Аномальные изменения картины метилирования геномной ДНК при хроническом В-клеточном лимфолейкозе

Москалёв, Евгений Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аномальные изменения картины метилирования геномной ДНК при хроническом В-клеточном лимфолейкозе
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аномальные изменения картины метилирования геномной ДНК при хроническом В-клеточном лимфолейкозе"

На правах рукописи

ООЗ1Т7221

АНОМАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КАРТИНЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ В^КЛЕТОЧНОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ

03 00 04 -Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических на^ 2 /1 £ [{ ?(][)7

Воронеж 2007

003177221

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Епринцев Александр Трофимович

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Пашков Александр Николаевич

кандидат биологических наук, доцент Башарина Ольга Владимировна

Ведущая организация Московский государственный университет

им М В Ломоносова

Защита состоится 7 декабря 2007 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212 038 03 при Воронежском государственном университете по адресу 394006, Воронеж, Университетская площадь, 1, ауд 59

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Автореферат разослан 6 ноября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Грабович М Ю

Актуальность проблемы. Важнейшие характерные свойства опухолевых клеток обусловлены аномальным функционированием сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл и апоптоз (Hanahan, Weinberg, 2000, Копнин, 2004) Митогенные и антиапоптотические сигналы передаются в ядро, где происходит активация генов-мишеней, запускающих генетические программы клеточного роста, пролиферации клеток и избегания апоптоза (Татосян, 2004)

В основе данных нарушений лежит изменение экспрессии ключевых для онкогенеза генов - протоонкогенов и опухолевых супрессоров, продукты которых задействованы в передаче сигналов в клетке и их регуляции Согласно традиционной модели онкогенеза, нарушение экспрессии генов является результатом генетических аберраций (Knudson, 2001)

Существенный пересмотр представлений об этиологии опухолей в настоящее время связан с обнаружением значительных эпигенетических нарушений, связанных с изменением активности генов во всех типах новообразований (Esteller, 2005) К эпигенетическим модификациям клетки относят картину метилирования геномной ДНК и характер модификаций хроматина Они определяют митотически наследуемые изменения функции генов, происходящие без нарушения нуклеотидных последовательностей (Yoo, Jones, 2006) Таким образом, аномальное изменение экпрессии генов в опухолях может иметь негенетическую природу

Аберрантное энзиматическое de novo метилирование CG-динуклеотидов в промоторных областях генов-супрессоров (CpG-островках) в опухолях сопряжено с потерей экспрессии и функционально аналогично инактивации генов вследствие мутаций (Bird, 2002, Киселёва, Лихтенштейн, 2004) Изменения нормального метилирования ДНК появляются на самых ранних этапах онкогенеза, когда клетка еще не приобрела свойства опухолевой (Holst et al, 2003), и поэтому представляют исключительную ценность для ранней диагностики, прогноза и классификации онкозаболеваний (Laird, 2003, Залетаев и др, 2004) Эпигенетическая инактивация транскрипции обратима деметилирующие агенты реактивируют ген, открывая возможность новой эпигенетической терапии онкозаболеваний (Yoo, Jones, 2006) Аномальное метилирование генов онкогенных сигнальных путей может предрасполагать к накоплению мутаций в генах тех же путей (неслучайность мутаций), приводя к прогрессии опухоли (Baylin, Ohm, 2006) Функционально эпигенетические и генетические нарушения при канцерогенезе представляются одинаково важными и находятся в тесном взаимодействии друг с другом (Feinberg, 2004, Ванюшин, 2005)

Хронический B-клеточный лимфолейкоз (В-ХЛЛ) представляет одно из наиболее распространенных лимфопролиферативных заболеваний, крайне гетерогенное по своему течению и характеризующееся нарушением апоптоза и клеточного цикла (Никитин, 2001, Zent, Kay, 2004) Цитогенетические нарушения в опухолевом клоне редко обнаруживаются на ранних стадиях заболевания (Chiorazzi et al, 2005), что позволяет предположить важный вклад эпигенетических изменений в патогенез В-ХЛЛ Однако характер метилирования геномной ДНК в опухолевых клетках при В-ХЛЛ мало изучен Данные литературы характеризуют общее содержание 5-метилцитозина, картину метилирования нескольких генов, а также аномальное метилирование отдельных CG-динуклеотидов в масштабе генома (Rush et al, 2004) Функциональное значение изменений картины метилирования ДНК при В-ХЛЛ в целом остается неясным

Многие широко используемые методы изучения картины метилирования ДНК обладают низкой информативностью и позволяют изучать метилирование лишь нескольких нуклеотидов за один эксперимент (например, метилспецифичная ПЦР) Методы анализа метилирования протяженных локусов (Ажикина, Свердлов, 2005) или целого генома (Rush, 2004) удовлетворяют условию масштабности, но достаточно трудоемки и ограничивают исследование нуклеотидами в участках узнавания метилчувствительных рестриктаз Особую актуальность поэтому приобретает разработка нового метода масштабного изучения метилирования, с помощью которого можно одновременно исследовать характер метилирования множества (сотни, тысячи) нуклеотидов разных локусов/генов сразу в нескольких биологических пробах В настоящей работе данные условия реализуются с использованием технологии ДНК-чипов (Hoheisel, 2006)

Разработка и применение данного метода для сравнительного исследования картины метилирования ДНК в опухолевых клетках при хроническом В-клеточном лимфолейкозе и В-лимфоцитах здоровых доноров имеет важное теоретическое и практическое значение Обнаружение аберрантно метилированных генов существенно расширяет наши представления об эпигенетическом механизме заболевания Аномально метилированные гены могут рассматриваться в перспективе в качестве биомаркеров для диагностики и прогноза В-ХЛЛ, а также мишеней для новых эпигенетических подходов к терапии

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы было сравнительное исследование картины метилирования 5'-областей (промотор, первый экзон) потенциально важных для онкогенеза генов в опухолевых клетках при хроническом В-клеточном лимфолейкозе и в В-лимфоцитах здоровых доноров Для выполнения цели поставлены следующие задачи

1 выбрать гены-кандидаты для изучения метилирования их 5'-регионов (по данным литературы),

2 разработать метод масштабного анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на in situ синтезированных олигонуклеотидных ДНК-чипах,

3 выделить ДНК из периферической крови больных В-ХЛЛ и В-лимфоцитов здоровых доноров и модифицировать ее бисульфитом натрия,

4 разработать олигонуклеотидные праймеры и провести ПЦР-амплификацию исследуемых областей генов на модифицированной бисульфитом ДНК (пробоподготовка),

5 спроектировать олигонуклеотидный состав ДНК-чипов для изучения характера метилирования искомых генов и синтезировать олигонуклеотидные зонды на поверхности чипов,

6 провести сравнительный гибридизационный анализ картины метилирования ДНК больных В-ХЛЛ и здоровых доноров,

7 верифицировать полученные результаты для некоторых генов с помощью широко используемых альтернативных методов - метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования ДНК,

8 сопоставить характер метилирования ДНК с признаками, имеющими прогностическое значение при В-ХЛЛ мутационным статусом генов иммуноглобулинов IgVH, стадией заболевания, исходным уровнем лимфоцитов, временем удвоения лимфоцитов, характером поражения костного мозга и полом,

9 предложить гипотетический эпигенетический механизм нарушения контроля передачи митогенных и проапоптотических сигналов в клоне B-XJIJI

Научная новизна. Разработанный метод масштабного анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на ДНК-чипах с т situ синтезированными олигонуклеотидными зондами Не имеет аналогов в отечественной литературе и позволяет дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования В ходе одного эксперимента возможен одновременный анализ метилирования порядка 1000 индивидуальных CG-динуклеотидов в каждой из восьми биологических проб Впервые в опухолевых клетках B-XJTJI выявлено аберрантное метилирование генов сигнального пути Wnt WIF1 (65%, 30/46), DKK1 (50%, 23/46 образцов), PYG01 (86%, 19/22), DACT1 (6%, 3/46), DKK2 (3/7), DKK3 (2/7), проапоптотических генов APAF1 (4/10), ВАХ (3/10) и RAD9A (3/10), гена, контролирующего клеточный цикл, UBE2C (4/6), а также генов BCL6 (6/6) и FSCNI (2/6) Аномальное метилирование данных генов, очевидно, имеет неслучайный характер и, по-видимому, вносит важный вклад в патогенез хронического лимфолейкоза, приводя к нарушению контроля клеточного цикла и передачи митогенных и апоптотических сигналов вклетках B-XJIJI

Практическая значимость. С помощью гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах возможен эпигенетический анализ любого типа опухоли, а также поиск новых локусов, подверженных метилированию при онкогенезе После дополнительных испытаний данный метод может быть использован в диагностических целях по ранее описанным маркерам метилирования ДНК в биоптатах опухолей или биологических жидкостях организма Установленное в работе аберрантое метилирование генов SFRPI, WIF1, PYGOl и ряда других при В-ХЛЛ (в т ч на ранних стадиях заболевания), а также характер метилирования отдельных CG-динуклеотидов создает основу для разработки диагностического теста на основе метилспецифичной ПЦР, а также испытаний деметилирующих агентов (например, децитабина) в качестве средств эпигенетической химиотерапии Обнаруженное метилирование генов негативных регуляторов сигнального пути Wnt важно для разработки направленной терапии B-XJTJI (например, ингибиторов Р-катенина)

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, в спецкурсах «Молекулярная биология», «Генетическая инженерия», «Молекулярная диагностика», а также при проведении практических и семинарских занятий по биохимии в Воронежской государственной медицинской академии

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях ежегодной международной конференции по методам анализа с помощью биочипов «Chiptechnologien» (Франкфурт, 2006), XIX зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007), 2-ой конференции Германского центра исследования рака (Хайдельберг, 2006), 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), межрегиональных конференциях, посвященных памяти проф А А Землянухина (Воронеж, 2006, 2007), ежегодной научной сессии отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского

государственного университета (2007), ежегодной конференции «Философские проблемы биологии и медицины» (Воронеж, 2004) По итогам 2-ой конференции Германского центра исследования рака сообщение признано победителем конкурса

Публикации Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 6 статьях, 5 тезисах и 1 учебно-методическом пособии

Работа поддержана 6-месячной стипендией Германской службы академических обменов (DAAD) и Министерства образования и науки РФ по совместной российско-немецкой программе «Михаил Ломоносов» (2004-2005 гг ) и годовой стипендией для молодых ученых от DAAD (2005-2006 гг )

Положения, выносимые на защиту

1 Разработанный гибридизационный метод анализа картины метилирования ДНК на олигонуклеотидных чипах позволяет проводить масштабное исследование метилирования ДНК (порядка 1000 CG-динуклеотидов) одновременно в нескольких биологических пробах

2 Аномальное метилирование генов, контролирующих клеточный цикл, и проапоптотических генов является частым событием в опухолевых клетках при В-

хлл

3 Высокая частота метилирования генов негативных регуляторов онкогенного сигнального пути Wnt предполагает эпигенетический механизм его аномальной активации в клоне В-ХЛЛ

4 Гипотетическая схема дерегуляции клеточного цикла и апоптоза, ассоциированной с аберрантным метилированием генов в клетках В-ХЛЛ

Структура и обьем работы Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста (150 стр основного текста и 53 стр приложения) и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (297 источников) Иллюстрационный материал включает 41 рисунок и 8 таблиц Материал, не вошедший в основной текст работы, изложен в пяти приложениях

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования В качестве объектов исследования служили образцы периферической крови 46 больных с диагнозом хронический В-клеточный лимфолейкоз и 8 здоровых доноров Пробы периферической крови больных были получены из лаб функциональной морфологии гемобластозов (зав проф, д б н И А Воробьев) и лаб молекулярной гематологии (зав к б н А Б Судариков) Гематологического научного центра РАМН с письменного согласия больных Клинико-диагностистическая информация предоставлена снс,кмн ЕА Никитиным

Селекция В-лимфоцитов. B-лимфоциты из периферической крови здоровых доноров осаждали на магнитных частицах с иммобилизованными антителами к поверхностному антигену CD 19 - Dynabeads CD 19 (Pan В) («Dynal Biotech AS А», Норвегия) согласно рекомендациям изготовителя

Выделение геномной ДНК. Геномную ДНК из цельной крови больных В-ХЛЛ и B-лимфоцитов здоровых доноров выделяли с помощью сорбции на микроколонках с силикагелевой мембраной - набор QIAamp DNA Blood Mmi Kit («Qiagen», Германия) - в соответствии с инструкцией производителя Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически

Модификация ДНК бисульфитом натрия. ДНК модифицировали бисульфитом по стандартной методике (Warnecke et al, 2002) с некоторыми изменениями Полноту конверсии C-»U подтверждали бисульфитным секвенированием

ГШР-амплиФикация исследуемых областей иативной и модифицированной бисульфитом ДНК. Нуклеотидные последовательности разработанных праймеров, размеры ампликонов и условия проведения ПЦР суммированы в таблице 2 диссертации Праймеры для амплификации модифицированной ДНК не содержали CG-динуклеотидов или имели однонуклеотидную замену в положении, соответствующем 5гпС ПЦР-амплификацию проводили в режиме «горячего старта» с использованием HotStartTaq ДНК-полимеразы и реактивов фирмы «Qiagen» в объеме 25-100 мкл Каждый праймер для метилспецифичной ПЦР содержал 2-4 анализируемых CG-динуклеотидов Результаты ПЦР оценивали в 2%- и 3,5%-(метилспецифичная ПЦР) агарозном геле, окрашенном бромистым этидием Специфичность ампликонов оценивали с помощью маркерных фрагментов ДНК, а также бисульфитного секвенирования Концентрацию ПЦР-продуктов после очистки определяли спектрофотометрически или денситографически с помощью маркерных фрагментов ДНК («Fermentas», Литва) и общедоступной программы Image J 1 34s на сервере NCBI (http //rsb info nih gov/ij)

Метилирование ДНК tn vitro. Препараты полностью метилированной геномной ДНК и ПЦР-продуктов получали с помощью фермента Sssl -метилтрансферазы («New England Biolabs», США) согласно протоколу производителя Полноту метилирования подтверждали с помощью гидролиза метилчувствительной рестриктазой BstUI, имеющей участок узнавания CG4-CG («New England Biolabs») Пробы ампликонов 25% и 50% степени метилирования получали, смешивая соответствующие количества полностью метилированной и неметилированной ДНК

Мечение ДНК биотином. Смесь ПЦР-продуктов для гибридизации на олигонуклеотидном чипе (0,5 пмоль каждого ампликона) метили Biotin- 16-dUTP («Roche Diagnostics GmbH», Германия) методом рассеянной затравки (Mund et al, 2005)

Проектирование олигонуклеотидного состава ДНК-чипов и их синтез in situ

Гибридизационный анализ на олигонуклеотидных ДНК-чипах проводили в отделе функционального анализа генома (зав Dr J D Hoheisel) Германского центра исследования рака (German Cancer Research Center) в Хайдельберге, Германия

Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных зондов (17 или 21 нуклеотидов) ДНК-чипа генерировали программой MethPat («Febit Biotech AG», Германия) по заданным последовательностям гибридизуемых на чипе ПЦР-продуктов Характер метилирования каждого отдельного CG-динуклеотида анализировали с помощью пары зондов, один из которых коплементарен исходно метилированной ДНК-мишени (М-зонд, содержит CG), а другой - исходно неметилированной ДНК (U-зонд, содержит TG) Исследуемый CG-динуклеотид соответствовал центральному нуклеотиду зонда Возможную перекрестную гибридизацию олигонуклеотидных зондов и проб ДНК оценивали, используя дополнение к MS Excel SNP Cross Checker («Febit Biotech AG») УФ-направленный синтез олигонуклеотидных зондов гп situ проводили на экспериментальной установке Geniom One («Febit Biotech AG») стандартным фосфорамидитным методом (Baum et al, 2003) В каждом из 8 каналов ДНК-чипа синтезировали 6776 олигонуклеотидных зондов (всего на чипе - 54208 олигонуклеотидных зондов), среди которых не менее 310 контрольных олигонуклеотидов для контроля качества олигонуклеотидного

синтеза, эффективности мечения гибридизуемой ДНК и подтверждения отсутствия неспецифической гибридизации Нуклеотидные последовательности зондов указаны в Приложении 5 к диссертации

Гибридизация, отмывание и детекция флуоресцентных сигналов Гибридизацию меченной биотином ДНК с олигонуклеотидными зондами чипа проводили в буфере MES (Mund et al, 2005) при 45°C в течение 16 ч По окончании гибридизационный раствор удаляли и чип отмывали два раза буфером SSPE 6х при 25°С 7 мин и SSPE 0,5х при 45°С 7 мин Для амплификации сигналов ДНК-чип инкубировали с конъюгатом стрептавидин-Я-фикоэритрин («Molecular Probes», Нидерланды) при 25°С в течение 25 мин Флуоресцентные сигналы регистрировались встроенной цифровой камерой установки Geniom One Измерение интенсивностей сигналов осуществлялось автоматически (Baum et al, 2003)

Бисульфитное секвенирование ДНК. Определение нуклеотидной последовательности очищенных ПЦР-продуктов осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI 3730XL с помощью набора BigDyeTerminator 3 1 и программы KB basecaller («Applied Biosystems», США) согласно рекомендациям производителя

Поиск CpG-octpobkob в 5'-областях генов. CpG-островки идентифицировали с помощью программы Methprimer (www urogene org/methprimer/indexl html)

Статистическая обработка экспериментальных данных Каждый олигонуклеотидный зонд синтезировали на ДНК-чипе в 5-9 повторностях Достоверность отличия индекса метилирования CG-динуклеотидов в ДНК больных и в норме оценивали с помощью t-критерия Стьюдекга Изучение связи гиперметилирования генов с прогностическими факторами B-XJIJ1 проводили с помощью двустороннего точного критерия Фишера Обсуждаются статистически достоверные различия при Р<0,05 (Glantz, 2002, Лакин, 1990)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В основе работы лежит следующая гипотеза Дерегуляция апоптоза и ускоренная пролиферация, характерная для опухолевого клона при хроническом лимфолейкозе, происходит предположительно по эпигенетическому механизму Потенциально важные в патогенезе В-ХЛЛ проапоптотические гены и регуляторы клеточного цикла могут быть гиперметилированы и эпигенетически инактивированы в клоне В-ХЛЛ, что объясняет феномен устойчивости опухолевого клона к проапоптотическим сигналам in vivo и его ускоренную пролиферацию

РАЗРАБОТКА МЕТОДА МАСШТАБНОГО АНАЛИЗА КАРТИНЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК С ПОМОЩЬЮ ГИБРИДИЗАЦИИ НА ДНК-ЧИПАХ

для сравнительного исследования картины метилирования днк в клетках в-хлл больных и b-лимфоцитах здоровых доноров выбраны 43 гена

Гены-кандидаты характеризуются следующими признаками 1) наличие CpG-островка в 5'-области (промотор и/или первый экзон), 2) потеря экспрессии гена при В-ХЛЛ (данные литературы) и/или важная для онкогенеза функция или 3) аберрантное метилирование отдельных CG-динуклеотидов, обнаруженных в геномном исследовании (Rush et al, 2004) Информация об изученных генах приведена в табл 1

