Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание и изучение поливакцины, состоящей из антигенных комплексов S.fiexneri la. 1b и 2а.

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Создание и изучение поливакцины, состоящей из антигенных комплексов S.fiexneri la. 1b и 2а."

Р Г Б ОД

2 2 ПИВ 1523

На правах рукописи

УДК 616.371.002:616.935

СОКОЛОВА Татьяна Васильевна

СОЗДАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИВАКЦИНЫ, СОСТОЯЩЕЙ ИЗ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ Ъ.ПехнеП 1а, 1Ь и 2а.

03. 00.07 - микробиология 14.00.30 - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Москва - 1995

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. ИМ. Сеченова ИЗ и МЕДПРОМ РФ

Научные руководители

- доктор медицинских наук, профессор В.В.Сергеев

- доктор медицинских наук, профессор Г.Д.Каминский Официальные оппоненты

- доктор медицинских наук, профессор С.Д.Воропаева

- кандидат медицинских наук Г.Е.Рубинов Ведущее учреждение - РГМУ им. Н.И. Пирогова

Защита состоится " Лу •• ¿^ 1996 г. в ^_ часо

на заседании диссертационного совета Д 074 05 10 при Московской ме цннской академии им. И.М. Сеченова ИЗ и МЕДПРОМ РФ ( 119435 г. Моек Б. Пироговская ул., 2-6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М. Сечнова.

Автореферат разослан " &

1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

А.Ю. МИРОНОВ

Актуальность проблемы. Среди актуальных проблем противозпидеми-зкого обеспечения населения дизентерия устойчиво сохраняет одно из иболее значимых мест.

Ведущее значение в профилактике дизентерии отводится санитар-гигиеническим мероприятиям противоэпидемической направленности. Од-га, с целью предупреждения заболеваемости среди отдельных групп каления, а также некоторых организованных коллективов,известную пользу гут оказать препарату для специфической профилактики.

По линии, выполняемой ВОЗ программы борьбы с диарейнши заболе-яиями, осуществляется поддержка и стимулирование исследований, наце-яных на разработку и оценку вакцин против острых килечных инфекции в частности, против дизентерии. Принятое ранее решение сконцентри-зать внимание на медицинских и санитарно-гигиенических мерах по эъбе с шигеллезами оказалось недостаточно эффектовним (Гкхл. ВОВ. Же-эа, 1986, 1991). Появление штаммов шигелл, устойчивых к широко ис-яьзуемым антибиотикам, быстрое распространение устойчивости к новым гимикробным препаратам, а также трудности практической реализации *итарно-гигиенических мероприятий постоянно стимулирупт научный noil средств и методов специфической профилактики дизентерии (Полоцкий с соавт., 1992, Сергеев В.В. с соавг.. 1989, Black R.E. et al, 37, Lindbergh A.A. et al, 1988) .

Обобщенные данные об этиологической структуре тигеллезов-в нашей эане свидетельствуют о преобладании возбудителей Shigella sonne 1 )7.) vi Shigella flexnerl (30-35%) (Солодовников Ю. П., 1992).

Среди возбудителей дизентерии Флекснера наиболее широко распрост-шны подсероварианты la, lb, 2а и 6-й серовариант (Солодовников I., 1989, 1992). Большинство крупных экономико-географических регио-) РФ характеризуются преобладанием во внутривидовом пейзаже -

S.flexneri la, lb и 2a. Сумма указанных подсеровариантов определ практически всю заболеваемость коллективов риска. 6 серовариант пр мужественно встречается на территориях, где дизентерия Флекснера yi тида доминирующие позиции.

Учитывая это обстоятельство, а также принимая во внимание т; пецифичность иммунитета при дизентерии Флекснера, что еще раз с убедите»но показано в полевых испытаниях шигеллезной моновакщ состоящей из антигенных комплексов S.flexneri 2а, проводившихся в i коль га« крупных регионах бившего СССР (Холодный П.М., 1986), к< вактна не снижала заболеваемости, вызванной другими вариантами гелл, в числе которых идентифицироывались преимущественно подсеров; анты 1а и 1Ь, была сформулирована цель настоящего исследования - < дать и изучить поливакцину из антигенных комплексов S.flexneri 1а, и 2а.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следую! задачи:

1. Разработать технологию получения биомассы вакцинных шта] S.flexneri la, lb и 2а с использованием метода полунепоерывного к тивировакия микроорганизмов.

