Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Репаративный остеогенез при ксенотрансплантации пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Фатхудинов, Тимур Хайсамудинович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. История изучения репаративного остеогенеза.

2.2. Методы стимуляции репаративного остеогенеза.

2.3. Культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

2.4. Культивирование хондробластов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Получение культуры пренатальных мультипотентных мезенхимальных клеток стромы костного мозга.

3.2. Получение культуры пренатальных хондробластов.

3.3. Методики характеристики фенотипа полученных культур клеток.

3.4. Экспериментальное исследование.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Характеристика фенотипа полученных культур клеток.

4.1.1. Культура мультипотентных мезенхимальных клеток стромы костного мозга.

4.1.2. Культура хондробластов.

4.2. Результаты экспериментального исследования.

4.2.1. Десятые сутки наблюдения.

4.2.2. Тридцатые сутки наблюдения.

4.2.3. Шестидесятые сутки наблюдения.

4.2.4. Девяностые сутки наблюдения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Репаративный остеогенез при ксенотрансплантации пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека"

1.1. Актуальность темы

Современные травмы опорно-двигательного аппарата, различные дегенеративные заболевания костной и хрящевой тканей нередко характеризуются большой тяжестью. Растущая распространенность заболеваний, ранняя трудовая и бытовая инвалидизация свидетельствуют об отсутствии эффективных средств медикаментозного или хирургического лечения [3, 8]. Несмотря на то, что костная ткань обладает высокой восстановительной способностью, в ряде случаев репаративный процесс в костной ткани даже при использовании различных остеопластических и остеоиндуктивных материалов не заканчивается восстановлением ее структуры и функции. Подобные состояния, обусловленные разрушением или несостоятельностью камбиальных клеточных элементов костной ткани, можно охарактеризовать как "остеогенную недостаточность" [8].

Регенерация кости - сложный многоступенчатый процесс, составляющими которого являются миграция, пролиферация, дифференцировка различных клеточных популяций мезенхимального происхождения. Регенерация костной ткани и развитие кости в эмбриогенезе протекают с участием незрелых клеток мезенхимы, которые сохраняются в так называемых стволовых нишах периоста, эндоста и костного мозга [55, 138, 173].

Учитывая недостаточность функционально 1 активных предшественников остеобластов, при лечении обширных травм и дегенеративных заболеваний кости особое значение приобретают методы, связанные с трансплантацией собственных или аллогенных клеток-предшественников. В связи с развитием клеточной биологии стало возможным в лабораторных условиях получать культуры стволовых/прогениторных клеток и трансплантировать их с целью стимуляции регенерации костной и хрящевой тканей.

Можно выделить три популяции самообновляющихся клеток, которые обладают высоким пролиферативным потенциалом и обусловливают рост и перестройку костной ткани [173, 181, 222]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) [17, 126], остеобласты (ОБ) [74] и хондробласты (ХБ) [20, 118] благодаря их высокой пролиферативной активности, могут быть успешно получены, размножены в культуре и использованы для стимуляции регенерации при различных заболеваниях костной и хрящевой тканей.

Разработка методов селективного выращивания стволовых и прогениторных клеток костного мозга, хряща и периостиума привела к ощутимому прогрессу фундаментальных исследований в области механизмов регенерации костной и хрящевой ткани in vitro и in situ. Однако современная реконструктивная хирургия пока не имеет надежных клеточных технологий, которые бы обеспечивали стимуляцию направленной регенерации кости и хряща. Несмотря на большое количество экспериментальных исследований на животных с использованием ММСК, хондро- и остеопрогениторных клеток, предпочтительная стратегия подготовки клеточного трансплантата для репаративного остеогенеза и хондрогенеза не сформулирована, поскольку существует несколько лабораторных путей репаративного гистогенеза кости как из прикрепленных к различным носителям клеток, так и суспензионной культуры [14, 70, 145]. Большинство исследований в этой области посвящены изучению репаративного остеогенеза при трансплантации аутологичных остеогенных клеток с использованием трехмерных конструкций из различных остеопластических материалов [32, 47, 116, 143]. Эти материалы обладают выраженной остеоиндуктивной активностью, являясь компонентами органического или неорганического матрикса кости и/или сорбируя на своей поверхности факторы роста и регенерации костной ткани [60, 80, 130, 217]. Однако плохо изученным остается вопрос о стимуляции регенерации кости и ее механизмах при введении только клеток предшественников без дополнительного действия остеопластических материалов. Причиной этого, по всей видимости, является отсутствие адекватной экспериментальной модели повреждения кости, которая позволила бы эффективно апплицировать и иммобилизовать суспензионный клеточный трансплантат.

Современные методы селективного культивирования ММСК и ХБ позволяют эффективно избавляться от примеси предшественников иммунокомпетентных клеток, несущих антигены главного комплекса совместимости II класса, что позволяет избежать развития реакции «трансплантат против хозяина». В ряде работ и нашем исследовании было показано, что при длительном культивировании существенно снижается уровень экспрессии HLA I [135]. Кроме того, в настоящее время широко изучается иммуномодулирущий эффект ММСК, который проявляется ингибирующим действием на пролиферацию Т-лимфоцитов при сокультивировании и супрессией Т-клеточного ответа при реакции смешанных лимфоцитов [102, 123, 136], экспрессией и синтезом различных противовоспалительных и иммуномодулирующих цитокинов, факторов роста (TGF, HGF, IL-3 и др.) [78, 122]. Трансплантация даже аллогеных МСК пролонгирует выживаемость ксено- и аллографтов. Безопасность и эффективность применения аллогенных и ксеногенных стволовых/прогениторных клеток для регенерации костной ткани и необходимость проведения иммуносупрессивной терапии требует дальнейшего изучения.

В свете приведенных положений разрабатываемая нами проблема является актуальной и представляет не только теоретическое, но и практическое значение, что определяет тему данного экспериментального исследования.

1.2. Цель исследования

Изучить влияние трансплантации пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека на репаративный остеогенез трубчатых костей крыс в эксперименте.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить культуры пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и хондробластов гиалинового хряща человека, охарактеризовать фенотип полученных культур.

2. Разработать экспериментальную модель повреждения бедренной кости для введения суспензионного трансплантата мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов.

3. Оценить влияние суспензии мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов при ксенотрансплантации на скорость и качество регенерации костной ткани диафиза бедра крысы.

4. Изучить особенности репаративного остеогенеза на противоположной конечности при односторонней трансплантации клеток.

5. Провести сравнительную оценку репаративного потенциала обоих типов клеток.

1.3. Научная новизна

Данная работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проводится оценка стимуляции регенерации костной ткани при ксенотрансплантации суспензионного клеточного трансплантата мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека на модели повреждения бедренной кости у крыс. Кроме того, исследован системный (дистантный) эффект стимуляции регенерации кости на противоположной конечности при односторонней трансплантации клеток.

В ходе исследования разработана модель экспериментального повреждения кости для оценки влияния суспензии мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов на эндоостальный и костномозговой остеогенез.

Установлено, что костная ткань, образующаяся при трансплантации ММСК и ХБ, встраивается в костный орган и подвергается полноценному ремоделированию, что приводит к восстановлению целостности органа.

Впервые было проведено сравнительное исследование репаративного потенциала двух типов клеток: мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов.

Показано, что ксенотрансплантация пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов без проведения иммуносупрбссии не вызывает осложнений и местных реакций отторжения трансплантата.

1.4 Научно-практическая значимость

Анализ полученных экспериментальных результатов позволяет разработать и внедрить в клиническую практику метод стимуляции регенерации дефекта костной ткани путем трансплантации пренатальных ММСК и ХБ, используя их выраженную остеогенную активность in situ и возможность крупномасштабного получения культур этих клеток.

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. Трансплантация ксеногенных пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов обеспечивает стимуляцию регенерации костной ткани, при этом образованная костная ткань встраивается в костный орган, подвергается ремоделированию и морфологически не отличается от окружающей кости.

2. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки обладают более выраженным остеорепаративным потенциалом, чем хондробласты.

3. При локальном одностороннем введении клеточного трансплантата имеет место системный эффект стимуляции регенерации кости.

1.6. Апробация работы

Основные положения работы доложены на: II Московском международном конгрессе «Биотехнология и медицина» (2003 г., Москва); XXXI Annual ESAO congress (2004 г, Варшава); Московской научной конференции «Клиническая трансплантация органов» (2005 г., Москва); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (2005 г., Москва); Межлабораторной научной конференции в НИИ морфологии человека РАМН (2006 г., Москва); Научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (2006 г., Москва).