Таблица 1

Гены-кандидаты для исследования картины метилирования Срв-островков при В-ХЛЛ

Ген* Номер в базе Положение Функциональная

GenBank на хромосоме категория

АРС М74088 5q21-q22 Регуляция онкогенного

DACT1 AF251079 14q223 сигнального пути Wnt

DKK1 605189 lOqll 2 (передает митогенный и

DKK2 АВ033208 4q25 антиапоптотический сигнал

DKK3 AF177396 1lpl5 3 от рецептора Fz на мембране

FRZB U24163 2qter клетки в ядро, где

GSK3B ВС012760 3ql3 3 происходит активация генов-

PYGOl AF457207 15q21 1 мишеней)

PYG02 ВС006132 lq22

SFRP1 AF017987 8p 11 21

SFRP2 AF017986 4q31 3

WIF1 AF122922 12ql4 2

CISH Z77852 3p21 3 Негативный контроль

PTPN6 NM 002831 12pl331 сигнального пути Jak/STAT

SOCS1 U88326 16pl3 13 (регуляция цитокинами)

SOCS3 АВ004904 17q25 3

RASSF1 AF 132675 3p21 3 Негативная регуляция

RASSF4 ВС032593 lOqll 1 сигнального пути Ras

RASSF5 ВС004270 lq31 (проапоптотические сигналы)

APAF1 AFO13263 12q23 Регуляция апоптоза

BAD AF021792 1lql3 1

ВАХ NM 138763 19ql3 3-ql3 4

BCL2 M14745 18q213

BID AF042083 22ql1 2

DAPK1 X76104 9q34 1

STK17A ABO 11420 7pl2-pl4

STK17B AB011421 2q33 1

ТР53 AF307851 17pl3 1

BUB1 AF046078 2pll-q21 Контроль клеточного цикла

CDKN2B AB060808 9p21

CDKN3 U02681 14q22

CENPE Z15005 4q24-q25

RAD9A U53174 11 q 13 l-ql3 2

UBE2C U73379 20ql3 12

CDH1 L08599 16q22 1 Адгезионные межклеточные

FSCN1 U03057 7p22 контакты

ZYX X95735 7q32

BCL6 NM 138931 3q27 Другие функции

CALCA X00356, M64486 1lpl5 2

GRM7 U92458 3p26-p25

TERT AF015950 5pl5 33

TWIST2 BC017907 2q37 3

ZAP70 L05148 2q 11 -q 13

* Жирным шрифтом выделены гены, метилирование которых анализировали с помощью гибридизации на ДНК-чипах

ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ЗОНДЫ ЧИПА СПОСОБНЫ ДИСКРИМИНИРОВАТЬ МИШЕНИ ДНК РАЗНОЙ СТЕПЕНИ МЕТИЛИРОВАНИЯ

На рис. 1а, б представлена схема типичного эксперимента по исследованию картины метилирования ДНК методом гибридизации на олигонуклеотидных чипах. На первом этапе работы оценивали принципиальную способность олигонуклеотидных зондов ДНК-чипа дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования. Для этого в разных каналах чипа с идентичным набором зондов гибридизовали смесь 17 модифицированных бисульфитом ПЦР-продуктов («Чип 1» в таблице 2) 0, 25, 50 и 100% степени метилирования. Метилированную ДНК получали метилированием in vitro, полноту метилирования подтверждали рестрикцией метилчувствительным ферментом BstUI и бисульфитным секвенированием ДНК. Общее число анализируемых CG-динуклеотидов в каждом канале составило 637, каждый зонд был представлен на чипе в 5-кратной повторное™.

^ анализируемая проба ДНК ^

-CG-

г-1 модификация 4J* бисульфитом

флуоресцентное и гибридизация на

мечение олигонуклеотидпом чипе

| <-►

ВЫХОД 1 СМ

Рис. I. Принцип анализа картины метилирования ДНК методом гибридизации модифицированной бисульфитом ДНК на олигонуклеотидных чипах.

в ВХОД

i каналы ДНК-чипа

СТААСТССаТАТТАСТА 1Ц-»

CTAACTCCqTATTACTA 1М~» АССААТАСаАААСАСТА 20"» ACCAATACgAAACACTA 2М"»

AATTTAACaTCCAACCA 3U"*

AATTTAACqTCCAACCA ЗМ-»

а - Принципиальная схема эксперимента, б - Анализ картины метилирования фрагмента ДНК, содержащего три СО-динуклеотида (пронумерованы). После модификации бисульфитом исходные цитозины представлены цитозинами или тиминами (строчные буквы). Метилирование каждого из них определяется с помощью пары олигонуклеотидных зондов (М и и). Нуклеотидная последовательность каждого зонда комплементарна подчёркнутой последовательности в пробе ДНК. в - Устройство ДНК-чипа, г - Увеличенный фрагмент чипа, взятый из п. б, после гибридизации с биотинилированной мишенью ДНК и инкубации с фикоэритрином. Флуоресцентные сигналы от трёх пар зондов из п. 6 (обведены) указывают на отсутствие метилировния СС-динуклеотидов (сигналы от М-зондов отсутствуют).

Степень метилирования каждого Св-динуклеотида оценивали по вычисляемой величине индекса метилирования М=1м/(Тм+Ти), где 1м и Ти - интенсивности флуоресцентных сигналов от М- и и-зондов соответственно. Большинство пар зондов статистически достоверно дискриминируют 0, 50 и 100% метилированные пробы ДНК с высоким уровнем значимости (Р<0,01) (рис. 2). 91% всех зондов различали ДНК 0 и 100% степени метилирования, 74% зондов - 0, 50 и 100% метилированную ДНК Причиной неспособности части зондов дискриминировать СО-динуклеотиды разной степени метилирования, по-видимому, является формирование олигонуклеотидами вторичных структур, а также неспецифичность гибридизации.

Средние интепсивностей сигналов

I зяш 5 жоо

> юсш

: 15Й0

: 1Шзо

е 5030

Ы УЖ' X

=3 ЗКОЗ I 25005 1 20006 Е.А5СОЗ | 1X00 « 5ФС1

Средние интенсивностей сигналов

.................................

Средние интенсивностей сигналов

'■СЬ 1 -."'.а зсосо зксо .

0% метилированиая ДНК

тае иш зкк .¡о;

0% метилированная ДНК

....... х =1 'КОЗ

5 25СС0

2 :осоо о ■ ',7• "

1КЮ0 | 10)00

2 «»С

35000 £ ••КО 1X00 и-ЖО 20000 ¿5X0 КООС

50% метилированная ДНК

Рис. 2. Способность олигонуклеотидных зондов ДНК-чипа дискриминировать мишени ДНК разной степени метилирования.

Координаты каждой точки на диаграммах соответствуют среднему значению величины флуоресцентного сигнала от одинаковых олигонуклеотидных зондов (всего ] 274 зонда) в двух каналах чипа после гибридизации проб ДНК разной степени метилирования: а - 0 и ] 00%, б - 0 и 50%, в - 50 и 100%. Из рисунка видна дискриминация проб ДНК разной степени метилирования.

Для количественного анализа метилирования могут быть использованы 12% зондов, характеризующиеся линейной зависимостью вычисленного индекса 1м/(1м + 1и) от реальной степени метилирования ДНК (рис. 3). Выбор подхода к исследованию-количественное или полуколичественное - полностью зависит от цели эксперимента. По нашему мнению, количественный анализ более целесообразен для идентификации ранее описанного аберрантного гиперметилирования ДНК в исследуемом типе опухоли, чем для поиска новых потенциально важных для онкогенеза гиперметилированных генов. Отбор небольшого числа олигонуклеотидных зондов, дающих количественную информацию, требует значительного времени и затрат. Кроме того, гены-кандидаты, выбранные для исследования по признаку потери экспрессии в опухоли или важной для онкогенеза функции, могут быть свободными от метилирования, т.к. потеря их функции может быть обусловлена другими неэпигенетическими факторами.

Статистически достоверно дискриминировать гибридизуемые образцы 0, 50 и 100%) метилированной ДНК способны большинство зондов (74%). Поэтому продемонстрировав принципиальную возможность количественного исследования характера метилирования ДНК посредством гибридизации пробы с заранее селектированными олигонуклеотидными зондами чипа, для анализа образцов лейкозной крови пользовались альтернативным подходом. Он заключался в прямом сравнении индексов метилирования ДНК из крови больных хроническим лимфолейкозом и В-лимфоцитов здоровых доноров без предварительной селекции зондов ДНК-чипа.

0% 50% 100% Ц М Ц М им АРАРС09 ПГПШ

АРАР С068

ОАРКИы) СО #4 Я!= 1,000

ОАРК1 СП4

СЯМ7 СС,8 ГТП

ЯТК17 В СС.9 Т\¥1$Т2 СО24

степень метилирования

СЯМП35) се # 8

степень метилирования

5Ш7Я са#9

100% 0% 50% 100%

степень метилирования

7шт се #9

50% 100% 0% 50% 100% 0% 50% 100% ь метилирования степень метилирования степень метилирования

Рис 3 Флуоресцентные сигналы (а) и калибровочные кривые (б) для пар олиго-нуклеотидных зондов, способных к количественному анализу степени метилирования ДНК.

ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ КАРТИНЫ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ПРИ В-ХЛЛ

Разработанные олигонуклеотидные днк-чипы позволяют исследовать характер метилирования 400-600 индивидуальных Св-динуклеотидов одновременно в нескольких биологических пробах в ходе одного эксперимента

Для изучения метилирования промоторно-экзонных Срв-островков 33 генов (названия выделены жирным шрифтом в таблице 1) при хроническом В-клеточном лимфолейкозе и в В-лимфоцитах здоровых доноров разработаны три олигонуклеотидных ДНК-чипа (таблица 2)

Таблица 2

Оигонуклеотидные чипы для гибридизационного анализа картины метилирования ДНК при В-ХЛЛ

х Я

о В §

м 2

и Н о

У И Ьй

= Я I в

Й О. 5 о 1111

X 3 я Е

2 о

и и

2 О

а и

2 8 « 2 Ё I § I

5 3

¡Р е

5 я о.

в* а п

Чип 1 17/16 АРАР1, В АО, ВАХ, ВСЬ2, 637 ВЮ, СА1СА, СйН1, СОКЫ2В, ОАРК1, СИМ7, ЯАйЯА, 5>ТК! 7А, ЗТК17В, ТР53, ТтЗТ2, 2АР70

Чип 2(1) 11/8 ЯРПР!, 5РЯР2, ЗРЯРЗ, 445 ОКК1, ОКК2, ОКК1, РУС02, ТЕКТ

Чип 2(2) 11/9 РУСО], В11В1, СйШЗ, 462 ВСЬб, СЕЫРЕ, РЯСМ,

_5РС5/, ЦВЕ2С, 7ЛХ_

5 6776/371 10

8-9 6776/340 7

7 6776/308 6

Восемнадцать генов аномально метилированы при в-хлл по результатам гибридизационного анализа

В таблице 3 суммированы данные о характере метилирования изученных генов. Метилированым считали СО-динуклеотид, индекс метилирования которого достоверно выше в клоне В-ХЛЛ, чем в нормальных В-лимфоцитах.

Строки в таблице соответствуют исследованным генам, колонки - пробам ДНК из крови больных. Ячейки, выделенные серым, означают метилированные Сй-динуклеотиды (по сравнению с нормой). Числа в ячейках - установленное количество метилированных СО-динуклеотидов. Пример типичного результата гибридизацион-ного анализа приведён на рис. 4.

Таблица 3

Аномальное метилирование генов при хроническом В-клеточном лимфолейкозе

Проба ДНК Ген ХЛЛ2 ХЛЛЗ ХЛЛ4 ХЛЛ 6 ХЛЛ 9 ХЛЛ 16 ХЛЛ 17 ХЛЛ 20 ХЛЛ 29 ХЛЛ 31 Частота метилиро- вания, %

АР AFI* 1 40

BAD щ J

В АХ* Щ 30

BCL2 -

BID i -

CALCA ** 5 S 1 40

CDH1 ** 4 ■ 3 И 2 mm i ;¡ I 80

CDKN2B ** liilií 3 ■в * 1 50

DAPK1 ** 1 2 1 30

GRM7** 9 H 10 i? 2 50

RAD9A * 4 4 2 щ 30

STK17A 4 -

STK17B 4 -

TP53 Ш -

TWIST2 ** 9 7 "p. ..5 - - 80

ZAP70 -

Проба ДНК Ген ХЛЛ 1 ХЛЛ 13 ХЛЛ 17 ХЛЛ 20 ХЛЛ 29 ХЛЛ 31 J Проба ДНК Ген ХЛЛ 1 ХЛЛ 13 ХЛЛ 20 ю CS X ХЛЛ 27 ХЛЛ 29 1 ХЛЛ 31 3? я Г

BCL6* 100 DKK1 « _

BUBI 4 - DKK2 * г 43

CDKN34 - DKK3 * 1 mm 78

CENPE - PYG02

FSCN1 *4 33

PYGOI * 100 SFRP1** 71

SOCS1 4 _ SFRP2** Ш 28

UBE2C* 4 67 FRZB** 7 43

ZYX 4 TERT

* Впервые установленное метилирование гена. ** Метилирование гена подтверждено с помощью гибридизации на ДНК-чипах. 4 Потеря экспрессии при В-ХЛЛ (Klein et al„ 2001).

Установлено аберрантное метилирование 18 генов, контролирующих апоптоз и клеточный цикл (см. таблицу 1). Типичный результат анализа картины метилирования ДНК представлен на рис. 4. Гиперметилирование избранных генов 5У-У?Р/, РУОО! и СОЯ/ при В-ХЛЛ полностью подтверждено с помощью бисульфитного секвенирования, тогда как в В-лимфоцитах четырёх здоровых доноров данные локусы полностью неметилированы (рис. 46). а

1-0,5 ¡0,4

ХЛЛ 31

ДНК здоровых доноров

Рис. 4. Аберрантное метилирование ДНК при В-ХЛЛ.

I о О О О О

........О и О О V/ . . -

: § 5 5 § ï г Ï Ï Ï SI :S35588888|ï

ddo8¡í88s!

t í t f !

CG-динуклеотиды исследованных генов

а — Пример типичной диаграммы, описывающей средние значения индексов метилирования CG-динуклеотидов в опухолевых клетках больного ХЛЛ31 и В-лимфоцитах четырёх здоровых доноров. Метилирование указанных стрелками CG-динуклео-щдов подтверждено в п. б. б - Фрагмент диаграммы бисульфитного секвенирования исследуемого участка CG-островка гена SFRP1 у больного ХЛЛ 31 (вверху) и в нормальных В-лимфоцитах (внизу), полностью подтверждающего

результат из п. а. На диаграмме изображены только С- и Т-пики (сплошная и пунктирная линии соответственно). С-пики указывают исходно метилированные цитозины CG-динуклеотидов (обозначены звёздочками). Видно полное отсутствие метилирования гена в норме (Т-пики указаны стрелками) и сильное его метилирование при В-ХЛЛ.

Шесть метилированных генов принадлежат сигнальному пути Wnt, передающему митогенный и антиапоптотический сигнал от рецептора на клеточной поверхности в ядро (таблица 1). Из данных литературы известно, что путь Wnt аномально активирован при В-ХЛЛ (Lu et al., 2004) и, по меньшей мере, отчасти обусловливает устойчивость опухолевых В-клеток к апоптозу in vitro. Однако механизм данной активации остаётся слабо изученным. Предположив возможный эпигенетический механизм, мы провели дополнительное исследование метилирования генов, кодирующих ингибиторы передачи сигналов через путь Wnt с помощью метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования в образцах ДНК из крови 46 больных. Так, метилирование генов SFRP1, WIF1, DKK1. DACT1 сопряжено с потерей их экспрессии в разных типах новообразований (приложение 1 к диссертации), что в ряде случаев предвещает неблагоприятный прогноз (Veeck et al., 2006; Roman-Gomez et al., 2007).

Было изучено также метилирование генов негативных регуляторов двух других важных для онкогенеза сигнальных путей - Jak/STAT и Ras. Путь Jak/STAT обеспечивает регуляторное действие цитокинов на клетки за счёт передачи сигнала от рецепторов цитокинов на поверхности клеточной мембраны в ядро (Valentino, Pierre,

ХЛЛ 31

Норма л

2006) Среди генов-мишеней пути Jak/STAT - протоонкоген MYC, гены циклинов D2 и D3, обеспечивающие активацию клеточного цикла, а также ген антиапоптотического белка BCL-XL Сигнальный путь, опосредуемый новыми эффекторами протоонкобелка Ras - RASSF1 и NORE1, проводит проапоптотический сигнал (Ortiz-Vega et al, 2002) Данные гены имеют промоторные CpG-островки, которые часто метилированы и в разных типах новообразований (приложение 1 к диссертации) Гиперметилирование данных генов сопряжено с потерей их экспрессии, что может приводить к нарушению контроля за передачей сигнала По данным литературы в клетках B-XJUI значительно понижен уровень транскрипции гена SOCS1, кодирующего негативный регулятор пути Jak/STAT

Принимая во внимание подверженность указанных генов аберрантному метилированию и эпигенетической инактивации в других типах новообразований и полное отсутствие данных при хроническом лимфолейкозе, нами было изучено метилирование CpG-островков в 5'-областях генов в клетках B-XJIJI

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОВ НЕГАТИВНЫХ РЕГУЛЯТОРОВ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ WNT, JAK/STAT И RAS С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРЯМОГО БИСУЛЬФИТНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ И МЕТИЛСПЕЦИФИЧНОЙПЦР

Высокая частота аномального метилирования генов ингибиторов пути WNT DKK1, SFRPl, WIF1 при В-ХЛЛ

Впервые при хроническом В-клеточном лимфолейкозе обнаружена высокая частота аберрантного метилирования генов WIF1, DKK1 и PYGOl (рис 5-6) Продукты двух первых генов ингибируют проведение митогенного и антиапоптотического сигнала в ядро, а белок Pygol активирует транскрипцию генов-мишеней пути Wnt По результатам метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования CpG-островок в 5'-области гена PYGOl метилирован в клетках В-ХЛЛ 86% больных (19/22 образцов крови), WIF1 - 65% (30/46), DKK1 - 50% (23/46) Частота метилирования гена ингибитора DACT1 составила 6% (3/46) Результаты метилспецифичной ПЦР и прямого бисульфитного секвенирования находились в полном соответствии друг с другом (рис 6) Для исключения возможной преимущественной ПЦР-амплификации метилированного аллеля по сравнению с неметилированным (Warnecke et al, 1997) проводили контрольное секвенирование ПЦР-продуктов, полученных при амплификации ДНК 50% степени метилирования

ДНК из В-лимфоцитов здоровых доноров была полностью неметилирована Исключение составила промоторная область гена PYGOl, первые 13 динуклеотидов которой были метилированы в норме (рис 5), что, по-видимому, представляет тканеспецифическую картину метилирования, характерную для ряда локусов Гены DKK1 и WIF1 метилированы в крови лишь одного из восьми здоровых доноров Метилирование CpG-островков генов в норме является редким явлением, однако описано ранее (Rush et al, 2004)

