Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль теломер и теломеразы в процессах клеточного старения и канцерогенеза

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль теломер и теломеразы в процессах клеточного старения и канцерогенеза"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А.ЭНГЕЛЫАРДТА

На правах рукописи

Егоров Егор Евгеньевич

РОЛЬ ТЕЛОМЕР И ТЕЛОМЕРАЗЫ В ПРОЦЕССАХ КЛЕТОЧНОГО СТАРЕНИЯ И КАНЦЕРОГЕНЕЗА

Специальность: 03.00.03 - молекулярная биология и 03.00.2S - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор A.B. Зеленин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

академик РАН Ю.В. Ильин

доктор биологических наук, профессор С.Г. Васеикий

доктор химических наук, профессор O.A. Донцова

Ведущая организация - Всероссийский онкологический научный центр

им. H.H. Блохнна Российской академии медицинских наук

Защита состоится^/ Лщ^ в на заседании

Диссертационного совета Д 0^2.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В.А. Эн гель гард та РАН

Автореферат разослан CUl&l -L 2003

года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических нау|

рнцын

ft ' (- у

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Тема исследования связана с канцерогенезом и старением - этим и определяется его актуальность. Известно, что тел оме раза активируется примерно в 85-90% опухолей. Она является самым общим раковым маркером. Сразу после ткрыгия теломеразы возникла идея лечить рак с помощью подавления теломеразы Во всем миро развернулись работы но поиску ингибиторов теломеразы, которые, к сожалению, до сих пор не привели к серьезным достижениям, пригодным для клинического исиолыования. Мы посчитали, чю в этих условиях было бы разумно изучить последствия подавления работы теломеразы в клетках, используя уже имеющиеся соединения, которые блокируют геломеразу, но не годны для лечения в силу разнообразных побочных эффектов В результате мы провели никл работ но долговременному блокированию функции теломеразы в разнообразных бессмертных клетках

Наши опыты с гетерокарионами привели к созданию системы, которая позволяет быстро и с минимальными затратами реактивов проверять ингибиторы теломеразы на клеточном уровне Используя современные системы скриниша и компьютерного моделирования, сравнительно легко получить июибиюр фермента, который будет работать в тест-растворе. Однако, тысячи соединений, подавляющих геломеразу в растворе, оказываются малоэффективными внутри клетки.

Человечество прогрессивно стареет. Одним из ведущих механизмов старения является но)еря клеток, которая не может бып> восполнена регенерацией. К потерям клеток гакже приводят травмы и огромное большинство болезней, связанных и не связанных со старением. Теломераза - это ферменг бессмертия, способный продлить пролиферацию клеток. Поэтому, как только представился случай поработать с геном теломеразы. мы воспользовались им и ввели ген каталитическою компонента теломеразы в фибробласты человека. Мы хотели сами убедиться в отсутствии отрицательных последствий геломеризацин, поскольку считаем, что временная экспрессия гепа каталитического компонента теломеразы может в будущем использоваться в клсточно-замеети1ельных терапиях.

Поиски тою, как связано клеточное старение со старением организма, подтолкнуло нас к изучению японских ускоренно стареющих мышей. Ускоренное старение мышей линии SA MPI очень напоминает естественный процесс. Благодаря небольшой продолжи 1елыюсти жизни мышей SAMP1, нам удалось в одном исследовании соединить изучение продолжительное!и их жизни и различные тесты на клетках, включая измерение теломеразной активности, теломер. пролиферагивнот о г loi снимала н времени переживания неделяшкхся клеток, что спало новым показателем, связывающим продолжительность жи лш с поведением клеток ш vitro

В процессе измерения теломеразной активности у нас возникали трудности с воспроизводимостью результатов измерения. При анализе данных выяснилось, что теломераз!гая активность сильно зависит от пролифератнвного статуса клеток, что послужило стимулом к независимому изучению пою вопроса В процессе разработки метода измерения теломеразной акч и к нос: и была обнаружена новая ДНК-поли меразная активность

При и)учении старения исследователям всетда хотелось иметь маркеры клеточного старения. В 1994 толу появилась статья о том. что якобы найден исклточительньтй маркер клеточиою старения. Мы, учитывая собственный onwi, усомнились в этом и провели специальное исследование, показавшее, чю эндо1енная Р-галактозидаза (рН 6) не является исключительным маркером старения клеток, а появляется в различных длительно нсдсляшихся клетках. .

I РОС, НАЦИОНАЛЬНАЯ ' БИБЛИОТЕКА -, j (.Петербург

ЗЛ0£>К

Цель работы и задачи исследования.

Основной целью нашего исследования было выяснение связи между им моргал ьнооью и теломеразной активностью. I лце в 80-е голы, при проведении опытов с гстерокарионами нами были получен!4 данные о качественных отлнчиях имморшгьных клеток Основными задачами исследования являлись oree г ы па следующие вопросы* I Чго пуле! с иммор1альиыми клетками, если подавить раГчлу гсломеразы?

2. Что будет с раковыми клерками, если подавить работу теломеразы''

3. Что будет, если в нормальных клежах начнеп работав 1сломераза?

4. Как связана 1еломеразная активность с пролиферацией клеток?

5. Существуют ли исключи re л ыше признаки клеточного старения?

6. Как связано оарснис клеток со старением организма?

7 Не связан ли ранее обнаруженнмй феномен реактивации ядер макрофаюв в гетерокарионах с работой теломеразы?

Научная новизна работы.

1 Впервые в мире с помощью подавления функции (еломеразы в иммортальных клетках нами показан феномен искусственного старения клеток

2 Впервые в России с помощью введения i ена ка1али1ического компонента теломеразы получены Неограниченно пролиферирующие, бессмертные клетки человека

3. За два юла до реального обнаружения геломерных нетель была создана модель петлевого строения геломерной ДНК,

4. Опровергнут мнение, что -»кспрессия чндогенной р-галаиозидазы (рН 6 0) является

исключительным признаком стареющих клеток. 5 Обнаружена тройственная корреляция между продолжительности житии мышей. нролифера1ивным потенциалом их фиброблаетов и временем переживания неделя щи хс я cocí ари вши хся клеток. Предложен iect изучения времени переживания неделящихся клеток, как инструмент изучения старения, дополнительный к и ¡учению нролиферативного потенциала.

6. Показано, что 1еломераза ответственна за реаюивацию ядер макрофагов в 1С1ерокариопах.

7. Создана модель, объясняющая поведение клеток во время кризиса, при котором в результате образовании сверхкоротких теломер. культура переходит в состояние, ко) да пролиферация и i нбедь клеток уравновешивают друг друга.

Практическая ценность работы.

I 15 процессе работы изучали последствия подавления теломеразы в опухолевых клегках человека Полученные данные могут быть использованы при разработке новых протоколов противораковой терапии с использованием ингибиторов теломеразы 2. Ьыли получены и охарактеризованы теломеризованные клетки. Возможно, в будущем временная экспрессия гена каталитического компонента iелочеразы в oeiKax человека позволит наращивав необходимое количество клеток для клеточной терапии. Вероятно, использование стволовых клегок лля -утих же целей потребует! дополнительной жспрессии iеломеразы в них, дабы избежать их с(арения.

3 В процессе рабош был испытан новый класс соединений - ингибиторов обратных транекриптаз и показаны их достоинства и недостатки. С помощью теста на гегерокарионах возможны испытания новых ингибитором 1еломеразы.

4. Методы измерения ¡еломеразиой активности и длины теломер, которые были освоены/разработаны в процессе данной работ, могут найти применение в клинической практике для диа) ностики и промюза опучолевых тболеваний и протероидных синдромов.

5 Предложен тест для оценки старения организма, основанный на времени переживания in vitro пелслящихс» клегок (фиброблас юв) ">тот гест может быть использован как дополни ¡ел ьный к изучению пролиферативпою потенциала (эффекта ХеНфлика). 6. Материалы диссертации можно использовать в учебном процессе.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на различных международных и всероссийских съездах, симпозиумах, совещаниях и семинара*, в том числе. "Структура и функции клеточного ядра" Шушино, 1984) и (Черноголовка 1987); "Макромолекулгj в функционирующей клегке" (Киев, 1984); "Генетика соматических клеток в культуре" (Звенигород, 1986); на ежегодных конференциях Американского общеава клеточной биологии (Сан Франциско, 1988, 1994, 1996 и Вашингтон 1995); Совещание "Клеточный цикл и дифференпнровка" (Либлине, 1989), 1-м съезде онкодоюв СНГ (Москва, 1996); на Московском семинаре "Хромосома1" 1998, Конференции Российской программы "Геном человека" (Черноголовка, 1999; Санкт Петербург, 2000); на Московском семинаре но клеточной биоло! ии 1999, 2000; Совещании "Био1ехнаЮ1ия в растениеводстве, животноводаве и ветеринарии" (Москва, 2000), на Всероссийском совещании "Клеточная биология на пороге 21 века" (Санкт-Петербур!, 2000); конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза» (Москва, 2001); Европейской школе по онкологии (Москва, 2001) и па конференции "Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении "(Москва, 2003)

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена истраницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка лиrepai уры. Работа содержит 87 рисунков и 16 таблиц, Слисок литературы состоит из 701 ссылки, из которых 40 на отечественные источники.

Список сокращений

AZT - ази доги мидии

ИОТ - ингибиторы обратных транскринтаз

"i АК - теломеразная активность

НПА - неспецифическая активность

УП * удвоения популяции

ЭФМ - эмбриональные фибробласты мыши

hTERT - ген каталитической субьединицы теломеразы человека

u-937, MeWo, Gal'i 2, ТК 164 - линии опухолевых kjisiok человека

SAM - японские ускоренно сгареюгцие мыши

ddC - дидезоксицитидин

ВВЕДЕНИЕ

Теломерами называют концевые участки хромосом, образованные теломерной ДНК и белками. Оказалось, что у человека и всех позвоночных iеломерная ДНК на всех хромосомах представлена в виде монотонного повтора TTAGGG, имеющего общую длину в тысячи оснований. Теломерная ДНК соматических клеток укорачивается нри пролиферации клеток, вследствие неполной репликации концевых участков (кошевой недорепликации) Укорочение 1е.юмер до определенного предела вызывает явление репликативного старения, когда пролиферация клеток останавливается. Пол ai этот, что репликативпос старение у человека служи! мошным барьером на пути развития рака. Нарушение механизмов решаикагивного старения (происходит в подавляющем большинстве случаев канцерогенеза) приводит к отмене телочерного контроля пролиферации, и клетки продолжают размножа1ься, несмогря на чрезмерное укорачивание, вплоть до полного исчезновения, тел оме р. В этом случае механизмы репарации ДНК пытаются предотвратить полное разрушение генома Сверхкороткие

)сломсры воспринимаются клегкой как разрывы хромосом Такие разрывы "чинятся" путем их соединения; происходят теломерные слияния II регулы а г е образуются хромосомы, имеющие по две центромеры. При прохождении через митоз динентрик. с большой вероя i нос i ыо. образует хромосомный мост, который разрешается случайным разрывом хромосомы Образуются две клетки' одна с нехваткой тспов, дру!ая с лишними копиями и с хромосомным разрывом Ютетка с нехваткой тенов обычно погибает, а с липшими копиями и хромосомным разрывом продолжает размножаться Последовательность событий "слинние-мосз -разрыв" многократно повторяется, генерируя па каждом rraiie новый генотип, состоящий из базового набора генов и некоторого меняющегося довеска. На каком-то этапе хромосомный разрыв может LLмечться'' и превратиться в теломеру Процесс "слияние-мос!-рафыв" приводит к многократному увеличению скороаи изменчивости клеток и в условия* орган и sm a (при наличии опухоли, вес которой обычно измеряется граммами) к очень быстрой селекции высокозлокачео венных и устойчивых к предложенной терапии клеток.

Явление концевой недорепликации и существование специальною фермента, ее компенсирующею, было предсказано в 197) г. Алексеем Оловниковым. В 1985 году 'этот фермент, получивший нашанис тсломеразм, был обнаружен в клетках простейшего Tetrahymena, а спустя несколько лег - в клетках большинства зукариот Оказалось, что фермент в полную силу работает в клетках половой гинни, надсч раивая их тел оме ри и, таким обраюм, обеспечивая клеточное бессмертие и возможность нашего существования. Незначительную активность теломераза проявляет в стволовых клетках и в ряде клеток иммунной системы, частично компенсируя концевую педорепл иканию. Активность теломеразьг появляется на корт кий срок в период интенсивной пролиферации (например, после встречи предшественника В-лимфоцита с антигеном)

Активацию фермента теломеразм обнаруживают в 85-90% всех опухолей человека На сегодняшний день по наиболее обгний маркер рака Фермент тепочераза обеспечивает опухолевым клеткам возможность безграничной пролиферации, чю в свою очередь предоставляет им время и, соответственно, возможность изменяться, выживать и захватывать новые пиши в организме Рели бы в процессе канцерогенеза не происходило акзивапии теломеразы, то клетки, в большинстве случаев, не смогли бы дожить до злокачественных стадий, и не было бы абсолютного большинства раковых опухолей.

Все клетки человека в раннем тчбрио!енезе обладают телом еразн ой активное) ью, которая по мере развития выключается во все большей доле клеток Человек устроен iаким образом, что клетки ортанизма. которым суждено много пролиферировать, сохраняю! о!раничеиную, временно индуцируемую, i ел оч срази ую активность Это потоляет, до какой-то степени, стабилизирован, хромосомы зтих клеток и уменьшить изменения, происходящие с возрастом Стволовые клетки и разного ранта клетки предшественники меняются с возрастом медленнее, чем но было бы при полном отсутствии тсломеразной активности. В подавляющем большинстве клеток человеческого организма происходит очень надежная репрессия геломеразы Это служит эффективным противораковым механизмом, которым обладают, видимо, крупные, долюживущие виды млекопитающих, включая человека При работе с клетками человека in vitro практически никогда не наблюл а км спонтанной активации тело «разы в нормальных клетках

Есть серьезные основания нола1ать, что медицина будущего будет во многом основываться на клеточпо-замеет и i елыгых технологиях Благодаря развитию цивилизации, население земною шара прогрессивно стареет. Продолжительность жизни людей сильно превысила ту, которая была выработана в процессе естественною отбора. 1 km ому естественные ресурсы человеческою 1ела оказываются недостаточными для нормальной жизни в возрасте, превышающем возраст людей каменного века (до 40 лет) В процессе С1арения происходит гибель клеток организма, которая не может быть воспо.шена регенерацией. Со временем потеря клеток приводит к ослаблению функций органов и тканей, уменьшению их надежности, развитию болезней, спя ганггых со

старением, и в итоге - к гибели opi аннзча Помимо собственно старения, любые болезни и травмы приводят к потерям клеток. Существуют и специфические болезни, выражающиеся в прогрессивной потере клеюк.

В 1998 г. впервые было показано, чю введение гена каталитического компопе!гта теломеразы способно им моргал изовать клетки человека т е. придать им способность проходить в культуре неограниченное число делений. Исследопагели не наблюдали при этом никаких побочных последствиН такой иммортализакии. Мм полагаем, что наиболее реалистичным подходом, позволяющим получать достаючное для кдеточно-заместитсльной ¡срании кол и ч ее i ко клеток, является временная экспрессия гена катали i ическо! о компонента теломеразы в клетках человека in vitro При этом теломераза будет удлинять теломеры, но не будет происходив iенегической модификации клеток. Такая процедура позволи! нарастить необходимую клеточную массу и провести в случае надобности генно-инженерную коррекцию дефекта Таким образом, клегочно-заместнтелыше технологии могут окаэаи.ся необходимыми и для генной терапии. При этом, основные операции по "лечению больных генов" будут производиться вне тела пациента с последующим введением клеток в организм

Регуляция теломеразы в opiaiiHíMe выработалась в эволюции как результат баланса двух тенденции- борьбы с раком и уменьшением последствий старения. Блокада 1еломеразы предотвращает рак, но уменьшав ношожггост клеток п роли фер и роватъ, что необходимо для продолжи тельной жили и; реактивация теломеразы открывает »о)можнос!н повысить регенерационные возможности opiаниэма, но увеличивает возможность ракового перерождения

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ДЛИТЕЛЬНОЕ ПОДАВЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ТЕЛОМЕРАЗЫ.

1.1. Изучение длительного подавления функции теломеразы в фибробластах мышн.

С целью проверки предположения л юм, тто укорачивание телом ер должно индуцирован? в кленах процессы репликагивног о старения, были проведены опыты по дол i овреме иному блокированию функции теломеразы в бессмертных клетках. Поскольку тело мера« являйся разновидное i ью обратных транскриптаз, било решено ис поль job л ь уже известные ипгибитры обратных транскрипта! (НОТ). Для начала надо было определить концентрации этих mhi ибиюров, коюрые не оказываю! значительною юксического действия

В первой серии экспериментов были определены максимальные концентрации иш ибиторов обратных гранскрипта!, которые нылыватш лишь незначительное подавление роста в длительных же и ери ментах Было установлено, что 3 мкМ азидотимидина (AZT), 20 мкМ карбовира или 100 мкМ дндеюксини] нднна (JJC) вызывают незначительное замедление poeta. Степень подавления роста не менялась в [ечение грех недель.

Чтобы исключить возможность! ого, чю НОТ подавляю! экспрессию теломеразы, мы исследовали влияние ИОТ на тел оме ражую активность (ГАК) при длительном культивировании клеток. Были взяты 4 клона спонтанно трансформированных фибробластов мышей СВА, а также клетки 3 ГЗ Swiss и N1H ЗТЗ. Клетки культивировали в присутствии ЙОГ в г ечение ipex ггедель. Достоверных изменений ТАК не происходило. Таким образом, было уешювлено. что ИОТ не подавляют экспрессию теломеразы.

Для оныюв но индукции "искусственною старения" первоначально использовали кле1ки клонов спонтанно трансформированных фиброблаетов СВ\, а также клетки 313 Но всех случаях (кроме ddC) собьиия ражинались следующим образом: скорость пролиферации постепенно уменьшалась, в культуре появлялись отдельные крупные

клетки, количество их нарастало П конце концов, через рамичные сроки, пройдя разное количество удвоений популяции (УМ), клетки переставали делиться полностью и длшельнос время переживали в мелел ищемся состоянии (1абл.1)

Поскольку продукт синтеза теломеразы (TTAG(jG)n не содержит цитидииа, сто аналог ddC не должен влиять на работу iсломеразы. Мы использовали ddC в качесiве отрипательиого контроля Клетки 3*13 N1H не меняли скорое)h роста и чорфоло!ню к присутствии ddC. по крайней мерс. 15 недель Напротив, клетки ЗТ1 Swiss очень быстро peai ировали на ddC быстрым снижением скорости роста и появлением морфологических изменений. Нрак| к чес к и во всех клетках появлялись выраженные перинуклеарпые включения. Пролиферация прекращалась полностью и клетки дегенерировали в течение недели. При ячене ddC на AZT после трех недель инкубации с ddC, токсические явления исчезали в течение нескольких дней, через две недели пролиферация восстанавливалась ло исходного уровня и в дальнейшем динамика процессов протекала также, как будто инкубации с ddC не было.

Таблица 1. Индукция "искусственного старения"

Появление Прекращение Переживание

Клетки Ингибиторы гигантских пролиферации неделя щ и хся

клеток* (пел, ( (нед.) клеток (нед.)

Клон №2 AZT 13 17 >4

ЗТЗ Swiss AZT 3-6 10-12 >4

ЗТЗ Swiss КарГювир 3-4 9-11 >4

ЗТЗ Swiss AZT+карбовир 2 7 >4

ЗТЗ Swiss ddC 2 3 1

N1H ЗТЗ А7Т 5-7 12-! 6 >4

NIH ЗТЗ Карбовнр 6-8 16-18 >4

NIH3I3 AZT+карбовир 2-3 9-10 >4

N1H ЗТЗ ddC - - -

Все тто свидетельствует о токсическом действии ddC на клетки, поскольку и морфологические и кинетические показатели действия ddC сильно отличаются, как от процессов естественном) старения, так и oi процессов, описанных при действии ЛЗТ и карбовира.

Отмена ИО! приводит к восстановлению пролиферации П кулыуре уже через 2-3 дня появляются митотические клетки. Резкое увеличение числа клеток, ситезируюшич ДНК в культурах, начинав с я на вторые сутки после отмены И01. Суючиая инкубадия клеток с П-[имидином чере! день после отмены И01 выявила, что все появляющиеся чиютические клеиси (было просчитано 226 клеток) мечены, чю IовориI о Юм, что под влиянием ИО'1 клетки останав.шваюкя в fit периоде к.имочпою цикла, также, как и ecieciBCHHO стареющие клетки (Stem and Dulic, 1995)

На сроках от 7 W lii дней после отмены ИО! были зарегистрированы 1игантскис мито(ические клетки (рис. 1)

Рнс. 1. Гигантская митотнческая клетка.

Наблюдения показали, что такие митозы /ишея много часов п клетки при тгом имеют неправильную форму. Стандартный кариологический анализ выявил, что в случае кулыуры ЗТЗ >ЛН 24% митотичсских клеток, полученных через 8 дней после отмены А7.Т, были полиплоидными, некоторые из них содержали свыше 300-600 хромосом. Можно предположить, что тги митозы возникают в клетках, длительно неделившихся под влиянием НОТ. Укорачивание тсломер в этих клетках изначально привело к индукции процессов, связанных со старением. После отмены НОТ тел оме раза продолжала функционировать, наращивая теломеры. Когда (еломеры достигали некой кри I и чес кой величины, в клетках запускались программы прохождения клеточного цикла, которые видимо, не могли нормально реализоваться.

Образовавшиеся в процессе "искусственного оарения", 01рсчные клетки обладаю! сильно развитой, структурированной цитоплазмой, которая, видимо, препятствует цитокинезу Через несколько дней после отмены ИОТ кул в 1 ура обогащаем я большим количеством двуядерных клеток, затем образуются «летки с очень большими ядрами, содержащими десятки ядрышек И только затем появляются гигантские митотическис клетки. Потгому мы не можем утверждать, что в результате "искусственного старения" образуются полиплоидные клетки Скорее всею, они образуйся после отмены ИОТ, В процессе возврат к пролиферации.

При длительном (свыше 5 месяцев) культивировании клеток клона 4, (спонтанно трансформированные эмбриональные фибробласты мышей СВА) в присутствии различных концентраций карбовира ([5. 20 мкМ) были получены устойчивые к нему кле!ки Они очень быстро росли в лрисутожии 20 мкМ карбовира и скорость их пролиферации не увеличивалась при отмене последнего. Анализ 1АК выявил ее режое повышение до 12 усл. ед,. Поскольку вероятность случайного увеличение ТАК в клетках одновременно с приобретением устойчивости к карбовиру невелика, мы пола!аем, что именно повышенная ТАК делает клетки относительно устойчивыми к ИОТ.

1.2. Изучение влияния длительного подавления функции теломеразы в миобластах крысы

Опы1ы с делящимися скелетными миобластами крысы 1.6 проводили в присутствии 5мкМ Л ¿Т. Примерно через месяц культивирования в культурах стали появляться большие клетки, количество их росло, они укрупнялись, рост кулыуры замедлялся, в

Рис. 2. Клетки Ь-6 в процессе искусственного старения, "Перья". Фазовый контраст.

к-oiiric (torшоп, примерно черсч два с ночовитюй месяца культура в основном состояла из крупных неделящихся клеток Слимоненным отличием их от стареющих фибробласюв была морфология клеток (рис. 2).

Подавляющее большинство клеток имаго очеш. яркие морфологические особенности. Уже на ранних стадиях в клетках происходило усиленное развитие питоскелета, нитоскелстные волокна поляризовались, собираясь в крупные пучки вочокон. Н цитоплазме появлялись множественные округлые власти просветления. Позже уже в более крупных клетках появлялись хорошо организованные структуры, напоминающие "перья". Размер отдельных клеток дос(игал 0,8 мм. Подавляющее большинство к.ieiок было одноядерными Для образование таких крупных клеток требовалось, по крайней мере, две недели пребывании в неделягнемся состоянии

Трансфекция крысиных миобластов линии Т 6 путем введения гена рецептора фактора роста фибробластоя 1(1 (FGF-1 р) приводит к ускорению роста и увеличению плотности клеток в монослос. Клетки округляются, уменьшается их )ависимость ог сыворотки Они теряют способность к дифференцировке. При длительном культивировании зтих клеток в присутствии азидотимилина (5мкМ) не происходило существенных изменений в морфологии клеток Начиная с четвертой недели кулыинирования рост культуры сильно замедлился. Появилось mhohi клеток, содержащих микроялра, многие клетки содержали повышенное количество вакуолей. Замедление роста кулыурьг происходило прежде всего «i счет увеличения числа мертвых клеток, при ттом читотическая активность культуры сохранялась на высоком уровне в течение двух недель, после чего вся культура ггт ибла.

1,3, Изучение влияния длительного подавления функции теломерязм в опухолевых клетка* человека.

Оныгьг с клетками (Г-9"?7 (суспензионная культура опухолевых промислопитарных к-те ток человека) проводили в присутствии t и 2 чкМ Л/1 Наблюла.!« замедление пролиферации клегок после трех педель культивирования Увеличивалась лоля прикрепленных клегок, иали появляться клеточные aipei агы, содержащие десятки клеюк Многие клетки погибали, но пролиферация полностью не прекращалась Примерно через 5 мес. культивирования рост ку.гыурьт ускорился, морфологии клегок

время (дни)

Рис. 3. Кинетика роста клеток 1!-937 в присутствии азидотимидина.

Опыты е клетками Мс\Уо (высокозлокачественная меланома человека) проводили в присутствии 4 мкМ Д2Т. Через ) мес. наблюдали замедление пролиферации; через 2 мсс. скорость роста культуры резко замедлилась, размер популяции оставадся постоянным в течение 3 тгед. В культуре одновременно наблюдали пролиферацию и гибель клеток.

Размер кле-тк изменялся незначительно. Появлялось много на г сто к с чикроядрами После тгого пролиферация восстановилась поч ги до исходного уровня

Средняя длина телом ерных повторов в клетках и-937 за 6 мес. культивирования в присукпвии I мкМ Л/1 уменьшилась на 8 тп.н , а в клетках МсШо за 2 мес. культивирования средняя длина геломерных повторов уменьшилась примерно па I г.п и

Аналогичные эксперименты были проведены с клетками двух линий почечных карцином человека Сак! 2 (в присутствии 15 мкМ А7Т) и ТК1Й4 (в присутствии 20 мкМ А2Т). Эти клетки были выбраны нами из 12 линий почечных карцином человека как клетки, обладающие наибольшей теломеразной активностью. При ,тли гель ном культивировании в присутствии А2Т наблюдали лишь временное незначительное замедление пролиферация, после чего рост нормализовался. При ттом, я случае клеток ТК164, средняя длина теломер уменьшилась на 1500 нуклеогилов (30 нуклеотидов на деление). В клетках Сак! 2 изначальная длина теломер была очень чалой (в среднем 3 т.п.н,) и никак не изменилась на протяжении 40 удвоений популяции в присугс1вии АXV

1.4. Долговременное блоки ронян не функции тел оме разы в теломеризо ва нн ых (с введенным геном ЬТЕКТ) клетках человека (см. также раздел 7).

С помощью введения !ена ИТЕКТ в нормальные фибробласты кожи человека были получены клоны имморталкных клеток, обладающих теломеразной активностью. Котки культивировали в присутствии 20 мкМ А7.Т II течение примерно месяца мы не наблюдали достоверных различий в скорост и пролиферации клеток с А2Т и без него, 1 !ри этом, уже чере) 2 недели мы зафиксировали существенное укорачивание теломер, примерно на 1-2 т.п.н .(рис. 16. раздел 7).

Через месяц пролиферация клеток с А7Т плавно замедлялась. Клетки укрупнялись, морфология культуры переставала быть регулярной, степень распластывания к.гстк росла, они приобретали неправильную форму (рис.4).

Клетки сохраняли жизнеспособность, они содержали одно ядро нормального ра}мера. Культура пол [гостью напоминала стареющую Митотические клетки практически отсутствовали. Примерно через месяц такого "искусственного" старения во флаконах появлялись отдельные пролиферируюшие мелкие клетки. Через некоторое время пролиферация культуры восстанавливалась до исходного уровня. Крупные неделящиеся клетки вытеснялись мелкими.

Рис. 4. Искусственное старение теломернзоваиных клеток (клон 16081еГ7) в

присутствии А2Т.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕ1УЛБТАТОВ ПО ДЛИТЕЛЬНОМУ ПОДАВЛЕНИЮ ФУНКЦИИ ТЕЛОМЕРАЗЫ

В наших опытах длительное блокирование функции геломеразы азидожмидином и карбовиром вызывало искусе ( венное старение бессмерт иых фибробласюн мыши, миоблаетов крысы пинии 1.6 и теломеризоваппых клепок человека Однако, аналогичное воздействие приводило в состояние кризиса опухолевые клетки человека I 1-937, MeWo, Cafci 2, ТК164, а также трансформированные миоблас ты крысы про гиоо речи высланные могут быть объяснены на основе гипотезы Ml'M2 (Wright & Shay, 1992) Согласно )юи I нпотезе по исчерпании пролиферат ивнот о потенциала в клетках запускается механизм Ml Результирующий процесс мы называем реплика тивным старением или пределом Хейфлика Репликативное старение характеризуется снижением пролиферат иннот о ответа на стимуляцию факторами pocra hi сыворотки появлением вну|риклеточпых ингибиторов сии i с за ДНК и остановкой клеток в fil периоде

Некоторые изменения внутриклеточной рефляции, которые инлуиируготся большим Т-антигеном вируса SV40 или антигенами Е6/Е7 вируса HPV-16 moi yi инактивировать или обойти механизм Ml, позволяя клеткам je л и i ься далее, до момента, когда индуцируется совершенно независимый механизм М2, вызывающий кризис Кризис происходит после прохождения большего числа делений, чем старение. Кризис - это состояние, при котором количество клеток в популяции сохраняем или уменьшается, поскольку продолжающиеся клеточные деления сопровождаются гибелью клеюк Редкие события инактивации механизма М2 приводят к выходу из кризиса и образованию бессмертной клеточной линии Продолжающаяся потеря теломерноИ ДПК ;ю кризиса и стабилизация ;игины тс л о мер после ичмортали кшии указывают на участие геломерачы или альтернативны* механизмов поддержания длины icjioMep в выходе m кризиса

ИНДУКЦИЯ ИСКУССТВЕННОГО СТАРЕНИЯ.

Бессмертные мышиные фибробласты линий ТП Swiss или NIH 1Т1 часто называют минимально трансформированными клетками. По сути, ли клетки являются спонтанными трансформантами эмбриональных фибробластов мыши ОФМ> и могуч рассматриваться, как нормальные фибробласты мыши с реактивированной теломеразом. Блокирование функции теломеразы в таких клетках вслст к укорачиванию тсломер и к индукции сохраненного клетками механиîmj Ml. кторьтй снова блокирует кле1ки в 01 Возможно, именно ни собмшя происходили в культуре бесе мергных фибробластов мыши, в миобластах крысы и втеломеризованных клетках человека.