1.7. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 в центральной печати, получен 1 патент.

1.8. Объем и структура работы диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Литературный указатель включает в себя 226 источников, из них 32 - отечественных, 194 - иностранных. Работа иллюстрирована 60 фотографиями, 35 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Фатхудинов, Тимур Хайсамудинович

выводы

1. Разработана экспериментальная модель, позволяющая фиксировать суспензионный клеточный трансплантат в области дефекта костной ткани с помощью полупроницаемой полиэфирсульфоновой мембраны, которая отграничивала периостальный остеогенез от эндостального и костномозгового.

2. Трансплантация ксеногенных пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека в область дефекта кости крысы приводит к ускорению регенерации на 10, 30 сутки наблюдения за счет увеличения площади костной части регенерата, зрелой компактной кости и уменьшения доли рыхлой соединительной ткани. При трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток выявлено более выраженное ускорение регенерации, чем при введении хондробластов в основном за счет увеличения доли зрелой компактной костной ткани.

3. Выявлен системный (дистантный) эффект стимуляции регенерации на противоположных конечностях при одностороннем введении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов на 10, 30 сутки эксперимента.

4. На отдаленных сроках (90 сутки) после трансплантации клеток в области дефекта формировался полноценный костный регенерат.

5. На исследуемых сроках ксенотрансплантация пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов без проведения иммуносупрессивной терапии не вызывала осложнений, местных реакций отторжения трансплантата.

6. Получены и охарактеризованы культуры пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и хондробластов гиалинового хряща человека. В гиалиновом хряще плода с увеличением срока гестации увеличивается количество клеток, синтезирующих тканеспецифический маркер, коллаген II типа. 7. Полученные результаты служат экспериментальным обоснованием для применения аллогенных трансплантаций пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов при лечении обширных дефектов костной ткани в клинической практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Объектом изучения в настоящей работе служили особенности репаративного остеогенеза трубчатых костей крыс при ксеногенной трансплантации суспензии пренатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и хондробластов человека. Основной из поставленных вопросов состоял в том, как влияют на скорость и качество регенерации костной ткани эти виды клеточных трансплантатов.

Основными задачами нашего исследования были получение и характеристика культур клеток, трансплантация которых приводит к стимуляции репаративного остеогенеза. Можно выделить три популяции самообновляющихся клеток, которые обладают высокой пролиферативной активностью и обусловливают рост и перестройку костной ткани. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, остеобласты и хондробласты могут быть успешно получены, размножены в культуре и использованы для стимуляции регенерации при различных заболеваниях костной и хрящевой тканей [7, 20, 86].

Как указывалось выше, источниками ММСК служат глубокий слой надкостницы, эндост, костный мозг и периферическая кровь [57, 111, 126, 189]. Большинство клеточных биологов для получения культуры ММСК используют пре- и постнатальный костный мозг, из клеток которого при ведении культуры в селективных культуральных средах и пассировании с низкой плотностью удается выделить клоногенную культуру ММСК [49, 50, 63, 170]. При добавлении в культуру различных факторов роста и дифференцировки можно получить клетки с миогенным, остеогенным, хондрогенным, адипогенным и другими фенотипами [17, 153, 220].

Крайне интересным и малоизученным остается вопрос участия хрящевой ткани в регенерации кости. Некоторые исследователи рассматривают образование гиалинового хряща при репаративном остеогенезе как патологический процесс, который протекает в условиях нарушенного кровоснабжения [66, 77, 82, 164]. В ряде ситуаций при обширных дефектах кости, недостаточности кровоснабжения и др. формируется ложный сустав, то есть дефект заполняется фиброзной или хрящевой тканями, не выполняющими функции опорного органа. Однако процесс формирования временной хрящевой ткани может рассматриваться и как компенсаторный механизм. В ряде исследований было показано, что в условиях гипоксии ММСК как in vivo, так и in vitro дифференцируются в хрящевые клетки [17, 26, 63, 110].

Для проведения исследования из стромы костного мозга нами были получены мультипотентной мезенхимальной стромальной клетки (ММСК). С помощью проточной цитофлуометрии был охарактеризован иммунофенотип ММСК по основным позитивным (CD 44, CD 90, CD 105) [170, 171] и негативным (CD 34, HLA DR) маркерам [170, 171].

Для получения культуры ХБ мы использовали пренатальный гиалиновый хрящ разных сроков гестации: 8-12 и 18-20 недель развития. В эмбриогенезе основная часть хрящевой ткани in situ возникает из конденсатов мезенхимальных клеток [183]. При накоплении «критической массы» мезенхимы мезенхимальные клетки обратимо дифференцируются в хондробласты (хондропрогениторные клетки), которые синтезируют экстрацеллюлярный матрикс другого типа: не коллагена I типа, а специфические протеогликаны и коллаген II типа [183], которые таким образом являются их маркерами. В тоже время ХБ сохраняют высокую пролиферативную активность. Эта зародышевая гиалиновая хрящевая ткань является главным источником ХБ. На внутриутробных стадиях развития хрящевая ткань состоит в основном из пролиферирующих хондропрогениторных популяций без примеси ангиогенных клеток и остеобластов. При формировании зачатков конечностей ткань состоит главным образом из мезенхимальных клеток и небольшого количества ХБ. В дальнейшем (стадия роста) количество ХБ увеличивается во много раз, и этот тип клеток временно начинает преобладает над остальными. В постнатальном периоде развития ХБ сохраняются только в перихондриуме и эпифизарных пластинках кости, обусловливая энхондральный рост костной ткани [66, 77, 164, 186]. Таким образом, пренатальная гиалиновая хрящевая ткань может быть использована для получения однородных культур ХБ без примеси ММСК и мезодермальных прогениторных клеток.

Однако в процессе нашей работы были выявлены четкие различия в первичных культурах, полученных из гиалинового хряща на разных сроках гестации. Клетки в первичных культурах, полученные из абортного материала на 8-12 неделях беременности, были представлены клетками полигональной и вытянутой формы с минимальным количеством отростков, тогда как первичные культуры из материала более поздних сроков беременности (18-20 нед.) были представлены клетками округлой и полигональной формы без отростков. При иммуноцитохимическом исследовании количество коллаген П-синтезирующих клеток возрастало с увеличением сроков гестации.

Кроме того, при сравнении первичной и многократно пассированной культур также отмечались различия внешнего вида полученных клеток и их иммунофенотипа, что, по всей видимости, обусловлено изменениями ХБ при культивировании. Это феномен широко описан в литературе [92, 105, 131, 206]. Многие исследователи при культивировании дифференцированных клеток гиалинового хряща на пластике отмечали, что клетки, особенно посеянные с низкой плотностью, достаточно быстро приобретают «фибробластоподобную», веретеновидную форму и, более того, перестают синтезировать коллаген II типа [206]. По этим причинам в нашем исследовании для трансплантации использовали культуры ХБ пренатальной гиалиновой хрящевой ткани, полученные из абортного материала на 18-20 неделях гестации и пассированные с высокой плотностью не более двух раз. Полученная культура по своим фенотипическим характеристикам отвечала целям и задачам исследования.

Таким образом, для стимуляции регенерации костной ткани использовались мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки и хондробласты с высокими остеогенными и остеоиндуктивными потенциями [17, 20]. При их трансплантации в виде суспензии в области дефекта формировалась полноценная костная ткань. Морфологически ее развитие повторяло обычные стадии нормального развития и регенерации трубчатых костей, то есть происходило формирование грубоволокнистой и пластинчатой костной ткани с ее последующим ремоделированием.

Решающим моментом в данной работе был выбор экспериментальной модели. Основное требование к модели повреждения состояло в том, чтобы было возможно эффективно фиксировать суспензионный клеточный трансплантат в области дефекта. Как показали наши наблюдения, полиэфирсульфоновая мембрана, будучи удачно зафиксированной, сохранялась в области имплантации до конца эксперимента. Кроме того, оказалось, что, препятствуя усиленному проникновению в костный дефект периостальных элементов, она накладывала определенный отпечаток на течение репаративного процесса, который осуществляется в этом случае преимущественно за счет вненадкостничного клеточного пула, т.е. за счет клеток, оказавшихся в самом костном дефекте. На данной экспериментальной модели мы оценивали влияние трансплантации ММСК и ХБ на скорость и качество регенерации кости.

