Структурно-функциональное исследование сайт-специфического метилирования ДНК эукариот

Шевчук, Тарас Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональное исследование сайт-специфического метилирования ДНК эукариот
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное исследование сайт-специфического метилирования ДНК эукариот"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Филиал Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

ШЕВЧУК ТАРАС ВАЛЕРЬЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ЭУКАРИОТ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино - 2008 р О Л " ! 2ЙО

003451386

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии растений Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и в департаменте клеточной биологии Национального медицинского центра (Лос-Анжелес, США).

Научный консультант: доктор биологических наук профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

доктор биологических наук

доктор биологических наук профессор

Бурьянов Ярослав Иванович

Патрушев Лев Иванович Кирьянов Глеб Иванович

Романов Георгий Александрович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

Защита состоится 2008 г. в 11 часов на заседании совета Д

501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, лаб. корпус "А", аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва.

Автореферат разослан -4-С* сг^,_2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, р

кандидат биологических наук И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на изучение явления энзиматического метилирования ДНК эукариот в течение шестидесяти лет, мы ещё далеки от полного понимания функциональной роли этой модификации генома. В клетках эукариотических организмов метилирование ДНК участвует в регуляции генетической экспрессии, клеточной дифференцировки и морфогенеза, эпигенетическом контроле геномного импринтинга и инактивации мобильных генетических элементов. Эти функции установлены как у млекопитающих, так и у высших растений. Нарушение нормальной картины метилирования ДНК сопровождает канцерогенез и генетические заболевания человека. В настоящее время установлено, что большинство своих функций метилирование ДНК осуществляет в качестве интегральной части механизма модификации и ремоделирования структуры хроматина. В этом процессе участвуют многочисленные белки, осуществляющие различные ковалентные модификации гистонов, а также короткие некодирующие РНК. Согласно современным взглядам, метилирование ДНК служит эпигенетической меткой, позволяющей регуляторным факторам транскрипции отличать метилированные последовательности генома от гомологичных, но не метилированных последовательностей. Существенные успехи в исследовании метилирования ДНК получены после открытия белков, связывающихся с метилированной ДНК. В настоящее время особое внимание уделено белкам, связывающимся с метилированными Срв-последовательностями ДНК и мобилизующими в эти участки гис-тоновые деацетилазы и другие гистон-модифицирующие белки, формирующие транскрипционно неактивную структуру хроматина. Картина сложноразветвлённой сети многочисленных взаимосвязанных реакций модификации и ремоделирования структуры хроматина только устанавливается, в том числе устанавливается специфичность функций индивидуальных ДНК-метилтрансфераз эукариотической клетки. В структурно-функциональном исследовании энзиматического метилирования эукариотических ДНК существует значительный пробел, связанный с изучением только Срв-типа этой модификации. Однако у эукариот обнаружен второй симметричный тип метилирования ДНК СрИрв (И — любой нуклеозид) и несимметричный тип метилирования Ср1Ч. Растущее внимание к картине метилирования эукариотического генома, на фоне которой развиваются нормальные и нарушенные процессы жизнедеятельности, ставит вопрос о раздельном анализе каждого из этих типов метилирования ДНК. Исследование различных типов сайт-специфического метилирования ДНК имеет фундаментальное значение для понимания функциональной роли этой модификации эукариотического генома.

Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение СрО- и СрКрО-тннов метилирования ДНК высших эукариот в условиях изменения метаболизма и клеточ-

ной дифференцировки и при трансген-индуцированном метилировании генома, а также разработка новых методических приёмов анализа метилирования ДНК и применения ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях. В число основных экспериментальных задач входили:

- разработка метода определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях ССУ/йй (ХУ = А или Т) генома;

- исследование эффекта трансген-индуцированного ССУ/Св-метилирования (СрЫрО-тип) ДНК клеток растений Мсойапа гаЬасит\

- анализ метилирования генома растений МезетЬгуамЬетит сгуз!аШпит в условиях солевого стресса и переключения метаболизма на С4-путь фотосинтеза;

- анализ метилирования 5'-концевой области гена кальцитонина человека в норме и при лейкозах;

- исследование эффекта трансген-индуцированного СС\¥СС-метилирования ДНК клеток НК293 культуры эпителиального слоя почек человека;

- разработка приёмов применения цитозиновых ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях.

Научная новизна. На основе особенностей каталитической активности ДНК-метилтрансфераз АггМ и ЕссЯШ разработан метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях СС\\ЮО.

Впервые осуществлён перенос в клетки растений гена гетерологичной ДНК-метилтрансферазы ЕсоБШ (М-£соМ1) в составе Т-ДНК агробактериальной Ть плазмиды дикого типа и в модифицированной форме М^-М-ЯсоИГ в составе обезоруженной Т-ДНК. Обнаружено, что неэкспрессируемый ген М-£соЮ1 индуцирует у первичной трансформированной клеточной ткани N. /аЬасшп образование новых морфологических и биохимических фенотипов. Установлен пониженный уровень метилирования внутреннего цитозина в последовательностях ССХУвО в ДНК этих клеток. Показано, что экспрессия гена МЬЗ-М-ЬЪэТШ индуцирует новый морфологический фенотип целого растения и вызывает в его геноме дополнительное метилирование последовательностей ССХУвО. Установлено, что в условиях засоления, при переключении Сз-фотосинтеза на С4-путь фотосинтеза, наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательностей СС\УОО в ДНК растений М. сгу.иаШпит, связанное с гиперметилированием фракции повторяющейся ДНК. Полученные данные могут свидетельствовать о новой специфической функциональной роли СрКрО-мстилирования повторяющейся ДНК в образовании специализированной структуры хроматина в клетках М. сгушШпит при их адаптации к солевому стрессу и переключении на С,4-фотосинтез.

Обнаружено, что при лейкозах гиперметилирование цитозина в последовательностях CpG в 5'-концевой области гена кальцитонина человека не распространяется на близлежащие последовательности CpNpG. Сформулировано положение о существовании особого безальтернативного CpG-метилирования генома высших эукариот. Впервые осуществлён перенос в клетки НК293 культуры эпителиального слоя почек человека гена ДНК-метилтрансферазы fcoRII в модифицированной форме NLS-M£ce>RII-GFP. Установлено, что трансген-индуцированное CCWGG-метилирование ДНК клеток НК293 не влияет на CpG-метилирование их генома. Показано отсутствие влияния CCWGG-метилирования промотора гена АРС на его экспрессию в клетках НК293. Установлено отсутствие эффекта CCWGG-метилирования олигодезоксинук-леотидных субстратов на активность ДНК-метилтрансферазы DNMT1 in vitro.

Выявлены особенности частоты встречаемости сайтов CWG и CCWGG в геноме человека, указывающие на их возможную различную структурно-функциональную роль.

Для применения в нанобиотехнологии и ингибирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз in vivo сконструированы и исследованы олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы на основе модифицированных производных цитозина и ДНК-метилтрансферазы EcoRII.

Практическая ценность работы. Разработанный метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG в геномной ДНК может применяться при анализе динамики сайт-специфического метилирования генома различных организмов в процессе их жизнедеятельности.

Получены генетические конструкции для экспрессии модифицированных форм гена ДНК-метилтрансферазы £coRII: NLS-M-£coRII и NLS-M-£coRII-GFP в клетках растений и млекопитающих.

Экспрессию в клетках растений гетерологичных генов цитозиновых ДНК-метилтрансфераз можно использовать для получения эпигенетического разнообразия клеточных культур растений, а полученные клетки и ткани использовать в качестве новых удобных объектов для исследования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК.

Клетки млекопитающих, экспрессирующие гетерологичные гены цитозиновых ДНК-метилтрансфераз могут использоваться как удобные модели для изучения особенностей эпигенетических модификаций ДНК.

Сконструированные на основе модифицированных производных цитозина и ДНК-метилтрансферазы EcoBll олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы перспективны для восстановления нормальной картины метилирования ДНК эукариотической клетки.

Полученные в работе оригинальные экспериментальные данные могут быть использованы в теоретических и практических курсах современной молекулярной и клеточной биологии высших эукариот.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из ведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 226 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка и 11 таблиц. Библиография включает 432 источника. Апробация результатов работы. Результаты данной работы были представлены на 4th New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, (Австрия, 1997); Annual Oncologycal Congress of American Urologie Association, (США, 2002); Scholarship of Anticancer Drug Design, (США, 2003); FEBS-CNRS Workshop on DNA and RNA modification enzymes: Comparative Strucure, Mechanism, Function and Evolution, (Франция, 2007); 12th Congress of the European Hematology Association, (Австрия, 2007); VI Съезде Гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь (Минск, 2007); III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); VI Съезде Общества Физиологов растений России (Сыктывкар, 2007); Международном симпозиуме по физико-химической биологии (Москва, 2004); IV съезде Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, (Пущино, 2006); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и программы Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека»

Автор выражает особую признательность профессору Я.И. Бурьянову, в лаборатории которого были выполнены приоритетные исследования, положенные в основу настоящей работы. Автор благодарит всех сотрудников и студентов своей группы, а также всех зарубежных коллег за плодотворное сотрудничество.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка метода определения уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК

У животных и растений в основном исследовано метилирование ДНК в последовательности CpG. Однако у растений ДНК метилирована в значительной степени не только в последовательности CpG, но и в последовательности CpNpG [Кирнос и др., 1981; Gruenbaum et al., 1981]. CpNpG-метилирование ДНК имеет место также в клетках млекопитающих [Clark et al., 1995]. Не исключено, что CpG- и CpNpG-типы метилирования ДНК могут выполнять особые функции в клетке. Растущее внимание к динамике метилирования генома, на фоне которого развиваются разнообразные генетические процессы, ставит вопрос о его раздельном анализе в последовательностях CpG и CpNpG.

В работе разработан энзиматический метод определения уровня метилирования цитозина в эукариотических ДНК в нуклеотидной последовательности, соответствующей CpNpG-метилированному мотиву. Предлагаемый метод основан на применении ДНК-метилтрансфераз EcoRll и B.v/NI. Оба фермента узнают в ДНК одинаковую последовательность CCWGG, в которой метилируют внутренний цитозин. Эти ферменты различаются продуктами ДНК-метилазной реакции. ДНК-метилаза £coR1I модифицирует цитозин, перенося метальную группу на С5-атом пиримидинового кольца с образованием 5-метилцитозина (т5С). ДНК-метилаза BifNI модифицирует этот же остаток цитозина, метилируя экзоциклическую аминогруппу и образуя N4-метилцитозин (ш4С). Особенностью ДНК-метилазы B.viNI является её способность модифицировать ДНК, содержащую в последовательности CCWGG внутренний цитозин в форме ш5С, образуя при этом К\5-диметилцитозин (m4,m5C) (рис. 1).

NH,

сн.

Н^ ^СНз N

сн.

5-метил цитозин (т5С)

Ж-метилцитозин (ш4С)

М4,5-диметилцитозин

Рис. 1. Метилированные производные цитозина.

Иными словами, по включению метальных групп в ДНК ферментом ßsfNI можно оценить в ней общее количество последовательностей CCWGG независимо от присутствия в ДНК т5С. С другой стороны, с помощью ДНК-метилазы EcoRE можно оценить в ДНК только количество неметилированных последовательностей CCWGG. Таким образом, разность между метальными группами, включёнными в анализируемую ДНК ферментами ßs/NI и EcoRII, должна отражать степень недометилированно-сти этой ДНК in vivo.

В предложенном методе необходимым требованием является полнота проведения энзиматической реакции метилирования ДНК в условиях отсутствия её лимитирования недостатком фермента или донором метальных групп S-аденозилметионина. Условия реакции энзиматического метилирования ДНК. Реакционная смесь содержала 40 мМ трис-HCl (pH 8,0), 2 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 6,6 мкМ S-аденозил-Ь-[метил-3Н]-метионин (удельная активность 15 Ки/мМ), от 0,1 до 1,2 мкг ДНК и 20 ед.акт. ДНК-метилазы (1 ед.акт. — количество фермента, катализирующее перенос на ДНК фага X dem- 1 пмоль метальных групп за 1 час). Реакцию проводили в течение 2 ч при 37°С с метилазой EcoRII и 55°С с метилазой ßjiNI. Пробы наносили на DE-81 бумагу 2x2 см, промывали последовательно 0,2 М раствором NaHC03, водой и этанолом. Образцы высушивали, помещали во флаконы с толуольным сцинтил-ляционным раствором и просчитывали на сцинтилляционном спектрометре.

Рис. 2. Включение метальных групп в ДНК Е. coli ДНК-метилазами EcoRII и ß.viNI.

I- ДНК Е. coli B834(N3), включение ДНК-метилазой EcoRII; 2- смесь (1:1) ДНК Е. coli В834 и Е. coli B834(N3), включение ДНК-метилазой EcoRII; 3 - смесь (1:1) ДНК Е. coli В834 и Е. coli B834(N3), включение ДНК-метилазой BstNl. Общее количество ДНК в стандартной ферментативной реакции составляло 1 мкг.

0,2 0.4 0,6 0,8 1.0 1,2 ДНК, MKT

Рис.3. Включение метальных групп в стандартных условиях реакции в смесь (1:1) ДНК.. £ coli В834 и Е. coli B834(N3) ДНК-метилазой &oRII (1), и в ДНК Е. coli B834(N3) ДНК-метилазой BstM (2).

В случае определения радиоактивности ш4С и ш4,ш5С ДНК после реакции энзима-тического метилирования гидролизовали до азотистых оснований в 57% хлорной кислоте в течение 1 ч при 100°С. К полученному гидролизату добавляли синтетические метилированные азотистые основания ш4С и ш4,ш5С. Разделение азотистых оснований проводили хроматографией на пластинках с целлюлозой (Merck, Германия) в системе бутанол-вода-аммиак (60:10:0,1). Сорбент из областей, соответствующих положению метилированных азотистых оснований, соскабливали, помещали во флаконы с толуольным сцинтилляционным раствором и просчитывали на сцинтилляцион-ном спектрометре.

Требование проведения полного метилирования ДНК удовлетворяется при использовании в энзиматической реакции метилирования 0,1-1,0 мкг ДНК, 20 ед. ДНК-метилазы, 6,6 мкМ концентрации SAM и проведении реакции в течение 1 ч (рис. 2, 3). Определение уровня метилирования сайтов CCWGG в исследуемых ДНК можно проводить двумя способами. В первом способе используется пара ДНК-метилтрансфераз EcoRII и B.S/NI.

Отношение величин включения метальных групп в ДНК, осуществляемое метила-зами EcóRlI и Ду/NI, равно 1 в случае полного отсутствия т5С в последовательности CCWGG и уменьшается пропорционально его количественному содержанию в этой последовательности. Уровень метилирования in vivo последовательностей CCWGG в исследуемой ДНК можно определить по формуле:

.. Г. ¡EcoRI! Л mn

М = 1--xlOO

IBstNI J

где M— уровень метилирования ДНК in vivo (в процентах), lEcoRlI— радиоактивность, включённая в ДНК метилазой EcoRU, IBstNI — радиоактивность, включённая в ДНК метилазой BstNL

Этот способ проверен на модельных ДНК Е. coli B834(N3), полностью модифицированной in vivo ДНК-метилтрансферазой EcoRII, и ДНК Е. coli В834, не содержащей остатков ш5С. Данные анализа этих ДНК, а также смеси этих ДНК в соотношении 1:1, полностью соответствуют ожидаемым результатам (табл. 1).

Второй способ определения уровня метилирования этой последовательности состоит в количественном анализе продуктов энзиматической модификации ДНК ферментом ß.v/NI, которыми могут быть т4С или т4,т5С. При этом ш4С образуется в случае присутствия в последовательности CCWGG внутреннего цитозина в немети-лированной форме, в то время как образование m4,m5C зависит от присутствия в этом положении т5С. Уровень метилирования in vivo последовательностей CCWGG в исследуемой ДНК можно определить по формуле:

„ С /(m4,m5C) "l „

V /(m4, т5С) + 1(т4СУ Х где М— уровень метилирования ДНК in vivo (в процентах), 1(т4С)— радиоактивность (количество) N -метилцитозина, Цт,т5С) — радиоактивность (количество) 1Ч4,5-диметилцитозина.

Этот метод проверен на тех же модельных ДНК Е. coli В834, Е. coli B834(N3) и равной смеси этих ДНК. Данные анализа этих ДНК, представленные в табл. 1, соответствуют результатам их анализа по первому способу с помощью пары ДНК-метилтрансфераз EcoRII и BífNI. Использование радиоактивного S-аденозил-Ь-[метил-3Н]-метионина позволяет брать для анализа в реакцию энзиматического метилирования ДНК менее 1 мкг ДНК, что ставит этот метод в ряд современных методов аналитического микроанализа ДНК.

Таблица 1.

Уровень метилирования последовательностей CCWGG различных ДНК

ДНК Уровень метилирования (%)

Метилазы £coRII+ß«NI (I способ) Метилаза ßsrNI (II способ)

Е. coli В 834 0* 1,8+0,5

Е. coli B834(N3) 97,5±3,2 98,2±2,8

Е. coli B834(N3)+£. coli B834 (1:1) 49,4+1,8 47,5+1,3

N. tabacum (листья) 64,5±2,7 63,3+1,2

"Включение метил-'Н групп в ДНК ферментом EcoRII на уровне фона.

Разработанный в данной работе метод можно использовать не только для анализа уровня метилирования последовательностей СС\УСС, но, в приближении, оценивать состояние метилирования и всех последовательностей СрМрй в ДНК.

Новым экспериментальным подходом к выяснению функциональной роли метилирования ДНК у эукариот является изучение трансгенных клеток с различными генами ДНК-метилтрансфераз. ДНК-метилаза £соМ1 (М£соМ1) модифицирует внутренний цитозин в последовательностях ДНК CCWGG. Эта последовательность содержит центральный тринуклеотид, соответствующий СрКрО-метилированному мотиву ДНК растений. В начальной части работы были трансформированы растения табака N. тЬасит рекомбинантной агробактериальной Т-ДНК с геном М-£соШ1 и проведён анализ некоторых физиолого-биохимических свойств полученных трансформированных тканей и уровня метилирования последовательностей СС\УСС в их геноме. Интеграция гена ДНК-метилтрансферазы EcoR.Il в Т-ДНК агробактериальной Л-плазмиды дикого типа. Клонированный в плазмиде рУК32 ген М-£соШ1 был суб-клонирован в коинтегративном векторе рЬОУ2382, содержащем фрагмент Т-ДНК агробактериальной Тьплазмиды рТЮ58 для проведения гомологичной рекомбинации с Тьплазмидой в клетках А. Ште/ааеп$. (рис. 4).

Рис. 4. Схема клонирования гена М-ЕсоМ! в Т-ДНК Тьплазмиды дикого типа рШУ2382.

2. Трансген-индуцированное ССЛУСС-метилирование ДНК растений МсоНапа <аЬасит

ЕсоШ

Ватт

Плазмиду pLGV2382-M-£coRII переносили из клеток Е. coli В834 в клетки A. tumefaciens С58 в трёхродительском скрещивании с помощью штамма Е. coli GJ23. В результате были получены клетки А. tumefaciens с коинтегрированной Ti-плазмидой, которая в дополнение к маркерным генам нопалинсинтазы (nos) и синтеза фитогормонов (tins], tms2, tmr) несла также ген M-EcoRII под дополнительным nos-промотором.

В клетках A. tumefaciens, также как и в клетках Е. coli В834, ген M-EcoRII определял CCWGG-специфичность метилирования клеточной ДНК и защищал её от гидролиза рестрикционной эндонуклеазой EcoRII. Аналогичным путём была получена ко-интегрированная Ti-плазмида без гена M-EcoRII, использованная в контрольных вариантах эксперимента.

Интеграция модифицированного гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII в обезоруженный агробактериальный вектор. Ген M-EcoRII был клонирован в плазмиду pRT103 под контроль конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV) (рис. 5). В дальнейшем кодирующая часть гена M'EcoRII была модифицирована вставкой сигнала ядерной локализации (NLS) вируса SV40. Продукт экспрессии полученной конструкции в dem" клетках Е. coli GM272 проявлял EcoRII-специфический характер метилирования ДНК. В дальнейшем модифицированный ген NLS-M-EcoRII был перенесён в бинарный вектор pGA482, и полученную плазмиду pGA482::NLS-M EcoRII переносили из клеток Е. coli GM272 в клетки А. tumefaciens 3101 в трёхродительском скрещивании с помощью штамма Е. coli GJ23.

M&riUF- pofrA1 PGA4S2

С .... „.. ^

nplll

LB 35S NLS M.EcoRlI polyA RB

Рис. 5. Схема клонирования модифицированного гена NLS-M EcoRII под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты.

В результате были получены клетки А. Ште/ас1еп$ с рекомбинантной Ть илазмидой, которая несла модифицированный ген {\LS-M ЕсоШ1 под контролем промотора 35Б СаМУ и ген прШ маркерного белка неомицинфосфотрансферазы. Присутствие целевого гена ]ЧЬ8-М £соШ1 в агробактериях было подтверждено гибридизацией по Саузерну с геном М ЕсоКII в качестве зонда.

2.1. Получение трансгенных опухолевых линий №соНапа ¡аЬасит, содержащих ген ДНК-метилтрансферазы £соШ1

На раневую поверхность стеблей проростков N. ГаЬасит наносили суспензию клеток А. ште/аЫепя, несущих Тьплазмиду с геном М ЕсоКй или без него. Образованные опухоли вырезали и культивировали в виде каллусной культуры на агаризован-ной среде Мурасиге-Скуга (М8). Селекцию трансформированных клеток проводили в суспензионной культуре на безгормональной жидкой среде МБ с цефотаксимом. Свободные от агробактерий клеточные микроагрегаты переносили на агаризованную среду МЭ без антибиотиков, содержащую фитогормоны нафтилуксусную кислоту и 6-бензиламинолурин. В течение двух месяцев культивирования первичной опухолевой культуры N. (аЬасит, трансформированной Тьплазмидой с геном М £соМ1, происходила её спонтанная морфологическая дифференциация. Эта культура дала начало несколькими новым стабильным морфологическим линиям с характерной структурой и цветом (рис. 6).

и А

0 Ч5КГ ь

Рис. 6. Фенотип трансформированных линий культуры ткани N. гаЬасит с геном М'ЯсоЯИ.

1 — «белая компактная» линия; 2 — первичная ткань с геном МЕсоМГ; 3 — «жёлтая рыхлая» линия; 4 — тератомная линия. Названия линий соответствуют их морфологии, цвету и плотности.

Физиолого-биохимическая характеристика трансгенных опухолевых линий N. (аЬасит. Первичная трансформированная культура имела типичные свойства опухолевой ткани, определяемые специфическими генами Т-ДНК агробактериальной Ть плазмиды дикого типа, и проявляла гормон-независимый рост и способность синтезировать нопалин. Однако образованные из первичной опухолевой культуры новые линии различались между собой по этим свойствам. Так, «белая компактная» каллус-ная линия проявляла нопалинсинтазную активность и гормон-независимый рост, а «жёлтая рыхлая» линия имела противоположные свойства, то есть не синтезировала нопалин и была гормон-зависимой (табл. 2). В то же время контрольная опухолевая культура ткани, полученная в результате трансформации Тьплазмидой без гена М 'ЕсоКМ, стабильно сохраняла свой исходный морфологический фенотип и по своим свойствам не отличалась от первичной опухолевой культуры с геном М \EcoRII.