По данным Liu et al (2006) промоторный CpG-островок гена SFRPl метилирован в 100% случаев В-ХЛЛ, в культуре опухолевых В-клеток WaC3CD5, а в В-лимфоцитах здоровых доноров метилирование полностью отсутствует Гиперметилирование гена SFRP1 сопряжено с уровнем его экспрессии в культуре опухолевых клеток - деметилирование гена с помощью децитабина (ингибитор ДНК-метилтрансфераз) реактивирует ген (Liu et al, 2006)

С использованием прямого бисульфитного секвенирования нами установлено дифференциальное метилирование гена SFRPI Ген метилирован в 91% случаев (20/22) Метилирование полностью отсутствовало в образцах крови двух пациентов

aaaaaari .□ааакзоа □□□□□□а ояваазп aaaaaaa □□□□□па □ааяааявп

за

• £иввававяаааслзовавиапиииа

• ••□ваиааввлсшаааяааиппиииа

□ваааавяаааааавааиапииив

OJ LRJ LI и п л я и и Cl □ □ Ü □ ci □ n G □ □ □ а

□аотаагюпааааэшэпаппсюсэ □□□□□□aaaaaaaaaaaaanaaan □лляадП'П laaaaa «□□□□паапд □лнааплааазвааазааааосгап -------—паааиапаяаппооаа

naaaaaaaaaaaGGDa пааааавэааппааав аввапявлапларааа □ааавялэааапаааа □аааавлавпапааав пвааазваааапаааа нваваялзааапааов

ааяаавяа □ававаясг ааяаааах. панаваяя яаяяяз; я

заааиаэ аяааааа —аиява

__аэзаа 1 I Hil l

□аааааа ааяаааа эвнаиаа заяаиаа аяззяаэ вваввва мляяязс ваявлна

раллааааоаааашиваааарррл

----~~ааавазвяа[Юлааааов

□□алаланаааваааапв □азлаааяэззлаапапл □ззззазлзлллаапппл —яялллязаялаапппв алялляэлалаапппа яялливяляяааппав авааялалавоааппв алпаалааапаопппл ияияляияяяаапппз алвллпяаааараааа ааааяаяяяалвпппа яааляааааваапппа □аааяаяааааапппа алааяаалаааааапл □лзляялиялдзпппа наяияяяяяваапппа

___________нляаяваяаааааппв

яляляяняллляяпаялпааопа

------»ялишляишпааапппа

яяляиазяляллрааая члзпаяятзлаппппа

юааиааааапсюппав юааяаяяаапааааав ■шияшшиавашарррра ■вяяиаплзямаапппз ■лллиилияааатппа ■алпяяяпяаяапааая юлавлваанваааааа ■зллзлллзалаапппл юлпаалвпааааоппа 1зяалзляааяааааоа •эялааянапиврааав ■аяавлвяляявапапа ¡□паповдгоаиадосюа шявавлллаааапппл мляваяапаааппппл з. тчзаазаааааппа 1лялапяпааяаааапа юзвааяввзаараапа •заавязаэзлапапаа laaaaaaaaaaaaaaaa кзвнияявааааппсюя оанааялпаапапааа ■вааааивяааааааав »вяааввяавнааосюа 1ааавиававааарааа ¡наваадраааапппда 1яааааллааяазпппа иялааввававапапа 1вяяаавваяаиааааа ивваавазвааааааа юааааааанааааааа маааяааэаияааааа заааааааааваааааа оиааяваяяаяааааа аяяяиаяааяиияпапа лаяяяаяааяаняаааа аавнвааааявявпооа

язааяалааааляпппа явянаваавв!----

■ ■ HCl kl I t IIIIII Ci Я

________'■■яяшялнан

нивввааввввналваа

апасюаааааааааэзп ааааааааяавааааяа аааяаяпашяааааааи аааааааэиааллазэя аааааняаяаняяааая вваянняааяяявяаяв влаааяаваааляяаая —яяазаяавааааляаяв

I '

s ^ g

; §

а» О

6 Си

ааазяяааязазаяаяаалазсаа аазазззвязязаааааазааааа аиаавллияляаалалазяззппа илиояиаи,«! s k зизаииииа аваанвавяилаиаааааяааоаа _пизпаявввввяввазллапапал ^□лпппняяпаляяляааялаарса

иаазааааазаоаааааааа ряяяяляяяялянляаяяла адлавлняавввзияяалва аяааааяаааляпяяапяяа аяаааааввааяаваааааа

алязазза эзаааааа аввавявп аававиаи анлаоаар

□яааааааазав__

аяяаззлзалддад i —аааааааааявавв ; Заяаааааааяаваа

; ~аяаадааззпддзд______

аааааавяяааааааавяаас аааазязааиаззаааяазас аапяпшллдияддадаяздзг . иааяаялаяяяллялаяааааааа адплддддаядвзаааалааэааа пяяняяяияяиллллллнляапал адядняляяяяяядяаэазяаааа - аядвявивпядядпддядиаасп~ Йаннявиававааааааааа— '□адняядддияаняздэад пллянлваналяяязяапл ваяиддяддаялаиаа-

GHH

ЛЛЗП

~аао

КГ ; I _

вас

____яаяяяааааааая

аняияияаяаааааааи авннявяяаааяааааа □нааяаяадзааддааз —рплааляаааааааааа ¿Раявняияввавнааара ^аяладддаявдззддза аяааавааваааааааа алииааяаааааааааас аааяаааааааааааааа

ааааааааааааааллал!____

□лвшвдяляплаллнязияиаа □аааняааааалалялаааааа аяааааяэяаааавааоааааа _риаавзвзваввряаэо£—

•-.□ПППМПШЛШИИЯППЯПП

ааааииааааааааааа!___

аававааааааяаааааваааа пдизимя■■■дяадяааддялп паиэяазшлязяаяязавааап оаняяааваивяааааааааза идяяззаддяаяааадиадаза пяяяяззвяизиэзлдпзязас :._пягюяпаяялааавпаалааао □аааааааяааавааииааиаи

ввоао

«ппгаг

аоааа

О Он S

а< о к

S о

о- о-

cd U

к си

g §>

Co s

8Í ^ ä ft, с

с " tj -i-& g п ж

О О

оз и S

I 5 В

s g f -t

к 5, s s

«s

. oL ю

! Д- >S

I G "

I § 5 ч

s s

. e-

cd ra

-- s

2 a К я _ К ш

grao

S Ш Q.

« O S

в В- я

S S tu

Sao

S" s » 2 -f" S >5 5

га 4 о. о s

c 2 * û s M

ra S S с a et

s s ж

Í H и

S S a

t- 2 ч

и ^ о

s £ §

X rn

Я S .

£ ? Я

о. О g

S U о

x а.

>-, из

S Л О. ч

<и

<и А.

з и

сЗ О

а) ж W

л Ш Ш

S о О X а- ч

5 ^ и Д 2

g e &

о в

Sog a щ 4 Й s g о з S к n

o ra о К Оч

о- 2

к fct Ч " Р X

SPS

о a

! H

> a ï- -е- i

S +

-f -to G

X S

-e- Oí Й ^

ra a ¥ h

t; >.

Й « С1- X И u a

5 m a

ra a s

a ci

a. s ■

s "

H X

6 r^;

с U

ч о, g _ о

È £ ° я

ÖS и

¡5 со » СО

? и з a н

S G

â О

« о

Э" <и 2

XJIJI 4 и XJTJI 26 и соответствовало картине метилирования в норме. Интересно, что в клетках B-XJIJT данных больных не был метилирован ген WIF1 (рис. 6), а у больного ХЛЛ 26 также ген DKK1.

Гены ингибиторов сигнальных путей Jak/STAT и Ras полностью

неметилированы при B-XJIJI

С использованием метилспецифичной ПЦР нами изучено метилирование промоторно-экзонных CpG-островков генов ингибиторов сигнальных путей Jak/STAT и Ras, часто метилированных при других типах новообразований (приложение 1 к диссертации). Среди исследованных генов - CISH, PTPN6, SOCS1, SOCS3 (путь Jak/STAT) и RASSF1, RASSF4, RASSF5 (путь Ras). Только ген PTPN6 метилирован в одной из проб крови ХЛЛ 26 (2%, 1/46). Метилирование остальных генов не выявлено, т.е. картина их метилирования соответствует норме. Данные результаты полностью подтверждены прямым бисульфитным секвенированием.

Анализ связи гиперметилирования генов dkkI, pygo!, sfrpI и wifI с

факторами прогноза в-хлл

Характер метилирования

плато

Для изучения прогностического значения установленного аберрантного метилирования генов ЭКК1, РУСО!, 8РЯР1 и \VIF1 при В-ХЛЛ мы провели анализ соответствия характера метилирования гена (метилирован или неметилирован) с известными прогностическими факторами хронического лифолейкоза для больных с известной клинико-диагностической информацией. Среди анализируемых признаков были мутационный статус генов иммуноглобулинов ^Ун, стадия заболевания, исходный уровень лимфоцитов в крови, время удвоения лимфоцитов, характер поражения костого мозга и пол (таблица 4).

Таблица 4

Демографические и клинические данные

« 5

ю R о х

с я

Стадии

* Затушёванная ячейка — метилирование гена по данным метилспецифичной ПЦР (гены ИКК1, 1-17/' /, РАСТ]) или бисульфитного секвенирования (гены Р)Ю01). Прочерк - отсутствие данных.

ХЛЛ 1 ХЛЛ 2

хллз

ХЛЛ 38 ХЛЛ 7 ХЛЛ 35 ХЛЛ 36 ХЛЛ 24 ХЛЛ 11 ХЛЛ 13 ХЛЛ 14 ХЛЛ 18 ХЛЛ 19 ХЛЛ 21 ХЛЛ 40 ХЛЛ 39 ХЛЛ 30 ХЛЛ 37 ХЛЛ 47

46 М

55 М

65 М

57 М

45 м

49 м

48 м

43 м

40 ж

46 м

57 м

43 ж

31 м

48 м

63 м

54 м

42 м

41 ж

38 м

99% 99% 100% 90% 99% 100% 99% 99% 99% 94% 99% 98% 99%

100% 100% 95% 87% 98%

диффузный диффузный диффузный

очаговый диффузный очаговый диффузный диффузный диффузный диффузный диффузный диффузный

очаговый диффузный диффузный очаговый очаговый диффузный диффузный

ГМММЁ!,

U-МСП I

м-мсп 1

I t I t '

CpG-

OCIPOBOK

ÏL_

123456789 101112 □□□□□□□□□□□□

аиаававввввв

—QBBSBBBBBB

юаввоввввв

IBSOOOOBBBQ IQQQBBQBBBB IQÜQQQUHBBB IQQQHÜÜÜQCS IDDDDDDBBQQ ¡□□□□□□□□□В

Номер CO 1 2 3 4 S 6

ЙП gggSSS

хлл 39 аввввв

ХЛЛ 37 UBQBBB ХЛЛ 27 овииов ХЛЛ * ------

40 50 □□□□□□□□□□□□□□□С □□□□□ваанваааиас □□□□□□□□□□□□□□□с □□□□□□□□□□□□□ÜUC 60 ]□□□□□ 3BQDBU ¡□□■■В 1ППОПО

КЙЧЧРЧ Зч с" m г

Рис. 6. Картина метилирования промоторно-экзонных участков CpG-островков генов DKK1 (а) и WIF1 (б) в норме и при В-ХЛЛ. В верхней части пп.. а и б изображены электрофореграммы продуктов метил-специфичной ПЦР (МСП) с образцами ДНК из крови больных (пронумерованы). ПЦР-продукты получены амплификацией с праймерами, специфичными к неметилированному (U-МСП) и метилированному (М-МСП) аллелям. В использованных условиях амплификация строго специфична (контрольная электрофореграмма справа). Обозначения: норма 1-4 - ДНК из В-лимфоцитов здоровых доноров; норма - их эквимолярная смесь; НК 1-4 -ДНК из периферической крови четырёх других здоровых индивидов; SssI -полностью метилированная ДНК in vitro; негативный контроль - реакционная ПЦР-смесь без ДНК; положительный контроль - полностью метилированная ДНК. Стрелки указывают пробы, в которых обнаружена метилированная ДНК. Гены WIF1 и DKK1 метилированы в 65% (30/46) и 50% (23/46) образцов лейкозной крови соответственно. Результаты МСП полностью подтверждены с помощью бисульфитного секве-нирования.

Для всех указанных признаков, кроме исходного уровня лимфоцитов, статистически достоверных различий в группах больных с метилированным или неметилированным характером генов DKK1, PYGOl, SFRP1, WIF1 или комбинаций данных генов выявлено не было (п=15, Р>0,05, двусторонний точный критерий Фишера) В исследованной выборке исходный уровень лимфоцитов различался у больных с метилированными и неметилированными генами SFRP1 в группе с метилированным геном SFRP1 среднее абсолютное количество лимфоцитов составило 52,5 тыс/мкл, а в группе с неметилированным геном - 20,1 тыс/мкл (п=15, Р=0,031) Аналогично метилирование гена PYGOl ассоциировано с высоким уровнем лимфоцитоза 50,5 тыс/мкл и 25,4 тыс/мкл (п=14, Р=0,039) в группах с метилированным и неметилированным геном соответственно

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что хронический В-клеточный лимфолейкоз имеет не только генетическую природу и развивается в результате онкогенных мутаций, но в значительной степени обусловлен эпигенетически Обнаружены неизвестные ранее при В-ХЛЛ существенные изменения картины метилирования важных для онкогенеза генов, которые вместе с описанными ранее хромосомными аберрациями могут вносить важный вклад в патогенез данного лимфопролиферативного заболевания и предрасполагать к его прогрессии

Комплексное исследование картины метилирования ДНК в клетках В-ХЛЛ во многом стало возможным благодаря разработанному нами методу гибридизации модифицированной бисульфитом ДНК на ДНК-чипах с от situ синтезированными олигонуклеотидными зондами Так, при гибридизации проб ДНК из крови больных В-ХЛЛ и здоровых доноров на трех ДНК-чипах стало возможным одновременное сравнительное изучение метилирования 1544 CG-динукпеотидов 33 генов в норме и при патологии Данный метод дает воспроизводимые результаты, позволяет дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования и обладает очевидным преимуществом перед рутинно используемыми методами исследования метилирования ДНК, которые позволяют изучить метилирование только нескольких CG-динуклеотидов за один эксперимент Проверка результатов гибридизационного анализа на ДНК-чипах с помощью альтернативных способов - бисульфитного секвенирования и метилспецифичной ПЦР, выявила полное соответствие результатов, полученных разными методами

Аномально метилированные при В-ХЛЛ гены, обнаруженные в данной работе, кодируют компоненты сигнальных систем, контролирующих клеточный цикл и апоптоз и поэтому важных для онкогенеза Возможные последствия метилирования отражены в предлагаемой нами гипотетической схеме дерегуляции клеточного цикла и апоптоза (рис 7) Предлагаемая модель основана на предположении о потере экпрессии гиперметилированных генов в опухолевых клетках В пользу справедливости этого допущения свидетельствует большое множество литературных данных по реактивации метилированных генов в культуре опухолевых клеток или первичных опухолях после деметилирования ДНК с помощью ингибиторов ДНК-метилтрансфераз (Aguilera et al, 2006, Ai et al, 2006, Liu et al, 2006)

Установленная в работе высокая частота аномального метилирования генов компонентов сигнального пути Wnt предполагает особую важность данной системы передачи сигнала в патогенезе хронического В-клеточного лимфолейкоза Девять аномально метилированных генов негативно регулируют сигнальный путь Wnt (рис 7) Таковы гены WIF1, SFRP1,2, FRZB (SFRP3), DKK1-3, белковые продукты которых

Внеклеточное ^пространство

Цитозоль

Ядро

Нарушение контроля клеточного цикла

Эпигенетическая инактивация внутреннего

Пролиферация, избегание апоптоза

генетическая инактивация ^^

треннего пути апоптоза ***** .........•■••••'""""____

ЦП мембрана

ядерная аспаза9) мембрана

Рис. 7. Гипотетическая схема эпигенетической дерегуляции клеточного цикла и апоптоза в клетках хронического В-клеточного лимфолейкоза.

прямая активация опосредованная активация прямое ингибирование опосредованное ингибирование потеря активности Выделение серым - метилирование гена +Р - фосфорилирование +и - убиквитинирование

препятствуют узнаванию сигнальных молекул Wnt рецептором Fz на клеточной поверхности А также ген DACTI, ингибирующий цитозольный участок цепи передачи сигнала, и ген Е-кадхерина CDH1, цитоплазматический домен которого способен связывать белок ß-катенин - ключевой компонент сигнального пути, уменьшая его концентрацию в цитоплазме В результате ß-катенин может накапливаться в цитоплазме и транслоцироваться в ядро, где функционирует как транскрипционный фактор, активируя антиапоптотические гены (например, survivin) и гены, регулирующие клеточный цикл (MYC, циклин D и др) Результатом гиперметилирования данных генов в клетках B-XJIJI может быть активирование пути Wnt, которое действительно имеет место и отчасти обусловливает устойчивость к апоптозу т vitro (Lu et al, 2004)

Установлено аберрантное метилирование гена UBE2C, продукт которого является убиквитин-конъюгирующим ферментом, необходимым для деградации митотических циклинов, а также гена CDKN2B, кодирующего ингибитор циклин-зависимой киназы 4 Согласованая эпигенетическая инактивация данных генов (потеря экспрессии UBE2C при В-ХЛЛ продемонстрирована Klein et al, 2006), по-видимому, приводит к нарушению нормальной регуляции клеточного цикла и пролиферации клеток В-ХЛЛ

Метилирование гена RAD9A (инактивирован при В-ХЛЛ по Klein et al, 2006), продукт которого активируется при повреждении ДНК и через онкосупрессорный белок р53 приводит к остановке клеточного цикла в G1/S чекпойнте и апоптозу, может отчасти объяснять феномен генетической нестабильности клеток В-ХЛЛ (Chiorazzi et al, 2005) Метилирование генов DAPK1 (протеинкиназа, ассоциированная с рецептором смерти), ВАХ и APAF1 (проапоптотические компоненты внешнего пути атюптоза), по-видимому, вносят вклад в известный феномен устойчивости клеток В-ХЛЛ к апоптозу in vivo

В данной работе впервые продемонстрирована высокая частота de novo метилирования гена PYGOI, продукт которого функционирует в ядре клетки как коактиватор транскрипции генов-мишеней пути Wnt Функциональное значение метилирования гена PYGOI при В-ХЛЛ не совсем понятно Однако его гиперметилирорвание может отражать потерю равновесия между экспансией метилирования (от метилированной в норме части промотора) (рис 6) и защиты от него в клетках В-ХЛЛ (Киселева, Лихтенштейн, 2004)

Мы не утверждаем, что метилирование каждого гена имеет важную биологическую роль и располагает к прогрессии заболевания Но эпигенетическая потеря функции, по меньшей мере, некоторых из них (рис 7), по-видимому, вносит важный вклад в патогенез хронического лимфолейкоза

Не установлено метилирование генов сигнальных путей Jak/STAT и Ras, характерное для других типов опухолей, в т ч для B-клеточных лимфом (Koyama et al, 2003) Потеря экспрессии гена SOCS1 ингибитора пути Jak/STAT (Klein et al, 2001), очевидно, имеет другой неэпигенетический механизм