Для оценки возможного системного (дистантного) эффекта стимуляции регенерации были созданы две контрольные группы. Учитывая наиболее вероятный механизм остеостимулирующей активности клеточной трансплантации - первичную и вторичную индукцию репаративных процессов за счет различных факторов роста и регенерации, которые могут иметь как местное, так и системное действие, - дефект кости на противоположной конечности не мог рассматриваться как контроль. Поэтому в контрольную группу входили животные, которым воспроизводили дефект на обеих конечностях и вводили физиологический раствор. Таким образом, отработанная экспериментальная модель, на наш взгляд, отвечала целям и задачам нашего исследования.

В настоящее время отсутствует четкое понимание процессов, лежащих в основе стимуляции регенерации при трансплантации стволовых/прогениторных клеток. Одним из вероятных механизмов регенерации является способность пересаженных клеток приживаться, пролиферировать и дифференцироваться в специализированные клетки и, таким образом, восстанавливать структуру и функцию поврежденной ткани [63, 68, 107]. Другим свойством стволовых/прогениторных клеток является продукция ряда факторов роста и дифференцировки, которые регулируют пролиферацию и дифференцировку как трансплантированных клеток, так и клеток реципиента в месте повреждения, стимулируя таким образом процессы регенерации [138]. Кроме того, некоторые исследователи продемонстрировали противовоспалительную и иммуномодулирующую активность стволовых клеток, в особенности мезенехимальных [40, 102, 122, 123].

При аллогенных и даже ксеногенных трансплантациях также было показано, что пересаженные клетки могут выживать, пролиферировать, мигрировать в место повреждения, дифференцироваться в специализированные клетки и участвовать в процессах репарации. В некоторых исследованиях клинический и гистоморфологический эффект подобных трансплантаций сопоставим с аутологичными пересадками [72, 140, 159, 212]. Это может объясняться тем, что современные методы культивирования позволяют максимально освободиться от клеток крови, иммунокомпетентных клеток и их предшественников. Селективное культивирование и применение гомогенных клеточных культур позволяет исключить развитие реакции «трансплантат против хозяина». Кроме того, в ряде работ было отмечено, что при культивировании снижается уровень экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости I класса, что подтверждается и в нашем исследовании [20].

В задачу нашей работы не входило изучение механизмов регенерации при трансплантации клеток, судьба пересаженных клеток, их выживаемость, пути миграции, пролиферация и направление дифференцировки. Основной вопрос, который мы перед собой ставили - как ксенотрансплантация ММСК и ХБ человека влияет на скорость и качество регенерации трубчатой кости крысы.

При изучении влияния трансплантации клеток на процессы регенерации костной ткани основными методами наблюдений служили контроль общего состояния животных в ходе эксперимента, исследование экспериментальных ран и макропрепаратов на аутопсии животных, гистоморфологическое и морфометрическое исследования костного регенерата и окружающих тканей в динамике через 10-90 суток после операции.

В раннем и позднем послеоперационном периоде состояние животных оставалось удовлетворительным, неугнетенным, без местных патологических реакций и осложнений. В области введения клеточных трансплантатов, ксеногенных для подопытных животных, не наблюдалось сколько-нибудь выраженных реакций отторжения, воспаления, лимфогистиоцитарной инфильтрации. На 90 сутки наблюдения в опытных и контрольных группах в области дефекта диафиза бедренной кости сформировалась полноценная костная ткань, восстанавливающая структуру и функцию костного органа. Следует подчеркнуть, что ни в одной из групп в течение всего срока наблюдения не образовалось избыточного количества костной ткани, которая выступала бы за края дефекта или превосходила материнскую кость по толщине. Несмотря на высокий пролиферативный потенциал ММСК и ХБ, остеогенные потенции этих клеток реализуются только в той степени, в которой это необходимо для восстановления целостности костного органа.

Основные гистоморфологические и морфометрические различия между экспериментальными группами были выявлены на 10 и 30 сутки наблюдения.

Через 10 суток от начала опытов во всех группах опытов наблюдалось образование регенерата, состоящего из двух компонентов: соединительнотканного и костного. В группе с введением в костную рану ММСК наблюдалось интенсивное увеличение массы его костной составляющей при соответственном уменьшении доли соединительной ткани. Отмечалось также повышение уровня созревания костного вещества. В группе ММСК-опыт также отмечалось увеличение доли костной части регенерата по сравнению с костной раной на противоположной конечности (ММСК-контроль). Следует отметить, что в группе ММСК-опыт костная регенерация протекала заметно активнее, чем в группе ХБ-опыт. Группа с введением в костную рану ХБ к 10 суткам опыта продемонстрировала значимое увеличение доли костной части регенерата как по сравнению с контрольной группой, так и с группой ХБ-контроль. Таким образом, было выявлено что под влиянием введения в костные раны суспензии ММСК и ХБ происходило ускорение репаративного остеогенеза, причем в группе с введением ММСК более выражено, чем в группе ХБ-опыт. Кроме того, в группах ММСК-контроль, ХБ-контроль доля костного компонента была значительно выше, чем в контрольной группе.

Как показали дальнейшие исследования, через 1 месяц от начала опыта в контрольной и опытных группах регенерат был целиком представлен костными структурами. В контрольных группах в регенерате сохранялись незначительные участки соединительной ткани. Таким образом, через 1 месяц более высокими оказались значения параметров, указывающие на активность процессов компактизации (увеличение доли зрелого костоного регенерата) и дифференциации костного вещества, особенно в группе ММСК опыт. На этих сроках наблюдения в опытных группах представляла интерес судьба полиэфирсульфоновой мембраны, ее соотношение с окружающими тканевыми структурами. На гистопрепаратах было отмечено, что мембраны прикрывали вход в костный дефект, т.е. располагались непосредственно над регенератом. А отступя в сторону от области травмы, можно было видеть нарастание пласта новообразованной костной ткани на мембрану. Судя по топике, новообразованная костная ткань была связана с периостом. Будучи плотно замурованной в новообразованной кости, полиэфирсульфоновая мембрана (непроницаемая для клеток) отчетливо разграничивала периостальный и внепериостальный репаративный остеогенез. Таким образом, можно предположить, что регенерация под полупроницаемой мембраной происходила за счет собственных клеток предшественников эндоста, периферической крови и трансплантированных клеток.

На второй месяц наблюдения во всех группах отмечалось дальнейшее развитие и дифференцировка костных структур регенерата. Значимых различий между опытными и контрольными группами не отмечалось.

Одной из задач проведенного экспериментального исследования было гистоморфологическое изучение энхондрального остеогенеза при трансплантации хондробластов. Однако только у двух животных в группе с введением ХБ через один и три месяца в некоторых срезах были выявлены участки хондроидной ткани. Подобная гистологическая картина была выявлена и у одной крысы из контрольной группы, поэтому эти данные рассматривались как артефакт и не учитывались при статистической обработке материала. Несмотря на это, в сериях экспериментов с введением ХБ, особенно в группе ХБ-опыт, отмечалось ускорение процессов регенерации по сравнению с контрольной группой. В связи с этим можно прийти к заключению, что трансплантированные ХБ на данной модели повреждения кости длительно не сохраняются в области дефекта, не пролиферируют, не дифференцируются в хондроциты и не образуют временный гиалиновый хрящ. Стимуляция процессов регенерации при трансплантации ХБ реализуется благодаря активной продукции различных цитокинов, факторов роста и дифференцировки, которые ускоряют регенерацию за счет собственных клеток-предшественников.

В серии опытов с введением в дефект кости ММСК была получена максимальная скорость регенерации. Мультипотентной мезенхимальной стромальной клетки вырабатывают огромное количество различных цитокинов, факторов роста и регенерации, изучается их противоспалительная и иммуномодулирующая активность как при местных воспалительных реакциях, так и при системных. Комплекс таких факторов может обеспечить максимальную стимуляцию восстановления структуры и функции тканей. Кроме того, ММСК является предшественником как хондробластов, так и остеобластов, поэтому можно предположить, что при незначительном объеме повреждения и в условиях обильного кровоснабжения ММСК выживали, пролиферировали и дифференцировались в остеобласты. Таким образом, в данном случае стимуляция репаративных процессов происходила не только за счет гуморальных факторов регуляции, но и с участием клеточных механизмов регенерации.