2. Сравнить продуктивность методов глубинного культивиров вакцинных штаммов S.flexneri.

3. Дать характеристику качества антигенов, полученных из биом вакцинных штаммов шигелл с помощью разработанной технологии куль рования.

4. Приготовить габлетированную поливакцину, состоящую из рас римьк антигенных комплексов S. flexneri la, lb, 2а.

5. Изучить безвредность, иммунологическую и протективную ак ность, стабильность при хранении поливакцины в лабораторных услови

6. Изучить безвредность, реактогекность, иммунологическую актиз-:ть и профилактическую эффективность поливакцины на ограниченном пингенте добровольцев.

Научная новизна.

Создана пероральная поливакцина из антигенных комплексов Б.Пех-гз 1а, 1в и 2а, извлеченных путем дезинтеграции бактериальных клеток лянокислым гидроксиламином с последующей очисткой и таблетированием.

Впервые показана возможность получения комбинированного препарата я профилактики дизентерии Флекснера, состоящего из белково-ЛПС комп-ксов шигелл с учетом преобладающих в распространении серовариантов збудителя.

Для получения биомассы вакцинных штаммов Б.Пехпсг! 1а, 1в и 2а зработана новая технология с использованием метода полунепрерывного льтивирования микроорганизмов в ферментере АНКУМ-2А (Пуийю), рабом объемом 20 литров.

Показаны преимущества новой технологии культивирования. Продук-;вность полунепрерывного культивирования вакцинных стаммов о.Г1ехпе-, рассчитанная по суммарном-/ выходу антигена из одного миллиарда «термальных клеток, была в несколько раз больсе, чем продуктивность >адиционного культивирования в реакторе. Антигены, полученные из био-юсы вакцинных штаммов шигелл,характеризовались Оолео высокой иммуно-юдогической активностью.

Впервые дана комплексная оценка качества антигенных комплексов, юдящих в состав шигеллезной поливакцины. Установлено, что совместное 1блетирование антигенных комплексов З.ПехпеП 1а, 1Ь, 2а не оказыва-: отрицательного влияния на качество и активность кахдого антигена в [■дельности.

Впервые показано, что пероральная иигеллезная поливакцина из ан-

тигенных комплексов Б.Пехпеп 1а, 1Ь и 2а является практически ар< тогенным и безвредным препаратом, а также обладает высокой иммунолс ческой активностью и профилактической эффективностью.

Практическая значимость работы.

Разработана новая высокопродуктивная технология получения био» сы вакцинных штаммов 5. Пехпег1 1а, 1Ь, и 2а, которая позволяет п< чить достаточное количество антигена с высокой иммунобиологической тивностью при использовании одной посевной дозы.

Утвержден экспериментально - производственный регламент (ЭПР технологию получения пероральной дизентерийной поливакцины Флекст Комитетом МККП (пр. N10 от 19.07.90 г.)

Шигеллезная поливакцина предназначена для специфической профи, тики дизентерии Флекснера в регионах, где сохраняют широкое распр< ранение подсероварианты З.С1вкпег1 1а, 1Ь и 2а, а также в отдел: организованных коллективах, в которых доминирующую роль в заОоле мости играют те же варианты возбудителя.

Поливакцина характеризуется технологичностью процесса изгото нкя, стандартностью больших серий препарата, устойчивостью при хр нии и практическим отсутствием противопоказанием к применению.

В зависимости от внутривидового пейзажа возбудителей дизент Флекснера на территории предполагаемого применения препарата, поте адьно возможен пересмотр набора компонентов поливакцины.

.Результаты проведенного исследования показывают целесообразн проведения дальнейшего испытания шигеллезной поливакцины на расши них контингентах в строго контролируемом эпидемиологическом опыте.

Положения, вин ост но на задругу.

- разработана новая технология получения биомассы вакцинных и мов И. Пехг)<?г1 1а. 1Ь и 2а, которая позволяет увеличить суммарный

ход антигена из биомассы, а также получить антигены с большей иммунобиологической активностью.

- создана пероральная поливакцина из растворимых антигенных комплексов S.flexnerl 1а, 1Ь и 2а, извлеченных путем дезинтеграции бактериальных клеток солянокислым гидроксиламином.

- поливакцина в испытанных дозах является практически ареактоген-ным и безвредным препаратом, а также обладает высокой иммунологической активностью и профилактической эффективностью.