Обратимость и н дун и ро ванного MOI старения ле(ко обьяснима. Известно, чю в кле1ка>! человека теломеразная активность не зависит от стадии клеючното цикла, а мышиные клетки 1Т1 Swiss обладают геломеразной активностью, по крайней мерс, первые 5 дней после выхода из клеточного цикла. I 1отт ому при отмене ИОТ теломеразная функция в неделящихся клетках восс i анавл и вается, что ведет к удлинению теломер. отмене механизма Mi и последующему восстановлению npo.iиферапии. Ьольшие клс-i ки, сформировавшиеся во время искусе г венного старения, имеют хорошо развитую структурированную цитоплазму, которая прспяicibjci нормальному цитокинезу Синтез ДНК в отсутствие цитокинеза ведет к образованию двуядерных клеток, которые имеют шансы стать полиплоидными Такие полип юидные клетки дают начало гигантским миютическим клеткам.

ОСОБЕННОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА,

Большинство человеческих клеток теряю! способность к репликашвному старению в процессе канцерогенеза. Насколько нам ишестно, бессмертные клеiки человека в культуре появляются только после продолжительною пребывания в состоянии кризиса (Shay et al, 1991 a; Rubeij, Pereira-Smith, 1994) (исключение составляет случаи

телом еризации клеток человека). Сшласмо гипотезе М1/М2, механизмы реплика] и им ого старения в кризисных клетках инактивированы.

При таком, с нашей точки зрения наиболее частом сценарии, искусственное укорачивание теломер опухолевых клеток, которое происходит при подавлении функции теломеразы, должно возвращать клетки на стадию канцерог енем, предшествую! ну го реактивации теломеразы. Регуляция роста в таких клетках нарушена, что необходимо для начала опухолевого роста, они имеют разрушенные или инакгивированные механизмы реп л и кати в ного старения и поэтому не способны входи1ь в это состояние

ТЕЛОМЕРИЗОВАННЫЕ КЛЕТКИ, В ОТЛИЧИЕ ОТ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА СОХРАНЯЮТ МЕХАНИЗМЫ СТАРЕНИЯ.

Мри кулы ивировании теломеризоваштых иммортальных клеток человека в присутствии АГТ, через 25УП мы наблюдали длительную задержку пролиферации. Клетки постепенно укрупнялись, становились сильно распластанными и приобретали морфоло1ию стареющих. Они были способны переживать в неделя!немея состоянии длительный срок {но крайней мере месяц) без потери жизнеспособности Задержка ич пролиферации в результате инкубации с КТЛ вероятно объясняется появлением в клетках чересчур коротких теломер За две недели культивирования с \ЪТ (примерно 14 УИ) средний размер теломер снижается на 1-2 иг н Это значит, что скорость укорачивания составляет около 100 п п. на деление, что соответствует скорости иедореп л икании у фибробластов человека. Скорее всего, этой скорости укорачивания достаточно, чтобы через месяц в клетках появились отдельные критически укороченные теломеры По всем этим критериям культура клеток приходила в состояние искусственного старения

Таким образом, тсломеризованные клетки коренным образом отличаются от всех исследованных опухолевых клеток человека по ответу па подавление функции теломеразы. "Эти клетки переходят в состояние искусственного старения, но не кризиса. Те ломеризо ванные клетки человека имеют сходство ео спонтанно им моргал изо ванными клетками грьнунон в гом, чю в обоих случаях активация теломеразы происходит в практически нормальных клетках с ненарушенным и механизмами репликативного старения.

КРИЗИС (М2).

Наиболее вероятно, что в ходе укорачивания теломер при подавлении теломеразы в опухолевых клетках человека происходят события, напоминающие кризис. Мы не смогли вызвать процесс искусственного старения в опухолевых клетках человека Те клетки, которые все-таки останавливали свою пролиферации при действии ИОТ, не претерпевали существенных морфологических изменений и не увеличивали своею размера. Такие неделяшиеся клетки были неспособны к длительному выживанию.

Для объяснения длительною равновесия между клеточной гибелью н размножением клеток во время кризиса мы предложили следующую гипотезу. Кризис начинается, когда отдельные, самые к0р01Кие юломеры полностью исчезают Дальнейшее укорачивание прямо или косвенно ведет к потерям ]енетического материала, несовместимым с жизнью клетки Вследствие очень широкого распределения I ел ом ер по длине, в любой момент в клетке существует самая корткая ¡еломера 'Ута самая короткая теломера может определять судьбу клетки Процесс репликации такой теломеры приводи! к образованию полной и укороченной копии (Рис-. 5).

Клетка с укороченной копией умирает, в то время как другая клетка продолжает размножа(ься. Процесс повторяется до тех пор. кока следующая геломера станет чрезвычайно короткой. Тогда равновесие между гибелью и размножением нарушается: только одна из четырех клеток продолжает размножение I олько если клеIка приобретет механизмы удлинения теломер, она может выйти из кри шса.

критически укороченные

Рнс. 5. Гипотеза, объясняющая поддержание размера популяции во время кризиса.

ЧАСТИЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА МИОБЛАСТОВ КРЫСЫ.

II клетках L6 при прекращении пролиферации происходят два параллельных процесса: процесс, напоминающий ciapcimc фибробласюв и специфичным для миобластов процесс. Неделящееся состояние клепки должно способствовать проявлению любых признаков дифференцировки, но тому что в этом случае они не "разбавляются" клеточным делением I'asBHTHe хорошо выраженною цитоскелета и появтение "перьев" можно рассматривать, как процесс, связанный с дифференциронкой, происходящей в необычных условиях и поэтому приводящей к появлению необычных клекж. Возможно, такие, напоминающие дифференнировку процессы, мог у г быть индуцированы в различных кле!ках с помощью искусовенною старения или дру!ими факюрами,

УСТОЙЧИВОСТЬ К ПОДАВЛЕНИЮ ФУНКЦИИ ТЕЛОМ ЕР А1Ы.

Особый интерес представляют случаи очень высокой ТАК (ТАК повышена в 3 и более раза, по сравнению со средним уровнем). Клетки с таким уровнем ТАК становятся резипешными к И01 и появляются обычно после продолжительного культивирования.

Механизм усюйчивости к И01 за счет увеличения ТАК пред пола! ает механизм удаления последнею теломерною нуклеотида Только при таком условии телом ¿раза может удлинять геломеры в присуте1вии 1ерминируюн1их нуклеотидов, mttoiокра!но начиная синтез Извесию, что теломеразы простейших и дрожжей обладают 3' зкзонуклеазной активностью (Collins & Greidcr, 1993, Bcdnenfco et al, 1997; Cohn & Blackburn. 1995); кроме того, известно, что даже н отсутствие ¡еломеразы может происходить зависимая от клеточною цикла деградация геломер (Wellmger el al, 1996) Все Tio може1 объяснять замещение послед не г о нуклеотида и служить фактором, способствующим появлению устойчивости

Существует много различных механизмов устойчивости к ингибиторам теломеразы. В наших экспериментах с опухолевыми клетками человека резииеншость появлялась после 80-160 дней культивирования в присутствии AZT и не была связана с увеличением геломеразной активности. Принимая но внимание сравнительно чалое количесто клеток в наших экспериментах (около 1 мт), можно заключим», чю в случаях опухолей, вес которых практически всеита итмерястся граммами, резистентность к ингибиюрам должна вошикать очень быстро .

2. СПОНТАННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ

Известно, чго клетки грызунов обладают выраженной способностью к спонтанной трансформации, меняющей их пролифера1ивный потенциал. Образующиеся при лом клетки, в отличие 01 исходных, обычно им моргал ьны

В начале наших экспериментов мы решили узнать, сопровождается ли спонтанная трансформация реактивацией 1еломеразы Образование первых двух исследованных клонов спонтанных транс формантов эмбриональных фиброблаа ок мышей (ЭФМ) СБА сопровождалось появлением теломеразной активности. После зтою возникла мысль о том, что долтовременное блокирование функции теломеразы в культуре ЭФМ должно подавлять сам процесс спонтанной трансформации. Были проведены опыты по длительному культивированию ЭФМ в присутствии интибиюров обратных транскриптаз: кТЛ, карбовира и ¿¿С

Спонтанные транс форманты, полученные без НОТ, либо в присутствии ск!С (неашивпый по отношению к теломеразе нуклеошд), на всех этапах роста, которые мы мотли изучать (начиная с 1 млн клеток) имели среднюю или повышенную ТАК, Исключение составил только один клон без ТАК, обладавший ограниченным пролиферативным потенциалом. В то же время, трансформанты, полученные в присутствии А2Т или карбовира, на начальных этапах роста (до 30 УП) были .мшены ТАК (рнс.6)

теломеразкая

уровень удвоения популяции

Рнс. б. Теломерязная активность спонтанных трансфорчантов. Темным обозначены клоны, появившиеся в присутствии ингибиторов обратных транскрнптаз, светлым -обычные клоны. Линии соединяют одноименные клоны.

Таким образом, в условиях блокирования функции телом Срази спонтанная трансформация имеет место, но она идет другим путем - без повышения теломеразной активности.

Судьба клонов спонтанных трансформа кто в.

Все клоны, образовавшиеся в наших опытах, как в нриеу1С1вии ИОТ, так и без них, можно разделить на две труппы' обладающие ограниченным пролиферативным потенциалом и имморгальные В силу ограничений метола, точное количество

короткоживуших клона и установить не удалось, но ясно, тго клетки большинства клонов имеют потенциал удвоений менее 20 УП Было получено 9 клопов, прошедших от 20 до 25 УП, и три клона, прошедшие от 25 до 30 УП.

Клопы, перешагнувшие рубеж 30 УП, всегда в наших опытах проходили более 50 УП без изменений в скорости роста и морфологи. На начальных этапах исследования пять клопов кулынвировали до 100 УП и далее, в дальнейшем, клоны замораживали па стадиях 60-70 УП. 1аким образом, было установлено, что пролифера(ивный потенциал спонтанных грансформантов меняется дискретно' либо он меньше 30 УП, либо - более 100 УП (видимо бесконечен)

Рост клетк клонов с ограниченным пролиферативным потенциалом, поначалу бурный, за несколько УП до остановки размножения клегок плавно замедлялся, клаки увеличивались, появлялись очень крупные, распластанные клетки. Вообще, поведение клеток и их морфолошя были сходны со стареющими. Образовавшиеся педелящиеся кле1ки длительное время переживали в неделяшемся состоянии, проходя при пом весь цикл морфаклических изменений, харамерных для старения в культуре. Принимая во внимание то, что спонтанные трансформанты Г_)ФМ СНА возникают, в юм числе, и и5 длительно (два - три месяца) поделившихся клеток в составе стареющих культур, следует полагать, что старение спонтанных трансформанIов с ограниченным нролиферашвным потенциалом происходит повторно.

Измерения юломеразной активности (ТАК) в клопах с о1раниченним пролиферативным потенциалом, как и ожидалось, показали 01су)ствие ГАК

ОБСУЖДЕНИЕ ОПЫТОВ ГО СПОНТАННЫМИ ТРАНСФОРМАНТАМИ

Мы показали, что существуют различные пути спонтанной трансформации: с активацией теломеразы и без нее. Г) условиях отсутствия ингибиторов обратных транскритпаз для клеток мыши в культуре характерен путь, при котором первым этапом является реактивация теломеразы. В присутствии ингибиторов существенное значение приобретает более редкий путь, к01 да первым этапом не является реактивация теломеразы.

Из изложенных данных весьма существенным нам представляется то, что в ряде случаев, при образовании спонтанных грансформантов, происходит увеличение пролиферативного потенциала клеток на величину до 30 УП, а также то, что при спонтанной трансформации наблюдаются случаи повторного старения клеток.

3.ГИПОТЕЗА ПЕТЛЕВОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ТЕЛОМЕР

Основу гипотезы составляет ответ на вопрос, каким образом укорачивание гслочер вызывает клеточное старение'' Несмотря на бурное ра)витие в последнее время науки о теломерах и тсломеразе, исследователям не удается объяснить механизм связи между укорачиванием тело мер и остановкой пролиферации клеток.

В 1997 году нами была предложена гшкиеза петлевою ст-роения ДНК (LropOB и др., 1997а), однако тогда еще не были сделаны опыты па бестеломеразных мышах и не была опубликована pa6oia (Gnffits et а), 1999) об обнаружении теломерпых нетель. Тти работы позволили нам значительно yupoci ить нашу модель.

Поскольку ДНК из внутренних районов хромосом обрату ci петли, и ян петли moi vt быть использованы клеткой для быстрот обнаружения разрывов ДНК, мы предположили, что теломерная Д) [К также м о лее г обраювывать петли Разница состоит в размерах. Сели внутренние петли имеют длину в соти тысяч нуклеотидов, го i ел «мерные петли должны иметь длину примерно в несколько шсяч нуклеотидов.

теломерныи повтор

теломер-евязывающие белки

фНЫИ ^

ядерный матрикс

/......./ К

!( i '••»и

\

прнтшю мерная ДНК

V* неправильная : " конформация : Х ДНК (сигнал повреждения)

Рис. 7. Гипотеза петлевого строения теломер. Тело мерная ДНК вместе с теломер-свнзываюшимн белками и ядерным матрнкеом может формировать петли. ДНК в петле имеет напряженную ко к форма шт. При укорачивании теломерной ДНК вследствие недорепликации, наступает момент, когда длина теломерного повтора не позволяет образоваться петле. Тело мерный конец ДНК приобретает свободную конформацню, которая воспринимается клеткой, как сигнал повреждения. В результате запускаются механизмы кле (очною старения.

По предложенной гипотезе (рис. 7), клеточное старение возникает в клетках, когда длина теломерного повтора уменьшается до такой степени, при которой становится невозможным образование котя бы одной петли. Oí дельные теломеры, не образовавшие петлю, являются источником си i нала, останавливающего пролиферацию. В тгом случае изменение пнут ри клеточной передачи сш нала способно восстанови гь пролиферацию, если сигнал будет отменен или ослаблен. Однако пролиферация в этом случае будет ограничена длиной одной петли. При полном исчезновении теломерного повтора свободный конец ДНК превращается в обычный хромосомный разрыв, что приводит к попыткам его репарации, запускается механизм слияние-мост-разрыв и тл. Это ведет к состоянию кризиса

1 FcjiH принять, что длина петли составляет 2-4 т.п.н., а м один клеточный чикл происходит укорачивание тсломер на 100 п.н., то длины одной петли хватит па 20-40 делений. Именно ними цифрами ограничивалась пролиферация спонтанных ¡раисформантов клеток мыши с ограниченным пролнферагнвным но1ентшалом в наших опытах. Примерно в ггих же пределах лежит увеличение нролиферативпого потенциала клеток человека при вменениях внуфиклег очной регуляции, вьиванных экспрессией Т-1>и i ш сна SV-40, au по снов ЫЛ и LIB аденовируса, ашженов вируса папилломы (Wright and Shay, 1992), при блокировании pRh и р53 (Shay et al, 1991; Нага et al, 1991) Во всех этих случаях происходит отключение механизмов клеючно! о аарения путем блокирования сиг пала от слишком коротких 1еломер.

2 I ипотеза объясняет опыты по гипер- и iипоэкспрессии 1КГ1, TRF2, TIN2 и других теломеросвязывеющих белков (Ludcrus et al, 1996, Zhong et al , 1992, Chong et al, 1995; Van Stccnsc! and de l^nge, 1997; Smogorzewska et a!, 2000; Rubio et al, 2002; Li et al, 2000) Теломеросвязываюнше белки участвуют в складывании i еломерной петли. При увеличении количества мест связывания le.ioMcpiwiо повтора должна происходить стабилизация теломерной структуры при более коротких геломерах и наоборот, потребуемся более длинный 1еломерпый повтор, чтобы организовать петлевое строение при уменьшении количества мест связывания.

4. ТЕЛОМЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ПРИ ИЗМЕНЕНИЯХ ИХ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО СОСТОЯНИЯ

4.1. Диффереицировка клеток I1L-60 и 11-937.

При индукции ди фферен ни ровки в клетках U-937 с помощью ГФА чере! двое суток наблюдали снижение доли ешмезируюших ДИК клеток, к третьему дню процесс ускорялся н 4cpej неделю клеток, синтезирующих ДНК, оставалось около 0,5% Происходил резкий рост числа прикрепленных клегок и клеток, имеющих маркеры, характерные для дифференкнровки макрофагов.

ТАК начинала резко снижаться уже в первые сутки процесса лифференпировки и через 3 дня ее значения приближались к 0. При дальнейшей инкубации клеток U-937 с 1ФА происходило незначительное увеличение ТАК до одной трети от исходного уровня. При удалении ТФА через 7 cyi ТАК медленно возрастала. При дифферент»ровке клегок Ш -60 IАК быстро снижалась, достигая нулевого уровня, уже через два дня

4.2. Переход клеток ЗТЭ Swiss в покой и выход из него,

11ри переводе клеток ЗТЗ Swiss, в покой с помощью лишения сыворотки пролиферагивная активность клеток довольно быстро снижалась и, через три дня, не более одною процента клеток включали меченый тимидин 1АК плавно снижалась до нулевою уровня к 7 сут покоя. После стимуляции клеток сыворогкой ТАК и уровень включения тимидина возрастали синхронно, н(¡специфическая полимеразная активность (HI LA) возрастала с незначительным опозданием (рис К) При культивировании клеток ЗТЗ Swiss в условиях высокой клеточной плотности (контактное торможение) в течение 6 сут наблюдали незначительное снижение IAK (на 25-40%); при тгом уровень синтеза

ДНК уменьшался значительно (до 5-10%), т.е. на 75-88% %

время (дни)

Рис. 8. Переход в пролнфератнвнмй покой и выход из него клеток ЗТЭ Swiss. Первые 8 дней клетки инкубировали в присутствии 0,25% сыворотки, далее с 10%

сыворотки.

4.3. Длительное воздействие азидотимндина на клетки LI-937.

При проведении опытов но индукции искусствен)тою старения с помощью AZT. нами был обнаружен эффект временной задержки пролиферации клеток 11-937 После примерно 25 удвоений популянии к.1еюк 1J-937 в присутствии t или 2 мкМ AZT клетки резко замедлили пролиферацию, появились крупные атрегагы клеток, состоящие hi десятков Kjiei ок ТАК и НПА резко снизилась

I(осле длительного периода медленною роста клетки постепенно возобнови ж пролиферацию При згом ТАК и ППА увеличились. В одном из субклонов пролиферация

ускорилась, чю сопровождалось еще большим увеличением ТАК и НПА, достигшими уровня контрольных клеток, растущих 6ej AZT

ОБСУЖДЕНИЕ СВЯЗИ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ С ПРОЛИФЕРАТИВНЫМ СТАТУСОМ

Изменения "IЛК изучали при трех различных способах перехода клеток в неделя щееся состояние ">ю индукция дифференцировки, переход в пролиферативный покой, а также долговременное подавление функции теломера;ы, приводящее к значи!е.1ьном> замедлению пролиферации.

Во всех описанных случаях наблюдали хорошую корреляцию между ТАК и уровнем пролиферации 'îto согласуется с литературными данными об уменьшении ТАК при дифференцировке (Sharma et а), 1995; Zhang et al, 1996; Savoy iky et al, 1996, Reichman et al, 1997) и при переходе в покой в результате сывороточно1 о голодания (Holt et al, 1996)

Изменения ТАК в соответствии с пролиферагивным состоянием клеток известны для многих типов к. 1erок (Belair et al, 1997; Kataktira et al, 1997; Saito et al, 1997; Kyo et al, 1997; Ramirez et al, 1997) Значение такой регуляции понятно: непропнферирующие клетки не нуждаются в защите от иедорепликации, к детки, выходящие из неделящегося состояния, нуждаются в ТАК для уменьшения потерь теломерной ДНК. При возобновлении репликации в процессе дедиффереицировки и при выходе из состояния нокоя рост ТАК в налшх опытах опережал рост доли синтезирующих ДНК клеток.

Скорость уменьшения ТАК при дифференцировке HL-60 и U-937 происходит быстрее, чем пассивный распад фермента Из этот следует, чю при дифференцировке HL-60 и U-937, в отличие от перехода клеток в покой, включается специальный механизм инактивации теломеразы.

Изучение свойств НПА покачало, что зга активность пемагрична, имеет ферментативный характер, не угнетается специфическим ингибитором концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы, пс требует специфического п рай мера. AZT-грифоефа! подавляет 1Н1Л, что свидетельствует в пользу тою, что НПА является ферментом поли неравного типа (Чернов и др., 1996).

Корреляция НПА и ТАК, наблюдавшаяся нами практически во всех опытах, может иметь два объяснения. Либо НПА mi независимый фермент, имеющий сходную регуляцию с теломеразой, либо 1111Д и тел оме раза связанны неносредст вен но. Например, НПА может являться белковым предшественником геломеразы, причем регуляция ТАК в этом случае осуществляется как за счет уровня предшественника, так и за счет его превращения в тедомеразу.

Непопятным остается вопрос, имеет ли НПА собственные функции в клетке или является просто спутником теломеразы. Характер Н!1А позволяет предположиiь, чю она может участвовать в SOS-репарации при нсматричном восстановлении ДНК. Поскольку восстановление длины геломер представляет собой, но сути, репарационный процесс, можно предположить, что Ш1А является эволюционным предшественником более эффективной, U0 и более специализированной теломеразы.

5, ЭКСПРЕССИЯ ЭНДОГЕННОЙ р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ (рН 6.0) В НЕДЕЛЯЩИХСЯ КЛЕТКАХ

Хотя процесс клеточно! о старения in vitro привлекает внимание множества иселедова1елей. в настоящее время пет общепринятою специфическою маркера стареющих клеток (Martin et al, 1996) Некоторые авторы рассматривали экспрессию эндогенной (3-галактозидазы (рН 6 0) как эксклюзивный маркер стареющих клеток (Dimri and Campisi, 1994; Dimri et a), 1995) Благодаря случайным наблюдениям, мы усомнились

в точ. что Р-талакюзидаза (рН 6 0) зксттрессируется исключительно в стареющих клетках. Было решено проверить, насколько па жспрессия специфична для стареющих клеток

5.1. Активация р-галактотидазы (рН 6.0) в стареющих клетках.

В свежеполученных эмбриональных фибробластах мыши ГЗФМ) линии СБА р-галактозидазпой активности не выявляется Примерно через месяц после инициации культуры в ней появляются первые клетки, позитивные по р-талактошдазе. Через 5 месяцев в культуре, спустя примерно 4 месяца после прекращения пролиферации более 50% клеток начинает экс пресс кровать P-i алактозидазу (рис. 9с)

5.2. Активация р-галахтозидазы (рН 6.0) в растущей культуре клеток ЗТЗ Swiss.

Мы обнаружили редкие случаи же пресен и Р-галактозидазы в клетках, растущих в нормальной кудьтуралыюй среде с 10% смвор01ки (рис 9а) Окрашивалось менее 0.1% клеток. Оказалось, что юлько 4% окрашенных клеток обладают нормальной морфологией Около 8% окрашенных клеток выглядети погибающими, все осгалыше клетки были очень большого размера и внешне напоминали стареющие клетки Примерно 40% из этих клеток были мhoiоядерными, преимущественно двуядерными. В разных опытах соотношение двуядертшх и одноядерных меняюсь (в одном из оныюв 75% крупных клеток было двуядерными), но распределение крупных, погибающих и нормальных клеток оставалось более менее посюянным.

Рис. 9. Эндогенная (J-га л а кто лтда з ная (рН 6.0) активность в различных неиролыфернрующнх клетках, а - растущая культура ЗТЗ Swiss, I) -покоящиеся клетки ЗТЗ Swiss (21 день в среде с 0,25% сыворотки), с -стареющие ЭФМ, d -дифференцированные клегкн 1-937 (13 дней инкубации с ТФД).

5.3. Активация р-галактозидазы (рН 6.0) в дифференцированных ¡п уИго клетках.

Поскольку терминальная дифференцировка клеток обычно сопровождается прекращением пролиферации, мы решили проверить, не происходи! ли нри тгом активация эндогенной р-1 адактшидазы.

11ролиферируюшис культуры клепок 11-937 и Н 1.-60 лишены р-татактозидазной активности. При индукции макрофатальной дифференнировки в клетках и-937 с помощью 1РА около 1% похожих на макрофаги дифференцированных клеток становились пошгивными по р-галактошдазе К 13-му дню доля позитивных клеток

увеличилась до 60% (рис. ЭД), Кулыуры HL-60 через Я дней после обработки ТРЛ содержали около 5% окрашенных клеток. К 13-му дню па доля увеличивалась до 25%.

5.4. Активация р-галактотидагы (рН 6.0) в покоящихся клетках и клетках, выходящих из состояния пролиферативного покоя.

Опыты со стандартными покоящимися клетками ЗТЗ Swiss (3 дня с 0,25% сыворотки) не выявили активании Р-галактозидазы Было решено удлинить время инкубации для достижения более глубокого пролиферачивною покоя После инкубации клеток ЗТЗ Swiss в среде с низким содержанием сыворотки в течение трех недель оказалось, что 40-50% клеток начинают экспрессировагь (3-галактозидазу (рис 9Ь)

Поскольку такая длительная инкубация в среде с низким содержанием сыворотки приводит к сущес!венному уменьшению жизнеспособности клеток, было решено перевес! и клетки в не делящееся состояние с помощью г епарина в полной ростовой среде. Ранее нами было показано, что инкубация с гепарином блокирует пролиферацию клеток, переводя их в сосюяние покоя. При этом клетки месяцами сохраняю) жизнеспособное! ь (Федоров и др., 1994) Опыты показали, чю 3 нед инкубации клеток в среде с 500 сд /мл гепарина приводят к акгивации эндогенной р-галактазилазы примерно в 11% клеток

Далее мы решили посмотреть, что происходит с позитивными по fï-iалактозидазе клетками при индукции пролиферации в длительно покоящихся культурах. После 14 дней покоя культуры были стимулированы 10% сыворотки. В среду вводили 3П-гимидии на различные сроки После окрашивания на fi-г а. ¡акт опушу проводили радиоавтотрафиютех же препаратов. Результаты преде (ав лены в таблице 2

Таблица 2. Активность эндогенной (ï-галэктозидаэы (рН 6.0) в клетках, стимулированных к пролиферации после длительного покоя.

клетки Доля клеток, позитивных ПО ft-1алакзозидазе (%) Доля сии (ем рук »них ДНК клеток (%) Доля синтезирующих ДНК среди позитивных по Р-галактозидазе клеток (%)

покоящиеся клетки 1-2 0 0

0-24 ч после стимуляции 1-2 3,9 11

24-48 ч после стимуляции 4-8 40 71

48-72 ч после стимуляции 2-5 21 9

Как видно, после стимуляции сывороткой доля нозишвных по Р-галактозидазе клегок повышается. При лгом доля реплицирующих ДНК клеток среди позитивных по [)-галактозидазе становится выше, чем в среднем в популяции.

ОБСУЖДЕНИЕ ОПЫТОВ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ (рН 6.0)

До нашей работы в литературе имелась информация о |}-галактозида)ной акчивносчи (рН 6.0) прежде всею клеток человека (Dimn and Campisi, 1994; Djmri et al, 1995). Мы расширили спектр изучаемых клеток и включили в него стареюшие '>ФМ и покоящиеся клетки ЗТЗ Swiss Первые клетки, позживные по (i-i атак гот ид азе появлялись в культуре №М только через месяц после инициации культуры. В 5-ти месячных культурах, т.е. через 4 месяца после прекращения пролиферации, более чем 50% клеток оказалось позитивными по р-галактозидаэе. Среди позитивных по р-талактозидазе клеток мы можем выделить 2 типа: крупные клетки, напоминающие стареющие и мелкие клетки Уже это

наблюдение показало, но с р-галактггзидазным окрашиванием не все нросго- мелкие клетки не подходили под катеюрию сереющих. Также (Î-галактоз и дазное окрашивание было обнаружено при макрофаг альной дифференцировке клеюк U-937 и HL-60 Эю уже напрямую свидетельствовало, чю [î-талаюозидазная акшвность (рН 60) не является исключительным признаком стареющих клеток.

Поскольку р-галактозидазная активность появляется только в длительно неделяшихся клетках, можно было предположить, чю она является показателем пчохой жизнеспособности клеток Однако опыты но сывороточной стимуляции длительно покоящихся клеток показали, чю при добавлении сыворотки происходи i увеличение доли р-галактози даза-п озити вн ы х клеток и что среди пози i и иных но р-галактозидазе клеток отвечает! на сыворотку реплика1тией более значительная доля клеюк, чем в среднем в популяции.

Мы полагаем, что повышение же пресс и и Р-галактози даты в длительно неделящихся клетках можно рассматривать как проявления повышенного каоболизма и, возможно, означает приближение клетки к ее гибели. В случае стимуляции сывороткой покоящихся клеток повышенный уровень катаболизма требуется клеткам для перестройки перед возвратом о клеточный цикл.

Главный вывод из этих экспериментов заключается в том, что активацию эндогенной р-галактозидазы (рН 60) нельзя рассматривав как специфический маркер аарения По-видимому, различные нслелншиеся клетки обладают общими механизмами, приводящими к активации эндогенной р-галактозидазы (рН 6 0)

6. ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОК ЯПОНСКИХ УСКОРЕННО СТАРЕЮЩИХ МЫШЕЙ ЛИНИЙ SAMP1 И SAMR]

Японские ускоренно стареющие мыши (SAM) являются удобной моделью для изучения ciapcuHM па уровне организма, поскольку их старение (линия SAMPI) очень напоминает естественное. Ныло ян tepecHo выяснить, каким образом ci арен не целою организма связано с особенностями клеток, его составляющих.

До возраста 6 мес мм не наблюдали разницы в выживаемости мышей SAMP1 и SAMR1 Максимальную скорость умирания у мышеи SAMP1 наблюдали в возрасте 10-12 мес., у мышей SAMR1 в возрасте - 14-16 месяцев Максимальная продолжительность жизни у мышей SAMP1 составила 16 мес., а у мышей SAMR! - 23 мес

Пролифера!ивный потенциал ЭФМ составил в среднем 8,7 (6 - 13) У11 для SAMI'l ; 12,3 (6-15) УП для SAMR1 и 20 ( 18 - 22)У11 дли СВА

Внешне ешреющне ЭФМ мышей SAM не отличаются ог клеюк мышей СВА Помимо уменьшенного пролиферагивного потенциала, клегки SAM характеризукггея ранним появлением активности эндогенной р-гajiaKiозндазы (pli 6 0) Доля окрашенных клеюк в культурах SAMP-I составляет 71,3% ira уровне i 1 УП. в культ}pax SAMR-1 - 25,3% на уровне 14 УН. В культурах ЭФМ СВА доля окрашенных клеток на сроке 5 месяцев составляет в среднем 50%,

Мы решили проверить время, которое состарившиеся педеля щи ее я ЭФМ способны переживать в культуре Для шло культуры, прекрагиишне рост, поддерживали в субконфлуентном сосюяиии Замену среды и микроскоиичсские наблюдения проводили до полной гибели клеток. Почги во всех случаях i ибе.н. ЭФМ ве тег к их откреплению от субстрата и, в итоте, лунки становятся пустыми В результате выяснилось, что ЭФМ СВА переживают в среднем 239 (220 260) дней, ЭФМ SAMRI в среднем 124 ( 100 ¡50) дней, а ЭФМ SAMP1 в среднем 103 ( 100-МО) дней

Изучение длины теломер показало, чю клетки мышей SAMPI имеют несколько более длинные гсломеры по сравнению с клетками мышей SAMRI, а те в свою очередь несколько длинней теломер мышей СВА Тслочеры мышей SAMP1 оказались более

гетерогенными (рис 10), чем тсломеры SA MR 1 Мы не смогли обнаружить ишенения ллинм те.чомер мышей SAM в процессе культивирования

SAMP1 SAMR1

УУП 2 5 8 2 5 5

длина

(т.п.н )

Рис. tO. Длина терминальных рсстрикшюнных фрагментов ЭФМ SA MPI и SAVIR1 на ратных этана* роста. УУП - уровень удвоения популяции.