На всех сроках наблюдения был отмечен системный (дистанционный) эффект стимуляции регенерации кости, который заключался в ускорении процессов заживления костной раны на противоположной конечности при введении клеток в одну из конечностей. Восстановительные процессы в этих группах наблюдения протекали медленнее, чем в группах ММСК-опыт и ХБ-опыт, но значительно активнее, чем в контрольной группе. В основе этого наблюдения, вероятнее всего, лежит то, что те же самые факторы роста и регенерации, действующие в области введения клеток, попадая в общий кровоток, могут оказывать системное регенераторное влияние на все поврежденные органы и ткани организма, в том числе на противоположной конечности. Кроме того, нельзя исключить возможность попадания трансплантированных клеток в общий кровоток и миграцию их за счет «хоуминга» в поврежденные ткани. Поэтому в нашем исследовании была заложена «чистая» контрольная группа, в которой животным воспроизводили костный дефект, но не вводили клеточный трансплантат.

В целом проведенные исследования показали, что разработанная экспериментальная модель повреждения кости позволила изучить влияние суспензионного клеточного трансплантата на репаративный остеогенез.

Введение в костные дефекты клеточных трансплантатов ММСК и ХБ оказывало стимулирующее влияние на репаративный остеогенез, особенно выраженное на 10 сутки эксперимента. Этот эффект при одностороннем введении клеточного трансплантата обнаруживал себя на обеих конечностях, хотя и не в равной степени. В более отдаленные сроки наблюдений, помимо построения костных трабекул, в регенерате на первый план выдвигались процессы созревания костной ткани. На 90 сутки наблюдения во всех группах в области дефекта сформировался полноценный костный регенерат, и образованная костная ткань успешно встраивалась в костный орган. Ксенотрансплантация пренатальных ММСК и ХБ без проведения иммуносупрессии не продемонстрировала ранних и поздних осложнений, местных реакций отторжения трансплантата.

Полученные результаты могут служить экспериментальным обоснованием для имплантаций пренатальных ММСК и ХБ при лечении обширных дефектов костной ткани в клинической практике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Фатхудинов, Тимур Хайсамудинович, Москва

1. Астахова B.C. Остеогенные клетки предшественники костного мозга человека. - Киев: Феникс, 2000. - 176 с.

2. Герасимов Ю.В., Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Шишкова В.В. Дифференцировочные потенции клональных штаммов костномозговых фибробластов. //Бюлл. экспер. биол. 1986. Т.101. №6. С.717-719.

3. Гололобов В.Г. Регенерация костной ткани при заживлении огнестрельных переломов. СПб.: Петербург-XXI век, 1997.

4. Горская Ю.Ф., Фриденштейн А.Я., Кулагина Н.Н. Клетки-предшественники фибробластов, выявляемые методом клонирования in vitro клеток кроветворных органов нормальных и облученных мышей. // Бюлл. экспер. биол. 1976. Т.5. С.614-617.

5. Григорьян А.С., Воложин А.И., Агапов B.C., Белозёров М.Н., Дробышев А.Ю. Остеопластическая эффективность различных форм гидроксиапатита по данным эксперементально-морфологического исследования. // Стоматология. 2000. №3. С.4-8.

6. Денисов-Никольский Ю.И., Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Матвейчук И.В. Актуальные проблемы теоретической и клинической остеоартрологии. М.: Новости, 2005.

7. Дулаев А.К., Гололобов В.Г., Деев Р.В., Иванов Д.Е., Николаенко Н.С., Цупкина Н.С., Пинаев Г.П. Остеогенные клетки и их использование в травматологии. // Медицинский академический журнал. 2003. Т.З. №3. С.59-66.

8. Дулаев А.К., Деев Р.В., Николаенко Н.С., Цупкина Н.В., Пинаев Г.П. Оптимизация репаративного остеогенеза трансплантацией стромальных клеток костного мозга. // Клеточная трансплантология. 2004. Т.З. С. 15-16.

9. Кузьменко Г.Н., Фриденштейн А.Я. Образование колоний фибробластов в монослойных культурах клеток селезенки нормальных и облученных мышей. // Бюлл. экспер. биол. 1971. Т.1. С.74-83.

10. Максимов А.А. Основы гистологии: часть II. Учение о тканях. Л.: БМИ, 1925.-316 с.

11. Матвеева А.И. Регенерация костей свода черепа у собак, вызванная ауто- и Гомотрансплантацией костных опилок. Пластические и восстановительные процессы. // Труды второй гистологической конференции. Москва, 1959. С. 170-172.

12. Мискарова Э.Д., Лалыкина К.С., Кокорин И.Н., Фриденштейн А.Я. Остеогенные потенции длительных диплоидных культур клеток костного мозга. //Бюлл. экспер. биол. 1970. Т.9. С.78-80.

13. Панасюк А.Ф., Лурия, Е.А., Фриденштейн А.Я., Кулагина Н.Н, Герасимов Ю.В. Культуры фибробластоподобных клеток костного мозга человека. //Пробл. гематол. 1972. Т.17. №8. С.34-39.

14. Петракова К.В., Толмачева А. А., Фриденштейн А.Я. Костеобразование, возникающее при трансплантации костного мозга в диффузионных камерах. // Бюлл. экспер. биол. 1963. Т.56. С.87-91.

15. Полежаев Л.В. Регенерация путем индукции. // Студитский А.Н., Лиознер Л.Д. (редакторы) Регуляторные механизмы регенерации. М.: Медицина, 1973. С. 15-28.

16. Полежаев Л.В. Утрата и восстановление регенерационной способности органов и тканей у животных. Москва, 1968.

17. Ржанинова А.А., Горностаева С.Н., Гольдштейн Д.В. Получение и фенотипическая характеристика мезенхимальных стволовых клеток из тимуса плодов человека. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005. №1. С.34-41.

18. Студитский А.Н. Закономерности восстановления костей у высших позвоночных животных. // Вопросы восстановления органов и тканей позвоночных животных. Труды Института морфологии животных АН СССР. -Москва, 1954. Вып. 11. С. 138.

19. Студитский А.Н. Тканевые взаимодействия при регенерации и трансплантации костей и мышц. // Студитский А.Н., Лиознер Л.Д.редакторы) Регуляторные механизмы регенерации. М.: Медицина, 1973. С.58-65.

20. Фриденштейн А.Я. Гистогенетические механизмы индуцированного остеогенеза. // Пластические и восстановительные процессы. Труды второй гистологической конференции. Москва, 1959. С.263-269.

21. Фриденштейн А.Я. Клонирование стромальных клеток-предшественников. // Методы культивирования клеток. JL, 1988. С.257-265.

22. Фриденштейн А.Я. // АН СССР. Сборник докладов на симпозиуме: «Клеточная дифференцировка и индукционные механизмы». Москва, 1965. С. 127-132.

23. Фриденштейн А.Я., Кеилис-Борок И.В., Раевская М.В. Свойства костной ткани, индуцированной переходным эпителием. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1982. Т.94. №12. С.87-89.

24. Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеоегенные клетки предшественники. М.: Медицина, 1973.

25. Фриденштейн А.Я, Лалыкина К.С. Особенности индукционных свойств переходного эпителия крыс после трансплантации. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1963. Т.55. С. 104-107.

26. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. Москва, 1980.

27. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В. Пролиферативные и дифференцировочные потенции скелетогенных костномозговых колониеобразующих клеток. // Цитология. 1986. Т.28. №3. С.341-349.

28. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворной ткани морских свинок. //Цитология. 1970. Т.12. №9. С.1147-1155.

29. Хилькин A.M., Шехтер А.Б., Истранов Л.П., Леменев В.Л. Коллаген и его применение в медицине. М.: Медицина, 1976. - 210 с.

30. Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С. Спонтанная и индуцированная дифференцировка костной ткани в популяции фибробластоподобных клеток, полученных из длительных монослойных культур костного мозга и селезенки. // Доклады АН СССР. 1969. Т. 187. №2. С.473-479.

31. Agrawal С.М., Ray R.B. Biodegradable polymeric scaffolds for musculoskeletal tissue engineering. // J. Biomed. Mater. Res. 2001. V.55. P. 141150.

32. Anderson C.E., Parker J. Invasion and resorption in endochondral ossification. // J. Bone Joint Surg. 1966. V.48A. P.899-914.

33. Andrew J.G., Hoyland J., Freemont A.J., Marsh D.R. Insulinlike growth factor gene expression in human fracture callus. // Calcif. Tissue Int. 1993. V.53. P.97-102.

34. Andrew J.G., Hoyland J.A., Freemont A.J., Marsh D.R. Platelet-derived growth factor expression in normally healing human fractures. // Bone. 1995. V.16. P.455-460.

35. Ashton B.A., Allen J.D., Howlatt C.R., Eagelsom C.D., Owen M., Hattori A. Formation of bone and cartilage by marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo. // Clin Orthop. Relat. Res. 1980. V.151. P.294-314.