Высокая частота метилирования исследованных генов при В-ХЛЛ (например, SFRP1 - 91%, WIF1 - 65%, DKK1 - 50%) и их важная для онкогенеза роль подтверждает предположение о неслучайном, направленном механизме de novo метилирования генов в неоплазиях, выдвинутое рядом исследователей по результатам эпигенетического анализа солидных опухолей (Baylin, Ohm, 2006)

Таким образом, нами предложен возможный эпигенетичекий механизм развития хронического B-клеточного лимфолейкоза, который значительно дополняет описанную ранее генетическую картину данного заболевания Нарушения нормальной картины метилирования ряда важных для онкогенеза генов

свидетельствуют о целесообразности дальнейших поисков в области эпигенетики В-XJTJI для более полного понимания событий, инициирующих опухолевую трансформацию B-клеток, истинного механизма данного заболевания и разработки новой эффективной терапии, а также эпигенетических маркеров для ранней диагностики и прогноза

ВЫВОДЫ

1 Разработан метод масштабного анализа картины метилирования ДНК посредством гибридизации модифицированной бисульфитом ДНК с in situ синтезированными олигонуклеотидными зондами ДНК-чипа Характер метилирования каждого CG-динуклеотида оценивается с помощью пары 17-21-членных олигонуклеотидных зондов, комплементарных метилированной и неметилированной ДНК-мишеням Возможно одновременное исследование метилирования порядка 1000 CG-динуклеотидов в нескольких биологических пробах

2 Олигонуклеотидные зонды ДНК-чипа способны статистически достоверно дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования 91% пар зондов - 0 и 100% метилированную ДНК, 74% пар - 0, 50 и 100% метилированную ДНК, 62% пар - образцы ДНК 0, 25, 50 и 100% степени метилирования

3 Показана принципиальная возможность количественного анализа степени метилирования ДНК в биологических образцах с помощью олигонуклеотидных зондов чипа, селектированных по способности дискриминировать 0, 50 и 100% метилированные пробы и характеризующихся линейной зависимостью вычисленных индексов метилирования от известной степени метилирования гибридизуемой ДНК Обнаружено 12% пар зондов, полностью удовлетворяющих данному критерию

4 Предложены две стратегии эпигенетического анализа на ДНК-чипах Для поиска новых аномально метилированных локусов целесообразно качественное сравнительное исследование картины метилирования ДНК опухолевых и нормальных клеток без предварительной селекции зондов Для ранее описанных метилированных генов (например, в диагностических целях) возможно изучить степень их метилирования в опухоли, используя олигонуклеотидные зонды, способные к количественному анализу

5 Впервые установлено аберрантное метилирование потенциально важных в патогенезе хронического лимфолейкоза генов посредством гибризизации на олигонуклеотидных чипах проапоптотические гены АР AFI (4 из 10 проб крови больных), ВАХ (3/10), RAD9A (3/10), негативный регулятор клеточного цикла UBE2C (4/6), транскрипционный регулятор BCL6 (6/6), гомолог фасцина FSCN1 (2/6), ген негативных регуляторов сигнального пути Wnt DKK2 (3/7), DKK3 (2/7), FRZB (3/7), SFRP2 (2/7), ген ядерного компонента сигнального пути Wnt PYGOl (6/6) Подтверждено гиперметилирование генов кальцитонина CALCA (4/10), Е-кадхерина CDH1 (8/10), ингибитора циклин-зависимой киназы CDKN2B (5/10), проапоптотической протеинкиназы DAPK1 (3/10), рецептора глутамата GRM7 (5/5) и антагониста р53 TWIST2 (8/10)

6 Впервые показана высокая частота аномального метилирования генов негативных регуляторов сигнального пути Wnt WIF1 (65%, 30/46), DKK1 (50%, 23/46) и PYGOl (86%, 19/22) Ген SFRP1 дифференциально метилирован при В-XJIJI (91%, 20/22) Не выявлено метилирование генов, кодирующих негативные регуляторы сигнальных путей Jak/STAT и Ras CISH, PTPN6, SOCS1/3, RASSF1,4,5

7 Исходный уровень лимфоцитов в крови достоверно выше у больных с гиперметилированными генами SFRP1 и PYGOl Не обнаружено корреляции гиперметилирования с другими прогностическим факторами при B-XJIJI мутационным статусом генов иммуноглобулинов IgVH, временем удвоения лимфоцитов, характером поражения костного мозга и полом

8 Аберрантное метилирование генов DKK1, PYGOl, SFRP1 и WIF1 обнаружено на всех (в т ч ранних стадиях) B-XJIJI, что является основой для использования характера метилирования данных генов в дальнейшем как эпигенетических маркеров для ранней диагностики заболевания

9 Установленное гиперметилирование 5-областей генов, по-видимому, носит неслучайный характер и представляет эпигенетический механизм дерегуляции клеточного цикла и апоптоза, вносящих важный вклад в патогенез B-XJIJI

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

1 Епринцев А Т Полимеразная цепная реакция как универсальный метод диагностики и идентификации генов / А Т Епринцев, Е А Москалев, В Н Попов // Системный анализ и управление в биомедицинских системах - 2001 - Т 1, № 1 - С 915

2 Епринцев А Т Применение блоттинга для исследования экспрессии генов и их идентификации / А Т Епринцев, Е А Москалев, В Н Попов // Системный анализ и управление в биомедицинских системах -2002 - Т1,№4 - С 341-347

3 Москалев Е А Эпигенетика все ли закодировано в ДНК'' / Е А Москалев // Сборник статей по итогам ежегодной конференции «Философские проблемы биологии и медицины» - Воронеж -2004 -С 21-23

4 Попов В Н Методы молекулярно-биологических и генно-инженерных исследований Учебно-методическое пособие по специальности 020201(011600) -Биология / В Н Попов, А Т Епринцев, Е А Москалев - Воронеж Изд-во Воронежского университета, 2005 - 47 с

5 Moskalyov Е A Epigenetic profiling of B-cell chronic lymphocytic leukemia by using oligonucleotide microarrays / E A Moskalyov, V Beier, A T Eprmtsev, J D Hoheisel // Statusseminar Chiptechnologien Entwicklung, Forschung und Routine - Frankfurt am Main (2-3 February) - 2006 - P 59

6 Москалев E А Анализ паттерна метилирования геномной ДНК с помощью олигонуклеотидных ДНК-чипов / Е А Москалев, V Beier, J D Hoheisel, A T Епринцев // 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXIвека» -Пущино(17-21 апреля) -2006 -С 32

7 Moskalyov ЕА Development of array-based assay for high-resolution DNA-methylation profiling of B-cell chronic lymphocytic leukemia / E A Moskalyov, V Beier, A T Eprintsev, I A Vorobjev, E A Nikitin, J D Hoheisel // Second general meeting of alumni DKFZ - Heidelberg (12-13 May) -2006 - P 9

8 Москалев E А Изменения паттернов метилирования геномной ДНК при канцерогенезе разработка метода гибридизационного анализа на олигонуклеотидных чипах / Е А Москалев, А Т Епринцев, V Beier, И А Воробьев, Е А Никитин, J D Hoheisel // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов межрегион сб науч работ, посвященный памяти А А Землянухина -Воронеж ЦЧРкн изд-во -2006 -Вып 8 -С 141-154

9 Москалев Е А Разработка высокопроизводительного метода анализа паттернов метилирования геномной ДНК опухолевых клеток с помощью гибридизации на олигонуклеотидных чипах / Е А Москалев, А Т Епринцев, И А Воробьев, J

Hoheisel // XIX зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» - Москва (7-9 февраля), 2007 - С 42

10 Nikitin ЕА Expression level of lipoprotein lipase and dystrophin genes predict survival in B-cell chronic lymphocytic leukemia / E A Nikitin, S G Malakho, В V Biderman, A V Baranova, Y Y Lone, A Y Shevelev, M M Peklo, T N Vlasik, E A Moskalev, В V Zingerman, I A Vorob'ev, А В Poltaraus, А В Sudankov, A I Vorobjev //Leukemia and Lymphoma -2007 -V 48, №5 -P 912-922

11 Москалев E А Эпигенетический анализ онкогенных сигнальных путей активация пути Wnt в патогенезе хронического B-клеточного лимфолейкоза / Е А Москалев, А Т Епринцев, V Beier, Е А Никитин, И А Воробьев, J D Hoheisel // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов межрегион сб науч работ, посвященный памяти А А Землянухина - Воронеж ЦЧР кн изд-во — 2007 -Вып 9 - С 4-13

12 Москалев Е А Методы определения картины метилирования геномной ДНК при канцерогенезе от отдельных нуклеотидов к метилому / Е А Москалев, А Т Епринцев, J D Hoheisel//Молекулярная биология -2007 -Т 41, № 5 - С 793-807

Статьи № 1,2,12 опубликованы в изданиях, соответствующих списку ВАК РФ.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю А Т Епринцеву за поддержку начинания с исследованием метилирования ДНК в опухолях и чуткое руководство, J D Hoheisel за возможность анализа метилирования Опухолевой ДНК на олигонуклеотидных чипах и финансирование данной серии экспериментов, И А Воробьеву и Е А Никитину, любезно предоставившим пробы крови больных и клинико-диагностические данные, за ценные советы по работе и плодотворное обсуждение стратегии исследований, а также Д В Василенко за терпеливые и компетентные ответы на мои дилетантские вопросы о медицинских аспектах онкологических заболеваний, научно-педагогическому коллективу кафедры физиологии и биохимии растений ВГУ

Особые слова благодарности В И Моисееву, познакомившему меня с новым взглядом на феномен жизни и патологии и более других оказавшему влияние на мое мировоззрение

Бесконечно благодарю мою семью и особенно маму за безоговорочную и постоянную поддержку на протяжении всего проекта, терпение и веру в успех

Искренне признателен В Н Попову, Л П Овчинникову, О Н Озолинь, М Ю Грабович, V Beier, О и М Скабкиным, N Tönisson, С Steinhoff, А Б Сударикову, Л К Воиновой, Т И Дедовой, С В Золотаревой, В Кузнецову, Я Сягайло, J Pullat, М Тутукиной, М Климовой, О Фоменко, Д Федорину, Ю Леоновой, Т П и В М Мининым, И М Каниной, А Гладких, Е Грицову, М Beier, A Thiel, С Busold, а также моим студентам-медикам - всем, без кого данная работа и её автор не могли состояться

Благодарен Германской службе академических обменов (DAAD) и Министерству образования и науки России за финансирование части работы

Подписано в печать 06 11 07 Формат 60*84 '/|6 Уел печ л 1,4 Тираж 100 экз Заказ 2312

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издагельско-полиграфического центра Воронежского государственного университета 394000, Воронеж, ул Пушкинская 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Москалёв, Евгений Александрович

Список сокращений и обозначений.g

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.,

1.1. ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ОНКОГЕНЕЗА.

1.1.1. Картина метилирования геномной ДНК (метилом) как эпигенетическая программа клеток.

1.1.1.1. Неполнота генетической информации и концепция эпигенома.

1.1.1.2. Природа эпигенетических модификаций.

1.1.1.2.1. Нормальная картина метилирования геномной ДНК.¡

1.1.1.2.2. Роль ДНК-метилтрансфераз в формировании метилома.

1.1.1.2.3. Ковалентные модификации гистонов. Гипотеза гистонового кода. j

1.1.1.3. Механизм репликации и взаимосвязь разных типов эпигенетических модификаций в клетке.

1.1.1.4. Реализация эпигенетической информации.

1.1.2. Аномальные изменения метилома и их роль в этиологии и патогенезе опухолей, jg

1.1.2.1. Ограниченность генетической (мутационной) модели онкогенеза.\ g

1.1.2.2. Локальное гиперметилирование CpG-островков de novo как эпигенетический механизм инактивации генов-супрессоров.

1.1.2.3. Общее деметилирование ДНК - фактор нестабильности генома.

1.1.2.4. Системы передачи онкогенных сигналов в клетке.

1.1.2.4.1. Роль протоонкогенов и генов-супрессоров в системе передачи сигналов в клетке.

1.1.2.4.2. Направленный характер эпигенетической инактивации генов-супрессоров

1.1.2.4.3. Сигнальный путь Wnt: митогенные и антиапоптотические сигналы.

1.1.2.4.4. Сигнальный путь Jak/STAT: регуляция цитокинами.

1.1.2.4.5. Сигнальный путь Ras: контроль апоптоза.

1.1.3. Анализ картины метилирования ДНК для ранней диагностики и прогноза онкологических заболеваний.

1.1.3.1. Онкомаркеры в молекулярной клинической диагностике опухолей.

1.1.3.1.1. Критерии идеального онкомаркера.

1.1.3.1.2. Чувствительность, специфичность и прогностические показатели маркеров опухоли.

1.1.3.1.3. Маркеры метилирования ДНК в биологических жидкостях для диагностики и прогноза онкозаболеваний.

1.1.3.1.4. Эпигенетическая классификация опухолей.

1.1.4. Эпигенетическая терапия опухолей: деметилирующие агенты как противоопухолевые химиотерапевтические средства.

1.1.5. Основные подходы к экспериментальному анализу картины метилирования ДНК.

1.1.5.1. Общие принципы дискриминации цитозина и 5-метилцитозина.

1.1.5.2. Методы локального эпигенетического анализа.

1.1.5.3. Методы крупномасштабного эпигенетического анализа.

1.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПАТОГЕНЕЗА ХРОНИЧЕСКОГО

В-КЛЕТОЧНОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА (В-ХЛЛ).

1.2.1. В-ХЛЛ - нозологическая форма зрелоклеточных опухолей из В-лимфоцитов.

1.2Л. 1. Механизмы нормальной дифференцировки и активации В-клеток.

1.2.1.2. Стадии В-ХЛЛ.

1.2.1.3. Роль цитогенетических изменений в патогенезе В-ХЛЛ.

1.2.1.4. Основные молекулярные нарушения и новые прогностические факторы В-ХЛЛ.

1.2.1.5. Роль В-клеточного рецептора и сигналов от микроокружения в прогрессии В-ХЛЛ.

1.2.1.6. Гипотетическая модель происхождения и эволюции клона В-ХЛЛ.

1.2.2. Крупномасштабный профиль экспрессии генов в клетках В-ХЛЛ.5]

1.2.3. Эпигенетические изменения при В-ХЛЛ.

1.2.3.1. Различия общего уровня метилирования ДНК в формах В-ХЛЛ с разным мутационным статусом генов иммуноглобулинов.

1.2.3.2. Гиперметилирование промоторных Срв-островков некоторых генов.

1.2.3.3. Крупномасштабный анализ метилома в клоне В-ХЛЛ.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Цель и задачи исследования.

2.2. Объекты и методы исследования.

2.2.1. Объекты исследования.

2.2.2. Методы исследования.

2.2.2.1. Забор периферической крови.

2.2.2.2. Селекция В-лимфоцитов.

2.2.2.3. Выделение геномной ДНК.

2.2.2.4. Модификация ДНК бисульфитом натрия.

2.2.2.5. Разработка олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-амплификации ДНК, метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования.

2.2.2.6. Условия ПЦР-амплификации.

2.2.2.7. Определение концентрации ПЦР-продуктов денситографически.

2.2.2.8. Очистка ПЦР-продуктов.

2.2.2.9. Метилирование ДНК in vitro.

2.2.2.10. Мечение ДНК биотином.

2.2.2.11. Проектирование олигонуклеотидного состава ДНК-чипов.

2.2.2.12. Синтез олигонуклеотидных ДНК-чипов in situ.

2.2.2.13. Гибридизация, отмывание и детекция флуоресцентных сигналов.

2.2.2.14. Анализ флуоресцентных сигналов.

2.2.2.15. Бисульфитное секвенирование ДНК.

2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных.

2.3. Полученные результаты и их обсуждение.

2.3.1. Разработка высокопроизводительного метода определения картины метилирования ДНК посредством гибридизации на олигонуклеотидных ДНК-чипах.

2.3.1.1. Гены-кандидаты для анализа метилирования при B-XJIJI.

2.3.1.2. Схема типичного эксперимента по гибридизации на ДНК-чипе.

2.3.1.3. Получение ДНК разной степени метилирования.

2.3.1.4. Способность олигонуклеотидных зондов дискриминировать ДНК разной степени метилирования.

2.3.1.5. Высокая воспроизводимость результатов.

2.3.1.6. Отбор эффективно дискриминирующих олигонуклеотидных зондов.

2.3.1.7. Прямое сравнение индексов метилирования ДНК в контрольной и клинической пробах.

2.3.2. Гибридизационный анализ картины метилирования ДНК в опухолевых клетках при В-ХЛЛ.

2.3.2.1. Олигонуклеотидные чипы для анализа метилирования ДНК.

2.3.2.2. Разработка олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-амплификации модифицированной бисульфитом ДНК и оптимизация условий проведения ПЦР

2.3.2.3. Подготовка пробы ДНК больных для гибридизации на чипах.

2.3.2.4. Аберрантное гиперметилирование промоторно-экзонных CpG-островков

18 генов при B-XJIJI.

2.3.2.5. Шесть аномально метилированных генов в клетках B-XJIJI кодируют белковые компоненты онкогенного сигнального пути Wnt.

2.3.3. Анализ метилирования генов негативных регуляторов сигнальных путей Wnt, Jak/STAT и Ras с использованием бисульфитного секвенирования и метилспецифичной ПЦР.

2.3.3.1. Высокая частота аномального метилирования генов ингибиторов пути

Wnt DKK1, SFRP1,WIF1.

2.3.3.2. Гены компонентов белкового комплекса деградации р-катенина АРС и GSK3B неметилированы при В-ХЛЛ.

2.3.3.3. Гены негативных регуляторов систем передачи сигналов Jak/STAT и Ras полностью неметилированы при В-ХЛЛ.

2.3.3.4. Анализ связи характера метилирования генов DKK1, PYGOl, SFRP1 и WIF1 с факторами прогноза В-ХЛЛ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аномальные изменения картины метилирования геномной ДНК при хроническом В-клеточном лимфолейкозе"

Актуальность проблемы. Опухолевый фенотип клетки является результатом аномального функционирования систем передачи сигналов в клетке [9]. Онкогенные сигнальные пути (Ras, Wnt, Jak/STAT, Akt, Hedgehog, Notch и другие) проводят митогенные и антиапоптотические сигналы в ядро от рецепторов на клеточной мембране [282]. Достигшие ядра сигналы активируют гены-мишени, запуская генетические программы клеточного роста, пролиферации клеток и избегания апоптоза [153]. В отличие от дифференцированных клеток онкогенные сигнальные пути в опухолях активны конститутивно вне зависимости от наличия реального сигнала (например, фактора роста).

В основе аберрантного функционирования сигнальных путей в опухолях лежат описанные ранее генетические нарушения. Точечные и хромосомные мутации, амплификации генов, образующиеся химерные гены приводят к потере экспрессии генов ингибиторов сигнальных путей (потенциальных генов-супрессоров), активации генов, продукты которых участвуют в цепи передачи сигнала, или к изменению структуры их белковых продуктов (протоонкогены). Традиционная модель онкогенеза [185] предполагает прогрессивное накопление генетических нарушений в клетке, необходимых для её трансформации. Следствием данной модели является случайность мутаций и их необратимость. Подобный взгляд на онкогенез определяет используемые подходы к терапии опухолей.

