Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность ДНК-метилаз этиолированных проростков пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кавальская, Виктория Степановна

ВВЕДЕНИЕ .б

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. ПРИРОДА И ПРОИСХОЖДЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ МЕТИЛИРОВАННЫХ ОСНОВАНИЙ В ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

1. Метилированные основания в ДНК и механизм их возникновения

2. Органоидная специфичность и внутригеномное распределение пРс .II

ГЛАВА 11. СОДЕРЖАНИЕ 5-МЕТИЛЦИТОЗИНА В ДНК ВЫСШИХ

РАСТЕНИЙ.

1. Видовая специфичность.

2. Тканевая /клеточная/ специфичность метилирования ДНК.

3. Изменение метилирования ДНК в онтогенезе

4. Влияние фитогормонов и других факторов на изменение содержания 5-метилцитозина в ДНК

ГЛАВА Ш. МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК У РАСТЕНИЙ

1. Синтез ДНК и ее метилирование in vivo

2. Особенности метилирования ДНК in vitro

3. ДНК-метилазы эукариот и их свойства

ГЛАВА 1У. ВОЗМОЖНАЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ

ДНК У ЭУКАРИОТ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Материалы и обьекты исследований

- з

2. Методы исследований

1. Проращивание семян пшеницы

2. Введение радиоактивной метки в ДНК проростков а/ Контроль за синтезом новообразованной ДНК с помощью /%/ тимидина. б/ Исследование степени метилирования вновь синтезируемых ДНК в присутствии /2-^С / оротовой кислоты и/ / аденина

3. Выделение ДНК а/ Модифицированный метод Мармура б/ Выделение и очистка из замороженных проростков высокомолекулярной ядерной ДНК центрифугированием в градиенте плотности С sCI в/ Выделение ДНК из замороженных жидким азотом проростков пшеницы . 44

4. Подготовка препаратов ДНК для анализа нуклеотидного состава.

5. Определение нуклеотидного состава и уровня метилирования ДНК а/ Гидролиз суммарной ДНК. б/ Подготовка целлюлозы и пластинок в/ Хроматография оснований

6. Получение бесклеточного экстракта с ДНК-метилазнои активностью ' а/ Осаждение нуклеиновых кислот сульфатом стрептомицина б/ Фракционирование белков бесклеточного экстракта сульфатом аммония в/ Гельфильтрация материала на Сефадексе d— грубый". г/ Проведение реакции метилирования in vitro 4

7. Выделение хроматина из этиолированных проростков пшеницы 50 Прочие методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБНАРУЖЕНИЕ ДНК-МЕТИЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В

БЕСКЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТАХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

1. Особенности метода определения ДНК-метилазной активности in vitro

2. Получение бесклеточного экстракта из 3-х суточных этиолированных проростков пшеницы

ГЛАВА П. СВОЙСТВА ЦИТ03ИН0В0Й.ДНК-МЕТИЛАЗЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ

3-Х СУТОЧНЫХ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

ГЛАВА Ш. СУБСТРАТНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДНК-МЕТИЛАЗЫ ИЗ

ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

ГЛАВА 1У. ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЦИТ03ИН0В0Й ДНК-МЕТИЛАЗЫ

ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ

ГЛАВА У. н6- МЕТИЛАДЕНИН В ДНК ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

1. Включение / 8- / аденина и метилирование адениновых остатков в ДНК первого листа проростков пшеницы

2. Адениновая ДНК-метилазная активность в первом листе этиолированных проростков пшеницы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Активность ДНК-метилаз этиолированных проростков пшеницы"

Одной из центральных проблем молекулярной биологии является изучение структуры и функции генома. Внимание многих исследователей привлечено, в частности, к проблеме метилирования ДНК в про-и эукариотических клетках, геном которых в результате подобной модификации приобретает уникальные специфические черты. У бактерий энзиматическое метилирование ДНК связано с явлениями хозяйской модификации и ресарикции. В последнее время получены сведения о том, что метилирование ДНК может служить одним из путей регуляции функциональной активности генов, транскрипции и клеточной дифференцировки /Razin ,Riggs 1980 ; Ванюшин, 1983 ; Cooper, 1983 /.

В связи с этим изучение природы и характера метилирования ДНК в эукариотических клетках при различных функциональных состояниях приобретает особый интерес.

Геном большинства изученных видов высших растений, в отличие от всех других про- и эукариотических организмов, характеризуется очень высокой степенью метилирования /содержание 5-ме-тилцитозина в ДНК отдельных видов достигает 10мол% /. Метилирование ДНК у растений видо-, тканево- и органоидоспецифично, оно изменяется в онтогенезе и под влиянием различных факторов /вирусные, грибковые инфекции и другие/ /Ванюшин, 1972, 1983; Дох:ием и др. 1978; Хвойка и др., 1978 / и под воздействием фитогормонов /Ванюшин, 1983 /.

У растений существует репликативное и пострепликативное метилирование ДНК /Башките и др., 1980/. Репликативное метилирование ДНК осуществляется по крайней мере в два этапа: сначала метилируются фрагменты Оказаки, а после их лигирования происхо

- 7 ~ дит дополнительное метилирование ДНК.-Релликвтивное метилирование ДНК является ведущим элементом регуляции сшепени метилирования ДНК в клетке. Практически ничего неизвестно, как метилируется ДНК в клеточном цикле у растений, какие и сколько ДНК-метилаз функционируют при этом, каковы свойства этих ферментов и узнаваемые ими нуклеотидные последовательности ДНК. Изучение этих моментов, на наш взгляд, имеет принципиальное значение, так как с одной стороны, позволит вплотную приблизиться к объяснению механизмов модификации генома растений и регуляции его активности при дифференцировке клеток, а с другой стороны, оно исключительно важно для выяснения биологической роли метилирования ДНК у высших растений.

Основной целью настоящей работы является выделение и исследование свойств ДНК-метилаз из развивающихся этиолированных проростков пшеницы.