36. Badrul A.H., Aminuddin B.S., Sharaf I., Samsudin O.C., Munirah S., Ruszymah B.H. The effects of autologous human serum on the growth of tissue engineered human articular cartilage. // Med J Malaysia. 2004. V.59. Suppl B. P.11-12.

37. Вак В., Jorgensen Р.Н., Andreassen Т.Т. Dose response of growth hormone on fracture healing in the rat. // Acta Orthop. Scand. 1990. V.61. P.54-57.

38. Beresford J.N. Osteogenic stem cells and the stomal system of bone and marrow. // Clin. Orthop. Rel. Res. 1989. V.240. P.270-280.

39. Bolander M.E. Regulation of fracture repair by growth factors. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1992. V.200. P.165-170.

40. Bourque W.T., Gross M., Hall B.K. Expression of four growth factors during fracture repair. // Int. J. Dev. Biol. 1993. V.37. P.573-579.

41. Boyde A., Corsi A., Quarto R., Cancedda R., Bianco P. Osteoconduction in large macroporous hydroxyapatite ceramic implants: evidence for a complementary integration and disintegration mechanism. // Bone. 1999. V.24. P.579-589.

42. Breitbart A.S., Grande D.A., Kessler R., Ryaby J.T., Fitzsimmons R.J., Grant R.T. Tissue engineered bone repair of calvarial defects using cultured periosteal cells. // Plast. Reconstr. Surg. 1998. V.101. №3. P.567-574.

43. Bruder S.P., Gazit D., Passi-Even L., Bab I., Caplan A.I. Osteochondral differentiation and the emergence of stage-specific osteogenic cell-surfacemolecules by bone marrow cells in diffusion chambers. // Bone Min. 1990. V.l 1. P.141-151.

44. Bruder S.P., Kraus K.H., Goldberg V.M., Kadiyala S. The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. // J. Bone Joint Surg. Am. 1998. V.80. №7. P.985-996.

45. Bruder S.P., Kurth A.A., Shea M., Hayes W.C., Jaiswal N., Kadiyala S. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells. //J. Orthop. Res. 1998. V.16. №2. P.155-162.

46. Burchardt H. Biology of bone transplantation. // Orthop. Clin. North. Am. 1987. V.18. №2. P.187-196.

47. Canalis E., Centrella M., McCarthy T. Effects of basic fibroblast growth factor on bone formation in vitro. // J. Clin. Invest. 1988. V.81. P.1572-1577.

48. Canalis E., McCarthy T.L., Centrella M. Effects of platelet-derived growth factor on bone formation in vitro. // J. Cell Physiol. 1989. V.140. P.530-537.

49. Cancedda R., Descalzi-Cancedda F., Castagnola P. Chondrocyte differentiation. // Int. Rev. Cytol. 1995. V.159. P.265-358.

50. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells. // J. Orthoped. Res. 1991. V.9. P.641-650.

51. Caplan A.I. Osteogenesis imperfecta, rehabilitation medicine, fundamental research and mesenchymal stem cells. // Connect. Tissue Res. 1995. V.31. №4. P.S9-14.

52. Caplan A.I., Elyaderani M., Mochizuki Y., Walcitani S., Goldberg V.M. Principes of cartilage repair and regeneration. // Clin. Orthop. 1997. V.342. P.254-269.

53. Carpenter J.E., Hipp J.A., Gerhart T.N., Rudman C.G., Hayes W.C., Trippel S.B. Failure of growth hormone to alter the biomechanics of fracture-healing in a rabbit model. // J. Bone Joint Surg. Am. 1992. V.74. P.359-367.

54. Cascone M.G., Sim B. and Downes S. Blends of synthetic and natural polymers as drug delivery systems for growth hormone. // Biomaterials. 1995. V.16. №7. P.569-574.

55. Castro-Malaspina H., Gay R.E., Resnik G. et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. // Blood. 1980. V.56. P.289-301.

56. Chang J.K., Cho M.H., Wang G.J., Ho M.L. Pre-cultivation in suspensionobtained chondrocyte-enriched cultures from articular-epiphyseal cartilage in fetal rats. // Kaohsiung J Med Sci. 2002. V.18. №3. P. 106-112.

57. Chen J., Wang C., Lu S., Wu J., Guo X., Duan C., Dong L., Song Y., Zhang J., Jing D., Wu L., Ding J., Li D. In vivo chondrogenesis of adult bone-marrow-derived autologous mesenchymal stem cells. // Cell Tissue Res. 2005. V.319. №3. P.429-438.

58. Chen X., Kidder L.S., Schmidt A.H., Lew W.D. Osteogenic protein-1 induces bone formation in the presence of bacterial infection in a rat intramuscular osteoinduction model. // J. Orthop. Trauma. 2004. V.18. №7. P.436-442.

59. Cheng L., Qasba P., Vanguri P., Thiede M.A. Human mesenchymal stem cells support megakaryocyte and pro-platelet formation from CD34+ hematopoetic progenitor cells. // J. Cell. Physiol. 2000. V.184. P.58-69.

60. Colnot C., Lu C., Hu D., Helms J.A. Distinguishing the contributions of the periostium, cartilage, and vascular endothelium to skeletal development. // Developmental Biology. 2004. V.269. P.55-69.

61. Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M., Prockop D.J. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic adherent cells from human bone marrow. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V.97. P.3213-3218.

62. Connolly J.F. Injectable bone marrow preparations to stimulate osteogenic repair. // Clin. Orthop. Relat. Res. 1995. V.313. P.8-18.

63. Cook J.L., Williams N., Kreeger J.M., Peacock J.T., Tomlinson J.L. Biocompatibility of three-dimensional chondrocyte grafts in large tibial defects of rabbits. // Am. J. Vet. Res. 2003. V.64. №1. P.12-20.

64. Crelin E.S., Koch W.E. An autoradiographic study of chondrocyte transformation into chondroclasts and osteocytes during bone formation in vitro. // Anat. Rec. 1967. Y.158. P.473-484.

65. Danis A. Apres une greffe de tissu squelettique osteogene, est a partir des cellules tranplantees que se constitue l'os denouvelle formation. // Bull. Soc. Int. Chirgurie. 1960. V.6. P.647-652.

66. De Kok I.J., Peter S.J., Archambault M., van den Bos C., Kadiyala S., Aukhil I., Cooper L.F. Investigation of allogeneic mesenchymal stem cell-based alveolar bone formation: preliminary findings. // Clin. Oral Implants Res. 2003. V.14. №4. P.481-489.

67. Deasy B.M., Qu-Peterson Z., Greenberger J.S. et al. Mechanisms of muscle stem cell expansion with cytokines. // Stem Cells. 2002. V.20. P.50-60.

68. Dennis J.E., Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma. // Stem Cells. 2002. V.20. P.205.

69. Dragoo J.L., Lieberman J.R., Lee R.S., Deugarte D.A., Lee Y., Zuk P.A., Hedrick M.H., Benhaim P. Tissue-engineered bone from ВМР-2-transduced stem cells derived from human fat. // Plast. Reconstr. Surg. 2005. V.115. №6. P. 16651673.

70. Eames B.F., Helms J.A. Conserved molecular program regulating cranial and appendicular slceletogenesis. // Developmental Dynamics. 2004. V.231. P.4-13.

71. Farnum C.E., Turgai J., Wilsmann J.N. Visualization of living hypertrophic chondrocytes of growth plate cartilage in situ by differential interference contrast microscopy and time lapse cinematography. // J. Orthop. Res. 1990. V.8. P.750-763.

72. Ferretti C., Ripamonti U. Human segmental mandibular defects treated with naturally derived bone morphogenetic proteins. // J. Craniofac. Surg. 2002. V.13. №3. P.434-444.

73. Fialkov J.A., Holy C.E., Shoichet M.S., Davies J.E. In vivo bone engineering in a rabbit femur. // The Journal of Craniofacial Surgery. 2003. V.14. №3. P.324-332.

74. Ford J.L., Robinson D.E., Scammell B.E. Endochondral ossification in fracture callus during repair: the localization of "cavity-lining cells" within the cartilage. // Journal of Orthopaedic Research. 2004. V.22. P.368-375.

75. Fridenstein A.J. Precursor cells of mechanocytes. // Int. Rev. Cytol. 1976. V.47. P.327-355.

76. Fridenstein A.J. et al. Marrow microenviroment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. // Exp. Hematol. 1982. V.10. P.217-227.