194 -14697 -

4923 -

9.46.5-

*

Теломеразная активиость 1ФМ ЧАМ оказалась довольно значительной и превысила не только активность 1ФМ СВА, но и активность чношх клеток имморгальных культур (ЗТЗ З'лтчч, N1113X3). (егюмеращая активность была особенно высокой в клетках эмбриона, при культивировании она снижались, а потом снова возрастала в случаях возникновения спонтанно трансформированных клеток Средняя активность в ')ФМ ЯАМР! на всех этапах культивирования, начиная от получения эмбриональных клеток и закапчивая клонами спонтанно трансформированных фибробласгов. была выше, чем в клетках

6.1. Парал.тельноеснижение п рол нферати иного ответа на различные факторы роста в процессе старения эмбриональных фиб роб ластов мышей SAM.

Поскольку репликативное оареиие характеризуется постепенным снижением о i нега клеюк на ростовые факторы, мы решили проследить изменения способности клеток в культуре по мерс их старения отвечать на отдельные факторы роста. Для проведения таких экспериментов клетки переводили в состояние покоя и затем стимулировали их добавлением либо ''пияерчалыгого фактора роста (EOF), либо фактора роста фибробласюв (FGK1), либо iромбоиитарпо!о фактора роста (PDGF-BB), либо сыворотки Оказалось, чтго miei к и S АМН и SAMR1 ранних пассажей (3-4 УН) отвечают на стимуляцию ростовыми факторами одинаково. Однако, уже начиная с уровня пятого удвоения популяции, ответ клезок SAMP1 резко снижается. Снижение происходит параллельно для всех исследованных факторов роста и для сыворотки, которая содержит ряд факторов роста.

Так как в наших опытах наблюдалось параллельное снижение ответа на различные факторы роста в процессе оарсния клеюк в культуре, мы предположили, что блок проведения сигнала возникает на ранних ступенях регуляции, до взаимодействия фактора роста с рецепторами. Поскольку в состав рецепторов факторов роста входя! тиро/типовые протеи нкиназы, мы решили проверить уровень фосфорилировання тирозина в процессе мнтогенной стимуляции клеток различною возраста

Измерения выявили резкое снижение общего уровня фосфорилировання белков но тирозину в процессе старения в культуре, как клеток SAMP1, так и SAMR!. При этом уровень фосфорилировання в клегках SAM1M был существенно ниже, чем в клетках SAMR 1, уже начиная с уровня трех удвоений популяции

SAMR1

2Î

ОБСУЖДЕНИЕ ОПЫТОВ С МЫШАМИ SAM

По тесту на выявление активности эндл! енной р-галактозидазы (рН 6 0), старение ')ФМ SAMP1 наступает раньше, чем старение ЭФМ линии SAMRI, а последних раньше, чем ЭФМ СВА.

Нами обнаружено, что в процессе старения в культуре происходит резкое снижение пролифератиикого ответа клеток SAMP1 на стимуляцию PTX1F-BB, FGF-1 и EGF. Эти три росювьтх фактора осуществляют свою функцию посредством трех независимых рецепторов, содержащих гирозиновьте пртггеинкиназы. Маловероятно, что уровень всех трех рецепторов резко снижается в клетках SAMPI. Известно, что количество рецепторов факторов роста существенно не меняется r процессе старения клеток в культуре (Phillips el al, 1983, CHstofalo et al, 1489, Sh imada et al, 1990; Ferber et al, 1993) Колее вероятной представляется возможность toi о, что уменьшение пролиферггтивно) о ответа клеток SAM является результатом ослабления мигогеннпго сигнала на пути, общем для всех тирозинкиназтгых рецепторов (рецептор фактора poeta MAP киназм - факторы транскрипции). На этом СИ1 нальном пути важную роль играет фосфорилироваине белков но остаткам тирозина Позтому общий уровень фосфорилирования клеточных белков по остаткам тирозина отражает "состояние" сигнального пути, идущего от рецептора фаю opa роста к факторам транскрипции. Мы показали, что в клетках SAM происходит уменьшение уровня фосфорилирования белков по тирозину, что означает ослабление передачи сигнала.

Мы полагаем, что старение клеток SAMPt можно рассматривать не как некий особый процесс, а как ускорение обычного старения, например клеюк SAMR1. Поскольку клегки S\MP1 и SAMR1 проходят различное количество удвоений популяции, то один и тот же уровень удвоения популяции для тгих кусток соответствует разным ттапам старения Если резулыаты опытов отложить по шкале относительных удвоений популяции (за 100% принять максимальный уровень удвоений популяции для каждой культуры), то резкие различия доли сишеэирующих ДНК клеюк исчезают (рис II) Однако, точная оценка раз 1ИЧИЙ при такой постановке вопроса невозможна, поскольку неизвестно положение точки начала координат (клетки начинают процесс старения уже в организме).

Рис. П. Зависимость индукции синтеза ДНК различными ростовыми факторами в эмбриональных фнбробласта* SAM от относительного пролиферативного возраста клеток. Время стимуляции - 24 ч. EGF- эпндерчальный фактор роста, FGF-1 -фактор роста фибробластов, PDOF-BB- тромбоцнтарный фактор роста, serum -сыворотка, р - клетки SAMR1, ( -клетки SAMPI. Размер фигу р отражает

not решиостн.

ДОЛЯ СИНТЕЗИРУЮЩИХ "

EGF

FGF-1

ДНК 30

КЛЕТОК м

<*> Z

30 50 70 90 30 SO 70 90

ОТНОСИТЕЛЬНЫЙ ВОЗРАСТ КУЛЬТУР (%)

Полученные результаты свидетельствую! в нолыу того, что феномен преждевременною старения мышей SAMP-1 связан с ускоренным старением их клеток, которое сопровождается снижением нролиферативпого о i нега на различные факторы роста.

Неожиданно оказалось, что свежеполученные культуры ЭФМ SAM обладают значительной геломеразной активное i ыо. которая превышает не только 1еломеразнуго активность Г5ФМ СВА, но и теломеразную активность многих клсток имморгальных культур. Однако, ora теломеразная активность довольно быстро снижается по мере культивирования. Такое же снижение теломерашой активное!« происходит при кулы ивировании фибропластов цыпленка (Ven k ate чал. Pnce, 1998), имеющих ограниченный пр0лифера1ивный потенциал Возможно, чю снижение теломеразпой активности в культуре ЭФ M SAM связано с процессами дифференцирован, при которых ! г рои сходи i репрессия теломеразы

Известно, что средний размер 1еломср у мышей составляет 40-50 т.и.о. (Kiplmg, Cooke, 1990, Zhu et al., 199Я; Nuda et al,, 199Я) Средняя длина теломер мышей SAM не менее 60 г.п.Н., а теломер мышей CRA - не мстгее 50 t.ii н Тсломеры мышей линии SAMP1 более rcieporcFiiiLT по длине по сравнению с теломерами мышей линий СПА и SAMFÍ1: среди иич встречаются как более короткие, так и более длинные.

Тройственная корреляция между продолжительностью жизни мышей, пролнферятивныч потенция лом нх эмбриональных фибробдастов и временем переживания состарившихся фибробластов в н(делящемся состоянии.

h ели изобразить полученные данные на 1иоограммс, приняв параметры мышей СВА за 100%, то становится видна наиболее интересная находка наших экспериментов, а именно, тройственная корреляция между продолжитслыюсп.ю жизни мышей СВА, SAMR1 и SAMP I, п роли фе pai ивным потенциалом их ЭФМ и временем переживания состарившихся ЭФМ в недслкщсмся состоянии (рис. 12)

longe v i t y

1 i f в s pan

s u г v i v a 1

СВА

(100%)

longevity

lifespan

survival

Jongevit^

lifespan_ survival

60% 62% 52%

44% 44%

43%

SAMR1

SAMP1

Рис. 12. Корреляция между средней продолжительностью жизни мышей (longevity), про-лнферативным потенциалом нх эмбриональных фибробластов (lifespan) н временем переживания эмбриональных фибробластов в неделящемся состоянии (survival). За 100% приняты параметры мышей СВА.

Каковы возможные причины существования обнаруженной корреляции? Поскольку любой многоклеточный орган и (Ч состоит из делящихся и педелящихся клеток, то два фактора - способность клеток к делению и способность к длительному переживанию должны влит ь на продолжи i ель нос гь жизни

Принято считан,, что старение сеть результат естественного отбора (Mcdawar, 1955, Hamilton, 1966), и полому все системы орштизма, на каком бы уровне мы их ни

рассматривали, должны бы lb относительно равнопрочными. Излишняя надежность (прочность) какой-либо системы должна элиминироваться отбором ввиду ее повышенной "стоимости". Поскольку продолжительность жизни зависит как от способности клеток к делению, так и oi способности неделяшихся клеток к переживанию, оба эти параметра должны соответствовать друг другу. Корреляция между продолжительностью жизни и пролиферативпым потенциалом, обнаруженная в данной работе, была ожидаемой и соответствует множеству более ранних работ (Finch, 1990). Волее того, очень хорошая корреляция между продолжительное! ью жизни мышей и пролиферативным потенциалом их клеток была получена для линий SAMR1 и SAMP11 (Hosokawa eta!, 1997b) Исходя из предположения о равнопрочттости всех систем, должна существовать корреляция между пролиферативным потенциалом и выживаемостью неделяшихся клеток. Однако в приложении этих рассуждений к мышам SAM имеется противоречие Образование мышей SAM произошло случайно, одномомен i но. без участия естественного отбора: это, видимо, случилось в результате спаривания мышей AKR/J с неизвестным партнером (Takeda et at, 1997а). Это событие повлекло за собой раннее появление в потомС1ве маркеров старения. Ученые заметили и поддержали ло изменение путем инбридинга Поэтому весьма вероятно, что одно собы;ие повлекло за собой два последе!вия: уменьшение пролиферативно! о жггентшала и уменьшение времени переживания неделяшихся клеток. Такое совпадение может указывать на общность механизмов, определяющих сокращение нролиферэтнвного потенциала и времени переживания неделяшихся клеток

Мы полагаем, что тест на время переживания неделяшихся фибробластов может использоваться для изучения механизмов старения, как дополнительный к изучению пролиферативно го потенциала клеток (предела Хейфлика).

Повышенная нестабильность ДНК в клетках SAM может объяснить все наблюдаемые в наших экспериментах явления.

Рис. 13. Нестабильность ДНК клеток SAM.

Известно, что мыши SAM характер и зунггея повышенной частотой мутаций (Odagin et al., 1998), что находит свое отражение в высокой частоте хромосомных аберраций в костном мозге (Nkitam et al, !990) Высокий уровень нестабильности ДНК (и в особенности теломер) может быть ключом к пониманию высокого уровня спонтанной трансформации, уменьшения н рол и фе рати в н ого потенциала и времени переживания в неделя!немея состоянии эмбриональных фибробластов мышей SAM. 11естабильность ДНК

может fifjib причиной компенса! opuoi о увеличения т слом с-рат ной амивлосги и соответственно! о увеличения г ercporemioci н тел ом ер Нестабильность ДНК, таким образом, может быть ответственна та уменьшение продолжительности жизни животных линий SAM и за все особенности их клеток, наблюдаемые в экспериментах в культуре (рис. 13).

7. ВВЕДЕНИЕ ГЕНА КАТАЛИТИЧЕСКОГО КОМПОНЕНТА ТЕЛОМЕРА1Ы В КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА

7,1. Про л иферя тив н ый потенциал клеток после введения гена каталитического компонента теломеразы (hTERT).

Известно, что введение ]ена hTI-R Г в фибробласты человека приводит к появлению в клетках теломеразной активности, поскольку все остальные (кроме hlfcRT) ком полипы |еломеразы снтенфуются в большинстве клеток человека постоянно (Bodnur ct al, 1998; Vaziri and Benchimol, 1998) Для опытов но грансфекпии нами был взят штамм диплоидных фибробластов кожи человека №1608 иi коллекции кулыур клеток МГ НЦ РАМН. Эти клетки были получены от нормального донора и имеют нормальный кариотип Выло получено несколько клопов транс фи ни ровоп m.i х клеток. Внешне клетки различных клонов чало отличались друг от друга и напоминали молодые диплоидные фибробласты человека. Они быстро росли и образовывали чонослой клеюк очень высокой шкпности.

Для изучения нролиферативною потенциала было выбрано два клона Один из них -1608tel7 об.илал иаиболыней скоростью роста, другой - t<S0Ktel2 - (таименыпей. По достижении клетками уровня 60-65 УН наблюдали замещение pociа клеток (рис. !4)

Время, дни

Рис. 14. Кривые роста фибробластов после введения ЬТЕНТ. 1608 - массовая культура, контроль - результат трансфекшш рОпео (пустой вектор), 16081е12 н 1608(е17 • грансфекция р190 <ЬТЕНТ), 1608те11.2 - введение плазм иды (сниженная экспрессия ИТЕЯТ),

Однако процессы, напоминающие старение, не зашли далеко и клетки начали уверенный poci, который в дальнейшем не изменялся. Морфологически зги клетки соответствовали молодым диплоидным фибробластам. При наблюдении в течение примерно 200 дней после преодоления предела Хейфлика, клетки обоих клонов сохраняли морфологию и скорость роста (рис. 14). За 710 время клетки клона !608tcl7 проделали примерно 200 УП, а клетки клона 160Stcl2 - свыше 120 УП. Проверка исходной культуры показала, что клетки способны проходить до 68 УП, Клоны клеток, трансфицированные пустым вектором, дорастали до уровня ниже 68 УII. При лом, как в случае нетрансфицироваипой культуры, так и при трансфекции пустым вектором клетки постепенно замедляли свою пролиферацию, становились крупнее и проходили все изменения, характерные для пролиферативного старения.

При введении плазмиды RS-1 (измененный сплайсинг hTERT) клетки (клон I608tell 2) без замедлений превосходили предел Хейфлика, однако их пролиферация была несколько имедлеиа но сравнению с клетками, грансфииированнычи р 190 (рис. 14). 7.2. Теломеразная активность н длина теломер после введения гена hTERT,

В результате введения hlfcftT в клетках появилась теломеразная активность Она сооанила в клетках клона )608iel7 1,9±0,9 условные единицы (у.е.), в клетках клопа 1608tel2 - !,5±0,8. Теломеразная активность в исходных клетках не выявлялась (0,2±0,4 у.е.). Для сравнения, теломеразная активность иммортальпых клеток человека U937 и HL60 состав.'ила около 1 -2 у.е., а активность бессмертных фибробластов мыши ЗТЗ Swiss варьировала от 2 до 4 у.е.

Теломеры трансфицированных клеток значитсльтто удлинились (рис. 15) и составили у клопов 1608tel7 и I608te12 примерно 15-20кЬ. Клетки исходною штамма 1608 имели теломеры примерно 6-9kb.

<ч ж

ii ii ill г т- г о е » ^

Рис. 15. Длины концевых рестрнкиконных фрагментов. Слева - молекулярный вес (г. п. и.).

mix - некло ни ро ванные клетки, трансфицированные hTERT,clone mix - клетки,

полученные из mix путей клонирования на поздних пассажах (примерно 120 УП). mixAZT -клетки mix, культивируемые в присутствии AZ.T 2 недели.

7.3. Метилирование, копийность и транскрипционная активность рибосомных генов после введения гена ЬТЕЯТ в фибропласты человека.

Было определено общее число копий рибосомных генов м исходных клетках пиамма 1608 и в клетках клонов 1608ю12 и 16081е17. Число копий рибосом кого новюра в клетках клона 1608 составило 340 + 20 (среднее значение для п - 20 измерений и стандартное отклонение), клона 7 - 330 ± 15, а клона 2 - 350 ±15 копий. Таким образом, число копий рибосомных генов не изменилось после теломеризации клеток 1608.

Чтобы оцепить, не раш и чаются ли соотношения активных и неактивных копий рибосомных повторов в лвух клонах и в исходных клетках, был определен обтцнй уровень метилирования исследуемого фрагмента ¡ела 283 рРНК. Я'" клеток клона 1608 значения показателя метилирования составили 1,41 ± 0,08 (п 15), для 1608(е1 7 - 1,35 ± 0,07 (п = 15), а для 16081е! 2 - 1,4 ±0,1 (п ~!0) Следовакльно. можно полатать, что уровень метилирования рибосомною повтора не изменился после иммор|а.1изании клеток !608,

При выявлении ядрышкообра^тощих районов (ЯОР) митотнческих хромосом азоптокис.тым серебром, размеры препинитша серебра (в баллах) отражают количество активных копий рибосомгтых генов (Ляпунова и др., 2001), Сумма баллов по всем десяти ЯОР составила для исходных клеток (ттиачм 1608) - 1У,8 ± 1,8 (п-20), у 1608(е17 - 20,0 ± ! ,9 (п-"20), для 16081е12 - 19,6 ± 1,0 (п- 20), Iаким обратом, видно, что теломеризация не повлияла на количество активных рибосомных 1енов в фибробластах.

7.4. Ответ телочеризованных клеток на сывороточное голодание.

Оказалось, что теломериюватшыс клетки нуждаются в сыворотке так же, как и исходные диплоидные фи б роб л ас г ы Уже на третий день после перевода клеток в среду с 0,25% сыворотки они массово выходят из клеточного цикла.

7.5. Изучение насыщающей плотности пролнферапнн.

Насыщающая плотность пролиферации показывает, при какой |усю1с монослоя клетки остаттавливакп пролиферацию из-за контактною торможения. Как видно из рис. 16, геломеризованные клетки имеют очень высокую насыщающую плотность. Она примерно в 2 раза выше, чем у молодых клеюк 160Я (на уровне 21 УП). Однако из динамики процесса видно, что клетки нодвер! тотся контактному юрчожению; кривая зависимости плотности от времени выходит на плато.

Рис. 16. Сравнение насыщающей плотности клеток. 1608 (57УП) - стареющие фиброблаеты, 1608 (21УП) -молодые фнброблас!ы, 16ОДе1пнх н 1608(е1т!же1опе -теломер изо ванные клетки.

300

250

200

150

100

50

Количество

клеток

(тыс.)

160ЗД«1гп1х

16081е1гтхс1оле

1608 (21УП)

1608 (57УП)

6 7 8 9 Время (сут)

7,6. Карнотип теломернзованных клеток.

Были изучены хромосомы в 50 метафазных пластинках клеток 1608(е17 Не было обнаружено ни одной метафазной пластинки с гиперлишюидным числом хромосом' ¿6 хромосом было в 36 случаях, 45 хромосом - в в и 44 - в 8. Никакой закономерности в отсутствии отдельных хромосом обнаружено не было. Анализ II дифференциально окрашенных метафазных пластинок (количество клеток, необходимое для диагностическою кариотипирования (Кулешов , Лурье. 1984» позволил нам сделать вывод о том, что клетки 1608к17 имеют нормальный кариотип - 46,ХУ

7.7. Веедепие гена hTERT в скелетные миобласты человека.

Исходные линии миобластов были генетически охарактеризованы и имели нормальные кариотипы. Клетки активно делились в культуре и образовывали мышечные волокна при индукции мио!енной дифференцировки.

После введения hTERT в миобластах появилась теломеразная активность. Кле[ки культивировали в течении более чем пяти месяцев, при этом они проходили от 23 до 48 УП. Существенного различия в пролиферативном потенциале исходных и телом ери зованных миобластов человека обнаружив не удалось Гелом ер изо ванные миобласты старели При лом, при индукции мшиенной дифференцировки они также, как и исходные миобласты образовывали мышечные волокна

ОБСУЖДЕНИЕ ОПЫТОВ ПО ТЕЛОМЕРИЗАЦИИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

До наших опытов было известно, что введение 1ена каталитического компонента телочеразы человека ("теломеризация") приводит к им морализации фибробластов (Bodnar et al, 1998; Vaziri , Bcnchtmol, 1998), клеток эндотелия (Yang et al., 1999) пигментного эпителия сетчатки (Bodnar et al, 1998) человека, однако не приводит к иммортализации миобластов (Seigncurin-Venin et al, 2000) и разнообразных эпи!едиальных клеток (Farwcl et al., 2000, Dickson et al, 2000; Jones et al, 2000) человека Кроме того, не всякие оныгы с фибробластами человека приводили к иммортализаиии (MaeKenzie et al, 2000; Franco et al, 2001). Хотя мы получили иммортальные клетки (прошедшие в культуре около 200 УП), обладающие теломеразной активностью и имеющие удлиненные теломеры, но в процессе их получения существовал длительный период замедления роста (рис. 14). Клетки, вступившие в этот период, уже обладали теломеразной активностью н средний размер теломер у них был значишльно увеличен "Эго замедление роста с последующим сто восстановлением можно объяснить тем, что в популяции отбирались клетки, способные к дальнейшему росту и что зтих клеток было очень мало в исходной популяции. Удивительно, что этот период замедления практически совпал по количеству пройденных удвоений с пределом Хей флика. Возможно, это случайное совпадение.

Эксперименты показали, чю re. юм ери зова иные клетки не отличаются от нормальных по кариО! ииу, активности рибосомных генов н способнос1и переходить в пролиферативный покой. При jtom их поведение в i етерокарионах (см. раздел 8) не отличается ог поведения любых других иммортальных клеток. Интересным представляю(ся два количественных наблюдения. Экспрессия измененного гена в клегках 1608tcll.2 (плазмида RS-1), видимо, снижена (добавочный сайт сплайсинга чоже! снижать уровень hTERT), что приводит к относи гечьному укорочению г ел ом ер /в сравнении с клетками, iрапсфииированными р!90, рис. 15) и к более медленному росту (рис. 14) Экспрессия гена hTERT вызывает повышение насыщающей плотное) и пролиферации, [аким образом, мы наблюдаем не только появление в 1еломеризованных клетках имморгалы!ости, по и изменение свойств клеток (насыщающая плотность пролиферации, скорость роста). 'Ути параметры телочериюваппых клеток напоминают параметры эмбриональных клеток и могут етражазь реальное омоложение клеток , т.е. изменение экспрессии генов.

Таким образом, нами показано, что в г сломернэованных клетках человека сохраняются механизмы пролифераг ишюго старения, способность переходить в пролиферативный покой при уменьшении содержания сыворотки и при увеличении клеточной плотности, В этих клетках сохраняется нормальный кариотип и работа рибосомных генов. Все это является очень важными свойствами ¡еломеризовакных клеток, позволяющими надеяться, что временная жепрессия теломеразы может быть применена для наращивания клеток в медицинских целях.

8. ОПЫТЫ НА ГЕТЕРОКАРИОНАХ С МАКРОФАГАМИ

В зточ разделе мы изучали влияние тело мера ¡ы на способное! I. пролиферирующих клеток вызывать реаюиванию ситеза ЛПК в ядрах макрофагов при слиянии с ними. Ранее нами было показано, что реактивация синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе (етсрокарионов происходит юлько при слиянии с клетками неограниченно пролиферирующих культур (рис, 17)

про л иферирующая * гетерокарион без

клетка / X реактивации

синтеза ДНК е

ядре макрофага

макрофаг _

реактивация

слияние \ ^^ ■^СИ'"взаЯНК макрофага и N. в пролиферирующей клетки ^ ----

Рис. 17 Схема опытов с гетерокарион а ми. Черным показан синтез ДНК.

8.1. Изучепне влияния AZT на реактниаиню emu еча ДНК в ядрах макрофагов в гетерокарионвх с клетками ЗТЗ Swiss.

AZT в концентрации до Ч) мкМ достоверно не пли ял на сип >ei ДНК в свободных Kjiei ка\ 1ТЗ Swiss и в ядрах клеток ЗТЧ Swiss в составе iетерокарионов При .»там AZT, начиная с концентрации 5 мкМ, подавлял реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в 1е]срокарнонах.

Я.2. Гетерокзрионы е тело меризо ванны ми фибропластами н миоблаетами человека.

Для того, чтобы прямо проверив ь г и пот ray об участии теломеразы в процессе реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе i е[ерокарионов чы провези опыты но слиянии) макрофагов с исходными диплоидными фибробластами человека и е теломеризованными клея ками Наблюдали реактивацию син г ем ДНК в ядрах макрофагов при слиянии с клетками 160Stel7. но не с клетками шгамма 1608

Аналогичные опыты были проведены с теломерию ванным и миобластами человека (1606 Г) В гетерокариоиах макрофагов и исходных миобластов реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов не выявили В экспериментах с использованием миобластов клона 1606Т в reí сро кари он ах наблюдали реакшвашно сишеза ДНК в ядрах макрофагов.

8.3. Влияние антисмысловмх оли гону клеотюв к матричному району тело ч ера зной РНК на ските! ДНК в гетерокариоиах.

В ной серии экспериментов геперокариопы обрабатывали высоко специфичными ингибиторами 1еломеразы - 2'-0-ме1ил РНК олигонуклеотндами, комплементарными матричному району тело мера зной РНК человека '>ги олигопук leoimiw специфически подавляли реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в гетерокариоиах с клетками

1608ie17 и не влияли на сиггтсз ДНК в ядрах свободных клеток I608te17 и в ядрах клеток 1608tel7 в гстерокарионах Ojshi онукдеотиды с двумя именами (контрольные) не оказывали достоверного эффекта

^.Сравнительный анализ длин тело мер макрофагов н эмбриональных фибробластов чышей СВА.

Так как в результате проведенных экспериментов выяснилось, что теломераза необходима для реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе iетсрокарионов, возникло предположение, что теломеры макрофагов могут быть укорочены. Чтобы проверить тто предположение, мы сравнили длины теломер макрофагов и ЭФМ СВА. В резулыа1е проведенных желернментов мы не обнаружили существенного укорачивания теломер макрофагов из перитонеалыгой полое га мыши по сравнению с геломерами ЭФМ Изучаемые теломеры ока)ались длинными и полиморфными, что характерно для теломер мыши

8.6. Синтез ДН1С в гетерокарионах со стимулированными макрофагами чышн.

В результате проведен шлх жеперименгов возникла гипотеза, предполагающая, чго 1еломеры резидентных перитопеальных макрофагов, испольюванных в наших опытах, изменяются в ¡ечение длительного пребывания макрофагов в перитонеальной полости мыши Чтобы проверить тто предположение, мы провели опыты со с!им улирова н н ы ми пернгонеальнымгг макрофагами. Иньекиня в пери го л сальную ) юл осп, мыши стерильного раствора крахмала приводит к быстрой миграции клеток, участвующих в воспалительной реакции в бргошиуто полость Инт.екцию делали за два дня до выделения макрофагов. Оказалось, чго 1ак же как и с резидентными макрофагами, реактивация синтеза ДНК в г етерокарионах с клетками 1608 не происходит

8.7. Влияние трипенковой обработки макрофагов на синтез ДНК в гетерокарионах,

Чгобьг проверить Iипотезу - не повреждаются ли теломеры макрофагов мыши в процессе выделения и очистки, прежде всего, в результате обработки трипсином, мы провели серию экспериментов с различным временем обработки клеток трипсином или вообще без него (с помощью обработки рас i вором Версена). Эксперименты не выявили реактивации макрофагов, нодвер1 шихся различной т риисиновой обработке в г ei ерокарионах с Г>ФМ Уровень синтеза ДНК в ядрах макрофагов в cociaee гетерокариопоп ие отличается достоверно ог уровня сиигеза ДНК свободными макрофагами.

ОБСУЖДЕНИЕ ОПЫТОВСГЕТЕРОКАРИОНАМИ

В начале 80-х годов нами было обнаружено, чго реактивация синтеза ДНК в ядрах макрофагов в та ерокарионах происходит только при слиянии с иммортальными клетками (Егоров и др, 1984, 1985, 1987; Prudov.sky ct al, 19R5, 1989а, 1989b, Зеленин и др., 1990). В перитопсальных резидентных макрофагах мыши не происходило реактивации сиггтсза ДНК нри сиянии с диплоидными фибробластами человека, с эмбриональными фибробластами мыши, крысы, с делящимися предшественниками мышиных макрофагов (Егоров, 1985). Однако синтез ДНК возникав при слиянии с клетками ЗТЗ NIH. 313 Swiss. SV3T3, L-929, СЗП 10Т1/2 и различными шжачествениыми клетками крысы и хомячка, жспрессирующими онкогены Заким образом, резидентные пери i or реальные макрофаги оказались клегками, которые специфически и быаро (та несколько часов) могли распознать иммортальные клетки.

Это явление мы пытались связать с действием различных онкогенов (Pradovsky et al, 1989а). однако механизм процесса оставался неизвестным. После открытия телом еразы, которую можно рассматривать, как универсальный маркер иммортальных клеток,

возникло гтрс,отложение, что именно гедомераза может участвовать в реактивации макрофагов в составе кперокарионон.

Ранее нами и другими показано, что ингибитор обратных транс крип газ AZT подавляет функцию теломеразы в различных культивируемых клетках, в том числе и в клетках ЗТЗ Swiss ÍVegorov et al, 1996, 1999, Чернов и др.. 1996; Ьгоров и др, 1997а,б.в, Strahl and Blackburn, 1994, Strahl and Blackburn, 1996, Melaría et dl, 1998, Gome/ et al, 1995, Gomez et

al, 1998; Murakami et al, 1999). От,..... с гегерокарионами были проведены с более

высокими концентрациями AZT, чем в опытах по дли тельному подавлению теломсра!ы (Yegorov et a1, 1996, 1999). Улобсто раГшт ы с t етер о кар и он a vi и состой! к том, что в каждом препарате имеются внутренние конгроли токсичности воутействия. AZI в наших они i ах не оказывал достоверного подавляющего действия на синтез ДИК, как в с победи о лежащих клетках ЗТЗ Swiss, гак и на ядра клеток ЗТЗ Swbs в rerepii кар ионах с макрофагами Таким образом подавление реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофатов не связано с токсическим действием А7Т на механизм синтеза ДНК, а является следствием подавления функнии те л оме рази, которая необходима для реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов.

В iетерокарионах. полученных путем слияния макрофагов с фибробластамн человека с введенным 1еном hTERT (1608te 17), индекс реактивации чакрофамтв составил 70% Несмотря на то. что тело меризо ватт ш,те миоб.тасты 16061 не стали иммориальными, к них клетках обнаружили высокую теломеразиую активность, и слияние с ними также приводило к реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов. Индекс реактивации макрофагов достигал 50% Клетки исходного штамма миобластов 1603 - не вызывали реактивацию Таким образом, другой подход (введение тена hTFRT) cute раз продемонстрировал ю, что для реактивации синтеза Д11К в ядрах макрофлов в гетерокарионах требуется тело мер.тз пая акт ивпость.