Таблица 2.

Фенотип трансформированных линий культуры ткани ккоНапа ¡аЬасит с геном М-£соШ1

Линия культуры ткани Синтез нопалина Зависимость от гормонов Уровень СС\¥СО-метилирования (%)

Первичная ткань с геном МЕсоЯП + — 33,4+1,5

«Белая компактная» линия + — 42,5±1,8

«Жёлтая рыхлая» линия — + 34,8±1,6

Тератомная линия — — 37,1+1,2

Нетрансформированный каллус(контроль 1) — + 58,3+1,8

Трансформированная ткань без гена М£со1Ш + - 60,5±2,3

Уровень метилирования последовательностей СС\УСО в геноме трансгенных опухолевых линий N. <аЬасит. Блот-гибридизационный анализ ДНК показал присутствие гена MficoR.II в геноме всех трансформированных фенотипических линий (рис. 7). В то же время, анализ геномов этих линий методом ПЦР с применением праймеров к 5-концам гена М-£со1111 показал отсутствие у них полноразмерных копий этого гена (рис. 8). Амплификация этого гена в смеси с исследуемыми ДНК различных фенотипических опухолевых линий табака указывает на отсутствие у них диффузного ингибитора ПЦР.

Определение уровня метилирования цитозина в последовательности СОМСО проводили по разработанному нами методу, основанному на применении ДНК-метилаз £соШ1 и В^ЬЧ. ДНК всех трансформированных опухолевых линий с геном ДНК-метилазы ЕсоШ! отличается пониженным уровнем метилирования последовательностей ССАУвв по сравнению с ДНК контрольной нетрансформированной каллусной ткани и опухолевой линии, трансформированной Тьплазмидой без гена М'£гоШ1

(табл. 2). Таким образом, интеграция в ДНК клеток табака гена М-ЕсоЯИ в составе агробактериальной Т-ДНК дикого типа не только не вызвала дополнительного метилирования генома клеток растений, но привела к его значительному понижению.

По-видимому, ген М EcoR.ll не экспрессируется в клетках трансформированных линий из-за нарушенной структуры его 5'-концевой области. Кроме того, в этих экспериментах ген М£соМ1 не кодировал сигнал ядерной локализации для транслокации ДНК-метилтрансферазы £соМ1 из цитоплазмы в ядро, что понижало вероятность проявления белком своей каталитической функции в ядре.

Влияние интегрированного в геном N. шЬасит гена ДНК-метилтрансферазы М -ЕсоКП на фенотип трансгенных опухолевых линий и пониженный уровень метилирования последовательностей СрИрй в их геноме можно объяснить возможностью гомологичной рекомбинации гена М'&сЖН с одним из собственных ДНК-метилтрансферазных генов N. шЬасит и его инактивации («нокаута»).

Этому соответствует наблюдаемый в настоящей работе положительный сигнал гибридизации между геном ДНК-метилазы £соШ1 и ДНК из клеток контрольной нормальной каллусной линии и опухолевой каллусной линии без гена М-ЕсоКП (рис.7, дор. 1, 6). В случае гибридизационного анализа ДНК из трансформированных линий с геном М-ёсоИП этот сигнал отсутствовал или его положение было заметно смещено. Сохраняющийся пониженный уровень метилирования последовательности ССХУвв в ДНК этих клеток может обеспечиваться активностью продуктов других интактных генов растительных ДНК-метилтрансфераз. Полученные данные указывают на существование выраженной причинно-следственной связи между интеграцией гена ДНК-метилазы £соЫ1 в геном N. ГаЬасит и изменением фенотипических свойств трансформированных опухолевых тканей.

12 3 4 5 6 т.п.н.

— 23,1

■щш&ШШ

шт «и» т ~~

Рис. 7. Блот-гибридизационный анализ ДНК культур тканей Шсайапа юЬасит.

1 - опухолевая ткань без гена МЕсоШ1; 2 - первичная опухолевая ткань с геном М-ЕсоЫ1; 3 - «белая компактная» линия; 4 - тератомная линия; 5 - «жёлтая рыхлая» линия; 6 - нетранс-формированный каллус.

—9,4 — 6,5

—4,3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 т.п.н.

-—1,5

Рис. 8. ПЦР-анализ ДНК культур тканей N¡0011(140. тЬасшп.

1 - ДНК плазмиды рЬОУ2383::М £соГШ: 2 - ДНК трансгенных растений табака с геном МЕсоЯН (№::М-£го1У1); 3 - «белая компактная» линия; 4 - «белая компактная» линия + №.:М-£соМ1; 5 - «желтая рыхлая» линия; 6 - «желтая рыхлая» линия 4 №;;М-ЕаЖ11; 7 - те-ратомная линия; 8 - тератомная линия + №::М-£соМ1; 9 - первичная ткань с геном М-£соШ1; 10 - первичная ткань с геном М-ЕсоЯП + №::М-£с«КП; II - ^трансформированный каллус; 12 - трансформированная ткань без гена М-£соЫ1; 13 - рВК//?га1

Интеграция гена ДНК-метилтрансферазы EcoR.II в геном трансформированных аг-робактериями клеток N. шЬасит привела к появлению различных физиологических и морфолого-биохимических фенотипов опухолевой ткани. После публикации нашей работы [Вигуапоу & а!., 1995] разнообразие морфологических фенотипов было отмечено также у растений Лга/л'с/»/лш ЛаПапа с пониженным метилированием генома [Бшпеяап й а!., 1996; КакШаш е! а1., 1996].

Применение химерных генов ДНК-метилтрансфераз с сигналами ядерной локализации расширяет возможности этого подхода для исследования функциональной роли энзиматичсского метилирования ДНК. Продолжением этой части работы было получение и исследование физиолого-биохимических свойств и СС\УСО-метилирования трансгенных растений N. /аЬасит, экспрессирующих ген ДНК-метилтрансферазы EcoR.Il с сигналом ядерной локализации.

2.2. Получение трансгенных растений №соНапа шЪасит, содержащих модифицированный ген >}Ь8-М -ЕсоМ!

Получение трансформированных растений табака N. ¡аЬасит. Агробактериаль-ную трансформацию проводили методом инокуляции листовых дисков растений табака клетками А. ште/аЫеш; 3101, несущих рекомбинантную И-плазмиду с геном 1ЧЬ8-М -£со1Ш. Образовавшиеся в ходе прямой регенерации растения переносили для укоренения на селективную безгормональную среду МБ, содержащую цефотаксим и канамицин. Свободные от агробактерий растения переносили на среду МБ без цефо-таксима. Для дальнейшего анализа было отобрано 12 линий устойчивых к канамици-ну растений.

Физиолого-биохимическая характеристика трансгенных растений Nicotiana ¡аЬасит. Трансгенная природа 12 линий растений N. ¡аЬасит была подтверждена ПЦР-анализом, который показал наличие полноразмерного гена прШ во всех двенадцати исследуемых линиях (рис. 9). Для подтверждения интеграции гена N1^5-М ЕсоКП был проведён ПЦР-анализ ДНК полученных линий трансформантов с применением праймеров к 5'-концам этого гена. Анализ показал присутствие полноразмерных копий гена ДНК-метилтрансферазы М£соШ1 только у пяти исследуемых линий (рис. 10).

В нашей работе в различных линиях трансгенных каллусных культур N. гаЬасит с геном МЕсоГШ без сигнала ядерной локализации также наблюдалось отсутствие полноразмерной формы этого гена. Это можно объяснить рекомбинационными перестройками между геном М£соМ1 и одним из генов ДНК-метилтрансфераз N. ¡аЬасит. Дальнейшая работа проводилась с растениями с полноразмерной формой гена М-ЕсоРШ.

1 2 3 4 5 6 7 8 т.п.н.

Рис. 9. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений Nкойапа IаЬасит с праймерами к гену я/«//. I - ДНК фага X, гидролизованная рестриктазой ШпЛ\\\ 2 - ДНК ^трансформированного растения Ж ¡аЬасит;3 - ДНК плазмиды рОА482::М'£соИ1; 4-8- ДНК трансгенных растений N. гаЬасит.

Рис. 10. ПЦР-анализ ДНК трансгенных растений ЫкоНапа ¡аЬасит с праймерами к 5'-концам полноразмерного гена МЕсо1Ш.

1 - ДНК фага X, гидролизованная рестриктазой Я/гаЛП; 2 - ДНК плазмиды рИТЮЗ; 3 - ДНК плазмиды рКТ1ОЗ::№.8-М-£с0М1; 4-10- ДНК трансгенных растений N. IаЬасит

Экспрессия чужеродного гена ДНК метилазы М£соШ1 в клетках трансгенных растений табака была подтверждена РНК-ДНК гибридизационным анализом, который показал транскрипцию этого гена во всех пяти линиях трансгенных растений (рис. 11). Трансгенные растения линий с полноразмерным геном MEcoR.II впоследствии были высажены в грунт в оранжерее. Через шесть недель после высадки в грунт эти растения обнаружили фенотипические отличия от нормального табака. В частности, их листья имели аномально развитые прилистники (рис. 12). Кроме того, трансгенные растения заметно отставали в росте, зацвели на две недели позже, и дали более мелкие семена.

/ 2 3 4 5 6 7 8

ф ^ ^ ** У

Рис. 11. Нозерн-блот гибридизационный анализ трансгенных растений Шсойапа шЬасит.

1- ДНК плазмиды рКТ103::М ЯсоМ1; 2- РНК (^трансформированного растения; 3-7-РНК трансгенных растений с полноразмерным геном М£соМ1; РНК трансгенного растения с неполноразмерной копией гена М ЯсоШ!.

От всех линий трансгенных растений были получены жизнеспособные семена, которые показали классическое расщепление 3:1 на среде с канамицином. Полученные из семян трансформантов растения первого поколения Р1 культивировались на среде МБ с канамицином. После высадки в грунт в оранжерее они также как и родительские растения (поколение БО) имели аномально развитые прилистники (рис. 12 В, С), которые не только сохранялись в последующих поколениях трансгенных растений, но и становились более выраженными. В первом поколении трансгенных растений Р1 с геном КЬв-М-ЕсоМ! прилистники не только имели больший размер, но и разрастались по всей длине листового черешка (рис. 12, С), в отличие от первичных трансформантов поколения БО, у которых прилистники развивались только у основания листового черешка.

Эти результаты вместе с ранними данными, полученными на трансгенных каллус-ных культурах с геном М-£соМ1, соответствуют наблюдениям других авторов о морфологических аномалиях мутантных растений А. МаИапа с нарушенным уровнем метилирования своего генома, вызванным специфическими мутациями или эффектом антисмысловой формы собственного гена ДНК-метилазы [КакЩат е1 а1„ 1996].

Рис. 12. Различия в морфологии между ^трансформированным растением N. 1аЬасит (А), трансгенным растением поколения И) с геном NLS-M-icoR.il (В) и трансгенным растением поколения с геном 1ЧЬ5-М-£с£ЖН (С). Стрелками показаны прилистники.

Следует также отметить, что в этих работах аномальный фенотип во всей полноте проявлялся у таких растений только через несколько поколений. Полученные данные о фенотипических аномалиях трансгенных растений табака с геном М-£соМ1 указывали на вероятное изменение картины метилирования генома полученных нами растений. Проведённый анализ подтвердил это предположение.

Определение уровня метилирования цитозина в последовательностях СС'Щ'ОО ДНК трансформированных растений N. ШЬасит. ДНК всех линий первичных растений-трансформантов (поколение РО) с геном ДНК-метилтрансферазы N1^5-М-£соЯН и их первого поколения (Б1) отличаются повышенным уровнем метилирования последовательностей СС\\ЮО по сравнению с ДНК контрольных нетрансфор-мированных растений (табл. 3). Экспрессия гена КЬБ-М-ЁсоКП в растениях приводит к повышению уровня СС\УОО-метилирования ДНК, сохраняющемуся и в последующем поколении трансгенных растений с аномальным фенотипом.

Таким образом, интеграция различных форм гена М£с<ЖП в геном трансформированных клеток N. гаЬасит приводила к появлению различных физиологических и морфолого-биохимических фенотипов у целых растений и каллусной ткани. Изменения уровня метилирования СрИрО-последовательностей ДНК, как в сторону его увеличения, так и в сторону его снижения приводили к появлению аномальных фенотипов каллусных тканей и целых растений.

Наши результаты показывают перспективность использования трансгенных растений с гетерологичными генами ДНК-метилтрансфераз как удобной модели для исследования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК.

Таблица 3.

Фенотип трансформированных линий растений Nicotiana tabacum с геном NLS-MrEcoRII

Линии растений Наличие прилистников Уровень CCWGG-метилирования (%)

Нетрансформированное растение №1 — 58,2+1,8

Нетрансформированное растение №2 — 59,0+1,5

Нетрансформированное растение №3 — 58,7+1,3

Линия №3 + 64,1+1,2

Линия №4 + 63,3+1,5

Линия №5 + 67,5+1,8

Линия №6 + 65,8+1,1

Линия №7 + 63,4±1,3

Линия №3 (П) + 64,5+1,4

Линия №4 (Р1) + 66,8±1,5

Линия №5 (И1) + 65,5±1,4

Линия №6 (И1) + 67,1±1,8

Линия №7 (Р1) + 66,2±1,7

3. Исследование метилирования растений Mesembryanthemum crystallinum в стрессовых условиях

Факультативные галофитные растения Mesembryanthemum crystallinum являются хорошо изученной физиологической моделью для исследования адаптации растений к засолению и водному дефициту. Особенностью этого растения является его способность в условиях водного дефицита, вызываемого засухой или засолением, переключаться с Сз-пути фотосинтеза на САМ-путь С4-фотосинтеза (Crassulacean acid metabolism). Благодаря своим физиолого-биохимическим особенностям и сравнительно небольшому размеру генома (около 350000 т.п.н.), М. crystallinum является удобным модельным организмом для исследования адаптации растений к условиям солевого стресса и водному дефициту.

САМ-специфическая форма фосфоенолпируват карбоксилазы (РЕР-карбоксилазы) является индикатором функционирования САМ-пути у растений М. crystallinum. В условиях водного дефицита или засоленности количество РЕР-карбоксилазы и соответствующей мРНК в клетках этих растений резко возрастает. В этих условиях у растений происходит индукция транскрипции гена Ppcl семейства генов РЕР-

карбоксилазы, а также других генов CAM-пути ассимиляции С02 [Bohnert et al., 1988]. В то же время, механизмы индукции экспрессии этих генов остаются невыясненными. В этих механизмах специфическую функцию может играть энзиматическое метилирование ДНК. Однако до настоящего времени отсутствовала информация о специфических особенностях метилирования ДНК растений М. crystallinum в условиях солевого стресса и о возможном его участии в регуляции CAM-специфических генетических программ. Целью этой части работы был анализ уровня CCWGG (CpNpG) сайт-специфического метилирования ядерной ДНК и исследование специфичности метилирования некоторых генов растений М. crystallinum, растущих в условиях солевого стресса.

Определение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК М. crystallinum. С помощью энзиматического метода, основанного на применении ДНК-метилтрансфераз EcoRII и AsfNI, обнаружено, что в условиях засоления (0,5 М NaCl), при переключении С3-фотосинтеза на CAM-метаболизм наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ядерном геноме растений М. crystallinum (табл. 4).

Таблица 4.

Уровень CCWGG-метилироваиия в ДНК растений М. crystallinum

ДНК Уровень метилирования (%)

Контрольные растения 31,5+3,8

Стресс (0,5М NaCl) 67,2+5,5

Поиск мишеней для СС^СС-гиперметипировапия в геноме М. сгу^аШпит. Блот-гибридизационный анализ ДНК контрольных и подвергнутых солевому стрессу растений М. сгу^!аШпшп не показал различий в картине CCWGG-мeтилиpoвaния 5'-регуляторно-промоторной области гена РЕР-карбоксилазы. В то же время, CCWGG-метилирование этого гена имеет место, о чём свидетельствуют различия в картине гидролиза гена рестриктазой ЕсоЯН (рис. 13, дор. 2,4) и рестриктазой (рис. 13, дор. 1, 3).

Различия в картине гидролиза гена Ррс1 РЕР-карбоксилазы рестриктазами МЪо\ и 5аиЗА (рис. 13, дор. 5-8) свидетельствуют о СрО-метилировании цитозина в последовательностях ОАТСв этого гена. Однако у растений, растущих в нормальных физиологических условиях и в условиях солевого стресса, картина метилирования этих последовательностей в гене РЕР-карбоксилазы также не изменяется. Таким образом, у растений М. сгу51аШпит картина Срв- и CCWGG-мeтилиpoвaния промоторной области гена РЕР-карбоксилазы при переключении С3-фотосинтеза на САМ-метаболизм не изменяется.

т.п.н. 1 2 3 4 5 6 7 8 23,0—

9,5 6,5

4,3 ->■

2,3 2,0

0,5 -*■

Рис. 13. Блот-гибридизационный анализ гена РЕР-карбоксилазы растений М. сгу.чшШпит.

1, 2, 5, 6- ДНК контрольных растений; 3, 4, 7, 8 - ДНК растений, культивированных в условиях солевого стресса; 1,3 - гидролиз рсстриктазой Й!ГМ1; 2,4- гидролиз рестриктазой £соШ1; 5, 7 - гидролиз рестриктазой МЪо\\ 6,8- гидролиз рестриктазой ХаиЗА.

т.п.н. 23,0 9,5

6,5 -»4,3

2,3 2,0 ~~

1 2 3 4 5 6 7 8

Г *

Рис. 14. Блот-гибридизационный анализ рибосомной ДНК растений М. сгуьшШпит.

1, 2, 5, 6 - ДНК контрольных растений; 3, 4, 7, 8 - ДНК растений, культивированных в условиях солевого стресса; 1.3- гидролиз рестриктазой Мяр!', 2, 4 - гидролиз рестриктазой Нра\\\ 5, 7 - гидролиз рестриктазой В5/№; б, 8 - гидролиз рестриктазой ЕсоШ!.

Солевой стресс не влияет также и на метилирование ядерной рибосомной ДНК. Блот-гибридизационный анализ ДНК растений, растущих в нормальных условиях и при засолении, показал отсутствие различий в картине метилирования СС\¥СО-последовательностей в этой области генома (рис. 14, дор. 5-8).

К ССХУОО-гиперметилированным мишеням генома растений М. сгуяшШпит, растущих в условиях солевого стресса, относится фракция повторяющейся («сателлит-ной») ДНК. На это указывают результаты блот-гибридизационного анализа геномной ДНК М. сгуМаШпит, где в качестве зонда использована меченная тотальная ДНК этих растений (рис. 15).

Присутствие на радиоэлектрофореграмме дискретных полос ДНК указывает на существование у растений М. сгу.иаШпит специфической фракции «сателлитной» ДНК. Анализ этой ДНК с помощью рестриктаз В.?г№ и ЕсоШ1 показал её существенное СС\\ЧЗО-метилирование у растений, растущих как в нормальных, так и в стрессовых условиях засоленности (рис. 15, дор. 5-8).

При этом у растений в условиях засоленности наблюдается гиперметилирование этих последовательностей ДНК. На это указывает существенное повышение уровня её устойчивости к расщеплению рестриктазой _EcoR.II, чему соответствует почти полное отсутствие дискретных полос ДНК (рис. 15, дор. 8). т.п.н.

23, —*■

9,5 —

6,5 —

4,3--->-

2.3 —

2,0 —

0,5

Рис. 15. Блот-гибридизационный анализ повторяющейся ДНК растений М. сгу&аШпит.

1, 2, 5, 6 - ДНК контрольных растений; 3. 4. 7, 8 - ДНК растений, культивированных в условиях солевого стресса; 1,3- гидролиз рестриктазой МярЬ 2, 4 - гидролиз рестриктазой НраЯ\ 5,7 — гидролиз рестриктазой ВиК!; 6, 8 - гидролиз рестриктазой £соШ1.

1 2 3 4 5 6 7

Таким образом, нами впервые обнаружено специфическое ССШОО-гиперметилирование повторяющейся ДНК в клетках М. сгух1а!Ипит в условиях включения экспрессии новой метаболической программы. Функциональная роль СС\¥СО-гиперметилирования «сателлитной» ДНК, вероятно, связана с формированием специализированной структуры хроматина, одновременно регулирующей экспрессию множества генов в клетках этих растений при их адаптации к засолению и переключении С3-фотосинтеза на САМ-метаболизм.

Дальнейшее развитие этой работы может быть связано с выделением и характеристикой фракции СС\УОО-гиперметилируемой повторяющейся ДНК, установлением её локализации на хромосомах растений М. сгуз1аШпит и с исследованием «САМ-специфической» структуры хроматина.

4. Анализ метилирования гена кальцитонина человека при лейкозах

Анализ последовательностей СССО. Гиперметилирование гена кальцитонина человека (КТ) в последовательностях СрО при злокачественных новообразованиях, включая лейкемии, наблюдали в различных работах. Ген КТ подвержен гиперметилированию в последовательностях Срв не только при развитии различных форм лейкозов, но и при некоторых других видах онкологических заболеваний. Данные о характере метилирования гена КТ при различных видах лейкемий остаются противоречивыми. Целью нашей работы было исследование сайт-специфических Срв- и СрИрО-типов метилирования 5'-области гена кальцитонина человека при различных формах лейкемий и лечении заболеваний.

В работе исследовано метилирование 5'-области гена КТ в клетках костного мозга и ядросодержащих клеток периферической крови у 25 человек при лейкозах и 27 человек здоровых доноров. В качестве специфического зонда применяли 5'-фрагмент гена КТ длиной 1700 п.н., любезно предоставленный доктором Б. ВауНп.

ДНК гидролизовали чувствительной к метилированию внутреннего цитозина в последовательности ССвв рестриктазой Hpa.ll и не чувствительной к этому типу метилирования рестриктазой М.чр\. Рестрикционная карта гена КЧ и различные варианты картины гидролиза 5-области гена КТ рестриктазами Мя/Л и Ира\\ представлены на рис. 16.

Гидролиз 5'-области гена КТ рестриктазой М.чр\ приводит к появлению нескольких фрагментов, из которых три с размерами 0,5, 0,6 и 1,0 т.п.н. видны при гибридизации с применяемым зондом (рис. 17, дор. 2). Гидролиз рестриктазой Нра\1 демонстрирует появление дополнительного фрагмента размером 2 т.п.н. вследствие частичного метилирования цитозина в специфической последовательности 5'-области гена КТ, что является нормой для здоровых тканей (рис. 17, дор. 1).

м, м2

1.7 кЬ

М,

0.5 кЬ

0.6 кЬ

М,

М, М2

I-«—

м4

м,

—I 3.1 кЬ

2.6 к1)

Рис. 16. Рестрикционная карта и возможные варианты гидролиза 5'-области гена кальцито-нина человека рестриктазами Нра\\ и Л/5/Я. Указаны экзоны (1, 2, 3) и координаты использованного зонда 1,7 т.п.н.