Апробация работу.

Результаты исследований, представленные в данной работе, доложены на конференции отдела вакцин и заседании Ученого совета НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН, а также на совместной научной конференции кафедры эпидемиологии, кафедры микробиологии и лаборатории молекулярной эпидемиологии ММА им.М.М. Сеченова от 22 ноября 1995 г.

Структура и объем работе.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, ¡включения, выводов и библиографического указателя. Содержание диссер-'ации иллхютрировано 8 рисунками и 18 таблицами. Список литературы сохранит 222 источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

?

В качестве вакцинных штаммов были использованы штаммы из коллек-ии Московского НИИВС им. И.И. Мечникова ( S.flexnerl 2а 1605. S.flex-erl la 1298, S.flexnerl lb 1818), обладающие типичными культурально-иохимическими. антигенным и др. свойствами. Штаммы депонированы в ИСК им. Л.А. Тарасевича.

Глубинное культивирование вакцинных штаммов проводили в ферментере АНКУМ-2М (СКВ биологического приборостроения г,Пущино), рабочим объемом Ю литров. Рост культуры контролировали величиной экстинции (Еи измеренной с помощью фотоэлектраколориметра, при длине волны 530 нм е кюветах с расстояниями между гранями 10 мм.

Протективную активность антигенов определяли в опытах на белы? беспородных мышах массой 12-14 г, применяя несколько иммунизируют» доз с пятикратным интервалом и одну разрешающую. В опытах испытывал; не менее 4 доз, по 10 мышей на дозу. В качестве контроля использовал) неиммуниэированных мышей той же партии. Антиген в 0,5 мл физиологического раствора вводили внутрибршинно. Заражение проводили на 12-1' день 18 часовой гомологичной культурой дозой, равной 5-10 Шэо. Имму ногенность выражали методом срединных доз - №50.

Токсичность определяли путем внутрибрюшинного введения беспарад ным белым мышам массой 16-18 г доз антигена от 1 до 5 мг на мышь фиксировали максимальную летальную дозу - ЦЗюо-

Серологическую активность антигена определяли по минимально нейтрализующей дозе (МВД) в РТПГА, для чего использовали кроличью хч периммунную сыворотку и эритроцитарный диагностикум в авторском варранте.

Всего испытано 15 серий антигенов и 4 серии поливакцины.

Шигеллезную поливакцину из антигенных комплексов 5.Нехлеп 1; 1Ь и 2а готовили в соответствии с ТУ 42 КВС.220-81.

Антигенные комплексы получали путем дезинтеграции микробных кл< ток шигелл, выращенных в жидкой питательной среде (на основе казеин« вого перевара Хоттингера) » 207. раствором солянокислого гидроксилами: из расчета 0,05 мг на 1 млрд бактерий трое суток при температуре °С. Осадок отделяли центрифугированием. Надосадочную жидкость очища

помощью диализа и лиофильно высушивали. Полученные антигены содержа-и около 502 белка, 35Х-402 Сахаров и 10% золы.

Лиофильно высушенные антигены таблетировались. Одна таблетка по- . ивакцины содержала 75 мг антигена (по 25 мг каждого компонента) и 200 г наполнителя.

Препараты хранились до использования при +5 - НО °С.

Вакцинации подлежали мужчины от 17 до 57 лет (77Х из них прихо-ился на возраст до 30 лет), которых отбирали на основании данных дис-ансерного обследовыания и учета состояния здоровья перед вакцинацией, етодом случайной выборки были сформированы две группы: опытная (136 еловек) и контрольная (138 человек). Обе группы составляли один и тот е коллектив спецучреждения МВД СССР, прививались одновременно и наб-юдались в течение одного и того же времени. Для вакцинации использо-али шифрованные препараты.

Вакцинацию про&одили порорально. Вакцинировали с таким расчетом, тобы в одних условиях содержания находились одновременно лица, полу-ившие поливакцину и неактивный препарат. Иммунизируемые получали жедневио в течение трех суток две таблетки вакцины - 150 мг препара-а. Лица контрольной группы получали две таблетки неактивного препара-а в течение трех дней. Полный курс иммунизации состоял из приема 150 г активного вещества каждого компонента вакцины и 450 мг - суммарно, сех трех.