Исходя из цели работы, конкретной задачей исследования было:

Выделить цитозиновую ДНК-метилазу из проростков пшеницы, изучить ее свойства и установить, какими отличительными чертами она обладает по сравнению с ранее изученными растительными ДНК-метилазами;

Установить, как изменяется ДНК-метилазная активность в клеточном цикле и коррелирует ли она с синтезом ДНК;

Выяснить, содержится ли в ДНК пшеницы и^-метиладенин и присутствуют ли в бесклеточных экстрактах этиолированных проростков пшеницы адениновые ДНК-метилазы.

В результате проведенных исследований в проростках пшеницы ньйдена ДНК-метилаза, способная переносить СН3-группы с s-аде-нозилметионина на цитозиновые остатки ДНК с образованием остатков 5-метилцитозина.

Показано, что цитозиновая ДНК-метилаза пшеницы способна метилировать эндогенцую и экзогенную гомологичные ДНК. Бактериальные ДНК из клеток Photobacterium Belozerskii метилируются в этих же условиях значительно хуже. Впервые установлено, что в процессе развития первого листа этиолированных проростков пшеницы в клетках меристемы изменяется цитозиновая ДНК-метилазная активность, коррелирующая с интенсивностью синтеза ДНК. 2

В ДНК проростков пшеницы впервые найден н -метиладенин в качестве дополнительного минорного основания /0,2% от включенного в ДНК меченого аденина/. В бесклеточных экстрактах из проростков пшеницы впервые обнаружена адениновая ДНК-метилазная активность, осуществляющая in vitro перенос метильных групп с S-аде-нозил- L-метионина на адениновые остатки гомологичной и бактериальной ДНК.

Выполненная работа носит теоретический характер. Полученные данные могут быть использованы при чтении курсов лекций и проведении практикумов по физиологии и биохимии растений и молекулярной биологии. Экспертиментальные результаты вносят вклад в понимание механизмов энзиматической модификации генома растений и регуляции его активности при дифференцировке клеток, полученные результаты могут быть использованы для разработки методов целенаправленного изучения ДНК-метилаз, в частности, для изучения существования рестрикции у растений и влияния зависимости матричной активности ДНК и экспрессии генов от степени и характера ее метилирования.

Настоящее исследование выполнено в Межфакультетской проблемной лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им.А.Н.Белозерского Московского государственного университета им.М.В.Ломоносова и на кафедре общей и молекулярной генетики Киевского государственного университета им.Т.Г.Шевченко.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ШВА I. ПРИРОДА И ПРОИСХОЖДЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ МЕТИЛИРОВАННЫХ ОСНОВАНИЙ В ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

I. Метилированные основания в ДНК и механизм их возникновения

В!.ДНК разного происхождения наряду с обычными могут встречаться дополнительные метилированные основания /fyatt , 1951/. В ДНК высших растений уже давно выявлен 5-метилцитозин /m ^С/ и он обнаруживается в суммарных ДНК всех изученных до сих пор высших растений /Ванюшин,1959, 1965, 1971, 1972/.

Минорные основания в ДНК возникают на полинуклеотидном уровне, в результате метилирования соответствующих нуклеотидных остатков в специфических нуклеотидных последовательностях ДНК-метилаза-ми /Ванюшин, Кирнос, 1976; Кудряшова, Ванюшин, 1976а, 19766; Simon, Grunert, 1978; Catо, Burdon, 1979/.

При инкубации проростков пшеницы с мечеными по метильной группе m 5q и его нуклеозидами заметной активности в выделенном из ДНК m ^С не обнаружено /Хвойка и др.,1974; Сулимова и др., 19786/. Сделан вывод, что п^С и его нуклеозиды не могут включаться в ДНК в готовом виде, а весь обнаруживаемый в ДНК растений и ^С, по-видимому, является продуктом энзимэти'ческого метилирования цитозиновых остатков в цепях ДНК.

Количество m % варьирует в ДНК разных видов растений от I до Ю мйп% /Ванюшин, 1959, 1965, 1971, 1972/.

Для исследования специфичности метилирования генома высших растений особый интерес приобретают поиски в их ДНК других оснований, и в частности, и^-метиладенина /ш ^А/. Это основание обычно для ДНК бактерий /Ванюшин, 1965а, 1968/; грибов ^/Бурьянов и др., 1970/ и водорослей /Пахомова и др., 1968 ; Rae,1976$Hattman et al. ,1978), был также обнаружен в ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae /Веножинскис и др. 1982/. После инкубации проростков кукурузы, ячменя, редиса, гороха, огурца и подсолнечника с [8 ^С]-аденином в течение ночи при комнатной температуре заметная радиоактивность /до 0,2% от включенного в ДНК аденина/ обнаруживается как в аденине, так и в А, выделенных из ДНК этих проростков /Ванюшин и др., 1971/. У хлопчатника, в описанных условиях инкубирования происходит значительное включение [8-^^С]аденина в ДНК проростков /до I-I05 инп/мин на I мкМ аденина ДНК/. 2

После разделения оснований гидролизата меченой ДНК в зоне Н-метиладенина всегда обнаруживалась радиоактивность, которая сохранялась после многократной рехроматографии на бумаге /Ванюшин, 1971/, радиоактивность в зоне этого основания составляла 0,04% от радиоактивности включившегося в ДНК аденина.

Позднее /Бурьянов и др., 1972/ из ДНК пыльцы ивы и березы с выделен и спектрофотометрически определен тА /0,22 мол% /. Нас личие и количественное содержание m А в ДНК может служить дополнительной характеристикой видовой специфичности высших растений. а

Открытие прА в ДНК растений указывает на то, что в клетках высших растений присутствуют особые ферменты ДНК-метилазы, которые модифицируют ДНК по остаткам аденина. До сих пор такие ДНК-метилазы у высших растений еще не обнаружены Aalousek, Morris, 1969/. Не выяснена также и функциональная роль метилирования ДНК у высших растений. Поэтому исследование характера энзиматической модификации ДНК у высших растений приобретает особый интерес и важно для понимания регуляции транскрипции генома у растений.