При лейкозных заболеваниях и гиперметилированном состоянии последовательностей ССБО в 5'-области гена КТ Я/?яП-картнна блот-гибридизационного анализа способен выявить появление дополнительных аномальных рестрикционных фрагментов размером 1,2, 2,2, 2,6, и 3,1 т.п.н. (рис. 18, 19). Ввиду малой информативности рест-рикционной картины гена КТ в области ниже 1,0 т.п.н. эта область на рис. 18-19 не 1 2 т.п.н. приводится. Из-за нечувствительности рестриктазы

М$р1 к метилированию внутреннего цитозина в последовательности ССОО Мл-р1-картина блот-гибридизации гена КТ у здоровых и больных людей остаётся одинаковой. Этот специфический внутренний контроль с помощью рестриктазы Мхр\ выполнен со всеми препаратами ДНК, но приведён лишь однажды на рис. 18 (дор. 2) и на рис. 19 (дор. 6).

Одинаковая картина гибридизации с зондом гена КТ наблюдалась во всех контрольных образцах (здоровые доноры), а также в ДНК периферической крови лиц из области зоны жёсткого контроля Чернобыльской АЭС.

Рис. 17 Картина гидролиза гена кальцитонина человека в норме.

1 - гидролиз рестриктазой Яра11; 2 - гидролиз рест-риктазой А/.ур1

Гиперметилирование гена КТ при миелоидных лейкозах. Описанная картина наблюдалась при всех формах заболеваний: хроническом миелоидном лейкозе (ХМЛ), остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) и миелодиспластическом синдроме (МДС). Гиперметилирование гена КТ обнаружено у всех больных ХМЛ (рис. 18, дор. 1-5) и всех первичных больных ОМЛ как в крови, так и в костном мозге (рис. 18, дор. 6, 10-14). Аналогичные изменения в картине метилирования наблюдаются и при рецидиве заболевания (рис. 18, дор. 9, 16). Аномалии метилирования полностью или почти полностью исчезали по достижении ремиссии (рис. 18, дор. 15, 17) и не были обнаружены в ДНК клеток костного мозга больного ОМЛ спустя два года стойкой ремиссии (рис. 18, дор. 8).

В отдельных случаях был прослежен характер изменения метилирования гена КЧ во времени, в зависимости от эффективности химиотерапевтического воздействия. Картина «патологического» гиперметилирования гена КЧ при первично-резистентном ОМЛ после трёх курсов химиотерапии не изменилась (рис. 18, дор. 6,7). В то же время у пациентов с благоприятным прогнозом она нормализовалась по достижении ремиссии (сравнить дор. 14 и 15; 16 и 17). У пациента с МДС присутствие аномального фрагмента размером 3,1 т.п.н. в ДНК клеток костного мозга обнаружено ещё в фазе клинического благополучия при нормальном лейкоцитозе за 4 месяца до трансформации МДС в острый лейкоз (дор. 18 и 19). Гиперметилирование обнаружено и у другого больного с МДС в фазе трансформации в ОМЛ (рис. 18, дор. 20).

Таким образом, метилирование ССвй сайтов 5'-области гена КЧ является характерной особенностью опухолевой прогрессии при различных формах лейкозов мие-лоидной природы. Вопросы диагностической значимости статуса метилирования гена кальцитонина в клинической практике лейкозов являются предметом профессионального исследования нашего соавтора Д.В. Маринича и не выносятся в нашей работе на обсуждение.

Гипермешилирование гена КТ при остром лимфоидном лейкозе. Аналогичная особенность гиперметилирования 5'-области гена КЧ характерна также для случаев лим-фоидных лейкозов (рис. 19). После курса химиотерапии в клетках костного мозга пациента с клиническим диагнозом гематологической ремиссии детектировалось гиперметилирование 5'-области гена КТ (рис. 19, дор. 1). Таким образом, на фоне клинической ремиссии отчетливо наблюдается «молекулярный рецидив» болезни.

Аномальные Я/мН-фрагменты, за исключением слабо выявляемого фрагмента размером 1,2 т.п.н., исчезли через 3 недели после проведения дополнительного курса лечения (рис. 19, дор. 2), однако через 4 недели эти фрагменты появились вновь (рис. 19, дор. 3) и уже не исчезали вплоть до клинико-лабораторной констатации рецидива через 6 месяцев (рис. 19, дор. 4-5).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 т.п.н.

—■3,1 +-2,6

*—2,0

1,2 —1,0

Рис. 18. Анализ СрО-метилирования 5'-области гена кальцитонина пациентов с различными формами миелоидных лейкозов.

1 - ХМЛ, рецидив; 2 - тот же пациент, что и /, гидролиз 3-5 - ХМЛ, терминальная стадия; 6 - ОМЛ, первичная диагностика; 7 - тот же пациент, что и б, устойчивость к химиотерапии; 8- ОМЛ, полная ремиссия; 9 - ОМЛ. рецидив; 10-14 - ОМЛ, первичная диагностика; 15 - тот же пациент, что и 14, полная гематологическая ремиссия; 16- ОМЛ, рецидив; 17-тот же пациент, что и 16, повторная ремиссия, 18- МДС; 19 - тот же пациент, что и 18. через 4 месяца. ОМЛ; 20 -трансформация МДС в ОМЛ. Везде гидролиз рестриктазой Нра11, кроме дорожки 2 (гидролиз Мхр1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 т.п.н.

—3,1 +-2,6

-<—2,0

—1,2 +-1,0

Рис. 19. Анализ Срв-метилирования 5'-области гена кальцитонина пациентов с острым лимфоидным лейкозов.

1 - гематологическая ремиссия, «молекулярный рецидив»; 2 - тот же пациент, что и /, дополнительный курс лечения; 3 - тот же пациент, что и 1, гематологическая ремиссия; 4 - тот же пациент, что и 1, костный мозг, клинический рецидив болезни; 5 - тот же пациент, что и 1, периферическая кровь, клинический рецидив болезни; 6 - первичная диагностика, гидролиз Мзр1\ 7- тот же пациент, что и 6, первичная диагностика; 8 -тот же пациент, что и б, гематологическая ремиссия; 9 - ОЛЛ в фазе неустойчивой ремиссии; 10 - тот же пациент, что и 9, дополнительный курс лечения; 11 - тот же пациент, что и 9, гематологическая ремиссия, 8 мес. до клинического рецидива, «молекулярный рецидив»; 12 -гематологическая ремиссия, «молекулярный рецидив»; 13 - тот же пациент, что и 12, клинический рецидив; 14 - гематологическая ремиссия, 2 мес. до клинического рецидива, «молекулярный рецидив»; 15 - ДНК клеток донорского костного мозга; 16 - ОЛЛ, трансплантация костного мозга; 17-18 - неустойчивая повторная ремиссия; 19 - тот же пациент, что и 77, второй клинический рецидив; 20-21 - ОЛЛ, первичная диагностика; 22-23 - ОЛЛ, устойчивость к химиотерапии. Везде гидролиз рестриктазой НраП, кроме дорожки 6 (гидролиз

Таким образом, картина «молекулярного рецидива» появилась на 5 месяцев раньше первых клинических признаков рецидива болезни. Сходная корреляция между картиной метилирования гена КТ и клиническим состоянием была отмечена также при лечении других пациентов (рис. 19, дор. 11-14).

Анализ последовательностей CCWGG . В клетках млекопитающих, как и в клетках высших растений, ДНК может быть метилирована как в CpG, так и в CCWGG-последовательностях (CpNpG-тип метилирования) [Clark et al., 1995]. Это поднимает вопросы о функциональной роли CpNpG-метилирования ДНК у млекопитающих и о специфичности генетических областей, подвергающихся CpNpG-метилированию. В этой связи ген КТ представляет особый интерес. Мы обратили внимание на то, что этот ген в своей 5'-концевой области содержит наряду с динуклеотидами CpG также и кластер последовательностей CCWGG (рис. 20), являющихся потенциальными мишенями для CpNpG-специфического метилирования ДНК [Broad et al., 1989]. До настоящего времени анализ состояния метилирования CCWGG последовательностей в 5'-концевой области гена КТ не проводился.

Нами исследовано CCWGG-метилирование 5'-области гена КТ в ДНК лейкоцитов ядросодержащих клеток костного мозга и периферической крови пациентов с миело-идными и лимфоидными лейкозами. В качестве контроля были использованы ДНК лейкоцитов периферической крови здоровых доноров. ДНК гидролизовали рестрик-тазой EcoRII, чувствительной к метилированию внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG, и рестриктазой 5s?NI, не чувствительной к этому типу метилирования ДНК. В качестве зонда использовали 1,7 т.п.н. фрагмент 5'-концевой области гена КТ. Рестрикционная карта гена КТ представлена на рис. 20.

Блот-гибридизационный анализ 5-области гена КТ с помощью рестриктазы BstNl и указанного зонда выявил ожидаемые нуклеотидные фрагменты с размерами 962, 331, 274, 235, 205, 157, 130, 101 и 83/80 п.н. (рис. 21).

1.7 kb

962

235

Рис. 20. Рестрикционная карта и возможные варианты гидролиза 5'-области гена кальцито-нина человека рестриктазами ficoR.II и В.«№. Указан экзон (1) и координаты использованного зонда 1,7 т.п.н.

Относительно слабая интенсивность радиоактивного сигнала фрагмента размером 962 п.н. связана с незначительным перекрыванием его гибридизуемым зондом. Во всех случаях картина гидролиза 5'-области гена КТ рестриктазой EcoRII, чувствительной к присутствию ш5С в узнаваемой последовательности, не отличалась от соответствующей fiy/NI-картины. Это указывает на отсутствие т'С в CCWGG последовательностях этой области гена как в норме, так и при различных формах лейкемий, характеризующихся CpG-гиперметилированием этой области гена. Известно, что в клетках млекопитающих при установлении de novo картины метилирования ДНК волна метилирования может распространяться не только на соседние CpG-сайты, но даже на отдельные остатки цитозина в непалиндромных последовательностях [Toth et al., 1990]. Однако ни в одном из проанализированных случаев нам не удалось обнаружить такого распространения метилирования на близлежащие последовательности CCWGG в 5-области гена КТ. Таким образом, нами обнаружено, что CCWGG-последовательности 5'-области гена кальцитонина человека, в отличие от гиперметилирования CpG-динуклеотидов, сохраняются неметилированными в процессе развития лейкозов.

В работах американских авторов было показано, что у культуры клеток первичных линий В-клеточной лимфомы и миеломы в промоторе неэкспрессируемого гена В-29 метилируются последовательности CCGG или CCWGG, но не обе эти последовательности одновременно [Malone et al., 2001]. Жёсткая обратная связь между метилированием этих последовательностей отмечена также для генома вируса мышиной лейкемии Молони [Lorincz et al., 2000] и миотического гена myf-3 [Franchina, Kay, 2000].

A 1 234 5 678 9 10

|§||

501/489 — 404 - 331 — т 'mi I, Ж <** ы ШЩ ШЩ pels ащ ¿¡й

242 — mm - ряж. »-« г-- -i* ее Щйя» т

190 —- _ ш »—»

147 — Ш/110 —- ■•mm ........5' ГГ ft ¡Ml

Рис. 21. Анализ состояния метилирования сайтов СС\¥СО в 5'-области гена кальцитонина человека в норме и при лейкозах.

А - риС19/Л/.с/Л; 1,2- острый лимфоидный лейкоз, полная ремиссия; 3,4 - острый лимфо-идный лейкоз, рецидив; 5,6 - острый миелоидный лейкоз, первая атака; 7,8- хронический миелоидный лейкоз, бластный криз; 9, 10 - норма. 1, 3, 5,7,9- гидролиз рестриктазой ЕсоЮ1\ 2, 4, 6, 8, 10 - гидролиз рестриктазой

В то же время полученные нами данные о постоянном отсутствии CCWGG-метилирования в 5'-области гена кальцитонина человека могут указывать на особый «безальтернативный» CpG-тип метилирования протяжённой последовательности ДНК.

С целью изучения влияния CpNpG-метилирования ДНК на уровень метилирования CpG-последователыюстей в дальнейшей работе было проведено исследование экспрессии в клетках эпителиального слоя почек человека полученного нами модифицированного гена бактериальной ДНК-метилтрансферазы MEcoRII.

5. Трансген-индуцированное CCWGG метилирование ДНК клеток эпителиального слоя почек человека

Получение трансгенных клеток, экспрессирующих модифицированный ген NLS-M-EcoRII-GFP Для трансфекции клеток НК293 получена плазмида pEcoGFP-N3, содержащая генетическую конструкцию, кодирующую модифицированный ген NLS-MEcoRII, сшитый с зелёным флуоресцентным белком (GFP) под контролем промотора цитомегаловируса (CMV) (рис. 22). Поскольку клетки НК293 не чувствительны к антибиотику G418 неомицинового ряда, а полученная плазмида содержала только ген устойчивости к неомицину, то гены GFP и NLS-M EcoRII-GFP были перенесены в вектор с устойчивостью к пуромицину pIGFP (рис. 22). Этот бицистронный вектор содержит IRES (internal ribosome entry site) за полилинкером, что обеспечивает совместную транскрипцию генов GFP или NLS-M EcoRII-GFP вместе с геном устойчивости к пуромицину под контролем CMV-промотора.

Трансфекцию клеток проводили стандартным Са-фосфатным методом. Свечение GFP наблюдали при ультрафиолетовом освещении в флуоресцентном микроскопе при экспрессии как самого GFP (контроль), так и NLS-M'EcoRII-GFP слитого белка (рис. 23). Поскольку фолдинг белковых молекул начинается с N-конца, флуоресценция GFP, расположенного на С-конце химерного белка указывает на правильную укладку его N-концевой части, содержащей ДНК-метилтрансферазу EcoRII. Клетки после трансфекции были отобраны на среде с пуромицином и фракционированы с помощью сортировщика клеток MoFlo MLS (Daco Cytomation, США) по флуоресценции GFP (рис. 24).

5.1. Анализ метилирования генома трансформированных клеток, экспрессирующих ген химерного белка NLS-M'EcoRII-GFP

De novo метилирование сайтов CCWGG. Сравнительный гидролиз высокомолекулярной ДНК трансформированных клеток НК293 рестриктазами EcoRII и BiiNI, подтверждает функциональную активность ДНК-метилазы EcoRH и её почти полное CCWGG метилирование в клетках с геном NLS-M£co/?//-GFP (рис. 25, табл. 6).

Рис. 22. Схема клонирования гена МЬ5-МЕсоГШ в вектор для экспрессии в животных клетках.

Рис. 23. Вид трансформированных клеток НК293 в флуоресцентном микроскопе в обычном (А) и ультрафиолетовом (В) свете.

Рис. 24. Графики сортировки трансформированных клеток НК293, экспрессирующих только ОБР (А) или слитый белок Г^-М ЯсоКП-СРР (В)

Таблица 6

Уровень CCWGG-мeтилиpoвaшlя в ДНК трансформированных клеток НК293

Линия клеток Уровень метилирования, %

М£соКП-СРР экспрессирующая 93,9±4,8

СРР экспрессирующая 55,2+3,4

^трансформированные клетки 57,6±3,1

Анализ метилирования последовательностей ССОС. С целью исследования эффекта экспрессии ДНК-метилтрансферазы М &оКП на СрО-метилирование был проведён анализ метилирования ССОв-последовательностей ДНК трансформированных клеток. Для этого сравнивали степень гидролиза геномной ДНК рестриктазами Нра\\ и М$р1. После гидролиза липкие концы образовавшихся фрагментов ДНК были мечены включением [32Р](1СТР с помощью фрагмента Клёнова.

т.п.н. 1 2 3 4 5 6

Рис. 25. Рестрикционный анализ ДНК трансформированных клеток НК293.

1 - негидролизованная ДНК клеток НК293 (СИР); 2 - негидролизованная ДНК клеток НК293 (]ЧЬ5-М-Ес01Ш-СРР); 3 - ДНК клеток НК293 (вРР), гидролиз ЕсоШ; 4 -ДНК клеток НК293 (СРР), гидролиз £«N1; 5 - ДНК клеток НК293 (ЫЬ8-М-£«ЖИ-вРР), гидролиз £С0Ш1; б-ДНК клеток НК293 (М^-МЕсоШЮРР), гидролиз ММ1

Соотношение включённой метки в гидролизатах ИраИ/Мэр! отражает относительное количество неметилированных ССвв сайтов. Результаты анализа указывают на отсутствие изменения общего уровня Срв-метилирования в ДНК клеток, экспресси-рующих МЕсоРП-СРР (табл. 7). Таким образом, трансген-индуцированное СС\\ЮО-метилирование генома клеток НК293 не оказывает заметного влияния на уровень его Срв-метилирования.

Таблица 7

Уровень метилирования CCGG сайтов в ДНК трансформированных клеток НК293

Линия клеток R Нра\\ концы (имп/мин/мкг) R-Mspl концы (имп/мин/мкг) RHpalVRMspl

M£coRII-GFP экспрессирующая 23491243 9752±994 0,241

GFP экспрессирующая 1834±195 7582±810 0,242

Нетрансформированные клетки 1957+213 8050±877 0,243

Состояние CpG-метилирования промоторов генов SERPIN В5 и АРС. Поскольку данные по тотальному метилированию в ДНК последовательностей CCGG прямо не отражают степень CpG-метилирования промоторных областей отдельных генов, был проведён анализ уровня метилирования CpG-последовательностей промоторов двух индивидуальных генов. Промотор гена SERPIN В5 характеризуется его полным CpG-метилированием в клетках НК293, тогда как промотор гена супрессора опухолей АРС (adenomatous polyposis coli) отличается отсутствием метилирования его CpG-динуклеотидов. [Futscher et al., 2002; Esteller et al., 2000]. Такая особенность состояния CpG-метилирования этих промоторов наблюдалась в контрольных клетках, экс-прессирующих только ген GFP, и сохранялась в клетках, экспрессирующих NLS-M'£coRII-GFP (рис. 26,27). Анализ метилирования промоторной области гена SERPIN В5 с помощью метода бисульфитного секвенирования показал, что во всех 10 секвенированных клонах рекомбинантная метилаза M£coRIl-GFP осуществляет полное CCWGG-метилирование этого промотора.

Рис. 26. Анализ метилирования промотора гена ЗЕЯРШ В5.

Красным показана степень метилирования СрО-сайтов в клетках, экспрессирующих только ген ОБР. Жёлтым показана степень метилирования СрО-сайтов в клетках, экспрессирующих ЫиЗ-М'£соШ1-СНР

9 10 11 .-s. 12 13 14 15 16 17 le 19

Рис. 27. Анализ метилирования промотора гена APC.

Красным показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирующих только ген GFP. Жёлтым показана степень метилирования CpG-сайтов в клетках, экспрессирующих NLS-MEcoRII-GFP

При этом, несмотря на присутствие метилированных сайтов CCWGG в этом промоторе, уровень его CpG-метилирования не изменялся (рис. 26). Таким образом, трансген-индуцированное CCWGG-метилирование промотора гена SERPIN В5 не влияет на его CpG-метилирование.

Результаты анализа промоторной области гена АРС показали, что во всех 10 секве-нированных клонах метилаза M /ict>Rll-GFP также осуществляет его полное CCWGG-метилирование. Появление метилированных сайтов CCWGG в этой промоторной области не индуцировало заметного метилирования практически всех CpG-сайтов (рис. 27).

Таким образом, CCWGG-метилирование ДНК не оказывает существенного эффекта как на индуцирование метилирования немодифицированных CpG-сайтов промо-торных областей индивидуальных генов, так и на блокирование их CpG-метилирования.

Анализ экспрессии CCWGG-метилированного гена АРС. Методом количественной RT-PCR определён уровень экспрессии генов АРС и hTERT. РНК выделяли из клеток экспрессирующих MEcoRII-GFP и клеток, экспрессирующих только GFP. Амплификацию проводили с использованием набора iScript RT-PCR с применением флуоресцентного красителя SYBR green (Bio-Rad, США). В каждом эксперименте для построения калибровочных кривых использовались пять точек разбавления РНК в диапазоне от 3,125 нг до 50 нг суммарной РНК. Уровень экспрессии гена hTERT использовали в качестве контроля, поскольку CpG-метилирование его промотора не приводит к обязательному замолканию гена [Devereuks et al., 1999; Dessain et al., 2000].

Уровень экспрессии генов АРС и hTERT в клетках с M£coRII-GFP оставался на том же уровне, что и в клетках, экспрессирующих только GFP. Таким образом, CCWGG-метилирование промоторов исследованных генов не влияло на уровень их экспрессии (рис. 28).

Проведённый анализ также показал отсутствие влияния CCWGG-метилирования на уровень экспрессии гена hTERT. По-видимому, CCWGG-метилирование не участвует в регуляции экспрессии исследованных генов.

Можно заключить, что интеграция в геном клеток НК293 модифицированной бактериальной метилтрансферазы M-ficoRII приводит к метилированию большинства CCWGG сайтов в их геноме. Однако, несмотря на значительное повышение уровня CCWGG-метилирования ДНК, оно не влияет как на общее метилирование CpG-последовательностей генома трансформированных клеток, так и на CpG-метилирование индивидуальных генов.

Следует отметить, что в наших экспериментах мы не наблюдали индуцированное CCWGG-метилированием возникновение и распространение волны метилирования на любые другие остатки цитозина в исследуемых последовательностях ДНК. Результаты нашей работы не подтверждают существование жёсткой обратной взаимосвязи между CpG- и CpNpG-типами метилирования ДНК и указывают на отсутствие влияния CpNpG-метилирования на генетическую экспрессию. Эти данные, однако, не противоречат ситуации, когда в специфических областях генома трансформированных клеток может сохраняться безальтернативный CpG-тип метилирования.

Рис. 28. Сравнение уровней экспрессии генов АРС и hTERT в клетках, экспрессирующих GFP или M EcoRII-GFP.

Показаны значения Ct (cycle threshold), соответствующие значениям разведения анализируемой РНК. А - данные для гена hTERT; В - данные для гена АРС; квадраты - данные для клеток, экспрессирующих M £coRII-GFP; ромбы - данные для клеток, экспрессирующих GFP. Полученные для каждого разведения данные указывают на отсутствие существенной разницы в уровне экспрессии генов АРС и hTERT в обоих клеточных линиях.

Этому соответствуют данные, полученные нами при биоинформационном анализе генома человека. Нами была проанализирована встречаемость СО, С\УО, ССХУвв и некоторых других последовательностей во всём геноме и в областях, фланкирующих 28501 индивидуальных генов (табл. 8).

Из случайной встречаемости, СО-динуклеотидов должно было бы быть значительно больше, чем С\УО-последовательностей, в то время как общее число последовательностей СО и С\\ЧЗ в геноме человека составляет соответственно 28163853 и 115802370. Это отражает уже известный многократный дефицит последовательностей Св в сравнении с СС-последовательностями в геномах высших животных.