За привитыми и лицами, получившими плацебо, установили медицинс-ое наблюдение в течение семи суток. Результаты наблюдения вносили в Карту привитого". До и после иммунизации изучали клинические анализы рови и мочи, биохимические показатели сыворотки крови. Сыворотки, поученные от лиц, находившихся под медицинским наблюдением, до и спустя -10 дней после окончания курса иммунизации, шифровались и хранились в

замороленним состоянии (- 40 °С) до момента исследования.

Изучение профилактической эффективности шигеллезной поливакцины проводили на основании сопоставления уровней заболеваемости клинической и бактериологически подтвержденной дизентерией в опытной и контрольной группах путем анализа данных журнала амбулаторного приема, журнала госпитализации и историй болезни. С этой целью на каждого привитого заполняли специальную карту "Карту учета соматической, инфекционной и аллергической заболеваемости привитого", куда вносили данные о перечисленной выше заболеваемости в течение 6 месяцев.

Статистическую обработку полученных данных, а также графическое построение проводили с помошъю программы Sigma Plot (Jandel scientific). Для расчета профилактической эффективности шигеллезной поливакцины был использован компьютерный пакет программ EhiInfo, версии 5.

2. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВАКЦИННЫХ ШТАМ-М38 S.flexnerl la. lb и 2а.

Для получения биомассы вакцинных штаммов S. flexnsri la, lb и 2а была использована система культивирования, включающая ферментер, рабочим объемом 10 литров, к полунепрерывный процесс культивирования. В полунепрерывных системах полная загрузка и разгрузка ферментера осуществляется однократно, однако в процессе роста культуры часть ее сливается, а освободившийся объем заливается свежей питательной средой. Таким образом функционирует сливно-доливная система, которая приводит микробную популяцию в однородное физиологическое состояние.

Оптимизацию периодического процесса культивирования, с которой начинается любой из известных глубинных процессов (в т.ч. полунепрерывный процесс) начинали с выбора дозы посевного материала. В качеств' посевного материала использовали культуру, полученную на плотной пита

тельной среде после инкубации при 27 С° в течение 16-18 часов.

Посевные дозы с оптической плотностью меньше 0,1 Е£ обуславливали длительную лаг-фазу, пролонгировали фазу экспоненциального роста, максимально* стационарная фаза наступала на 9-10 часу от начала культивирования. Оптимальная посевная доза соответствовала значениям оптической плотности от 0,2 - 0,5 Е^ В этих условиях вырзщиваяия культура быстро адаптировалась, что выражалось отсутствием лаг-фазы и увеличением скорости роста популяции.

Решающее значение для успешного проведения культивирования имел выбор момента перехода от периодического к полунепрерывному процессу.

Была изучена возможность перехода к полунепрерывному процессу в разные периоды роста культуры: в середине экспоненциальной фазы, на вершине экспоненциальной фазы и в фазе замедления роста. При переходе к полунепрерывному культивированию на вершине экспоненциальной фазы сливно-доливная система начинала функционировать '/же на 4 часу от начала культивирования. Переходный период был непродолжительным, а процесс. стабилизировался полностью в пределах оптической плотности 4,0 ЕЬ. Этот режим позволил поддерживать культуру в однородном физиологическом состоянии, а также осуществить достаточное число синхронных циклов.

До начала настоящей работы для получения биомассы шигеллезной культуры использовался метод периодического культивирования в реакторе, рабочим объемом 70 литров. Этот процесс был воспроизведен для сравнительной оценки продуктивности методов глубинного культивирования и характеристики выделенных антигенных комплексов.

Фазовый портрет периодического и полунепрерывного культивирования представлен на рис. 1.

Метод периодического культивирования в реакторе предусматривал

Рис. I

Фазовый портрет периодического культивирования трех вакцинных штаммов вЬ-Иехпеп

Н

5

1а

-1Ь

-5».-2а

4 5 6 7 8 9 Время (часы)

10 11 12

Фазовьп) портрет полунепрерывного культивирования трех вакцинных штаммов ЭЬ.Цехпоп

В

§ Б

£ а

1а

- -♦-1Ь

-о-—2а

4 5 6 7 Время (часы)

9 10 »1

внесение посевного материала в полноценную питательную среду и получение биомассы по достижении заданной фазы развития культуры. Посевной материал получали на твердой питательной среде в течение 16-18 часов.. Оптическая плотность посевной дозы соответствовала 0,06-0,08 Е^ Процесс культивирования продолжался 11 часов. Первые 2-3 часа культура находилась в лаг-фазе. Начиная с четвертого часа периодического выра-¡цивания, культура переходила в фазу логарифмического роста и характеризовалась максимальной скоростью деления клеток. В начале стационарной фазы из реактора сливали культуральную жидкость, которую обрабатывали гидроксиламином с целью получения антигенных комплексов.