L - II

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кавальская, Виктория Степановна

ВЫВОДЫ

1. В бесклеточных экстрактах из первого листа этиолированных проростков пшеницы обнаружена цитозиновая ДНК-метилаза, осуществляющая модификацию цитозиновых остатков в составе ДНК с образованием в ней 5-метилцитозина.

2. Установлено, что цитозиновая ДНК-метилаза из бесклеточных экстрактов проростков пшеницы в условиях температуры 30° имеет оптимум действия при рН - 7,8 в случае бактериальной ДНК и при рН 7,5 - ДНК пшеницы.

3. Показано, что в отличие от ДНК-метилаз животных ДНК-метилазная активность из проростков пшеницы преимущественно метилирует эндогенную и выделенную из того же источника ДНК. ДНК из бактериальных клеток Photobacterium Belizerskii метилируются в этих условиях значительно хуже.

4. Установлено, что активность ДНК-метилаз в &фазе клеток меристемы первого листа изменяется пропорционально скорости репликации ДНК.

5. Показано, что активности ДНК-метилаз, осуществляющие метилирование гомологичной и гетерологичной бактериальной ДНК, изменяются в клеточном цикле проростков по-разному: в одинаковых условиях метилирования максимум метилирования гомологичной ДНК совпадает с миниь/гумом метилирования бактериальной ДНК. Предполагается, что в ядрах проростков пшеницы могут присутствовать по крайней мере две разные по свойствам и времени действия в клеточном цикле ДНК-метилазы.

6. В суммарной ДНК проростков пшеницы в качестве дополнись тельного метилированного основания обнаружен и -метиладенин около 0,2 % от включенных в ДНК остатков аденина/.

7. В бесклеточных экстрактах первого листа этиолированных проростков пшеницы найдена адениновая ДНК-метилазная активность, осуществляющая перенос метильных групп с S -аденозил-L -метиони-на на остатки аденина гомологичной и гетерологичной ДНК с образод ванием остатков Н -метиладенина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований в проростках пшеницы найдены ДНК-метилазы, способные переносить СНэ-группы с s-адено-зилметионина на цитовиновые и адениновые остатки ДНК с образованием 5-метилцитозина и $-метиладенина.

Это является подтверждением предположения о множественности и различной специфичности растительных ДНК-метилаз,обусловленной различным уровнем функциональной активности генома в клетках /Ванюшрн и др., 1971» Бурьянов и др., i972<;:Kalousek, Morris, 1969 Theias, Pellman, 1980; Sano, Sager, 1980).

В ряде работ были предприняты попытки обнаружить и ^С в хло-ропластах и митохондриальных ДНК высших растений /Кирнос и др., 1983а, 19836; Tewari, 1966 /. Эти исследования не выявили m^С ни в хлДНК, ни в мтДНК. Во фракции хлоропластов, полученных из выращенных на свету листьев проростков пшеницы, после сахарозного градиента, нам так же не удалось обнаружить существенной цито-зиновой ДНК-метилазной активности.

При исследовании количественного распределения цитозиновой ДНК-метилазной активности, нами показано, что большая ее доля приходится на клетки меристемы листа, где происходит интенсивный синтез ДНК /Кирнос и др., 1983/.

В одной из первых работ, посвященных изучению ДНК-метилаз высших растений было показано, что в проростках гороха до 93% обнаруженной в ядрах клеток ДНК-метилазной активности было связано с нерастворимым ядерным материалом /Kaiousek, Morris, 1969/. В наших исследовангях обнаруженная нами ДНК-метилаза, действительно ассоциирована с хроматином активно делящихся клеток меристемы листа проростков.

- 90

При метилировании гомологичной ДНК зародышей пшеницы реакция имеет оптимум рН 7,5, а при метилировании в тех же условиях гетерологичной бактериальной ДНК /Photobacterium Belozerskii/ -при 7,8. Температурный оптимум реакции - 30°. Эти данные довольно близки по значению к величинам* полученным ранее для цитози-новых ДНК-метилаз, обнаруженных в ядрах проростков гороха - рН 7,8; 28-30° /::.Kalousek,Morris, 19б9/и ядрах зародышей пшеницы - рН 7,3; 25° / Theias, Fellman, 1980/.

Как известно, цитозиновые ДНК-метилазы животного происхождения эффективнее метилируют гомологичные не метилированные ДНК бактериального происхождения, чем собственные гомологичные ДНК г Roy et al., 1975;Adams et al,t9/№>> сравнили акцепторные свойства эндогенной ДНК экстракта, гомологичной ДНК из зародышей пшеницы и гетерологичной не метилированной ДНК бактерии Hi. Belozerskii При добавлении гомологичной ДНК в реакционную смесь, количество метки в возрастает почти в 3 раза по сравнению с метилированием одной только эндогенной ДНК» Это свидетельствует о том, что гомологичная ДЕК эффективно метилируется ДНК-метилазой бесклеточного экстракта. Наши данные согласуются с результатами, полученными для ДНК-метилаз из всех изученных объектов раститель--ного происхождения / Kalousek, Morris,1969; Sano,Sager, 1980; Theias, 198/)/ дю означает, что несмотря на высокую степень метилирования растительных ДНК 111 vitro в них все же остаются не метилированные, либо полуметилированные сайты, которые в условиях реакции метилирования ^ vi"br0 становятся доступными для ДНК-метилаз / Кирнос и др., 1983; Deumling, I98f/ Вместе с тем, если для ДНК-метилаз из проростков гороха и клеток Chlamidomonas reinhardi /Kalousek,Morris,1969;Sano,Sager,1980/ было показано довольно высокое сродство к бактериальной ДНК i ДНК Е. coli и Microccocus luteus /, то в наших экспериментах включение метки в ДНК почти не изменилось при проведе

- 91 ~ нии реакции метилирования в присутствии гетерологичной бактериальной ДНК. Это заметно отличает исследуемую нами ДНК-метилазу из проростков пшеницы от изученных ранее ДНК-метилаз растительного происхождения.

Согласно гипотетическим представлениям Разина и Риггса в эукариотической клетке, по-видимому, существуют два типа ДНК-метилаз: инициирующие и поддерживающие метилирование /Razin, Riggs,l980/ Предполагается, что инициирующие ферменты способны заново метилировать вовсе неметилированные ДНК не содержащие СН3-групп в обеих цепях симметричной ^ ^ последовательности, а поддерживающие ДНК-метилазы метилируют только возникающие при репликации полуметилированные сайты m q q. Б этом отношении в наших опытах метилирование бактериальной, несодержащей заметного количества остатков m ^С ДНК можно рассматривать как метилирование по инициирующему типу, а метилирование эндогенной ДНК проростков или экзогенной гомологичной ДНК зародышей пшеницы, содержащей полуметилированные сайты /Кирнос и др., 1983/, - по поддерживающему типу метилирования ДНК. Судя по нашим данным активности этих ДНК-метилаз в клеточном цикле не совпадают; в известном смысле они зеркально противоположны: в клеточном цикле при максимуме одной активности, другая минимальна. Эти данные, во-первых, указывают, на множественность различающихся по субстратной специфичности цитозиновых ДНК-метилаз у растений, а во-вторых, на разную их временную приуроченность к метилированию ДНК в клеточном цикле, что, в свою очередь, может указать на возможность метилирования разных интерметиэтов синтеза ДНК в клеточном цикле различными специфическими для них ДНК-метилазами.

В ДНК высших растений /Ванюшин и др.,1971/ помимо m 5С был0 обнаружено еще одно метилированное основание - N ^-метиладенин./111 ^А/. В наших опытах в ДНК выделенной из инкубированных в присутствии

- 92 ~ аденина проростков пшеницы, практически вся радиоактивность содержится в аденине и гуанине. Кроме того, во всех случаях относительно небольшая радиоактивность четко присутствует при хроматографии гидролизата меченой пшеничной ДНК строго в зоне m ^А. Эта радиоактивность в т^А / 0,2-0,8/6/ сохраняется после многократной, в том числе и двумерной тонкослойной хроматографии индивидуального т^А в разных системах растворителей. Это свидетельствует о том, что в суммарной новосинтезированной ДНК развивающихся проростков пшеницы присутствует тбА. Значит, в проростках пшеницы могут присутствовать и адениновые ДНК-метилазы. К сожалению, мы еще не можем сказать в какой степени разные клеточные ДНК /яДНК, мтДНК, хлДНК/ подвержены метилированию по адени-новым остаткам. Однако, мы зьаем, что в листе проростка на изученной стадии развития /48-96 час/ подавляющее количество новообразованной ДНК приходится на долю яДНК /Кирнос и др.,1983/. Поэтому с большей долей вероятности можно считать, что в проростках пшеницы метилированию по адениновым остаткам подвержены именно лДНК. Вместе с тем, нельзя исключать, что эта энзиматическая модификация по адениновым остаткам ДНК может осуществляться также в миюхондриях и особенно в хлоропластах.

Величина включения метки из ( метил-3Н) в остатки различных ДНК-акцепторов составляли в разных опытах от 5 до 2.7% от радиоактивности в остатках т5С. В ДНК Photobacterium Belozerski: адениновые остатки метилируются по отношению к остаткам цитозина втрое интенсивнее, чем в гомологичной экзогенной ДНК из проростков пшеницы. По-видимому в ДНК Photobactreium Belozerskii содержится существенно большее количество сайтов для адениновой метилазы, однако в условиях инкубации с бесклеточным экстрактов, содержащим неочищенную адениновую ДНК-метилазу, не все из них

- 93 могут быть промктилированы. Фракционирование бесклеточного экстракта сульфатом аммония /60% насыщения/ привело к значительной ^ стимуляции включения метки в остатки аденина гомологичной и, в особенности, гетерологичной ДНК.

Наличие т^а в ДНК проростков пшеницы указывает на то, что в клетках высших растений в отличие от животных / Vanyushin, 1970 / присутствуют особые ДНК-метилазы, которые модифицируют ДНК по остаткам аденина.

Таким рбразом, изучение растительных ДНК-метилаз имеет принципиальное значение, так как позволяет приблизиться к объяснению механизмов модификации генома растений и регуляции его активности при дифференцировке клеток, а так же; оно исключительно важно для выяснения биологической роли метилирования у высших растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кавальская, Виктория Степановна, Киев

1. Антонов А.С. Нуклеотидный состав ДНК животных: связь с систематикой этих организмов и его эволюция. - Успехи совр.биол., 1965, т.60, № 5, с.161-177.

2. Бартон К. Определение концентрации ДНК с помощью дифениламина. В кн.: Методы исследования нуклеиновых кислот. Под ред. акад. А.Н.Белозерского. М., Мир, 1970, с.79-82.

3. Башките Е.А., Славенас И.Ю., Ванюшин Б.Ф. Содержание 5-метилцитозина в ДНК салата при воздействии гибберелином на ранних стадиях онтогенеза. Вестник МГУ, Биология, 1978, № I, с.45-50.

4. Башките Е.А., Хвойка Л.А., Фридрих А., Ванюшин Б.®. Изменение содержания 5-метилцитозина в ДНК растений гороха под влиянием фитогормонов. Биолог, науки, 1979, № 7, с.23-28.

5. Башките Е.А., Кирнос М.Д., Кирьянов Г.И., Александруш-кина Н.И., Ванюшин Б.®. Репликация и метилирование ДНК в клетках суспензионной культуры табака и влияние ауксина Биохим.,I980gt т.45, № 8, с.1448-1455.

6. Башките Е.А., Александрушкина Н.И., Кирнос М.Д., Кирьянов Г.И., Ванюшин Б.Ш. Метилирование ДНК в суспензионной культуре клеток табака при обработке фитогормонами Биолог, науки, 1980 т.196 № 4, с.103-110.

7. Бердышев Г.Д., Коротаев Г.К., Боярских Г.В., Ванюшин Б.Ф. Исследование нуклеотидного состава ДНК в соматических тканях нерестующей горбуши. Цитология и генетика, 1967, т.1, № 3, с.56-60.

8. Бурханова Э.А. Выделение ядер и хроматина из растительных тканей. Физиология растений, 1976, т.23, № 2, с.421-426.

9. Бурцева Н.Н., Демидкина Н.П., Азизов Ю.М., Ванюшин Б.Ф. Изменение специфичности метилирования ДНК в лимфоцитах крови крупного рогатого скота при хроническом лимфолейкозе. Биохимия, 1978, т.43, № II, с.2082-2091.

10. Бурьянов Я.И., Ильин А.В., Скрябин Г.К. Содержание 6-метиламинопурина в ДНК грибов Mueor hiemalis.

11. Доклады АН СССР, 1970, т.195, с.728-730.

12. Буряьнов Я.И., Ерошина Н.В., Вагабова JI.M., Ильин А.В. О нахождении 6-метиламинопурина в ДНК пыльцы высших растений. -Доклады АН СССР, 1972, т.206, № 4, с.992-995.

13. Ванюшин Б.Ф., Белозерский А.Н. Нуклеотидный состав ДНК высших растений.- Докл. АН СССР, 1959, т.129, № 2, с.944-946.

14. Ванюшин Б.Ф. Определение нуклеотидного состава нуклеиновых кислот. В кн.: Современные методы в биохимии. Под ред. В.Н. Ореховича, М., Медицина, 1964, с.236-250.

15. Ванюшин Б.Ф. Нуклеиновые кислоты и систематика растений. В кн.: Проблемы филогении растений. М., 1965, т.13,с.14-22.

16. Ванюшин Б.3>., Кокурина Н.А., Белозерский А.Н. 6-ме-тиламиноцурин в ДНК некоторых микроорганизмов. Доклады АН СССР, 1965 а, № 6, с.1451-1454.

17. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и его биологическое значение. Успехи соврем, биолог., 1968, т.65, с. 163-185.

18. Ванюшин Б.Ф., Кадырова Д.Х., Каримов Х.Х., Белозерский А.Н. Минорные основания в ДНК высших растений. Биохим., 1971, т.36, № 6, с.1256-1258.

19. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и его значение в диф-ференцировке видов и эволюции организмов. В кн.: Строение ДНК и положение организмов в системе, М., МГУ, 1972, с.279-319.

20. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК в клетках различных организмов. Успехи соврем, биол., 1974, т.77, №2, с.68-90.

21. Ванюшин Б.§., Кирнос М.Д. Структура митохондриальных ДНК животных: нуклеотидный состав, пиримидиновые блоки и характер метилирования, Молекулярная биология, 1976, т.Ю, № 4,с.868-878.

22. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК в клетках различных организмов. Успехи совр. биолог., 1977, т.77, № 2, с.68-90.

23. Ванюшин Б.Ф., Бердышев Г.Д. Ферментативная модификация ДНК и ее изменения в процессе онтогенеза. В кн.: Молекуляр-но-генетические механизмы старения. М.: Медицина, 1977 а, с. 2551.

24. Ванюшин Б.Ф., Сингх С.С., Сонвол Г. Изменение метилирования ДНК люцерны при заражении кускутой и тканевые различияв ДНК паразитического растения. Биохимия, 1979, т.44, № 5, с.864-867.

25. Ванюшин Б.Ф., Башките Е.А., Фридрих А., Хвойка Л.А. Метилирование ДНК в проростках пшеницы и влияние фитогормонов. -Биохимия, 1981, т.4, № I, с.47-54.

26. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и дифференцировка у высших растений. В кн.: Рост растений и дифференцировка. Наука, Москва, 1981 а, с.176-191.

27. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК у эукариотов новый механизм регуляции экспрессии генов и клеточной дифференцировки. - Успехи биологической химии, 1983, т.24, с.170-193.

28. Васильев В.К., Гарибян Д.В., Захарян Р.А., Галоян А.А., Ванюшин Б.Ф. Различный уровень метилирования ДНК в разных отделах головного мозга крупного рогатого скота. Докл. АН СССР, 1972, т.205, № 3, с.721-723.

29. Веножинскис М.Т., Канопкайте С.И., Бурьянов Я.И. Метилированные азотистые основания ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.- Биохим., 1982, т.47, № 12, с. 2064-2067.

30. Георгиев Г.П. Гипотеза о структурной организации опе-рона и регуляции синтеза РНК в животной клетке. Мол.биол., 1970, т.4, с.17-29.

31. Г^уськова Л.В., Бурцева Н.Н., Тушмалова Н.А., Ванюшин Б.Ф. Уровень метилирования ДНК ядер нейронов и глиии коры больших полушарий мозга крыс и его изменение при выработке условного рефлекса. Докл. АН СССР, 1977, т.233, № 5, с.993-996.

32. Даскалюк А.П., Тищенко Е.Н., Остаплюк А.Н., Лобов В.П. Свойства уникальных и повторяющихся последовательностей ДНК родственных яровых и озимых сортов пшеницы. Физиол. и биохимия культ, раст., 1982, тД4, № I, с.134-137.

33. Демидкина Н.П., Кирьянов Г.И., Ванюшин Б.Ф. Метилирование вновь синтезируемой ДНК в культуре мышиных фибробластов. -Биохимия, 1979, т.44, № 8, с.1416-1426.

34. Дохием М., Сулимова Г.Е., Ванюшин Б.Ф. Нуклеотидный состав и пиримидиновые олиго^клеотиды в ДНК некоторых высших растений. Вестник Московского университета /Биология/, 19789 № I, с.70-73.

35. Дохием М., Сулимова Г.Е., Ванюшин Б.Ф. Распределение 5-метилцитозина в пиримидиновых олигонуклеотидах ДНК некоторых высших растений. Биохим., 1978 йб, т.З, № 7, с.1312-1317.

36. Дрожденюк А.П., Сулимова Г.Е., Ванюшин Б.Ф. Изменение цуклеотидного состава и молекулярной популяции ДНК пшеницы цри прорастании. Мол.биология, 1976, т.10, № 6, с.1378-1381.

37. Дрожденюк А.П., Сулимова Г.Е., Ванюшин Б.Ш. Содержание 5-метилцитозина в разных классах повторяющихся последовательностей ДНК некоторых высших растений. Биохимия, 1977, т. 42, № 8, 1439. 1448.

38. Зиньковская Г.Г., Бердышев Г.Д., Ванюшин Б.Ф. Тканево-специфическое уменьшение и изменение метилирования ДНК крупного рогатого скота при старении. Биохимия, 1978, т.43, № 10, с.1883-1892.

39. Ибрагимов А.П., Ариджанов Ш.А. Пахомова Л.С., Юцусха-нов Ш. Молекулярные механизмы биосинтеза белков и нуклеиновых кислот. Изд-во Ш Узб.ССР, Ташкент, 1975, с.161-177.

40. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.3>. 5-ме-тилцитозин в пиримидиновых последовательностях ДНК растений и животных: специфичность и метилирование. Биохим., 1981, т.46, № 8, с.1458-1473.

41. Кирнос М.Д., Бакеева Л.Е., Волкова С.А., Ганичева Н.И., Ванюшин Б.Ф. Митохондриальная природа новообразованной ДНК в стареющих колеоптилях этиолированных проростков пшеницы. Биохим., 1983а,т.48, №9, с.1505-1512.

42. Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю., Ченцов D.C. Биохимический подход к проблеме полинемности хромосом некоторых растений. -Доклады АН СССР, 1974, т.218, № 2, с.485-488.

43. Кирьянов Г.И., Романов Г.А., Ванюшин Б.Ф. Внутригеном-ное распределение 5-метилцитозина в ДНК некоторых эукариотов

44. Докл. АН СССР, 1974 а, т.219, № 4, с.1007-1009.

45. Кирьянов Г.И., Смирнова Т.А., Исаева Л.В., Ванюшин Б.Ф., Буряьнов А.И. Ограниченная доступность сайтов метилирования ДНКв хроматине разных уровней организации для бактериальных метилаз м ecor 11 и м ее о dam. -Биохимия, 1981, т. 46, № 10,с.1887-1895.

46. Кирьянов Г.И., Исаева Л.В., Кирнос М.Д., Ганичева Н.И., Ванюшин Б.§. Репликативное метилирование ДНК в Ь-клетках : действие s- изобутиладенозина и циклогексимида и возможное существование двух ДНК-метилаз. Биохим., 1982, т.47, № I, с.153-161.

47. Кокурина Н.А., Ванюшин Б.Ф. Нуклеотидный состав ДНК мхов. Тезисы доклада ХП Международного ботанического конгресса. Л., 1975, с.26.

48. Кудряшова И.Б., Ванюшин Б.Ф. Метилирование ядерных ДНК из разных органов 1фысы: тканевые и возрастные различия акцепторной способности ДНК Биохим. 1976 а, т.41, № 6, с.НОб-III5.

49. Кудряшова И.Б., Ванюшин Б.Ф. Метилирование ядерной ДНК печени крысы при индукции гидрокортизоном. Биохим., 1976 б, т.41, № 2, с.215-222.

50. Кудряшова И.Б., Волкова С.А., Кирнос М.Д., Ванюшин Б.Ф. Метилирование новообразованной ДНК в развивающихся проростках пшеницы. Биохимия, 1983, т.48, № 6, сЛ031-1034.

51. Ладик Я. В кн.: Квантовая биохимия для химиков и биологов. -М.: Мир, 1975, с.112-121.

52. Мазин А.Л., Ванюшин Б.Ф. Сулимова Г.Е. Нуклеотидный состав и частота встречаемости разных пиримидиновых фрагментов в ДНК беспозвоночных животных. Биохимия, 1969, т.34, с.1202-1208.

53. Мирошниченко Г.П., Антонов А.С., Вальско-Роман К.М. Результаты исследования кинетики реассоциации денатурированных фрагментированных ДНК некоторых высших растений. Докл. АН СССР, 1972, т.205, № 5, с.1243-1245.

54. Никольская И.И., Лопатина Н.Г., Рекунов В.Н., Юрке-вич A.M., Дебов С.С. О влиянии s-нуклеозил L- гомоцистеинов на активность некоторых метилаз ДНК. - Воггр. мед.химии, 1978, т.24, № 2, с.252-255.

55. Пахомова М.В., Зайцева Г.И., Белозерский А.Н. Наличие S-метиламинопурина в составе ДНК некоторых водорослей. Доклады АН СССР, 1968, т.183, № 3, с.712-715.

56. Романов Г.А., Кирьянов Г.И., Дворкин В.М., Ванюшин Б.Ф. Влияние гидрокортизона на метилирование и молекулярную популяцию ДНК в печени крыс Биохимия, 1976, т.41, № б, с.1038, 1042.

57. Романов Г.А., Ванюшин Б.Ф. Сравнительный анализ кинетики ренатурации вновь синтезированной и суммарной ДНК эукариотов как способ выявления избирательного синтеза генома. Мол.биол., 1977, т.11, вып.4, с.941-949.

58. Романов Г.А., Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК у эукариотов I. Метилируемые последовательности и ДНК-метилазы. Биоло-гич. науки, 1980, № II, с.5-17.

59. Романов Г.А., Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК эука-риот. П. Биологическое значение. Биологич.науки,1981, № I,с.5-14.

60. Смирнова Т.А., Кирьянов Г.И., Будницкая Е.В. Содержание 5-метилцитозина в ДНК листьев пшеницы зараженных стеблевой ржавчиной. Биологич.науки, 1976, т.149, № 5, с.20-25.

61. Смирнов В.Г., Романов Г.А., Ванюшин Б.Ф. Содержание 5-метилцитозина в разной по степени повторенности последовательностях ДНК печени крыс и его изменение при индукции гидрокортизоном. Докл. АН СССР, 1977, т.232, № 4, с.961-964.

62. Смирнов В.Г., Кирьянов Г.И., Ванюшин Б.Ф. Локализация 3Н -гидрокортизона в ядрах печени крыс. Биохимия, 1978, т.43,4, с.240-248.

63. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия, 1958, т.23, № 5, с.656-662.

64. Сулимова Г.Е., Дрожденюк А.П., Ванюшин Б.Ф. Изменение метилируемых последовательностей и молекулярной популяции ДНК пшеницы при прорастании. Молек.биол., 1978а?т.12, № 3, с.496-503.

65. Сулимова Г.Е., Ванюшин Б.Ф., Хвойка Л.А., Фридрих А., Булгакова Р.Л., Черны Б. 0 невозможности включения 5-метилцитозина и его нуклеотидов в ДНК высших растений. Биохим., 1978,б, т.43, № 3, с.240-248.

66. Хвойка Л.А., Фридрих А., Черны Б., Ванюшин Б.Ф. Включение и метилирование предшественников пиримидиновых нуклеотидов в ДНК высших растений. В кн.: Структура и функции нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. Изд-во МГУ, 1974, с.37-40.

67. Хвойка Л.А., Сулимова Г.Е., Булгакова Р., Башките Е.А., Ванюшин Б.Ф. Изменение содержания 5-метилцитозина в ДНК растений по мере градиента цветения. Биохим., 1978, т.43, № 6, с.996-100.

68. Xbeles R. The mechanism of'action of S-adenosyl-homocysteinase. -Coll.Ges.Biol.Chem., 1981, N;32, p. 192-195.

69. Adams R.L.P. Newly synthesized DNA is not methylated. Biochim. Biophys. Acta, 1974, v. 335, p. 365-373.

70. Anderson W.A., Marshall Jr., Remy C.N., Sipe J.E. Ribosomal ribocnucleic acid-adenine (N—) methylase of Escherichia coli strain Bi ionic and substrate site requirements. J. Bacteriol., 1973, v. 114, p. 988.

71. Bestor Т.Н., Jugrani V.M. Two DNA methyltransferase from murine erythroleukemia cells: purification, sequence specificity, and mode of interection with DNA PNAS, 1983, v. 80, N 18, p. 55595563.

72. Bird A.P., Southern E.M. Use of restriction enzymes to study eukaryotic DNA methylation. I. The methylation pattern in ribosomal DNA from Xenopus laevis. J.Mol.Biol., 1978, v. 118, N 1, p. 27- 49.

73. Browne M.J•, Burdon R.H. The sequence specificity of vertebrate ША methylation. Nucl. Acid. Res., 1977, v. 4, К 1» p. 10251037.

74. Christman J.K., Price P., Pedrfan b., Acs G. Correlation between hypomethylation of ША and expression of globin genes in Friend erythroleukaemia cells. Europ. J. Biochem., 1977, v. 81, p. 5361.

75. Collins A.R.S., Squires S., Jonson R.T. Inhibitors of repair ША synthesis. Uucl. Acids Res., 1982, v. 10, N 4, p. 1203-1213.

76. Cortellaro M. Rapporti tra s-adenosilmetionine e metabolismo lipidico. Minerva Med., 1972, v. 63, p.2224-2230.

77. Cooper D.N. Eukaryotic DNA methylation. Нша Genet., 1983, v. 64, p.315-333.

78. Coulandre C., Miller J.H., Farabough P.J., Cilbert W. Moiccuiar basis of base substitution hotspots in E. coli. Nature, 1978, v. 274, p.775-781.

79. Cullis C.A. DNA sequence organisation in the flax genome. -Biochim. et Biophys. Acta, 1981, v. 652, N 1, p. 1-15.

80. Cox R., Prescott C., Irving C. The effect of S-adenosylhomocys-teine on ША methylation in isolated rat liver nuclei. -Biochim. Biophys. Acta, 1977, V. 474, p.493-499.

81. Drabovsky D., Wacker A. Inactivation of mammalian ША methylase activities by JT-methyl-N-nitrosoguanidine. Eur. J. Cancer, ШЧ-5, v. 11, N 17, p. 517-519.

82. Doerfler W. DNA methylation a regulatory signal in eukaryotic gene expression. - J. Gen Virol, 1981, V. 57, p. 1-20. j# Durante M., Geri C., Ciomei M. ША methylation in dedifferentiating plant pith tissue. - Experientia, 1982, v. 32, IT 4, p. 451452.

83. Ehrlich M., Wang R.Y.H. 5-methylcytosine in eukaryotic DM. -Science, 1981, v. 219, p. 1350-1357.3, Finkelstein J.D., Harris B. Methyonine metabolism in rat tissues. ■ Arch. Biochem. and Biophys., 1973, v. 159, p. 160-167.

84. Gorovsky M.A., Hattman S., Pleger G.L. И-- Methyladenine in thenuclear DNA of a eukaryote, Tetrahymena pyriformis. J.Cell Biol., 1973, v. 56, p. 697-701.

85. Groudine M., Eisenman R., Weintraub H. Chromatin structure of endogenous retroviral genes and activation by an inhibitor of DUA methylation. Hature, 1981, v. 292, p. 311-317.

86. Gruenbaum Y., Naveh-Many Т., Cedar H,, Razin A. Sequence specificity of methylation in higher plant DM. Nature, 1981, v, 292, Ж 5826, p. 860-862.

87. Herrmann R.G., Bohnert H.J., Kowallik K.V., Schmitt J.M. Size conformation and purity of chloroplast DM of some higher plants. -Biochim. Biophys. Acta, 1975, v. 378, p. 305-317.

88. Holliday R., Pugh J,E. DM modification mechanism and gene activity during development. Science, 1975, v. 187, N 4173, p. 226232.

89. Ishida Т., Tanaka A., Inoue M., Fujiwara Т., Tomita K. Conformational studies of S-adenosyl-b-homocysteine, a potential inhibitor of S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferases. J.Amer. Chem. Soc., 1982, v. 104, N 25, p. 7239-7248.

90. Miller O.J., Cartwright E.M., Brownlee G.G., Pedoroff N.V., Brown D.D. The nucleotide sequence of oocyte 5S DNA in Xenopus laevis. II. The GC-rich region. Cell, 1978, v. 13, p. 717.

91. Mohandas Т., Sparkes R.S., Shapiro L.I. Reactivation of an inactive human X chromosome: evidence for X inactivation by DNA methylation. Science, 1981, v. 211, p.393-396.

92. Roy P.H., Weissbach A. DNA methylase from Hela cell nuclei. -Nucl. Acid Res., 1975, v. 2, N 10, p. 1669-1684.

93. ZfQ.Royer H.D., Sager R. Methylation of chloroplast DNAs in the life cycle of chlamydomonas. Proc.Natl.Acad.Sci USA, 1979, v.76,p. 5794-5798.

94. Sager R., Kitchin R. Selective silencing of eukaryotic ША. -Science, 1975, v. 189, p. 4201.

95. Sanders H.L., Blanchard, Hellewell S., Ingram V.M, ЩА methylation in chicken 4 -globin gene expression. Proc. Nat. Acad. Sci USA. Biol. Sci, 1982, V. 72, N 17, p. 5332-5336.

96. Sano H., Sager R. DM methyltransferase from the eukaryote. Chlamydomonas reinhardi. Eur. J. Biochem., 1980, V. 105, p. 471-485.

97. Sano H., Grabowy G., Sager R. Differential activity of DNA methyltransferase in the life cycle of Chlamydomonas reinhardi. -Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981, v. 73, p, 3118-3123.

98. Sano H., Sager R. Tissue specificity and clustering of methylated cytosines in bovine satellite I DNA. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Biol. Sci., 1982, v. 79, N 11, p. 3584-3588.

99. Sims MiAl,, Doering J.L., Hoyle H.D. DM methylation patterns in the 5S DMs of Xenopus laevis. Nucl. Acids Res., 1983, v. 11, IT 2, p. 277-290.

100. Simon D., Grunert P., Acken U.V., DOring H.P., Kr6ger H. DNAmethylase from regenerating rat liver: purification and characterization. Nucl. Acids Res., 1978, v. 5, N 6, p. 2153-2167.

101. Sneider T.W. Methylation of mammalian deoxyribonucleic acid. II. The distributions of 5-methylcytosine in Novikoff hepatoma cell DM. J. Biol. Chem., 1971, v. 246, IT 15, p. 4474-4783.

102. Sneider T.W. Methylation of mammalian DM. Terminal versus internal location of 5-methylcytosine in oligodeoxyribonucleotides from Novikoff hepatoma cell DNA. J. Biol. Chem., 1972, v. 247, p. 2872-2875.

103. Sneider T.W., Teague N.M., Rogachevsky Ъ.М. S-adenosylmethionine: DNA-cytosine 5-methyltransferase from a Novikoff rat hepatoma cell line. Nucl. Acids Res., 1975,v. 2, N 10, p. 1685-1700.

104. Stein R,, Razin A., Ceder H. In vitro methylation of the hamster adenine phosphoribosyltransferase gene inhibits its expression in mouse Ь cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Biol. Sci., 1982,v. 79, If 11, p. 3418-3422.

105. Sturm K.S., Taylor J.H. Distribution of 5-methylcytosine in the DNA of somatic and germline cells from bovine tissues. Nucl. Acids Res., 1981, v. 9, N 18, P. 4537-4546.

106. Taylor S.M., Jones P.A. Mechanism of action of eukaryotic DUA methyltransferase. Use of 5-aracytosine-containing DUA.

107. J. Mol. Biol., 1982, v. 162, N 3, p. 679-692.

108. Tewari K.K., Wildman S.G. Chloroplast DNA from tobacco leaves. -Science, 1966, v. 153. p. 1269-1273.

109. Theias G., Fellmann H. 5-methylcytosine formation in wheat embryo DNA. Biochim. Biophys. Res. Com., 1980, v. 94, N 1, p. 291-297.

110. Turnbull P., Adams R.b.P. DHA methylase: purification from ascites cells and the effect of various DNA substrates on its activity. Nucl. Acids Res., 1976, v. 3, p. 677-695.

111. Van der Ploeg LHT, Flavell R.A. DHA methylation in the human Jj-globin locus in erythroid and nonerythroid tissues. Cell, 1980,1. V. 19, p. 947-958.

112. Vanyushin B.P., TTkjacheva S.G., Belozersky A.N. Rare bases in animal ША. Nature, 1970, v. 225, p. 948-949.

113. Q. Vanyushin B.P., Kiryanov G.I., Kudryashova I.В., Belozersky A.N. DNA-methylase in loach embryos. PEBS Letters, 1971, v. 15, N 4, p. 313-316.

114. X. Vanyushin B.P., Mazin A.L., Vasilyev V.K., Belozersky A.N. The content of 5-methylcytosine in animal DNAs the species and tissue specificity. Biochim. Biophys Acta, 1973, v. 299, p. 397-403.

115. Waalwijk C., Flavell R.A. DNA methylation of a CCGG sequence in the large intron of the rabbit B-globin gene: tissue-specific variations. Nucl. Acids Res., 1978, v. 5, N 12, p. 4631-4641.

116. V/albot V., Dure L.S. Developmental biochemistry of cotton seed embriogenesis and germination. J. Mol. Biol., 1976, v. 101, p.503-536.

117. Щ. Walker P.M. "Repetitive" DNA in higher organisms. Prog. Biophys. Molec. Biol., 1971, v. 23, p. 145-201.

118. Weintraub H, Larsen A., Grudine M. ^-Globin gene switching during the development of chicken embryoss expression and chromosome structure. Cell, 1981, v. 24, p. 333-338.

119. Wyatt G.R. The purine and pyrimidine composition of deoxypentose nucleic acids. Biochem. J. 1951, v. 48, N 5, p. 584-590.