77. Fridenstein A., Chailakhyan R.K. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea pig bone marrow and spleen cells. // Cell Tissue Kinet. 1970. V.3. P.393-403.

78. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Gerasimov U.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. // Cell Tissue Kinet. 1987. V.20. №3. P.263-272.

79. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. // Exp. Hematol. 1976. V.4. P.267-274.

80. Friedenstein A.J., Petrakova K.V., Kurolesova A.I., Frolova G.P. Heterotopic of bone marrow.Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. // Transplantation. 1968. V.6. №2. P.230-247.

81. Fridenstein A.J., Piatetzky-Shapiro I.I. et al. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. //J. Embryol. Exp. Morphol. 1966. V.16. P.381-390.

82. Fuchs J.R., Terada S., Ochoa E.R., Vacanti J.P., Fauza D.O. Fetal tissue engineering: in utero tracheal augmentation in an ovine model. // J Pediatr Surg. 2002. V.37. №7. P.1000-1006.

83. Gao J., Dennis J.E., Solchaga L.A., Awadallah A.S., Goldberg V.M., Caplan A.I. Tissue-engineered fabrication of an osteochondral composite graft using rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells. // Tissue engineering 2001. V.7.№4. P.363-371.

84. Goldberg V.M., Stevenson S. The biology of bone grafts. // Semin. Arthroplasty. 1996. V.7. P. 12-17.

85. Goshima J., Goldberg V.M., Caplan A.I. The origin of bone formed in composite grafts of porous calcium phosphate ceramic loaded with marrow cells. // Clin. Orthop. 1991. V.269. P.274-283.

86. Goujon E. Recherches experimentales sur les proprietes physiologiques de la moelle des os. // J. L'Anat. Physiol. 1869. V.6. P.399^112.

87. Gronthos S., Simmons P.J. The growth factor requirements of STRO-1 positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro. // Blood. 1995. V.85. P.929-940.

88. Guo J., Jourdan G.W., MacCallum D.K. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads. // Conn. Tiss. Res. 1989. V.19. P.277-297.

89. Guo X., Wang C., Duan C., Descamps M., Zhao Q., Dong L., Lu S., Anselme K., Lu J., Song Y.Q. Repair of osteochondral defects with autologous chondrocytes seeded onto bioceramic scaffold in sheep. // Tissue Eng. 2004. V.10. №11-12. P.1830-1840.

90. Haid R.W. Jr., Branch C.L. Jr., Alexander J.T., Burkus J.K. Posterior lumbar interbody fusion using recombinant human bone morphogenetic protein type 2 with cylindrical interbody cages. // Spine J. 2004. V.4. №5. P.527-538.

91. Harvey W.K., Pincock J.L., Matulcas V.J., Lemons J.E. Evaluation of a subcutaneously implanted hydroxylapatite-avitene mixture in rabbits. // J. Oral. Maxillofac. Surg. 1985. V.43. №4. P.277-280.

92. Hench L.L. Bioceramics: from concept to clinic. // J. Am. Ceram. Soc. 1991. V.74. P. 1487-1510.

93. Hidvegi M., Raso E., Farkas R.T., Lapis K., Szende B. Effect of MSC on the immune response of mice. // Immunopharmacology. 1999. V.41. P. 183-186.

94. Hoemann C.D., Sun J., Legare A., McKee M.D., Buschmann M.D. Tissue engineering of cartilage using an injectable and adhesive chitosan-based cell-delivery vehicle. // Osteoarthritis Cartilage. 2005. V.13. №4. P.318-329.

95. Holtrop M.E. The ultrastructure of the epiphyseal plate II. The hypertrophic chondrocyte. // Calcif. Tissue Res. 1972. V.9. P.140-151.

96. Honorati M.C., Cattini L., Facchini A. IL-17, IL-lbeta and TNF-alpha stimulate VEGF production by dedifferentiated chondrocytes. // Osteoarthritis Cartilage. 2004. V.12. №9. P.683-691.

97. Horwitz E.M., Prockop D.J., Fitzpatrick L.A., Koo W.W.K.,Gordon P.L., Neel M., et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. // Nat. Med. 1999. V.5. P.309-313.

98. Howlett C.R. The fine structure of the proximal growth plate and metaphysis of the avian tibia: endochondral osteogenesis. // J. Anat. 1980. V.130. P.745-768.

99. Hu D.N., Yang P.Y., Ки М.С., Chu С.Н., Lim A.Y., Hwang M.H. Isolation and cultivation of human articular chondrocytes. // Kaohsiung J Med Sci.2002. V.18. №3. P. 113-120.

100. Huang C.Y., Hagar K.L., Frost L.E., Sun Y., Cheung H.S. Effects of cyclic compressive loading on chondrogenesis of rabbit bone-marrow derived mesenchymal stem cells. // Stem Cells. 2004. V.22. №3. P.313-323.

101. Huang C.Y., Reuben P.M., D'Ippolito G., Schiller P.C., Cheung H.S. Chondrogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in agarose culture. // Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 2004. V.278. №1. P.428-436.

102. Huang J.I., Zuk P.A., Jones N.F., Zhu M., Lorenz H.P., Hedrick M.H., Benhaim P. Chondrogenic potential of multipotential cells from human adipose tissue. // Plast. Reconstr. Surg. 2004. V.113. №2. P.585-594.

103. Huch K., Stove J., Puhl W., Gunther K.P. Review and comparison of culture-techniques for articular chondrocytes. // Z Orthop Ihre Grenzgeb. 2002. V.140. №2. P.145-152.

104. Huggins C. // Arch. Surg. 1931. V.22. P.377.

105. Hupp J.R., Me Kenna S.J. Use of porose hydroxyapatite blocks for augmentation of atrophic mandibles. // J. Oral maxillofax. surg. 1988. V.46. №7. P.538-545.

106. Hutmacher D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. // Biomaterials. 2000. V.21. P.2529-2543.

107. Ishikawa F., Livingston A.G., Minamiguchi H., Wingard J.R., Ogawa M. Human cord blood long-term engrafting cells are CD34+ CD38-. // Leukemia.2003. V.17. №5. P.960-964.

108. Iyoda K., Miura Т., Nogami H. Repair of bone defect with cultured chondrocytes bound to hydroxyapatite. // Clin. Orthop. Relat. Res. 1993. V.288 P.287-293.

109. Jarcho M. Retrospective analysis of hydroxyapatite development for oral implant applications. // Dent. Clin. North. Am. 1992. V.36. №1. P. 19-26.

110. Jiang Y., Vaessen В., Lenvik Т., Blaclcstad M., Reyes M., Verfaillie C.M. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. // Exp. Hematol. 2002. V.30. P.896-904.

111. Jingushi S., Heydemann A., Kana S.K., Macey L.R., Bolander M.E. Acidic fibroblast growth factor (aFGF) injection stimulates cartilage enlargement and inhibits cartilage gene expression in rat fracture healing. // J. Orthop. Res. 1990. V.8. P.364-371.

112. Jogensen C., Djouad F., Fritz V., Apparailly F., Plence P., Noel D. Mesenchymal stem cells and rheumatoid arthritis. // Joint Bone Spine. 2003. V.70. P.483-485.

113. Jorgensen C., Djouad F., Apparailly F., Noel D. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy. // Gene Therapy. 2003. V.10. P.928-931.

114. Joyce M.E., Jingushi S., Bolander M.E. Transforming growth factor-beta in the regulation of fracture repair. // Orthop. Clin. North. Am. 1990. V.21. P. 199209.

115. Kadiyala S., Jaiswal N., Bruder S.P. Culture-expanded, bone marrow derived mesenchymal stem cells can regenerate a critical-sized segmental bone defect. // Tissue Eng. 1997. V.3. P. 173-185.

116. Kadiyala S., Young R.G., Thiede M.A., Bruder S.P. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. // Cell Transplant. 1997. V.6. №2. P.125-134.

117. Kahn A.J., Simmons D.J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium free epiphyseal cartilage. // Clin. Orthop. Rel. Res. 1977. V.129. P.299-304.

118. Kim H.W., Knowles J.C., Kim H.E. Hydroxyapatite porous scaffold engineered with biological polymer hybrid coating for antibiotic Vancomycin release. // J. Mater. Sci. Mater. Med. 2005. V.16. №3. P.189-195.

119. Kino-Oka M., Yashiki S., Ota Y., Mushialci Y., Sugawara K., Yamamoto Т., Takezawa Т., Taya M. Subculture of chondrocytes on a collagen type I-coated substrate with suppressed cellular dedifferentiation. // Tissue Eng. 2005. V.ll. №3-4. P.597-608.

120. Коп E., Muraglia A., Corsi A. et al. Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones. // J. Biomed. Mater. Res. 2000. V.49. P.328-337.

121. Kotobuki N., Ioku K., Kawagoe D., Fujimori H., Goto S., Ohgushi H. Observation of osteogenic differentiation cascade of living mesenchymal stem cells on transparent hydroxyapatite ceramics. // Biomaterials. 2005 V.26. №7. P.779-85.

122. Kuhls R., Werner-Rustner M., Kuchler I., Soost F. Human demineralised bone matrix as a bone substitute for reconstruction of cystic defects of the lower jaw. // Cell Tissue Bank. 2001. V.2. №3. P.143-153.

123. Le Blanc K., Tammik C., Rosendahl K., Zetterberg E., Ringde'n O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. // Experimental Hematology. 2003. V.31. P.890-896.

124. Le Blanc K., Tammik L., Sundberg B. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of major histocompatibility complex. // Scandinavian Journal of Immunology. 2003. V.57.P.11-20.

125. Lee D.A., Reisler Т., Bader D.L. Expansion of chondrocytes for tissue engineering in alginate beads enhances chondrocyte phenotype compared toconventional monolayer techniques. // Acta. Orthop. Scand. 2003. V.74. №1. P.6-15.

126. Lieberman J.R., Daluiski A., Einhorn T.A. The role of growth factors in the repair of bone. Biology and clinical applications. // Bone and Joint Surgery. 2002. V.84-A. №6. P. 1032-1044.

127. Linkhart T.A., Mohan S., Baylink D.J. Growth factors for bone growth and repair: IGF, TGF beta and BMP. // Bone. 1996. V.19. №1 Suppl. P.1S-12S.

128. Louis-Ugbo J., Murakami H., Kim H.S., Minamide A., Boden S.D. Evidence of osteoinduction by Grafton demineralized bone matrix in nonhuman primate spinal fusion. // Spine. 2004. V.29. №4. P.360-366.

129. Louisia S., Stromboni M., Meunier A., Sedel L., Petite H. Coral grafting supplemented with bone marrow. // J. Bone Joint Surg. Br. 1999. V.81. P.719-724.

130. Lufti A.M. The fate of chondrocytes during cartilage erosion in the growing tibia in the domestic fowl. // Acta. Anat. 1971. V.19. P.27-35.

131. Ma P.X., Zhang R., Xiao G., Franceschi R. Engineering new bone tissue in vitro on highly porous poly(alphahydroxyl acids)/hydroxyapatite composite scaffolds. //J. Biomed. Mater. Res. 2001. V.54. P.284-293.

132. Majumdar M.K., Thiede M.A. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow derived mesenchymal stem cells and stromal cells. // J. Cell. Physiol. 1998. V.176. P.57-66.

133. Manjubala I., Sastry T.P., Kumar R.V. Bone in-growth induced by biphasic calcium phosphate ceramic in femoral defect of dogs. // J. Biomater. Appl. 2005. V.19. №4. P.341-360.

134. Mark von der K. Differentiation, modulation, and dedifferentiation of chondrocytes. //Rheumatology. 1986. V.10. P.272-315.

135. Marlovits S., Tichy В., Truppe M., Gruber D., Vecsei V. Chondrogenesis of aged human articular cartilage in a scaffold-free bioreactor. // Tissue Eng. 2003. V.9. №6. P.1215-1226.

136. Martin I., Muragila A. et al. Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. // Endocrinology. 1997. V.138. P.4456-4462.

137. Maximov A.A. // Beitr. Pathol. Anat. 1907. V.41. P. 122.

138. Mehlisch D.R. Collagen/hydroxylapatite implant for augmenting deficient alveolar ridges: a 24-month clinical and histologic summary. // Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. 1989. V.68. P.505-514.

139. Metcalf D. The molecular control of cell division, differentiation commitment and maturation in haemopoietic cells. // Nature. 1989. V.339(6219). P.27-30.

140. Mizuno S., Glowacki J. Chondroinduction of human dermal fibroblasts by demineralizated bone in three-dimensional culture. // Exp. Cell. Res. 1996. V.227. P.89-97.

141. Moskalewski S., Malejczyk J. Bone formation following intrarenal transplantation of isolated murine chondrocytes: chondrocytes-bone cell transdifferentiation. //Development. 1989. V.107. P.473-480.

142. Nah H.D., Pacifici M., Gerstenfeld L.C., Adams S.L., Kirsch T. Transient chondrogenic phase in the intramembranous pathway during normal skeletal development. // J Bone Miner. Res. 2000. V.15. №3. P.522-533.

143. Nash T.J., Howlett C.R., Martin C., Steele J., Johnson K.A., Hicklin D.J. Effect of platelet-derived growth factor on tibial osteotomies in rabbits. // Bone. 1994. V.5. P.203-208.

144. Niemeyer P., Seckinger A., Simank H.G., Kasten P., Sudkamp N., Krause U. Allogenic transplantation of human mesenchymal stem cells for tissue engineering purposes: an in vitro study. // Orthopade. 2004. V.33. №12. P.1346-1353.

145. Noda M., Camilliere J.J. In vivo stimulation of bone formation by transforming growth factor-beta. // Endocrinology. 1989. V.124. P.2991-2994.

146. Noth U., Osyczka A.M., Tuli R., Hickok N.J., Danielson K.G., Tuan R.S. Multilineage mesenchymal differentiation potential of human trabecular bone-derived cells. // J. Orthop. Res. 2002. V.20. P.l060-1069.

147. Nutall M.E., Patton A.J. Olivera D.L. Human trabecular bone cells are able to express both osteoblastic and adipocytic phenotypes: implications for osteogenic disorders. // J. Bone Miner.Res. 1998. V.13. P.371-382.

148. Ortega N., Behonick D.J., Werb Z. Matrix remodeling during endochondral ossification. // Trends in Cell Biology. 2004. V.14. №2. P.86-93.

149. Owen M.E., Cave J., Joyner C.J. Clonal analysis in vitro of osteogenic differentiation of marrow CFU-F. // J. Cell Science. 1987. V.87. P.731-738.

150. Perka С., Schultz О., Lindenhayn К., Spitzer R.S., Muschik M., Sittinger M., Burmester G.R. // Joint cartilage repair with transplantation of embryonic chondrocytes embedded in collagen-fibrin matrices. Clin. Exp. Rheumatol. 2000. V.18. №1. P.13-22.

151. Peterson В., Zhang J., Iglesias R., Kabo M., Hedrick M., Benhaim P., Lieberman J.R. Healing of critically sized femoral defects, using genetically modified mesenchymal stem cells from human adipose tissue. // Tissue Eng. 2005. V.l 1. №1-2. P.120-129.

152. Petite H., Viateau V., Bensaid W., Meunier A., de Pollak C., Bourguignon M., Oudina K., Sedel L., Guillemin G. Tissue-engineered bone regeneration. //Nat. Biotechnol. 2000. V.18. №9. P.959-963.

153. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. // Science. 1999. V.284. P. 143-147.

154. Pittenger M.F., Martin B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. // Circ. Res. 2004. V.95. №1. P.9-20.

155. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for non hematopoetic tissues. // Science. 1997. V.276. P.71-74.

156. Qi H., Aguiar D.J., Williams S.M., Verfaillie C.M. et al. Identification of genes responsible for osteoblast differentiation from human mesodermal progenitor cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V.100. №6. P.3305-3310.

157. Quarto R., Mastrogiacomo M., Cancedda R., Kutepov S. M., Mukhachev V., Lavroukov A., Коп E., Marcacci M. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells. // N. Engl. J. Med. 2001. V.344. P.385-386.

158. Radomsky M.L., Aufdemorte T.B., Swain L.D., Fox W.C., Spiro R.C., Poser J.W. Novel formulation of fibroblast growth factor-2 in a hyaluronan gel accelerates fracture healing in nonhuman primates. // J. Orthop. Res. 1999. V.17. P.607-614.

159. Radomsky M.L., Thompson A.Y., Spiro R.C., Poser J.W. Potential role of fibroblast growth factor in enhancement of fracture healing. // Clin Orthop. 1998. V.355. Suppl. P.S283-S293.

160. Ramadori G., Saile B. Mesenchymal cells in the liver—one cell type or two? // Liver. 2002. V.22. №4. P.283-294.

161. Reddi A.H. Implant-stimulated interface reactions during collagenous bone matrix-induced bone formation. // J. Biomed. Mater. Res. 1985. V.19. №3. P.233-239.