С целью подтвердить зтот вывод с помощью еше одного независимого подхода мы провели опыты по подавлению функции теломеразы в iетерокарионах с помощью введения ант нем меловых цуклеотилов к РНК-компоненту теломеразы. Известно, что 2'-О-метил-РНК ОЛИ1 онуклеотиды являются сильными и специфичными итнибиторами (еломеразы (Pitts and Corey, 1998) Мы наблюдали подавление синтеза ДНК в ядрах макрофагов в ¡етерокарионах без какого-пибо эффекта на синтез ДНК клерками 1608te!7, как свободными, так н в составе гетерокарионов ">ти океперимен гы еще раз под терли л и теломеразозависимый синтез ДНК в ядрах макрофагов в составе тетерокариопов

Насколько нам известно, гетерокариопы с макрофатами - тто первая описанная система, подходящая для исследования ишибиторов теломеразы на клеточном уровне Для тгой техники (рсбуются чалые количества иш ибиторов (необходимые лш нескольких миллилитров культура, плюй среды) Результаты же пери ментов моту! быть известны в течение нескольких дней Альтернативным методом является культивирование клеток в присутствии ингибиторов теломеразы и определение длины телочер, что 1рсбует шачительно больших количеств игнибторов и занимает больше времени. Однако /ия практического применения этою метода требуется значительно упростить процедуру идентификации гетерокарионов

Результаты работы, безусловно, подтверждают наше предположение о том, что теломераза принимает непосредственное участие в реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе тетерокариопов Поскольку теломераза надстраивает теломеры. логично сделать вывод о том, что гсломеры мышиных неритонеальпых макрофагов изменены (укорочены или имеют измененную конформацию) Реактивация синтеза ДНК происходи! юлько после восстановления тежччертсломерл ¡ой

Макрофаги в г етерокарионах проявляют олю удивительное свойство В противоположное^ многим другим неделяпптчея клеткам (Prudovsky et а!, 1993, Rabinovich and Norwood, 1980, Stein and Yanisbevsky, 1981, Ringcrtz et al, 1985, Laerig et al, 1985; Prudovsky с! al, 1990), они гге оказывают ипгибиру тощее действие на сише; ДНК

в гетерокарионах Отсутствие такого эффекта макрофагов на синтез ЛИК в ядрах незлокачественных клеток в гетерокариопах (данная работа, (Prudovsky et al, 1985; Prudovsky et al, 1989 а, Ь>) означает, что они не содержат каких-либо, способных к диффузии интибиторов пролиферации Отсутствие ингибиторов пролиферации и, одновременно, поддержание макрофатами неделящсгося состояния, привело нас в 1989 году к выводу, что "какие-то изменения в геноме макрофагов препятствуют репликации и 410 в I стерокарионах благодаря действию им моргали лующич онкогенов происходит элиминация или нейтрализация эт их изменений" (Zelemn and Prudovsky, 1989; Prudovsky et al, 1993) Полученные результаты подтверждают тгу гипотезу

Однако, неясно, когда и какие именения происходят с теломерами макрофагов. Мы попытались выяснить, когда происходит укорочение'изченение геломер макрофатов 1) При их нормальной дифференцировкс 2) R процессе их длительного пребывания в периюнеадьной полости мыши 3) В процессе их получения и очистки

Прямое измерение длины теломер в макрофатах показало, что длины телочер в макрофагах и в фибробластах мышей СВА существенно не различаются. Это означает, что в макрофа1ах мыши имеются достаточно длинные тедомеры, и иеделящсеся состояние макрофагов вряд ли можно объяснить наличием коротких геломер в них.

Были проведены эксперименты: 1) со стимулированными макрофагами мыши (снежедифферепцированные клетки, мигрирующие в перитоттеалытую полость), и 2) с различной обработкой макрофа! ов во время их получения. Стимулированные крахмалом макрофа! и, которые находились в перитонеальпых полостях мышей не больше двух дней, (резидентные макрофаги находятся в перитонсальтюй полости порядка нескольких месяцев), проявляли те же свойства в составе гетсрокарионов, чю и резидентные макрофа!и. Таким образом, стало ясно, »гто время пребывания макрофатов в перитопеалыюй полости мыши ке влияет иа теломеразозависимлсть реактивации синтеза ЛПК.

Известно, что макрофа! и обладают относительно высокой устойчивостью к обработке раствором трипсина их трипсиирезистегпностъ растет но мере дифферент!pi>вки (Cline et a 1, 1971) Чтобы убедиться в том, что чли тельная трипеинизация не влияет на способность макрофагов к реактивации репликации, были проведены жеперименты, в которых макрофаги подвергались грипсиновой обработке различной длительносш Оказалось, что способ обработки макрофагов в наших экспериментах не оказывает существенного влияния на способность макрофагов к возобновлению синтеза ДНК.

Таким обраюм. эксперимент ы показали, чю изменение геломер макрофаюн происходит ие в процессе длительной» пребывания макрофа! ов в неритонеальной иол ос i и мыши, и не в результате получения и очистки макрофаюв Возможно, 1еломеры макрофа:ов принимают специфическую конформанию в процессе дифференцировки и участвуют в поддержании неделяшеюся состояния макрофагов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение рабомj можно подвести некоторые итоти 1 С помошыо блокирования функции теломеразы бы т получен феномен нскусс i нештот старения клею к, однако к реальной пракшке лечения рака л oi резулыат видимо крайне маловероятен Особенность челпвеческо! о организма состоит в крайне надежной репрессии теломерая.1 в co\iai и чески х клет ках 1! большинстве случаев, реактивация теломеразы ттри капиеро!енеte происходит в процессе выхода к теток и: состояния кртниса, когда наблюдается многократное повышение Iенети чес кой изменчивости Поскольку ) г и кпетки момшти в состояние кризиса, ¡о в них разрушены или нейтралиюканы механизмы репликативно!о старения Полому подавление теломеразы в опухолевых клетках человека Btmpantaei их в состояние кризиса, но не вызывает репликативно го старения. А это значит, что снова будет происходив чрезмерное

увеличение i eiiei ичсской нестабильное i и R m лично от кризиса в процессе становления опухоли, пот крипте будет захватывать существенно большее число клеток Попом у, nccMoip* на то, что большинство клеток будет погибать, довольно быстро возникнут клетки, устойчивые к предложенной терапии В силу всего вышесказанного, а также из-за тою, что при подавлении геломеразы торможение пролиферации наступает с задержкой, необходимой для укорачивания теломер в результате нелореплнкацни, подавление геломеразы, как самостоятельный меюд лечения рака, вряд ли достиг не1 больших усггсхов, I ораздо более подходящими для терапии нам кажукя методы воздействия на опухолевые клетки, которые используют гедочеразу не как непосредственную мишень, а как маркер опухолевых клеюк и повреждающие клетки с активно работающим ферментом. Усиление иммунной реакции на теломеразные пептиды, использование конструкций с промоюрами hTERT (которые будут активными только в клетках с работающей теломеразои), встраивание с помощью тсломеразы в теломеры опухолевых клеток фотосенсибилизагоров - вот вероятные пути развишя ан i и опухолевой терапии.

2 Опыты по введению гена катали i ическо! о компонента i слом срази не выявили каких-либо нарушений в регуляции размножения теломеризованных клеток По двум показателям: скорости размножения и насыщающей плотности пролиферации Kiei ки стали похожими на более молодые эмбриональные фи ó роб ласты человека Можно предположи i ь, что для успешной имморгали шции с помошью введения гена hTERT других дифференцированных клеток, потребуется лцатезтьпый подбор условий культивирования Они должны будут имитировать условия, в которых происходит размножение данных клеток в opiaumMC. Таким обраюм, развитие этой технологии погволит не только создавать материал .для клеточно-замеиитсльной терапии, но и будет способствовать общему развитию технологии вы ран in или и я клеток ill vitro Успешная ичмортали¡ация клеюк с помошыо введении hTERT означаем что, по крайней мерс, в части клеточной популяции все возникающие повреждения полностью рс парируются Поэтому сам факт успешною зкеперимеп г а является лучшим гестом на адекватность условий культивирования.

выводы

1. Долговременное блокирование функции теломера1ы в бессмертных клетках приводит к укорачиванию теломер, что, в свою очерель, может вызывать два эффекта. Ьсли в клетках сохранены механизмы репликативжх о старения, kjici ки пол вер] аются искусственному старению, когда fiocjic ряда закономерных изменений образуются крупные педслящиеся клоки, обладающие способностью к дательному (месяцами) переживанию. Пели в клетках не функционируют механизмы репликативного старения, ю клетки претерпеваю! кризис. Явление кризиса сопровождается одновременно идущими процессами пролиферации и гибели клеток. Не происходит образования крупных, дли гельно переживающих клеток.

а. При помощи длительною блокирования функции тсломеразы ингибиторами обрагных транскриптаз в культуре бессмертных фиброблаеггов мыши наблюдали явление искусственного старения клеток

б. Долювременное блокирование функции (еломеразы в опухолевых клетках человека приводило культуру в состояние кризиса.

в. С помощью долговременно) о блокирования функции теломеразы показано существование механизмов репликативного старения в теломеризованных клетках.

2. С помощью введения юна каталитического компонента теломеразы (hTERT) в диплоидные фибробласты кожи взрослою человека получены бессмертные фибробласты человека. Показано, чю по всем изученным признакам зги клетки нормальны и напоминают эмбриональные фибробласты человека. Эти клетки способны к длительной пролиферации (они прошли свыше 200 удвоений популяции), сохраняют нормальный кариотип. зависимость пролиферации от ei.mopoi ки и прикрепления, в них сохранены механизмы реп нткативното старения и не изменена работа рибосомных генов Длина теломер и насыщающая плотность пролиферации этих клепок соответствуют эмбриональным клеткам человека

3 Введение гена ЬТЬКГ tic приводи! к иччортали;лП1н скелетных чиобластв человека В клетках при ном сохраняется способность к дифференцировке.

4. Показано, чю тел о мера üi oíbciс i веп па за pean инлнию синтеза Д1ПС в ядрах перитонеальных резидентных макрофатов в составе ¡ eiepoKapnomm с пролиферируюшими KieiKdMH Гетсрокарионы с макрофагами являются первой моделью, позволяющей быефо и с мини мадытыми лат para ми материалов начать ингибиторы теломеразы на клеточном уровне.

5 Установлено, что активность чтдогенпой Р-галактозилазы <рН 6 0) лс является исключительным признаком стареющих клеток. 'ha активность обнаружена в разнообрашых л ли i елыто нсдслящихся клетках (стареющих, дифференцированных и в состояниях нролиферагивно! о покоя),

6 На различных линиях мышей продемонстрирована корреляция между продолжи г ел ьнос i ью жи jhh мыши, пролнферативным потенциалом ее эмбриональных фибробластов и продолжительностью переживания in vitro состарившихся педелящихся фибробластов. Продолжительность переживания педеляшихся фибробласгов может являться гестом для изучения механизмов старения, дополнительным к изучению пролнферативного погенциала

7 Показана связь теломеразной активносги с нролиферагивным состоянием клеток. При переходе в неделяшссся состояние тсломераэная ак!ивносгь уменьшается, при возврате к активной пролиферации увеличение теломеразной активносги предшествует началу репликации.

8. Обнаружена новая нематричная полимеразная активность. Она напоминает активность терминальной дезоксирибонуклеошлтрансферазы (ТДТ). но не иш ибируется специфическим hhi ибитором ТДТ.

9 Обнаружено, что существует два нуги образования спошанно трансформированных клеток мыши- е реактивацией телочеразы и без псе. 1-сли обращавшиеся клетки лишены теломеразной активности, то они обладают о!раниченным нролиферативным потенциалом.

10 Предложена петлевая модель струкгуры тсломер, позволяющая объяснить многие противоречия iе.юмерной теории.

11 Можно по татать что ан траком я герани я с помошгто подавления телочеразы будет малоэффективной, :ак как:

а. Эффект после подавления 1ел<>меразы наступает с задержкой, необходимой укорачивания тсломер вслед ст вис педорепликании Время ной задержки составляет дсся1ки удвоении популяции, что равноценно десяткам дней

Ъ Опухолевые клетки человека в результате укорачивания их i ел о мер переходят в со<тоянис кризиса, при коюроч мнтокраню возрастает их теистическая изменчивость Учитывая ipo\i<unoc число клеток в опухоли (обычно более Ю10) и ич повышенную в ре wit дате кризиса генетическую изменчивое п., можно ожидать быстрою появления ю 1Сгок, устойчивых к предложенной терапии.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.Е.Егоров. И А Пруловский, Л.В.Зеленин Синтез ДНК в гибридах макрофагов и клеток культур с различной нролиферативной активностью. Докл Акад. Наук, 1984, т.276, с. 961-965.

2. Е.Е.Егоров, И А. Пру до веки й, А В.Зеленин Макрофаги не тормоз вступление н синтез Д1IK ядер не злокачествен и мх пролиферирующих клеюк в гегерокарионах Докл. Акад. Наук, 1985, т.280. с. 1016-1019

3.1A Prudovsk у, Y.E.Yegorov, А V Zelenm DNA synthesis in the heterokanons of

nondividing differentiated celts and culture cells with various proliferative potentials "Cell Differentiation1985, 17,239-246

4.1 A Prudovsky, Y.E.Yegorov, R R Gumeniuk, A V Zelenm The capacity of cultured animal cells to induce the reactivation of DNA synthesis in dormant nuclei in hcterokaryons and its dependence on culture proliferative potential Acta Biologtca Hungarica, 1986, 37s, II

5.1A Prudovsky, Y.E.Yegorov, R R Gumeniuk, E M Kapnik, A V Zelenin Terminal cell differentiation and the regulation of DNA synthesis m hetcrokaryons Cell Differentiation, 1987,20s, 91

6. Е.Е.Егоров, P P. Гу мешок И А,Пруловский, А.В.Зеленин Синтез ДНК в гибридах макрофагов и различных клеток с ограниченной способностью к пролиферации Биополимеры и клетки, 1987, тЗ, с. 313-317

7. А V Zelenin, I A Prudovsky, Y.E.Yegorov, R.R Gumeniuk, E M Kapnik Macrophages and nucleated erythrocytes, two types of non-proliferation at terminal differentiation The Journal of Cell Biology, 1988, 107, 528a

8.1A Prudovsky,R R Gumemuk,Y.E.Yegorov,A I Poletayev, P M Chumakov.A V Zelenin Immortalized phenotype and the presence of active oncogenes correlate with the capacity of culture cells to induce reactivation of DNA synthesis in macrophage nuclci in hcterokanons Cell Differentiation and Development, 1989, 26,221-228

9.1 A Prudovsky,R R Gumemuk,Y.E.Yegorov,A V Zelenm Resident macrophages specifically inhibit DNA synthesis in the nuclei of transformed cells in heterokanons International Journal of Cancer, 1989,44,1005-1008

10. Y.E.Yegorov, I A Prudovsky, A V Zelenm. R R Gumeniuk, Y V Fedorov, E M Kapnik, Non-uniformity of the mechanisms maintaining terminally differentiated cclls in non-dividing state Cell Cycle and Differentiation, June 12-17,1989, Ubhee, Chekhoslovakia, p9.

11. А.В.Зенеиин, И.А Пруловский, Р.Р.Гуменюк, Е.Е.Егоров, Ь.М.Капиик, Р.Ь. Касимов, Ю.В.Федоров. Исследование природы блока пролиферации в дифференцированных клетках на модели i етерокарионов: различные типы о1сутствия пролиферации в клетках при терминальной дифференцировке. Онтогенез, 1990, т 21, с.32-40

12. И.А.ПрудовскиЙ, Е.Е.Егоров, Р.К Касимов, Ь.М.Капник. Р Р.Гуменюк. А.А.Ходяков, Г.Е.Онищенко, Т.Тсонг Позитивная и iicrai ивная регуляция репликации в шбридных клетках. Молекулярная биология, 1991, i 25, с. 1157-1180

13. Ю.В.Федоров, Е.Е.Егоров, А,В.'Зеленин, 1 епарин гормозит пролиферацию диплоидных фибробластов человека в двух периодах клеточного цикла. Докл. Акад. Наук, 1994, т.ЗЗб, с.704-706

14. Y.E.Yegorov, Y V Fedorov, I A Prudovsky Common mechanisms of nonproliferation in high-density cultures, different iatcd cells and under the influence of heparin Molecular Biology of the Cell, 1994, 5s, 16a

15. Y.E.Yegorov, D N Chernov Spontaneous transformation of mouse cmbryonic fibroblasts with or without acquisition of telomcrase activity and artificial senescence of transformants Molecular Biology of the Cell, 1995,6s, 95a.

16. Y.E.Yegorov, D N Chernov, S S Akimov, N L Bolslteva, A A Kraycvsky, A V Zelcmn Reverse transcriptase inhibitors suppress telomerase function and induce sen csce nec-like processes m cultured mouse fibroblasts FFBS Letters, 19%, ISO, 115-118

17. Д И Чернов, Е.Е.Егоров. Г Г.Акимов. 1еломерашая активность клеток мыши при снотанной трансформации. Докл Акал Наук, 1996, i 349, с 121-123

18. Y.E.Yegorov, D N Chernov, S S Akimov, A V 7elcJiin Reverse transcnptase inhibitors suppress telomerase activity and inducc scnescence-like processes in cultured mouse fibroblasts Molecular Biology of the Cell, 1996, 7s, 534a

19. Е.Е.Егоров Теломераза, старение, рак Молекулярная биолог ия 1997,31,16-25

20. Е.Е.Егоров. Л Н Чернов. С С.Акимов, НЛ.Ьольшева, А.А.Краевский, А В Зеленил. Действие ишибиторов обратных траискриглаз на функцию >еломеразы в иммортальпых фибробластах мыши Молекулярная биолот ия 1997, 31,130-136

21. Е.Е.Егоров, А X Ахмалишева, К) Б Смирнова, Д Ь Шинкарев, Д Н Чернов,

А В Зеленин, А А Краевский А шло (ими лип, блокируя функцию (е.гочеразы, уменьшает длину теломерных повторов в различных культивируемых клегках 1 епетнка, 1997, 33, 1444-1446

22. Е.Е.Егоров, Л Н Чернов, С С Акимов, А X Ахмалишева, Ю Б Смирнова,

Д К Шинкарев, И В Семенова, И Н Егорова, А В Зеленин Подавление функции Iеломеразы аналотами нуклеозидов Биохимия, 1997,62, 1516-1527

23. Y.E.Yegorov, S S Akimov, R Hass, A V Zetenin, I A Prudovsky Endogenous beta-

gal actosidase activity in continuously nonpro! iterating cclls Experimental Cell Research, f 99ft, 243, 207-211

24. Е.Е.Егоров, Д H Чернов. С С Акимов, A X Ахмалишева, К.В.Попов, Р Хасс, И.А.Нрудовский, А.В.Зеленин. Теломеразпая активность клеток при изменениях их пролиферативпого сосюяния Биологические мембраны, 1998,15,630-638

25. Е.Е.Егоров RoKpyi тсломеразы. Молекулярная биология, 1999,33, 385-392

26. Y.E.Yegorov, S Ч Akimov, А К Akhmalisheva, I V Semenova, Y В Smimova,

A A Kracvsk у, А V Zelcmn Blockade of telomerase function in various cells Anti-Cancer Drug Design, 1999, 14, N4, 305-316

27. Е.Е.Егоров. "Теломсризацпя" клеток как метод i енной терапии в кн ■ Генная терапия- медицине будущею, ред. А В Зеленин, ВИНИТИ РАН, Москва, 2000 г.,с.130-132

28. Е.Е.Егоров. И.В Сеченова, Д 11 Караченцев. М JT.Семенова, А В.Зеленин Корреляция выживаемое!и эмбриональных фибробластов и их пролиферативпою потенциала с продолжительное) ью жизни мышей различных линиИ Биоло! ические мембраны, 2000, 17,685-688

29. Е.Е.Ргоров Теломеры, ге юмерная ДНК, хромосомы. Ьиоло1 ические мембраны, 2001, 18, N3,240-247

30. Y.E.Yegorov, I V Semenova, D N Karachentsev, M L Semenova, S S Akimov,

I N Yegorova, A V Zclenin Senescent accelerated mouse (SAM) - a mode! that binds in vivo and in vrtro aging Journal of Anti-Aging Medicine, 2001,4, N1,41-49

31. Г В Казнмирчук, Е.Е.Егоров. Д Н Караченмев. А В.Зеленин Влияние азидотимидина на процесс реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гегерокарионоа. Молекулярная биология, 2001, 35, 908-911

32. Егоров Е.Е, Теломераза и канцерогене! Гвропейская школа по онкологии' Рак у пожилых: достижения и перспективы. Москва 19-20 ноября 2001 г Материалы школы стр 1-18

33. Е.Е.Егоров, Г В Казнмирчук, С М Терехов, Д П Карачснисв, X С Вишнякова,

Ю А Мещерякова, А В Зелепип Имчортаипаиия клеюк человека и индукция сигиеза ДНК в гстерокарионах Молекулярная биология, 2002, 36,94-95

34. Егоров Е.Е., Сеченова И В., Андреева В В . Акимов С.С . Прудовский И А . Зеленин А.В. Пролифератившм: старение эмбриональных фибробласю» японских ускоренно

стареющих мышей (SAM) сопровождается параллельным ослабление« ответа на различные факторы pocia Молекулярная биология, 2002,36. №3,466-471

35. Е.Е.Егоров, Н.Н.Вейко, 1 .Г. Цвет кока, С.М Терехов, Д. Н. Караченцев,

X С Вишнякова, Т Д.Смирнова, Н А.Ляпунова, А В .Зеленин Метилирование, копийноаь и активность рибосомных генов не изменяются после "!еломсригапии" фибробласюв человека. Докл. Акад. Наук, 2002, 386, N5, 703-704

36. Е.Е.Егоров, С М Терехов, X С Вишнякова, Д Н Караченцев, М А Эль даров, Т Д Смирнова, Ю А.Мсщсрякова, А.В Зеленин Иммортализация нормальных фибробластов кожи в ¡росло! о человека путем введения iena каталитического комнонеша геломеразы. Биологические мембраны, 2002, 19,483-490

37. Y.E.Yegorov, Е V Kazimirchuk, S М Terek ho v, D N Karachentsev, F A Shirokova, A L Khandazhinskaya, J A Mesh cheryak ova, D R Corey, A V Telenin Telomerase-deperidcnt reactivation of DNA synthesis in macrophages implies alteration of telomeres Cell Biology International, 2002,26, I01<M027

38. Е.Е.Егоров, С M Терехов, X С Вишнякова, Д Н Караченцев, F В Казимирчук, Т Г Цвегкова, Н И Вейко, ТД Смирнова, А С Макаре н ков, М А Эль л арок,

Ю А Мещерякова, Н А Ляпунова, А В Зеленин Теломеризация - способ получения иммортальныч клепок человека, сохраняющих нормальные свойства Онтогенез, 2003, 34,183-192

39. V.E.Vegorov, А V Zelenm Duration of senescent cell survival in viiro as a characteristic of organism longevity, an additional to (he proliferative poteniial of fibroblasts FEBS Letters, 2003, 541,6-10

40. Е.Е.Егоров Роль гсломераш в канцерогенезе в книге: Канцерогенез, Москва. Медицина, 2003 (в печати).

РНБ Русский фонд

2006-4 35605

Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102 Тираж 100 экз. Заказ №55

о 4 №11 7303

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Егоров, Егор Евгеньевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ 5 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Теломераза

2. Теломеры

3. Теломераза и опухоли

4. Способы подавления опухолей, опосредованные теломерами и теломеразой

5. Теломеризация клеток

6. Противоречия теломерной теории

7. Японские ускоренно стареющие мыши (SAM)

8. Изучение регуляции пролиферации в опытах на гетерокарионах

9. Кариологическая нестабильность межвидовых гибридов 80 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 86 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ДЛИТЕЛЬНОЕ ПОДАВЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ТЕЛОМЕРАЗЫ

Изучение длительного подавления функции теломеразы в клетках грызунов

Изучение длительного подавления функции теломеразы в клетках человека

Обсуждение результатов по длительному подавлению функции теломеразы

2. СПОНТАННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ В УСЛОВИЯХ ПОДАВЛЕНИЯ ФУНКЦИИ ТЕЛОМЕРАЗЫ 139 Обсуждение опытов со спонтанными трансформантами

3. ГИПОТЕЗА ПЕТЛЕВОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ТЕЛ ОМЕР

4. СЕГРЕГАЦИЯ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА В СОМАТИЧЕСКИХ ГИБРИДАХ С КЛЕТКАМИ МЫШИ 150 Обсуждение механизмов сегрегации хромосом

5. ТЕЛОМЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ПРИ ИЗМЕНЕНИЯХ ИХ ф ПРОЛИФЕРАТИВНОГО СОСТОЯНИЯ

Обсуждение связи теломеразной активности с пролиферативным состоянием

6. ЭКСПРЕССИЯ ЭНДОГЕННОЙ р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ В НЕДЕЛЯЩИХСЯ КЛЕТКАХ 165 Обсуждение опытов по р-галактозидазе

7. ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОК ЯПОНСКИХ УСКОРЕННО СТАРЕЮЩИХ МЫШЕЙ SAM 171 Обсуждение опытов с японскими ускоренно стареющими мышами 180 Время переживания состарившихся клеток - новый инструмент изучения старения ф 8. ВВЕДЕНИЕ ГЕНА КАТАЛИТИЧЕСКОГО КОМПОНЕНТА ТЕЛОМЕРАЗЫ

В КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА

Обсуждение опытов по теломеризации клеток человека

9. ОПЫТЫ НА ГЕТЕРОКАРИОНАХ С МАКРОФАГАМИ

Обсуждение опытов с гетерокарионами

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль теломер и теломеразы в процессах клеточного старения и канцерогенеза"

Теломерами называют концевые участки хромосом, образованные теломерной ДНК и белками. Оказалось, что у человека и всех позвоночных теломерная ДНК на всех хромосомах представлена в виде монотонного повтора TTAGGG, общей длиной в сотни и тысячи т.п.н. Теломерная ДНК соматических клеток укорачивается при пролиферации клеток, вследствие неполной репликации концевых участков (концевой недорепликации). Короткие теломеры вызывают явление репликативного старения, когда пролиферация клеток останавливается. Полагают, что репликативное старение у человека служит мощным барьером на пути развития рака. Нарушение механизмов репликативного старения (происходит в подавляющем большинстве случаев канцерогенеза) приводит к отмене теломерного контроля пролиферации, и клетки продолжают размножаться, несмотря на чрезмерное укорачивание, вплоть до полного исчезновения, теломер. В этом случае механизмы репарации ДНК пытаются предотвратить полное разрушение генома. Сверхкороткие теломеры воспринимаются клеткой, как разрывы хромосом. Такие разрывы "чинятся" путем их соединения; происходят теломерные слияния. В результате образуются хромосомы, имеющие по две центромеры. При прохождении через митоз дицентрик, с большой вероятностью, образует хромосомный мост, который разрешается случайным разрывом хромосомы. Образуются две клетки: одна с нехваткой генов, другая с лишними копиями и с хромосомным разрывом. Клетка с нехваткой генов обычно погибает, а с лишними копиями и хромосомным разрывом продолжает размножаться. Последовательность событий "слияние-мост-разрыв" многократно повторяется, генерируя на каждом этапе новый генотип, состоящий из базового набора генов и некоторого меняющегося довеска. На каком-то этапе хромосомный разрыв может "залечиться" и превратиться в теломеру. Процесс "слияние-мост-разрьш" приводит к многократному увеличению скорости изменчивости клеток и в условиях организма (при наличии опухоли, вес которой обычно измеряется граммами) к очень быстрой селекции высокозлокачественных и устойчивых к предложенной терапии клеток. Явление концевой недорепликации и существование специального фермента, ее компенсирующего было предсказано в 1971 г. Алексеем Оловниковым. В 1985 году этот фермент, получивший название теломераза, был обнаружен в клетках простейшего Tetrahymena, спустя несколько лет в клетках большинства эукариот. Оказалось, что фермент в полную силу работает в клетках половой линии, надстраивая их теломеры и, таким образом, обеспечивая клеточное бессмертие и возможность нашего существования. Незначительную активность теломераза проявляет в стволовых и в ряде клеток иммунной системы, частично компенсируя концевую недорепликацию. Активность появляется на короткий срок в период интенсивной пролиферации (например, после встречи ф предшественника В-лимфоцита с антигеном). Активацию фермента теломеразы обнаруживают в 85-90% всех опухолей человека. На сегодняшний день это наиболее общий маркер рака. Фермент теломераза обеспечивает опухолевым клеткам возможность безграничной пролиферации, что в свою очередь предоставляет им время и, соответственно, возможность изменяться, выживать и захватывать новые ниши в организме. Если бы в процессе канцерогенеза не происходило активации теломеразы, то клетки, в большинстве случаев, не смогли бы дожить до злокачественных стадий, и не было бы абсолютного большинства раковых опухолей. Все клетки человека в раннем эмбриогенезе обладают теломеразной активностью, которая по мере развития выключается во все большой доле клеток. Человек устроен таким образом, что клетки организма, которым суждено много пролиферировать Ш сохраняют ограниченную, временно индуцируемую теломеразную активность. Это позволяет до какой-то степени стабилизировать хромосомы этих клеток и уменьшить изменения, происходящие с возрастом. Стволовые клетки и разного ранга предшественники меняются с возрастом медленнее, чем это было бы при полном отсутствии теломеразной активности. В подавляющем большинстве клеток человеческого организма происходит очень надежная репрессия теломеразы. Это служит эффективным противораковым механизмом, которым обладают, видимо, крупные, долгоживущие виды млекопитающих, включая человека. При работе с клетками человека in vitro практически никогда не наблюдают спонтанной активации теломеразы в нормальных клетках. Есть серьезные основания полагать, что медицина будущего будет во многом основываться на клеточно-заместительных технологиях. Благодаря развитию цивилизации население земного шара прогрессивно стареет. Продолжительность жизни людей сильно превысила ту, которая бьша выработана в процессе естественного отбора. Поэтому естественные ресурсы человеческого тела оказываются недостаточными для нормальной жизни в возрасте, превышающем возраст людей каменного века (до 40 лет). В процессе старения происходит гибель клеток организма, которая не может быть восполнена регенерацией. Со временем потеря клеток приводит к ослаблению функций органов и тканей, уменьшению их надежности, развитию болезней, связанных со старением, и в итоге к гибели организма. Помимо собственно старения, любые болезни и травмы приводят к потерям клеток. Бывают и специфические болезни, выражающиеся в прогрессивной потере клеток. В 1998 г. впервые было показано, что введение гена каталитического компонента теломеразы способно иммортализовать клетки человека, т.е. придать им способность проходить в культуре неограниченное число делений. Исследователи не наблюдали никаких побочных последствий такой иммортализации. Мы полагаем, что наиболее реалистичным подходом, позволяющим получать достаточное для клеточно-заместительной терапии количество клеток, является временная экспрессия гена каталитического компонента теломеразы в клетках человека in vitro. При этом теломераза будет удлинять теломеры, но не будет происходить генетической модификации клеток. Такая процедура позволит нарастить необходимую клеточную массу и провести в случае надобности генно-инженерную коррекцию дефекта. Таким образом, клеточнозаместительные технологии могут оказаться необходимыми и для генной терапии. Возможно, что основные операции по "лечению больных генов" будут производиться вне тела пациента с последующим введением

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Егоров, Егор Евгеньевич

выводы

1. Долговременное блокирование функции теломеразы в бессмертных клетках приводит к укорачиванию теломер, что, в свою очередь, может вызывать два эффекта. Если в клетках сохранены механизмы репликативного старения, клетки подвергаются искусственному старению, когда после ряда закономерных изменений образуются крупные неделящиеся клетки, обладающие способностью к длительному (месяцами) переживанию. Если в клетках не функционируют механизмы репликативного старения, то клетки претерпевают кризис. Явление кризиса сопровождается одновременно идущими процессами пролиферации и гибели клеток. Не происходит образования крупных, длительно переживающих клеток. а. При помощи длительного блокирования функции теломеразы ингибиторами обратных транскриптаз в культуре бессмертных фибробластов мыши наблюдали явление искусственного старения клеток. б. Долговременное блокирование .функции теломеразы в опухолевых клетках человека приводило культуру в состояние кризиса. в. С помощью долговременного блокирования функции теломеразы показано существование механизмов репликативного старения в теломеризованных клетках.

2. С помощью введения гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в диплоидные фибробласты кожи взрослого человека получены бессмертные фибробласты человека. Показано, что по всем изученным признакам эти клетки нормальны и напоминают эмбриональные фибробласты человека. Эти клетки способны к длительной пролиферации (они прошли свыше 200 удвоений популяции), сохраняют нормальный кариотип, зависимость пролиферации от сыворотки и прикрепления, в них сохранены механизмы репликативного старения и не изменена работа рибосомных генов. Длина теломер и насыщающая плотность пролиферации этих клеток соответствуют эмбриональным клеткам человека.

3. Введение гена hTERT не приводит к иммортализации скелетных миобластов человека. В клетках, при этом, сохраняется способность к дифференцировке.

4. Показано, что теломераза ответственна за реактивацию синтеза ДНК в ядрах перитонеальных резидентных макрофагов в составе гетерокарионов с пролиферирующими клетками. Гетерокарионы с макрофагами являются первой моделью, позволяющей быстро и с минимальными затратами материалов изучать ингибиторы теломеразы на клеточном уровне.

5. Установлено, что активность эндогенной р-галактозидазы (рН=6.0) не является исключительным признаком стареющих клеток. Эта активность обнаружена в разнообразных длительно неделящихся клетках (стареющих, дифференцированных и в состояниях пролиферативного покоя).

6. На различных линиях мышей, продемонстрирована корреляция между продолжительностью жизни мыши, пролиферативным потенциалом ее эмбриональных фибробластов и продолжительностью переживания in vitro состарившихся неделящихся фибробластов. Продолжительность переживания неделящихся фибробластов может являться тестом для изучения механизмов старения, дополнительным к изучению пролиферативного потенциала.

7. Показана связь теломеразной активности с пролиферативным состоянием клеток. При переходе в неделящееся состояние теломеразная активность уменьшается, при возврате к активной пролиферации, увеличение теломеразной активности предшествует началу репликации.

8. Обнаружена новая нематричная полимеразная активность. Она напоминает активность терминальной дезоксирибонуклеотидтрансферазы (ТДТ), но не ингибируется специфическим ингибитором ТДТ.

9. Обнаружено, что существует два пути образования спонтанно трансформированных клеток мыши: с реактивацией теломеразы и без нее. Если образовавшиеся клетки лишены теломеразной активности, то они обладают ограниченным пролиферативным потенциалом.

10. Предложена петлевая модель структуры теломер, позволяющая объяснить многие противоречия теломерной теории.

11. Можно полагать, что антираковая терапия с помощью подавления теломеразы будет малоэффективной, так как: а. Эффект после подавления теломеразы наступает с задержкой, необходимой для укорачивания теломер вследствие недорепликации. Время этой задержки составляет десятки удвоений популяции, что равноценно десяткам дней. б. Опухолевые клетки человека в результате укорачивания их теломер переходят в состояние кризиса, при котором многократно возрастает их генетическая изменчивость. Учитывая громадное число клеток в опухоли (обычно более Ю10) и их повышенную в результате кризиса генетическую изменчивость можно ожидать быстрого появления клеток, устойчивых к предложенной терапии.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я хочу выразить мою глубочайшую благодарность всем людям, которые помогали мне и внесли вклад в эту диссертационную работу. Это, прежде всего:

Александр Владимирович Зеленин - научный консультант при написании этой диссертации, заведующий Лабораторией, в которой создалась атмосфера, способствующая интердисциплинарному подходу 6 биологии, руководитель моей кандидатской работы.

Игорь Александрович Прудовский - человек, заложивший во мне серьезное отношение к работе.

Александр Антонович Краевский - явившийся инициатором работ по теломеразе, сильно расширивший мое понимание клеточной биологии.

Алексей Матвеевич Оловников и Jerry W. Shay - люди, в общении с которыми возникали и рушились разнообразные теоритические построения, являющиеся поводом для проведения дальнейших экспериментов.

Многие из моих многочисленных соавторов: С.С.Акимов, А.Х.Ахмалишева, В.В.Андреева, В.Е.Барский, Н.Л.Болынева, Н.Н.Вейко, Х.С.Вишнякова, И.Н.Егорова, В.Ю.Золотарев, Е.В.Казамирчук, Д.Н.Караченцев, А.ЮЛупатов, Ю.А.Мещерякова, К.В.Попов, И.В.Семенова, М.Л.Семенова, Ю.Б.Смирнова, Т.Д.Смирнова, С.М.Терехов, Ю.В.Федоров, Л.И.Федорова, Т.Г.Цветкова, Д.Н.Чернов, Д.Б.Шинкарев, Е.А.Широкова, А.Л.Хандажинская, М.А.Эльдаров, D.R.Corey, R. Hass.

Автор выражает искреннюю благодарность всему коллективу Лаборатории функциональной морфологии хромосом.

Особо хочу поблагодарить Вишнякову Хаву Сафиулловну за помощь в подготовке диссертации.

Хочу поблагодарить Медико-биологический факультет Московского Медицинского Университета за хорошее образование и В.Н.Ярыгина, моего первого научного руководителя, за то, что он направил меня в Институт молекулярной биологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение работы хочется подвести некоторые итоги. 1. С помощью блокирования функции теломеразы был получен феномен искусственного старения клеток. Однако в реальной практике лечения рака этот результат, видимо, крайне маловероятен. Особенность человеческого организма состоит в крайне надежной репрессии теломеразы в соматических клетках. В большинстве случаев, реактивация теломеразы при канцерогенезе происходит в процессе выхода клеток из состояния кризиса, когда наблюдается многократное повышение генетической изменчивости. Поскольку эти клетки попали в состояние кризиса, то в них разрушены или нейтрализованы механизмы репликативного старения. Поэтому подавление теломеразы в опухолевых клетках человека возвращает их в состояние кризиса, но не вызывает репликативного старения. А это значит, что снова будет происходить чрезмерное увеличение генетической нестабильности. В отличие от кризиса в процессе становления опухоли, этот кризис будет захватывать существенно большее число клеток. Поэтому, несмотря на то, что большинство клеток будет погибать, довольно быстро возникнут клетки, устойчивые к предложенной терапии. В силу всего вышесказанного, а также из-за того, что при подавлении теломеразы эффект наступает с задержкой, необходимой для укорачивания теломер в результате недорепликации, подавление теломеразы, как самостоятельный метод лечения рака, вряд ли достигнет больших успехов. Гораздо более подходящими для терапии нам кажутся методы воздействия на опухолевые клетки, которые используют теломеразу не как непосредственную мишень, а как маркер опухолевых клеток и повреждающие клетки с активно работающим ферментом.

Усиление иммунной реакции на теломеразные пептиды, использование конструкций с промоторами hTERT (которые будут активными только в клетках с работающей теломеразой), встраивание с помощью теломеразы в теломеры опухолевых клеток фотосенсибилизаторов - вот вероятные пути развития антиопухолевой терапии, связанные с теломерами и теломеразой.

2.Опыты по введению гена каталитического компонента теломеразы не выявили какихлибо нарушений в регуляции размножения теломеризоваиных клеток. По двум показателям: скорости размножения и насыщающей плотности пролиферации клетки стали похожими на более молодые эмбриональные фибробласты человека. Можно предположить, что для успешной иммортализации с помощью введения гена hTERT разнообразных дифференцированных клеток потребуется тщательный подбор условий культивирования, которые должны будут имитировать условия, в которых происходит размножение данных клеток в организме. Таким образом, развитие этой технологии * позволит не только создавать материал для клеточно-заместительной терапии, но и будет способствовать общему развитию технологии выращивания клеток in vitro. Успешная иммортализация клеток с помощью введения hTERT означает, что, по крайней мере, в части клеточной популяции все возникающие повреждения полностью репарируются. Поэтому сам факт успешного эксперимента является лучшим тестом на адекватность условий культивирования.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Егоров, Егор Евгеньевич, Москва

1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Д., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Д. Молекулярная биология клетки. Москва, Мир, 1994,3, 452.

2. Акимов С.С., Масиаг Т., Зеленин А.В., Капник Е.М., Попов К.В., Прудовский И.А. Взаимозаменяемость факторов роста в раннем G0-G1 периоде клеточного цикла. 1998, Доклады Академии Наук, 359, 557-560.

3. Большева Н.Л., Лупатов А.Ю., Егоров Е.Е., Золотарев В.Ю., Егорова И.Н., Зеленин А.В. Скорость сегрегации хромосом в соматических гибридах человек-мышь контролируется геномом мыши. Доклады Академии Наук, 1993, 330, 516-519.

4. Вейко Н.Н. Структурно-функциональная организация рибосомных повторов человека // Автореферат дисс. докт. биол. наук. Москва. 2001.

5. Вейко Н.Н., Ляпунова Н.А., Богуш А.И., Цветкова Т.Г., Громова Э.В. Определение количества рибосомных генов в индивидуальных геномах человека. Сравнение результатов молекулярного и цитогенетического анализа. Молекулярная биология,. 1996.30. 1076-1084.

6. Вильсон Э. Клетка и ее роль в развитии и наследственности. М.-Л. ГИБМЛ 1936,1,211212.

7. Егоров Е.Е., Прудовский И.А., Зеленин А.В. Синтез ДНК в гибридах макрофагов и клеток культур с различной пролиферативной активностью. Докл. Акад. Наук, 1984, 276, 961-965.

8. Егоров Е.Е. Регуляция репликации в гибридах и цибридах неделящихся дифференцированных и пролиферирующих клеток. Диссертация канд. биол. наук, Москва, 1985.

9. Егоров Е.Е., Прудовский И.А., Зеленин А.В. Макрофаги не тормозят вступление в синтез ДНК ядер незлокачественных пролиферирующих клеток в гетерокарионах. Докл. Акад. Наук, 1985,280, 1016-1019.

10. Егоров Е.Е., Гуменюк P.P., Прудовский И.А., Зеленин А.В. Синтез ДНК в гибридах макрофагов и различных клеток с ограниченной способностью к пролиферации. Биополимеры и клетки, 1987, .3, 313-317.

11. Егоров Е.Е. Теломераза, старение, рак. Молекулярная биология. 1997,31,16-25.

12. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Ахмалишева А.Х., Смирнова Ю.Б., Шинкарев Д.Б., Семенова И.В., Егорова И.Н., Зеленин А.В. Подавление функции теломеразы аналогами нуклеозидов. Биохимия, 1997а, 62,1516-1527

13. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Большева Н.Л., Краевский А.А., Зеленин А.В. Действие ингибиторов обратных транскриптаз на функцию теломеразы в иммортальных фибробластах мыши. Молекулярная биология. 1997b, 31, 130-136.

14. Егоров Е.Е., Ахмалишева А.Х., Смирнова Ю.Б., Шинкарев Д.Б., Чернов Д.Н., Зеленин А.В., Краевский А.А. Азидотимидин, блокируя функцию теломеразы, уменьшает длину теломерных повторов в различных культивируемых клетках. Генетика, 1997с, 33, С. 1444-1446.

15. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Ахмалишева А.Х., Попов К.В., Хасс Р., Прудовский И.А., Зеленин А.В. Теломеразная активность клеток при изменениях их пролиферативного состояния. Биологические мембраны, 1998, 15,630-638.

16. Егоров Е.Е. Вокруг теломеразы. Молекулярная биология, 1999,33, С. 385-392.

17. Егоров Е.Е. "Теломеризация" клеток как метод генной терапии, в кн.: Генная терапия-медицине будущего, ред. А.В.Зеленин, ВИНИТИ РАН, Москва, 2000, 130-132

18. Егоров Е.Е., Семенова И.В., Караченцев Д.Н., Семенова М.Л., Зеленин А.В. Корреляция выживаемости эмбриональных фибробластов и их пролиферативного потенциала с продолжительностью жизни мышей различных линий. Биологические мембраны, 2000, 17,685-688.

19. Егоров Е.Е. Теломеры, теломерная ДНК, хромосомы. Биологические мембраны, 2001, 18,249-256.

20. Егоров Е.Е., Казимирчук Е.В., Терехов С.М., Караченцев Д.Н., Вишнякова Х.С., Мещерякова Ю. А.3еленин А.В. Иммортализация клеток человека и индукция синтеза ДНК в гетерокарионах. Молекулярная биология, 2002а, 36, 94-95.

21. Казимирчук Е.В., Егоров Е.Е., Караченцев Д.Н., Зеленин А.В. Влияние азидотимидина на процесс реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов. Молекулярная биология, 2001,35,908-911.

22. Краевский А.А. Модифицированные нуклеозиды и нукпеотиды, подавляющие репродукцию ВИЧ: анализ ситуации и вероятная перспектива. Молекулярная Биология, 1992,26, 725-744.

23. Краевский А.А. Пути поиска ингибиторов репродукции HIV среди нуклеотидов. Молекулярная Биология, 1994,. 28, 1245-1257.

24. Кулешов Н.П., Лурье И.В. Регистр хромосомных болезней человека. М.: АМН СССР, 1984. 235.

25. Лупатов А.Ю. Геномная нестабильность и пролиферативное старение при образовании иммортальных соматических гибридов человек-мышь. Дис.(канд. биол. наук) Москва, ИМБ РАН, 1995,109.

26. Оловников A.M. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Докл. Акад. Наук, 1971,. 201, 1496-1499.

27. Оловников A.M. Старение есть результат укорочения "дифферотены" в теломере из-за концевой недорепликации и недорепарации ДНК. Известия АН СССР. Серия биол., 1992, N4, 641-643.

28. Прудовский И.А., Сухарев С.И. Гибридизация клеток животных / В кн.: Методы культивирования клеток. Под ред. Г.П.Пинаева, Л.: Наука, 1988, с. 176-193.

29. Прудовский И.А., Егоров Е.Е., Касимов Р.Б., Капник Е.М., Гуменюк P.P., Ходяков А.А., Онищенко Г.Е., Тсонг Т. Позитивная и негативная регуляция репликации в гибридных клетках. Молекулярная биология, 1991,25, 1157-1180.

30. Сетков Н.А., Полуновский В.А., Епифанова О.И. Зависимость вступления клеток линии NIH3T3 в период синтеза ДНК от длительности их предварительного пребывания в состоянии покоя. Цитология, 1984,26,936-941.

31. Урываева И.В., Маршак T.JI., Захидов С.Т., Семенова M.JI., Делоне Г.В. Накопление с возрастом микроядерных аберраций в клетках печени ускоренно стареющих мышей линий SAM., Доклады Академии Наук, 1999,38,703-705.

32. Федоров Ю.В, Егоров Е.Е, Зеленин А.В. Гепарин тормозит пролиферацию диплоидных фибробластов человека в двух периодах клеточного цикла. Докл. Акад. Наук, 1994, .336, 704-706.

33. Чернов Д.Н., Егоров Е.Е., Акимов С.С. Теломеразная активность клеток мыши при спонтанной трансформации. Докл. Акад. Наук, 1996,349, С. 121-123.

34. Abercrombie M. Contact inhibition in tissue culture. In Vitro 1970, 6, 128-142.

35. Abuin M., Martinez P., Sanchez L. Localization of repetitive telomeric sequence (TTAGGG)n in four salmonid species., Genome, 1996, v. 39, p. 1035-1038.

36. Adelfalk C., Lorenz M., Serra V., von Zglinicki Т., Hirsch-Kauffmann M.,Schweiger M. Accelerated telomere shortening in Fanconi anemia fibroblasts~a longitudinal study. FEBS Lett., 2001,506,22-26.

37. Alfonso-De Matte M.Y., Yang H., Evans M.S., Cheng J.Q., Kruk P.A. Telomerase is regulated by c-Jun NH2-terminal kinase in ovarian surface epithelial cells. Cancer Res., 2002, 62,4575-4578.

38. Allshire R.C., Dempster M., Hastie N.D. Human telomeres contain at least three types of G-rich repeats distributed nonrandomly. Nucl. Acids Res., 1989,17,4611-4627.

39. Allsopp R.C., Vaziri H., Patterson C., Goldstein S., Younglai E.V., Futcher A.B., Greider C.W., Harley C.B. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1992,89,. 10114-10118.

40. Allsopp R.C., Chang E., Kashefi-Aazam M., Rogaev E.I., Piatyszek M.A., Shay J.W., Harley C.B. Telomere shortening is associated with cell division in vitro and in vivo. Exp. Cell Res., 1995,220, 194-200.

41. Aparicio O.M., Billington B.L., and Gottschling D.E. Modifiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S. cerevisiae. Cell, 1991, 66, 1279-1287.

42. Arai J., Yasukawa M., Ohminami H., Kakimoto M., Hasegawa A., Fujita S. Identification of human telomerase reverse transcriptase-derived peptides that induce HLA-A24-restricted antileukemia cytotoxic T lymphocytes. Blood, 2001,'97,2903-2907.

43. Arai K., Masutomi K., Khurts S., Kaneko S., Kobayashi K., Murukami S. Two independent regions of human telomerase reverse transcriptase are important for its oligomerization and telomerase activity. J. Biol. Chem., 2002,277, 8538-8544.

44. Autexier C., Pruzan R., Funk W.D., Greider.C.W. Reconstitution of human telomerase activity and identification of a minimal functional region of the human telomerase RNA. EMBO J. 1996, 15,5928-5935.

45. Avilion A.A., Piatyszek M.A., Gupta J., Shay J.W., Bacchetti S., Greider C.W. Human telomerase RNA and telomerase activity in immortal, cell lines and tumor tissues., Cancer Res., 1996,. 56, 645-650.

46. Bachand F., Autexier C. Functional regions of human telomerase reverse transcriptase and human telomerase rna required for telomerase activity and rna-protein interactions. Mol. Cell. Biol., 2001, 21, 1888-1897.

47. Bachand F., Boisvert F.M., Cote J., Richard S., Autexier C. The product of the survival of motor neuron (smn) gene is a human telomerase-associated protein. Mol. Biol. Cell, 2002,13, 3192-3202.

48. Bailey S.M., Cornforth M.N., Kurimasa A., Chen D.J., Goodwin E.H. Strand specific postreplicative processing of mammalian telomeres. Science, 2001, 293, 2462-2465.

49. Balajee A.S., Dominguez I., Bohr V.A., Natarajan A.T. Immunofluorescent analysis of the organization of telomeric DNA sequences and their involvement in chromosomal aberrations in hamster cells. Mutat. Res., 1996,372,163-172.

50. Bandyopadhyay D., Timchenko N., Suwa Т., Hornsby P.J., Campisi J., Medrano E.E. The human melanocyte: a model system to study the complexity of cellular aging and transformation in non-fibroblastic cells. Exp. Gerontol., 2001,36,1265-1275.

51. Baran N., Pucshansky L., Marco Y., Benjamin S., Manor H. The SV40 large T-antigen helicase can unwind four-stranded DNA structures linked by G-quartets. Nucl. Acids Res., 1997,25,297-303.

52. Barma D.K., Elayadi A., Falck J.R., Corey D.R. Inhibition of telomerase by BIBR 1532 and related analogues. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003,13, 1333-1336.

53. Barski G., Cornefert E. Characteristic of "Hybrid"-type clonal cell lines obtained from mixed culture in vitro. J. Nat. Cancer Inst., 1962, 28, 801-8? 1.

54. Bauer E.A., Silverman N., Busiek D.F., Kronberger A., Deuel T.F. Diminished response of Werner's syndrome fibroblasts to growth factors PDGF and FGF. Science, 1986, 234, 12401243.

55. Baumann P., Cech T.R. Protection of telomeres by the Ku protein in fission yeast. Mol. Biol. Cell, 2000.11,3265-3275.

56. Baumann P., Cech T.R. Potl, the putative telomere end-binding protein in fission yeast and humans. Science, 2001, 292,1171- 1175.

57. Baur J.A., Zou Y., Shay J.W., Wright W.E. Telomere position effect in human cells. Science, 2001,292,. 2075-2077.

58. Bayreuther K., Rodemann H.P., Hommel R., Dittmann K., Albiez M., Francz P.I. Human skin fibroblasts in vitro differentiation along a terminal cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1988,. 85,5112-5116.

59. Beattie G.M., Itkin-Ansari P., Cirulli V., Leibowitz G., Lopez A.D., Bossie S., Mally M.I., Levine F., Hayek A. Sustained proliferation of PDX-1+ cells derived from human islets. Diabetes, 1999,48, 1013-1019.

60. Beattie T.L., Zhou W., Robinson M.O., Harrington L. Functional multimerization of the human telomerase reverse transcriptase. Mol. Cell Biol., 2001,21,6151-6160.

61. Bednenko J., Melek M., Greene E.C., Shippen D.E. Developmentally regulated initiation of DNA synthesis by telomerase: evidence for factor-assisted de novo telomere formation. The EMBO Journal, 1997, 16,. 2507-2518.

62. Belair C.D., Yeager T.R., Lopez P.M., Reznikoff C.A. Telomerase activity: a biomarker of cell proliferation, not malignant transformation Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1997, 94,1367713692.

63. Bell E., Marek L.F., Levinstone D.S., Merrill C., Sher S., Young I.T. Eden M. Loss of division potential in vitro: aging or differentiation? Science, 1978, 202,1158-1162.

64. Benn P.A. Specific chromosome abberations in senescent fibroblast cell lines derived from human embryos. Am. J. Hum. Genet., 1976, 28,465-473.

65. Betts D., Bordignon V., Hill J., Winger Q., Westhusin M., Smith L., King W. Reprogramming of telomerase activity and rebuilding of telomere length in cloned cattle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2001, 98, 1077-1082.

66. Bianchi A., Smith S., Chong L., Elias P., de Lange TTRF1 is a dimer and bends telomeric DNA. EMBO J., 1997,16, 1785-1794.

67. Bicknell R. in Endothelial Cell Culture (Bicknell, R., ed) pp. xii and 136, Cambridge University Press, 1996, Oxford, United Kingdom '

68. Biessman H., Mason J.M., Ferry К., d'Hulst M., Valgeirsdottir K., Traverse K.L., Pardue M.L. Addition of telomere-associated HeT DNA sequences "heals" broken chromosome ends in

69. Drosophila. Cell, 1990, 61, 663-673.

70. Bisoffi M., Chakerian A.E., Fore M.L., Bryant J.E., Hernandez J.P., Moyzis R.K., Griffith J.K. Inhibition of human telomerase by retrovirus expressing telomeric antisense RNA. Eur. J. Cancer, 1998, 34,1242-1249.

71. Blackburn E.H. Structure and function of telomeres. Nature, 1991,350, 569-573.

72. Blasco M.A., Funk W., Villeponteau В., Greider C.W. Functional characterization and developmental regulation of mouse telomerase RNA. Science, 1995,269, 1267-1270.

73. Blasco M.A., Lee H.W., Hande M.P., Samper E., Lansdorp P.M., DePinho R.A., Greider C.W. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell., 1997,91,25-34.

74. Bodnar A.G., Ouellette M., Frolkis M., Holt S.E., Chiu C.P., Morin G.B., Harley C.B., Shay J.W., Lichtsteiner S., Wright W. E. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science., 1998,279, 349-352.

75. Boklan J., Nanjangud G., MacKenzie K.L., May C., Sadelain M., Moore M.A.S. Limited proliferation and telomere dysfunction following telomerase inhibition in immortal murine fibroblasts. Cancer Res., 2002,62,2104-2114.

76. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 1976, 72,248-254.

77. Breslow R.A., Shay J.W., Gazdar A.F., Srivastava S. Telomerase and early detection of cancer: a National Cancer Institute workshop. J. Nat. Cancer Inst., 1997, 89, 618-623.

78. Broccoli D., Young J.W.,de LangeT. Telomerase activity in normal and malignant hematopoietic cells. Proc. Natl .Acad. Sci. USA, 199-5,92, 9082-9086.

79. Brock G.J.R., Bird A.P. Mosaic methylation of the repeat unit of the human ribosomal RNA genes. Hum. Mol. Genet. 1997, 6,451-456.

80. Brown W.R.A., Mackinnon P.J., Villasante A., Spurr N., Buckle V.J., Dobson M.J. Structure and polymorphism of human telomere associated DNA. Cell, 1990,3, 119-132.

81. Brown J.P., Wei W., Sedivy J.M. Bypass of senescepce after disruption of p21Cipl/Wafl gene in normal diploid human fibroblasts. Science, 1997,277, 831-834

82. Bryan T.M., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., Reddel R.R. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. The EMBO Journal, 1995, 14, 4240-4248.

83. Bryce L.A., Morrison N., Hoare S.F., Muir S, Keith W.N. Mapping of the gene for the human telomerase reverse transcriptase, hTERT, to chromosome 5p 15.33 by fluorescence in situ hybridization. Neoplasia,. 2000, May-Jun; 2(3), 197-201.

84. Buchkovich K.J., Greider C.W. Telomerase regulation during entry into the cell cycle in normal human T cells. Mol. Biol. Cell, 1996, 7, 1443-1454.

85. Callen E., Samper E., Ramirez M.J., Creus A., Marcos R., Ortega J.J., Olive Т., Badell I., Blasco M.A., Surralles J. Breaks at telomeres and TRF2-independent end fusions in Fanconi anemia. Hum. Mol. Genet., 2002,11,439-444.

86. Carman T.A., Afshari C.A., Barrett J.C. Cellular senescence in telomerase-expressing Syrian hamster embryo cells. Exp. Cell Res., 1998,244, 33-42.

87. Carrel A. On the permanent life of tissues outside of the organism. J. Exp. Med., 1912,15, 516-528.

88. Carrel A., Ebeling A.H. Age and multiplication of fibroblasts. Journal of Experimental Medicine, 1921,34,599.

89. Chang L.M., Bollum F.J. Molecular biology of terminal transferase. CRC Crit. Rev. Biochem., 1986,21,27-52.

90. Chang L.M., Bollum F.J. Multiple roles of divalent cation in the terminal deoxynucleotidyltransferase reaction. J. Biol. Chem., 1990,265, 17436-17440.

91. Chang E., Harley C.B. Telomere length and replicative aging in human vascular tissues. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1995, 92, 1190-1194.

92. Chapon C., Cech T.R., Zaug A.J. Polyadenilation of telomerase ma in budding yeast. RNA,i1997,3, 1337-1351.

93. Chen J.L., Blasco M.A., Greider C.W. Secondary structure of vertebrate telomerase RNA., Cell, 2000,100,503-514.

94. Chen J.L., Opperman K.K., Greider C.W. A critical stem-loop structure in the cr4-cr5 domain of mammalian telomerase RNA. Nucleic Acids Res., 2002,30, 592-597.

95. Chiu C.P., Dragowska W., Kim N.W., Vaziri H., Yui J., Thomas Т.Е., Harley C.B., Lansdorp P.M. Differential expression of telomerase activity in hematopoietic progenitors from adult human bone marrow. Stem Cells 1996, 14,239-248.

96. Chong L., van Steensel В., Broccoli D., Erdjument-Bromage H., Hanish J., Tempst P., de Lange T. A human telomeric protein. Science, 1995,270, 1663-1667.

97. Cline M.J., Sumner M.A. Bone marrow macrophage precursors. Some functional characteristics of the early cells of the mouse macrophage series. Blood, 1972, 40, 62-69.

98. Cohn M., Blackburn E.H. Telomerase in yeast. Science, 1995,269, 396-400.

99. Colige A., Nusgens В., Lapiere C.M. Altered response of progeria fibroblasts to epidermal growth factor. J. Cell Sci., 1991,100,649-655.

100. Colige A., Roujeau J.C., De la Rocque F., Nusgens В., Lapiere C.M. Abnormal gene expression in skin fibroblasts from a Hutchinson-Gilford patient. Lab. Invest., 1991, 64, 799806.

101. Colgin L.M., Wilkinson C., Englezou A., Killian A., Robinson M.O., Reddel R.R. The hTERTa splice variant of the human telomerase catalytic subunit inhibits telomerase activity. Neoplasia, 2000,2,426-432.

102. Colgin L.M., Baran К., Baumann P., Cech T.R., Reddel R.R. Human POT1 facilitates telomere elongation by telomerase. Curr. Biol., 2003, 13,942-946.

103. Collins K., Greider C.W. Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation. Genes & Development, 1993, 7, 1364-1376.

104. Comijn J., Berx G., Vermassen P., Verschueren K., van Grunsven L., Bruyneel E., Mareel M., Huylebroeck D., van Roy F. The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion. Mol. Cell., 2001, 7, 1267-1278.

105. Comolli L.R., Smirnov I., Xu L., Blackburn E.H., James T.L. A molecular switch underlies a human telomerase disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2002, 99, 16998-17003.

106. Condon J., Yin S., Mayhew В., Word R.A., Wright W.E., Shay J.W., Rainey W.E. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biology of Reproduction, 2002,67, 506-514.

107. Cong Y-S., Wen J., Bacchetti S. The human telomerase catalytic subunit hTERT: organization of the gene and characterization of the promoter. Hum. Mol. Genet., 1999, 8, 137-142.

108. Coren J.S., Epstein E.M., Vogt V.M. Characterization of a telomere-binding protein from Physarum polycephalum. Mol. Cell. Biol., 1991,11,2282-2290.

109. Counter C.M., Gupta J., Harley C.B., Leber В., Bacchetti S. Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies. Blood, 1995, 85,2315-2320.

110. Cristofalo V.J., Phillips P.D., Sorger Т., Gerhard G. Alterations in the responsiveness of senescent cells to growth factors. J. Gerontol., 1989,44, 55-62.

111. Gristofalo V.J., Gerhard G.S. Pignolo R.J. Molecular biology of aging. Surg. Clin. North Am., 1994, 74, 1-21.

112. Cristofalo V.J., Allen R.G., Pignolo R.J., Martin B.G., Beck J.C. Relationship between donor age and the replicative lifespan of human cells in culture: A reevaluation. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1998,95,10614-I0619.

113. Croce C.M., Koprowski H. Assignment'of genes for cell transformation to human chromosome 7 carrying the Simian virus 40 genome. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, 72, 1658-1660.

114. Cultraro C.M., Bino Т., Segal S., Function of the c-Myc antagonist Madl during a molecular switch from proliferation to differentiation. Mol. Cell Biol., 1997, 17,2353-2359.

115. Dagarag M., Ng H., Lubong R., Effros R.B., Yang O.O. Differential impairment of lytic and cytokine functions in senescent human immunodeficiency virus type 1 -specific cytotoxic T lymphocytes. J. Virol., 2003, 77, 3077-3083.

116. Dallaire F., Dupuis S., Fiset S., Chabot B. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Al and UP1 protect mammalian telomeric repeats and modulate telomere replication in vitro. J. Biol. Chem., 2000, 275, 14509-14516.

117. Daniel C.W., de Ome K.B., Young J.T., Blair P.B., Faulkin L.J. Jr. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1968,61,53-60.

118. Dernburg, A.F., Sedat, J.W., Cande, W.Z., and Bass, H.W. Cytology of telomeres. In Telomeres, E.H. Blackburn and C.W. Greider, eds. 1995, (Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

119. Dessain S.K., Yu H., Reddel R.R., Beijersbergen R.L., Weinberg R.A.,. Methylation of the human telomerase gene CpG island. Cancer Res., 2000,60, 537-541.

120. Devereux T.R., Horikawa I., Anna C.H., Annab L.A., Afshari C.A., Barrett J.C.,. DNA methylation analysis of the promoter region of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene. Cancer Res., 1999,59, 6087-6090.

121. Dhar S., Squire J.A., Hande M.P., Wellinger R.J., Pandita Т.К. Inactivation of 14-3-3 sigma influences telomere behavior and ionizing radiation-induced chromosomal instability. Mol Cell Biol., 2000, 20,7764-7772.

122. Diede S.J., Gottschling D.E. Telomerase-mediated telomere addition in vivo requires DNA primase and DNA polymerases alpha and delta. Cell 1999,99, 723-733.

123. Dimri G.P., Campisi J. Molecular and cell biology of replicative senescence. Cold Spring Symp. Quant. Biol., 1994, LIX, 67-73.

124. Dimri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M., Scott G., Roskelley C., Medrano E.E., Linskens M., Rubelj I., Pereira-Smith O. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92,9363-9367.

125. Dragon F., Pogacic V., Filipowicz W. In vitro assembly of human H/ACA small nucleolarrnps reveals unique features of ul7 and telomerase RNAs. Mol. Cell. Biol., 2000,20,3037-3048.

126. Duncan E.L., Whitaker N.J., Moy E.L., Reddel R.R. Assignment of SV40-immortalized cells to more than one complementation group for immortalization. Exp. Cell Res., 1993,205, 337344.

127. Edelstein-Keshet L., Israel A. Lansdorp P. Modelling perspectives on aging: can mathematics help us stay young? J. Theor. Biol., 2001, 213, 509-525.

128. Effros R.B. Replicative senescence in the immune system: impact of the Hayflick limit on T-cell function in the elderly. Am J Hum Genet., 1998, 62, 1003-1007.

129. Effros R.B., Pawelec G. Replicative senescence of T lymphocytes: Does the Hayflick limit lead to immune exhaustion? Immunol. Today, 1997,18,450-454.

130. Eickbush Т.Н. Telomerase and retrotransposons: Which came first? Science, 1997, 277, 911912.

131. Elayadi A.N., Demieville A., Wancewicz E.V., Monia B.P., Corey D.R. Inhibition of telomerase by 2'-0-(2-methoxyethyl) RNA oligomers: effect of length, phosphorothioate substitution and time inside cells. Nucl. Acids Res. 2001,29, 1683-1689.

132. Ellis N.A., Groden J.Ye.T., Straughen J., Lennon D.J., Ciocci S., Proytcheva M., German J. The Bloom's syndrome gene product is homologous to RecQ helicases. Cell, 1995, 83, 655666.

133. Ephrussi В., Weiss M.C. Interspecific hybridization of somatic cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1965,53, 1040-1042.

134. Epifanova O.I., Setkov N.A., Polunovsky V.A., Terskikh V.V. Cellular rest as an active metabolic state. In: Cell Function and Differentiation. N.Y: Alan Liss Inc., 1982, part A, 231242.

135. Epstein C.J., Martin G.M., Schultz A.L., et al. Werner's syndrome: a review of its symptamotology, natural history, pathologic features, genetics, and relationship to the natural aging process. Medicine, 1966,45, 177-221.

136. Espejel S., Blasco M.A. Identification of telomere-dependent senescence-like arrest in mouse embryonic fibroblasts. Exp. Cell Res., 2002,276, 242-248.

137. Ethier S.P., Mahacek M.L., Gullick W.J., Frank T.S., Weber B.L. Differential isolation of normal luminal mammary epithelial cells and breast cancer cells from primary and metastatic sites using selective media. Cancer Res., 1993,53, 627-635

138. Evans S.K., Lundblad V. Positive and negative regulation of telomerase access to the telomere. J. Cell Sci., 2000,113, 3357- 3364.

139. Eversole A., Maizels N. In vitro properties of the conserved mammalian protein hnRNP D suggest a role in telomere maintenance. Mol. Cell. Biol., 2000,20, 5425-5432.

140. Fahraeus R., Lane D.P. The pl6(INK4a) tumour suppressor protein inhibits alpha(v)beta(3) -integrin-mediated cell spreading on vitronectin by blocking PKC-dependent localization of alpha(v)beta(3) to focal contacts. EMBO J., 1999,18,2106-2118.

141. Figueroa M.L., Vig B.K. Sequence of centromere separation: lack of colcemid effect on the Chinese hamster genome. Cytogenet. Cell Genet., 1983,36, 627-632.

142. Finch C.E. Longevity, senescence, and the genome.Chicago: University of Chicago Press. 1990.

143. Fiset S., Chabot B. hnRNP Al may interact simultaneously with telomeric DNA and the human telomerase RNA in vitro. Nucleic Acids Res., 2001,29,2268-2275.

144. Flint J., Craddock C.F., Villegas A., Bentley D.R., Williams H.J., Galanello R., Cao A., Wood W.G., Ayub H., Higgs D.R. Healing of broken human chromosomes by the addition of telomeric repeats., Amer. J. Hum. Genetics, 1994, 55, 505-512.

145. Folini N., Colella G., Villa R., Lualdi S., Daidone N.G., Zafforoni N. Inhibition of telomerase activity by a hammerhead ribozyme targeting the RNA component of telomerase in human melanoma cells. J. Invest. Dermatol., 2000,114,259-267.

146. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat. Med 1995, 1,27-31.

147. Ford L.P., Suh J.M., Wright W.E., Shay J.W. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins С1 and C2 associate with the RNA component of human telomerase. Mol. Cell Biol., 2000,20,Щ9084-9091.

148. Ford L.P., Shay J.W., Wright W.E. The La antigen associates with the human telomerase ribonucleoprotein and influences telomere length in vivo. RNA, 2001, 7, 1068-1075.

149. Ford L.P., Wright W.E., Shay J.W. A model for heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in telomere and telomerase regulation. Oncogene, 2002,21, 580-583.

150. Forney J., Henderson E.R., Blackburn E.H. Identification of the telomeric sequence of the acellular slime moulds Didimium iridis and Physarum polycephalum. Nucleic Acids Res.,1. W 1987,15,9143-9152.

151. Forsythe H.L., Jarvis J.L., Turner J.W., Elmore L.W., Holt S.E. Stable association of hsp90 and p23, but Not hsp70, with active human telomerase. J. Biol. Chem., 2001,276, 1557115574.

152. Fragnet L., Blasco M.A., Klapper W., Rasschaert D.'The RNA subunit of telomerase is encoded by Marek's disease virus. J. Virol., 2003, 77, 5985-5996.

153. Franco S., MacKenzie K.L., Dias S., Alvarez S., Rafii S., Moore M.A. Clonal variation in phenotype and life span of human embryonic fibroblasts (MRC-5) transduced with the catalytic component of telomerase (hTERT). Exp. Cell Res., 2001, 268, 14-25.

154. Freedman V.H., Shin S.I. Cellular tumorigenicity in nude mice: correlation with cell growth insemi-solid medium. Cell, 1974,3, 355-359.

155. Fry M., Loeb L.A. Human Werner syndrome DNA helicase unwinds tetrahelical structures of the fragile X syndrome repeat sequence d(CGG)n. J. Biol. Chem., 1999,274, 12797-12802.

156. Gabet A.-S., Mortreux F., Charneau P., Riou P., Duc-Dodon M., Wu Y., Jeang K.-T., Wattel E. Inactivation of hTERT transcription by Tax. Oncogene, 2003, 22, 3734-3741.

157. Galy V., Olivo-Marin J.C., Scherthan H., Doye V., Rascalou N., Nehrbass U. Nuclear pore complexes in the organization of silent telomeric chromatin. Nature, 2000,403, 108-112.

158. Ganal M.W., Lapitan N.L., Tanksley S.D. Macrostructure of the tomato telomeres. Plant Cell., 1991,3, 87-94.

159. Gasser S.M. A sense of the end. Science, 2000, 288, 1377-1379.

160. Gilchrest B. A. Prior chronic sun exposure decreases the lifespan of human skin fibroblasts in vitro. J. Gerontol. 1980,35, 537-541.

161. Gilley D., Lee M.S., and Blackburn E.H. Altering specific telomerase RNA template residues affects active site function. Genes & Dev., 1995,9, 2214-2226.

162. Goldstein S. Lifespan of cultured cells in progeria. Lanset, 1969,1, 424.

163. Goldstein S., Moerman E.J., Soeldner J.S., Gleason R.E., Barnett D.M. Chronologic and physiologic age affect replicative life-span of fibroblasts from diabetic, prediabetic, and normal donors. Science, 1978,199, 781-782.

164. Gollahon L.S., Shay J.W. Immortalization of human mammary epithelial cells transfected with mutant p53 (273his). Oncogene, 1996, 12, 715-725.

165. Gomez D.E., Kassim A., Olivero O.A. Preferential incorporation of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine (AZT) in telomeric sequences of CHO cells. International J. Oncology, 1995, 7, 1057-1060.

166. Gomez D.E., Tejera A.M., Olivero O.A. Irreversible telomere shortening by 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine (AZT) treatment. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, 246, 107-110.

167. Goodwin E.C., Yang E., Lee C.J., Lee H.W., DiMaio D., Hwang E.S. Rapid induction of senescence in human cervical carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97, 1097810983.

168. Goodwin E.C.and DiMaio D. Repression of human papillomavirus oncogenes in HeLa cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97, 12513-12518.

169. Gordon S. and Cohn Z. Macrophage-melanocyte heterokaryons. The activation of macrophage DNA synthesis. Studies with inhibitors of RNA synthesis. J. Exp. Med., 1971, 133,321-338.

170. Gottschling D.E., Aparicio O.M., Billington B.L., Zakian V.A. Position effect at S. cerevisiae telomeres: Reversible repression of Pol II transcription. Cell, 1990, 63, 751-762.

171. Graves J. Chromosome segregation from cell hybrids. I. The effect of parent cell ploidy on segregation from mouse-Chinese hamster hybrids. Canadian J. Genet. Cytol., 1984, 26, 557563.

172. Graves J. Chromosome segregation from cell hybrids. II. Do differences in parental cell growth rates and phase times determine direction of loss? Canadian J. Genet. Cytol., 1986,28, 735-743.

173. Graves J. Chromosome segregation from cell hybrids. V. Does segregation result from asynchronous centromere separation? Genome, 1987,35, 537-540.

174. Graves J., Barbieri H. Chromosome segregation from cell hybrids. VII. Reverse segregation from karyplast hybrids suggest control by cytoplasmic factors. Genome, 1992,35,537-540.

175. Greider C.W., Blackburn E. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell, 1985, 43, 405-413.

176. Greider C.W., Blackburn E.H. A telomeric sequence in the rna of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature, 1989,337,331-337.

177. Greider C.W., Blackburn E.H. Telomeres, telomerase and cancer. Sci. Amer., 1996,274,9297.

178. Griffith J., Bianchi A., de Lange T. TRF1 promotes parallel pairing of telomeric tracts in vitro. J. Mol. Biol., 1998,278,79-88.

179. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., de Lange T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop., Cell, 1999,97,503-514.

180. Gronthos S., Chen S., Wang C.Y., Robey P.G., Shi S. Telomerase accelerates osteogenesis of bone marrow stromal stem cells by upregulation of CBFAI, osterix, and osteocalcin. J. Bone Miner. Res., 2003,18,716-722.

181. Grubeck-Loebenstein В., Lechner H., Trieb K. Long-term in vitro growth of human T cell clones: can postmitotic "senescent" cell populations be defined? Int. Arch. Allergy Immunol. 1994,104,232.

182. Guilleret I., Yan P., Grange F., Braunschweig R., Bosman F.T., Benhattar J. Hypermethylation of the human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene correlates with telomerase activity. Int. J. Cancer 2002,101, 335-341.

183. Gunes C.A., Lichtsteiner S., Vasserot A.P., Englert C. Expression of the hTERT gene is regulated at the level of transcriptional initiation and repressed by Madl. Cancer Res., 2000, 60,2116-2121.

184. Haendeler J., Hoffmann J., Brandes R.P., Zeiher A.M., Dimmeler S. Hydrogen peroxide triggers nuclear export of telomerase reverse transcriptase via Src kinase family-dependent phosphorylation of tyrosine 707. Mol. Cell. Biol., 2003,23,4598-4610.

185. Hahn W.C., Stewart S.A., Brooks M.W., York S.G., Eaton E., Kurachi A., Beijersbergen R.L., Knoll J.H.M., Meyerson M., Weinberg R.A. Inhibition of telomerase limits the growth of human cancer cells. Nat. Med., 1999,5, 1164-1170.

186. Hakin-Smith V., Jellinek D.A., Levy D., Carroll Т., Teo M., Timperley W.R., McKay M.J., Reddel R.R., Royds J.A. Alternative lengthening of telomeres and survival in patients with glioblastoma multiforme. Lancet, 2003,361, 836-838.

187. Halvorsen T.L., Leibowitz G., Levine F. Telomerase activity is sufcient to allow transformed cells to escape from crisis. Molecular and Cellular Biology, 1999,19, 1864-1870.

188. Halvorsen T. L., Beattie G.M., Lopez A.D., Hayek A., and Levine F. Accelerated telomere shortening and senescence in human pancreatic islet cells stimulated to divide in vitro. Journal of Endocrinology, 2000,166,103-109

189. Hamilton W.D. The moulding of senescence by natural selection. J. Theor. Biol., 1966,12, 12-45.

190. Hamilton S.E., Simmonds C.G., Kathiriya I.S., Corey D.R. Cellular delivery of peptide nucleic acids and inhibition of human telomerase. Chem. and Biol., 1999, 6, 343-351.

191. Hammond P.W., Lively T.N., and Cech T.R. The anchor site of telomerase from Euplotes aediculatusrevealed by photo-cross-linking to single- and doublestrandedDNA primers. Mol. Cell. Biol., 1997,17,296-308.

192. Han H., Hurley L.H. G-quadruplex DNA: a potential target for anti-cancer drug design., TiPS, 2000,21, 136-142.

193. Hande P., Slijepcevic P., Silver A., Bouffler S., van Buul P., Bryant P., Lansdorp P. Elongated telomeres in scid mice. Genomics, 1999, 56, 221-223.

194. Hanson H., Mathew C.G., Docherty Z. Mackie Ogilvie C. Telomere shortening in Fanconi anaemia demonstrated by a direct FISH approach. Cytogenet.,Cell Genet., 2001, 93, 203-206.

195. Нага E., Tsurui H., Shinozaki A., Nakada S., Oda K. Cooperative effect of antisense-Rb and antisense-p53 oligomers on the extension of life span in human diploid fibroblasts, TIG-1. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991,179, 528-534.

196. Нага E., Smith R., Parry D., Tahara H., Stone S., Peters G. Regulation of pI6CDK2 expression and its implications for cell immortalization and senescence. Mol. Cell Biol., 1996, 16, 859-867.

197. Harle-Bachor C., Boukamp P. Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93, 6476-6481.

198. Harley C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? Mutat. Res., 1991,256,271282.

199. Harley C.B., Futcher А.В., Greider C.W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature, 1990,345,458-460.

200. Harley C.B., Goldstein S., Posner B.I., Guyda H. Decreased sensitivity of old and progenic human fibroblasts to a preparation of factors with insulin activity., J. Clin. Invest., 1981,68, 988-994.

201. Harley C.B., Kim N.W., Prowse K.R., Weinrich S.L., Hirsch K.S., West M.D., Bacchetti S., Hirte H.M., Counter C.M., Greider C.W., Piatyszek M.A., Wright W.E., Shay J.W.

202. Telomerase, cell immortality and cancer, Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 1994,59,307-315.

203. Harrington L.A., Greider. C.W. Telomerase primerspecificity and chromosome healing. Nature, 1991,353,451-454.

204. Harrington L., McPhail Т., Mar V., Zhou W., Oulton R., Bass M.B., Arruda I., Robinson M.O. A mammalian telomerase-associated protein. Science, 1997, 275, 973-977.

205. Harris H. Behaviour of differentiated nuclei in heterokaryons of animal cells from different species. Nature, 1965,206, 583-588.

206. Harris H., Watkins J.F., Ford C.E., Schoefl G.I. Artificial heterokaryons of animal cells from different species. J.Cell Science, 1966,1, 1-30.

207. Hastie N.D., Dempster M., Dunlop M.G., Thompson A.M., Green D.K., Allshire R.C. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. Nature, 1990,346, 866868.

208. Hayflick L. Conference: Telomeres and telomerase: implications for cell immortality, cancer, and age related disease. Hotel Sofitel, Redwood City, California, June 1-3, 1998.

209. Hayflick L. The limited in vitro life time of human diploid cell strains. Exp. Cell. Res., 1965, 37,614-636.

210. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains, Exp. Cell Res., 1961,25,585-621.

211. Hayflick L. The cell biology of aging. J. Invest. Dermatol., 1979, 73, 8-14.

212. Hayflick L. Current theories of biological aging. Fed. Proc., 1975, 34,9-13.

213. He P., Yasumoto K. Dietary butylated hydroxytoluene counteracts with paraquat to reduse the rate of hepatic DNA single strand breaks in senescence accelerated mice., Mech. Aging Dev., 1994,76,43-48.

214. Heller D.A., Ahern F.M., Stout J.T., McClearn G.E. Mortality and biomarkers of aging in heterogeneous stock (HS) mice. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 1998,53, B217-230.

215. Hemann M.T., Greider C.W. G-strand overhangs on telomeres in telomerase-deficient mouse cells. Nucleic Acids Res., 1999, 27, 3964-3969.

216. Hensler P.J., Annab L.A., Barrett J.C., Pereira-Smith O.M. A gene involved in control of human cellular senescence on human chromosome lq. Mol. Cell. Biol., 1994,14, 2291-2297.

217. Herbert В., Pitts A.E., Baker S.I., Hamilton S.E., Wright W.E., Shay J.W., Corey D.R. Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1999,96,14276-14281.

218. Herbert B.-S., Wright W.E., Shay J.W. pl6ink4a inactivation is not required to immortalize mammary epithelial cells. Oncogene, 2002,21, 7897-7900.

219. Henderson E.R., Blackburn E.H. An overhanging 3' terminus is a conserved feature of telomeres, Mol. Cell. Biol., 1989, 9, 345-348.

220. Higuchi K. Genetic characterization of senescence-accelerated mouse (SAM). Exp. Gerontol., 1997,32, 129-138.

221. Hill P.A., Reynolds J.J., Meikle M.C. Osteoblasts mediate insulin-like growth factor-I and -II stimulation of osteoclast formation and function. Endocrinology, 1995, 136, 124-131.

222. Hinek A. Nature and the multiple functions of the 67-kD elastin-/laminin binding protein. Cell Adhes. Commun., 1994, 2, 185-193.

223. Hinkley C.S., Blasco M.A., Funk W.D., Feng J., Villeponteau В., Greider C.W., Herr W. The mouse telomerase RNA 58 end lies just upstream of the telomerase template sequence. Nucleic Acid Res., 1998,26 532-536.

224. Hiyama E., Hiyama K., Yokoyama Т., Matsuura Y., Piatyszek M.A., Shay J.W. Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes. Nature Medicine, 1995a, 1, 249-255.

225. Hiyama K., Hiyama E., Ishioka S., Yamakido M., Inai K., Gazdar A.F., Piatyszek M.A., Shay J.W. Telomerase activity in small-cell and non-small-cell lung cancers. J. Natl. Cancer Inst., 1995b, 87, 895-902.

226. Hiyama E., Yokoyama Т., Tatsumoto N., Hiyama K., Immamura Y., Marakami Y., Kodama Т., Piatyszek M.A., Shay J.W., Matsuura Y. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res. 1995c, 55,3258-3262.

227. Hiyama E., Gollahon L., Kataoka Т., Kuroi K., Yokoyama Т., Gazdar A.F., Hiyama K., Piatyszek M.A., Shay J.W. Telomerase activity in human breast tumors. J. Natl. Cancer Inst., 19966, 88,37-43.

228. Hiyama E., Hiyama K., Tatsumoto N., Kodama Т., Shay J.W., Yokoyama T. Telomerase activity in human intestine. Int. J. Oncol., 1996a, 9:453-458,.

229. Hiyama E., Kodama Т., Shinbara K., Iwao Т., Itoh M., Shay J.W., Matsuura Y., Yokoyama Т., Telomerase activity is detected in pancreatic cancer but not in benign tumors., Cancer Res., 1997,57,326-331.

230. Hiyama E., Hiyama K. Telomerase as tumor marker. Cancer Letters, 2003,194, 221-233.

231. Holt, S.E., Wright, W.E. and Shay, J.W. Regulation of telomerase activity in immortal cell lines. Mol. Cell Biol., 1996,16, 2932-2939.

232. Holt S.E., Aisner D.L., Shay J.W., Wright W.E. Lack of cell cycle regulation of telomerase activity in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 10687-10692.

233. Holt S.E., Aisner D.L., Baur J., Tesmer V.M., Dy M., Ouellette M„ Trager J.B., Morin G.B., Toft D.O., Shay J.W., Wright W.E., White M.A. Functional requirement of p23 and Hsp90 in telomerase complexes. Genes Dev., 1999, 13, 817-826.

234. Hooijberg E., Ruizendaal J.J., Snijders P.J., Kueter E.W., Walboomers J.M., Spits H. Immortalization of human CD8+ T cell clones by ectopic expression of telomerase reverse transcriptase. J. Immunol., 2000,165, 4239-4245.

235. Horikawa I., Cable P.L., Afshari C., Barrett J.C., Cloning and characterization of the promoter region of human telomerase reverse transcriptase gene. Cancer Res., 1999. 59, 826-830.

236. Hornsby P.J., Yang L., Raju S.G., Maghsoudlou S.S., Nallaseth F.S. Changes in gene expression during senescence of adrenocortical cells in culture. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1992,43,385-395.

237. Hosokawa Т., Hosono M, Higuchi К, Aoike A., Kawai K., Takeda T. Immune responses in newly developed short-lived SAM mice I. Age-associated early decline in immune activities ofcultured spleen cells. Immunology 1987,62,419-423.

238. Hosokawa M., Ashida Y., Nishikawa Т., Takeda T. Accelerated aging of dermal fibroblast-like cells from senescence-accelerated mouse (SAM). 1. Acceleration of population aging in vitro. Mech Ageing Dev, 1994, 74, 65-77

239. Hosokawa M., Fujisawa H., Zhu B.H., Jujo H., Higuchi K. In vitro study of the mechanisms of senescence acceleration. Exp. Gerontol., 1997b, 32, 197-203.

240. Hsiao R., Sharma H. W., Ramakrishnan S., Keith E., Narayanan R. Telomerase activity in normal human endothelial cells. Anticancer Res., 1997,17, 827-832

241. Hsu H.L., Gilley D., Galande S.A., Hande M.P., Allen В., Kim S.H., Li G.C., Campisi J.,

242. Kohwi-Shigematsu, Т., Chen, D.J. Ku acts in a unique way at the mammalian telomere toprevent end joining. Genes Dev. 2000, 14,2807-2812.i

243. Ни B.T., Lee S.C., Marin E., Ryan D.H., Insel R.A.Telomerase is up-regulated in human germinal center В cells in vivo and can be re-expressed in memory В cells activated in vitro. J Immunol., 1997,159,1068-1071.

244. Huffman K.E., Levene S.D., Tesmer V.M., Shay J.W., Wright W.E. Telomere shortening is proportional to the size of the G-rich telomeric З'-overhang. J. Biol. Chem., 2000,275, 1971919722.

245. Hurley L.H., Wheelhouse R.T., Sun D., Kerwin S.M., Salazar M., Fedoroff O.Y., Han F.X., Han H., Izbicka E., Von Hoff D.D. G-quadruplexs as target for drug design., Pharmacol. Therapeut., 2000,85,141-158.

246. Hurley L.H. The Frank Rose memorial lecture: targeting nuclear protein complexes in cancer cells for selective cancer therapeutics. Br. J. Cancer, 2001,85, S35.

247. Igarashi H., Sakaguchi N. Telomerase activity is induced by the stimulation to antigen receptor in human peripheral lymphocytes., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996,219,649.655.

248. Igarashi H. and Sakaguchi N. Telomerase activity is induced in human peripheral В lymphocytes by the stimulation to antigen receptor. Blood, 1997, 89, 1299-1307.

249. Ijdo J.W., Baldini A., Ward D.C., Reeders S.T., Wells R.A. Origin of human chromosome 2: an ancestral telomere-telomere fusion., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1991,88, 9051-9055.

250. Jacobson C.O. Reactivation of DNA synthesis in mammalian neuron nuclei after fusion with . cells of an undifferentiated fibroblast line. Exp. Cell Res., 1968,53, 316-318.

251. James S.E., Faragher R.G., Burke J.F., Shall S. Mayne L.V. Werner's syndrome T lymphocytes display a normal in vitro life-span. Mech. Ageing Dev., 2001, 121, 139-149.

252. Jami J., Grandchamp S. Karyological properties of Human-mouse somatic hybrids. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1971,68, 3097-3101.

253. Jha A.N., Dominquez I., Balajee A.S., Hutchinson Т.Н., Dixon D.R., Natarajan A.T. Localization of a vertebrate telomeric sequence in the chromosomes of two marine worms (phylum Annelida: class Polychaeta). Chromosome Res. 1995,3, 507-508.

254. Johnes R.B., Whitney R.G., Smith J.R. Intramitotic variation in proliferative potential: stochastic events in cellular aging. Mech Ageing Dev. 1985,29, 143-149.

255. Johnson Т.Е., Genetic influences on aging. Exp. Gerontol., 1997.32, 11-22.

256. Jones, P.A., Laird, P.W. Cancer epigenetics comes of age. Nat. Genet.,1999,21, 163-167.

257. Kakuo S., Asaoka K., Ide T. Human is a unique species among primates in terms of telomere length. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999,263,308-314.

258. Kamb A., Gruis N.A., Weaver-Feldhaus J., Liu Q., Harshman K., Tavtigian S.V., Stockert E., Day R.S. Ill, Johnson B.E., Skolnick M.H. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science, 1994, 264, 436—440

259. Kamnert I., Nielsen L., Edstrom J.E. A conceitedly evolving region in Chironomus, unique within the telomere., J. Mol. Evol., 1998, 46, 562-570.

260. Kang S.S., Kwon Т., Kwon D.Y., Do S.I. Akt protein kinase enhances human telomerase activity through phosphorylation of telomerase reverse transcriptase subunit. J. Biol. Chem., 1999,274, 13085-13090.

261. Kanzaki Y., Onoue F., Ishikawa F., Ide T. Telomerase rescues the expression level of keratinocyte growth factor and insulin-like growth factor-II in senescent human fibroblasts. Exp. Cell Res., 2002,279,321-329.

262. Kao F.T., Puck T.T. Genetics of somatic mammalian cells. Linkage studies with human-chinese hamster cell hybrids. Nature, 1970,228,329-332.

263. Karamysheva Z., Wang L., Shrode Т., Bednenko J., Hurley L.A., Shippen D.E. Developmental^ programmed gene elimination in Euplotes crassus facilitates a switch in the telomerase catalytic subunit. Cell, 2003,113, 565-76.

264. Karlseder J., Smogorzewska A., de Lange T. Senescence induced by altered telomere state, not telomere loss. Science, 2002,295,2446-2449.

265. Katakura Y., Yamamoto K., Miyake O., Yasuda Т., UcharaN., Nakata E., Kawamoto S., Shirahata S. Bidirectional regulation of telomerase activity in a subline derived from human lung adenocarcinoma.Biochem. Biophys. Res. Communs., 1997,237, 313-317.

266. Kerwin S.M. G-quadruplex DNA as a target for drug design. Current Pharmaceutical Design, 2000,6,441-471.

267. Kharbanda S., Kumar V., Dhar S., Pandey P., Chen C., Majumder P., Yuan Z.M., Whang Y„ Strauss W., Pandita Т.К., Weaver D., Kufe D: Regulation of the hTERT telomerase catalytic subunit by the c-Abl tyrosine kinase. Curr Biol., 2000,10, 568-575.

268. Khokhlov A.N. Stationary cell cultures as a tool for gerontological studies. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1992, 663,475-476.

269. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L.C., Coviello G.M., Wright W.E., Wewrich S.L., Shay J.W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer., Science, 1994,266, 2011-2014.

270. Kim S.H., Kaminker P., Campisi J. TIN2, a new regulator of telomere length in human cells. Nat. Genet., 1999,23,405-412.

271. Kipling D., Cooke H.J. Hypervariable ultra-long telomeres in mice. Nature, 1990,347,400402.

272. Kipling D., Cooke H.J. Beginning or end? Telomere structure, genetics and biology. Human Molec. Genet., 1992,1,3-6.

273. Kiyono Т., Foster S.A., Koop J.I., McDougall J.K., Galloway D.A., Klingelhutz A.J. Both Rb/pl6INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells. Nature, 1998,396, 84-88.

274. Klagsbrun M. and D'Amore P. A. Regulators of angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 1991, 53, 217-239

275. Klobutcher L.A., Swanton M.T., Donini P., Prescott'D.M. All gene-sized DNA molecules in four species of hypotrichs have the same terminal sequence and an unusual 3' terminus., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1981, 78, 3015-3019.

276. Koeppel F., Riou J.F., Laoui A., Mailliet P., Arimondo PB, Labit D, Petitgenet O, Helene C, Mergny JL.Ethidium derivatives bind to G-quartets, inhibit telomerase and act as fluorescent probes for quadruplexex. Nucl. Acids Res., 2001, 29, 1087-1096.

277. Koga S., Kondo Y., Komata Т., Kondo S. Tratment of bladder cancer cells in vitro and in vivo with 2-5A antisense telomerase RNA. Gene Ther., 20016,8,654-658.

278. Koi M., Shimizu M., Morita H., Yamada H., Oshimura M. Construction of mouse A9 clones containing a single human chromosome tagged with neomycin-resistance gene via microcell fusion. Japan. J. Cancer Res., 1989, 80,413-418.

279. Komata Т., Kondo Y., Koga S., Ко S.C., Chung L.W.K., Kondo S. Combination therapy of malignant glioma cells with 2-5A antisense telomerase RNA and recombinant adenovirus p53. Gene Therapy, 2000, 7,2071-2079.

280. Kondo S., Kondo Y., Li G., Silverman R.H., Cowell J.K. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. Oncogene, 1998b, 16, 3323-3330.

281. Kondo Y., Koga S., Komata Т., Kondo S. Treatment of prostate cancer in vitro and in vivo with 2-5A-anti-telomerase RNA component. Oncogene, 2000,19,2205-2211.

282. Kondo Y., Komata Т., Kondo S. Combination therapy of 2-5 A antisense against telomerase RNA and cisplatin for malignant gliomas. Int. J. Oncol., 2001, 18, 1287-1292.

283. Kost M.V., Alimov A.A., Sarafanov A.G., Tikchomirova T.P., Gumeniuk R.R., Timofeeva M.J., Zelenin A.V. 5S rRNA gene hybridized to human chromosome 1 in two sites (lq42.11-42.13 and lq43). Cytogenet. Cell Genet., 1995,68, 82-84.

284. Kramer K.M. and J.E. Haber. New telomeres in yeast areinitiated with a highly selected subset of TGI-3 repeats. Cell, 1993, 75, 1083-1093.

285. Krauskopf A., Blackburn E.H. Control of telomere growth by interactions of Rap 1 with the most distal telomeric repeats. Nature, 1996,383, 354.-357.

286. Krauskopf A. and Blackburn E.H. Rapl protein regulates telomere turnover in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 12486- 12491.

287. Kruk P.A., Orren D.K., Bohr B.A. Telomerase activity is elevated in early S phase in hamster cells. Biochem. Biophys. Res. Communs. 1997,233, 717-722.

288. Kruk P.A., Balajee A.S., Rao K.S., Bohr V.A. Telomere reduction and telomerase inactivation during neuronal cell differentiation. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1996,224,487-492.

289. Krupp G., Bonatz G., Parwaresch R. Telomerase, immortality and cancer. Biotechnol. Annu. Rev. 2000, 6, 103-140.

290. Kubota C., Yamakuchi H., Todoroki J., Mizoshita K., Tabara N., Barber M., Yang X. Six cloned calves produced from adult .broblast cells after long-term culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97,990-995.

291. Kuroki Т., Huh N.H. Why are human cells resistant to malignant cell transformation in vitro? Japan. J. Cancer Res., 1993,84, 1091-1100.

292. Kushner D.M., Paranjape J.M., Bandyopadhyay В., Cramer H., Leaman D.W., Kennedy A.W., Silverman R.H., Cowell J.K. 2-5A antisense directed against telomerase RNA produces apoptosis in ovarian cancer cells. Gynecol. Oncol., 2000, 76,183-192.

293. Kuwahara I., Ikebuchi K., Hamada H., Niitsu Y., Miyazawa K., Ohyashiki K., Fujisawa H., Furukawa K. Changes in N-glycosylation of human stromal cells by telomerase expression. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003,301, 293-297.

294. Kyo S., Kondo S. A novel telomerase-specific gene therapy: gene transfer of caspase-8 utilizing the human telomerase catalytic subunit gene promoter. Hum. Gene Ther., 2000,11, 1397-1406.

295. Kyo S., Takakura M., Kanaya Т., Wang Z., Fujimoto K., Nishio Y., Orimo A., Inoue M. Estrogen activates telomerase. Cancer Res., 1999,59, 5917-5921.

296. Kyo S., Takakura M., Ishikawa H., Sasagawa Т., Satake S., Tateno M., Inoue M. Application of telomerase assay for the screening of cervical lesions. Cancer Res., 1997, 57, 1863-1867.

297. Kyo S., Takakura M., Taira Т., Kanaya Т., Itoh H., Yutsudo M., Ariga H., Inoue M. Spl cooperates with c-Myc to activate transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT). Nucleic. Acids Res., 2000,28, 669-677.

298. LaBranche H., Dupuis S., Ben-David Y., Bani M.-R., Wellinger R.J., Chabot B. Telomere elongation by hnRNP A1 and a derivative that interact with telomeric repeats and telomerase. Nature Genet., 1998,19, 199-202.

299. Laeng H., Harris D.T., Schindler R. Proliferative quiescence of normal mast cells resembles that of cold-sensitive mutant mastocytoma cells. Dominant expression of the quiescent state in heterokaryons. Exp. Cell Res., 1985,158, 170-176.

300. Lakatta E.G. Alterations in Circulatory Function. Principles of Geriatric Medicine and Gerontology, 1994, Third Edition, 493-508.

301. Langford L.A., Piatyszek M.A., Xu R., Schold S.C.Jr., Shay J.W. Telomerase activity in human brain tumours. Lancet, 1995,346, 1267-1268.

302. Lansdorp P.M., Verwoerd N.P., van de Rijke F.M., Dragowska V., Little M.T., Dirks R.W., Raap A.K., Tanke H.J. Heterogeneity in telomere length of human chromosomes. Hum. Mol. Genet., 1996, 5,685-691.

303. Le S., Moore J.K., Haber J.E., Greider C.W. RAD50 and RAD51 define two pathways that collaborate to maintain telomeres in the absence of tdlomerase. Genetics, 1999,152, 143-152.

304. Le S., Sternglanz R., Greider C.W. Identification of two RNA-binding proteins associated with human telomerase RNA. Mol. Biol. Cell. 2000,11,999-1010.

305. Lee M.S. and Blackburn E.H. Sequence-specific DNA primer effects on telomerase polymerization activity. Mol.Cell. Biol., 1993,13,6586-6599.

306. Lee H.W., Blasco M.A., Gottlieb G.J., Horner J.W. 2nd, Greider C.W., DePinho R.A. Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs. Nature, 1998, 92, 569-574.

307. Lee K.M., Nguyen C., Ulrich A.B., Pour P.M., Ouellette M.M. Immortalization with telomerase of the Nestin-positive cells of the human pancreas. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003a, 301, 1038-1044.

308. Levis R.W., Ganesan R., Houtchens K., Tolar L.A., Sheen F. Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere. Cell, 1993,75, 1083-1093.

309. Levy M.A., Allsopp R.C., Futcher A.B., Greider C.W., Harley C.B. Telomere end-replication problem and cell aging. J. Mol. Biol., 1992,225,951-960.

310. Li H., Zhao L.L., Funder J.W., Liu J.P. Protein phosphatase 2A inhibits nuclear telomerase activity in human breast cancer cells. J. Biol. Chem. 1997,272, 16729-16732.

311. Li H., Zhao L., Yang Z., Funder J.W., Liu J.P. Telomerase is controlled by protein kinase Ca in human breast cancer cells. J. Biol. Chem. 1998,273,33436-33442.

312. Li В., Oestreich S., de Lange, T. Identification of human Rapl: implications for telomere evolution. Cell, 2000,101,471-483.

313. Lidwig A., Saretzki G., Holm P.S., Tiemann F., Lorenz M, Emrich T, Harley CB, von Zglinicki T. Ribozyme cleavage of telomerase mRNA sensitizes breast cancer cells to inhibitors of topoisomerase. Cancer Res., 2001,61,3053-3061.

314. Liggett Jr W.H., Sidransky D. Role of the pi 6 tumor suppressor gene in cancer. J. Clin. Oncol., 1998,16, 1197-1206.

315. Lin S.-Y., Elledge S.J. Multiple tumor suppressor pathways negatively regulate telomerase. Cell, 2003,113,881-889.

316. Lindsey J., McGill N.I., Lindsey L.A., Green D.K., Cooke H.J. In vivo loss of telomeric repeats with age in humans. Mutat. Res., 1991,256,45-48.

317. Lingner J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V., CechT.R. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomejase. Science, 1997,276, 561-567.

318. Littlefield J. Selection of hybrids from mating of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. Science, 1964,145, 709-710.

319. Littlefield J. The use of drug-resistant markers to study the hybridisation of mouse fibroblasts. Exp. Cell Res., 1966,41, 190-196.

320. Liu W.S., Fredga K. Telomeric (TTAGGG)n sequences are associated with nucleolus organizer regions (NORs) in the wood lemming. Chromosome Res., 1999,. 7,235-240.

321. Loayza D., De Lange Т. POT1 as a terminal transducer of TRF1 telomere length control. Nature, 2003,423, 1013-1018.

322. Luderus M.E.E., van Steensel В., Chong L., Sibon O.C.M., Cremers F.F.M., de Lange T. Structure, subnuclear distribution, and nuclear matrix association of the mammalian telomeric J. Cell Biol., 1996, 135,867-881.

323. Lukowiak A.A., Narayanan A., Li Z.H., Terns R.M., Terns M.P. The snoRNA domain of vertebrate telomerase RNA functions to localize the RNA within the nucleus. RNA, 2001, 7, 1833-1844.

324. Ly H., Xu L., Rivera M.A., Parslow T.G., Blackburn E.H. A role for a novel 'trans-pseudoknot' RNA-RNA interaction in the functional dimerization of human telomerase. Genes Dev., 2003,17,1078-1083.

325. Macieira-Coelho A. Markers of'cell senescence1. Mech. Ageing Dev., 1998,. 104,207-211.

326. MacKenzie K. L., Franco S., May C., Sadelain M., Malcolm A. S. Mass Cultured Human Fibroblasts Overexpressing hTERT Encounter a Growth Crisis Following an Extended Period of Proliferation. Exp. Cell Res., 2000, 259, 336-350.

327. Magnenat L., Tobler H., Muller F. Developmentally regulated telomerase activity is correlated with chromosomal healing during chromatin diminution in Ascaris suum. Mol. Cell Biol., 1999, 19, 3457-3465.

328. Makarov V.L., Hirose Y., Langmore J.P. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest а С strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell, 1997,88, 657-666.

329. Marciniak R. A., Johnson F.B., Guarente L. Type I ALT telomere maintenance in a human cell line, in Telomeres & Telomerase, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001, 188.

330. Martens U.M., Zijlmans J.M.J.M., Poon S.S.S., Dragowska W., Yui J., Chavez E.A., Ward R.K., Lansdorp P.M. Short telomeres on'human chromosome 17p. Nature Genetics, 1998,18, 76-80.

331. Martens J.W., Sieuwerts A.M., Vries J.B., Bosma P.T., Swiggers S.J., Klijn J.G., Foekens J.A. Aging of stromal-derived human breast fibroblasts might contribute to breast cancer progression. Thromb. Haemost., 2003, 89, 393-404.

332. Martin G., Sprague C., Epstein C. Replicative life-span of cultivated human cells; effects of donor age, tissue and genotype., Lab. Invest., 1970, 23, 86-92.

333. Martin G.M., Austad S.N., Johnson Т.Е. Genetic analysis of ageing: role of oxidative damage and environmental stresses. Nature, 1996,13,25-34.

334. Martin J.A., Buckwalter J.A. The role of chondrocyte senescence in the pathogenesis of osteoarthritis and in limiting cartilage repair. J. Bone Joint Surg. Am., 2003,85-A, Suppl. 2, 106-110.

335. Marx S., Spiegel A.M., Skarulis M.C., Doppman J.L., Collins F.S., Liotta L.A. Multiple endocrine neoplasia type 1: clinical and genetic topics. Ann. Intern. Med., 1998,129, 484-494.

336. Mason J.M., Biessmann H. The unusual telomers of Drosophila. Trends in Genetics, 1995,. 11,58-62.

337. Matsumura Т., Zerrudo Z., Hayflick L. Senescent human diploid cells in culture: survival, DNA dynthesis and morphology. J. Gerontol, 1979,34, 328-334.

338. Matsushita H., Chang E., Glassford A.J., Cooke J.P., Chiu C.P., Tsao P.S. eNOS activity is reduced in senescent human endothelial cells: preservation by hTERT immortalization. Circ. Res., 2001,89, 793-798.i

339. Matthews D.H., Sabina J., Zuker M., Turner D.H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure. J. Mol. Biol., 1999,288,911-940.

340. McClintock B. The fusion of broken ends of sister half-chromatids following chromatid breakage at meiotic anaphases. Missouri Agric. Exp. Sta. Res. Bull., 1938,290, 1-48.

341. McClintock B. The behavior in successive nuclear divisions of a chromosome broken at meiosis. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 1939,25,405-416.

342. McClintock B. The stability of broken ends mzea mays. Genetics, 1941, 26, 234-282.

343. McCormick-Graham M., Romero D.P. Ciliate telom,erase RNA structural features. Nucleic Acids Research, 1995,23, 1091-1097.

344. McCormick-Graham M., Haynes W.J., Romero D.P. Variable telomeric repeat synthesis in Paramecium tetraureliais consistent with misincorporation by telomerase.EMBO J. 1997,16, 3233-3242.

345. McEachern M.J., Blackburn H. Runaway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. Nature, 1995,376,403-409.

346. McEachern M.J., Iyer S., Fulton T.B., Blackburn E.H. Telomere fusion caused by mutating the terminal region of telomeric DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97, 11409-11414.

347. McKee J.A., Banik S.S., Boyer M.J., Hamad N.M., Lawson J.H., Niklason L.E., Counter C.M. Human arteries engineered in vitro. EMBO Rep., 2003,4,633-638.

348. Medawar P.B. The definition and measurement of senescence. In: Wolstenholme GEW,i

349. Cameron M.P., eds. Ciba Foundation colloquia on aging. I. General aspects. London: Churchill, 1955,4-15.

350. Mehle C., Piatyszek M.A., Ljunberg В., Shay J.W., Roos G. Telomerase activity in human renal cell carcinoma. Oncogene. 1996,13, 161-166.

351. Melana S.M., Holland J.F., Pogo B.G. Inhibition of cell growth and telomerase activity of breast cancer cells in vitro by 3'-azido-3'deoxythymidine. Clin.Cancer Res., 1998,4,693-696.

352. Melek M., Greene E.C., Shippen D.E. Processing of nontelomeric 38 ends by telomerase: Default template alignmentand endonucleolytic cleavage. Mol. Cell. Biol., 1996,16: 34373445.

353. Mergny J.L., Mailliet P., Lavelle F., Riou J.F., Laoui A., Helene C. The development of telomerase inhibitors: the G-quartet., Anti-Cancer Drug Design, 1999,14, p. 327-339.

354. Metz A.M., Love R.A., Strobel G.A., Long D.M. Two telomerase reverse transcriptases (terts) in Candida albicans. Biotechnol. Appl. Biochem., 2001,34,47-54.

355. Meyne J., Baker R.J., Hobart H.H., Hsu T.C., Ryder O.A., Ward O.G., Wiley J.E., Wurster-Hill D.H., Yates T.L., Moyzis R.K. Distribution of nontelomeric sites of the (TTAGGG)n telomeric sequence in vertebrate chromosomes. Chromosoma, 1990, 99, p. 3-10.

356. Meyne J., Ratliff R.L., Moyzis R,K. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 7049-7053.

357. Meyne J., Hirai H., Imai H.T. FISH analysis of the telomere sequences of bulldog ants (Myrmecia: Formicidae). Chromosoma, 1995, 104, 14-18.

358. Minamino Т., Mitsialis S.A., Kourembanas S. Hypoxia extends the life span of vascular smooth muscle cells through telomerase activation. Mol Cell Biol., 2001, 21, 3336-3342.

359. Minamino Т., Miyauchi H., Yoshida Т., Ishida Y., Yoshida H., Komuro I. Endothelial cell senescence in human atherosclerosis: role of telomere in endothelial dysfunction. Circulation, 2002,105, 1541-1544,

360. Minev B.R., Chavez F.L., Mitchell M.S. Cancer vaccines: novel approaches and new promise. Pharmacol. Ther., 1999, 81, 121-139.

361. Minev В., Hipp J., Firat H., Schmidt J.D., Langlade-Demoyen P., Zanetti M. Cytotoxic T cell immunity against telomerase reverse transcriptase in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 2000,97,4796-4801.

362. Minna J.D., Coon H.G. Human-mouse hybrid cells segregating mouse chromosomes and izozymes. Nature, 1974,252,401-404.

363. Mitchell J.R., Wood E., Collins K. A telomerase component is defective in the human disease dyskeratosis congenita. Nature, 1999,402, 551-555.

364. Mitchell J.R., Cheng J., Collins K. A box H/ACA small nucleolar RNA-like domain at the human telomerase RNA 3' end. Mol. Cell. Biol., 1999a, 19,567-576.

365. Miyamoto M. Characteristics of age-related behavioral changes in senescence-accelerated mouse SAMP8 and SAMP10. Exp. Gerontol. 1997,32, 139-148.

366. Morales C.P., Holt S.E., Ouellette M., Kaur K.J., Yan Y„ Wilson K.S., White M.A., Wright W.E., Shay J.W. Absence of cancer associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase. Nature Genet., 1999, 21, 115-118.

367. Morales C.P., Gandia K.G., Ramirez R.D., Wright W.E., Shay J.W., Spechler S.J. Characterisation of telomerase immortalised normal human oesophageal squamous cells. Gut, 2003,52,327-333.

368. Mori S., Kawano M., Kanzaki Т., Morisaki N., Saito Y., Yoshida S. Decreased expression of the platelet-derived growth factor beta-receptor in fibroblasts from a patient with Werner's syndrome. Eur. J. Clin. Invest., 1993,23,161-165.

369. Moriarty T.J., Huard S., Dupuis S., Autexier C. Functional multumerization of human telomerase requires an RNA interaction domain in the N terminus of catalytic subunit. Mol. Cell. Biol., 2002,22,1253-1265.

370. Morin G.B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell, 1989, 59, 521-529.

371. Morin G.B. Recognition of a chromosome truncation site associatedwith alpha-thalassaemia by human telomerase. Nature, 1991,353,454-456.

372. Morin G.B., Cech T.R. Mitochondrial telomeres: suprising diversity of repeated telomeric DNA sequences among six species of Tetrahymena. Cell, 1988, 52, 367-374.

373. Mouly V., Edom F., Decary S„ Vicart P., Barbet J. P., Butler-Browne G. S. SV40 large T antigen interferes with adult myosin heavy chain expression, but not with differentiation of human satellite cells. Exp. Cell Res., 1996, 225,268-276.

374. Mozdziakac P.E., McFarlandb D.C., Schultzc E. Telomeric profiles and telomerase activity turkey satellite cell clones with different in vitro growth characteristics. Biochim. Biophys. Acta, 2000,1492,362-368.

375. Mukai S., Kondo Y., Koga S., Komata Т., Ваша B.P., Kondo S. 2-5A antisense telomerase RNA therapy for intracranial malignant gliomas. Cancer Res., 2000,60,4461-4467.

376. Muller H.J. The remaking of chromosomes. The Collecting Net, 1938, V. 8, P. 182-195.

377. Mulligan R.C., Berg P. Factor governing the expression of a bacterial gene in mammalian cells. Mol. Cell. Biol., 1981,1,449-459.

378. Munoz-Jorda'n J.L., Cross G.A., de Lange Т., Griffith J.D. T-loops at trypanosome telomeres. EMBO J., 2001,20,579-588.

379. Murakami J., Nagai N., Shigemasa K., Ohama K. Inhibition of telomerase activity and cell proliferation by a reverse transcriptase inhibitor in gynaecological cancer cell lines. Eur. J. Cancer, 1999,35,1027-1034.

380. Murasawa S., Llevadot J., Silver M., Isner J.M., Losordo D.W., Asahara T. Constitutive human telomerase reverse transcriptase expression enhances regenerative properties of endothelial progenitor cells. Circulation, 2002,106, 1133-1139.

381. Murnane J.P., Yu L.-C. Acquisition of telomere repeat sequences by transfected DNA integrated at the site of a chromosome break. Molec. Cell. Biol., 1993,13, 977-983.

382. Murnane J.P., Sabatier L., Marder B.A., Morgan W.F. Telomere dynamics in an immortal human cell line. The EMBO Journal, 1994,13,4953-4962.

383. Naasani I., Seimiya H., Tsuruo T. Telomerase inhibition, telomere shortening, and senescenceof cancer cells by tea catechins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998,249,391-396.t

384. Nakamura T.M., Cech T.R. Reversing time: origin of telomerase. Cell, 1998, 92, 587-590.

385. Nakamura T.M., Morin G.B., Chapman K.B., Weinrich S.L., Andrews W.H., Lingner J., Harley C.B., Cech T.R. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human., Science, 1997, 277, p. 955-959.

386. Nakayama J.I., Saito M., Nakamura H., Matsuura A., Ishikawa F. TLP1: A gene encoding a protein component of mammalian telomerase is a novel member of WD repeats family. Cell, 1997,88, 875-884.

387. Nakayama J., Tahara H., Tahara E., Saito M., Ito K., Nakamura H., Nakanishi Т., Ide Т., Ishikawa F. Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. Nature Genet., 1998,. 18, 65-68.

388. Navas M.A., Munoz-Elias E.J., Kim J., Shih D., Stoel M. Functional characterization of the MODY1 gene mutations HNF4(R127W), HNF4(V255M), and HNF4(E276Q). Diabetes, 1999, 48 1459-1465.

389. Nelson W.G., Kastan M.B. DNA strand breaks: the DNA template alterations that trigger p53-dependent DNA damage response pathways. Mol. Cell. Biol., 1994,14, 1815-1823.

390. Nettelbeck D.M., Jerome V., Muller R. Gene therapy: designer promotes for tumour targeting. Trends Genet., 2000,16, 174-181.

391. Newbold R.F. The significance of telomerase activation and cellular immortalization in human cancer. Mutagenesis 2002, 17,539-550

392. Niida H., Matsumoto Т., Satoh H., Shiwa M., Tokutake Y., Furuichi Y., Shinkai Y. Severe growth defect in mouse cells lacking the telomerase RNA component. Nature Genet., 1998,19, 203-206.

393. Nisitani S., Hosokawa M., Sasaki M.S., Yasuoka K, Naiki H, Matsushita T, Takeda T. Acceleration of chromosome aberrations in senescence-accelerated strains of mice. Mutat. Res., 1990, 237,221-228.

394. Norrback K.F., Hultdin M., Dahlenborg K., Osterman P., Carlsson R. Roos G. Telomerase regulation and telomere dynamics in germinal centers. Eur. J. Haematol. 2001,67, 309-317.

395. Norwood Т.Н., Pendergrass W.R., Spraque C.A., Martin G.M. Dominance of the senescent phenotype in heterokaryons between replicative and postreplicative human fibroblast-like cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974,71,2231-2235.

396. Nowell P.C., Croce C.M. Cytogenetics of neoplasia, in: Development and Recognition of the Transformed Cell (eds: Greene M.I. & Hamaoka T.) 1-19 (Plenum, New York, 1987).

397. Odagiri Y., Uchida H., Hosokawa M., Takemoto K., Morley A.A., Taleda T. Accelerated accumulation of somatic mutations in the senescence accelerated mouse. Nature Genet., 1998,19,116-117.

398. Ogino H., Nakabayashi K., Suzuki M., Takahashi E., Fujii M., Suzuki Т., Ayusawa D. Release of telomeric DNA from chromosomes in immortal human cells lacking telomerase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998,248,223-227.

399. Oh S., Song Y., Yim J., Kim Т.К. The Wilms' tumor 1 tumor suppressor gene represses transcription of the human telomerase reverse transcriptase gene. J. Biol. Chem., 1999,274, 37473-37478.

400. Oh, S., Song, Y-H., Yim, J., Kim, Т.К., Identification of Mad as a repressor of the human telomerase (hTERT) gene. Oncogene, 2000,19, 1485-1490.

401. Oka Y., Shiota S., Nakai S., Nishida Y., Okubo S. Inverted terminal repeat sequence in the macronuclear DNA of stylonychia pustulata., Gene, 1980,10,301-306.

402. Okasaki S., Tsuchida K., Maekawa H., Ishikawa H., Fujiwara H. Identification of a pentanucleotide telomeric sequences, (TTAGG)n in the silkworm Bombyx mori and in other insects. Mol. Cell. Biol., 1993,13, 1424-1432.

403. Olovnikov A.M. Senescence is the result of shortening of "differotene" in telomere because of underreplication and underrepair of DNA. Izvestia AN SSSR Seria Biologicheskaya, 1992,4, 641-643

404. Ookawa K., Tsuchida S., Adachi J.-I., Yokota J. Differentiation induced by RB expression andapoptosis induced by p53 expression in an osteosarcoma cell line. Oncogene, 1997, 14, 1389i1397.

405. Osanai M., Tamaki Т., Yonekawa M., Kawamura A. Sawada N. Transient increase in telomerase activity of proliferating fibroblasts and endothelial cells in granulation tissue of the human skin. Wound Repair Regen., 2002,10,59-66.

406. Oshima A., Yoshida K., Itoh K., Kase R., Sakurata H., Suzuki Y. Intracellular processing and maturation of mutant gene products in hereditary beta-galactosidase deficiency (beta-galactosidosis). Hum. Genet. 1994, 93, 109-114.

407. Oshima J., Campisi J., Tannock T.C., Martin G.M. Intracellular processing and maturation of mutant gene products in hereditary beta-'galactosidase deficiency (beta-galactosidosis). J. Cell Physiol., 1995,162,277-283.

408. Ouellette M.M., Aisner D.L., Savre-Train I., Wright W.E., Shay J.W. Telomerase activity does not always imply telomere maintenance. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999,254, 795-803.

409. Packer L., Fuehr K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 1977,267, 423-425.

410. Pardue M.L., DeBaryshe P.G. Drosophila telomeres: two transposable elements with important roles in chromosomes. Genetica, 1999,107,189-196.

411. Parrinello S., Samper E., Krtolica A., Goldstein J., Melov S., Campisi J. Oxygen sebsitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nature Cell Biology, 2003, 5, 741-747.

412. Pelliccia F., Volpi E.V., Lanza V., Gaddini L., Baldini A., Rocchi A. Telomeric sequences of Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda). Heredity, 1994,72,78-80.

413. Pereira-Smith O.M., Smith J.R. Genetic analysis of indefinite division in human cells: identification of four complementation groups. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1988,85,60426046.

414. Perrem K., Bryan T.M., Englezou A., Hackl Т., Moy E.L., Reddel R.R. Repression of an alternative mechanism for lengthening of telomeres in somatic cell hybrids. Oncogene, 1999, 18,3383-3390.

415. Perrem K., Colgin L.M., Neumann A.A. Yeager T.R., Reddel R.R. Telomerase does not repress the ALT mechanism, in: Telomeres & Telomerase, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001., 190.

416. Perry P.J., Arnold J.R.P., Jenkins. Telomerase inhibitors for the treatment of cancer: the current perspective. Expert Opin. Investig. Drugs, 2001,10, 2141-2156.

417. Petersen S., Saretzki G., von Zglinicki T. Preferential accumulation of single-stranded regions in telomeres of human fibroblasts. Exp. Cell. Res., 1998,239, 152-160.

418. Petracek M.E., Lefebvre P.A., Silflow C.D., Berman J. Chlamydomonas telomere sequences are A+T-rich but contain three consecutive G-C base pairs. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8222-8226.

419. Phillips P.D., Kaji K., Cristofalo V.J. Progressive loss of the proliferative response of senescing WI-38 cells to PDGF, EGF, insulin, transferrin and DEX. J. Gerontol., 1984,39,1117.

420. Phillips P.D., Kuhnle E., Cristofalo V.J. EGF binding ability is stable throughout the replicative life-span of WI-38 cells. J. Cell Physiol., 1983,114, 311-316.м

421. Pich U., Schubert I. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Alliumсера. Chrom. Res., 1998, 6, 315-321.

422. Pitts A.E., Corey D.R. Inhibition of human telomerase by 2'-0-methyl-RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998,95, 11549-11554.

423. Plisco A., Gilchrest B.A. Growth factor responsiveness of cultured human fibroblasts declines with age. J. Gerontol., 1983,38,513-518.

424. Plumb J.A., Bilsland A., Kakani R., Zhao J., Glasspool R.M., Knox R.J., Evans T.R., Keith

425. W.N. Telomerase-specific suicide gene therapy vectors expressing bacterial nitroreductasesensitize human cancer cells to the pro-drug CB1954. Oncogene, 2001, 20, 7797-7803.i

426. Pontecorvo G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol (PEG) treatment. Somat. Cell Mol. Genet., 1976,1,397-400.

427. Pravtcheva D., Ruddle V. X chromosome-induced reversion of chromosome segregation inmouse/Chinese hamster somatic cell hybrids. Cellular recognition of native and foreign X chromosomes. Exp. Cell Res., 1983,146, 401-406.

428. Prescott J., E.H. Blackburn. Telomerase RNA mutationsin Saccharomyces cerevisiae alter telomerase actionand reveal nonprocessivity in vivo and in vitro. Genes &Dev. 1997, 11: 528540.

429. Pritchard C. A., Goodfellow P.N. Investigation of chromosome-mediated gene transfer using HPRT region of the human X-chromosome as a model. Genes Dev., 1987,1,172-178.

430. Prowse K.R., Avilion A.A., Greider C.W. Identification of a nonprocessive telomerase activity from mouse cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 1493-1497.

431. Prowse K.R., Greider C.W. Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995,92,4818-4822

432. Prudovsky I.A., Yegorov Y.E., Zelenin A.V. DNA synthesis in the heterokarions of nondividing differentiated cells and culture cells with various proliferative potentials. Cell Differentiation, 1985, 17,239- 246.

433. Prudovsky I.A., Gumeniuk R.R., Yegorov Y.E., Zelenin A.V. Resident macrophages specifically inhibit DNA synthesis in the nuclei of transformed cells in heterokarions. "International Journal of Cancer", 1989b, 44, 1005-1008.

434. Prudovsky I.A., Kapnik E.N., Fedorov Y.V., Barbul A.I., Zelenin A.V. Differential regulation of DNA synthesis in heterokaryons between chicken erythrocytes and culture cells with various proliferative potentials. Eur. J. Cell Biol., 1990, 51, 347-352.

435. Prudovsky I.A., Kosimov R.B., Sukharev S.I., Pospelova T.V., Prasolov V.S., Zelenin A.V. The control of DNA replication in hybrids between neutrophils and fibroblasts. Cell Prolif., 1993,26,221-233.

436. Quelle D.E., Zindy F., Ashmun R.A., Sherr C.J. Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest. Cell, 1995,83, 993-1000

437. Rabinovich P.S., Norwood Т.Н. Comparative heterokaryon study of cellular senescence and the serum-deprived state. Exp. Cell Res., 1980,130, 101-109.

438. Ramirez R.D., Wright W.E., Shay J.W. and Taylor, R.S. Telomerase activity concentrates in the mitotically active segments of human hair follicles. J. Invest. Dermatol., 1997,108,113117.

439. Ramirez R.D., Morales C.P., Herbert B.-S., Rohde J.M., Passons C., Shay J.W., Wright W.E. Putative telomere-independent mechanisms of replicative aging reflect inadequate growth conditions. Genes Dev., 2001, 15,398-403.

440. Rao P.N., Johnson R.T. Cell fusion and its application to studies on the regulation of cell cycle. Meth. Cell Physiol., 1972,5, 75-126.

441. Reddel R.R., Dunham M.A., Fasching C.L., Neumann A.A., Yeager T.R. Telomeric recombination in telomerase-negative immortalized human cells, in: Telomeres & Telomerase, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001, 189.

442. Reddel R.R. Alternative lengthening of telomeres, telomerase, and cancer. Cancer Letters, 2003,194, 155-162.

443. Reichman T.W., Albanell J., Wang X., Moore M.A.S., Studzinski G.P.Downregulation of telomerase activity in HL-60 cells by differentiating agents is accompanied by increased expression of telomerase-associated protein. J. Cell Biochem., 1997,67, 13-23.

444. Riha K., McKnight T.D., Fajkus J., Vyskot В., Shippen D.E. Analysis of the G-overhang structures on plant telomeres: evidence for two distinct telomere architectures. Plant Journal, 2000,23, 633-641.

445. Ringertz N.R., Nyman U., Bergman M. DNA replication and H5 histone exchange during reactivation of chick erythrocyte in heterokaryons. Chromosoma, 1985,91, 391-396.

446. Robles S.J., Adami G.R. Agents that cause DNA double strand breaks lead to pl6INK4a enrichment and the premature senescence of normal fibroblasts. Oncogene, 1998,16,11131123.

447. Rodeman H.P., Peterson H.P., Schwenke K., von Wangenheim K.H. Terminal differentiation of human fibroblasts is induced by radiation. Scanning Microscopy, 1991, 5, 1135-1143.

448. Rohme D. Evidence for a relationship between longevity of mammalian species and life spans of normal fibroblasts in vitro and erytrocyles in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1981, 78, 5009-5013.

449. Romero D.P., Blackburn E.H. A conserved secondary structure for telomerase RNA. 1991, Cell, 67,343-353.

450. Rosenberg S.A. Yang J.C., Schwartzentruber D.J., Hwu P., Marincola F.M., Topalian S.L.,i

451. Rubelj I., Pereira-Smith O.M. SV40-transformed human cells in crisis exhibit changes that occur in normal cellular senescence. Exp. Cell Res., 1994,211,82-89.

452. Rubio M.A., Kim S.-H., Campisi J. Reversible manipulation of telomerase expression and telomere length. Implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J. Biol. Chem., 2002,277,28609-28617.

453. Rufer N., Migliaccio M., Antonchuk J., Humphries R.K., Roosnek E., Lansdorp P.M. Transfer of the human telomerase reverse transcriptase (TERT) gene into T lymphocytes results in extension of replicative potential. Blood, 2001,98,597-603

454. Saito H., Hammond A.T., Moses R.E. The effect of low oxygen tension on the in vitro replicative life span of human diploid fibroblast cells and their transformed derivatives. Exp. Cell Res., 1995,217,272-279.

455. Sahara K., Marec F., Traut W. TTAGG telomeric repeats in chromosomes of some insects and other arthropods. Chrom. Res., 1999, 7,449-460.

456. Salvadori S., Deiana A.M., Elisabetta C., Floridia G., Rossi E., Zuffardi O. Colocalization of (TTAGGG)n telomeric sequences and ribosomal genes in Atlantic eels. Chromosome Res., 1995,3,54-58.

457. Samper E., Goytisolo F.A., Slijepcevic P., van Buul P.P.W., Blasco M.A. Mammalian ku86• aprotein prevents telomeric fusions independently of the length of TTAGGG repeats and the G-strand overhang. EMBO Reports, 2000,1,244-252.

458. Sancar A. DNA excision repair. Ann. Rev. Biochem., 1996, 65,43-81.

459. Saretzki G., Sitte N., Merkel U., Wurm R.E., von Zhlincki T. Telomere shortening triggers a p53 dependent cell cycle arrest via accumulation of G - rich single stranded DNA fragments., Oncogene, 1999,18,5148-5158.

460. Saretzki G., Petersen S., Petersen I., Kolble K., von Zglinicki. hTERT gene dosage correlates with telomerase activity in human lung cancer cell lines. Cancer Letters, 2002,176, 81-91.

461. Savoysky E., Yoshida K., Ohtomo Т., Yamaguchi Y., Akamatsu K., Yamazaki Т., Yashida S., Tsuchiya M. Down-regulation of telomerase activity is an early event in the differentiation of HL60 cells. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1996,226, 329-334.

462. Scher C.D., Todaro G.J. Selective growth of human neoplastic cells in medium lacking serum growth factor. Exp. Cell Res. 1971, 68,479-481.

463. Schnabl В., Purbeck C.A., Choi Y.H., Hagedorn C.H., Brenner D. Replicative senescence of activated human hepatic stellate cells is accompanied by a pronounced inflammatory but less fibrogenic phenotype. Hepatology, 2003,37,653-664.

464. Schneider E.L., Mitsui Y. The relationship between in vitro cellular aging and in vivo human age. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1976, 73, 3584-3588.

465. Schulz V.P., Zakian V.A., Ogburn C.E., McKay J., Jarzebowicz A.A., Edland S.D. Martin G.M. Accelerated loss of telomeric repeats may not explain accelerated replicative decline of Werner syndrome cells. Hum. Genet., 1996, 97, 750-754.

466. Seabright M. The use of proteolytic enzymes for the mapping of structural rearrangements in the chromosomes of man. Chromosoma, 1972,36,204-210.

467. Seigneurin-Venin S., Bernard V., Tremblay J.P. Telomerase allows the immortalization of T antigen-positive DMD myoblasts: a new source of cells for gene transfer application. Gene Ther., 2000a, 7,619-623.

468. Seimiya H., Sawada H., Muramatsu Y., Shimizu M., Ohko K., Yamane K., Tsuruo T. Involvement of 14-3-3 proteins in nuclear localization of telomerase. The EMBO J., 2000,19, 2652-2661.

469. Serra V., von Zglinicki Т., Lorenz M., Saretzki G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. J. Biol. Chem., 2003, 278,6824-6830.

470. Shammas M.A., Simmons C.G., Corey D.R., Shmookler R.J. Telomerase inhibition by peptide nucleic acids reverses immortality of transformed cells. Oncogene, 1999,18, 6191-6200.

471. Shampay J., Szostak J.W., Blacburn E.H. DNA sequenceof telomeres maintained in yeast Nature, 1984,310,154-157.

472. Sharma H.W., Sokoloski J.A., Perez J.R., Maltese J.Y., Sartorelli A.C., Stein C.A.,Nichols G., Khaled Z., TelangN.T., Narayanan R. Differentiation of immortal cells inhibits telomerase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995,92, 12343-12346.

473. Shay J.W., Pereira-Smith O.M., Wright W.E. A role for both RB and p53 in the regulation of human cellular senescence. Exp. Cell Res., 1991,196, 33-39.

474. Shay J.W., Wright W.E., Werbin H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochimicaet Biophysica Acta, 1991a, 1072, 1-7.

475. Shay J.W., Wright W.E., Brasiskyte D., Van der Haegen B.A. E6 of human papillomavirus type 16 can overcome the Ml stage of immortalization in human mammary epithelial cells but not in human fibroblasts. Oncogene, 1993,8, 1407-1413.

476. Shay J.W., Wright W.E., Werbin H. Toward a molecular understanding of human breast cancer: a hypothesis. Breast Cancer Res. Treatment. 1993a, 25, 83-94.

477. Shay J.W., Van der Haegen B.A., Ying Y., Wright W.E. The frequency of immortalization of human fibroblasts and mammary epithelial cells transfected with SV40 large T-antigen. Exp. Cell Res., 1993b, 209,45-52.

478. Shay J.W., Wright W.E. The reactivation of telomerase activity in cancer progression. Trends in Cenetics, 1996,12, 129-131.

479. Shay J.W., Wright W.E. Implications of mapping the human telomerase gene (hTERT) as the most distal gene on chromosome 5p. Neoplasia, 2000,2, 195-196.

480. Shay J.W., Bacchetti S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur. J. Cancer, 1997, 33:787-791.

481. Sherr C.J., Roberts J.M. Inhibitors of mammalian GI cyclin-dependent kinases. Genes and Dev., 1995,9, 1149-1163.

482. Shi S., Grontos S., Chen S., Reddi A., Counter C.M., Robey P.G., Wang C.-Y. Bone formation by human postnatal bone marrow stromal cells is enhanced by telomerase expression. Nature Biotechnology, 2002, 20, 587-591.

483. Shimada Y., Kaji K., Ito H., Noda K., Matsuo M. Growth-inhibiting effect of tumor necrosis factor on human umbilical vein endothelial cells is enhanced with advancing age in vitro., J. Cell, Physiol., 1990,142, 31-38.

484. Shimada A, Ohta A, Akiguchi I, Takeda T. Inbred SAM-P/10 as a mouse model of spontaneous, inherited brain atrophy. J.Neuropathol. Exp. Neurol., 1992, 51,440-450.

485. Shin S., Freedman V.H., Risser R., Pollack R. Tumorigenicity of virustransformed cells in nude mice is correlated specifically with anchorage independent growth in vitro. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1975,72,4435-4439

486. Shin Y.A., Wierzba K., Matsuo K.I., Ohtani T, Yamada Y, Furihata K, Hayakawa Y, Seto H. Telomestatin, a novel telomerase inhibitor from Streptomyces anulatus. J. Amer. Chem. Soc., 2001,123, 1262-1263.

487. Siegfried Z., Cedar H. DNA methylation: a molecular lock. Curr. Biol., 1997,7, 305-307.

488. Simon L. V., Beauchamp J. R., O'Hare M., Olsen I. Establishment of long term myogenic cultures from patients with Duchenne Muscular Dystrophy by retroviral transduction of a temperature-sensitive SV40 large T antigen. Exp. Cell Res., 1996,224,264-271.

489. Simonsson T. G-quadruplex DNA structures variations on a theme. Biol. Chem., 2001,382, 621-628.

490. Singer M.S., Gottscling D.E. TLC1: Template RNA component of Saccharomyces cerevisiae telomerase. Science, 1994,266,404-409.

491. Smith J.R., Whitney R.G. Introclonal variation in proliferative potential of human diploid fibroblasts: stochastic mechanism for cellular aging. Science, 1980, 207, 82-84.

492. Smith J.K., Yeh G. Telomere reduction in endometrial adenocarcinoma. Amer. J. Obstet. Gynecol., 1992,167,1883-1887.

493. Smith S., Giriat I., Schmitt A., de Lange T. Tankyrase, a poly(ADP-ribose) polymerase at human telomeres. Science, 1998,282, 1484-1487.

494. Smith L.L., Coller H.A., Roberts J.M. Telomerase modulates expression of growth-controlling genes and enhances cell proliferation. Nat. Cell Biol.-, 2003,5,474-479.

495. Smogorzewska A., van Steensel В., Bianchi A., Oelmann S., Schaefer M.R., Schnapp G., de Lange, T. Control of human telomere length by TRF1 and TRF2. Mol. Cell. Biol., 2000,20, 1659- 1668.

496. Solvagione E., Bourbouze R., Percheron F., Hecquet C., Adolphe M. Lineage-specific telomere shortening and unaltered capacity for telomerase expression in human T and В lymphocytes with age. J. Biochimie, 1987, 69, 239-243.

497. Sommerfeld H.J., Meeker A.K., Piatyszek M.A., Bova G.S., Shay J.W., Coffey D.S.

498. Telomerase activity: a prevalent marker of malignant human prostate tissue. Cancer Res.,i1996,56,218-222.

499. Southern P.J., Berg P. Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter. J. Molec. Appl. Gen., 1982,1, 327-341.

500. Stanley J.F., Pye D. MacGregor A. Comparison of doubling numbers attained by cultured animal cells with life span of species. Nature, 1975,255,158-159.

501. Stein G.H., Yanishevsky R.M. Quiescent human diploid cells can inhibit entry into S-phase in replicative nuclei in heterokaryons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, 3025-3029.

502. Stein G.H. Human diploid fibroblasts (HDF) can induce DNA synthesis in cycling HDF but not in quiescent HDF or senescent HDF. Exp. Cell Res., 1983,144,468-471.

503. Stein G.H., Dulic V. Origins of G1 arrest in senescent human fibroblasts. BioEssays, 1995,17, 537-543.

504. Stein G.H., Drullinger L.F., Soulard A., Dulic V. Differential roles for cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and pi 6 in the mechanisms of senescence and differentiation in human fibroblasts. Mol. Cell Biol., 1999,19,21.09-2117. ,

505. Stewart S.A., Ben-Porath I., Carey V.J., O'Connor B.F., Hahn W.C., Weinberg R.A. Erosion of the telomeric single-strand pverhang at replicative senescence. Nature Genetics, 2003,33, 492-496.

506. Steinert S., Shay J.W., Wright W.E. Transient expression of human telomerase extends the life span of normal human fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Com., 2000, 273, 1095-1098.

507. Steinert S., White D.M., Zou Y., Shay J.W., Wright, W.E. Telomere biology and cellular aging in nonhuman primate cells. Exp. Cell Res., 2002,272,146-152.

508. Strahl С., Blackburn E.H. The effects of nucleoside analogs on telomerase and telomeres in Tetrahymena. Nucleic Acids Research, 1994, 22, 893-900.

509. Strahl C., Blackburn E.H. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomerase activity in two immortal human cell lines. Mol. Cell. Biol., 1996,16, 53-56.

510. Sugawara O., Oshimura M., Koi M., Annab L., Baret J. Induction of cellular senescence in immortalized cells by human chromosome 1. Science, 1990,247,707-710.

511. Sun H., Karow J.K., Hickson I.D., Maizels N. The Bloom's syndrome helicase unwinds G4 DNA. J. Biol. Chem., 1998, 273, 27587-27592.

512. Sundstrom C.and Nilsson K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). Int. J. Cancer, 1976,17,565-577

513. Tahara H., Kuniyasu H., Yasui W., Yokozaki H., Shay J.W., Ide Т., Tahara E. Telomerase activity in preneoplastic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clinical Cancer Res.ti

514. Rapid Com., 1995a, 1. 1245-1251.

515. Tahara H., Nakanishi Т., Kitamoto M., Nakashio R., Shay J.W., Tahara E., Kajiyama G., Ide T. Telomerase activity in human liver tissues: comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinomas. Cancer Res., 1995b, 55,2734-2736.

516. Takeda Т., Hosokawa M., Takeshita S., Irino M., Huguchi K., Matsuhita Т., Tomita Y., Yasuhira K., Hamamoto H., Shimizu K., Ishii M., Yamamuro T. A new murine model of accelerated senescence. Mech. Aging Dev., 1981,17, 183-194.

517. Takeda Т., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence accelerated mouse (SAM): a novel murine model of accelerated senescence. J. Amer. Geriatr. Soc., 1991,39,911-919.

518. Takeda Т., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence accelerated mouse (SAM). A novel murine model of aging, in: The SAM model of senescence, ed. Takeda Т., Excerpta Medica, Elsevier Science B.V., Amsterdam, 1994, 15-22.

519. Takeda Т., Hosokawa M., Higuchi К. Senescence accelerated mouse: a novel murine model of senescence. Exp. Gerontol., 1997a, 32, 105-109.

520. Takeda Т., Matsuhita Т., Kurozumi M., Takemura K., Higuchi K., Hosokawa M. Pathobiology of senescence accelerated mouse (SAM). Exp. Gerontol., 1997b, 32, 117-127.

521. Tamiya E., Nakajima Y., Kamioko H., Suzuki M., Karube I. DNA cleavage based on high voltage electric pulse. FEBS Letters, 1988,234 ,357-361.

522. Taylor R.S., Ramirez R.D., Ogoshi M., Chaffins M., Piatyszek M.A., Shay J.W. Detection of telomerase activity in malignant and nonmalignant skin conditions. Inves. Derm., 1996,106, 759-765.

523. Tendian S.W., Parker W.B. Interaction of deoxyguanosine nucleotide analogues with human telomerase. Mol. Pharmacol. 2000,57, 695-699.

524. Teschke C., Solleder G., Moritz K.B. The highly variable pentameric repeats of the AT-rich germline limited DNA in Parascaris univalens are the telomeric repeats of somatic chromosomes. Nucl. Acids Res., 1991,19,2677-2684.

525. Thomas E., al-Baker E., Dropcova S., Denyer S., Ostad N., Lloyd A., Kill I.R. Faragher R.G. Different kinetics of senescence in human fibroblasts and peritoneal esothelial cells. Exp. Cell Res., 1997,236,355-358.

526. Thomas M., Yang L., Hornsby P.J. Formation of functional tissue from transplanted adrenocortical cells expressing telomerase reverse transcriptase. Nat. Tech., 2000,18,39-42.

527. Thweatt R., Goldstein S. Werner syndrome and biological ageing: a molecular genetic hypothesis. Bioessays 1993,15, 421-426.

528. Tollefsbol Т.О., Cohen H.J. Werner's syndrome: an underdiagnosed disorder resembling premature aging. Age 1984; 7, 75-88.

529. Tominaga K., Olgun A., Smith J.R. Pereira-Smith O.M. Genetics of cellular senescence. Mech. Ageing Dev., 2002,123,927-936.

530. Tuntiwechapikul W., Lee J.T., Salazar M. Design and synthesis of the G-quadruplex-specific cleaving reagent perylene-EDTA-iron (II). J. Amer. Chem. Soc., 2001,123,5606-5607.

531. Vaziri H., Benchimol S. From telomere loss to p53 induction and activation of a DNA-damage pathway at senescence: the telomere loss/DNA damage model of cell aging. Exp. Gerontol., 1996,31,295-301.

532. Vaziri H., Benchimol S. Reconstitution of telomerase activity in normal human cells leads to elongation of telomeres and extended replicative lifespan. Current Biology, 1998, 8, 279-282.

533. Vaziri H., Dragowska W., Allsopp R.C., Thomas Т.Е., Harley C.B., Lansdorp P.M. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994,91,9857-9860.

534. Veitonmaki N., Fuxe J., Hultdin M., Roos G., Pettersson R.F., Cao Y. Immortalization of0bovine capillary endothelial cells by hTERT alone involves inactivation of endogenous p 16INK4A/pRb. FASEB J., 2003,17, 764-766.

535. Veldman Т., Liu X., Yuan H., Schlegel R. Human papillomavirus E6 and MYC proteins associate in vivo and bind to and cooperatively activate the telomerase reverse transcriptase promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003,100, 8211-8216.

536. Venetsanakos E., Mirza A., Fanton C., Romanov S.R., Tlsty Т., McMahon M. Induction of tubulogenesis in telomerase-immortalized human microvascular endothelial cells by glioblastoma cells. Exp. Cell Res., 2002,273, 21-33.

537. Venkatesan R.N., Price C. Telomerase expression irf chickens: constitutive activity in somatic tissues and down-regulation in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998,95, 14763-14768.

538. Vialas С., Pratviel G., Meunier B. Oxidative damage generated by an oxo-metalloporphyrin onto the human telomeric sequence. Biochemistry, 2000,39,9514-9522.

539. Vig B.K., Athwal R.S. Sequence of centromere separation: separation in quasi-stable mouse-human somatic cell hybrid. Chromosoma, 1989,98, 167-173.

540. Villa R., Porta C.D., Folini M., Daidone M.G., Zaffaroni N. Possible regulation of telomerase activity by transcription and alternative splicing of telomerase reverse transcriptase in human melanoma. J. Invest. Dermatol., 2001, 116, 867-873.,

541. Villa R., Folini M., Porta C.D., Valentini A., Pennati M., Daidone M.G., Zaffaroni N. Inhibition of telomerase activity by geldanamycin and 17-allylamino, 17-demethoxygeldanamycin in human melanoma cells. Carcinogenesis, 2003, 5, 851-859.

542. Vos Dolmans M. Self-renewal of colony forming units (CFU) in serial bone marrow transplantation experiments. Cell Tissue Kinet., 1972, 5, 371-385.

543. Vulliamy Т., Marrone A., Goldman F., Dearlove A., Bessler M., Mason P.J., Dokal I. The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita. Nature, 2001,413,432-435.

544. Vulliamy T.J., Knight S.W., Mason PJ, Dokal I. Very short telomeres in the peripheral blood of patients with x-linked and autosomal dyskeratosis congenital. Blood Cells Mol. Dis., 2001a, 27, 353-357.

545. Wallweber G., Gryaznov S., Pongracz K., Pruzan R. Interaction of human telomerase with its primer substrate. Biochemistry, 2003,42, 589-600.

546. Walter M., Davies J.P., Ioannou Y.A. Telomerase immortalization upregulates Rab9 expression and restores LDL cholesterol egress from Niemann-Pick CI late endosomes. J. Lipid Res., 2003,44,243-253.

547. Wang S.S., Zakian V.A. Telomere-telomere recombination provides an express pathway for telomere acquisition. Nature, 1990,345,456-458.

548. Wang J., Hannon G.J., Beach D.H. Risky Immortalization by telomerase. Nature, 2000, 405, 755-756.

549. Wang S.S., Zakian V.A. Sequencing of Saccharomyces telomeres cloned using T4 DNA polymerase reveals two domains. Mol. Cell. Biol., 1990,10,4415-4419.

550. Wang S., Zhu J. Evidence for a relief of repression mechanism for activation of the human telomerase reverse transcriptase promoter. J. Biol. Chem., 2003,278,18842-18850.

551. Watanabe Y., Lee S.W., Detmar M., Ajioka I., Dvorak H.F. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) delays and induces escape from senescence in human dermal microvascular endothelial cells. Oncogene, 1997,14,2025-2032.

552. Watson J. D. Origin of concatemeric T7 DNA., Nature, 1972,239, 197-201.

553. Weilbaecher R.G., Lundblad V. Assembly and regulation of telomerase. Curr. Opin. Chem. Biol., 1999,3,573-577.

554. Weismann, A. (1884) Uber Leben und Tod, Jena.

555. Weismann A. Essays upon heredity and kindred biological problems. 1891,1, Clarendon Press, Oxford.

556. Weiss H. and Scherthan H. Aloe spp. plants with vertebrate-like telomeric sequences.

557. Chromosome Res., 2002, 10, 155-164.

558. Weiss M., Green H. Human-mouse hybrid cell lines containing partial complements of humanichromosomes and functioning human genes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1967, 58, 1104-1111.

559. Wellinger R.J., Ethier K., Labrecque P., Zakian V.A. Evidence for a new step in telomere maintenance. Cell, 1996, 85,423-433.

560. Weng N.P. Regulation of telomerase expression in human lymphocytes. Springer Semin. Immunopathol. 2002,24, 23-33.

561. Wenz C., Enenkel В., Amacker M., Kelleher C., Damm K., Lingner J. Human telomerase contains two cooperating telomerase RNA molecules. EMBO J., 2001,20, 3526-3534.

562. Werner J.E., Kota R.S., Gill B.S., Endo T.R. Distribution of telomeric repeats and their role in the healing of broken chromosome ends in wheat. Genome, 1992,35, 844-848.

563. Whitaker N.J., Kidston E.L., Reddel R.R. Finite life span of hybrids formed by fusion of different simian virus 40-immortalized human cell lines. J. Virology, 1992, 66,1202-1206.

564. Wick M., Zubov D., HagenG. Genomic organization and promoter characterization of the gene encoding the human telomerase reverse transcriptase (hTERT). Gene, 1999,232, 97-106.

565. Wicky C., Villeneuve A.M., Lauper N., Codourey L., Tobler H., Muller F. Telomeric repeats (TTAGGG)n are sufficient for chromosome capping function in Caenorhabditis elegans. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996,93, 8983-8988.

566. Wieser R.J. and Oesch F. Contact-dependent regulation of growth of diploid human fibroblasts is dependent upon the presence of terminal galactose residues on plasma membrane glycoproteins. Exp. Cell Res., 1988,176, 80-86.

567. Wieser R.J., Heck R., Oesch F. Involvement of plasma membrane glycoproteins in the contact-dependent inhibition of growth of human fibroblasts. Exp. Cell Res., 1985,158,493499.

568. Williams G.C. Pleiotrophy, natural selection and the evolution of senescence. Evolution, 1957, 11,398-411.

569. Winkles J.A., O'Connor M.L., Friesel R. Altered regulation of platelet-derived growth factor A-chain and c-fos gene expression in senescent progeria fibroblasts. J. Cell Physiol., 1990, 144,313-325.

570. Won J., Yim J., Kim Т.К. Opposing regulatory roles of E2F in human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene expression in human tumor and normal somatic cells. FASEB J., 2002,16,1943-1945.

571. Wong J.M., Kusdra L., Collins K. Subnuclear shuttling of human telomerase induced by transformation and DNA damage. Nat. Cell. Biol., 2002,4, 731-736.

572. Wood R.D. DNA repair in eukaryotes. Ann. Rev. Biochem., 1996,65, 135-167.

573. Woods J.P., Goldman W.E. In vivo generation of linear plasmids with addition of telomeric sequences by Histoplasma capsulatum. Mol. Microbiol. 1992,6,3603-3610.

574. Wright N.A. and Alison M. The biology of epithelial cell populations. 1994, Clarendon Press, Oxford, UK.

575. Wright W.E., Pereira-Smith O.M., Shay. J.W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol. Cell. Biol., 1989,9, 3068-3092.

576. Wright W.E., Piatyszek M.A., Rainey W.E., Byrd W., Shay J.W. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells., Dev. Genet., 1996a, 18, 173-179.

577. Wright W.E., Tesmer V.M., Huffman K.E., Levene S.D., Shay J.W. Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. Genes & Development, 1997, 11,2801-2809.

578. Wright W.E., Shay J.W. Telomere positional effects and the regulation of cellular senescence. Trends Genet., 1992a, 8, 193-197.

579. Wright W.E., Shay J.W. The two-stage mechanism controlling cellular senescence and immortalization. Exp. Gerontol., 1992b, 27, 383-389.

580. Wright W.E., Shay J.W. Mechanism of escaping senescence in human diploid cells., in Cellular Aging and Cell Death, Wiley-Liss, Inc., 1996b, 153-166.

581. Wright W.E., Shay J.W. Telomere dynamics in cancer progression and prevention: fundamental differences in human and mouse telomere biology. Nature Medicine. 2000,6, 849-851.

582. Wright W.E., Shay J.W. Cellular senescence as a tumor-protection mechanism: the essential role of counting. Current Opinion Genet Dev., 2001,11,98-103.

583. Wright W.E., Shay J.W. Historical claims and current interpretations of replicative aging. Nature Biotechnology, 2002,20, 8-14.

584. Wu A., Ichihashi M., Ueda M., Correlation of the expression of human telomerase subunits with telomerase activity in normal skin and skin tumors. Cancer, 1999, 86, 2038-2044.

585. Wynford-Thomas D., Bond J.A., Paterson H. Supression of transformation and immortality in human-chinese hamster fibroblast hybrids a model for suppressor gene isolation. Int. J. Cancer, 1989,43,293-299.

586. Xia C., Higuchi K., Shimizu M., Matsushita Т., Kogishi K., Wang J., Chiba Т., Festing M.F., Hosokawa M. Genetic typing of the senescence accelerated mouse (SAM) strains with micro satellite markers., Mamm. Genome, 1999, 10,235-238.

587. Xu D., Gruber A., Bjorkholm M., Peterson C., Pisa, P. Suppression of telomerase reverseitranscriptase (hTERT) expression in differentiated HL-60 cells: regulatory mechanisms. Br. J. Cancer, 1999, 80,1156-1161.

588. Yang J., Chang E., Cherry A.M., Bangs C.D., Oeii Y., Bodnar A., Bronsteini A., Chiui C., Herron G.S. Human endothelial cell life extension by telomerase expression. J. Biol. Chem., 1999,274,26141-26148.

589. Yang L., Suwa Т., Wright W.E., Shay J.W., Hornsby P.J. Telomere shortening and decline in replicative potential as a function of donor age in human adrenocortical cells. Mech. Ageing. Dev., 2001, 122, 1685-1694.

590. Yang H., Kyo S., Takatura M., Sun L. Autocrine transforming growth factor beta suppresses telomerase activity and transcription of human telomerase reverse transcriptase in human cancer cells. Cell Growth Differ., 2001a, 12,119-127.

591. Yang J., Nagavarapu U., Relloma K., Sjaastad M.D., Moss W.C., Passaniti A., Herron G.S.

592. Telomerized human microvasculature is functional in vivo. Nat. Biotechnol., 2001b, 19, 219-224.

593. Yang Y., Chen Y., Zhang C., Huang H., Weissman S.M. Nucleolar localization of hTERT protein is associated with telomerase function. Exp. Cell Res., 2002,277,201-209.

594. Yashima K., Maitra A., Rogers B.B., Timmons C.F., Rathi A., Pinar H., Wright W.E., Shay J.W. Gazdar A.F.) Expression of the RNA component of telomerase during human development and differentiation. Cell Growth Differ., 1998,9, 805-813.

595. Yaswen P. and Stampfer M.R. Molecular changes accompanying senescence and immortalization of cultured human mammary epithetial cells. Int. J. Biochem. Cell. Biol., 2002,34, 1382-1394.

596. Yeager T.R., Neumann A.A., Englezou A., Huschtscha L.I., Noble J.R., Reddel R.R. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body., Cancer Res., 1999,59,4175-4179.

597. Yegorov Y.E., Chernov D.N., Akimov S.S., Bolsheva N.L., Krayevsky A.A., Zelenin A.V. Reverse transcriptase inhibitors suppress telomerase function and induce senescence-like processes in cultured mouse fibroblasts. FEBS Letters, 1996a, 389, 115-118.

598. Yegorov Y.E., Chernov D.N., Akimov S.S., Zelenin A.V. Reverse transcriptase inhibitors suppress telomerase activity and induce senescence-like processes in cultured mouse fibroblasts. Molecular Biology of the Cell, 1996b, 7s, 534a.

599. Yegorov Y.E., Akimov S.S., Hass R., Zelenin A.V., Prudovsky I.A. Endogenous p-galactosidase activity in continuously nonproliferating cells. Exp. Cell Res., 1998, 243,207211.

600. Yegorov Y.E., Akimov S.S., Akhmalisheva A.K., Semenova I.V., Smirnova Y.B., Kraevsky A.A., Zelenin A.V. Blockade of telomerase function in various cells. Anti-Cancer Drug Design, 1999,14,305-316.

601. Yegorov Y.E., Semenova I.V., Karachentsev D.N., Semenova M.L., Akimov S.S., Yegorova I.N., Zelenin A.V. Senescent accelerated mouse (SAM) a model that binds in vivo and in vitro aging. Journal of Anti-Aging Medicine, 2001,4,41-49.

602. Yegorov Y.E., Zelenin A.V. Duration of senescent cell survival in vitro as a characteristic oforganism longevity, an additional to the proliferative potential of fibroblasts. FEBS Letters,»2003,541,6-10.

603. Yi X., White D.M., Aisner D.L., Baur J.A., Wright W.E., Shay J.W. An alternate splicing variant of the human telomerase catalytic subunit inhibits telomerase activity. Neoplasia, 2000, 2,433-440.

604. Yokoyama Y., Takahashi Y., Shinora A., Wan X.Y., Takahashi S., Niwa K., Tamaya T. The 5'-end of hTERT mRNA is a good target for hammerhead ribozyme to suppress telomerase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000,273, 316-321.

605. Yokoyama Y., Wan X., Takahashi Y., Shinohara A., Tamaya T. Alternatively spliced variant deleting exons 7 and 8 of the human telomerase reverse transcriptase gene is dominantly expressed in the uterus. Mol. Hum. Reprod., 2001, 7,853-857.

606. Young J.I., Sedivy J.M., Smith J.R. Telomerase expression in normal human fibroblasts stabilizes DNA 5-methylcytosine transferase I. J. Biol. Chem., 2003,278, 19904-19908.

607. Yu C.E., Oshima J., Fu Y.H., Wijsman E.M., Hisama F., Alisch R., Matthews S., Nakura J., Miki Т., Ouais S., Martin G.M., Mulligan J., Schellenberg G.D. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science 1996, 272,258-262.

608. Yu G.L., Bradley J.D., Attardi L.D., Blackburn E.H. In vivo alteration of telomere sequences, and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs. Nature, 1990,344, 126132.

609. Yu G.-L., E.H. Blackburn. Developmentally programmed healing of chromosomes by telomerase in Tetrahymena. Cell, 1991, 67, 823-832.

610. Zaug A.J., Linger J., Cech T.R. Method for determining RNA 3' ends and application to human telomerase RNA. Nucleic Acids Res., 1996, 24, 532-533.

611. Zelenin A.V., Prudovsky I. A. The regulation of DNA synthesis investigated on heterokaryons of dividing and non-dividing cells. Int. Review Cytol., 1989,117, 179-214.

612. Zhan X., Ни X., Friesel R., Maciag T. Long term growth factor exposure and differential tyrosine phosphorylation are required for DNA synthesis in BALB/c 3T3 cells. J. Biol. Chem., 1993,. 268, 9611-9620.

613. Zhang X., Mar V., Zhou W., Harrington L., Robinson M.O. Telomere shortening and apoptosis in telomerase-inhibited human tumor cells. Genes Dev., 1999, 13,2388-2399.

614. Zhao J., Bilsland A., Hoare S.F., Keith W.N. Involvement of NF-Y and Spl bindingsequences in basal transcription of the human telomerase RNA gene. FEBS Letters, 2003, 536,111.119.

615. Zhu X., Kumar R., Mandal M., Sharma N., Sharma H.W., Dhingra U., Sokolovski J.A., Hsiao R., Narayanan R. Cell cycle-dependent modulation of telomerase activity in tumor cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996,93, 6091-6095.

616. Zhu L., Hathcock K.S., Hande P., Lansdorp P.M., Seldin M.F., Hodes R.J. Telomere length regulation in mice is linked to a novel chromosome locus., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1998, 95, 8648-8653.

617. Zijlmans J.M.J.M., Martens U.M., Poon S.S.S., Raap A.K., Tanke H.J., Ward R.K., Lansdorp P.M. Telomeres in the mouse have large inter-chromosomal variations in the number of T2AG3 repeats. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1997, 94,7423-7428.

618. Zou Y., Yi X., Wright W., Shay J.W. Human telomerase can immortalize Indian muntjac cells. Exp. Cell Res., 2002,281,63-76.