Полунепрерывное культивирование продолжалось 11 часов и состояло из 8 идентичных циклов. Посевная доза была подобрана таким образом, что культура практически сразу переходила в фазу логарифмического роста и достигала вершины экспоненциальной фазы уже на 4 часу от начала культивирования. Затем переходили к сливно-доливному процессу. Через одинаковые промежутки времени, равные одной генерации (приблизительно - 1 час), из ферментера сливали половину объема выросшей культуры и одновременно добавляли такое же количество свежей питательной среда. Слитую иа ферментера культуру собирали каждый цикл отдельно и также обрабатывали гидроксиламином.

В таб. 1 приведены сравнительные данные о продуктивности методов периодического и полунепрерывного культивирования вакцинных штаммов Б.ПехпеП, которая рассчитывалась по выходу антигена из одного миллиарда микробных клеток. Суммарный выход антигена при культивировании в ферментере был в 2,5 - 3 раза выше, чем при традиционном культивировании в реакторе.

Таблица 1 Выход антигенных комплексов на млрд микробных клеток при выраэдвании вакцинных штаммов Б^1ехпег1 методами периодического и полунепрерывного культивирования

I-1-1

Порядковый N цикла

Выход антигенных комплексов (мкг/млрд)

1а

1в

2а

1 | 187±24 168426 191+37

2 | 179+36 189441 195±24

3 | 195±48 198435 189431

4 | 228+27 213124 235428

5 ! 241418 235421 241417

6 | 257+14 241418 256414

7 | 263+17 268421 271421

8 | 275414 278418 281±17

Периодическое культивирование!

84436

87 ±41

72±37

Иммунобиологическая активность антигенов (нейтрализующая и про тективная активность), полученных в результате полунепрерывного кул тивирования, не уступали, а по некоторым параметрам, в частности, с рологической активности, превосходили антигены из биомассы, получены традиционным способом культивирования в реакторе. Так, МНД антигено полученных на разных циклах полунепрерывного культивирования, была

2,9 - 10 раз меньше, по сравнению с антигенами из бактериальной массы, полученной в реакторе, что говорит о более высокой способности антигенных комплексов, связывать специфические антитела иммунной сыворотки (таб. 2).

Таблица 2 Нейтрализующая активность антигенных комплексов вакцинных штаммов 5. Пехпег! в РТПГА

1 1 1 1 Минимальная нейтрализующая доза —1

| Порядковый | антигенных комплексов (мкг)

) п Цт\Лск ) " '

1 1 1 1 1а 1в 2а

1 1 1 1 1 1,4+0,4 1,6+0,3 1,2+0,3

1 2 "1 1.3Ю.5 1,3+0.4 1,310,5

1 з | 1,5±0,3 1,6+0,2 1,710,4

1 • 4 1 1,8±0,2 1,9+0,4 1.910,3

1 5 1 2,110,3 1,910,2 1,8Ю,4

1 б ) 2.7Ю.З 3,110,4 2.910.3

1 7 1 2,910,2 3.910.3 3.110.3

I 8 | 1 1 3,410,3 3.9±0,4 3.810.2

| Периодическое | 9,8*0,5 11,7Ю,4 12.5Ю.4

| культивтрование | 1, ... _ , ,,.,_., ,.,...1 _1

3. ИЗУЧЕНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ ПОЛИВАКЦИНЫ, СОСТОЯЩЕЙ ИЗ АНТИГЕН НЫХ КОМПЛЕКСОВ 5. ПехпеП 1а, 1Ь И 2а, В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ.

При изучении поливакцины в лабораторных условиях была изучена се рологическая активность антигенов, входящих в состав поливакцины, хрс ническая токсичность препарата, иммунологическая активность и протеи тивная активность в зависимости от сроков хранения.

Поскольку вакцина представляет собой комплексный препарат, нео( ходимо было выяснить взаимное влияние антигенов друг на друга и акти! ность каяиого в отдельности.