162. Reddi A.H. Regulation of cartilage and bone differentiation by bone morphogenetic proteins. // Curr. Opin. Cell Biol. 1992. V.4. P.850-855.

163. Reyes M., Lund F., Lenvik Т., Aguiar D., Koodie L., Verfaillie C.M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. // Blood. 2001. V.98. P.2615-2625.

164. Roach H.I., Erenpreisa J., Aigner T. Osteogenic differentiation of hypertrophic chondrocytes involves asymmetric cell divisions and apoptosis. // The Journal of Cell Biology. 1995. V. 131. №2. P.483-494.

165. Robey P.G., Young M.F., Flanders K.C., Roche N.S., Kondaiah P., Reddi A.H., Termine J.D., Sporn M.B., Roberts A.B. Osteoblasts synthesize and respond to transforming growth factor-type beta (TGF-beta) in vitro. // J. Cell Biol. 1987. V.105. P.457-463.

166. Rodan S.B., Wesolowski G., Thomas K., Rodan G.A. Growth stimulation of rat calvaria osteoblastic cells by acidic fibroblast growth factor. // Endocrinology. 1987. V.121. P.1917-1923.

167. Rose Felicity R.A. J., Oreffo Richard O.C. Bone tissue engineering: hope vs hype. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2002. V.292. P. 1-7.

168. Rosier R.N., O'Keefe R.J., Hicks D.G. The potential role of transforming growth factor beta in fracture healing. // Clin. Orthop. 1998. V.355. Suppl. P.S294-S300.

169. Saadeh P.B., Khosla R.K., Mehrara B.J., Steinbrech D.S., McCormick S.A., DeVore D.P., Longaker M.T. Repair of a critical size defect in the rat mandible using allogenic type I collagen. // J. Craniofac. Surg. 2001. V.12. №6. P.573-579.

170. Sakaguchi Y., Sekiya I., Yagishita K., Muneta T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. //Arthritis Rheum. 2005. V.52. №8. P.2521-2529.

171. Schimandle J.H., Boden S.D., Hutton W.C. Experimental spinal fusion with recombinant human bone morphogenetic protein-2. // Spine. 1995. V.20. P.1326-1337.

172. Schmitt J.M., Hwang K., Winn S.R., Hollinger J.O. Bone morphogenetic proteins: an update on basic biology and clinical relevance. // J. Orthop. Res. 1999. V.17. P.269-278.

173. Schor A.M., Canfield A.E. Osteogenic potential of vascular pericytes. // Beresford J.N. et al. (editors). Marrow Stromal Cell Culture. Cambridge: Cambridge University Press. - P.128-148.

174. Sciadini M.F., Johnson K.D. Evaluation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 as a bone-graft substitute in a canine segmental defect model. // J. Orthop. Res. 2000. V.18. P.289-302.

175. Shimomura Y., Yoneda Т., Suzuki F. Osteogenesis by chondrocytes from growth cartilage of rat rib. // Calcif. Tissue Res. 1975. V.19. P.179-187.

176. Silva R.V., Camilli J.A., Bertran C.A., Moreira N.H. The use of hydroxyapatite and autogenous cancellous bone grafts to repair bone defects in rats. // Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 2005. V.34. №2. P. 178-184.

177. Sottile V., Halleux C., Bassilana F., Keller H., Seuwen K. Stem cell characteristics of human trabecular bone-derived cells. // Bone. 2002. V.30. P.699-704.

178. Sweeney T.M., Opperman L.A., Persing J.A., Ogle R.C. Repair of critical size rat calvarial defects using extracellular matrix protein gels. // J. Neurosurg. 1995. V.83. №4. P.710-715.

179. Tallheden Т., Bengtsson C., Brantsing C., Sjogren-Jansson E., Carlsson L., Peterson L., Brittberg M., Lindahl A. Proliferation and differentiation potential of chondrocytes from osteoarthritic patients. //Arthritis Res. Ther. 2005. V.7. №3. P.560-568.

180. Tallheden Т., Dennis J.E., Lennon D.P. Phenotypic plasticity of human articular chondrocytes. // J. Bone Joint Surg. 2003. V.85-A. Suppl. 2. P.93-100.

181. Tanaka Т., Komaki H., Chazono M., Fujii K. Use of a biphasic graft constructed with chondrocytes overlying a beta-tricalcium phosphate block in the treatment of rabbit osteochondral defects. // Tissue Eng. 2005. V.l 1. №1-2. P.331-339.

182. Tavasolli M., Crosby W.H. Transplantation of marrow to extramedullary sites. // Science. 1968. V.161. P.548-556.

183. Thaller S.R., Dart A., Tesluk H. The effects of insulin-like growth factor-1 on critical-size calvarial defects in Sprague-Dawley rats. // Ann. Plast. Surg. 1993. V.31.P.429-433.

184. Thesingh C.W., Grout C.G., Wassenaar A.M. Transdifferentiation of hypertrophic chondrocytes in murine metatarsal bones, induced by cocultured cerebrum. //Bone Min. 1991. V.l2. P.25-40.

185. Thiede M.A., Pittenger M.F., Mbalaviele G. In vitro maintenance of hematopoetic stem cells. //U.S. Patent. 2000. №6,030,836.

186. Thirion S., Berenbaum F. Culture and phenotyping of chondrocytes in primary culture. // Methods Mol. Med. 2004. V.100. P. 1-14.

187. Tiedeman J.J., Garvin K.L., Kile T.A., Connolly J.F. The role of a composite, demineralized bone matrix and bone marrow in the treatment of osseous defects. //Orthopedics. 1995. V.18. №12. P.l 153-1158.

188. Trippel S.B. Growth factors as therapeutic agents. // Instr. Course Lect. 1997. V.46. P.473-476.

189. Trippel S.B. Potential role of insulinlike growth factors in fracture healing. // Clin. Orthop. 1998. V.355. Suppl. P.S301-S313.

190. Trippel S.B., Rosenfeld R.G. Growth factor treatment of disorders of skeletal growth. //Instr. Course Lect. 1997. V.46. P.477-482.

191. Tsuchida H., Hashimoto J., Crawford E., Manske P., Lou J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. // J. Orthop. Res. 2003. V.21. №1. P.44-53.

192. Tuli R., Seghatoleslami M.R., Tuli S., Wang M.L., Hozack W.J., Manner P.A., Danielson K.G., Tuan R.S. A simple, high-yield method for obtaining multipotential mesenchymal progenitor cells from trabecular bone. // Mol. Biotechnol. 2003. V.23. P.37-49.

193. Urist M.R. Bone: formation by autoinduction. // Science. 1965. V.150. P.893-899.

194. Urist M.R. Bone Transplants and Implants. // Urist M.R. (editor). Fundamental and Clinical Bone Physiology. Philadelphia: JB Lippincott, 1980. -P.331-368.

195. Urist M.R., McLean F.C. Osteogenic potence and new bone formation by induction in transplants to the anterior chamber of the eye. // J. Bone Joint Surg. Am. 1952.V.34. P.443-470.

196. Weiland A.J., Moore J.R., Daniel R.K. Vascularized bone autografts: experience with 41 cases. // Clin. Orthop. 1983. V.174. P.87-95.

197. Whittaker J.P., Smith G., Makwana N., Roberts S., Harrison P.E., Laing P., Richardson J.B. Early results of autologous chondrocyte implantation in the talus. // J. Bone Joint Surg. Br. 2005. V.87. №2. P.179-183.

198. Wiles M.V., Keller G. Multiple hematopoietic lineages develop from embryonic stem (ES) cells in culture. // Development. 1991. V.lll. №2. P.259-267.

199. Wolbach S.B., Hegsted D. Endochondral bone growth in the chick. // Arch. Path. 1952. V.54. P. 1-12.

200. Yoo J.U., Johnstone B. The role of osteochondral progenitor cells in fracture repair. // Clin. Orthop. 1998. V.355. Suppl. P.73-81.

201. Yukya R.A., Cassingham R.J., Candill R.F. et al. Six month evalution of Calcitite (hydroxyapatite ceramic) in periodontal osseous defects. // J. Periodont. Restorative Dent. 1986. V.6. P.35-46.

202. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. //Mol. Biol. Cell. 2002. V.13. P.4279-4295.

203. Zuk P.A., Zhu M., Muzino et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. // Tissue Engineering. 2001. V.7. №2. P.211-228.

204. Плохинский H.A. Математические методы в биологии. М.: МГУ, -1978, - 226 с.