Таблица 8

Отношение реального к теоретически рассчитанному количеству некоторых фланкирующих гены последовательностей в геноме человека

CG CWG CCWGG

всего в геноме 0,2356507 1,341659605 3,31372508

104 П.Н./5' 0,375492 1,346793 3,423061

350 п.н./5' 0,371113 1,358913 3,543773

300 п.н./5' 0,377446 1,347656 3,444138

250 П.Н./5' 0,385302 1,349094 3,483417

200 П.Н./5' 0,396256 1,360905 3,346418

200 п.н./З' 0,225111 1,343136 3,124633

250 п.н./З' 0,228525 1,337590 3,091102

300 п.н./З' 0,230770 1,349032 3,197923

350 п.н./З' 0,234954 1,352709 3,128944

104 п.н./З' 0,227323 1,348970 3,28223

Эта величина для промоторной области больше, чем для З'-области, что соответствует сблоченности этой последовательности в CpG-островках [Bird et al., 1986]. В то же время, частота встречаемости последовательности CCWGG более чем в три раза выше расчётной величины и значительно выше величины для последовательности CWG. Эта выявленная особенность, по-видимому, отражает различную структурно-функциональную роль последовательностей CWG и CCWGG в геноме человека. Эффект CCWGG-метилироеания на активность ДНК-метитрансферазы DNMT1. Проведено сравнение активности DNMT1 на субстратах, не содержащих 5-метилцитозин, содержащих метилированный сайт CCWGG, содержащих метилированный сайт CG и одновременно содержащих метилированные сайты CCWGG и CG (рис. 29). Этот анализ подтвердил, что метилтрансфераза DNMT1 наиболее эффек-

тивна на асимметрично метилированных последовательностях СрО. При этом скорость метилирования асимметрично метилированных сайтов Срв существенно не изменялась в случае присутствия близкорасположенных метилированных сайтов СС\\ЧЗО (рис. 29).

б. Применение ДНК-метилтрансфераз в нанобиотехнологии

В настоящее время нанобиотехнология — одно из наиболее активно развивающихся и перспективных направлений биологических наук. Целью нанобиотехнологии является создание новых материалов и надмолекулярных конструкций с использованием биологических макромолекул, в первую очередь белков и нуклеиновых кислот.

субстрат (Ц.М)

Рис. 29. Эффективность включения СН3-групп в олигодезоксинуклеотидные субстраты с различным метилированием.

1-5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3'

3'-ассССсасдасдС6ТССас±сддЪдвСдасдаадасдддЪсЪдЪ-5'

2-5'-tggCGgtgctgcCCAGGtgagccacCGctgcttctgcccagaca-3' 31-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5'

ш т

3 - 5' ^ддССдЪдсЪдсССАССЪдадссасСОсЪдсЪЪсЪдсссадаса-З ' 3'-accGCcacgacgGGTCCactcggtgGCgacgaagacgggtctgt-5'

4-5' -tggCGgtgctgcCCAGGtgagcc:acCGctgcttctgcccagaoa-3' 3' -ассвСсасдасдССТССас1:сддЬдССдасдаадасддд1;сЛд1;-5' т

В нанобиотехнологии можно использовать способность белков к связыванию со специфическими последовательностями ДНК. В этой связи перспективным объектом являются сайт-специфические (цитозин-С5)ДНК-метилтрансферазы. Одним из возможных практических применений нанобиотехнологий является создание противораковых препаратов. Развитие онкологических заболеваний сопровождается гиперметилированием специфических последовательностей ДНК, в том числе и генов-супрессоров опухолей. Ингибирование ДНК-метилтрансферазной активности может блокировать опухолевую прогрессию, что поднимает вопросы разработки ингибиторов ДНК-метилтрансфераз для их клинического применения.

Первые применяемые ингибиторы ДНК-метилтрансфераз представляли собой производные 5-азацитидина, которые ковалентно и необратимо связывались с цистеино-вым остатком в активном центре фермента, тем самым блокируя его активность. Однако, включаясь в молекулы вновь синтезированной ДНК клетки и необратимо связываясь с молекулами цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, 5-азацитидин способен инициировать нарушение нормальных процессов репликации и транскрипции и вызывать формирование аномальной структуры хроматина. Случайное включение 5-азацитидина в ДНК способно вызвать её неспецифическое деметилирование, что может инициировать экспрессию онкогенов.

Для снижения неспецифического токсического воздействия 5-азацитидина на клетку нами были разработаны и проверены новые методы подбора ингибирующих структурных аналогов цитидина. Таким менее токсичным производным оказался 5-фтордезоксицитидин.

Двуцепочечные олигонуклеотиды с 5-азацитидином в их составе относятся ко второму поколению ингибиторов цитозиновых ДНК-метилтрансфераз, не включающихся в ДНК.

Проведены эксперименты по оценке эффективности связывания модельной ДНК-метилазы НИа\ с ингибиторами ДНК-метилтрансфераз второго поколения. Для этого были синтезированы комплементарные олигонуклеотиды длиной 30 оснований: 5'-ТСАССАОАТС(5РС)СТСТАООТССТСТС(5РС)ССТССТТССАССАОАС(5РС)ССТТ САССТСТАСТТ-З' и 5'-ААСТАСАСОТСАСАО(5тС)ССТСТСОТССААССАС(т5С) ССАСАСОАССТАСАО(ш5С)ССАТСТССТОА-3'. Олигонуклеотиды включали три асимметрично метилированных по одной цепи сайта узнавания СвСв для ДНК-метилазы НИЛ, причём в другой цепи метилируемый внутренний цитидин был заменен на 5-фтордезоксицитидин. Такие каталитические «капканы» предназначались для связывания метилазы DNMT1, которая имеет повышенное сродство к асимметрично метилированной ДНК в сайтах Срв.

Анализ продуктов связывания с помощью капиллярного электрофореза и электрофореза в полиакриламидном геле выявил образование всех теоретически ожидаемых комплексов: свободного олигонуклеотида и олигонуклеотида с одной присоединенной молекулой НИа1, с двумя и с тремя молекулами НИсЛ (рис. 30).

а ш и а га 2

о и си ч с >. ч

и *

0) ч

с >>

о §

и и 0) ч

с >>

10380 Ьр-»" 7000 Ьр — 5000 Ьр — 3000 Ьр — 2000 Ьр — 1500Ьр^" 1000 Ьр —

25 35 45 55 65 75 85 время (с)

Рис. 30 Анализ продуктов связывания ДНК-метилтрансферазы Н1м1 с 30-членным дуплексным олигонуклеотидом-ингибитором: 5' -tcaccagatg5Fcctgtaggtcgtgtg5Fcgctggttccaccagag5гcgcttgacctgtagtt-3' 3' -agtggtctacg'пcgacatccagcacacg™cgaccaaggtggtctcgщcgacactggacatcaa-51

А - результаты анализа продуктов связывания, полученные капиллярным электрофорезом В - результаты анализа продуктов связывания, полученные электрофорезом в полиакриламиде

Создание ингибиторов ДНК-метилтрансфераз третьего поколения. Вероятность встречи ДНК-метилазы с ингибирующим линейным олигонуклеотидным дуплексом (второе поколение ингибиторов) можно увеличить только повышением концентрации самого ингибитора. Негативным фактором остаётся также равномерное распределение ингибитора по объёму всей клетки вместо его локализации в клеточном ядре.

Ингибиторы третьего поколения, представляют собой сложные олигонуклеотидные структуры или олигонуклеотид-белковые комплексы (рис. 31).

Сконструированные ингибиторы имитировали форму репликативной вилки (У-структуру), к которой ДНК-метилтрансфераза БИМИ имеет повышенное сродство. В процессе проектирования ингибиторов третьего поколения применялось трёхмерное молекулярное моделирование (рис. 32).

Сборку этой структуры проводили путём последовательного отжига всех трёх частично комплиментарных олигонуклеотидов.

отдельные олигонуклеотид

отдельные олигонуклеотмды

У-структура

моно-замещенная У-струюура

ди-замешениая У-струкгура

гри-замещенная У-структура

Рис. 31. Схема сборки олигонуклеотидного ингибитора и его связывание с ДНК-метилтрансферазой Нка\.

Рис. 32. Компьютерная модель связывания олигонуклеотидного ингибитора с ДНК-метилтрансферазой Нка\.

При связывании модельной ДНК-метилтрансферазы НЬа\ с У-структурой наблюдалось формирование всех трёх возможных форм, соответствующих комплексам с одной, двумя или тремя молекулами фермента (рис. 33). Степень насыщения всех трёх сайтов связывания была пропорциональна повышению концентрации ДНК-метилтрансферазы Н1га\ и обратно пропорциональна концентрации самого ингибитора (рис. 34).

л ч а н о о

2 ч

3 *

л в

4 Р

« Ь

ч в

Р ч

о о

л а.

Й а

О. н

я « о. а

и а

>> >->

о. а

н н

-10380 пн

50 пн

85 [секунды!

Рис. 33. Сборка и связывание ДНК-метилтрансферазы Н1ш1 с олигонуклеотидной У-структурой (анализ капиллярным электрофорезом)

10380ПН-

50 пн-

иУ

-(УУГ

1.5 цМ 0.73 цМ 0.37 цМ У-структура У-структура У-структура

Рис. 34. Кинетика связывания Н1га\ ингибитором третьего поколения

Проведены эксперименты по оценке специфичности связывания ДНК-метилтрансфераз с полученными ингибиторами. Для этого была собрана У-структура, содержащая различные сайты узнавания: два сайта для М #/ш1 и один сайт для М£«Ж11. Обе ДНК-метилтрансферазы связывались специфично и с высокой избирательностью. В отдельном эксперименте была показана способность ингибитора специфично связывать метилазу M-ficoR.II из частично очищенного бесклеточного экстракта, то есть в условиях, имитирующих работу ингибитора в клетке. Комплекс М-Ест^Н с ингибитором выявлялся в виде единичной полосы с молекулярной массой несколько большей, чем продукт связывания с одной молекулой М-Я/га1, что соответствует разнице в молекулярной массе этих ферментов: 57,5 Ша для М£«ЖП и 39,5 кйа для М-Я/иТ.

В реакции с метилазой НЬа\ наблюдалось образование комплексов ингибитора с одной и двумя молекулами метилазы Н1га\. В реакции одновременно с двумя ДНК-метилтрансферазами М ННа\ и М-Ес(ЛШ наблюдалось формирование всех трёх возможных комплексов, что указывает на высокую специфичность ингибитора (рис. 35).

Для повышения стабильности У-структуры к ней была ковалентно присоединена по сайту узнавания ДНК-метилтрансфераза М£соШ1. В полученной конструкции ДНК-метилтрансфераза М ЕсеЖП содержала сигнал ядерной локализации для направленного переноса этого надмолекулярного комплекса в клеточное ядро.

10380пн-

о <4

+ +

вг

2 о § ¿3 2 ?

й О. л п. л а ей О, &

^ 2

Сц о. р. о.

о о н о

£ £

РШ щщ | 3 |

-ь- У

25 35 45 55 65 75 [секунды]

Рис. 35. Сборка и связывание ДНК-метилтрансфераз Н1шI и ЕсоШI с олигонуклеотидной У-структурой (анализ капиллярным электрофорезом)

выводы

1. Разработан энзиматический метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательности ССХУвО эукариотических ДНК (Ср^трО-тип метилирования) с помощью ДНК-метилтрансфераз £соМ1 и ВягМ.

2. Получена рекомбинантная агробактериальная Тьплазмида дикого типа с интегрированным в область Т-ДНК неэкспрессируемым геном ДНК-метилтрансферазы ЕсоШ\ (М-£со1Ш). Этой плазмидой осуществлена генетическая трансформация клеток Шсойапа IаЬасит. Ген МЕсуЯШ индуцировал у первичной трансформированной клеточной линии образование новых морфологических и биохимических фенотипов. Установлен пониженный уровень СС\УСС-метилирования ДНК этих клеток, что может быть связано с инактивацией одного из генов ДНК-метилтрансфераз.

3. Для трансген-индуцированного СС\\^30-метилирования ДНК в клетках эукариот получены модифицированные формы экспрессируемого гена М-£соЯН, кодирующие этот фермент, слитый с сигналом ядерной локализации (N1^5- М-£со1Ш) и зеленым флуоресцентным белком (N1^5-М-ЕсоМЮРР).

4. Экспрессия гена Г^ЬБ-М-ЕсоКН в клетках растений Шсойапа шЬасит приводит к изменениям морфологического фенотипа трансформированных растений и к дополнительному СС\УСС-метилированию их ДНК.

5. В условиях засоления, при переключении СЗ- на С4-фотосинтез, наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательности СС\\^СО в ДНК растений МезетЬгуапЛетит сгушШпит. К СС\\ЧЗС-гипер-метилированным мишеням генома растений относится фракция повторяющейся ДНК, что может указывать на специфическую функциональную роль СС\\ЧЗО-метилирования этой ДНК в образовании специализированной структуры хроматина при адаптации растения к солевому стрессу и переключении на САМ-метаболизм.

6. Проведён анализ статуса метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG 5'-концевой области гена кальцитонина человека в клетках периферической крови и костного мозга при различных видах лейкозов. Эти последовательности сохраняются неметилированными как в норме, так и при лейкозах, сопровождающихся их CpG-гиперметилированием. Таким образом, гиперметилирование динуклеоти-дов CpG в промоторной области гена кальцитонина человека не распространяется на близлежащий блок последовательностей CCWGG. Сформулировано положение о существовании особого безальтернативного CpG-метилирования генома эукариот.

7. Осуществлена и исследована экспрессия ДНК-метилтрансферазы £ct>RII в модифицированной форме NLS-M-£coRII-GFP в клетках культуры эпителиального слоя почек человека. Трансген-индуцированное CCWGG-метилирование ДНК этих клеток не влияет на CpG-метилирование их генома. CCWGG-метилирование промотора гена АРС не влияет на его экспрессию в трансформированных клетках. Установлено отсутствие эффекта CCWGG-метилирования олигодезоксинуклеотидных субстратов на активность ДНК-метилтрансферазы DNMT1 in vitro. Выявлены особенности частоты встречаемости сайтов CWG и CCWGG в геноме человека, указывающие на их возможную различную структурно-функциональную роль.

8. Для применения в нанобиотехнологии и для ингибирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз in vivo сконструированы и исследованы олигоде-зоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы на основе модифицированных производных цитозина и ДНК-метилтрансферазы £coRII.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Обзоры:

1. Buryanov Ya.I., Shevchuk Т. The use of prokaryotic DNA methyltransferases as experimental and analytical tools in modem biology // Analitical Biochemistry, 2004, V.338, P.l-11.

2. Clark J., Shevchuk Т., Swiderski P.M., Dabur R„ Crocitto L.E., Buryanov Ya.I., Smith S.S. Construction of ordered protein arrays // Methods in Molecular Biology, 2004, V. 300, P.325-348.

3. Бурьянов Я.И., Шевчук T.B. ДНК-метилтрансферазы и структурно-функциональная специфичность модификации эукариотических ДНК // Биохимия, 2005, Т. 70, № 7, С. 885-899.

Статьи:

4. Buryanov Ya.I., Shevchuk T.V., Belokopitov B.F. DNA resistance to specific restriction endonucleases as a genetic marker in microbial release experiments // Molecular Ecology, 1994,V.3,№6,P.606.

5. Buryanov Ya.I., Zacharchenko N.S., Shevchuk T.V., Bogdarina I.G. Effect of the M'EcoRII methyltransferase-encoding gene on the phenotype of Nicotiana tabaccum transgenic cells // Gene, 1995,V. 157, P.283-287

6. Маринич Д.В., Воробьев И.А., Смольникова B.B., Холмс Дж„ Бабан Д., Шевчук Т.В., Бурьянов Я.И., Мирошников А.И. Гиперметилирование гена кальцитонина человека при лейкозах миелоидного происхождения // Гематология и трансфузиология, 1999,№4,С.7-10.

7. Бурьянов Я.И., Шевчук Т.В. Использование ДНК-метилтрансфераз для определения уровня метилирования цитозина в последовательности ДНК CCWGG // Биоорганическая Химия, 1999,Т.25,№8,С.630-633.

8. Бурьянов Я.И., Шевчук Т.В., Захарченко Н.С., Дьяченко О.В., Маринич Д.В., Воробьёв И.А. Отсутствие CNG-типа метилирования в 5'-концевой области гена кальцитонина человека в норме и при лейкозах // Биоорганическая химия, 2000,Т.26,№5,С.397-399.

9. Шевчук Т.В., Захарченко Н.С., Дьяченко О.В., Бурьянов Я.И. Влияние гена ДНК-метилтрансферазы EcoRII на фенотип трансгенных опухолевых линий Nicotiana tabacum и уровень метилирования последовательностей CpNpG в их геноме Н Физиология Растений,2001,Т.48,№4,С.478-482

Ю.Маринич Д.В., Усс A.JI., Смирнова Л.А., Воробьев И.А., Холмс Дж., Су-лимова Г.Е., Шевчук Т.В., Бурьянов Я.И. Гиперметилирование гена кальцитонина человека как молекулярный маркер острой лимфоидной лейкемии // Вопросы медицинской химии, 2001,Т.47,№5,С.537-546.

11.Clark J., Shevchuk Т., Kho M.R., Smith S.S. Methods for the designs and analysis of oligodeoxynucleotide-based DNA (cytosine-5)methyltransferase inhibitors // Analitical Biochemistry,2003, V.321.P.50-64.

12.Clark J., Shevchuk Т., Swiderski P.M., Dabur R., Crocitto L.E., Buryanov Ya.I., Smith S.S. Mobility-shift analysis with microfluidics chips // BioTech-niques,2003,V.35,P.548-554

13.Маринич Д.В., Воробьев И.А., Холмс Дж., Захарченко Н.С., Дьяченко О.В., Бурьянов Я.И., Шевчук Т.В. Гиперметилирование 5'-области гена кальцитонина человека при лейкозах: структурные особенности и диагностическая значимость // 2004,Т.69,№3,С.420-431

14. Shevchuk Т., Kretzner L„ Munson К., Axume J., Clark J., Dyachenko O., Caudill M., Buryanov Ya., Smith S. Trangene-induced CCWGG methylation does not alter CG methylation pattering in human kidney cells // Nucleic Acids Research,2005,V.33,No. 19,P.6124-6136

15.Дьяченко O.B., Захарченко H.C., Шевчук T.B., Бонерт X., Кушман Дж., Бурьянов Я.И. Гиперметилирование CCWGG последовательностей в ДНК растений Mesembryanthemum crystallinum при их адаптации к солевому стрессу // Биохимия,2006,Т.7 \,№4,С.570-575

16.Watson В., Munson К., Clark J., Shevchuk Т., Smith S.S. Distribution of CWG and CCWGG in the Human Genome II Epigenetics, 2007,V.2,P. 151-154

Для заметок

Заказ №44/10/08 Подписано в печать 06.10.2008 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 3

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шевчук, Тарас Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Распределение 5-метилцитозина в различных нуклеотидных последовательностях и областях генома высших эукариот.

1.1. Метилируемые последовательности эукариотических ДНК.

1.2. Срв-островки и их свойства.

2. Структурно-функциональные свойства цитозин(С5)-ДНК-метилтрансфераз.

2.1. Функциональная топография первичной структуры прокариотических цитозин(С5)-ДНК-метилтрансфераз.

2.2. Эукариотические ДНК-метилазы.

2.2.1. ДНК-метилтрансферазы млекопитающих.

2.2.2. ДНК-метилтрансферазы растений.

3. Тотальное метилирование цитозина в эукариотических ДНК и РНК-интерференция.

4. Процессы тотального метилирования последовательностей

ДНК грибов.

5. Регуляция экспрессии и модуляции активности ДНК-метилтрансфераз.

6. Функциональная роль специфических типов метилирования

ДНК эукариот.

6.1. Первичная функция метилирования ДНК — защита от внутригеномных паразитов.

6.2. Срв-тип метилирования ДНК.

6.2.1. Метилирование и транскрипция генов. Белки, связывающиеся с метилированной ДНК.

6.2.2. Метилирование ДНК, структура хроматина и деацетилирование гистонов.

6.2.3. Деметилирование ДНК.

6.2.4. Метилирование ДНК и геномный импринтинг.

6.2.5. Роль метилирования ДНК в развитии растений.

6.2.6. Метилирование ДНК и канцерогенез.

6.2.6.1. Гипометилирование ДНК.

6.2.6.2. Увеличение ДНК-метилтрансферазной активности в опухолевых клетах.

6.2.6.3. Локальное гиперметилирование генома.

6.3. Несимметричный тип метилирования ДНК.

6.3.1. Метилирование ДНК и ее репликация.

6.3.2. Метилирование ДНК и выключение генетической экспрессии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональное исследование сайт-специфического метилирования ДНК эукариот"

Актуальность проблемы. Несмотря на изучение явления энзиматического метилирования ДНК эукариот в течение шестидесяти лет, мы еще далеки от полного понимания функциональной роли этой модификации генома. В клетках эукариотических организмов метилирование ДНК участвует в регуляции генетической экспрессии, клеточной дифференцировки и морфогенеза, эпигенетическом контроле геномного импринтинга и инактивации мобильных генетических элементов. Эти функции установлены как у млекопитающих, так и у высших растений. Нарушение нормальной картины метилирования ДНК сопровождает канцерогенез и генетические заболевания человека. В настоящее время установлено, что большинство своих функций метилирование ДНК осуществляет в качестве интегральной части механизма модификации и ремоделирования структуры хроматина. В этом процессе участвуют многочисленные белки, осуществляющие различные ковалентные модификации гистонов, а также короткие некодирующие РНК. Согласно современным взглядам, метилирование ДНК служит эпигенетической меткой, позволяющей регуляторным факторам транскрипции отличать метилированные последовательности генома от гомологичных, но не метилированных последовательностей. Существенные успехи в исследовании метилирования ДНК получены после открытия белков, связывающихся с метилированной ДНК. В настоящее время особое внимание уделено белкам, связывающимся с метилированными Срв-последовательностями ДНК и мобилизующими в эти участки гистоновые деацетилазы и другие гистон-модифицирующие белки, формирующие транскрипционно неактивную структуру хроматина. Картина сложноразветвленной сети многочисленных взаимосвязанных реакций модификации и ремоделирования структуры хроматина только устанавливается, в том числе устанавливается специфичность функций индивидуальных ДНК-метилтрансфераз эукариотической клетки. В структурно-функциональном исследовании энзиматического метилирования эукариотических ДНК существует значительный пробел, связанный с изучением только Срв-типа этой модификации. Однако у эукариот обнаружен второй симметричный тип метилирования ДНК СрКрв (К — любой нуклеозид) и несимметричный тип метилирования Ср1Ч. Растущее внимание к картине метилирования эукариотического генома, на фоне которой развиваются нормальные и нарушенные процессы жизнедеятельности, ставит вопрос о раздельном анализе каждого из этих типов метилирования ДНК. Исследование различных типов сайт-специфического метилирования ДНК имеет фундаментальное значение для понимания функциональной роли этой модификации эукариотического генома.

Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение Срв- и СрИрО-типов метилирования ДНК высших эукариот в условиях изменения метаболизма и клеточной дифференцировки и при трансген-индуцированном метилировании генома, а также разработка новых методических приемов анализа метилирования ДНК и применения ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях. В число основных экспериментальных задач входили:

- разработка метода определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях СС\УвО (Ср^О-тип) генома;

- исследование эффекта трансген-индуцированного СС\УОО-метилирования ДНК клеток растений ШсоНапа 1аЪасит\

- анализ метилирования генома растений МезетЬгуапЖетит сгузгаШпит в условиях солевого стресса и переключения метаболизма на С4-путь фотосинтеза;

- анализ метилирования 5'-концевой области гена кальцитонина человека в норме и при лейкозах;

- исследование эффекта трансген-индуцированного СС\\^00-метилирования ДНК клеток НК293 культуры эпителиального слоя почек человека;

- разработка приемов применения цитозиновых ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях. Научная новизна. На основе особенностей каталитической активности ДНК-метилтрансфераз Лл/М и £соК11 разработан метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях СС\УОО. Впервые осуществлен перенос в клетки растений гена гетерологичной ДНК-метилтрансферазы ЕсоШ\ (М\£со1Ш) в составе Т-ДНК агробактериальной Тьплазмиды дикого типа и в модифицированной форме №.8-М'£с01Ш в составе обезоруженной Т-ДНК. Обнаружено, что неэкспрессируемый ген М-2?соШ1 индуцирует у первичной трансформированной клеточной ткани Ж tabacum образование новых морфологических и биохимических фенотипов. Установлен пониженный уровень метилирования внутреннего цитозина в последовательностях СС\¥ОС в ДНК клеток этих фенотипов. Показано, что экспрессия гена НЬБ-МчЕсоКЛ индуцирует новый морфологический фенотип целого растения и вызывает в его геноме дополнительное метилирование последовательностей ССХУвО. Установлено, что в условиях засоления, при переключении Сз-фотосинтеза на С4-путь фотосинтеза, наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательностей СС\УОО в ДНК растений М. crystallinum, связанное с гиперметилированием фракции повторяющейся ДНК. Полученные данные могут свидетельствовать о новой специфической функциональной роли СрМрО-метилирования повторяющейся ДНК в образовании специализированной структуры хроматина в клетках М. сгу^МаШпит при их адаптации к солевому стрессу и переключении на С4-путь фотосинтеза.

Обнаружено, что при лейкозах гиперметилирование цитозина в последовательностях Срв в 5'-концевой области гена кальцитонина человека не распространяется на близлежащие последовательности СрЫрО. Сформулировано положение о безальтернативном характере Срв-метилирования специфических областей генома высших эукариот. Впервые осуществлен перенос в клетки НК293 культуры эпителиального слоя почек человека гена ДНК-метилтрансферазы £coRII в модифицированной форме NLS-M\£coRII-GFP. Установлено, что трансген-индуцированное CCWGG-метилирование ДНК клеток НК293 не влияет на CpG-метилирование их генома. Показано отсутствие влияния CCWGG-метилирования промотора гена АРС на его экспрессию в клетках НК293. Установлено отсутствие эффекта CCWGG-метилирования олигодезоксинуклеотидных субстратов на активность ДНК-метилтрансферазы DNMT1 in vitro.

Установлены особенности в распределении и частотах встречаемости сайтов CWG и CCWGG в геноме человека, указывающие на возможную различную функцию их метилирования.

Для ингибирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз в клетке и применения в нанобиотехнологии сконструированы и исследованы олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы на основе модифицированных производных цитозина и ДНК-метилтрансферазы

Получены генетические конструкции для трансформации клеток растений и млекопитающих и экспрессии модифицированных форм гена ДНК-метилтрансферазы £coRII: NLS-M£coRII и NLS-M£coRII-GFP. Перенос в клетки растений гетерологичных генов цитозиновых ДНК-метилтрансфераз можно использовать для получения эпигенетического разнообразия клеточных культур растений, а полученные клетки и ткани использовать в качестве новых удобных объектов для исследования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК. Клетки млекопитающих, экспрессирующие гетерологичные гены цитозиновых ДНКметилтрансфераз могут использоваться как удобные модели для изучения особенностей эпигенетических модификаций ДНК.

Сконструированные на основе модифицированных производных цитозина и ДНК-метилтрансферазы EcoRll олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы имеют перспективы использования в медицине для восстановления нормальной картины метилирования ДНК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из ведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 232 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка и 11 таблиц. Библиография включает 454 источника.

Апробация результатов работы. Результаты данной работы были представлены на 4th New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, (Австрия, 1997); Annual Oncologycal Congress of American Urologic Association, (США, 2002); Scholarship of Anticancer Drug Design, (США, 2003); FEBS-CNRS Workshop on DNA and RNA modification enzymes: Comparative Strucure, Mechanism, Function and Evolution, (Франция, 2007); 12th Congress of the European Hematology Association, (Австрия, 2007); VI Съезде Гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь (Минск, 2007); III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); VI Съезде Общества Физиологов растений России (Сыктывкар, 2007); Международном симпозиуме по физико-химической биологии (Москва, 2004); IV съезде Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, (Пущино, 2006); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); IV, V и IX Пущинской конференции молодых ученых, (Пущино, 1999, 2001, 2005); III, IV и VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пугцино, 1997, 1998, 2006); Отчетных конференциях Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Пущино, 1999, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ. Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все основные эксперименты, проведенные в работе, выполнены лично автором, а также руководимыми им сотрудниками и студентами. В работах, выполненных в соавторстве с сотрудниками ФИБХ РАН, сотрудниками других институтов РАН и с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, прямом участии в проведении экспериментов и получении результатов, их обсуждении и оформлении в виде публикаций. Благодарности. Благодарю всех своих коллег и друзей из лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН, всех российских и зарубежных коллег за плодотворное сотрудничество. Выражаю особую признательность профессору Я.И. Бурьянову, в лаборатории которого были выполнены приоритетные исследования, положенные в основу настоящей работы, и профессору Стивену Смиту («City of Норе» National Medical Center, США) за возможность развития этой работы в его лаборатории.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шевчук, Тарас Валерьевич

выводы

1. Разработан энзнматическнй метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательности СС\УОО эукариотических ДНК (СрЫрС-тип метилирования) с помощью ДНК-метилтрансфераз ЯсоЯП и £.^N1.

2. Получена рекомбинантная агробактериальная Тьплазмида дикого типа с интегрированным в область Т-ДНК неэкспрессируемым геном ДНК-метилтрансферазы £соМ1 (М-£соЯП). Этой плазмидой осуществлена генетическая трансформация клеток Шсойапа tabacum. Ген индуцировал у первичной трансформированной клеточной линии образование новых морфологических и биохимических фенотипов. Установлен пониженный уровень ССАУОО-метилирования ДНК этих клеток, что может быть связано с инактивацией одного из генов ДНК-метилтрансфераз.

3. Для трансген-индуцированного СС\УОО-метилирования ДНК в клетках эукариот получены модифицированные формы экспрессируемого гена М'-ЁсоШТ, кодирующие этот фермент, слитный с сигналом ядерной локализации (N1,8- M-iicoR.II) и зеленым флуоресцентным белком (N1,8-М-Ясо1Ш-ОРР).

4. Экспрессия гена NLS-M•£,coRII в клетках растений Шсойапа гаЬасит приводит к изменениям морфологического фенотипа трансформированных растений и к дополнительному ССХУСв-метилированию их ДНК.

5. В условиях засоления, при переключении СЗ- на С4-фотосинтез, наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательности СС^'ОО в ДНК растений МеяетЬгуаШкетит сгуБгаШпит. К СС\УОО-гипер-метилированным мишеням генома растений относится фракция повторяющейся ДНК, что может указывать на специфическую функциональную роль ССАУвО-метилирования этой

ДНК в образовании специализированной структуры хроматина при адаптации растения к солевому стрессу и переключении на САМ-метаболизм.

6. Проведен анализ статуса метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG 5'-концевой области гена кальцитонина человека в клетках периферической крови и костного мозга при различных видах лейкозов. Эти последовательности сохраняются неметилированными как в норме, так и при лейкозах, сопровождающихся их CpG-гиперметилированием. Таким образом, гиперметилирование динуклеотидов CpG в промоторной области гена кальцитонина человека не распространяется на близлежащий блок последовательностей CCWGG. Сформулировано положение о существовании особого безальтернативного CpG-метилирования генома эукариот.

7. Осуществлена и исследована экспрессия ДНК-метилтрансферазы £coRII в модифицированной форме NLS-M-iscoRII-GFP в клетках культуры эпителиального слоя почек человека. Трансген-индуцированное CCWGG-метилирование ДНК этих клеток не влияет на CpG-метилирование их генома. CCWGG-метилирование промотора гена АРС не влияет на его экспрессию в трансформированных клетках. Установлено отсутствие эффекта CCWGG-метилирования олигодезоксинуклеотидных субстратов на активность ДНК-метилтрансферазы DNMT1 in vitro. Выявлены особенности частоты встречаемости сайтов CWG и CCWGG в геноме человека, указывающие на их возможную различную структурно-функциональную роль.

8. Для применения в нанобиотехнологии и для ингибирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз in vivo сконструированы и исследованы олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы на основе модифицированных производных цитозина и ДНК-метилтрансферазы EcoRll.

Заключение

Исследования последнего времени показали, что у большинства эукариотических организмов геномное метилирование осуществляют множественные ДНК-метилазы, специфически участвующие в различных генетических процессах, при этом иногда даже без проявления своей каталитической метилтрансферазной функции. Даже в клетках низших эукариот с одной ДНК-метилазой этот фермент способен выполнять множественные функции и модифицировать цитозин в различных специфических последовательностях ДНК за счет еще недостаточно изученных модулирующих факторов.

Особый тип контролирования картины метилирования ДНК может осуществляться на уровне ДНК-белковых взаимодействий. Так, фактор транскрипции Spl часто ассоциирован с неметилированными CpG-островками в промоторах «хаус-киппинг»-генов, запрещая de novo метилирование CpG-островков и поддерживая конститутивную экспрессию этих генов [Holler et al., 1994]. Делеция промоторной области гена aprt с GC-боксами или мутагенез в них Spl-узнаваемых последовательностей с CpG-сайтами приводили к метилированию de novo CpG-островка этого гена [MacLeod et al., 1994].

В то же время белки, связывающиеся с метилированной ДНК, могут сохранять ее метилированное состояние. В этой связи следует отметить существование особого класса ДНК(т5СрО) -связывающихся белков [Tatematsu et al., 2000]. Не исключено, что такими белками может определяться существование жесткой обратной связи между CpG- и CpNpG-типами метилирования специфических генетических областей и безальтернативным CpG-типом их гиперметилирования при некоторых формах рака [Маринич и др., 2004]. Возможно, экранирование одной из цепей ДНК специфическими белками вместе с модуляцией активности ДНК-метилаз приводит к дифференциальному массивному метилированию цитозина в одной из цепей ДНК центромерных областей хромосом проростков растений [Luo and Preuss 2003].

В клетке ДНК-метилазы модифицируют ДНК в структуре сложноустроенного хроматина. На уровне хроматина окончательно реализуются взаимосвязи между метилированием генома, многочисленными эпигенетическими модификациями белков хроматина и регуляторными функциями различных некодирующих малых РНК. В современные исследования регуляции генетической экспрессии в процессе роста и развития эукариот прочно вошло понятие эпигенома. Эпигеном объединяет в себе такие структуры как ДНК, гистоны, другие ассоциированные белки и молекулярные процессы ковалентной модификации ДНК и белков. В настоящее время актуально выяснение причинно-следственной последовательности процессов сайт-специфического метилирования ДНК и энзиматических модификаций ядерных белков в установлении специфических структур хроматина. Показано, что CpG-метилирование выполняет функцию центрального координатора эпигенетической памяти у растений [Mathieu et al., 2007].

Важен также вопрос о статусе различных сайт-специфических типов метилирования в целой картине метилирования генома в норме и патологии. Получение этой информации важно как для диагностики и прогнозирования заболеваний, связанных с аномальным метилированием ДНК, так и для их терапии. В этой связи остро стоит задача разработки методов мониторинга отдельных структурно-функциональных типов метилирования тотального генома и субгеномных фракций, а также поиска маркерных аномально метилируемых последовательностей ДНК. На этом пути уже достигнуты значительные успехи в получении геномной картины аномального метилирования CpG-островков [Costello et al, 2000], намечены некоторые подходы к анализу метилирования CpNpG-последовательностей в тотальном геноме и субгеномных фракциях [Бурьянов и Шевчук, 1999], а также найдены маркеры аномального метилирования ДНК для некоторых форм канцерогенеза [Esteller et al., 2001]. Дальнейшие исследования структурно-функциональной картины метилирования эукариотического генома и путей его регуляции должно внести существенный вклад в понимания фундаментальных основ эпигенетических процессов.

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Материалы и оборудование 1.1. Оборудование

В работе использовалось следующее оборудование: центрифуга настольная Eppendorf 5415С (США), ультрацентрифуга Beckman L3-50, центрифуга Beckman J2-21, термомиксер Eppendorf 5436 (США), УФ-трансиллюминатор LKB 2011 Macrovue (Швеция), прибор для горизонтального электрофореза Pharmacia GNA-100 (Швеция), источники питания LKB 2197 и 2301 (Швеция), сцинтилляционный счетчик радиоактивности Beckman LS 6800 (США), счетчик радиоактивности (настольный) Minimonitor tml25 (Victoreen, США), термостат LP 141 (Венгрия), аппарат для электроблоттинга Mini Trans Blot (Bio-Rad, США), микробиологические качалки New Brunswik, центрифуга Tehtnica PLC-322 (Югославия), ПЦР-амплификатор Perkin Elmer GeneAmpPCR system 2400 (США), сортировщик клеток MoFlo MLS (Daco Cytomation, США).

1.2. Реактивы, среды и ферменты

Использовали следующие реактивы отечественного производства (квалификация «х.ч.» или «о.с.ч.»): хлорид натрия, ацетат натрия, нитрат аммония, нитрат калия, хлорид кальция, сульфат магния, гидрофосфат калия, сульфат марганца, сульфат цинка, сульфат меди, сульфат железа, хлорид кобальта, натрий молибденовокислый, гидроксид натрия, бромид калия, тиосульфат натрия, сульфит натрия, карбонат натрия, борную кислоту, этиловый спирт, изопропиловый спирт, медицинский хлороформ, фенол, 8-оксихинолин, мезо-инозитол, сахароза, муравьиная кислота, уксусная кислота, ацетон, фотофиксаж БКФ-2, хлорамин Б, азотнокислое серебро, аргинин.

В работе использовали следующие импортные реактивы: ацетат натрия (Fluka, Швейцария), агароза (Bio-Rad, США), бромфеноловый синий (Sigma, США), фенантренхинон (Sigma, США), саркозил (N-lauroylsarcosine) (Sigma, США), бакто-агар (Difco, США), бакто-триптон (Difco, США), дрожжевой экстракт (Difco, США), акриламид, бис-акриламид, персульфат аммония и 1Ч,]Ч,]^,]\[-тетраметилэтилендиамин (Serva, Германия), додецилсульфат Na, трис (оксиметиламинометан), EDTA, ксиленцианол, БСА, лизоцим, ацетосирингон, нопалин (Sigma, США), атропин (Sigma, США), кетоглутаровая кислота, меркаптоэтанол, бромистый этидий, Whatman ЗММ, мембрана для переноса ДНК Hybond-N (Amersham, Англия), сефадекс G-50 (Pharmacia, Швеция), ДЕАЭ-целлюлоза.

Использованные в работе эндонуклеазы рестрикции EcoRll и Äs/NI были выделены и очищены в нашей лаборатории согласно [Бурьянов и др., 1981; Барышев и др., 1989]. Эндонуклеазы Hpall и Mspl — производства New England Biolabs (США). Остальные эндонуклеазы рестрикции и другие ферменты для генной инженерии — производства «MBI Fermentas» (Литва). При получении ДНК-зондов использовали набор «DNA multiprime labelling system» Amersham (Англия). В работе была использована ДНК-полимераза Taq.

32 32

Радиоактивные соединения: [а Р, у Р] ИВЭ (Обнинск). S-аденозилл

Ь-[метил- Н]метионин; удельная активность: 15 Ci/mmol («Amersham», Англия); [3H]dCTP («Amersham», Англия).

Олигонукпеотиды. Структура олигонуклеотидов для амплификации последовательности гена npt II : 5'-TAT TCG GCT ATG ACT GGG CA-3' 5'-GCC AAC GCT ATG TCC TGA TA-3' Для амплификации последовательности гена M \ËcoRII: 5-CGG GTA CCA TGG GAT CCT CTG AAT TTG AAT TAC TGG CGC AG-3' 5'-CGA GAT CTT CAG ATT CGT TCA ACC TTG CAC-3' Для исследования активности ДНК-метилтрансферазы DNMT1:

З'-ТСОССОТОСТССССАССТСАОССАССССТОСТТСТССССАОАСА-З' 3'-ACCGCCACGACGGGTCCACTCGGTGGCGACGAAGACGGGTCTGT-5, ш

5'-ТСОССОТОСТОСССАССТСАСССАССССТОСТТСТОСССАСАСА-3' 3'-АСССССАСОАСОССТССАСТСООТСССОАСОААОАСОООТСТОТ-5' т т

5'-ТСОССОТОСТОСССАССТСАОССАССССТССТТСТССССАОАСА-3' 3'-АСССССАСОАСОССТССАСТСООТСССОАСОААОАСОООТСТСТ-5'

5'-ТООССОТОСТССССАССТСАОССАССССТССТТСТССССАОАСА-3' 3'-АСССССАСОАСОССТССАСТСаОТСССОАСОААОАСОООТСТСТ-5' ш

Для исследования эффективности связывания ДНК-метилазы Нка\ с ингибиторами ДНК-метилтрансфераз второго поколения: 5'-ТСАССАОАТО(5РС)СТОТАООТСОТОТО(5РС)ОСТООТТССАССАОАО (5РС)ОСТТСАССТСТАОТТ-3'

5'-ААСТАСАООТСАСАС(5шС)ОСТСТСОТСОААССАО(5шС)ОСАСАСО АССТАСАО(5тС)ОСАТСТСОТСА-3'.

Микробиологические среды: ЬВ-бульон: Юг бактотриптона (Б1£со, США), 5 г дрожжевого экстракта (Б1:Гсо, США), 10 г №С1, воды дистиллированной до 1 л, рН 7,5. ЬВ агар: к ЬВ-бульону добавляли бакто-агар (1Жсо, США)до 15 г/л. УЕВ: 5 г бакто-говяжьего экстракта (1Жсо, США), 1 г бакто-дрожжевого экстракта (1Жсо, США), 5 г пептона (Б1&о, США), 5 г сахарозы, воды дистиллированной до 1 л, рН 7,2.

Среда для конъюгации: ИВ-питательный бульон США) - 8г, агар

США) - 15 г, на 1 литр. Среда для культивирования растений: МЗ [Мига8Ы§е апс! Skoog., 1962]. Состав среды приводится в таблице 2. Среду готовили из концентрированных растворов макросолей (20х), микроэлементов (100х), Ре-хелата (200х) и витаминов (100х), добавляли инозит, сахарозу, агар, стерилизовали автоклавированием (0,5 атм., 30 мин). Гормоны и антибиотики добавляли непосредственно перед употреблением.

Среда для культивирования животных клеток: DMEM (Mediatech, США) Растворы гормонов: 6-БАП (Serva, ФРГ), растворяли в 0,1 М NaOH, гиббереловую кислоту (ГК) (Serva, ФРГ), кинетин (Serva, ФРГ), НУК (Serva, ФРГ) и ИУК (Serva, ФРГ) растворяли в капле этанола и разводили водой до концентрации 1,0 мг/мл. Стерилизовали фильтрованием через нитроцеллюлозные фильтры типа ВА83 или ВА85 (Schleicher&Schuell, ФРГ). Таблица 2

Состав среды MS для культивирования растений (мг/л) компонент концентрация макроэлементы

СаС12-2Н20 440

NH4N03 1650

KNO3 1900

КН2Р04 170

MgS04-7H20 370 микроэлементы

Н3ВО3 6,2

Na2Mo04-2H20 0,25

KI 0,83

СоС12-6Н20 0,025

MnS04-4H20 22

CuS04-5H20 0,025

ZnS04-7H20 8,6

Fe-хелат:

Na2EDTA FeS04 37,2 27,85 витамины

Никотиновая кислота 0,5

Пиридоксин-HCl 0,5

Тиамин-HCl 0,1 другие компоненты

Глицин 2

Инозитол 100

Растворы антибиотиков: Для селекции бактериальных штаммов и трансформированных растений использовали ряд антибиотиков. Рабочие концентрации антибиотиков, приведенные в таблице 3, получали путем добавления к средам исходных водных растворов (50 мг/л) карбенициллина, канамицина (Минмедбиопром, Москва), (250 мг/мл) цефотаксима, раствор рифампицина (Serva, ФРГ) в диметилсульфоксиде (50 мг/мл), тетрациклина в 50% этаноле.

Раствор РНКазы: РНКазу растворяли в дистиллированной воде в концентрации 10 мг/мл, прогревали при 100°С и хранили при -20°С. ТЕ-буфер: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 1 мМ 3DTA.

ТВЕ-буфер для электрофореза 5х: трис - 54 г; борная кислота - 27,5 г; 0,5 М EDTA, рН 8,0 - 20 мл. Рабочий раствор - 89 мМ трис-борат, 89 мМ - борная кислота, 2 мМ - EDTA.

Буфер для нанесения проб на гель (10х): 0,25% бромфеноловый синий; 0,25% ксиленцианол; 25% фиколл (тип 400) в воде.

Раствор для предгибридизации: 6xSSC; 0,5% SDS; 5х раствор Денхардта; 100 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося или тимуса теленка.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шевчук, Тарас Валерьевич, Пущино

1. Баранова A.B., Янковский Н.К. Гены-супрессоры опухолевого роста. Н Мол. биол. 1998. Т. 32. С. 206-218.

2. Демидкина Н.П., Кирьянов Г.И., Ванюшин Б.Ф. Метилирование вновь синтезируемой ДНК в культуре мышиных фибробластов. // Биохимия. 1979. Т. 44. С. 1416-1426.

3. Дорохов Ю.Л. «Умолкание» генов у растений. // Молекулярная биология. 2007. Т. 41. С. 579-592.

4. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.Ф. 5-метилцитозин в пиримидиновых последовательностях ДНК растений и животных: специфичность метилирования. // Биохимия. 1981. Т. 46. С. 1458-1474.

5. Кирнос М.Д., Ганичева Н.И., Кутуева Л.И., Ванюшин Б.Ф. Нерепликативные синтез и метилирование ДНК в клеточном цикле клеток первого листа этиолированных проростков пшеницы. // Биохимия. 1984b. Т. 49. С. 1690-1702.

6. Маринич Д.В., Воробьев И.А., Смольникова В.В., Холмс Дж., Бабан Д., Шевчук Т.В., Бурьянов Я.И., Мирошников А.И. Гиперметилирование гена кальцитонина человека при лейкозах миелоидного происхождения // Гематология и трансфузиология. 1999. №4. С. 7-10.