Изучая нейтрализующую активность совместно таблетированых ант] генных комплексов, мы убедились в том, что их серологическая акт ность осталась такой же, как и у нетабдетированных моноантигенов, вз: тих в качестве контроля.

Исследование хронической токсичности было проведено на беспоро ных белых мышах, массой 14-15 гр, которым десять дней подряд перорал но вводили раствореннута в физиологическом растворе поливакцину в доз равной 40 эквивалентным дозам для человека (20 мг каждого антигена или 8 эквивалентным дозам (4 мг каждого антигена). Животных ежеднев взвешивали. Животные, получавшие пероральную вакцину, не отставали весе и даже превыаали в отдельные дни квотных из контрольной групп На 1-е и 7-е сутки от момента последнего введения вакцины живот» усыпляли эфирным наркозом для морфологического исследования.

При вскрытии опытных и контрольных животных патологических язь нений со стороны внутренних органов обнаружено не было ни на 1-е суг после последнего введения препарата, ни на 7-е сутки. Гистологичеа изучение внутренних органов показало отсутствие дистрофических, воа

[ительных и некротических процессов как в опытных группах, так и в контрольной группе животных.

Патоморфологическое исследование органов животных, умерщвленных . 1а 1-е сутки после последнего введения препарата, обнаружило признаки жтивации иммуноморфологических реакций во вторичных лимфоидных орга-1ах. На 7-е. сутки от момента введения препарата различий между органами контрольных и опытных животных не отмечалось.

Таким образом, было показано отсутствие повреждающего действия на эрганизм животных препарата в дозах, значительно превышающих прививоч-*ую.

Изучение иммунологической активности поливакцины на животных по-<азало усиление антителообраэования в ответ на пероральное введение *ышам поливакцины одновременно ко всем компонентам. Так, уровень циркулирующих антител к Б.Пехпег! 1а поливакцины был выше уже на 7-е зутки после иммунизации и сохранялся на том же уровне в течение всего зрока наблюдения. Наименее иммуногенным компонентом поливакцины оказался антиген 5.Пехлег1 1Ь; лишь на 28-е сутки уровень циркулирующих антител данного подсероварианта оказался значимо выше. . Преимущество антителообраэования к г.Пехлег! 2а поливакцины проявилось отчетливо на 21-е и 28-е сутки после иммунизации. Кроме того, наблюдался значимый прирост титров антител к этому варианту в течение 28 дневного эксперимента.

Высокую протективную активность продемонстрировали в опытах прямой защиты при заражении гомологичным вирулентным штаммом все компоненты поливакцины. Защищающая способность была более выражена у антигенов, относящихся к варианту Б.ПехпеП 2а. В зависимости от серии и сроков хранения препарата индекс эффективности колебался в пределах от 8 до 13 и полностью соответствовал результатам. Полученным о протек-

тивной активности моновакцины. Изучая протективную активность препа тов. оставленных в разное время на хранение в условиях бытового хо. дильника, пришли к заключению, что они сохраняют свою активность в 1 - чение 5 лет.

4. ИЗУЧЕНИЕ БЕЗВРЕДНОСТИ, РЕАКТОГЕННОСТИ, ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ А ТИВНОСТИ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОЛИВАКЦИНЫ, СОСТОЯЩЕЙ РАСТВОРИМЫХ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ Б.Пехпег1 1а, 1Ь, 2а. НА ДОБРОВО

цах:

После успешного завершения доклинических испытаний поливакц Б.ПехпеП 1а, 1Ь, 2а было получено разрешение Комитета медицине иммунобиологических препаратов при МЗ СССР на испытание препарата ограниченном контингенте добровольцев. В программе изучения безвр чости, резктогенкости, иммунологической и профилактической активно поливакцины участвовали: Медицинская служба ШД СССР, Государствен институт стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л Тарасевича и Московский НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.

Высокая интенсивность эпидемического процесса при нигелл Флекснорл среди спецконтингента определила выбор коллектива риска , реализации программы изучения поливакцины на людях. Был выбран конт гект, состоящий из 274 добровольцев, которые находились в одинако условиях труда и быта закрытого коллектива. Методом случайной выбо наблюдаемые были разбиты на дне группы. Одна группа, состоящая из человек была иммунизирована поливакциной, другая - 138 человек, по чила неактивный препарат. Вакцинацию проводили с таким расчетом, чт в одних условиях содержания находились одновременно лица, получив! поливакцину и неактивный препарат. Схема иммунизации предусматрив ежедневный прием двух таблеток препарата в течение трех дней без

рвалов.