В настоящее время происходит существенный пересмотр представлений об этиологии опухолей в связи с обнаружением значительных эпигенетических нарушений во всех изученных типах новообразований. К эпигенетическим модификациям клетки относят картину метилирования геномной ДНК и паттерн модификаций хроматина. Эпигенетические модификации определяют митотически наследуемые изменения функции генов, происходящие без изменения их нуклеотидных последовательностей [240]. Показано, что аберрантное гиперметилирование 5'-областей генов связано с их инактивацией [50, 113, 119, 197], а общее деметилирование ДНК сопряжено с возрастанием нестабильности генома [10]. Таким образом, эпигенетические нарушения функционально не менее важны, чем онкогенные мутации. Судьба клетки, приобретшей онкогенную мутацию, по-видимому, сильно зависит от имеющихся в ней эпигенетических нарушений [134]. Изменения нормального метилирования ДНК появляются на самых ранних этапах трансформации, когда клетка еще не приобрела свойства опухолевой [161, 188, 200, 220, 292], и поэтому представляют исключительный интерес для ранней диагностики и прогноза онкозаболеваний. Аномальное метилирование генов онкогенного сигнального пути может предрасполагать к накоплению мутаций в генах того же пути (неслучайность мутаций) [63], и именно эпигенетические нарушения могут инициировать трансформацию клеток по меньшей мере в ряде случаев.

Механизмы столь значительных изменений картины метилирования ДНК в опухолях только начинают исследовать. К сегодняшнему дню детально описана картина метилирования не более 0,1% генома [243]. Знание эпигенетических нарушений в опухолевых клетках иключительно важно с точки зрения понимания этиологии новообразований, а также - учитывая обратимость эпигенетических изменений - для разработки новых эпигенетических подходов к терапии опухолей. Все это выводит на первый план методические аспекты исследования картины метилирования ДНК. Большинство используемых в настоящее время методов обладают низкой информативностью и позволяют анализировать характер метилирования только одного или нескольких нуклеотидов за один эксперимент. Особую актуальность поэтому приобретает разработка новых методов крупномасштабного и высокопроизводительного анализа метилирования ДНК, с помощью которых можно одновременно анализировать характер метилирования множества (сотни, тысячи) нуклеотидов (генов) в нескольких биологических образцах в ходе одного эксперимента.

Лимфопролиферативное заболевание хронический В-клеточный лимфолейкоз (В-ХЛЛ) имеет относительно благоприятный прогноз, но крайне гетерогенное течение [16]. Клинические, морфологические и цитогенетические исследования позволяют считать В-ХЛЛ неоднородным заболеванием, имеющим несколько форм с различной клинической картиной [20]. Цитогенетические нарушения в опухолевом клоне редко обнаруживаются на ранних стадиях заболевания [75], что позволяет предположить важный вклад эпигенетических изменений в патогенез В-ХЛЛ. Однако характер метилирования геномной ДНК в опухолевых клетках при В-ХЛЛ мало изучен. Имеющиеся данные описывают общее содержание 5-метилцитозина, картины метилирования нескольких генов, а также аномальное метилирование отдельных Св-динуклеотидов в масштабе генома. Функциональное значение изменений картины метилирования ДНК при В-ХЛЛ в целом остаётся неясным.

В связи с этим важным является исследование характера метилирования потенциально важных в патогенезе В-ХЛЛ генов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное исследование картины метилирования 5'-регионов (промотор, первый экзон) потенциально важных для онкогенеза генов в опухолевых клетках при хроническом В-клеточном лимфолейкозе и в В-лимфоцитах здоровых доноров.

Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. разработать метод анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на in situ синтезированных олигонуклеотидных ДНК-чипах;

2. выбрать гены-кандидаты для изучения метилирования их 5'-областей (по данным литературы);

3. выделить геномную ДНК из клеток периферической крови больных B-XJIJ1 и В-лимфоцитов здоровых доноров и модифицировать её бисульфитом натрия;

4. разработать олигонуклеотидные праймеры и провести ПЦР-амплификацию исследуемых участков промоторных областей генов на нативной и модифицированной бисульфитом геномной ДНК (пробоподготовка);

5. спроектировать олигонуклеотидный состав ДНК-чипов для изучения характера метилирования искомых генов и синтезировать ДНК-чипы;

6. провести гибридизационный анализ проб ДНК из опухолевых клеток больных В-ХЛЛ и периферической крови здоровых доноров на ДНК-чипах;

7. проверить полученные результаты с помощью широко используемых альтернативных методов - метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования ДНК;

8. сопоставить характер метилирования ДНК с известными прогностическими факторами В-ХЛЛ: мутационным статусом генов иммуноглобулинов IgVH, уровнем лимфоцитов исходно, временем удвоения лимфоцитов и полом.

9. предложить гипотетический механизм аномальной эпигенетической активации сигнального пути Wnt в клоне В-ХЛЛ.

Научная новизна. Разработанный метод масштабного анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на олигонуклеотидных чипах не имеет аналогов в отечественной литературе и позволяет дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования. В ходе одного эксперимента возможен одновременный анализ метилирования 500-1000 индивидуальных CG-динуклеотидов в каждой из восьми биологических проб. Показана возможность количественного анализа степени метилирования CG-динуклеотидов с помощью гибридизации с зондами чипа, селектированных по способности дискриминировать пробы ДНК известной степени метилирования. Впервые в опухолевых клетках В-ХЛЛ выявлено аберрантное метилирование генов сигнального пути Wnt: DKK1 (50%, 23/46 образцов), PYG01 (86%, 19/22), WIF1 (65%, 30/46), DACT1 (6%, 3/46), PTPN6 (2%, 1/46), DKK2 (3/7), DKK3 (2/7); проапоптотических генов APAF1 (4/10), ВАХ (3/10) и RAD9A (3/10); гена, контролирующего клеточный цикл, UBE2C (4/6), а также генов BCL6 (6/6) и FSCN1 (2/6).

Гиперметилирование промоторных CpG-островков генов, кодирующих негативные регуляторы сигнального пути Wnt, по-видимому, представляет эпигенетический механизм его аномальной активации при B-XJIJI. Установлено отсутствие метилирования генов, кодирующих негативные регуляторы путей Jak/STAT и Ras.

Практическая значимость. Метод масштабного анализа картины метилирования ДНК с помощью гибридизации на олигонуклеотидных чипах, разработанный в данной работе, может быть использован для эпигенетического анализа (в т.ч. количественного) любого типа опухоли, поиска новых локусов, подверженных метилированию в новообразованиях. После дополнительных испытаний возможно использование метода в диагностических целях по ранее описанным маркерам метилирования ДНК в биоптатах опухолей или биологических жидкостях организма (например, ДНК плазмы или сыворотки крови). Установленное гиперметилирование генов SFRP1, WIF1, PYG01 и ряда других при B-XJIJ1 создаёт основу для разработки клинического теста для диагностики В-XJIJT, а также испытаний деметилирующих агентов (например, децитабина) в качестве новых химиотерапевтических средств. Обнаруженное метилирование генов негативных регуляторов сигнального пути Wnt важно для разработки новых средств направленной терапии B-XJIJI.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, в спецкурсах «Молекулярная биология», «Генетическая инженерия», «Молекулярная диагностика», а также при проведении автором практиктических и семинарских занятий по биохимии в Воронежской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Основные положения работы были представлены на XIX зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007); ежегодной международной конференции по методам анализа с помощью биочипов «Chiptechnologien» (Франкфурт, 2006); 2-ой конференции Германского центра изучения рака (Gemían Cancer Research Center) (Хайдельберг, 2006); 10-й Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); межрегиональных конференциях, посвященных памяти проф. А. А. Землянухина (Воронеж, 2006, 2007); ежегодной научной сессии отчётной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2006); ежегодной конференции «Философские проблемы биологии и медицины» (Воронеж, 2004). По итогам 2-ой конференции Германского центра изучения рака сообщение было признано победителем конкурса.

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 6 статьях, 5 тезисах и 1 учебно-методическом пособии.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 204 страницах машинописного текста (151 стр. основного текста и 53 стр. приложений) и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (297 источников). Иллюстрационный материал включает 41 рисунок и 8 таблиц. Материал, не вошедший в основной текст работы, изложен в пяти приложениях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Москалёв, Евгений Александрович

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод масштабного анализа картины метилирования ДНК посредством гибридизации модифицированной бисульфитом ДНК с /и si tu синтезированными олигонуклеотидными зондами ДНК-чипа. Характер метилирования каждого CG-динуклеотида оценивается с помощью пары 17-21-членных олигонуклеотидных зондов, комплементарных метилированной и неметилированной ДНК-мишеням. Возможно одновременное исследование метилирования порядка 1000 CG-динуклеотидов в нескольких биологических пробах.

2.0лигонуклеотидные зонды ДНК-чипа способны статистически достоверно дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования: 91% пар зондов - 0 и 100% метилированную ДНК, 74% пар - 0, 50 и 100% метилированную ДНК, 62% пар -образцы ДНК 0, 25, 50 и 100% степени метилирования.

3.Показана принципиальная возможность количественного анализа степени метилирования ДНК в биологических образцах с помощью олигонуклеотидных зондов чипа, селектированных по способности дискриминировать 0, 50 и 100% метилированные пробы и характеризующихся линейной зависимостью вычисленных индексов метилирования от известной степени метилирования гибридизуемой ДНК. Обнаружено 12% пар зондов, полностью удовлетворяющих данному критерию.

4.Предложены две стратегии эпигенетического анализа на ДНК-чипах. Для поиска новых аномально метилированных локусов целесообразно качественное сравнительное исследование картины метилирования ДНК опухолевых и нормальных клеток без предварительной селекции зондов. Для ранее описанных метилированных генов (например, в диагностических целях) возможно изучить степень их метилирования в опухоли, используя олигонуклеотидные зонды, способные к количественному анализу.

5.Впервые установлено аберрантное метилирование потенциально важных в патогенезе хронического лимфолейкоза генов посредством гибризизации на олигонуклеотидных чипах: проапоптотические гены APAF1 (4 из 10 проб крови больных), ВАХ (3/10), RAD9A (3/10), негативный регулятор клеточного цикла UBE2C (4/6), транскрипционный регулятор BCL6 (6/6), гомолог фасцина FSCN1 (2/6), ген негативных регуляторов сигнального пути Wnt DKK2 (3/7), DKK3 (2/7), FRZB (3/7), SFRP2 (2/7), ген ядерного компонента сигнального пути Wnt PYGOl (6/6). Подтверждено гиперметилирование генов кальцитонина CALCA (4/10), Е-кадхерина CDH1 (8/10), ингибитора циклин-зависимой киназы CDKN2B (5/10), проапоптотической протеинкиназы DAPK1 (3/10), рецептора глутамата GRM7 (5/5) и антагониста р53 TWIST2 (8/10).

6.Впервые показана высокая частота аномального метилирования генов негативных регуляторов сигнального пути Wnt WIF1 (65%, 30/46), DKK1 (50%, 23/46) и PYG01 (86%, 19/22). Ген SFRP1 дифференциально метилирован при В-ХЛЛ (91%, 20/22). Не выявлено метилирование генов, кодирующих негативные регуляторы сигнальных путей Jak/STAT и Ras: CISH, PTPN6, SOCS1/3, RASSF1,4,5.

7.Исходный уровень лимфоцитов в крови достоверно выше у больных с гиперметилированными генами SFRP1 и PYG01. Не обнаружено корреляции гиперметилирования с другими прогностическим факторами при B-XJTJT: мутационным статусом генов иммуноглобулинов IgVn, временем удвоения лимфоцитов, характером поражения костного мозга и полом.

8.Аберрантное метилирование генов DKK1, PYGOl, SFRP1 и WIF1 обнаружено на всех (в т.ч. ранних стадиях) В-ХЛЛ, что является основой для использования характера метилирования данных генов в дальнейшем как эпигенетических маркеров для ранней диагностики заболевания.

Э.Установленное гиперметилирование 5'-областей генов, по-видимому, носит неслучайный характер и представляет эпигенетический механизм дерегуляции клеточного цикла и апоптоза, вносящих важный вклад в патогенез В-ХЛЛ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что хронический В-клеточный лимфолейкоз имеет не только генетическую природу и развивается в результате онкогенных мутаций, но в значительной степени обусловлен эпигенетически. Обнаружены неизвестные ранее при В-ХЛЛ существенные изменения картины метилирования важных для онкогенеза генов, которые вместе с описанными ранее хромосомными аберрациями могут вносить важный вклад в патогенез данного лимфопролиферативного заболевания и предрасполагать к его прогрессии.

Комплексное исследование картины метилирования ДНК в клетках В-ХЛЛ во многом стало возможным благодаря разработанному нами методу гибридизации модифицированной бисульфитом ДНК на ДНК-чипах с in situ синтезированными олигонуклеотидными зондами. Так, при гибридизации проб ДНК из крови больных В-ХЛЛ и здоровых доноров на трёх ДНК-чипах стало возможным одновременное сравнительное изучение метилирования 1544 CG-динуклеотидов 33 генов в норме и при патологии. Данный метод даёт воспроизводимые результаты, позволяет дискриминировать пробы ДНК разной степени метилирования и обладает очевидным преимуществом перед рутинно используемыми методами исследования метилирования ДНК, которые позволяют изучить метилирование только нескольких CG-динуклеотидов за один эксперимент. Проверка результатов гибридизационного анализа на ДНК-чипах с помощью альтернативных способов - бисульфитного секвенирования и метилспецифичной ПЦР, выявила полное соответствие результатов, полученных разными методами.

Аномально метилированные при В-ХЛЛ гены, обнаруженные в данной работе, кодируют компоненты сигнальных систем, контролирующих клеточный цикл и апоптоз и поэтому важных для онкогенеза. Возможные последствия метилирования отражены в предлагаемой нами гипотетической схеме дерегуляции клеточного цикла и апоптоза (рис. 41). Предлагаемая модель основана на предположении о потере экпрессии гиперметилированных генов в опухолевых клетках. В пользу справедливости этого допущения свидетельствует большое множество литературных данных по реактивации метилированных генов в культуре опухолевых клеток или первичных опухолях после деметилирования ДНК с помощью ингибиторов ДНК-метилтрансфераз.

Установленная в работе высокая частота аномального метилирования генов компонентов сигнального пути Wnt предполагает особую важность данной системы

Внеклеточное ^пространство я

Цитозоль

Ядро

Нарушение контроля клеточного цикла

Пролиферация, избегание апоптоза

ЦП мембрана

Рис. 41. Гипотетическая схема эпигенетической дерегуляции клеточного цикла и апоптоза в клетках хронического В-клеточного лимфолейкоза. прямая активация опосредованная активация прямое ингибирование опосредованное ингибирование потеря активности Выделение серым - метилирование гена +Р - фосфорилирование +и - убиквитинирование передачи сигнала в патогенезе хронического B-клеточного лимфолейкоза. Девять аномально метилированных генов негативно регулируют сигнальный путь Wnt (рис. 41). Таковы гены WIF1, SFRP1.2, FRZB (SFRP3), DKK1-3, белковые продукты которых препятствуют узнаванию сигнальных молекул Wnt рецептором Fz на клеточной поверхности. А также ген DACT1, ингибирующий цитозольный участок цепи передачи сигнала, и ген Е-кадхерина CDH1, цитоплазматический домен которого способен связывать белок ß-катенин - ключевой компонент сигнального пути, уменьшая его концентрацию в цитоплазме. В результате ß-катенин может накапливаться в цитоплазме и транслоцироваться в ядро, где функционирует как транскрипционный фактор, активируя антиапоптотические гены (например, survivin) и гены, регулирующие клеточный цикл (МУС, циклин D и др). Результатом гиперметилирования данных генов в клетках B-XJLJ1 может быть активирование пути Wnt, которое действительно имеет место и отчасти обусловливает устойчивость к апоптозу in vitro.

Установлено аберрантное метилирование гена UBE2C, продукт которого является убиквитин-конъюгирующим ферментом, необходимым для деградации митотических циклинов, а также гена CDKN2B, кодирующего ингибитор циклин-зависимой киназы 4. Согласованая эпигенетическая инактивация данных генов (потеря экспрессии UBE2C при B-XJ1JI продемонстрирована Klein et al., 2006), по-видимому, приводит к нарушению нормальной регуляции клеточного цикла и пролиферации клеток B-XJLJ1.

Метилирование гена RAD9A (инактивирован при В-ХЛЛ), продукт которого активируется при повреждении ДНК и через онкосупрессорный белок р53 приводит к остановке клеточного цикла в G1/S чекпойнте и апоптозу, может отчасти объяснять феномен генетической нестабильности клеток В-ХЛЛ. Метилирование генов DAPK1 (протеинкиназа, ассоциированная с рецептором смерти), В АХ и АР AFI (проапоптотические компоненты внешнего пути апоптоза), по-видимому, вносят вклад в известный феномен устойчивости клеток В-ХЛЛ к апоптозу in vivo.

В данной работе впервые продемонстрирована высокая частота de novo метилирования гена PYG01, продукт которого функционирует в ядре клетки как коактиватор транскрипции генов-мишеней пути Wnt. Функциональное значение метилирования гена PYG01 при В-ХЛЛ не совсем понятно. Однако его гиперметилирорвание может отражать потерю равновесия между экспансией метилирования (от метилированной в норме части промотора) (рис. 29) и защиты от него в клетках В-ХЛЛ.

Мы не утверждаем, что метилирование каждого гена имеет важную биологическую роль и располагает к прогрессии заболевания. Но эпигенетическая потеря функции, по меньшей мере, некоторых из них (рис. 41), по-видимому, вносит важный вклад в патогенез хронического лимфолейкоза.

Другой важный для онкогенеза путь Jak/STAT передаёт сигнал от рецепторов цитокинов на клеточной мембране в ядро. Активный путь Jak/STAT приводит к клеточному росту и избеганию апоптоза за счёт усиления транскрипции генов-мишеней [166, 171]. Для настоящего исследования путь Jak/STAT был выбран ввиду ранее обнаруженной потери экспрессии гена его негативного регулятора SOCS1 в клетках В-ХЛЛ по сравнению с нормальными В-лимфоцитами (в 18,5 раз) [147]. Гиперметилирование данного гена является частым событием в разных типах опухолей (Приложение 1). Инактивация данного гена может вносить вклад в аномальную передачу сигнала через путь Jak/STAT при В-ХЛЛ. Ген другого негативного регулятора PTPN6(SHP1) инактивирован метилированием в В-клеточных лимфомах [45]. Для исследования предположения об эпигенетическом механизме потери экспрессии генов был исследован характер метилирования промоторно-экзонных CpG-островков генов SOCS1/3, PTPN6 и CISH (Рис. 34-37). По результатам метилспецифичной ПЦР и бисульфитного секвенирования метилирование гена PTPN6 обнаружено только в 1 из 46 проб крови больных (2%). Метилирование генов SOCS1/3 и CISH не выявлено ни в одном случае. Данные результаты позволяют предположить существование другого неэпигенетического механизма активации данного сигнального пути.

Метилирование генов RASSF1, RASSF4 и RASSF5, кодирующих эффекторы протоонкобелка Ras и контролирующих апоптоз, также не выявлено. Данные результаты свидетельствуют о том, что сигнальный путь Ras, по-видимому, не вовлечён в патогенез В-ХЛЛ (несмотря на высокую частоту метилирования данных генов в других типах опухолей (Приложение 1)), т.к. уровень экспрессии данных генов не отличается в опухолевы В-клетках от нормальных В-лимфоцитов [147].

Результаты гибридизационного анализа генов RAD9A, CDKN2B, UBE2C, APAF1, ВАХ, DAPK1, GRM7, TWIST2 полностью воспроизводят ранее обнаруженное при В-ХЛЛ метилирование данных генов, что свидетельствует о надёжности разработанного метода. Кроме того, метилирование генов 8РЯР1, СВН1 и РУ001 было подтверждено с помощью широко используемых методов бисульфитного секвенирования и метилспецифичной ПЦР (рис. 28, 29).

Таким образом, нами предложен возможный эпигенетичекий механизм развития хронического В-клеточного лимфолейкоза, который значительно дополняет описанную ранее генетическую картину данного заболевания. Нарушения нормальной картины метилирования ряда важных для онкогенеза генов свидетельствуют о целесообразности дальнейших поисков в области эпигенетики В-ХЛЛ для более полного понимания событий, инициирующих опухолевую трансформацию В-клеток, истинного механизма данного заболевания и разработки новой эффективной терапии, а также эпигенетических маркеров для ранней диагностики и прогноза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Москалёв, Евгений Александрович, Воронеж

1. Аномальное метилирование генов-супрессоров опухолевого роста имикросателлситная нестабильность в предраковых состояниях шейки матки / Т. В. Кекеева и др.. // Молекуляр. биология. 2006. - Т. 40, № 2. - С. 224-230.

2. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом ракемолочной железы / В. В. Землякова и др.. // Молекуляр. биология. 2003. -Т. 37, № 4. - С. 696-703.

3. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеленуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике / В. Барский и др.. // Молекуляр. биология. 2002. - V. 36, № 4. -Р. 563-584.

4. Ванюшин Б. Ф. Энзиматическое метилирование ДНК эпигенетический контроль загенетическими функциями клетки / Б. Ф. Ванюшин // Биохимия. 2005. - Т. 70, №5.-С. 598-611.

5. Глик Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение / Б. Глик, Дж.

6. Пастернак. М.: Мир, 2002. - 589 с.

7. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологическихзаболеваниях / Д. В. Залетаев и др.. // Молекуляр. биология. 2004. - Т. 38, № 2. -С. 213-223.

8. Москалёв Е. А. Методы определения картины метилирования геномной ДНК приканцерогенезе: от отдельных нуклеотидов к метилому / Е. А. Москалёв, А. Т. Епринцев, J. D. Hoheisel // Молекуляр. биология. 2007. - Т. 41, №. 5. - С. 793-807.

9. Изменение метилирования ДНК лимфоцитов крупного рогатого скота прихроническом лимфолейкозе / Н. Н. Бурцева и др.. // Биохимия. 1977. - Т. 42. -С. 1690-1696.

10. Канцерогенез: Руководство / Под ред. Д. Г. Заридзе. М.: Медицина, 2004. - С. 191-203.

11. Киселёва Н. П. 2005. Деметилирование ДНК и канцерогенез / Н. П. Киселева,

12. Ф. Л. Киселев // Биохимия. Т. 70, № 7. - С. 900-911.

13. Кольман Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рём. М.: Мир, 2000. - 469 с.

14. Лакин Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин. 4-е издание. - М.: Высш. школа, 1990. - 352 с.

15. Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия / В. Дж. Маршалл. М. - СПб.:

16. Издательство БИНОМ»-«Невский Диалект», 1999. 368 с.

17. Метилирование предполагаемого гена-супрессора RASSF1 в опухолях шейки матки / А.

18. В. Малюкова и др.. // Молекуляр. биология. 2004. - Т. 38, № 6. - С. 1005-1013.

19. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херрингтона,

20. Дж. Макги. М: Мир, 1999. - 560 с.

21. Никитин Е. А. Прогностическое значение мутаций вариабельного регионаиммуноглобулинов при хроническом лимфолейкозе: Автореф. дис. на соискание учен. степ. канд. мед. наук / Е. А. Никитин. Москва, 2001. - 24 с.

22. Онкомаркеры, их характеристика и некоторые аспекты клинико-диагностическогоиспользования / М. JI. Алексеева // Проблемы репродукции. 2005. - №3. - 65-79.

23. Ройт А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000. - 592 с.

24. Руководство по гематологии / Под ред. А. И. Воробьёва. М.: Ньюдиамед, 2003.1. Т. 2. 280 с.

25. Сингер М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг. М.: Мир, 1998. - Т. 1. - 373 с.

26. Уровень метилирования промоторной области гена RASSF1A в первичныхэпителиальных опухолях / В. И. Логинов и др.. // Молекуляр. биология. 2004. - Т. 38, № 4. - С. 654-667.

27. Функциональная патология генов RB1 и pió в ретинобластомах / О. В. Бабенко идр.. // Молекуляр. биология. 2002. - Т. 36, № 5. - С. 777-783.

28. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells /

29. B. E. Bernstein et al.. // Cell. 2006. - V. 125, № 20. - P. 315-326.

30. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residuesin individual DNA strands / M. Frommer et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. -V. 89, №5.-P. 1827-1831.

31. A mammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA /

32. S. K. Bhattacharya et al.. // Nature. 1999. - V. 397, № 6720. - P. 579-583.

33. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from amultivariate survival analysis / J. L. Binet et al.. // Cancer. 1981. - V. 48, № 1. - P. 198-206.

34. A quantitative Hpall-PCR assay to measure methylation of DNA from a small number ofcells / J. Singer-Sam et al.. // Nucleic Acids Res. 1980. - V. 18, № 3. - P. 687.

35. A stem cell-like chromatin pattern may predispose tumor suppressor genes to DNAhypermethylation and heritable silencing / J. E Ohm et al.. // Nat. Genet. 2007. -V. 39, № 2. - P. 237-242.

36. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication inmammalian nuclei / H. Leonhardt et al.. // Cell. 1992. - V. 71, № 5. - P. 865-873.

37. Aberrant CpG island hypermethylation of chronic gastritis, in relation to aging, gender,intestinal metaplasia, and chronic inflammation / G. H. Kang et al.. // Am. J. Pathol. -2003. V. 163, № 4. - P. 1551-1556.

38. Aberrant methylation of RASGRF2 and RASSF1A in human non-small cell lung cancer /

39. H. Chen et al.. //Oncol. Rep. 2006. - V. 15, № 5. - P. 1281-1285.

40. Aberrant methylation of RASSF4/AD037 in nasopharyngeal carcinoma / L. S. Chow //

41. Oncol. Rep. 2004. - V. 12, № 4. - P.781-787.

42. Aberrant methylation of suppressor of cytokine signalling-1 (SOCS-1) gene in pancreaticductal neoplasms / N. Fukushima et al.. // Br. J. Cancer. 2003. - V. 89, № 2. - P. 338-343.

43. Aberrant methylation of the negative regulators RASSFIA, SHP-1 and SOCS-1 inmyelodysplastic syndromes and acute myeloid leukaemia / M. F. Johan et al.. // Br J Haematol. 2005. - V. 129, № 1. - P. 60-65.

44. Aberrant methylation of the Wnt antagonist SFRP1 in breast cancer is associated withunfavourable prognosis / J. Veeck et al.. // Oncogene. 2006. - V. 25, № 24, 34793488.

45. Aberrant promoter hypermethylation and silencing of the critical 3p21 tumour suppressorgene, RASSF1A, in Chinese oesophageal squamous cell carcinoma / M. L. Wong et al.. // Int. J. Oncol. 2006. - V. 28, № 3. - P. 767-773.

46. Aberrant promoter hypermethylation of multiple genes in gallbladder carcinoma andchronic cholecystitis / T. Takahashi et al.. // Clin. Cancer. Res. 2004. - V. 10, № 18 Pt 1. - P. 6126-6133.

47. Aberrant promoter methylation profiles of tumor suppressor genes in hepatocellularcarcinoma / B. Yang et al.. // Am. J. Pathol. 2003. - V. 163, № 3. - P. 1101-1107.

48. Abnormalities of the APC/beta-catenin pathway in endometrial cancer / G. Moreno-Buenoet al.. // Oncogene. 2002. - V. 21, № 52. - P. 7981-7990.

49. Abundant hypermethylation of SOCS-1 in clinically silent pituitary adenomas / R. Busleiet al.. // Acta Neuropathol. (Berl). 2006. - V. 111, № 3. - P. 264-271.

50. Activated proliferation of B-cell lymphomas/leukemias with the SHP1 gene silencing byaberrant CpG methylation / M. Koyama et al.. // Lab. Invest. 2003. - V. 83, № 12 . -P. 1849-1858.

51. Activated proliferation of B-cell lymphomas/leukemias with the SHP1 gene silencing byaberrant CpG methylation / M. Koyama et al.. // Laboratory Investigation. 2003. -V. 83, №12.-P. 1849-1858.

52. Activation of the Wnt signaling pathway in chronic lymphocytic leukemia / D. Lu, Y.

53. Zhao, R. Tawatao et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101, № 9. -P. 3118-3123.

54. Activity of the suppressor of cytokine signaling-3 promoter in human non-small-cell lungcancer / B. He et al.. // Clin. Lung. Cancer. 2004. - V. 5, № 6. - P. 366-370.

55. Agathanggelou A. Role of the Ras-Association domain family 1 in tumor /

56. A. Agathanggelou, W. N. Cooper, F. Latif // Cancer Res. 2005. - V. 65, № 9. - P. 3497-3508.

57. Allele-specific hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene / T. Sakaiet al.. // Am. J. Hum. Genet. 1991. - V. 48, № 5. - P. 880-888.

58. Allelic silencing at the tumor-suppressor locus 13ql4.3 suggests an epigenetic tumorsuppressor mechanism / D. Mertens et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006. -V. 103,№20.-P. 7741-7746.

59. Alterations of the Wnt signaling pathway during the neoplastic progression of Barrett'sesophagus / G. Clément et al.. // Oncogene. 2006. V. 25, № 21. - P. 3084-3092.

60. An autocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells /

61. A. Bafico et al.. // Cancer Cell. 2004. - V. 6, № 5. - P. 497-506.

62. Analysis of adenomatous polyposis coli promoter hypermethylation in human cancer /

63. M. Esteller et al.. // Cancer Res. 2000. - V. 60, № 16. - P. 4366-4371.

64. Antequera F. Structure, function and evolution of CpG island promoters / F. Antequera //

65. Cell. Mol. Life Sci. 2003. - V. 60, № 8. - P. 1647-1658.

66. Antisense suppression of Pygopus 2 results in growth arrest of epithelial ovarian cancer / C.

67. M. Popadiuk et al.. // Clin. Cancer Res. 2006. - V 12, № 7 Pt. 1. - P. 2216-2223.

68. APC, beta-catenin, and E-cadherin and the development of recurrent endometrialcarcinoma / J.M. Pijnenborg et al.. // Int. J. Gynecol. Cancer. 2004. - V. 14, № 5. -P. 947-956.

69. Apoptosis and cancer therapy / Eds. K. M. Debatin, S. Fulda. Weinheim: Wiley-VHC,2006. P. 60-85.

70. Array-based analysis of genomic DNA methylation patterns of the tumor suppressor genepl6INK4A promoter in colon carcinoma cell lines / C. Mund et al.. I I Nucleic Acids Res.-2005.-V. 33, №8.-P. e73.

71. Arrayed primer extension: solid phase four-color DNA resequencing and mutationdetection technology / A. Kurg et al.. // Genetic testing. 2000. - V. 4, № 1. - P. 1-7.

72. Association of promoter hypermethylation of the RASSF1A gene with prognosticparameters in endometrial cancer / H. Jo et al.. // Oncol. Res. 2006. - V. 16, № 4. -P. 205-209.

73. Baylin S. B. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joints genetics /

74. S. B. Baylin, J. G. Herman // Trends Genet. 2000. - V. 16, № 4. - P. 168-174.

75. Baylin S. B. Epigenetic gene silencing in cancer a mechanism for early oncogenicpathway addiction? / S. B. Baylin, J. E. Ohm // Nature Rev. 2006. - V.6, № 2. -P. 107-116.

76. B-cell chronic lymphocytic leukemia cells express a surface membrane phenotype ofactivated, antigen-experienced B lymphocytes / R. N. Damle et al.. // Blood. 2002. -V. 99,№ 11.-P. 4087-4093.

77. Bernstein B. E. The mammalian epigenome / B. E. Bernstein, A. Meissner, E. S. Lander //

78. Cell. 2007. - V.128, № 4. - P. 669-681.

79. Bioinformatics methods and protocols: methods in molecular biology / S. Krawetz,

80. S. Misener (Eds.). Totowa: Humana Press, 2000. - pp. 365-386.

81. Biology and treatment of chronic lymphocytic leukemia / M. J. Keating et al.. //

82. Hematology (Am. Soc. Hematol. Educ. Program). 2003. - P. 153-175.

83. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory / A. Bird // Genes Dev. 2002.-V. 16, № l.-P. 6-21.

84. Bird A. P. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation: I. Themethylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis / A. P. Bird, E. M. Southern //J. Mol. Biol. 1978. - P. 118, № 1. - P. 27-47.

85. Bird A. Perceptions of epigenetics / A. Bird // Nature. 2007. - V. 447, № 7143. - P. 396-398.

86. Boes M. Role of natural and immune IgM antibodies in immune responses / M. Boes //

87. Mol. Immunol. 2000. - V. 37, № 18. - P. 1141-1149.

88. Brero A. Replication and translation of epigenetic information / A. Brero, H. Leonhardt,

89. M. C. Cardoso // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006. - № 301. - P. 21-44.

90. Cadigan K. M. Wnt signaling: a common theme in animal development / K. M. Cadigan,

91. R. Nusse // Genes Dev. 1997. - V. 11, № 24. - P. 3286-3305.

92. Chim C. S. Epigenetic dysregulation of the Jak/STAT pathway by frequent aberrantmethylation of SHP1 but not SOCS1 in acute leukaemias / C. S. Chim, A. S. Wong, Y. L. Kwong // Ann. Hematol. 2004. V. 83, № 8. - P. 527-532.

93. Chiorazzi N. Chronic lymphocytic leukemia / N. Chiorazzi, K. R. Rai, M. Ferrarini //

94. N. Engl. J. Med. 2005. - V. 352, № 8. - P. 804-815.

95. Chronic lymphoid leukemias / Ed. B. D. Cheson. 2nd ed. - New York: Marcel Dekker,2001.-P. 127-160.

96. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia / K. R. Rai et al.. // Blood. 1975.1. V. 46, № 2. 219-234.

97. Clonal inheritance of the pattern of DNA methylation in mouse cells / R. Stein et al.. //

98. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79, № 1. - P. 61-65.

99. Combination analysis of hypermethylated Wnt-antagonist family genes as a novelepigenetic biomarker panel for bladder cancer detection / S. Urakami et al.. // Clin. Cancer Res. 2006. - V. 12, № 7 . - P. 2109-2116.

100. Composition and histone substrates of polycomb repressive group complexes changeduring cellular differentiation / A. Kuzmichev et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2005.-V. 102, №6. -P. 1859-1864.

101. Concurrent DNA hypermethylation of multiple genes in acute myeloid leukemia /

102. J. R. Melki et al.. // Cancer Res. 1999. - V. 59, № 15. - P. 3730-3740.

103. Constitutional activation of IL-6-mediated JAK/STAT pathway through hypermethylationof SOCS-1 in human gastric cancer cell line / K.F. To et al.. // Br. J. Cancer. 2004. -V. 91, № 7. - P. 1335-1341.

104. Control of microtubule stability by the RASSF1A tumor suppressor / L. Liu et al.. //

105. Oncogene. 2003. - V. 22, № 50. - P. 8125-8136.

106. Cox A. D. The dark side of Ras: regulation of apoptosis / A. D. Cox, C. J. Der // Oncogene.- 2003. V. 22, № 56. - P. 8999-9006.

107. CpG island methylation and expression of the secreted frizzled-related protein gene familyin chronic lymphocytic leukemia / T. Liu et al.. // Cancer Res. 2006. - V. 66, № 2. -P. 653-658.

108. CpG island methylation of DNA damage response genes in advanced ovarian cancer /

109. J. M. Teodoridis et al.. // Cancer Res. 2005. - V. 65, № 19. - P. 8961-8967.

110. CpG island promoter hypermethylation of the Ras-effector gene NORE1A occurs in thecontext of a wild-type K-ras in lung cancer / M. Irimia et al.. // Oncogene. 2004. -V. 23, № 53 . - P. 8695-8699.

111. Cremer T. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammaliancells / T. Cremer, C. Cremer // Nat. Rev. Genet. 2001. - V. 2, № 4. - P. 292-301.

112. Dalerba P. Cancer stem cells: model and concepts / P. Dalerba, R. W. Cho, M. F. Clarke //

113. Annu Rev Med. 2007. - № 58. - P. 267-284

114. Dammann R. Hypermethylation of the CpG island of Ras association domain family 1A

115. RASSF1A), a putative tumor suppressor gene from the 3p21.3 locus, occurs in a large percentage of human breast cancers / R. Dammann , G. Yang, G. P. Pfeifer // Cancer Res. 2001. - V. 61, № 7. - P. 3105-3109.

116. Datta S. R. Cellular survival: a play in three Akts / S. R. Datta, A. Brunet, M. E. Greenberg

117. Genes Dev. 1999. - V. 13, № 22. - P. 2905-2927.

118. Demethylation of the zygotic paternal genome / W. Mayer et al.. // Nature. 2000.

119. V. 403, № 6769. P. 501-502.

120. Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis of bisulphitetreated DNA / P. Warnecke et al.. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25, № 21. -P. 4422-4426.

121. Diagnostic and prognostic information in prostate cancer with the help of a small set ofhypermethylated gene loci / P. J. Bastian et al.. // Clin. Cancer Res. 2005. - V. 11, № 11.-P. 4097-4106.

122. Differential DNA methylation of gene promoters in small B-cell lymphomas / J. Guo //

123. Am. J. Clin. Pathol. 2005. - V. 124, № 3. - P. 430-439.

124. Differential hypermethylation of SOCS genes in ovarian and breast carcinomas /

125. K.D. Sutherland et al.. // Oncogene. 2004. - V. 23, № 46. - P. 7726-7733.

126. Distinct epigenetic changes in the stromal cells of breast cancers / M. Hu et al.. // Nat.

127. Genet. 2005. - V. 37, № 8. - P. 899-905.

128. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation inthe human genome / M. Weber et al.. // Nat. Genet. 2007. - V. 39, № 4. - P. 457-466.

129. DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy / S. A. Leon et al.. //

130. Cancer Res. 1977. - V. 37, № 3. - P. 646-650.

131. DNA methylation changes in multiple myeloma / O. Galm et al.. // Leukemia. 2004.

132. V. 18, № 10.-P. 1687-1692.

133. DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas /

134. S. B. Baylin et al.. // Cancer Res. 1986. - V. 46, № 6. - P. 2917-2922.

135. DNA Methylation: Basic Mechanisms / Ed. W. Doerfler, P. Bohm. Berlin Heidelberg.:

136. Springer-Verlag, 2006. 321 p.

137. DNA methyltransferase Dnmtl associates with histone deacetylase activity / F. Fuks et al..

138. Nat. Genet. 2000. - V. 24, № 1. - P. 88-91.

139. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation andmammalian development / M. Okano et al.. // Cell. 1999. - V. 99, № 3. - P. 247-257.

140. DNMT1 forms a complex with Rb, E2F1 and HDAC1 and represses transcription from

141. E2F-responsive promoters / K. D. Robertson et al.. // Nat. Genet. 2000. - V. 25, № 3. - P. 338-342.

142. Doerfler W. DNA methylation and gene activity / W. Doerfler // Annu. Rev. Biochem.1983.-№.52.-P. 93-124.

143. Dormant tumor cells develop cross-resistance to apoptosis induced by CTLs or imatinibmesylate via methylation of suppressor of cytokine signaling 1 / A. Saudemont et al.. // Cancer Res. 2007. - V. 67, № 9. - P. 4491-4498.

144. Epigenetic alterations complement mutation of JAK2 tyrosine kinase in patients with

145. BCR/ABL-negative myeloproliferative disorders / E. Jost et al.. // Leukemia. 2007. - V. 21, № 3. - P. 505-510.

146. Epigenetic alterations in RASSF1A in human aberrant crypt foci / E. J. Greenspan et al..

147. Carcinogenesis. 2006. - V. 27, № 7. - P. 1316-1322.

148. Epigenetic alterations of the Wnt/p-catenin pathway in human disease / O. Aguilera et al..

149. Endocrine, Metabolic and Immune Disorders Drug Targets. - 2007. V.7 № 1. -P. 13-21.

150. Epigenetic changes may contribute to the formation and spontaneous regression ofretinoblastoma / V. Greger et al.. // Hum. Genet. 1989. - V. 83, № 2. - P. 155-158.

151. Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic livercells from patients with hereditary haemochromatosis / U. Lehmann et al.. // Hum. Mol. Genet.-2007.-V. 16, №11.-P. 1335-1342.

152. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumoursuppressor locus 3p21.3 / R. Dammann et al.. // Nat. Genet. 2000. - V. 25, № 3. -P.315-319.

153. Epigenetic inactivation of RASSFla in uveal melanoma / W. Maat et al.. // Invest.

154. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. - V. 48, № 2. - P. 486-490.

155. Epigenetic inactivation of SOCS-1 by CpG island hypermethylation in human gastriccarcinoma / Y. Oshimo et al.. // Int. J. Cancer. 2004. - V. 112, № 6. - P. 1003-1009.

156. Epigenetic inactivation of the RASSF1A tumour suppressor gene in ependymoma /

157. D. W. Hamilton et al.. // Cancer Lett. 2005. - V. 227, № 1. - P. 75-81.

158. Epigenetic inactivation of the Wnt antagonist DICKKOPF-1 (DKK-1) gene in human colorectalcancer/ O. Aguilera et al.. // Oncogene. 2006. - V. 25, № 29. - P. 4116-4121.

159. Epigenetic inactivation of tumor suppressor genes in serum of patients with cutaneousmelanoma / A. Marini et al.. //J. Invest. Dermatol. 2006. - V. 126, № 2. - P. 422-431.

160. Epigenetic Inactivation of Wnt Inhibitory Factor-1 Plays an Important Role in Bladder

161. Cancer through Aberrant Canonical Wnt/ p-Catenin Signaling Pathway / S. Urakami et al.. // Clin. Cancer Res. 2006. - V. 12, № 2. - P. 383-391.

162. Epigenetic profiling in chronic lymphocytic leukemia reveals novel methylation targets /

163. J. Rush et al.. // Cancer Res. 2004. - V. 64, № 7. - P. 2424-2433.

164. Epigenetic regulation of Wnt-signaling pathway in acute lymphoblastic leukemia /

165. J. Roman-Gomez et al.. // Blood. 2007. - V. 109, № 8. - P. 3462-3469.

166. Epigenetic stem cell signature in cancer / M. Widschwendter et al.. // Nat. Genet. 2007.-V. 39,№2.-P. 157-158.

167. Espada J. Epigenetic control of nuclear architecture / J. Espada, M. Esteller // Cell. Mol.1.fe Sci. 2007. - V. 64, № 4. - P. 449-457.

168. Esteller M. Aberrant DNA methylation as a cancer-inducing mechanism / M. Esteller //

169. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005. - №. 45. - P. 629-656.

170. Evaluating the arrayed primer extension resequencing assay of TP53 tumor suppressorgene / N. Tonisson et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99, № 8. -P. 5503-5508.

171. Evidence that chronic lymphocytic leukemia B lymphocytes are frequently committed toproduction of natural autoantibodies / L. Borche et al.. // Blood. 1990. - V. 76, № 3. -P. 562-569.

172. Expression level of lipoprotein lipase and dystrophin genes predict survival in B-cellchronic lymphocytic leukemia / E. A. Nikitin et al.. // Leukemia and Lymphoma. -2007.-V. 48, №5,- P. 912-922.

173. Expression of the secreted frizzled-related protein gene family is downregulated in humanmesothelioma / A.Y. Lee et al.. // Oncogene. 2004. - V. 23, № 39. - P. 6672-6676.

174. Feinberg A. P. DNA methylation and genomic imprinting: insights from cancer intoepigenetic mechanisms / A. P. Feinberg, H. Cui, R. Ohlsson // Semin. Cancer Biol. -2002. -V. 12, №5.-P.389-398.

175. Feinberg A. P. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from theirnormal counterparts / A. P. Feinberg, B. Vogelstein // Nature. 1983. - V. 301, № 5895. - P. 89-92.

176. Feinberg A. P. The history of cancer epigenetics / A. P. Feinberg, B. Tycko // Nat. Rev.

177. Cancer. 2004. - V. 4, № 2. - P. 143-153.

178. Felsenfeld G. Controlling the double helix / G. Felsenfeld, M. Groudine // Nature. 2003.-V. 421,№6921-P. 448-453.

179. Fisher A. G. Gene silencing, cell fate and nuclear organization / A. G. Fisher,

180. M. Merkenschlager // Curr. Opin. Genet. Dev. 2002. - V. 12, № 2. - P. 193-197.

181. Frequent epigenetic inactivation of RASSF1A and BLU genes located within the critical3p21.3 region in gliomas / L. Hesson et al.. // Oncogene. 2004. - V. 23, № 13. -P. 2408-2419.

182. Frequent epigenetic inactivation of RASSF1A in human bladder carcinoma / M. G. Lee et al..

183. Cancer Res. 2001. - V. 61, № 18. - P. 6688-6692.

184. Frequent epigenetic inactivation of SFRP genes and constitutive activation of Wntsignaling in gastric cancer / M. Nojima et al.. // Oncogene. 2007. V. 26, № 32. -P. 4699-4713.

185. Frequent epigenetic inactivation of Wnt inhibitory factor-1 in human gastrointestinalcancers / H. Taniguchi et al.. // Oncogene. 2005. V. 24, № 53. P. 7946-7952.

186. Frequent hypermethylation of 5' flanking region of TIMP-2 gene in cervical cancer /

187. T. Ivanova et al.. // Int. J. Cancer. 2004. - V. 108, № 6. - C. 882-886.

188. Frequent hypermethylation of the RASSF1A gene in prostate cancer / L. Liu et al.. //

189. Oncogene. 2002. - V. 21, № 44. - P. 6835-6840.

190. Frequent loss of SFRP1 expression in multiple human solid tumours: association withaberrant promoter methylation in renal cell carcinoma / E. Dahl et al.. // Oncogene. -2007. V. 26, № 38. - P. 5680-5691.

191. Frequent promoter hypermethylation of RASSF1A and CASP8 in neuroblastoma /

192. P. Lazcoz et al.. // BMC Cancer. 2006. - № 6. - P.254.

193. Fukui T. Transcriptional silencing of secreted frizzled related protein 1 (SFRP1) bypromoter hypermethylation in non-small-cell lung cancer / T. Fukui, M. Kondo, G. Ito // Oncogene. 2005. - V. 24, № 41. - P. 6323-6327.

194. Functional variants within the secreted frizzled-related protein 3 gene are associated withhiposteoarthritis in females / J. Loughlin et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V.101, № 26. - P. 9757-9762.

195. Gene expression profiling of B cell chronic lymphocytic leukemia reveals a homogeneousphenotype related to memory B cells / U. Klein et al.. // J. Exp. Med. 2001. -V. 194, № 11.- P. 1625-1638.

196. Gene silencing of the tyrosine phosphatase SHP1 gene by aberrant methylation inleukemias/lymphomas / T. Oka et al.. // Cancer Res. 2002. - V. 62, № 22. -P. 6390-6394.

197. Genetic and epigenetic alterations of the APC gene in malignant melanoma / J. Worm et al..

198. Oncogene. 2004. - V. 23, № 30. - P. 5215-5226.

199. Glantz S. A. Primer of biostatistics / S. A. Glantz. 5th ed. - McGraw-Hill Medical, 2002.- 489 p.

200. Gonzalgo M. L. Quantitative methylation analysis using methylation-sensitive singlenucleotide primer extension (Ms-SNuPE) / M. L. Gonzalgo, P. A. Jones // Methods. -2002.-V. 27, №2.-P. 128-133.

201. Hall T.A. BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysisprogram for Windows 95/98/NT / T. A. Hall // Nucl. Acids Symp. 1999. - Ser. 41. -P. 95-98.

202. Hanahan D. The hallmarks of cancer / D. Hanahan, R. A. Weinberg // Cell. 2000.1. V. 100, №1,-P. 57-70.

203. HDPR1, a novel inhibitor of the WNT/b-catenin signaling, is frequently downregulated inhepatocellular carcinoma: involvement of methylation mediated gene silencing / T. Yau et al.. // Oncogene. 2005. - V. 24, № 9. - P.1607-1614.

204. Hendrich B. Identification and characterization of a family of mammalian methyl-CpGbinding proteins / B. Hendrich, A. Bird // Mol. Cell. Biol. 1998. - V. 18, № 11. -P. 6538-6547.

205. High bone density due to a mutation in LDL-receptor-related protein 5 / L. M. Boyden et al. //

206. N. Engl. J. Med. 2002. V.346, № 20. - P. 1513-1521.

207. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A and pl6 and its relationship toaflatoxin Bl-DNA adduct levels in human hepatocellular carcinoma / Y. J. Zhang et al.. // Mol. Carcinog. 2002. - V. 35, № 2. - P. 85-92.

208. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma /

209. K.-W. Lo et al.. // Cancer Res. 2001. - V. 61, № 10. - P. 3877-3881.

210. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in tumorous and nontumourous tissue of breast cancer / W. Yeo et al.. // Pathology. 2005. - V. 37, № 2. -P. 125-130.

211. Hillmen P. Chronic lymphocytic leukemia aiming at a moving target! / P. Hillmen //

212. Haematologica/The hematology Journal. 2005. - V. 90, № 11. - P. 1451-1452.

213. Histologically normal human mammary epithelia with silenced pl6(INK4a) overexpress

214. COX-2, promoting a premalignant program / Y. G. Crawford et al.. // Cancer Cell. -2004. V. 5, № 3. - P. 263-273.

215. Hoheisel J. D. Microarray technology: beyond transcript profiling and genotype analysis /

216. J. D, Hoheisel // Nat. Rev. Genet. 2006. - V. 7, № 3. - P. 200-210.

217. Holland-frei cancer medicine / D. W. Kufe et al.. 6nd ed. - Amsterdam: Elsevier, 2003.- 2400 p.

218. Homozygous WNT3 mutation causes tetra-amelia in a large consanguineous family /

219. S. Niemann et al.. // Am. J. Hum. Genet. 2004. - V.74, № 3,- P. 558-563.

220. Hotchkiss R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paperchromatography / R. D. Hotchkiss//J. Biol. Chem. 1948. - V. 168. - P. 315-332.

221. Hypermethylation associated with inactivation of the SOCS-1 gene, a JAK/STAT inhibitor,in human hepatoblastomas / H. Nagai et al.. // J. Hum. Genet. 2003. V. 48, № 2. -P. 65-69.

222. Hypermethylation of E-cadherin in leukemia / J. R. Melki et al.. // Blood . 2000.1. V. 95, №10.-P. 3208-3213.

223. Hypermethylation of the APC promoter but lack of APC mutations in myxoid/round-cellliposarcoma / S. Sievers et al.. // Int. J. Cancer. 2006. V. 119, № 10. - P. 2347-2352.

224. Hypermethylation of the death-associated protein (DAP) kinase promoter andaggressiveness in stage I non-small-cell lung cancer / X. Tang et al.. // J. Natl. Cancer Inst. 2000. - V. 92, № 18. - P. 1511-1516.

225. Hypermethylation of the suppressor of cytokine signalling-1 (SOCS-1) in myelodysplasticsyndrome / K. Brakensiek et al.. // Br. J. Haematol. 2005. - V. 130, № 2. - P. 209-217.

226. Hypermethylation-associated inactivation of the SOCS-1 gene, a JAK/STAT inhibitor, inhuman pancreatic cancers / T. Komazaki et al.. // Jpn. J. Clin. Oncol. 2004. - V. 34, № 4. - P.191-194.

227. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing / P. M. Warnecke et al.. //

228. Methods. 2002. - V. 27, № 2. - P. 101-107.

229. Identification of pancreatic cancer stem cells / C. Li et al.. // Cancer Res. 2007. - V. 67,3. P.1030-1037.

230. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas toalkylating agents / M. Esteller et al.. // N. Engl. J. Med. 2000. - V. 343, № 23. -P. 1350-1354.

231. Inactivation of Wnt inhibitory factor-1 (WIF1) expression by epigenetic silencing is acommon event in breast cancer / L. Ai et al.. // Carcinogenesis. 2006. - V.27, № 7. -P. 1341-1348.

232. Increased DNA methyltransferase expression in leukemia / J. R. Melki et al.. // Leukemia.- 1998. V. 12, №3.-P. 311-316.

233. Initial sequencing and analysis of the human genome / E. S. Lander et al.. // Nature.2001. V. 409, № 6822. - P. 860-921.

234. Issa J.-P. Decitabine in chronic leukemias / J. P. Issa, J. C. Byrd // Semin. Hematol. 2005.- V. 42, № 3 Suppl. 2. P. S43-49.

235. Issa J.-P. CpG island methylator phenotype in cancer / J.-P. Issa // Nat. Rev. Cancer.2004.-V. 4, № 12. -P. 988-993.

236. Issa J.-P. Decitabine / J.-P. Issa // Curr. Opin. Oncol. 2003. - V. 15, № 6. - P. 446-451.

237. Katzenellenbogen R. A. Hypermethylation of the DAP-kinase CpG island is a commonalteration in B-cell malignancies / R. A. Katzenellenbogen, S. B. Baylin, J. G. Herman // Blood. 1999. - V. 93, № 12. - 4347-4353.

238. Jenuwein T. Translating the histone code / T. Jenuwein, C. D. Allis // Science. 2001.

239. V. 293, № 5532. P. 1074-1080.

240. Jones P. A. The epigenomics of cancer / P. A. Jones, S. B. Baylin // Cell. 2007. - V. 128,4, 683-692.

241. Khan N. I. Role of WNT signaling in normal and malignant hematopoiesis / N. I. Khan,

242. J. Bendall // Histol. Histopathol. 2006. - V.21, № 7. - 761-774.

243. Knudson A. G. Two genetic hits (more or less) to cancer / A. G. Knudson // Nat. Rev.

244. Cancer. 2001. - V. 1, № 2. - P. 157-162.

245. Kouzarides T. Chromatin modifications and their function / T. Kouzarides // Cell. -2007.1. V. 128,№4.-P. 693-705.

246. Kriaucionis S. DNA methylation and Rett syndrome / S. Kriaucionis, A. Bird // Hum. Mol.

247. Genet. 2003. - V. 12, Spec. № 2. - P. R221-R227.

248. Laird P. W. Early detection: the power and the promise of DNA methylation markers /

249. P. W. Laird // Nat. Rev. Cancer. 2003. - V. 3, № 4. p. 253-266.

250. LDL receptor-related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development /

251. Y. Gong et al.. II Cell. 2001. V.107, № 4. P. 513-523.

252. Li L. C. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs / L. C. Li., R. Dahiya //

253. Bioinformatics. 2002. - V. 18, № 11. - P. 1427-1431.

254. Liu S. Mammary stem cells, self-renewal pathways, and carcinogenesis / S. Liu, G. Dontu,

255. M. S. Wicha // Breast Cancer Res. 2005. - V. 7, № 3. - P. 86-95.

256. Lu H. Inflammation, a key event in cancer development / H. Lu, W. Ouyang, C. Huang //

257. Mol. Cancer Res. 2006. - V.4, № 4. - P.221-233.

258. Luo L. Leukemia Stem Cells / L. Luo, Zh. Ch. Han // Int. J. Hematol. 2006. V. 84, №2.1. P.123-127.

259. Lustig B. The Wnt signaling pathway and its role in tumor development / B. Lustig,

260. J. Behrens // J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 2003. - V. 129, № 4. - P. 199-221.

261. MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex /

262. H. H. Ng et al.. // Nat. Genet. 1999. - V. 23, № 1. - P. 58-61.

263. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription /

264. P. L. Jones et al.. // Nat Genet. 1998. - V. 19, № 2. - P. 187-191.

265. Methylation and silencing of the retinoic acid receptor-beta 2 gene in cervical cancer /

266. T. Ivanova et al.. // BMC Cancer. 2002. - №. 2. - P. 4.

267. Methylation of apoptosis related genes in the pathogenesis and prognosis of prostate cancer

268. M. Suzuki et al.. // Cancer Lett. 2006. - V. 242, № 2. - P. 222-230.

269. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins / M. Lachner et al..

270. Nature. 2001. - V. 410, № 6824. - P. 116-120.

271. Methylation of pl6(INK4a) promoters occurs in vivo in histologically normal humanmammary epithelia / C. R. Hoist et al.. // Cancer Res. 2003. - V. 63, № 7. - P. 1596-1601.

272. Methylation of RAS association domain family protein 1A as a biomarker of lung cancer /

273. H. J. Grote et al.. // Cancer. 2006. - V. 108, № 2. - P. 129-134.

274. Methylation of Socs-3 and Socs-1 in the carcinogenesis of Barrett's adenocarcinoma /

275. Tischoff et al.. // Gut. 2007. - V. 56, № 8. - P. 1047-1053.

276. Methylation silencing of SOCS-3 promotes cell growth and migration by enhancing

277. JAK/STAT and FAK signalings in human hepatocellular carcinoma / Y. Niwa et al.. // Oncogene. 2005. - V. 24, № 42. - P. 6406-6417.

278. Methylation status of suppressor of cytokine signaling-1 gene in hepatocellular carcinoma /

279. H. Miyoshi et al.. //J. Gastroenterol. 2004. - V. 39, № 6. - P. 563-569.

280. Methylation status of the SOCS3 gene in human malignant melanomas / T. Tokita et al..

281. Int. J. Oncol. 2007. - V. 30, № 3. - P. 689-694.

282. Methylation-associated silencing of the Wnt antagonist SFRP1 gene in human ovariancancers / T. Takada et al.. // Cancer Sci. 2004. - V. 95, № 9. - P. 741-744.

283. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands /

284. J. G. Herman et al.. // Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93, № 18. - P. 9821-9826.

285. Multiple distinct sets of stereotyped antigen receptors indicate a key role for antigen inpromoting chronic lymphocytic leukemia / B. T. Messmer et al.. // J. Exp. Med. -2004.-V. 200, №4.-P.519-525.

286. Norel inhibits tumor cell growth independent of Ras or the MST1/2 kinases / Y. Aoyamaet al.. // Oncogene. 2004. - V.23, № 19. - P. 3426-3433.

287. NORE1A, a homologue of RASSF1A tumour suppressor gene is inactivated in humancancers / L. Hesson et al.. // Oncogene. 2003. - V. 22, № 6. - P. 947-954.

288. Novel method for high throughput DNA methylation marker evaluation using PNA-probelibrary hybridization and MALDI-TOF detection / P. Schatz et al.. // Nucleic Acids Res. 2006. - V. 34, № 8. - P. 59.

289. Ohm J. E. Stem cell chromatin patterns: an instructive mechanism for DNAhypermethylation? / J. E. Ohm, S. B. Baylin // Cell Cycle. 2007. - V. 6, № :9. -P. 1040-1043.

290. Oligonucleotide-based microarray for DNA methylation analysis: principles andapplications / H. Shi et al.. // J. Cell. Biochem. 2003. - V. 88, № 1. - P. 138-143.

291. On mammary stem cells / W. A. Woodward et al.. //J. Cell Sci. 2005. - V. 118, Pt. 16.- P. 3585-3594.

292. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53and pl6INK4a / M. Serrano et al.. // Cell. 1997. - V. 88, № 5. - P. 593-602.

293. Oncogenic Ras-mediated cell growth arrest and apoptosis are associated with increasedubiquitin-dependent cyclin D1 degradation / J. Shao et al.. // J. Biol. Chem. 2000. -V. 275, № 30. - P. 22916-22924.

294. Parallel genotyping of over 10,000 SNPs using a one-primer assay on a high-densityoligonucleotide array / H. Matsuzaki et al.. // Genome Res. 2004. - V. 14, №3. -P. 414-425.

295. Perantoni A. O. Renal development: perspectives on a Wnt-dependent process /

296. A. O. Perantoni // Semin. Cell Dev. Biol. 2003. - V. 14, № 4. - P. 201208.

297. Perwez H. S. Inflammation and cancer: an ancient link with novel potentials /

298. H. S. Perwez, C. C. Harris // Int. J. Cancer. 2007. - V. 121, № 11. - P. 2373-2380.

299. Phases of biomarker development for early detection of cancer / M. S. Pepe et al.. //

300. J. Natl. Cancer Inst. 2001. - V. 93, № 14. - P. 1054-1061.

301. Polycomb-mediated methylation on Lys27 of histone H3 pre-marks genes for de novomethylation in cancer / Y. Schlesinger et al.. // Nat. Genet. 2007. - V. 39, № 2. -P. 232-236.

302. Preferential methylation of Wnt inhibitory factor-1 in acute promyelocytic leukemia: anindependent poor prognostic factor / C. S. Chim et al.. // Leukemia. 2006. - V. 20, №5. -P. 907-909.

303. Promoter CpG methylation of tumor suppressor genes in colorectal cancer and itsrelationship to clinical features / S.-Y. Lin et al.. // Oncol.Rep. 2004. - V. 11, № 2. -P. 341-348.

304. Promoter hypermethylation profile of ovarian epithelial neoplasms / P. B. Makarla et al..

305. Clin. Cancer Res. 2005. - V. 11, № 15. - P. 5365-5369.

306. Promoter methylation inhibits APC gene expression by causing changes in chromatinconformation and interfering with the binding of transcription factor CCAAT-binding factor / G. Deng et al.. // Cancer Res. 2004. - V. 64, № 8. - P. 2692-2698.

307. Promoter methylation of RASSF1A, RARbeta and DAPK predict poor prognosis ofpatients with malignant mesothelioma / J. R. Fischer et al.. // Lung Cancer. 2006. -V. 54, №1.-P. 109-116.

308. Promoter methylation of the secreted frizzled-related protein 1 gene SFRP1 is frequent inhepatocellular carcinoma / Y. L. Shih et al.. // Cancer. 2006. - V.107, № 3. -P. 579-590.

309. Purification and molecular cloning of a secreted, frizzled-related antagonist of Wnt action / P.

310. W. Finch et al.. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94, № 13. - P. 6770-6775.

311. Quantitative analysis of DNA methylation in chronic lymphocytic leukemia patients /

312. F. Lyko et al.. // Electrophoresis. 2004. - V. 25, № 10-11. - P. 1530-1535.

313. Rare bases in animal DNA / B. F. Vanyushin et al.. // Nature. 1970. - V. 225, № 5236.- P. 948-949.

314. RASSF2, a potential tumour suppressor, is silenced by CpG island hypermethylation in gastriccancer / M. Endoh et al.. // Br. J. Cancer. 2005. - V. 93, № 12. - P. 1395-1399.

315. RASSF3 and NORE1: identification and cloning of two human homologues of the putativetumor suppressor gene RASSF1 / S. Tommasi et al.. // Oncogene. 2002. - V. 21, № 17.-P. 2713-2720.

316. Reciprocal regulation of SOCS 1 and SOCS3 enhances resistance to ionizing radiation inglioblastoma multiforme / H. Zhou et al.. // Clin. Cancer Res. 2007. - V. 13, № 8. -P. 2344-2353.

317. Reconstitution of Syk function by the ZAP-70 protein tyrosine kinase / G. H. Kong et al..

318. Immunity. 1995. - V. 2, № 5. - P. 485-492.

319. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cellchronic lymphocytic leukemia / A. Rosenwald et al.. // J. Exp. Med. 2001. - V. 194, № 11. -P.1639-1647.

320. Relationship of the aberrant DNA hypermethylation of cancer-related genes withcarcinogenesis of endometrial cancer / K. Banno et al.. // Oncol. Rep. 2006. V. 16, №6.-P. 1189-1196.

321. Remarkably similar antigen receptors among a subset of patients with chronic lymphocyticleukemia / F. Ghiotto et al.. // J. Clin. Invest. 2004. - V. 113, № 7. - P. 1008-1016.

322. Ringrose L. Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax groupproteins / L. Ringrose, R. Paro // Annu. Rev. Genet. 2004. - № 38. - P. 413-443.

323. Ronaghi M. A sequencing method based on real-time pyrophosphate / M. Ronaghi,

324. M. Uhlen, P. Nyren // Science. 1998. - V. 281, № 5375. - P. 363-365.

325. Russo V. E. A. Epigenetic mechanisms of gene regulation / V. E. A. Russo,

326. R. A. Martienssen, A. D. Riggs. New York: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1996. - 692 p.

327. Sanger F. DNA-sequencing with chain-terminator inhibitors / F. Sanger, S. Nicklein,

328. A. R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74, № 12. - P. 5463-5467.

329. Santoro R. Many players, one goal: how chromatin states are inherited during cell division

330. R. Santoro, F. De Lucia // Biochem. Cell Biol. 2005. - V. 83, №3. - P. 332-343.

331. Schumacher A. Microarray-based DNA methylation profiling: technology and applications

332. A. Schumacher, P. Kapranov, Z. Kaminsky. Nucleic Acids Res. - 2006. - V. 34, № 2. - P. 528-542.

333. Secreted frizzled-related protein 4 is silenced by hypermethylation and induces apoptosis inbeta-catenin-deflcient human mesothelioma cells / B. He et al.. // Cancer Res. 2005. -V. 65, №3.-P. 743-748.

334. Selker K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms / K. Struhl //

335. Genes Dev. 1998. - V. 12, № 5. - P. 599-606.

336. SFRP1 suppressed hepatoma cells growth through Wnt canonical signaling pathway /

337. Y. L. Shih et al.. // Int. J. Cancer. 2007. V. 121, № 5. - P. 1028-1035.

338. Signalling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges /

339. T. Kisseleva et al.. // Gene. 2002. - V. 285, № 1-2. - 1-24.

340. SOCS1 and SHP1 hypermethylation in mantle cell lymphoma and follicular lymphoma:implications for epigenetic activation of the Jak/STAT pathway / C. S. Chim et al.. // Leukemia. 2004. - V. 18, № 2. - P. 356-358.

341. SOCS1 and SHP1 hypermethylation in multiple myeloma: implications for epigeneticactivation of the Jak/STAT pathway / C. S. Chim et al.. // Blood. 2004. - V. 103, №12.-P. 4630-4635

342. SOCS-1, a negative regulator of cytokine signaling, is frequently silenced by methylation inmultiple myeloma / O. Galm et al.. // Blood. 2003. - V. 101, № 7. - P. 2784-2788.

343. SOCS-3 is frequently methylated in head and neck squamous cell carcinoma and itsprecursor lesions and causes growth inhibition / A. Weber et al.. // Oncogene. 2005. - V. 24, № 44. - P. 6699-6708.

344. SOCS-3 is frequently silenced by hypermethylation and suppresses cell growth in humanlung cancer / B. He et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100, № 24. -P. 14133-14138.

345. Sokol S. Y. Wnt signaling and dorso-ventral axis specification in vertebrates / S. Y. Sokol

346. Curr. Opin. Genet. Dev. 1999. - V. 9, № 4. - P. 405-410.

347. STAT3- and DNA methyltransferase 1-mediated epigenetic silencing of SHP-1 tyrosinephosphatase tumor suppressor gene in malignant T lymphocytes / Q. Zhang et al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102, № 19. - P. 6948-6953.

348. Strathdee G. Aberrant DNA methylation in cancer: potential clinical interventions /

349. G. Strathdee, R. Brown // Exp. Rev. Mol. Med. 2002. - V. 4, № 4. - P. 1-17.

350. Suppressor of cytokine signalling-1 gene silencing in acute myeloid leukaemia and humanhaematopoietic cell lines / D. Watanabe et al.. // Br. J. Haematol. 2004. - V. 126, № 5. - P. 726-735.

351. Sustained IL-6/STAT-3 signaling in cholangiocarcinoma cells due to SOCS-3 epigeneticsilencing / H. Isomoto et al.. // Gastroenterology. 2007. - V. 132, № 1. - P. 384-396.

352. Suv39h-mediated histone H3 lysine 9methylation directs DNA methylation to majorsatellite repeats at pericentric heterochromatin / B. Lehnertz et al.. // Curr. Biol. -2003.-V. 13,№14. -P. 1192-1200.

353. The content of 5-methylcytosine in animal DNA: the species and tissue specificity /

354. B. F. Vanyushin et al.. // Biochim. Biophys. Acta. 1973. - V. 299, № 3. - P. 397-403.

355. The DNA (cytosine-5) methyltransferases / S. Kumar et al.. // Nucleic Acids Res. 1994.1. V. 22, №1,- P. 1-10.

356. The human frizzled-3 (FZD3) gene on chromosome 8p21, a receptor gene for Wntligands.is associated with the susceptibility to schizophrenia / T. Katsu et al.. // Neurosci. Lett. 2003. V.353, № 1. - P. 53-56.

357. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation / E. Vire et al.. //

358. Nature. 2006. - V. 439, № 7078. - P. 871-874.

359. The putative tumor suppressor RASSF1A homodimerizes and heterodimerizes with the

360. Ras-GTP binding protein Norel / S. Ortiz-Vega et al.. // Oncogene. 2002. - V. 21, №9.-P. 1381-1390.

361. The Wnt antagonist sFRPl in colorectal tumorigenesis / G. M. Caldwell et al.. // Cancer

362. Res. 2004. - V. 64, № 3. - P. 883-888.

363. The Wnt antagonist sFRPl is downregulated in premalignant large bowel adenomas /

364. G. M. Caldwell et al.. // Br. J. Cancer. 2006. - V. 94, № 6. - P. 922-927.

365. Tônisson N. Mutation detection by primer extension on oligonucleotide microarray

366. Dissertation for commencement of the degree of Doctor of Philosophy in Molecular Diagnostics) / N. Tônisson. Tartu: Tartu University Press, 2002. - 124 p.

367. Tost J. Analysis and quantification of multiple methylation variable positions in CpGislands by Pyrosequencing / J. Tost, J. Dunker, I. G. Gut // BioTechniques. 2003. -V. 35, №1.-P. 152-156.

368. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histonedeacetylase complex / X. Nan et al.. // Nature. 1998. - V. 393, № 6683. - P. 386-389.

369. Transcriptional silencing of the Dickkopfs-3 (Dkk-3) gene by CpG hypermethylation inacute lymphoblastic leukaemia / J. Roman-Gomez et al.. // Br. J. Cancer. 2004. -V. 91, №4. - P. 707-713.

370. Trinh B. N. DNA methylation analysis by Methylight technology / B. N. Trinh, T. I. Long,

371. P. W. Laird / Methods. 2001. - V. 25, № 4. - P. 456-462.

372. Tumor-specific methylation in saliva: a promising biomarker for early detection of headand neck cancer recurrence / C. A. Righini et al.. // Clin. Cancer Res. 2007. - V. 13, №4.-P. 1179-1185.

373. Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis /

374. P. Adorjan et al.. // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30, № 5. - P. e21.

375. TWIST2 demonstrates differential methylation in immunoglobulin variable heavy chainmutated and unmutated chronic lymphocytic leukemia / A. Raval et al.. // J. Clin. Oncol. 2005. - V. 23, № 17. - P. 3877-3885.

376. Ubiquitous activation of Ras and Jak/Stat pathways in human HCC / D. F. Calvisi et al.. //

377. Gastroenterology. 2006. - V. 130, № 4. - P. 1117-1128.

378. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chroniclymphocytic leukemia / T. J. Hamblin et al.. // Blood. 1999. - V. 94, № 6. -P. 1848-1854.

379. Vairapandi M. Characterization of DNA demethylation in normal and cancerous cell linesand the regulatory role of cell cycle proteins in human DNA demethylase activity / M. Vairapandi //J. Cell. Biochem. 2004. - V. 91, № 3. - P. 572-583.

380. Valentino L. JAK/STAT signal transduction: regulators and implication in hematologicalmalignancies / L. Valentino, J. Pierre // Biochem. Pharmacol. 2006. - V.71, № 6. -P. 713-721.

381. Validation of a novel, fully integrated and fexible microarray benchtop facility for geneexpression profiling / M. Baum et al.. // Nucleic Acids Res. 2003. - V. 31, № 23. -P. el51.

382. Waalwijk C. DNA methylation at a CCGG sequence in the large intron of the rabbit betaglobin gene: tissue-specific variations / C. Waalwijk, R. A. Flavell // Nucleic Acids Res. 1978. - V. 5, № 12. - P. 4631-4634.

383. Walsh C. P. Transcription of IAP endogenous retroviruses is constrained by cytosinemethylation / C. P. Walsh, J. R. Chaillet, T. H. Bestor // Nat. Genet. 1998. - V. 20, №2.-P. 116-117.

384. Watson J. D. / Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid

385. J. D. Watson, F. H. Crick // Nature. 1953. - V. 171, № 4356. - P. 737-738.

386. Weinberg R. A. The biology of cancer / R. A. Weinberg. New York: Garland Science,2007. 850 p.

387. Wigler M. The somatic replication of DNA methylation / M. Wigler, D. Levy, M. Perucho

388. Cell. 1981. - V. 24, № 1. V. 33-40.

389. Wnt and P-catenin signalling: diseases and therapies / R. T. Moon et al.. // Nat. Rev.

390. Genet. 2004. - V. 5, № 9. - P. 689-699.

391. Wnt inhibitory factor-1 is silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer /

392. J. Mazieres et al.. // Cancer Res. 2004. - V. 64, № 14. - P. 4717-4720.

393. Wnt inhibitory factor-1 is silenced by promoter hypermethylation in human lung cancer /

394. J. Mazieres et alj. // Cancer Res. 2004. - V. 64, № 14. - P. 4717-4720.

395. Wnt inhibitory factor-1, a Wnt antagonist, is silenced by promoter hypermethylation inmalignant pleural mesothelioma / S. Batra et al.. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - V. 342, № 4. - P. 1228-1232.

396. Wnt4 overexpression disrupts normal testicular vasculature and inhibits testosteronesynthesis by repressing steroidogenic factor 1/p-catenin synergy / B. K. Jordan et al.. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V.100, № 19. - P.10866-10871.

397. Wyatt G. R. Recognition and estimation of 5-methylcytosine in nucleic acids / G. R. Wyatt

398. J. Biochem. (Tokyo). 1951. - V. 48, № 5. - P. 581-584.

399. Xiong Zh. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay / Zh. Xiong,

400. P. W. Laird // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25, № 12. - P. 2532-2534.

401. Yoder J. A. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites / J. A. Yoder,

402. T. H. Bestor // Trends Genet. 1997. - V. 13, № 8. - P. 335-340.

403. Yoo C. Epigenetic therapy of cancer: past, present and future / C. Yoo, P. A. Jones // Nat.

404. Rev. Drug Discov. 2006. - V. 5, № 1, 37-50.

405. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable-region mutations inchronic lymphocytic leukemia / M. Crespo et al.. // N. Engl. J. Med. 2003. - P. 348, № 18.-P. 1764-1775.

406. ZAP-70 methylation status is associated with ZAP-70 expression status in chroniclymphocytic leukemia / M. Corcoran et al.. // Haematologica. 2005. - V. 90, № 8. -P. 1078-1088.

407. ZAP-70: a 70 kd protein-tyrosine kinase that associates with the TCR zeta chain /

408. A. C. Chan et al.. // Cell. 1992. - V. 71, № 4. - P. 649-662.

409. Zent C. S. Advances in the understanding of biology and prognosis in chronic lymphocyticleukemia / C. S. Zent, N. E. Kay // Curr. Oncol. Rep. 2004. - V.6, № 5. - P. 348-354.

410. Zhao C.H. Hypermethylation and aberrant expression of Wnt antagonist secreted frizzledrelated protein 1 in gastric cancer / C. H. Zhao, X. M. Bu, N. Zhang // World J. Gastroenterol. 2007. - V. 13, № 15. - P. 2214-2217.

411. Настоящая работа стала возможной благодаря поддержке окружавших меня людей, которые способствовали развитию моих научных интересов и которым я обязан за всё, чему научился до сих пор.

412. Огромное спасибо Станиславе Владимировне Золотарёвой, Татьяне Ивановне Дедовой и Лидии Константиновне Воиновой за развитие моего интереса к биологии и химии в школе, высочайший профессионализм и педагогический талант.

413. Бесконечно благодарю мою семью и особенно маму за безоговорочную поддержку, терпение и искреннее желание успеха на пути научных исследований.

Информация о работе

Москалёв, Евгений Александрович
кандидата биологических наук
Воронеж, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Аномальные изменения картины метилирования геномной ДНК при хроническом В-клеточном лимфолейкозе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы