК, обес лечившая получение стабильных результатов в отличии от известны: методов без предварительного прогревания лизатов. На основани: специальных условий лизиса бактерий вне лунок агарозного геля дос тигнуты высокие выходы плазмиды вирулентности шигелл Зонне как ; неочищенных лизатах, так и при их частичной очистке.

2. В штаммах шигелл Зонне и Флекснера выявлялись 4 группы плаз мид: малой, средней, большой и очень большой молекулярной масс Количество отдельных плазмидных полос на клетку колебалось от 1 д 9, но преобладали полиплазмидные штаммы. Данные закономерности об наруяивались у бактерий, выделенных с 40-х по 80-е годы, что сви детельствует о сохранении способа организации генома шигелл в те чение длительного времени.

3. Отмечена неодинаковая встречаемость плазмид разных молеку лярных масс. Очень крупные плазмиды присутствовали у 38И штаммов крупные - у 632, средние - у 682. В то se время малые плазмиды об наруяивались у 1002 штаммов. Диапазон колебания размеров малы плазмид был выше у шигелл Флекснера. чем у шигелл Зонне.

4. Стопроцентная выявляемость плазмид малой молекулярной масс позволяет предполагать, что они играют ваяную роль в сохранени вида в естественных условиях циркуляции, и рекомендовать обозна чать их как pS Obligatoire.

5. Найдены штаммы, обладающие только одной плазмидой, относя вейся к группе малых (нигелла Зонне Linde II фаза, шигелла Флекс нера 2а 232078). Эти плазмиды могут быть легко получены из одноп лазмидных штаммов классическими методами выделения плазмидной ДНК

6. Показана возмояность использования одноплазмидных штаммов качестве источников плазмидного материала для создания зондов. Об наруяена способность гибридизации меченой биотином плазмиды 3,5 т п.о. штамма 232078 шигелл Флекснера с тотальной ДНК штаммов шиге

Зонне I-941 —HP-i8 Км I фазы и 1-941—HP II Фазы. Связывание зонда с ДНК штаммов Е. coli С600 и К37 не существенна или отсутствует.

Работа, опубликованная по теме диссертации

T.fi.T. Ба, О.В. Емшанов, Г.Д. Каминский. Анализ плазмидного профиля коллекции штаммов для колициногенотипирования шигелл Зонне. //Яурн. микробиал. - 1993, - Н 6. -С. 23-24.

3ак.883 тир.100 АМН РСФСР Солянка 14.