Лихорадочные реакции в пределах 37,1 - 37,5 °С были отмечены рез 10 - 12 ч после первой прививки у 11 человек из группы лривитых у 9 человек из контрольной группы. В последующие сроки наблюдения хорадочные реакции не регистрировались. Не было отмечено случаев из-нения колебания частоты пульса и величины артериального давления.

ивитые не предъявляли жалоб на ухудшение общего самочувствия, голов»

ю боль, снижение аппетита, изменения стула и другие диспепсические ления. Вакцинация не сказалась на уровне гемоглобина, составе фор-нных элементов периферической крови и СОЭ. Не было обнаружено изме-ний в осадке мочи, в моче отсутствовали патологических ингредиентов белок, сахар ).

Для изучения влияния иммунизации на функцию почек и печени оп-деляли концентрацию некоторых биохимических показателей сыворотки юви: аланинаминотрансферазы (Алт), аспартатаминотрансферазы (АсТ), ¡лочной фосфотазы ДО), гаммаглутаминтранспептидазы (ГГТП), общего ширубина (ОБ), азота мочевины (АМ), креатинина (Кр), холестерина !ол). Изучаемые биохимические показатели у привитых после иммунизации ! претерпели существенных изменений, за-исключением холестерина, уро-;нь которого значимо повысился линь в группе привитых.

Приростом титра антител после иммунизации ответило 80 X приви-IX. На два и три компонента поливакцины ответило 607. вакцинированных. 60% привитых отмечено повышение титра антител к Б.ПехпвП 1а, 1Ь и 50% - к Б.Пвхпег1 2а . У лиц, персрально иммунизированных полйвак-ягой, произошло достоверное увеличение титра антител ко всем трем эмпонентам поливакцины после иммунизации (рис.2),

В соответствии с материалами, представленными на рис. 3, про-гнт лиц, в сыворотках которых были обнаружены неполные антитела, от-

Рис. 2

Определение уровня антител до к после иммунизации поливакциной в сыворотках добровольцев

Ц

о £

ь £ Я

га а

0 и О

к «

о. о о

2.0

1.5

1.0

[Ь

0.5 |-

[ Э.Иехпсп 1а ]

0.0

До иммунизации

I В.|!«хпсг1 ХЬ Гз.Цехнсп 2а

ш

а Поело иммунизации

носящиеся к !£А, составил: 92,57. для Б.ПехпеП 1а, 7Ь7. для 5.Пехпсг 1Ь и 95х!для Я.Пехлег1 2а; процент положительных сывороток, выявивши антитела ^-класса, колебался т> пределах 60 - 87,5%, а антител 1ЕМ~класса определялись у 62,5 - Я37. привитых в.зависимости от тип диагностикума. Поливакцина в знг-штельной степени стимулировала обра зовачие антител 1гА-классл.

Положительный бактериолплиеский эффект был получен с сывороткг ми привитых во всех изученных разведениях.

Рис. 3

Выявление положителкпы v <-».i»••>)>«> i ok и РПГА и модифицированной прсИоКумогя

S.llextiQrt U<

S.llexneri lb

¡вакцинаЦЦ^ | плаиеСо]"

S.Ûexneri 2a

Гемагглютинины XgM IgG Ig A

В результате длительного (6 мес) наблюдения за вакцинированные и получившими плацебо установлено, что ЛОР-заболевания, заболевай! сердечно-сосудистой системы, бронхов и легких, кожные болезни, гнойнь инфекции встречались одинаково часто как в группе привитых, так и ср< ди лиц, получивших неактивный препарат, за исключением, заболевай] желудочно-кишечного тракта.

Заболеваемость острыми кишечными инфекциями в контрольной груш превышала заболеваемость ОКИ в опытной группе в 4 раза. Шигеллез( Флекснера заболели 5 человек из 138 человек, получивших плацебо. П] бактериологическом исследовании было установлено, что 4 случая забол! вания вызваны серовариантом S.flexnerl 2а и 1 случай - S.tlexnerl II Среди вакцинированных не было зарегистрировано ни одного случая заб( левания. Тачим образом, заболеваемость среди непривитых бактериолог: чески подтвержденной дизентерией Флекснера за 6 месяцев составила 3 на 100 нас., или 3623 на 100000 нас.

Предварительные данные о профилактической эффективности полива цины, изученной на ограниченном контингенте добровольцев, свидетельс вуют о высокой потенциальной эффективности препарата: индекс эффекти ности равен 11, а показатель эффективности - 9IX.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ."

В производстве иммунобиологических препаратов большое внимал уделяется вопросам технологии культивирования микроорганизмов. Возмо ность управления процессом развития микроорганизмов и получение куд туры с определенными свойствами обеспечивает высокое качество нов вакцинным препаратам, что подтверждается результатами выполненой рас ты.

Экспериментальные, клинические и эпидемиологические данные ci

детельствуют о существовании постинфекционного иммунитета при дизентерии, а проведенное исследование убеждает в принципиальной возможности создания дизентерийной вакцины, обладающей низкой реактоге'нностью и. достаточно высокой иммунологической активностью и профилактической эффективностью.

ВЫВОДЫ :

1. Разработана новая технология получения биомассы вакцинных штаммов Б^1ехпег1 1а, 1Ь и 2а с использованием метода полунепрерывного культивирования микроорганизмов в ферментере, включающая выбор оптимальной посевной дозы при периодическом культивировании и оптимальный момент перехода от периодического к полунепрерывному культивированию.

2. Продутивность полунепрерывного культивирования вакцинных штаммов 5.Пехпег1, ■ рассчитанная по суммарному выходу антигена из одного миллиарда бактериальных клеток, была в 2,5 - 3 раза больше, чей продуктивность традиционного культивирования в реакторе.

3. По своей иммунобиологической активности антигены из биомассы вакцинных штаммов шигелл, полученной методом полунепрерывного культивирования, не уступали, а по некоторым параметрам, в частности, серологической активности, превосходили антигены из биомассы, полученной традиционным способом культивирования в реакторе.

4. Создана пероральная поливакцина из растворимых антигенных комплексов Б.Пехпег! 1а, 1Ь, и 2а, извлеченных путем дезинтеграции бактериальных клеток солянокислым гидроксиламином.

5. При комплексном клинико-лабороторном изучении установлено, что шигеллезная поливакцина характеризуется стабильностью при хранении, безвредностью, ареактогенностыо и высокой антигенной и иммуноло-

гической активностью всех входящих .в ее состав компонентов.

6. При пероральном введениии шигеллезная поливакцина индуцирует на все-компоненты, представленные в вакцине, иммунный ответ, который проявляется нарастанием титров гемагглютининов, образованием неполных антител, принадлежащих к иммуноглобулинам классов IgG, IgM , IgA, г также нарастанием бактериологической активности сывороток привитых.

7. Потенциальная эффективность шгелдеаной поливакцины, изученной' на ограниченном контингенте добровольцев, была высокой: индекс эффективности составил 11, а показатель эффективности - 91Z.

8. Предварительные данные, полученные на ограниченном контингенте добровольцев, покапывают целесообразность проведения испытали! пероралььой поливакцины, состоядей из антигенных комплексов S.flexner la, lb и 2а на расширенных контингентах в строго контролируемом эпидо миологическом опыте.

ОПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сергеев В.В., Каверина К.Г., Елкина С.И., Крейнин Л.С., Калин Н.Г. Соколова Т.В. Бесклеточная шигеллезная вакцина для профилактик .дизентерии // Тез. докл.. 6 Всероссийского съезда микробиологов, эпид« миологов и паразитологов (г. Нижний Новгород, 1091). - М., 1991. - С 202 - 203.;

t

2. Каверина К.Г., Соколова Т.В., Мелихова В.А., Калина Н.Г. Ист тачие на добровольцах литоральной поливакцины для профилактики дизе! терки Флекснера // Журн. мнкробиол. - 1992. - NN 5 - 6. - С. 67 - 6i

3. Баснакьян И.А., Мирясова Л.В., Соколова Т.В., Янькова М.М Калика Н.Г., Елкина С.И.. Сергеев В.В. Оптимизация технологии культ: вированил вакцинных штаммов Shigella flexnorl // Журн. мнкробиол. 1993. - N 5. - С. 6 - 10.

4. Соколова Т.В., Икрамов А. Анализ плазмидного профиля штаммов шигелл Флекснера, используемых для получения вакцинных препаратов // Журн. микробиол. - 1994. - N б. - С. 67 - 68.