7. Савельев C.B., Ашапкин В.В., Ванюшин Б.Ф. Рибосомная ДНК гексаплоидной пшеницы: характер метилирования и временная организация репликации в развивающихся проростках. // Мол. биол. 1990. Т. 24. С. 1042-1050.

8. Aapola U., Liv I., Peterson P. Imprinting regulator DNMT3L is a transcriptional repressor associated with histone deacetylase activity. // Nucí. Acids Res. 2002. V. 30. P. 3602-3608.

9. Anderson J.E. Restriction endonucleases and modification methylases. // Curr. Opinion Struct. Biol. 1993. V. 3. P. 24-30.

10. Antequera F., Bird A. CpG islands as genomic footprints of promoters that are associated with replication origins. // Curr. Biol. 1999. V. 9. P. R661-R667.

11. Antequera F., Boyes J., Bird A. Higth levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG Hands in cell lines // Cell. 1990.V. 62. P. 503-514.

12. Ashapkin V. V., Antoniv T.T., Vanyushin B.F. Methylation-dependent binding of wheat nuclear proteins to the promoter region of ribosomal RNA genes. // Gene. 1995. V. 157. P. 273-277.

13. Attadia V. Effects of 5-aza-2'-deoxycytidine on differentiation and oncogene expression in the human monoblastic leukemia cell line U-937. II Leukemia. 1993. May;7. Suppl. 1. P. 9-16.

14. Aufsatz W., Mette M. F., Van Der Winden J., Matzke A. J. Matzke M. RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis. II Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 16499-16506.

15. Banks J.A., Masson P., Fedoroff N. Molecular mechanisms in the developmental regulation of the maize Suppressor-mutator transposable element. // Gen. DeV. 1988. V. 2. P. 1364-1380.

16. Barry C., Faugeron G., Rosignol J.-L. Methylation induced premeiotically in Ascobolus: coextension with DNA repeat lengths and effect on transcript elongation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 4557-4561.

17. Baylin S.B., Herman J.G., Graff J.R., Vertino P. M., Issa J.-P. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. // Adv. Cancer Res. 1998. V. 72. P. 141-196.

18. Baylin S.B., Hoppener J.W.M., de Bustros A., Steenbergh P. H., Lips C.J.M., Nelkin B.D. DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas. // Cancer Res. 1986. V. 46. P. 2917-2922.

19. Behrens B., Noyer-Weidner M., Pavlek P., Lauster R., Balganesh T.S., Trautner T.A. Organization of multispecific DNA methyltransferases encoded by temperate Bacillus subtilis phages. // EMBO J. 1987. V. 6. P. 1137-1142.

20. Bestor T.H. Activation of mammalian DNA methyltransferase by cleavage of a Zn binding regulatory domain. // EMBO J. 1992. V. 11. P. 2611-2617.

21. Bestor T.H. DNA methylation: evolution of a bacterial immune function into a regulator of gene expression and genome structure in higher eukaryotes. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1990. V. 326. P. 179-187.

22. Bestor T.H. Methylation meets acetylation. // Nature. 1998. V. 393. P. 311-312.

23. Bird A. Genomic imprinting: imprints of islands. // Curr. Biol. 1993. V. 3. P. 275-277.

24. Bird A.P. CpG-rich islands and the function of DNA methylation. // Nature. 1986. V. 321. P. 209-213.

25. Bird A.P., Taggart M.H., Nicholls R.D., Higgs D.R. Nonmethylated CpG-rich islands at the human alpha-globin locus: implications for evolution of the alpha-globin pseudogene. // EMBO J. 1987. V. 6. P. 999-1004.

26. Bird A.P., Wolffe A.P. Methylation-induced repression belts, braces and chromatin. // Cell. 1999. V. 99. P. 451-454.

27. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucl. Acids Res. 1979 Nov 24;7(6): 1513-23.

28. Blow J.J., Laskey R.A. A role for the nuclear envelope in controlling DNA replication within the cell cycle. // Nature. 1988. V. 332. P. 546548.

29. Bostick M., Kim J.K., Esteve P.O., Clark A., Pradhan S., Jacobsen S.E. UHRF1 plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cells. II Science. 2007. V. 317. P. 1760-1764.

30. Bourbonniere M., Nalbantoglu J. The restriction enzyme ^/wNI is blocked by overlapping methylation // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 4774.

31. Bourc'his, D., Xu, G.L., Lin, C.S., Bollman, В., and Bestor, Т.Н. Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints. // Science. 2001. V. 294. P. 2536-2539.

32. Brenton J.D., Viville S., Surani M.A. Genomic imprinting and cancer. // Cancer Surv. 1995. V. 25. P. 161-171.

33. Broad P.M., Symes A.J., Thakker R.V., Craig R.K. Structure and methylation of the human calcitonin/alpha-CGRP gene. // Nucl. Acid Res. 1989. V. 17. P. 6999-7011.

34. Brock R.D., Davidson J.L. 5-azacytidine and gamma rays partially substitute for cold treatment in vernalizing winter wheat. // Environ. Exp. Bot. 1994. V. 34. P. 195-99.

35. Burn J.E., Bagnall D.J., Metzger J.D., Dennis E.S., Peacock W.J. DNA methylation, vernalization, and the initiation of flowering. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 287-291.

36. Buryanov Ya.I., Zinoviev V. V., Gorbunov Yu.A., Tuzikov F.V., Rechkunova N.I., Malygin E.G., Bayev A. A., Interaction of the Eco Dam methyltransferase with synthetic oligodeoxyribonucleotides. // Gene. 1988. V. 74. P. 67-69.

37. Buryanov Ya.I., Zinoviev V. V., Vienozhinskis M.T., Malygin E.G., Nesterenko V. F., Popov S.G. Gorbunov Yu.A. Does the DNA methylase Eco dam pair nucleotide sequences to form site-specific duplexes?// FEBS Lett. 1984. V. 168. P. 166-168.

38. Buschhausen G., Witting B., Graessmann M., Graessmann A. Chromatin structure is required to block transcription of the methylated herpes simplex virus thymidine kinase gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 1177-1181.

39. Cambareri E.B., Jensen B.C., Schabtach E., Selker E.U. Repeat-induced G-C to A-T mutations in Neurospora. II Science. 1989. V. 244. P. 15711575.

40. Cameron E.E., Bachman K., Myöhänen S., Herman J.G., Baylin S.B. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the reexpression of genes silenced in cancer. // Nature Genet. 1999. V. 21. P. 103-107.

41. Cao X., Springer N.M., Muszynsk, M.G., Phillips R.L., Kaeppler S.M., Jacobsen S.E. Conserved plant genes with similarity to mammalian de novo DNA methyltransferases. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000. V. 97. P. 4979-4984.

42. Chan S.W., Henderson I.R., Jacobsen S.E. Gardening the genome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana. // Nature Rev. Genet. 2005. V. 6. P. 351-360.

43. Chaudhuri S., Messing J. Allelespecific parental imprinting of dzrl, a posttranscriptional regulator of zein accumulation. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. V. 91. P. 4867-71.

44. Chen T., Ueda Y., Dodge J., Wang Z., Li E. Establishment and maintenance of genomic methylation patterns in mouse embryonic stem cells by Dnmt3a and Dnmt3b. // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 55945605.

45. Chen Z., Pikaard C.S. Epigenetic silencing of RNA polymerase I transcription: a role for DNA methylation histone modification in nuclear dominance. // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 2124-2136.

46. Cheng X. DNA modification by methyltransferases. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995a. V. 5. P. 4-10.

47. Cheng X. Structure and function of DNA methyltransferases. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995b. V. 24. P. 293-318.

48. Cheng X., Kumar S., Posfai J., Pflugrath J.W., Roberts R.J. Crystal structure of the Hhal DNA methyltransferase complexed with S-adenosyl-L-methionin. // Cell. 1993. V. 74. P. 299-307.

49. Chernov A.V., Vollmayr P., Walter J., Trautner T.A. Masc2, a C5-DNA-methyltransferase from Ascobolus immersus with similarity to methyltransferase of higer organisms. // Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 1467-1473.

50. Choi Y.-C., Chae C.-B. Demethylation of somatic and testis specific histone H2A and H2B genes in F9 embrionic carcinoma cells. // Mol. Cell. Biol. 1993. V. 13. P. 5538-5548.

51. Christman J.K., Sheikhnejad G., Dizik M., Abileah S., Wainfan E. Reversibility of changes in nucleic acid methylation and gene expression induced in rat liver by severe dietary methyl deficiency. // Carcinogenesis. 1993. V. 14. P. 551-557.

52. Christman J.K., Sheikhnejad G., Marasco C.J., Sufrin J.R. 5-methyl-2-deoxycytidine in single-stranded DNA can act in cis to single de novo DNA methylation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 73477351.

53. Chuang L.S, Ian H.I, Koh T.W, Ng H.H, Xu G, Li B.F. Human DNA-(cytosine-5)methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAFl. II Science. 1997. V. 277. P. 1996-2000.

54. Clark J, Shevchuk T, Kho M.R, Smith S.S. Methods for the design and analysis of oligodeoxynucleotide-based DNA (cytosine-5) methyltransferase inhibitors. II Anal. Biochem. 2003. V. 321. P. 50-64.

55. Clark S.J, Harrison J, Frommer M. CpNpG methylation in mammalian cells. /¡Nature Genet. 1995. V. 10. P. 20-28.

56. Clewell D.B, Helinski D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex in Escherichia coli: purification and induced conversion to an opern circular DNA form. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1969. V. 62. P. 11591166.

57. Cokus S.J, Feng S, Zhang X, Chen Z, Merriman B, Haudenschild

58. C.D, Pradhan S, Nelson S.F, Pellegrini M, Jacobsen S.E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. II Nature. 2008. V. 452. P. 215-219.

59. Comb M, Goodman H.M. CpG methylation inhibits proenkephalin gene expression and binding of the transcription factor AP-2. // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 3975-3982.

60. Cooper D.N, Taggart M.H, Bird A.P. Unmethylated domains in vertebrate DNA. // Nucl. Acids Res. 1983. V. 11 P. 647-658.

61. Costello J.F, Friihwald M.C, Smiraglia D.J, Rush L.J, Robertson G.P, Gao X, Wright F.A, Feramisco J.D, Peltomaki P, Lang J.C, Schuller

62. Coulondre C., Miller J.H., Farabaugh P. J., Gilbert W. Molecular basis of base substitution hotspots in Escherichia coli. II Nature. 1978. V. 274. P. 775-780.

63. Craig J.M., Bickmore W.A. The distribution of CpG islands in mammalian chromosomes. // Nature Genet. 1994. V. 7. P. 376-381.

64. Cross S., Meehan R., Nan X., Bird A. A component of the transcriptional repressor MeCPl shares a motif with DNA methyltransferase and HRX proteins. II Nature Genet. 1997. V. 16. P. 256-259.

65. Cumaraswamy G., Lennon G., Trask B.J., Celano B.J., Baylin S.B. Isolation and characterization of the cDNA encoding human DNA methyltransferase. IINucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 2287-2291.

66. Czank A., Hauselmann R., Page A.W., Leonhardt H., Bestor T.H., Schaffner W., Hergersberg M. Expression in mammalian cells of a cloned gene encoding murine DNA methyltransferase. // Gene. 1991. V. 109. P. 259-263.

67. De Carvalho F., Gheysen G., Kushnir S., Van Montagu., Inze D., Castresana C. Suppression of (3-1,3-glucanase transgene expression in homozygous plants. // EMBO J. 1992. V. 11. P. 2595-2602.

68. De Marzo A.M., Marchi V. L., Yang E.S., Veeraswamy R., Lin X., Nelson W.G. Abnormal regulation of DNA methyltransferase expression during colorectal carcinogenesis. // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 38553860.

69. Deng J., Szyf M. Multiple isoforms of DNA methyltransferase are encoded by vertebrate cytosine DNA methyltransferase gene. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 22869-22872.

70. Dennis E.S., Finnegan E.J., Bilodeau P., Chaudhury A., Genger R. Vernalization and the initiation of flowering. // Semin. Cell Dev. Biol. 1996. V. 7. P. 441-448.

71. Dennis K., Fan T., Geiman T., Yan Q., Muegge K. Lsh, a member of the SNF2 family, is required for genome-wide methylation. // Genes Dev. 2001. V. 15. P. 2940-2944.

72. Deplus R., Brenner C., Burgers W.A., Putmans P., Kouzaridis T., de Launoit Y., Fuks F. Dnmt3L is a transcriptional repressor that recruits histone deacetylase // Nucl. Acids Res. 2002. V. 30. P. 3831-3838.

73. Dessain S.K., Yu H., Reddel R.R., Beijersbergen R.L. Weinberg R.A. Methylation of the human telomerase gene CpG island. // Cancer Res. 2000. V. 60. 537-541.

74. Devereux T.R., Horikawa I., Anna C.H., Annab L.A., Afshari C.A. Barrett J.C. DNA methylation analysis of the promoter region of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene. // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 6087-6090.

75. Dhodapkar M., Gill J., Lust J. A. Abnormal Regional Hypermethylation of the Calcitonine Gene in Myelodisplastic Syndrome // Leukemia Res. 1995. V. 19. P. 719-726.

76. D'lncalci M., Covey J.M., Zaharko D.S., Kohn K.W. DNA alkali-labile sites induced by incorporation of 5-aza-2'-deoxycytidine into DNA of mouse leukemia L1210 cells. // Cancer Res. 1985. V. 45. P. 3197-3202.

77. Doerfler W. The fate of the DNA of adenovirus type 12 in baby hamster kidney cells. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1968. V. 60. P. 636-643.

78. Doskocil J, Sorm F. Distribution of 5-methylcytosine in pyrimidine sequences of deoxyribonucleic acids. // Biochim. Biophys. Acta. 1962. V. 55. P. 953-959.

79. Draper J., Scott R., Armitage Ph., Waiden R. Plant genetic transformation and gene expression. // A laboratory manual / J.Draper, R.Scott, Ph.Armitage (eds). London: Blackwell Sei. Publ. 1988. 355 p.

80. Drexler H.G. Review of alterations of the cyclin-dependent kinase inhibitor INK4 family genes pi5, pi6, pl8 and pi9 in human leukemia-lymphoma cells. II Leukemia. 1998. V. 12. P. 845-859.

81. Eads C.A., Danenberg K.D., Kawakami K., Saltz L.B., Danenberg P.V., Laird P.W. CpG island hypermethylation in human colorectal tumors is not associated with DNA methyltransferase overexpession. // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 2302-2306.

82. Edwards K, Johnstone C, Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. // Nitcl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

83. Esteller M., Corn P.G., Baylin S.B., Herman, J.G. A gene hypermethylation profile of human cancer. // Cancer Res. 2001. V. 61. P. 3225-3229.

84. Fedoreeva L.I., Vanyushin B.F. N6-Adenine DNA-methyltransferase in wheat seedlings. IIFEBSLett. 2002. V. 514. P. 305-308.

85. Fedoroff N., Masson P., Banks J.A. Mutations, epimutations, and the developmental programming of the maize Suppressor-mutator transposable element. // BioEssays. 1989. V. 10. P. 139-144.

86. Feher Z., Kiss A., Venetianer P. Expression of a bacterial modification methylase gene in yeast. // Nature. 1983. V. 302. P. 266-268.

87. Feinberg A.P., Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. // Nature. 1983. V. 301. P. 89-92.

88. Finnegan E.J., Dennis E.S. Isolation and identification by sequence homology of a putative cytosine methyltransferase from Arabidopsis thaliana. //Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. P. 2383-2388.

89. Finnegan E.J., Genger R.K., Peacock W.J., Dennis E.S. DNA methylation in plants. // Annu.Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. V. 49. P. 223-247.

90. Finnegan E.J., Peacock W.J., Dennis E.S. Reduced DNA methylation in Arabidopsis thaliana results in abnormal plant development. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8449-8454.

91. Fire A. RNA-triggered gene silencing. // Trends Genet. 1999. V. 15. P. 358-363.

92. Flavell R.B., O'Dell M., Thompson W.F. Regulation of cytosine methylation in ribosomal DNA and nucleolus organizer expression in wheat. II J. Mol. Biol. 1988. V. 204. P. 523-534.

93. Foss H.M., Roberts C.J., Claeys K.M., Selker E.U. Abnormal chromosome behaviour in Neurospora mutants defective in DNA methylation. // Science. 1993. V. 262. P. 1737-1741.

94. Franchina M., Kay P.H. Evidence that cytosine residues within 5'-CCTGG-3' pentanucleotides can be methylated in human DNA independently of the methylating system that modifies 5'-CG-3' dinucleotides. H DNA Cell Biol. 2000. V. 19. P. 521-526.

95. Frank D., Keshet I., Sham M., Levinc A., Razin A., Cedar H. Demethylation of CpG islands in embryonic cells. // Nature. 1994. V. 351. P. 239-241.

96. Fuks F., Burgers W.A., Brehm A., Hughes-Davies L., Konzarides T. DNA methyltransferase Dnmtl associates with histone deacetylase activity. // Nature Genet. 2000. V. 24. P. 88-91.

97. Fuks F., Burgers W.A., Godin N., Kasai M., Kouzaridis T. Dnmt3a binds deacetylases and is recruited by a sequence-specific repressor to silence transcription HEMBOJ. 2001. V. 20. P. 2536-2544.

98. Fuks F., Hurd P.J., Deplus R., Kouzaridis T. The DNA methyltransferases associate with HP1 and the SUV39H1 histone methyltransferase. II Nucl. Acids Res. 2003. V. 31. P. 2305-2312.

99. Futscher B.W., Oshiro M.M., Wozniak R.J., Holtan N., Hanigan C.L., Duan H. Domann F.E. Role for DNA methylation in the control of cell type specific maspin expression. // Nature Genet. 2002. V. 31. P. 175179.

100. Gama-Sosa M.A., Slagel V.A., Trewyn R.W., Oxenhandler R., Kuo K.C., Gehrke C.W., Ehrlich M. The 5-methylcytosine content of DNA from human tumors. // Nucl. Acids Res. 1983. V. 11. P. 6883-6894.

101. Gardiner-Garden M, Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes. // J. Mol. Biol. 1987. V. 196. P. 261-282.

102. Gaudet F, Talbot D, Leonhardt H, Jaenisch R. A short DNA methyltransferase isoform restores methylation in vivo. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 32725-32729.

103. Gehring M, Choi Y, Fisher R. Imprinting and seed development // Plant Cell. 2004. V. 16. P. S203-S213.

104. Giordano M, Mattachini M.E, Cella R, Pedrali-Noy G. Purification and properties of a novel DNA methyltransferase from cultured rice cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V. 177. P. 711-719.

105. Glickman J.F, Pavlovich J.G, Reich N.O. Peptide mapping of the murine DNA methyltransferase reveals a major phosphorylation site and the start of translation. II J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 17851-17867.

106. Goyon C, Barry C, Gregoire A, Faugeron G, Rossignol J.-L. Methylaion of DNA repeats of decreasing sizes in Ascobolus immersus. 11 Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 3054-3065.

107. Goyon C, Faugeron G. Targeted transformation of Ascobolus immersus and de novo methylation of the resulting duplicated DNA sequences. // Mol. Cell. Biol. 1989. V. 9. P. 2818-2827.

108. Graesmann A, Graesmann M. DNA methylation, chromatin structure and regulation of Herpes simplex virus tk gene expression. // Gene. 1988. V. 74. P. 135-137.

109. Gribnau J, Hochedlinger K, Hata K, Li E, Jaenisch R. Asynchronous replication timing of imprinted loci is independent of DNA methylation,but consistent with differential subnuclear localization. // Genes Dev. 2003. V. 17. P. 759-773.

110. Grippo P., Iaccarino M., Parisi E., Scarano E. Methylation of DNA in developing sea urchin embryos. // J. Mol. Biol. 1968. V. 36. P. 195-208.

111. Gruenbaum Y., Naveh-Many T., Cedar H., Razin A. Sequence specificity of methylation in higher plant DNA. // Nature. 1981. V. 292. P. 860-862.

112. Grunstein M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. IINature. 1997. V. 389. P. 349-352.

113. Guschibauer W., The DNA and S-adenosylmethionine-binding regions of EcoDam and related methyltransferases. // Gene. 1988. V. 74. P. 211214.

114. Gutierrez-Marcos J., Dickinson H. Imprinted genes in maize / In: Comparative Biochemistry and Physiology. Part A132. 2002. P. SI70.

115. Hamilton A.J., Baulcombe D.C. A species of small antisense RNA in posttanscriptional gene silencing in plants. // Science. 1999. V. 286. P. 950-952.

116. Han.M., Grunstein M. Nucleosome loss activates yeast downstream promoters in vivo. II Cell. 1988. V. 55. P. 1137-1145.

117. Hata K., Sakaki Y. Identification of critical CpG sites for repression of LI transcription by DNA methylation. // Gene. 1997. V. 189. P. 227-234.

118. Hata, K., Okano, M., Lei, H., and Li, E. Dnmt3L cooperates with the Dnmt3 family of de novo DNA methyltransferases to establish maternal imprints in mice. II Development. 2002. V. 129. P. 1983-1993.

119. Hatada I., Fukasawa M., Kimura M., Morita S., Yamada K., Yoshikawa T., Yamanaka S., Endo C., Sakurada A., Sato M., Kondo T., Horii A.,

120. Ushijima T., Sasaki H. Genome-wide profiling of promoter methylation in human. // Oncogene. 2006. V. 25. P. 3059-3064.

121. Hatada J., Hayashizaki Y., Hirotsune S., Komatsubara H., Mukai T. A genomic scaning method for higher organisms using restriction sites as landmarks. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 9523-9527.

122. Hendrich B., Bird A. Identification and characterization of a famaly of mammalian methyl-CpG binding proteins. // Mol. Cell Biol. 1998. V. 18. P. 6538-6547.

123. Henikoff S., Comai L. A DNA methyltransferase homolog with a chromodomain exists in multiple polymorphic forms in Arabidopsis. // Genetics. 1998. V. 149. P. 307-318.

124. Hererra-Estrella L., De Block M., Messens E., Hernalsteens J.-P., Van Montagu M., Schell J. Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells. //EMBOJ. 1983. V. 2. P. 987-995.

125. Hermann A., Schmitt S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(cytosine-C5) methyltransferase activity. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 31717-31721.

126. Heslop-Harrison J.S. Gene expression and parental dominance in hybrid plants. // Development. 1990. Suppl. P. 21-28.

127. Holler M., Westin G., Jiricny J., Schaffner W. Spl transcription factor binds DNA and activates transcription even when the binding site is CpG methylated. // Genes Dev. 1988. V. 2. P. 1127-1135.

128. Holsters M., Silva B., Van Vliet F., Genetello C., De Block M., Dhaese P., Depicker A., Inze D., Engler G., Villaroel R., Van Montagu., Shell J. The functional organization of the nopalin Ti plasmid pTi C58. // Plasmid. 1980. V. 3. P. 212-230.

129. Huettel B., Kanno T., Daxinger L., Aufsatz W., Matzke A.J., Matzke M. Endogenous targets of RNA-directed DNA methylation and Pol IV in Arabidopsis. //EMBOJ. 2006. V. 25. P. 2828-2836.

130. Hurtvagner G., Simard M.G. Argonaute proteins: key players in RNA silencing. II Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2008. V. 9. P. 22-32.

131. Iguchi-Ariga S.M., Schaffner W. CpG methylation of the cAMP-responsive enhancer/promoter sequence TGACGTCA abolishes specific factor binding as well as transcriptional activation. // Genes Dev. 1989. V. 3. P. 612-619.

132. Ingelbrecht I., Van Houdt H., Van Montagu M., Depicker A. Posttranscriptional silencing of reporter transgenes in tobacco correlates with DNA methylation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 10502-10506.

133. Irvine D.V., Zaratiegui M., Tolia N.H., Goto D.B., Chitwood D.H., Vaughn M.W., Joshua-Tor L., Martienssen R.A. Argonaute slicing isrequired for heterochromatic silencing and spreading. // Science. 2006. V. 313. P. 1134-1137.

134. Issa J.-P., Ottaviano Y.L., Celano P., Hamilton S.R., Davidson N.E., Baylin S.B. Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia in human colon. // Nature Genet. 1994. V. 7. P. 536-540.

135. Issa J.-P., Vertino P. M., Boehm C.D., Newsham I.F., Baylin S.B. Switch from monoallelic to biallelic human IGF2 promoter methylation during aging and carcinogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996.V. 93. P. 11757-11762.

136. Jackson J.P., Lingroth A.M., Cao X., Jacobsen S.E. Control of CpNpG DNA methylation by the KRYPTONITE histone H3 methyltransferase // Nature. 2002. V. 416. P. 556-560.

137. Jacobsen S.E., Meyerowitz E.M. Hypermethylated SUPERMAN epigenetic alleles mArabidopsis. II Science. 1997. V. 277. P. 1100-1103.

138. Jacobsen S.E., Sakai H., Finnegan E.J., Cao X., Meyerowitz E.M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. II Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 179-186.

139. Jaenisch R. DNA methylation and imprinting: why bother? 11 Trends Genet. 1997. V. 13. P. 323-329.

140. James S.J., Pogribny I.P., Miller B.J., Pogribna M. Refeeding the contrrol diet during tumor promotion increases frequency of liver tumors and metastases in folate/methyl deficient rats. // Proc. Am. Assoc. Cancer. Res. 1997. V. 38. P. 711.

141. Janousek B., Siroky J., Vyskot B. Epigenetic control of sexual phenotype in a dioecious plant, Melandrium album. II Mol. Gen. Genet. 1996. V. 250. P. 483-490.

142. Jeanpierre M., Turleau C., Aurias A., Prieur M., Ledeist F., Fischer A., Viegas-Pequignot E. An embryonic-like methylation pattern of classicalsatellite DNA is observed in ISF syndrome. // Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2. P. 731-735.

143. Jeddeloh J.A., Stokes T.L., Richards E.J. Maintenance of genomic methylation requires a SWI2/SNF2-like protein. // Nature Genet. 1999. V. 22. P. 94-97.

144. Jia D., Jurkowska R.Z., Zhang X., Jeltsch A., Cheng X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. II Nature. 2007. V. 449. P. 248-251.

145. Johnson L.M., Bostick M., Zhang X., Kraft E., Henderson I., Callis J., Jacobsen S.E. The SRA methyl-cytosine-binding domain links DNA and histone methylation. // CurrBiol. 2007. V. 17. P. 379-384.

146. Jones P. A. The DNA methylation paradox. // Trends Genet. 1999. V. 15. P. 34-37.

147. Jones P. L., Veenstra G.J.C., Wade P. A., Vermaak D., Kass S.U., Landsberger N., Strouboulis J., Wolffe A.P. Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. // Nature Genet. 1998. V. 19. P. 187-191.

148. Kakutani T. Genetic characterization of late-flowering traits induced by DNA hypomethylation mutation in Arabidopsis thaliana. // Plant J. 1998. V. 12. P. 1447-1451.

149. Kakutani T. Jeddeloh J.A., Flowers S.K., Munakata K., Richards E.J. Developmental abnormalities and epimutations associated with DNA hypomethylation mutations. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. V. 93. P. 12406-12411.

150. Kakutani T, Jeddeloh J, Richards E.J. Characterization of an Arabidopsis thaliana DNA hypomethylation mutant. // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 130-137.

151. Kang E.S, Park C.W, Chung J.H. Dnmt3b, de novo DNA methyltransferase, interacts with SUMO-1 and Ubc9 through its N-terminal region and is subject to modification by SUMO-1 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 289. P. 862-868.

152. Kangaspeska S, Stride B, Metivier R, Polycarpou-Schwarz M, Ibberson D, Carmouche R.P, Benes V, Gannon F, Reid G. Transient cyclical methylation of promoter DNA. II Nature. 2008. V. 452. P. 112115.

153. Kanno T, Huettel B, Mette M.F, Aufsatz W, Jaligot E, Daxinger L, Kreil D.P, Matzke M, Matzke A.J. Atypical RNA polymerase subunits required for RNA-directed DNA methylation. // Nature Genet. 2005. V. 37. P. 761-765.

154. Kanno T, Mette M.F, Kreil D.P, Aufsatz W, Matzke M, Matzke A.J. Involvement of putative SNF2 chromatin remodeling protein DRD1 in RNA-directed DNA methylation. // Curr Biol. 2004. V. 14. P. 801-805.

155. Kass S.U., Landsberger N, Wolff A.P. DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation. // Curr. Biol. 1997. V. 7. P. 157-165.

156. Kautainien T. L, Jones P. A. DNA methyltransferase levels in tumorigenic and non-tumorigenic cells in culture. II J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 1594-1598.

157. Kazazian H.H., Jr, Moran J.V. The impact of LI retrotransposons on the human genome. II Nature Genet. 1998. V. 19. P. 19-24.

158. Kermicle J.L. Imprinting of gene action in maize endosperm. / In: Maize Breeding and Genetics, ed. D.B. Waiden, New York. Wiley. 1978. P. 357-371.

159. Kermicle J.L., Alleman M. Gametic imprinting in maize in relation to the angiosperm life cycle. // Development Suppl. 1990. P. 9-14.

160. Kim, G.D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R.J., Pradhan, S. Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases // EMBOJ. 2002. V. 21. P. 4183-4195.

161. Kimura H., Shiota K. Methyl-CpG-binding protein, MeCP2, is a target molecule for maintenance DNA methyltransferase, Dnmtl // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 4806-4812.

162. Kingston R.E., Bunker C.A., Imbalzano A.N. Repression and activation by multiprotein complexes that alter chromatin structure. // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 905-920.

163. Kinoshita T., Miura A., Choi Y., Kinoshita Y., Cao X., Jacobsen S., Fisher R., Kakutani T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation // Science. 2004. V. 303. P. 521-523.

164. Kladde M.P., Xu M., Simpson R.T. DNA methyltransferases as probes of chromatin structure in vivo. // Methods Enzymol. 1999. V. 304. P. 431^147.

165. Klimasauskas S., Kumar S., Roberts R.J., Cheng X Hhal methyltransferase flips its target base out of DNA helix. // Cell. 1994. V. 76. P. 357-369.

166. Knezetic J.A., Luse D.S., The presence of nucleosomes on a DNA template prevents initiation by RNA polymerase II in vitro. // Cell. 1986. V. 45. P. 95-104.

167. Knudson A.G. Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1971. V. 68. P. 820-823.

168. Kochanek S., Renz D., Doerfler W. DNA methylation in the Alu sequences of diploid and haploid primary human cells. IIEMBO J. 1993. V. 12. P. 1141-1151.

169. Kornberg R.D., Lorch Y. Tventy-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukayote chromosome. // Cell. 1999. V. 98. P. 285-294.

170. Kouzminova, E., Selker, E.U. dim-2 encodes a DNA methyltransferase responsible for all known cytosine methylation in Neurospora. // EMBO J. 2001. V. 20. P. 4309-4323.

171. Kumar S., Cheng X., Klimasauskas S., Sha ML, Posfai J., Roberts R.J., Wilson G.G. The DNA (cytosine-5) methyiltransferases. // Nucl. Acids Res. 1994. V. 22. P. 1-10.

172. Laird P. W., Jackson-Grusby L., Fazeli A., Dickinson S.L., Jung W.E., Li E., Weinberg R.A., Jaenisch R. Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation. // Cell. 1995. V. 81. P. 197-205.

173. Lauster R. Evolution of type II methyltransferases. A gene duplication model. II J. Mol. Biol. 1989. V. 206. P. 313-321.

174. Lauster R., Trautner T.A., Nouer-Weidner M. Cytosine-speciflc type II DNA methyltransferases: a conserved enzyme core with variable target-recognition domains. II J. Mol. Biol. 1989. V. 206. P. 305-312.

175. Leegwater P. A., Lambooy L.H., De Abreu R.A., Bokkerink J.P., van den Heuvel L.P. DNA methylation patterns in the calcitonin gene region at first diagnosis and at relapse of acute lymphoblastic leukemia (ALL). II Leukemia. 1997. V. 11. P. 971-978.

176. Leemans J., Shaw Ch., Deblaere R., De Greve H., Hemalsteens J.P., Maes M., Van Montagu M., Schell J. Site-specific mutagenesis of Agrobacterium Ti plasmids and transfer of genes to plant cells. // J.Mol.Appl.Genet. 1981. V. 1. P. 149-164.

177. Lei H., Oh S.P, Okano ML, Jüttermann R., Goss K.A., Jaenisch R., Li E. De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. II Development. 1996. V. 122. P. 3195-3205.

178. Lei H., Oh S.P, Okano M., Jüttermann R., Goss K.A., Jaenisch R., Li E. De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. II Development. 1996. V. 122. P. 3195-3205.

179. Leonhardt H., Page A.W., Weier H.-U., Bestor T.H. A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei. // Cell. 1992. V. 71. P. 865-873.

180. Lewis J.D., Meehan R.R., Henzel W.J., Maurer-Fogy I., Jeppesen P., Klein F., Bird A. Purification, sequence and cellular localization of a novel chromosomal protein that binds to methylated DNA. // Cell. 1992. V. 69. P. 905-914.

181. Li E., Beard C., Forster A.C., Bestor T.H., Jaenisch R. DNA methylation, genomic imprinting, and mammalian development. // Cold Spring Harbor Sympos. Quant. Biol. 1993. V. 58. P. 297-305.

182. Li E., Bestor T.H., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. // Cell. 1992. V. 69. P. 915-926.

183. Lin B-Y. Ploidy barrier to endosperm development in maize. 11 Genetics. 1984. V. 107. P. 103-115.

184. Lin K.T., Momparler R.L., Rivard G.E. High-performance liquid chromatographic analysis of chemical stability of 5-aza-2'-deoxycytidine. II J Pharm Sei. 1981. V. 70. P. 1228-1232.

185. Lindroth A.M., Cao X., Jackson J.P., Zilberman D., McCallum C.M., Henikoff S., Jacobsen S.E. Requirement of CHROMOMETHYLASE3for maintenance of CpXpG methylation // Science. 2001. V. 292. P. 2077-2080.

186. Liu L., Santi D.V. Mutation of asparagine 229 to aspartate in thymidylate synthase converts the enzyme to a deoxycytidylate methylase. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 5100-5104.

187. Loeb L.A. Mutator phenotype may be required for multistage carcinogenesis. // Cancer Res. 1991. V. 51. P. 3075-3079.

188. Loh W.E., Scrable H.J., Livanos E., Arboleda M.J., Cavenee W.K., Oshimura M., Weissmann B.E. Human chromosome 11 contains two different growth suppressor genes for embryonal rhabdomyosarcoma. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 1755-1759.

189. Lorch Y., La Pointe J.W., Kornberg R.G. Nucleosomes inhibit the initiation of transcription but allow chain elongation with the displacement of histones. // Cell. 1987. V. 49. P. 203-210.

190. Lucy A.P., Guo H.-S., Li W.-X., Ding S.-W. Suppression of posttranscriptional gene silencing by a plant viral protein localized in the nucleus. HEMBOJ. 2000. V. 19. P. 1672-1680.

191. Luo S., Preuss D. Strand-biased DNA methylation associated with centromeric region in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 11133-11138.

192. Lyko F., Ramsahoye, B.H., Jaenisch, R. Development DNA methylation in Drosophila melanogaster. II Nature. 2000. V. 408. P. 538-540.

193. MacLeod A.R., Rouleau J., Szyf M. Regulation of DNA methylation by the Ras signaling pathway. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 1132711337.

194. MacLeod A.R., Szyf M. Expression of an antisense to the DNA methyltransferase mRNA induces DNA demethylation and inhibits tumorigenesis. II J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 8037-8043.

195. MacLeod D., Ali R.R., Bird A.P. An alternative promoter in the mouse major histocompatibility complex class II I-Ap gene: implications for the origin of CpG islands. // Mol. Cell Biol. 1998. V. 18. P. 4433-4443.

196. MacLeod D., Charlton J., Mullins J., Bird A.P. Spl sites in the mouse aprt gene promoter are required to prevent methylation of the CpG island. // Genes Dev. 1994. V. 8. P. 2282-2292.

197. Majumder S., Ghoshal K., Datta J., Smith D.S., Bai S., Jacob S.T. Role of DNA methyltransferases in regulation of human ribosomal RNA gene transcription. II J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 22062-22072.

198. Malagnac F., Gregoire A., Goyon C., Rossignol J.-L., Faugeron G. Masc2, a gene from Ascobolus encoding a protein with a DNA-methyltransferase activity in vitro is dispensable for in vivo methylation. II Mol. Microbiol. 1999. V. 31. P. 331-338.

199. Malinen T, Palotie A, Pakkala S, Peltonen L, Ruutu T, Jansson S.E. Acceleration of chronic myeloid leukemia correlates with calcitonin gene hypermethylation. //Blood. 1991. V. 77. P. 2435-2440.

200. Malone C.S, Kuraishy A.I, Fike F.M, Loya R.G, Mikkili M.R, Teitell M.A, Wall R. B29 gene silencing in pituitary cells is regulated by its 3' enhancer. //J. Mol. Biol. 2006. V. 362. P. 173-183.

201. Malone C.S, Miner M.D, Doerr J.R, Jackson J.P, Jacobsen S.E, Wall R, Teitell M. CmC(A/T)GG DNA methylation in mature B cell lymphoma gene silencing. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. . 2001. V. 98. P. 10404-10409.

202. Margot J.B, Aguirre-Arteta A.M., Di Giacco B.V, Pradhan S, Roberts R.J, Cardoso M.C, Leonhardt H. Structure and function of the mouse DNA methyltransferase gene: Dnmtl shows a tripartite structure. // J. Mol. Biol. 2000. V. 297. P. 293-300.

203. Martienssen R.A, Richards E.J. DNA methylation in eukaryotes. // Curr. Opinion Genet. Dev. 1995. V. 5. P. 234-242.

204. Mathieu O, Reinders J, Caikovski M, Smathajitt C, Paszkowski J. Transgenerational Stability of the Arabidopsis Epigenome Is Coordinated by CG Methylation. // Cell. 2007. V. 130. P. 851-862.

205. Matzke M, Matzke A.J.M. Genomic imprinting in plants: parental effects and ira«s-inactivation phenomena. // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1993. V. 44. P. 53-76.

206. Matzke M.A, Birchler J.A. RNAi-mediated pathways in the nucleus. // Nature Rev. Genet. 2005. V. 6. P. 24-35.

207. Matzke M.A, Matzke A.J.M, Primig M, Trnousky J. Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed tobacco plants. HEMBOJ. 1989. V. 8. P. 643-649.

208. McCormick F. Signalling networks that cause cancer. // Trends Cell Biol. 1999. V. 9. P. M53-M60.

209. McDonald J.F., Transposable elements, gene silencing and macroevolution. // Trends Ecol. Evolut. 1998. V. 13. P. 94-95.

210. Meehan R.R., Lewis J.D., McKay S., Kleiner E.L., Bird A.P. Identification of a mammalian protein that binds specifically to DNA containing methylated CpGs. // Cell 1989. V. 58. P. 499-507.

211. Mertineit C., Yoder J.A., Taketo T., Laird D.W., Trasler J.M., Bestor T.H. Sex-specific exons control DNA methyltransferase in mammalian germ cells. II Development. 1998. V. 125. P. 889-897.

212. Mette M., van der Winden J., Matzke M.A., Matzke A.J.M. Production of aberrant promoter transcripts contributes to methylation and silencing of unlinked homologous promoters in trans. // EMBO J. 1999. V. 18. P. 241-248.

213. Meyer P., Heidmann I., Niedenhof I. Differences in DNA-methylation are associated with a paramutation phenomenon in transgenic petunia. // Plant J. 1993. V. 4. P. 89-100.

214. Meyer P., Niedenhof I., ten Lohuis M. Evidence for cytosine methylation of non-symmetrical sequences in transgenic Petunia hybrida. II EMBO J. 1994. V. 13. P. 2084-2088.

215. Mi S., Roberts R.J. The DNA binding affinity of Hhal methylase is increased by a single amino acid substutuion in the catalytic center. // Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. P. 2459-2464.

216. Miyamura Y., Ohtsu H., Niwa O., Kurishita A., Watanabe H., SadoT., Ono T. Comparison of the age-and tumor-associated changes in the c

217. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. // Plant Physiol. 1962. V. 15. P. 473-497.

218. Nakano Y., Steward N., Sekine M., Kusano T., Sano H. A tobacco NtMET cDNA encoding a DNA methyltransferase: molecular characterization and abnormal phenotypes of transgenic tobacco plants. // Plant Ce//.Physiol. 2000. V. 41. P. 448-457.

219. Nan X., Campoy F., Bird A. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin. // Cell. 1997. V. 88. P. 471-481.

220. Nan X., Meehan R.R., Bird A. Dissection of the methyl-CpG-binding domain from the chromosomal protein MeCP2. // Nucl. Acids Res. 1993. V.21.P. 4886-4892.

221. Nan X., Ng H.-H., Johnson C.A., Laherty C.D., Turner B.M., Eisenman R.N., Bird A. Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. II Nature. 1998. V. 393. P. 386-389.

222. Nan X., Tate P., Li E., Bird A. DNA methylation specifies chrmosomal localization ofMeCP2. II Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 414-421.

223. Napoli C., Lemieux C., Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. I ¡Plant Cell. 1990. V. 2. P. 279-289.

224. Nelkin B. D., Przepiorka D., Burke P. J., Thomas E. D., Baylin S. B. Abnormal methylation of the calcitonin gene marks progression of chronic myelogenous leukemia. // Blood. 1991. V. 77. P. 2431-2434.

225. Neumann B., Kubicka P., Barlow D.P. Characteristics of imprinted genes. II Nature Genet. 1995. V. 9. P. 12-13.

226. Ng H.-H., Zhang Yi., Hendrich B., Johnson C.A., Turner B.M., Erdjument-Bromage H., Tempst P, Reinberg D., Bird A. MBD2 is a transcriptional repressor belonging to the MeCPl histone deacetylase complex. II Nature Genet. 1999. V. 23. P. 58-61.

227. Nick H., Bowen B., Ferl R.J., Gilbert W. Detection of cytosine methylation in the maize alcohol dehydrogenase gene by the genomic sequencing. II Nature. 1986. V. 319. P. 243-246.

228. Noyer-Weinder M., Trutner T.A. Methylation of DNA in procaryotes. 11 DNA methylation: molecular biology and biological significance./ J.P. Jost, H.P. Saluz (eds) Basel; Boston; Berlin: Birhauser Verlag, 1993. P. 39-108.

229. Nuovo G.J., Plaia T.W., Belinsky S.A., Baylin S.B., Herman J.G. In situ detection of the hypermethylation-induced inactivation of the pl6 gene as an early event in oncogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 12754-12759.

230. Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. // Cell. 1999. V. 99. P. 247-257.

231. Okano M., Xie S., Li E. Cloning and characterization of a family of novel mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases. // Nature Genet. 1998b. V. 19. P. 219-220.

232. Okano M., Xie S., Li E. Dnmt2 is not required for de novo and maintenance methylation of viral DNA in embryonic stem cells. // Nucl. Acids Res. 1998a. V. 26. P. 2536-2540.

233. Palmisano W.A., Divine K.K., Saccomanno G., Gilliland F.D., Baylin S.B., Herman J.G., Belinsky S.A. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. // Cancer Res. 2000. V. 60. P. 5954-5958.

234. Papa C.M., Springer N.M., Muszynski M.G., Meeley R., Kaeppler S.M. Maize chromomethylase Zea methyltransferase2 is required for CpNpG methylation. H Plant Cell. 2001. V. 13. P. 1919-1928.

235. Paranjape S.M., Kamakaka R.T., Kadonaga J.T. Role of chromatin structure in the regulation of transcription by RNA polymerase II. // Annu. Rev. Biochem. 1994.V. 63. P. 265-297.

236. Pazin M.J., Kadonaga J.T. SWI2/SNF2 and related proteins: ATP-driven motors that disrupt protein-DNA interaction? // Cell. 1997a. V. 88. P. 737-740.

237. Pazin M.J., Kadonaga J.T. What's up and down with histone deacetylation and transcription? // Cell. 1997b. V. 89. P. 325-328.

238. Pedone P. V., Pikaart M.J., Cerrato F., Vernucci M., Ungaro P., Bruni C.B., Riccio A. Role of histone acetylation and DNA methylation in the maintenance of the imprinted expression of the HI 9 and Igf2 genes. // FEBSLett. 1999. V. 458. P. 45-50.

239. Pelissier T, Thalmeir S., Kempe D., Sänger H.-L., Wassenegger M. Heavy de novo methylation at symmetrical and non-symmetrical sites is a hallmark of RNA-directed DNA methylation. // Nucl. Acids Res. 1999. V. 27. P. 1625-1634.

240. Plass C. Cancer epigenomics. // Hum. Mol. Genet. 2002. V. 11. P. 24792488.

241. Pogribny L.P., Miller B.J., James S.J. Alterations in hepatic p53 gene methylation patterns during tumor progression with folate/methyl deficiency in the rat. // Cancer Lett. 1997. V. 115. P. 31-38.

242. Portier M, Molès JP, Mazars GR, Jeanteur P, Bataille R, Klein B, Theillet C. p53 and RAS gene mutations in multiple myeloma. // Oncogene. 1992. V. 7. P. 2539-2543.

243. Posfai J., Bhagwat A. S., Posfai G., Roberts R.J. Predictive motifs derived from cytosine methyltransferases. // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P. 2421-2435.

244. Pradhan S., Adams R.L.P. Distinct CG and CNG DNA methyltransferases in Pisum sativum. II Plant J. 1995. V. 7. P. 471-481.

245. Pradhan S., Cummings M., Roberts R.J., Adams R.L.P. Isolation, characterization and baculovirus-mediated expression of the cDNA encoding cytosine DNA methyltransferase from Pisum sativum. II Nucl. Acids Res. 1998. V. 26. P. 1214-1222.

246. Pradhan S., Kim G.D. The retinoblastoma gene product interacts with maintenance human DNA (cytosine-5) methyltransferase and modulates its activity // EMBO J., 2002, V. 21, P. 779-788.

247. Ramchandani S., Bhattacharya S.K., Cervoni N., Szyf M. DNA methylation is a reversible biological signal. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 6107-6112.

248. Ramchandani S, MacLeod A.R, Pinard M, von Hofe E, Szyf M. Inhibition of tumorigenesis by a cytosine-DNA methyltransferase, antisense oligodeoxynucleotide. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 684-689.

249. Ramsahoye B.H, Biniskiewicz D, Lyko F, Clark V, Bird A.P., Jaenish R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 5237-5242.

250. Ratcliff F, Harrison B.D, Baulcombe D.C. A similarity between viral defense and gene silencing in plants. // Science. 1997. V. 276. P. 15581560.

251. Razin A, Cedar H. DNA methylation and genomic imprinting. // Cell. 1994. V. 77. P. 473-476.

252. Reik W. Genomic imprinting and genetic disorders in man. // Trends Genet. 1989. V. 5. P. 331-336.

253. Reik W, Walter J. Imprinting mechanisms in mammals. // Curr. Opinion Genet. Dev. 1998. V. 8. P. 154-164.

254. Reik W, Collick A, Norris M.L, Barton S.C, Surani M.A. Genomic imprinting determines methylation of parental alleles in transgenic mice. // Nature. 1987. V. 328. P. 248-254.

255. Rhounim L, Gregoire A, Salama S, Faugeron G. Clustering of multiple trsnsgene integrations in highly-unstable Ascobolus immersus transformants. // Curr.Genet. 1994. V. 26. P. 344-351.

256. Rhounim L, Rossignol J.-L, Faugeron G. Epimutation of repeated genes in Ascobolus immersus. I/EMBOJ. 1992. V. 11. P. 4451-4457.

257. Rideout W.M. Ill, Coetzee G.A, Olumi A.F, Jones P. A. 5-methylcytosine as an endogenous mutagen in the human LDL receptor and p53 genes. II Science. 1990. V. 249. P. 1288-1290.

258. Riggs A.D, Pfeifer G.P. X-chromosome inactivation and cell memory. // Trends Genet. 1992. V. 8. P. 169-174.

259. Ritter M., de Kant E., Huhn D., Neubauer A. Detection of DNA methylation in the calcitonin gene in human leukemias using differential polymerase chain reaction. II Leukemia. 1995. V. 9. P. 915-921.

260. Romanov G.A., Vanyushin B.F. Methylation of reiterated sequences in mammalian DNAs. Effects of the tissue type, age, malignancy and hormonal induction. // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 653. P. 204-218.

261. Ronemus M.J., Galbiati M., Ticknor C., Chen J., Dellaporta S.L. Demethylation-induced developmental pleiotropy in Arabidopsis // Science. 1996. V. 273. P. 654-657.

262. Rossignol J.-L., Faugeron G. Gene inactivation triggered by recognition between DNA repeats. // Experientia. 1994. V. 50. P. 307-317.

263. Rouleau J., MacLeod A.R., Szyf M. Regulation of the DNA methyltransferase by the Ras-APl signaling pathway. // J. Biol Chem. 1995. V. 270. P. 1595-1601.

264. Rountree, M.R., Bachman, K.E., Baylin, S.B. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci // Nature Genet. 2000. V. 25. P. 269-277.

265. Salomon R., Kaye A.M. Methylation of mouse DNA in vivo: di- and tripyrimidine sequences containing 5-methylcytosine. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 204. P. 340-351.

266. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning : a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbour Press, 1989. 545p.

267. Santini V., Kantarjian H.M., Issa J.P. Changes in DNA methylation in neoplasia: pathophysiology and therapeutic implications. // Ann. Intern. Med. 2001. V. 134. P. 573-586.

268. Sapienza C., Peterson A., Rossant J., Balling R. Degree of methylation of transgenes is dependent on gamete of origin. // Nature. 1987. V. 328. P. 251-254.

269. Schluckebier G., O'Gara M., Saenger W., Cheng X. Universal catalytic domain structure of AdoMet-dependent methyltransferases. // J. Mol. Biol. 1995. V. 247. P. 16-20.

270. Schmutte C., Jones P. A. Involvement of DNA methylation in human carcinogenesis. II Biol. Chem. 1998. V. 379. P. 377-388.

271. Schwartz D., Dennis E. Transposase activity of the Ac controlling element in maize is regulated by its degree of methylation. // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 205. P. 476^182.

272. Selker E. Premeiotic instability and repeated sequences in Neurospors crassa. II Annu. Rev. Genet. 1990. V. 24. P. 579-613.

273. Selker E.U. Epigenetic phenomena in filamentous fungi: useful paradigms or repeat-induced confusion? // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 296-301.

274. Selker E.U., Cambareri E.B., Jensen B.C., Haack K.R. Rearrangement of duplicated DNA in specialized eels of Neurospora. // Cell. 1987. V. 51. P. 741-752.

275. Selker E.U., Fritz D.Y., Singer M.J. Dense nonsymmetrical DNA methylation resulting from repeat-induced point mutation in Neurospora. II Science. 1993. V. 262. P. 1724-1728.

276. Selker E.U., Stevens J.N DNA methylation at asymmetric sites is associated with numerous transition mutations. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. P. 8114-8118.

277. Serrano M., Hannon G.J., Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. // Nature. 1993. V. 366. P. 704-707.

278. Shapiro H.S., Chargaff E. Studies on the nucleotide arrangement in deoxyribonucleic acid IV. Patterns of nucleotide sequence in the deoxyribonucleic acid of rye germ and its fractions. // Biochim. Biophys. Acta. 1960. V. 39. P. 68-82.

279. Shemer R., Birger Y., Riggs A.D., Razin A. Structure of the imprinted mouse Snrpn gene and establishment of its parental-specific methylation pattern. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 10267-10272.

280. Shen J.-C., Rideout W.M., III, Jones P. High frequency mutagenesis by a DNA methyltransferase. // Cell. 1992. V. 71. P. 1073-1080.

281. Shen J.-C., Zingg J.-M., Yang A.S., Schmutte C., Jones P. A. A mutant Hpall methyltransferase functions as a mutator enzyme. // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 4275-4282.

282. Simon D., Stuhlmann H., Jahner D., Wagner H., Werner E., Jaenisch R. Retrovirus genomes methylated by mammalian but not bacterial methylase are non-infectious. II Nature. 1983. V. 304. P. 275-277.

283. Singh J., Klar, A.J. Active genes in budding yeast display enhanced in vivo accessibility to foreign DNA methylases: a novel in vivo probe for chromatin structure of yeast. // Genes DeV. 1992. V. 6. P. 186-196.

284. Sinsheimer R.L. The action of pancreatic deoxyribonuclease I. Isolation of mono- and dinucleotides. II J. Biol. Chem. 1954. V. 208. P. 445-459.

285. Sinsheimer R.L. The action of pancreatic deoxyribonuclease II. Isomeric dinucleotides. II J. Biol. Chem. 1955. V. 215. P. 579-583.

286. Slack A., Cervoni N, Pinard M., Szyf M. Feedback regulation of DNA methyltransferase gene expression by methylation. // Eur. J. Biochem. 1999. V. 264. P. 191-199.

287. Smit A.F. The origin of interspersed repeats in the human genome. // Curr. Opin. Genet. Dev. 1996. V. 6. P. 743-748.

288. Smith S.S. Biological implications of the mechanism of action of human DNA (cytosine-5)methyltransferase. // Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 1994. V. 49. P. 65-111.

289. Smith S.S. Gilbert's conjecture: the search for DNA (cytosine-5) demethylases and the emergence of new functions for eukaryotic DNA (cytosine-5) methyltransferases. // J. Mol. Biol. 2000. V. 302. P. 1-7.

290. Smith S.S., Kan J.L.C., Baker D.J., Kaplan B.E., Dembek P. Recognition of unusual DNA structures by human DNA (cytosine-5)methyltransferase. II J. Mol. Biol. 1991. V. 217. P. 39-51.

291. Smith S.S., Kaplan B.E., Sowers L.C., Newman E.M. Mechanism of human methyl-directed DNA methyltransferase and the fidelity ofcytosine methylation. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. V. 89. P. 4744-4748.

292. Smith S.S., Niu L., Baker D.J., Wendel J.A., Kane S.E., Joy D.S. Nucleoprotein-based nanoscale assembly. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. P. 2162-2167.

293. Sneider T.W. The 5!-cytosine in CCGG is methylated in two eucaryotic DNAs and Mspl is sensitive to methylation at this site. // Nucl. Acids Res. 1980. V. 8. P. 3829-3840.

294. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. II J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-512.

295. Spencer V.A., Davie J.R. Role of covalent modifications of histones in regulating gene expression. // Gene. 1999. V. 240. P. 1-12.

296. Stancheva I. Caught in conspiracy: cooperation between DNA methylation and histone H3K9 methylation in the establishment and maintenance of heterochromatin. // Biochem. Cell Biol. 2005. V. 83. P. 385-395.

297. Stöger R., Kubicka P., Lin C.G., KafriT., Razin A., Cedar H., Barlow D.P. Maternal-specific methylation of the imprinted mouse Igf2r locus identifies the expressed locus as carrying the imprinting signal. // Cell. 1993. V. 73. P. 61-71.

298. Strahl K. Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. // Genes Dev. 1998. V. 12. P. 599-606.

299. Suetake I., Shinozaki F., Miyagawa J., Takeshima H., Tajima S. DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 27816-27823.

300. Surani M.A. Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance. II Nature. 2001. V. 414. P. 122-128.

301. Szyf M., Rouleau J., Theberge J., Bozovic V. Induction of myogenic differentiation by an expression vector encoding the DNA methyltransferase cDNA sequence in the antisense orientation. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 12831-12836.

302. Tamaru H., Selker E.U. A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa // Nature. 2001. V. 414. P. 277-283.

303. Tariq M, Paszkowski J. DNA and histone methylation in plants. // Trends Genet. 2004. V. 20. P. 244-251.

304. Tariq M, Saze H, Probst AV, Lichota J, Habu Y, Paszkowski J Erasure of CpG methylation in Arabidopsis alters patterns of histone H3 methylation in heterochromatin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 8823-8827.

305. Tasheva E.S., Roufa D.J. A mammalian origin of bidirectional DNA replication within the transcribed sequences of the Chinese hamster RPS14 locus. // Mol. Cell. Biol. 1994a. V. 14. P. 5628-5635.

306. Tasheva E.S., Roufa D.J. Densely methylated DNA islands in mammalian chromosomal replication origins. // Mol. Cell Biol. 1994b. V. 14. P. 5636-5644.

307. Tasheva E.S., Roufa D.J. Deoxycytidine methylation and the origin of spontaneous transition mutations in mammalian cells. // Somat.Cell Mol. Genet. 1993. V. 19. P. 275-283.

308. Tate P., Skarnes W., Bird A. The methyl-CpG binding protein MeCP2 is essential for embryonic development in the mouse. // Nature Genet. 1996. V. 12. P. 1469-1475.

309. Tatematsu K.I., Yamazaki T., Ishikawa F. MBD2-MBD3 complex binds to hemi-methylated DNA and forms a complex containing DNMT1 at the replication foci in late S phase. // Genes Cells. 2000. V. 5. P. 677688.

310. Teerawanichpan P., Chandrasekharan M.B., Jiang Y., Narangajavana J., Hall T.C. Characterization of two rice DNA methyltransferase genes and RNAi-mediated reactivation of a silenced transgene in rice callus // Planta. 2004. V. 218. P. 337-349.

311. Thayer R.E., Singer M.F., Fanning T.G. Undermethylation of specific LINE-1 sequences in human cells producing a LINE-1-encoded protein. // Gene. 1993. V. 133. P. 273-277.

312. Theiss G, Schleicher R., Schimpff-Weil R., Follmann H. DNA methylation in wheat. // Eur. J. Biochem. 1987. V. 167. P. 89-96.

313. Thomas X., Teillon M.H., Belhabri A., Rimokh R., Fiere D., Magaud J.P., Archimbaud E. Hypermethylation of calcitonin gene in adult acute leukemia at diagnosis and during complete remission. // Hematol. Cell Ther. 1999. V. 41. P. 19-26.

314. Tolberg, M.E. and Smith, S.S. (1984) Methylation of a middle repetitive DNA sequence class during differentiation in Friend erythroleukemia cells. // FEBSLett. V. 176. P. 250-254.

315. Tollefsbol T.O., Hutchinson C.A., III. Control of methylation spreading in synthetic DNA sequences by the murine DNA methyltransferase. // J. Mol. Biol. 1997. V. 269. P. 494-504.

316. Tollefsbol T.O., Hutchinson C.A., III. Mammalian DNA(cytosine-5)-methyltransferase expressed in Escherichia coli, purified and characterized. H J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 18543-18550.

317. Tornaletti S, Pfeifer G.P. Complete and tissue-independent methylation of CpG sites in the p53 gene: implications for mutations in human cancers. //Oncogene. 1995. V. 10. P. 1493-1499.

318. Toth M, Miiller U, Doerfler W. Establishment of de novo DNA methylation patterns. Transcription factor binding and deoxycytidine methylation at CpG and non-CpG sequences in an integrated adenovirus promoter. II J. Mol. Biol. 1990. V. 214. P. 673-683.

319. Tran R.K, Henikoff J.G, Zilberman D, Ditt R.F, Jacobsen S.E, Henikoff S. DNA methylation profiling identifies CG methylation clusters in Arabidopsis genes. // Curr Biol. 2005. V. 15. P. 154-159.

320. Tsukiyama T, Wu C. Chromatin remodeling and transcription. // Curr. Opinion Genet. Dev. 1997. V. 7. P. 182-191.

321. Tuck S.P, Crawford L. Characterization of the human p53 gene promoter. II Mol. Cell. Biol. 1989. V. 9. P. 2163-2172.

322. Tweedie S, Charlton J, Clark V, Bird A. Methylation of genomes and genes at the invertebrate-vertebrate boundary. // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 1469-1465.

323. Tyler J.K, Kadonaga J.T. The «dark side» of chromatine remodeling: repressive effects on transcription. // Cell. 1999. V. 99. P. 443-446.

324. Ueda H, Ullrich S.J, Gangemi J.D, Kappel C.A, Ngo L, Feitelson M.A, Jay G. Functional inactivation but not structural mutation of p53 causes liver cancer. II Nature Genet. 1995. V. 9. P. 41-47.

325. Van der Krol A.R, Mur L.A, Beld M, Mol J.N.M, Stuitje A.R. Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression. // Plant Cell. 1990. V. 2. P. 291-299.

326. Vanyushin B.F., Kirnos M.D. DNA methylation in plants. 11 Gene. 1988. V. 74. P. 117-121.

327. Vanyushin B.F., Lopatina N.G., Wise C.K., Fullerton F.R., Poirier L.A. Butylated hydroxytoluene modulates DNA methylation in rats. // Eur. J. Biochem. 1998. V. 256. P. 518-527.

328. Vaucheret H., Beclin C., Elmayan T., Fenerbach F., Godon C., Morel J.B., Mourrain P., Palauqui J.-C., Vernettes S. Transgene-induced gene silencing in plants. II Plant J. 1998. V. 16. P. 651-659.

329. Venkatachalam S., Shi Y.P., Jones S.N., Bradley A., Pinkel D., Donehower L.A. Retention of wild-type p53 in tumors from p53 heterozygous mice: reduction of p53 dosage can promote cancer formation. II EMBO J. 1998. V. 17. P. 4657-4667.

330. Vertino P. M., Yen R.C., Gao J., Baylin S.B. De novo methylation of CpG island sequences in human fibroblast overexpressing DNA (cytosine-5-)-methyltransferase. // Mol. Cell Biol. 1996. V. 16. P. 45554565.

331. Vinkenoog R., Scot R.J. Regulation of genomic imprinting in floering plants / In: Comparative Biochemistry and Physiology. Part A132. 2002. P. S170.

332. Vlasova T.I., Demidenko Z.N., Kirnos M.D., Vanyushin B.F. In vitro DNA methylation by wheat nuclear cytosine DNA methyltransferase: effect of phytohormones. // Gene. 1995. V. 157. P. 279-281.

333. Voinnet O. Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections. II Nature Rev. Genet. 2005. V. 6. P. 206-220.

334. Wade P. A., Gegonne A., Jones P. L., Ballestar E., Aubry F., Wolffe A.P. Mi-2 complex couples DNA methylation to chromatin remodelling and histone deacetylation. // Nature Genet. 1999. V. 23. P. 62-66.

335. Wainfan E., Poirier L.A. Methyl groups in carcinogenesis: effect of DNA methylation and gene expression. // Cancer Res. 1992. V. 52. P. 2071s-2077s.

336. Wakefield M.J., Keohane A.M., Turner B.M., Graves J.A.M. Histone underacetylation is an ancient component of mammalian X-chromosome inactivation. HProc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. P. 9665-9668.

337. Wassenegger M., Heimes S., Sänger H.L. An infectious viroid RNA replicon evolved from an in vitro-generated non-infectious viroid deletion mutant via a complementary deletion in vivo. // EMBO J. 1994. V. 13. P. 6172-6177.

338. Waterhause P. M., Graham M.W, Wang M.-B. Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. V. 95. P. 1395913964.

339. Wendel J.A., Smith S.S. Uracil as an alternative to 5-fluorocytosine in addressable protein targeting // Nanotechnology. 1998. V. 9. P. 297-304.

340. Wicki R., Franz C., Scholl F.A., Heizmann C.W., Schäfer B.W. Repression of the candidate tumor suppressor gene S100A2 in breast cancer is mediated by site specific hypermethylation. // Cell Calcium. 1997. V. 22. P. 243-254.

341. Wilke K., Rauhut E., Noyer-Weidner M., Lauster R., Pawlek B. Sequential order of target-recognition domains in multispecific DNA methyltransferases. II EMBO J. 1988. V. 7. P. 2601-2609.

342. Wilkinson, C.R., Bartlett, R., Nurse, P., and Bird, A.P. The fission yeast gene pmtl+ encodes a DNA methyltransferase homologue. // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 203-210.

343. Woo H.R., Pontes O., Pikaard C.S., Richards E.J. VIM1, a methylcytosine-binding protein required for centromeric heterochromatinization. // Genes Dev. 2007. V. 21. P. 267-277.

344. Wood W.B. Host specificity of DNA produced by E.coli:- bacterial mutations affecting the restriction and modification of DNA. // J. Mol. Biol. 1966. V16. P. 118-133.

345. Woodcock D.M., Crowther P. J., Diver W.P. The majority of methylated deoxycytidines in human DNA are not in the CpG dinucleotide. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 145. P. 888-894.

346. Woodcock D.M., Lawler C.B., Linsenmeyer M.E., Doherty J.P., Warren W.D. Asymmetric methylation in the hypermethylated CpG promoter region of the human LI retrotransposon. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 7810-7816.

347. Wu J., Herman J.G., Wilson G., Lee R.Y., Yen R.W., Mabry M., de Bustros A., Nelkin B.D., Baylin S.B. Expression of procaryotic Hhal DNA methyltransferase is transforming and lethal to NIH3T3 cells. // Cancer Res. 1996. V. 56. P. 616-622.

348. Wu J., Issa J.-P., Herman J., Bassett D.E.Ir., Nelkin B.D., Baulin S.B. Expression of an exogenous eukaryotic DNA methyltransferase gene induced transformation of NIH3T3 cells. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 8891-8895.

349. Wutz A., Smrzka O.W., Schweifer N., Schellander K., Wagner E.F., Barlow D.P. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island. II Nature. 1997. V. 389. P. 745-749.

350. Wyszynski M., Gabbara S., Bhagwat A.S. Cytosine deaminations catalyzed by DNA cytosine methyltransferases are unlikely to be the major cause of mutational hot spots at sites of cytosine methylation in

351. Escherichia coli. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. V. 91. P. 15741578.

352. Wyszynski M.W., Gabbara S., Bhagwat A.S. Substitutions of a cysteine conserved among DNA cytosine methylases result in a variety of phenotypes. // Nucl. Acids Res. 1992 V. 20. P. 319-326.

353. Xie S., Wang Z., Okano M., Nogami M., Li Y., He W.W., Okumura K., Li E. Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. // Gene. 1999. V. 236. P. 87-95.

354. Yang A.S., Shen J.-C., Zingg J.-M., Mi S., Jones P. A. Hhal and Hpall DNA methyltrasferases bind DNA mismatches, methylate uracil and block DNA repair. II Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 1380-1387.

355. Yebra M., Bhagwat A.S. A cytosine methyltransferase converts 5-methylcytosine in DNA to thymine. // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 14752-14757.

356. Yen R.W., Vertino P. M., Nelkin B.D., Yu J.J., el-Deiry W., Cumaraswamy A., Lennon G.G., Trask B.J., Celano P, Baylin S.B. Iisolation and characterization of the cDNA encoding human DNA methyltransferase. II Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 2287-2291.

357. Yoder J.A., Bestor T.H. A candidate mammalian DNA methyltransferase related to pmtlp of fission yeast. // Hum. Mol. Genet. 1998. V. 7. P. 279284.

358. Yoder J.A., Walsh C.P., Bestor T.H. Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. // Trends Genet. 1997. V. 13. P. 335

359. Yoshida M., Horiniuchis S., Beppu T. Trichostatin A and trapoxin: Novel chemical probes for the role of histone acetylation in chromatin structure and function. // BioEssays. 1995. V. 17. P. 423-430.

360. Zamore P. D., Haley B. Ribo-genome: the big world of small RNAs. // Science. 2005. V. 309. P. 1519-1524.

361. Zamore P., Tuschl T., Sharp P., Bartel D. RNAi: Double-stranded RNA directs the ATPdependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. // Cell. 2000. V. 101. P. 25-33.

362. Zhang X., Haswell S.J. Micro-fluidic and lab-on-a-chip technology. // Ernst. ScheringFoundSymp. Proc. 2006. V. 3. P. 21-37.

363. Zhang X., Jacobsen S.E. Genetic analyses of DNA methyltransferases in Arabidopsis thaliana. // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2006. V. 71. P. 439-447.

364. Zhang Y., LeRoy G., Seeling H.P., Lane W.S., Reinberg D. The dermatomyositis-specific autoantigen Mi2 is a component of a complex containing histone deacetylase and nucleosome remodeling activities. // Cell. 1998. V. 95. P. 279-289.

365. Zhou L, Cheng X, Connolly BA, Dickman MJ, Hurd PJ, Hornby DP. Zebularine: a novel DNA methylation inhibitor that forms a covalent complex with DNA methyltransferases. // J. Mol. Biol. 2002. V. 321. P. 591-599.

366. Zhu J.K. Regulation of ion homeostasis under salt stress. // Curr. Opin. Plant Biol. 2003. V. 6. P. 441-445.

367. Zilberman D., Cao X., Jacobsen S. ARGONAUTE4 control of locus-specifi c siRNA accumulation and DNA and histone methylation. // Science. 2003. V. 299. P. 716-719.

368. Zimermann C., Guhl E., Graessmann A. Mouse DNA methyltransferase (MTase) deletion mutants that retain the catalytic domain display neither de novo nor maintenance methylation activity in vivo. II Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 393-405.

Информация о работе

Шевчук, Тарас Валерьевич
доктора биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Структурно-функциональное исследование сайт-специфического метилирования ДНК эукариот - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы