Миогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro и in vivo

Горностаева, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Миогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro и in vivo
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Миогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro и in vivo"

На правах рукописи

Горностаева Светлана Николаевна

МИОГЕННАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

И IN VIVO

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006 г.

Работа выполнена в НП Институте стволовой клетки и клеточных технологий, ГУ Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук Гольдштейн Дмитрий Вадимович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Болтовская Марина Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Ванько Людмила Викторовна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится «¿5» 2006 года в часов

на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01) ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. П^орупы, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека

РАМН

Автореферат разослан

2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Л.П. Михайлова

100 С A

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Интенсивное развитие клеточных технологий в течение последнего десятилетия вызвало возрастание интереса к клеточным трансплантациям в репаративной медицине, в том числе в кардиологии. Необходимым условием высокой эффективности клеточной терапии при сердечно-сосудистых заболеваниях является выбор клеточных типов, способных активно участвовать в репарации поврежденного миокарда. Несколькими группами исследователей показано, что трансплантированные в миокард фетальные кардиомиоциты формировали контакты с кардиомиоцитами реципиента и улучшали сократительную функцию сердца (Etzion et al; 2001; Li., 1996; Soonpaa, 1994). Однако технически сложно получить достаточное количество фетальных кардиомиоцитов для репарации поврежденного миокарда Применение скелетных миобластов уменьшает выраженность вентрикулярной дилятации и улучшает сократительную функцию сердца (Hughes, 2002; Ghostine, 2002). Недостаток этого метода в том, что трансплантированные рабдомиобласты не обладают автоматизмом и не образуют контакты в миокарде реципиента (Jian, 2001) Пересадка ядросодержащей фракции костного мозга, так же оказывала положительное влияние на миокард. Но, как выяснилось, этот эффект был связан не с гемопоэтическими. а со стромальными клетками костного мозга (Fukuda, Fujita, 2005).

Сравнительно с другими типами клеток, рассматриваемыми для кардиомиопластики, мультипотентные стромальные мезенхимальные клетки (ММСК), по-видимому, обладают уникальными свойствами, которые позволяют использовать их для высокоэффективной клеточной терапии. Способность ММСК к дифференцировкс в различные клеточные типы (Jiang, 2002; Prockop, 2003), а также возможность культивирования в качестве аутотрансплантата, делают клетки этого типа чрезвычайно перспективными для клеточной заместительной терапии.

настоящее время остается открытым ¿ой96с "д^йШАЛ-ШбЛе трансплантации

БИБЛИОТЕКА I С.Петер^ " 1 ОЭ М

пи I с

ТЛГ;

....... :

численно предифферснциропанных или недифференцированных клеток. Так же еше до конца не изучена способность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток дифференцироваться в клетки мышечного типа.

Большинство статей посвящено мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам взрослого организма (Reyes et al, 2001; Prockop et al, 2003; Shim et al, 2004) и очень мало известно о пренатальных ММСК В онтогенезе человека пролиферация и дифференцировка гемопоэтических стволовых\прогениторных клеток происходит в гистологически различном микроокружении. В костном мозге взрослою организма ММСК тесно связаны с гемопоэтическими клетками. Печень, селезенка, гимус и костный мозг - хорошо известные органы активного гемопоэза на разных стадиях в пренатальный период развития. ММСК из этих органов гемопоэза слабо изучены (Campagnoli et al, 2001; Inl Ancer et al, 2003), ММСК из тимуса человека в литературе не описаны Изучение поведения в культуре и особенностей дифференцировки пренатальных ММСК может способствовать пониманию онтогенеза этих клеток и открывает новые возможности для клеточной и генной терапии.

Цель и задачи исследования. Провести сравнительную характеристику мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из органов гемопоэза и иммуногенеза, исследовать их миогенный потенциал ex vivo и in vivo.

В соответствии с поставленной целью в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Отработка методики выделения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных костного мозга, печени, тимуса и селезенки;

2. Анализ иммунофенотипа выделенных культур методом проточной цитоф лу ориметр ии;

3 Оценка му>1ьтипотентности полученных культур (хондрогенез, остеогенез, адипогенез) с использованием селективных сред.

4 Оценка спонтанной миогенной дифференцировки.

5 Изучение индукции миогенной дифференцировки культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro.

6 Исследование поведения и дифференцировки выделенных культур у лабораторных животных с моделированным инфарктом миокарда.

Научная новизна работы. Данная работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проведена сравнительная характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных органов гемопоэза и иммуногенеза - тимуса, селезенки, костного мозга и печени Получены данные о их различии в экспрессии маркеров гистосовместимости I класса (МНС-I) и молекулы адгезии CD-54 (ICAM-I) Впервые выделены и охарактеризованы мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки тимуса человека.

Впервые показана способность к спонтанной дифференцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, тимуса и печени в скелетную и сердечную мышцу. Выявлены отличия в потентности к миогенной дифференцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из разных источников. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки селезенки, в отличие от мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, тимуса и печени такой способностью не обладали.

Научно-практическая значимость работы. Разработан протокол получения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток тимуса Показана перспективность применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток тимуса в качестве клеточного аллотрансплантата, благодаря его значительно меньшей, rio сравнению с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками из других источников иммуногенности, и высокой технологичности получения культуры.

Определены условия отбора клеючных популяций, предпочтительно дифференцирующихся в миобласты. Показано, что клонирование и отбор мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток позволяет избежать обработки культуры токсичным 5-азацитидином для предифференцировки в кардиомиогенном направлении перед трансплантацией клеток in vivo. Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Втором Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва. 2003), Конференции в РГМУ (Москва, 2003, 2004), VTII Ежегодной сессии НЦССХ им. АН Бакулева РАМН (Москва. 2004), I, II международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», (Москва, 2004, 2005), на

межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Москва, март 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 6 статей в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 147 страницах и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов собственных исследований и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 38 рисунками Указатель цитируемой литературы включает 157 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Выделение мезенхимальных клеток из тимуса, костного мозга, печени и селезенки

Для получения культуры ММСК тимуса, селезенки, печени и костного мозга человека использовали аутопсийный материал от 9-ти мертворожденных плодов 12-20 нед гестации после самопроизвольных прерываний беременности в соответствии с Договором о научно-практической деятельности. Получение стромальных клеток тимуса, селезенки, печени и костного мозга проводили по модифицированной методике Фриденштейна А.Я. (1974). Тканевые фрагменты тимуса, селезенки и печени дезагрегировали 0,2% раствором диспазы (Invitrogen Corp.) 20 минут при 37С. После дезагрегации суспензию центрифугировали 5 мин при 800 об/мин (~4вС), надосадочную жидкость удаляли. К осадку добавляли холодную среду DMEM с 1% фетальной телячьей сывороткой. Клеточную суспензию фильтровали через сито из нержавеющей стали и центрифугировали. Костный мозг вымывали из болынеберцовой кости 20 мл раствора Хенкса, содержащего гепарин и гентамицин. Полученную суспензию двухкратно отмывали центрифугированием (5 мин при 1000 об/мин) в растворе Хенкса с антибиогиком. Жизнеспособность мононуклеаров, оцениваемая по окраске трипановым синим, составляла 85-97%.

Клеточный осадок суспендировали в средс ДМЕМ (Invitrogen Corp.), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, отобранной для оптимального росла культур в низкой плотности (HyClone, Fetalclone I, Lot № AND18477), 2 mM L-глютамина и 10 мкг/мл гентамицина. Суспензию клеток рассевали на пластиковые чашки Петри

(Nunclon) диаметром 90 мм в концентрации 104 одноядерных клеток на 1 мл и инкубировали при 37°С в С02 -инкубаторе при 5% СО2. Через 24 часа неприкрепленные клетки удаляли, а прикрепившиеся клетки дважды промывали средой Хэнкса и инкубировали до конфлюентного монослоя в ростовой среде, дополнительно содержащей фактор роста фибробластов 10 нг\мл (Sigma), 8 ЕД\мл гепарина, 1% инсулин-трансферин-селенит («НПП ПанЭко»).

Подсчет колоний

Исследуемые клетки рассевали на пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм в плотности 30 кл/см2. Культуры инкубировали 10 дней, затем среду удаляли, чашки промывали фосфатно-солевым буфером (рН=7,0) и окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым "Реахим" в метаноле. Клетки дважды отмывали дистиллированной водой и считали количество колоний. Колонии диаметром менее 2 мм не учитывали.

Иммуноцитохимические исследования Клетки для анализа выращивали на стеклах, обработанных полилизином, фиксировали 4% формальдегидом 20 мин, отмывали и хранили до исследования в фосфатно-солевом буфере, рН=7 4. В работе использовали моноклональные антитела к MyoD, миогенину (Novocastra Lab Ltd), коллагену И, агтрекану (Sigma), миозину медленной склетной мышцы (Sigma-Aldrich), тропонину I (Abeam). Для визуализации первичных антител использовали Novostatin Super ABC Kit (Novocastra Lab Ltd) или козьи антимышиные антитела, коньюгированные с ФИТЦ или фикоэритрином (Biotrend) Окраску антителами проводили по протоколу фирмы Abeam.

Анализ иммунофенотипа Пробы для цитофлуориметрического исследования готовили по стандартной методике и анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Calibur ("BD Biosciences")- Использовали мышиные моноклональные антитела к CD90, CD44, CD 105, CD54 CD71 (BD Biosciences), HLA-DR, HLA-A,B,C CD34, CD45, CD38, CD4, производимые фирмами PharMingen и Chemicon. В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические мышиные, кроличьи IgG тех же фирм. Результаты обрабатывали с помощью программы WINMDI 2.8.

Функциональная характеристика Для оценки способности культур ММСК к остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировке использовали дифференцировочные среды, описанные

в литературе (Colter et al, 2000). Для выявления остеогенной дифференцировки культуры фиксировали в 70% этаноле и окрашивали спиртовым раствором ализаринового красного S, рН=4,1 (Sigma). Адипогенную дифференцировку выявляли по наличию фазоконтрастных включений в цитоплазме. Хондрогенную дифференцировку оценивали по окраске антителами, коньгированными с ФИТЦ к белкам, специфичным для хондробластов - коллагену II и аггрекану (Sigma).

Направленная кардиомиогенная дифференцировка ММСК 5-азацитидином Направленную дифференцировку ММСК костного мозга и селезенки в кардиомиобласты осуществляли добавлением деметилирующего агента 5-азацитидина Клетки рассевали в плотности 10000 клеток на чашку диаметром 90мм (п=60). 5-азацитидин добавляли в количестве 1/iM, 3fiM, 10fiM. Чтобы оценить ингибирование пролиферации, клетки снимали через 6 и 12 дней культивирования с добавлением 5-азацитидина, окрашивали 0,2% трипановым синим и подсчитывали в камере Горяева. Для оценки дифференцировки в кардиомиобласты клетки через 8 нед культивирования фиксировали 4% формальдегидом и окрашивали антителами на миозин медленной мышцы и тропонин I.

Моделирование инфаркта миокарда

Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики». Модель была разработана в совместной работе с сотрудниками эксперименгального отдела НЦ ССХ им. Бакулева РАМН. Инфаркт миокарда моделировали на крысах линии Вистар (2-х месячные самки массой тела 120-140г). Операцию проводили под тиопенталовым наркозом. Наркотизированным животным делали боковую торакотомию на уровне 4-го межреберья. Сердце крысы освобождали от перикарда и выводили в операционную рану. Выделяли переднюю межжелудочковую артерию (ПМЖА) и накладывали лигатуру из пролена 6,0 двукратно. Затем грудную клетку послойно ушивали. Автор выражает благодарное ib ординатору ПЦ ССХ им Бакулева Втюриной И В. за оказанную помощь в выполнении этого раздела работы.

Клеточная трансплантация В эксперименте использовали самок крыс линии Вистар с моделированным

инфарктом миокарда. Для трансплантации брали клонированные ММСК костного мозга и селезенки без признаков дифференцировки. Клетки флюоресцентно метили бисбензимидом два часа до трансплантации. Ксенотрансплантацию клеток проводили на стадии некроза - через 6 дней после моделирования инфаркта. Меченые клетки в среде Хенкса, по 2*106 на крысу вводили интрамиокардиально в зону постинфарктного рубца в объеме 100 мкл. Контрольной группе вводили физиологический раствор в том же объеме, что и опытным животным. На 14-е и 24-е сутки после трансплантации крыс выводили из эксперимента передозировкой тиопентала.

Приготовление микропрепаратов

Для приготовления препаратов сердце перфузировали в физиологическом растворе при комнатной температуре. Затем разрезали на уровне желудочков на два поперечных фрагмента. Изготовляли криостатные срезы, фиксировали их в 10 % формалине. Распределение флуоресцентно меченых клеток наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Выбранные срезы окрашивали гематоксилином и эозином

Фазово-контрастную и флуоресцентную микроскопию проводили на микроскопе "Olympus СК-40" (Япония). Для фотографирования и видеосъемки использовали цифровую фотокамеру "Olympus". Фотографии просматривали и обрабатывали в программе ACDSee 6,0 и CorelDraw 12.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием методов вариационной статистики, используя t-критерий Стьюдента. В обработке материала применяли программы Excel пакета MS Office и Статистика 6,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Работа состоит из 4-х разделов. Первый раздел посвящен методике получения и клонирования культур ММСК из костного мозга, тимуса, печени и селезенки. Во второй части охарактеризовали выделенные культуры клоногенных ММСК Третий раздел посвящен исследованию направленной и спонтанной миогенной дифференцировки, четвертый - поведению и дифференцировке выделенных культур in vivo.

Выделение колоний мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из органов гемопоэза и иммуногенеза

Полученные клетки стромы тимуса, печени, селезенки и костного мозга на 1-ом пассаже предсгавляют собой гетерогенную популяцию прикрепленных клеток, из которых только небольшая часть является мультипотентными МСК. С целью отбора популяций стволовых клеток, культуры стромальных клеток были серийно клонированы в низкой плотности 30 кл/см2. После 3-7 дней инкубирования наблюдали образование колоний, содержащих от 4-6 до нескольких десятков клеток Для формирования колоний диаметром более 2 мм требовалось 14-15 сут. На данном этапе культивирования в культуре присутствовали следующие типы клеток: колонии мелких округлых клеток, фибробластоподобные колонии и участки роста крупных распластанных стромальных клеток. Встречались также колонии смешанного типа. Колонии мелких клеток выделяли и повторно клонировали. При отборе колоний оценивали фенотипическую однородность клеток, количество митозов и скорость пролиферации.

Для сравнения частоты встречаемости ММСК из разных источников проводили подсчет колоний через 15 дней после посева по окрашиванию колоний раствором кристаллического фиолетового. Количество колониеобразующих единиц варьировало в разных образцах (табл.1). Подобное отличие может быть связано со временем забора образцов, сроком гестации, индивидуальными характерис гиками. Частота встречаемости ММСК в костном мозге была выше, чем в остальных исючниках (oi 78,0±8,0 до 155,0±18,6 на 2*103 стромальных клеток). Наименьшее количество колониеобразующих единиц содержала печень (от 16,0±3,2 до 25,0±4,3 на 2* 103 стромальных клеток).

Наши результаты сходны с данными, полученными int Anker Р. и соавт. (2003) при сравнении частоты ММСК из пренатальных печени (0,28/103), селезенки (1,72/103) и костного мозга (2,5/103) плодов второго триместра гестации методом лимитирующих разведений. Campagnoli и соавт. определяли частоту встречаемости ММСК, полученных из печени, костного мозга и крови плодов первого триместра гестации подсчетом образовавшихся колоний на первом пассаже. По данным этах авторов частота ММСК составляла 11,3±2/106 ядросодержащих клеток дай печени, 12,6±3,6/106 для костного

Табл.1. Результаты подсчета количества колоний мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных органов гемопоэза

I Гроба Срок гестац, нед Костный мозг Селезенка Печень Тимус Достоверность различий

Ь26 20 1) 92,0±8,3 8) 73±6 15) 16±3 22) 54±б Р).8,22<0,01, Р.5-1,8.22<0,001

121 18-18,5 2) 143±13 9) 108±11 16) 22±4 23) 97±7 Р2-9,23<0,С1, Р16-2,9,23*^0,001

Ь28 20 3)155±19 10) 121±12 17) 25±4 24) 103±11 Р3.24<0,01, Р.7-3,Ю,24<0,001

Ь29 20 4) 97±9 11) 84±8 18) 17±3 25) 60±7 Р18-4,П,25<0,001, Р25^,П<0,01

ЬЗО 18-19 5) 118±12 12) 102±10 19) 23±б 26) 67±8 Р19-5,12,26<0,001, Р26-5,12<0,01

Ь31 19-20 6) 78±8 13) 59±7 20) 14±2 27) 42±6 Р<ИЗ,27<0,01, Р20-6,13,27<0,001

1.32 18-19 7) 115±9 14) 97±8 21) 19±5 28) 8(Н:9 Р7-28<0,01 Р21.7Д4,28<0,001

Примечание. Рассчитывали среднее значение по результатам анализа не менее Зх чашек диаметром 90мм Плотность посева во всех случаях составляла 30 клеток\см2.

мозга и 8,2=1-0,6 для крови. Поскольку, во всех трех случаях использовались разные методы оценки, разный материал и состав среды, то сравнивать результаты довольно сложно Однако данные обоих исследований коррелируют с результатами, полученными в настоящей работе, где показано наибольшее количество КОЕ-Ф для костного мозга и наименьшее для печени.

Таким образом, подбор оптимальных условий культивирования (соответствующая плотность посева, присутствие в составе культуральной среды фактора роста

фибробластов) позволил выделить клеточные популяции, которые обладают колониеобразующей активностью и способностью к самообновлению.

Характеристика выделенных культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга

Иммунофенотип культур клеток из тимуса, селезенки, костного мозга и печени определяли цитофлуориметрией. Мы выбрали группу маркеров, наиболее часто используемых для анализа ММСК из костного мозга взрослых доноров (БоиПе й а1., 2002; Р^ег^ег. й а!., 2004).

Для исследования выделяли наиболее типичные фибробластоподобные колонии, морфологически однородные и культивировали в одинаковых условиях. Анализ проводили на 2-3 и на 10-11 пассаже. Проанализировали экспрессию поверхностных эпитопов в культурах ММСК из 9 пренатальных тимусов, ММСК из 9 аспиратов пренатального костного мозга. ММСК из 9 пренатальных селезенок и ММСК из 9 образцов печени. Иммунофенотипический профиль ММСК тимуса, селезенки, косгного мозга и печени незначительно менялся после 10 пассажей в культуре. ММСК, изолированные из различных источников, по основным маркерам демонстрировали сходный иммунофенотип (табл.2). Основные маркеры гемопоэтических и эндотелиальных клеток С034, С045, СВ38, СОН в культурах ММСК из тимуса, косшого мозга селезенки и печени экспрессировали менее 1% клеток (на уровне отрицательного контроля). Маркеры главного комплекса гистосовместимости II типа (ИЬЛ-БЯ) также отсутствовали во всех исследуемых кульгурах. Наибольшая клеточная популяция ММСК (80-94,3%) окрашивалась антителами на мезенхимальные маркеры ТЬу-1 (СВ90), СБ44 (65-92,8%) и эндоглин СВ1()5 (больше 50%). Клеточные популяции, экспрессирующие рецептор трансферрина С071, выявляли во всех культурах, однако доля позитивных клеток колебалась от 15 до 70%. Результаты проведенных нами исследований показали отсутствие корреляции между частотой пассирования клеточных культур из пренатальных тканей и экспрессией рецептора трансферрина.

Таким образом, профиль экспрессии наших культур по основным мезенхимальным маркерам сходен с профилем экспрессии, показанным для ММСК из костного мозга взрослых доноров (Мш^Иа е1 а1., 2000; БойПе е1 а!., 2002; Рте^ег <Л а1., 2004).

Таблица.2. Иммунофенотип культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из разных источников

Маркер Костный мозг Тимус Печень Селезенка

НЬА -АВС (МНС1) ++ + ++ ++

Н1А -ОИ (МНСП) - - - -

СБ 34 - - - -

СБ 45 - - - -

СБ 4 - - - -

СБ 71 + + + +

СБ 44 (Н-САМ) ++ ++ ++ ++

СБ 90 (ТЬу-1) -н- ++ ++ ++

СБ 105 (эндоглин) ++ ++ ++ ++

СИ 54 (1САМ-1) + + ++ +

++ большинство клеток позитивны + меньше 50 % экспрессирующих маркер клеток

100% клеток негативны (на уровне отрицательного контроля) по этим маркерам

При анализе антигенов комплекса гистосовместимости I класса и молекулы адгезии 1САМ-1 получили большой разброс в уровне экспрессии. Во всех проанализированных образцах тимуса (10,3 ± 3,6), костного мозга (6,1 ± 2,8) и селезенки (14,6 ± 5,2) присутствовала небольшая клеточная популяция, которая окрашивалась антителами против 1САМ-1 - растворимой молекулы межклеточной адгезии I (СП54) Однако в ММСК печени выделены отдельные колонии с высоким

уровнем экспрессии СЭ54 - более 50%. Известно, что 1САМ-1 (СБ54) индуцируется определенным набором цитокинов, среди которых 1Ь-1, ТОТ-Х. Можно предположить, что активация экспрессии 1САМ-1 в выделенных колониях вызвана специфическим цитокиновым профилем, характерным только для небольшого числа клеточных популяций. Наибольший уровень экспрессии СБ54 мы наблюдали в ММСК из печени (45%), а наименьший - в ММСК из костного мозга (6,14%) (рис.1).

, 60,0 -

Рис.1. Сравнительная характеристика уровня экспрессии СБ-54 в культурах мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток печени (1), селезенки (2), тимуса (3) и костного мозга (4), Р1.2;з14<0,01.

Различия в уровне экспрессии CD54 (молекулы адгезии), возможно, могут влиять на способность клеток к миграции после трансплантации ín vivo, и, следовательно, могут иметь значение при выборе трансплантата для клеточной терапии.

Отсутствие МНС-I экспрессии на поверхности трансплантируемой клеточной популяции защищает их от распознавания Т-клетками, но, в то же время, делает эти клетки мишенью для естественных киллеров (NK) (Vilches et al, 2002). Способность избегать и адаптивного и врожденного иммунного ответа может способствовать лучшему выживанию и пролиферации трансплантата. Недавние исследования на человеке и мыши, показали, что NK не лизируют эмбриональные стволовые клетки (Drukker et al, 2002), популяции гемопоэтических стволовых клеток (Aguila et al,

120,0

Рис.2 Сравнительная характеристика уровня экспрессии НЬА-А,В,С в культурах мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток селезенки (1), печени (2), костного мозга (3) и тимуса (4), Р^О.О!, Р2-4<0,01.

1996) и нейрональных стволовых клеток (Матто1епИ е1 а1, 2004), не несущих МНС класса I и И.

Самый высокий уровень экспрессии антигенов МНС I выявили в культуре ММСК из селезенки. Антигены комплекса МНС-1 (НЬА-АВС) присутствовали на поверхности только 5 - 30% ММСК тимуса. Доля позитивных клеток незначительно изменялась при пассировании, однако в целом оставалась стабильно низкой. Тогда как, 90,5-97% ММСК селезенки несли антигены МНС-1. На НЬА-А,В,С также окрашивалось 53,4% ММСК костного мозга и 71% ММСК печени (рис.2.).

Таким образом, по результатам сравнительного исследования, ММСК из тимуса имеют наиболее низкий уровень экспрессии антигенов МНС I по сравнению с аналогично выделенными культурами из других пренатальных источников, в том числе костного мозга.

Функциональную активность культур ММСК оценивали по способности к направленной дифференцировке. В настоящей работе были использованы индуцирующие среды и условия проведения экспериментов, описанные в литературе

для оценки дифференцировки ММСК из костного мозга в хондрогенные, остеогенные и адипогенные линии (табл. 3).

Было проанализировано по 3 параллели 8-ми образцов ММСК костного мозга, тимуса, селезенки и печени на каждый дифференцирующий агент.

На 21 сут инкубирования в остеогенной среде, выявляли образование очагов минерализации окрашиванием спиртовым раствором ализаринового красного. Во всех проанализированных образцах (п=96) культур из печени, костного мозга, тимуса и селезенки наблюдали очаги минерализации. Окрашенные участки располагались в

Таблица. 3. Схема экспериментов по направленной диффеоенцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

Направление дифференцировки Вид культуры Состав дифференцирующей сред! Время наблюдения

Хондрогенез Суспензионная 500нг\мл ВМР-6 10нг\млТСР-Ь 10"7М дексаметазон 50 мкг\мл аскорбиновой кислоты ИТС 21 сут

Остеогенез Монослойная 10"8М дексаметазон 0,2мМ аскорбиновой кислоты ЮмМ в-глицерофосфат 21 сут

Адипогенез Монослойная 0,5 мкМ гидрокортизон 50 мкМ индометацин 21 сут

местах наиболее плотного роста клеток, варьировали в размере и количестве от 6 до 40 и больше очагов на чашку. Подобной картины не наблюдали в культуре фибробластов кожи, культивировавшихся в тех же условиях.

После инкубирования в адипогенной среде во всех образцах ММСК костного мозга, печени, тимуса и селезенки (п-96), при наблюдении в фазовом концэасте отмечали липидные включения в цитоплазме. В культуре фибробластов кожи, использовавшихся в качестве контроля, подобных элементов не наблюдали.

Для достижения хондродифференцировки клетки инкубировали в нсадгезивных условиях в хондрогенной среде. Через 2 недели культивирования наблюдали образование клоноподобных сфероидов, состоящих из живых клеток, не включающих трипановый синий. На 21 день культуры фиксировали и окрашивали антителами против специфических маркеров хондрогенеза - коллагена 2 типа и аггрекана. Все проанализированные культуры ММСК печени, костного мозга, тимуса и селезенки (гг96) положительно окрашивались на эти маркеры. Фибробласты кожи, культивировавшиеся в хондрогенной среде, были негативны на апрекан.

Подбор оптимальных условий культивирования позволил выделить клеточные популяции, которые способны в культуре образовывать колонии мультипотентных клеток с высоким уровнем пластичности. Выделенные популяции стромальных клеток из всех прена'1 альных источников экспрессировали мезенхимальные маркеры, а также были способны дифференцироваться в адипогенную, хондрогенную и остеогенную линию, и, следовательно, могут рассматриваться как истинные ММСК. Исследование миогенеза в культурах мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, тимуса, иечени и селезенки Спонтанная миогенная дифференцировка Исследовали ММСК из костного мозга 9-ти доноров, ММСК из тимуса 7-ми доноров, ММСК из печени 8-ми доноров, ММСК из селезенки 8-ми доноров, Необходимым условием получения миогенной дифференцировки без добавления индуцирующих агентов является выделение колоний мелких клеток, выращенных из плотности 6-30 клеток\см2 в присутствии основного фактора роста фибробластов. Стимуляция миогенеза в колониях данного типа происходила в результате временного торможения пролиферации: чашки с культурами содержали в условиях дефицита С02 и понижения температуры до 25 °С в течение 30 минут. С помощью фазово-контрастного микроскопа наблюдали изменение морфологии клеток только в культурах ММСК костного мозга, печени и тимуса. Клетки вытягивались в одном направлении, сливались и через 7-8 дней формировали миотубоподобные структуры, содержавшие 3-10 ядер на

клетку. Окраской по Романовскому выявляли центральное расположение ядер, что характеризует раннюю стадию образования миосимпластов. Появление характерных многоядерных миотрубочек наблюдали во всех исследованных образцах ММСК тимуса, костного мозга, и печени. Ни в одном из образцов ММСК селезенки образование мышечных трубочек не выявляли. Поскольку в литературе не описана спонтанная миогенная дифференцировка ММСК, предположили, что это связано с фетальным происхождением клеток. Чтобы проверить это предположение, клонировали ММСК из костного мозга 6-ти взрослых доноров, и во всех 6-ти образцах, также получили миогенную дифференцировку.

Миогенез регулируется семейством транскрипционных факторов MRF, которое включает MyoD, Myf5, миогенин и MRF4. В течение эмбрионального развития Myo D и Myf 5 вовлечены в формирование скелетной мышцы, тогда как миогенин необходим для терминальной дифференцировки (Sabourin et al, 2000).

Выбрали MyoD для оценки раннего миогенеза и миогенин в качестве позднего маркера. Через 3 дня после неспецифического торможения пролиферации культуры ММСК из костного мозга, тимуса и печени позитивно окрашивались антителами к MyoD. После образования миотрубочек (через 7-8 дней) в тех же культурах выявляли экспрессию миогенина.

Примерно через месяц после начала миогенеза, наблюдали образование автономно сокращающихся кардиомиоцитоподобных структур. Дифференцировавшиеся клетки сокращались многократно и спонтанно без специфической стимуляции. Культуры, в которых образовывались подобные структуры, позитивно окрашивались на тяжелую цепь миозина медленной мышцы и тропонин I. Количество кардиомиоцитоподобных структур на чашку варьировало от 2 до 8. Несмотря на то, что структуры образовывались практически одновременно, сокращаться они начинали в разное время. Сокращения были асинхронные и с разной амплитудой, однако наблюдали также структуры, бившиеся синхронно и ритмично. Возможно, это связано с образованием пейсмекерного региона Кардиомиоцитоподобные структуры сокращались в течение 4872 часов и не дедифференцировались.

До сих пор в литературе не была показана спонтанная дифференцировка ММСК в кардиомиоциты Для кардиомиогенной дифференцировки ММСК использовали 5-азацитидин, сокультивирование с кардиомиоцитами или добавление кардиомиогенных

дифференцирующих сред (Fukuda, 2005; Iijima et al., 2003, Shim ct al., 2004). В статье Fukuda. (2005) приводятся данные о сокращении непосредственно миотрубочек, образованных дифференцировавшимися под действием 5-азацитидина мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга взрослых доноров. В нашей работе, при спонтанной дифференцировке ММСК, наблюдали образование клоиоподобных структур, схожих с теми, которые образуются при кардиомиогенной дифференцировке эмбриональных стволовых клеток (Mummery et al, 2003).

Показано, что спонтанная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток может инициироваться высокой плотностью (Choi et al, 2004) Однако при выращивании клеток в высокой плотности (4* 103 клеток/см2 и больше) и в не клонированной культуре, образование миотуб не выявляли. Возможно, это связано с тем, что при такой плотности не удавалось отобрать популяции клеток, которые обладают миогенным потенциалом.

Для оценки способности к направленной миогенной дифференцировке выбрали 2 культуры, показавшие различные характеристики в предыдущем эксперименте. Для одной из них (ММСК костного мозга) показана способность к спонтанной миогенной дифференцировке, а в другой (ММСК селезенки) нам не удалось обнаружить такой способности. В опыт брали не клонированные культуры без признаков спонтанной дифференцировки на 3-4 пассаже. В качестве дифферентдировочного агента использовали 5-азацитидин (аналог цитозина), обладающий деметилирующей активностью и, как показано в литературе, индуцирующий дифференцировку ММСК в кардиомиоциты (Makino, 1999) Клетки сажали в количестве 10* 103 на чашку диаметром 90 мм (п=40). 5-азацитидин добавляли в концентрации 1 цМ, ЗцМ и ЮцМ. В качестве контроля использовали культуры ММСК костного мозга и селезенки, соответственно, культивировавшиеся на той же среде в отсутствии 5-азацитидина. Чтобы оценихь влияние 5-азацитидина на пролиферативную активность клеток через 6 и через 12 дней инкубирования, клетки снимали с культуральной посуды раствором трипсина с версеном и подсчитывали среднее количество клеток в 10 пробах на точку. Как видно из представленных данных, и в культуре ММСК селезенки (Рис. 3) и в культуре ММСК костного мозга (Рис. 4) 5-азацитидин ингибировал пролиферацию ММСК в прямой зависимости от концентрации.

Пролиферативная активность клеток, обработанных 1цМ 5-азацитидином ингибировалась незначительно, однако уменьшалась по сравнению с контролем на 6

6 дней

12 дней

о 2000 Г 1800

ж 1600 ® 1400 g 1200

Рис.З. Влияние 5-азацитидина на пролиферацию ММСК селезенки через 6 и 12 дней инкубации. 1 -контроль, 2-4 - концентрации 5-азацитидина 1цМ, ЗдМ и ЮцМ, соответственно. * - различия достоверны (Р<0,01) при сравнении с контрольной 1руппой.

день для ММСК костного мозга (233,0 ± 3,6 против 300,0 ± 5,0, при Р<0,001) и на 12 день (1275,0 ± 90,1 против 1550,0 ± 86,6, при Р<0,001); для ММСК селезенки на 6 день (250,0 ± 10,0 против 322,5 ± 2,5, при Р<0,005) на 12 день (1379,0 ± 56,5 против 1642,0 ± 131,0, при Р<0,001). Более сильно ингибировался рост клеток после обработки ЗцМ 5-азацитидином на 6 день для ММСК костного мозга (162,0 ±7,2 против 300,0 ± 5,0, при Р<0,001) и на 12 день (808,3 ± 162,6 против 1550,0 ± 86,6, при Р<0,001); для ММСК селезенки на 6 день (180,0 ± 5,0 против 322,5 ± 2,5, при Р<0,001) и на 12 день (901,6 ± 102,5 против 1642,0 ± 131,1, при Р<0,001). И уменьшалась больше чем в 5 раз после обработки ЮцМ на 6 день для ММСК костного мозга (47,3 ± 8,7 против 300,0 ± 5,0, при Р<0,001), на12-й день (339,3 ± 80,5 против 1550,0 ± 86,6,

6 дней

Рис.4. Влияние 5-азацитидина на пролиферацию ММСК костного мозга через 6 и 12 дней инкубации. 1 -контроль, 2-4 - концентрации 5-азацитидина 1 цМ, ЗцМ и ЮцМ, соответственно. * - различия достоверны (Р<0,01) при сравнении с контрольной группой.

при Р<0,001); для ММСК селезенки на 6 день (59,6 ± 5,9 против 322,5 -к 2,5, при Р<0,001) и на 12 день (332,0 ± 43,2 против 1642,0 ± 131,1, при Р<0,001).

Кардиомиогенную дифференцировку оценивали через 8 недель культивирования. После индукции мезенхимальные стволовые клетки селезенки увеличивались в размерах, распластывались и замедляли рост, появлялось большое количество адипоцитоподобных клеток. Однако даже при максимальной концентрации индуцирующего агента в культуре ММСК селезенки не выявляли признаков миогенной дифференцировки.

В культуре ММСК костного мозга, также как и в культуре селезенки наблюдали отдельные адипоцитоподобные клетки. В отличие от ММСК селезенки, в культуре

ММСК костного мозга после индукции 5-азацитидином наблюдали миогенную дифференцировку клеток (окраска на тропонин I и МуНС). Наиболее выраженный эффект отмечали при использовании 10 рМ 5-азацитидина (20-30% клеток). Применение 1 рМ 5-азацитидина давало незначительный эффект, несколько большее количество дифференцировавшихся клеток наблюдали с 3 цМ 5-азацитидином (около 10% клеток).

При индукции 5-азацитидином неклонированных ММСК костного мозга мы получали менее выраженную миогенную дифференцировку, чем при спонтанной дифференцировке клонированных клеток. Это проявлялось в том, что на направленную дифференцировку требовалось больше времени (4 недели против 7 дней), при этом получая меньший процент дифференцировавшихся клеток (20-30% против 40-50%). Т.е. клонирование и отбор ММСК позволяют избежать обработки культуры токсичным 5-азацитидином для получения кардиомиогенной дифференцировки.

Таким образом, впервые получена спонтанная кардиомиогенная дифференцировка ММСК in vitro. В то же время было показано, что ММСК из органов гемопоэза обладают разным миогенным потенциалом в культуре. В то время как ММСК тимуса, костного мозга и печени способны дифференцироваться в скелетные миобласты и кардиомиоциты, ММСК селезенки ни спонтанно, ни при индуцирующем воздействии не обладают такой способностью. Однако неизвестно сохранится ли подобная модель поведения при трансплантации in vivo.

Трансплантация мультипотентиых мезенхимальиых стромальных клеток крысам с моделированным инфарктом миокарда

Поскольку события, происходящие in vitro, не всегда коррелируют с данными, полученными in vivo, оценили миогенез на лабораторных животных с моделированным инфарктом миокарда. В эксперименте использовали клонированные ММСК селезенки и костного мозга без признаков дифференцировки, на 3-4 пассаже. Клетки метили бисбензимидом и пересаживали крысам на 6-е сутки инфаркта (на стадии некроза). В опыт брали по 10 животных на группу. Результаты оценивали через 14 и 24 сут после пересадки.

Картина клеточной миграции при трансплантации ММСК костного мозга и селезенки не зависела от типа вводимых клеток. Максимум флюоресцентно

окрашенных клеток во всех случаях наблюдали в области инфаркта, прилегающей к лигатуре. Наибольшее количество мигрировавших клеток обнаруживали в эпикарде. Меньшее количество трансплантированных клеток наблюдали в периинфарктной зоне. В неповрежденной ткани миокарда донорские клетки не обнаруживали.

Через 14 дней после трансплантации ММСК меченные бисбензимидом донорские клетки обнаружили в сердце 9 из 10 крыс. Бисбензимид-позитивные ММСК селезенки и костного мозга при наблюдении во флюоресцентный микроскоп были негативны на антитела к тропонину I. Через 24 дня после трансплантации на срезах в зоне инфаркта обнаруживали меченные бисбензимидом донорские клетки. На срезах сердца с трансплантированными ММСК костного мозга в клетках одновременно с флюоресценцией бисбензимида наблюдали экспрессию кардиоспецифического белка - тропонина I. В группе с введением ММСК селезенки в бисбензимид-позитивных клетках экспрессии тропонина I не наблюдали.

Таким образом, ММСК селезенки и костного мозга выживают и сохраняют способность к миграции ¡n vivo при ксенотрансплантации. В группе с трансплантированными ММСК костного мозга выявляли также признаки кардиомиогенной дифферендировки.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный цитофлуориметрический анализ культур, полученных из пренагальных органов гемопоэза и иммуногенеза показал, что культуры имели сходный иммунофенотип. отличающийся только по маркерам JILA-A,В,С и CD54. Наиболее низкий уровень экспрессии маркеров гистосовмесгимости I класса выявлен в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток тимуса (5-30%), наиболее высокий - в кулыуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток селезенки (90-97%).

2. Строма пренатального тимуса содержит колониеобразующую популяцию мультипотентных клеток. Морфология и иммунофенотип выделенной популяции соответствовал харак1еристикам мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (позитивны на: CD90, CD44, CD105, виментин, негативны на гемопоэ!Ические маркеры. CD34, CD45, CD38).

3. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки из пренатального костного мозга, тимуса и печени обладают способностью к спонтанной миогенной дифференцировке: образование миосимпластов и экспрессия специфических маркеров раннего (MyoD) и позднего (миогенина) миогенеза. Через месяц культивирования в тех же культурах выявляли автономно сокращающиеся кардиомиоцитоподобные структуры, экспрессирующие кардиоспецифичные маркеры - миозин медленной мышцы и тропонин I.

4 Дифференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из органов гемопоэза и иммуногенеза зависел от сайта выделения. Показано, что мультипотентность МСК селезенки ограничена по сравнению с ММСК из других органов гемопоэза и иммуногенеза. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки селезенки дифференцировались в остеогенную, хондрогенную и адипогенную линии, но не обладали способностью ни к спонтанной ни к направленной (5-азацитидин) миогенной дифференцировке.

5 Через 24 дня после трансплантации крысам с моделированным инфарктом миокарда мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга экспрессировали кардиомиогенные маркеры (тропонин I). Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки селезенки, не обладающие способностью к миогенной дифференцировке in vitro, in vivo также не проявляли признаков дифференцировки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ржанинова А А., Горностаева С.Н., Гольдштейн Д.В , Сабурина И.Н., Репин B.C. Мезенхимальные стволовые клетки из фетального и донорского костного мозга человека- получение и сравнительная характеристика. // Бюлл. эксиер. биол. и мед. Приложение 2003, С.39-43.

2. Мануйлова Е С , Арсеньева E.JL, Хайдарова Н В., Шугурова И.М. Горностаева С Н., Иноземцева J1.C., Катруха А.И., Гривенников И.А, Тарантул В.З Влияние регуляторных генов вируса иммунодефицита человека 1 типа на пролиферацию и дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши // Онтогенез, 2003; 34(3):204-10.

3 Ржанинова А А , Горностаева С Н., Гольдштейн Д В , Сабурина И II, Репин В С Мезенхимальные стволовые клетки из эмбриональных и взрослых тканей Получение и характеристика //Материалы Второго Московского Международного Конгресса; «Биотехнология' состояние и персиекшвы развития», 2003, С.130-131

4 Ржанинова А.А..Гольдштейн Д.В., Горностаева С.Н., Репин B.C., Бокерия Л А., Ким А И Выделение клонов мезенхимальных клеток (ММСК) из фетальных органов кроветворения человека с монодифференцировкой в миобласгы. // VIII Ежегодная сессия НЦССХ им А Н. Бакулева РАМН. Бюллетень НГДССХ им. А.Н Бакулева РАМН: Сердечно-сосудистые заболевания 2004. т. 5, №5. С.315.

5. Ржанинова АА, Горностаева С.Н., Гольдштейн Д.В. Получение и фенотипическая характеристика мезенхимальных стволовых клеток из тимуса плодов человека // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2005, № 1. С 34-41

6. Фатхудинов Т.Х. Гольдштейн Д.В., Кулаков A.A., Гршорян A.C., Пулин А.А , Макаров А.В . Шаменков Д А., Ржанинова A.A., Горностаева С.Н. Стимуляция репаративного остеогенеза при ксснотрансплантации пренатальных мезенхимальных стволовых клеток и хондробластов человека. // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2005, № 2. С.75-83.

7. Фатхудинов Т.Х. I ольдштейн Д.В.. Пулин А А., Шаменков Д А., Ржанинова A.A., Горностаева С.Н., Григорян A.C. Кулаков А.А Особенности репаративного остеогенеза при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток //Бюл экспер. биол и мед. 2005. т.140, № 7, С. 109-113.

8. Горностаева С.Н, Ржанинова А.А, Гольдштейн Д.В Получение и характеристика мезенхимальных стволовых клеток печени, стабильно несущих ген зеленого белка. // Материалы Второй международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва; 2005, С. 112.

9. Горностаева СН, Ржанинова A.A.., Гольдштейн Д.В. Миогенез в культуре мезенхимальных стволовых клеток кроветворных тканей II Клеточные технологии в биологии и медицине, 2006, № 2, С. 62-65

Соискатель / L-, С.Н. Горностаева

Автор выражает признательность Директору экспериментальных программ ЗАО «РеМеТэкс» Ржаниновой АА. за консультации и поддержку в процессе работы над диссертацией

к исполнению 21/04/2006 Исполнено 24/04/2006

Заказ №327 Тираж ЮОэкз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www autoreferat ш

¿006A

91 05

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Горностаева, Светлана Николаевна

Введение.

Глава I. Обзор литературы

1.1. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки: получение и свойства.

1.1.1. Регуляция дифференциации.

1.2. Источники мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

1.3. Миогенная дифференцировка ММСК in vitro.

1.4. Изучение миогенеза in vivo.

1.4.1. Как стволовые клетки становятся кардиомиоцитами. Слияние или дифференцировка.

1.4.2. Кардиомиогенные сигналы дифференциации.

1.4.3. Временной промежуток для оптимальной дифференциации.

Глава II. Материалы и методы

11.1. Выделение мезенхимальных клеток из тимуса, костного мозга, печени и селезенки.

11.2. Клонирование.

11.3. Подсчет колоний.

11.4. Иммуноцитохимические исследования.

II.5. Анализ иммунофенотипа полученных культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

11.6. Функциональная характеристика выделенных культур.

11.7. Направленная миогенная дифференцировка 5-азацитидином.

11.8. Моделирование инфаркта миокарда.

11.9. Приготовление клеточного трансплантата.

11.10. Клеточная трансплантация in vivo.

II. 11. Приготовление гистологических препаратов.

11.12. Статистическая обработка данных.

Глава III. Результаты и обсуждение

III. 1. Выделение колоний мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных органов гемопоэза и иммуногенеза.

III. 1.1 Получение культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из костного мозга.

III. 1.2. Выделение культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из тимуса.

III. 1.3. Выделение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из печени.

III. 1.4. Выделение культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из селезенки.

III.2. Характеристика выделенных культур.

III.2.1. Цитофлюориметрический анализ иммунофенотипа клеточных культур.

III.2.2 Исследование дифференцировочного потенциала функциональной активности) выделенных культур.

111.3. Исследование миогенеза в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, тимуса, печени и селезенки.

III.3.1 Спонтанная миогенная дифференцировка.

III.3.2. Направленная миогенная дифференцировка.

111.4. Клеточная трансплантация in vivo. ^^

III.4.1 Выбор экспериментальной модели. ^^

111.4.2. Дизайн эксперимента. ^^

111.4.3. Трансплантация клеток.

111.4.4. Оценка результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Миогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro и in vivo"

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания - одна из основных причин смертности в мире. В последнее время возрос интерес к клеточным трансплантациям в кардиологии для репарации поврежденного миокарда. Идут интенсивные дебаты по поводу наиболее подходящего для этой цели типа клеток. Показано, что трансплантированные фетальные кардиомиоциты формировали контакты с кардиомиоцитами реципиента и улучшали сократительную функцию сердца [78,44]. Однако технически сложно получить достаточное количество фетальных кардиомиоцитов для репарации поврежденного миокарда. Применение скелетных миобластов уменьшает выраженность вентрикулярной дилятации и улучшает сократительную функцию сердца [53,62]. Недостаток этого метода в том, что трансплантированные рабдомиобласты не обладают автоматизмом и не образуют нексусы в миокарде реципиента [67]. Пересадка ядросодержащей фракции костного мозга, так же оказывала положительное влияние на миокард. Но, как выяснилось, этот эффект был связан не с гемопоэтическими, а со стромальными клетками костного мозга [50,51].

Сравнительно с другими типами клеток, рассматриваемыми для кардиомиопластики, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), по-видимому, обладают уникальными свойствами, которые позволяют их использовать для высокоэффективной клеточной терапии.

Способность ММСК к дифференцировке в различные клеточные типы [70,101,102,103], а также возможность выращивания в качестве аутотрансплантата [104], делают клетки этого типа чрезвычайно перспективными для клеточной заместительной терапии.

Дифференцировка трансплантированных клеток в кардиомиобласты может зависеть от типа имплантированных стволовых клеток, а также качественных и количественных отличий в локальных условиях в момент трансплантации [144,149,154]. В настоящее время остается открытым вопрос о преимуществе трансплантации миогенно предифференцированных или недифференцированных клеток. На сегодняшний день безопасность предифференцировки не доказана. Так же еще убедительно не показана способность ММСК дифференцироваться в клетки мышечного типа.

Большинство статей посвящено мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам взрослого организма [104,106,114,123] и очень мало известно о пренатальных ММСК. В течение онтогенеза человека пролиферация и дифференцировка гемопоэтических стволовых\прогениторных клеток происходит в гистологически различном микроокружении. ММСК тесно связаны с гемопоэтическими клетками во взрослом костном мозге. Печень, селезенка, тимус и костный мозг являются известными сайтами активного гемопоэза на разных стадиях в фетальный период развития. ММСК из этих органов гемопоэза слабо изучены, ММСК из тимуса человека совсем не описаны в литературе.

Отсутствие этих данных позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Провести сравнительную характеристику мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных органов гемопоэза и иммуногенеза, исследовать их миогенный потенциал ex vivo и in vivo.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

2. Анализ иммунофенотипа выделенных культур методом проточной цитофлуориметрии;

3. Оценка мультипотентности полученных культур (хондрогенез, остеогенез, адипогенез) с использованием селективных сред.

4. Оценка спонтанной миогенной дифференцировки.

5. Изучение индукции миогенной дифференцировки культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro.

6. Исследование поведения и дифференцировки выделенных культур у лабораторных животных с моделированным инфарктом миокарда.

Научная новизиа работы. Данная работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проведена сравнительная характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пренатальных органов гемопоэза и иммуногенеза - тимуса, селезенки, костного мозга и печени. Получены данные о их различии в экспрессии маркеров гистосовместимости I класса (MHC-I) и молекулы адгезии CD-54 (ICAM-I). Впервые выделены и охарактеризованы мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки тимуса человека.

Впервые показана способность к спонтанной дифференцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, тимуса и печени в скелетную и сердечную мышцу. Выявлены отличия в потентности к миогенной дифференцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из разных источников. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки селезенки, в отличие от ММСК костного мозга, тимуса и печени такой способности не проявляли.

Практическая значимость работы. Впервые разработан протокол получения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток тимуса. Показана перспективность применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток тимуса в качестве клеточного аллотрансплантата, благодаря его значительно меньшей, по сравнению с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками из других источников, иммуногенности и высокой технологичности получения культуры.

Определены условия отбора клеточных популяций, предпочтительно дифференцирующихся в миобласты. Показано, что клонирование и отбор мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток позволяет избежать обработки культуры токсичным 5-азацитидином для предифференцировки в кардиомиогенном направлении перед трансплантацией клеток in vivo.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Втором Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), Конференции в РГМУ (Москва, 2003, 2004), VIII Ежегодной сессии НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН (Москва, 2004), I, II международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», (Москва, 2004, 2005), на межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Москва, март 2006).

Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 9 работ, из них 6 статей в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 147 страницах и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), изложения результатов собственных исследований и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 3 таблицами и 38 рисунками. Указатель цитируемой литературы включает 157 источников.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Горностаева, Светлана Николаевна

Выводы

1. Сравнительный цитофлуориметрический анализ культур, полученных из пренатальных органов гемопоэза и иммуногенеза, показал, что культуры имели сходный иммунофенотип, отличающийся только по маркерам HLA-A,B,C и CD54. Наиболее низкий уровень экспрессии маркеров гистосовместимости I класса выявлен в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток тимуса (5-30%), наиболее высокий - в культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток селезенки (90-97%).

2. Мезенхима пренатального тимуса содержит колониеобразующую популяцию мультипотентных клеток. Морфология и иммунофенотип выделенной популяции соответствовал характеристикам мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (позитивны на: CD90, CD44, CD 105, виментин; негативны на гемопоэтические маркеры: CD34, CD45, CD38).

3. ММСК из пренатальных костного мозга, тимуса и печени обладали способностью к спонтанной миогенной дифференцировке: образование миосимпластов и экспрессия специфических маркеров раннего (MyoD) и позднего (миогенина) миогенеза. Через месяц культивирования в тех же культурах выявляли автономно сокращающиеся кардиомиоцитоподобные структуры, экспрессирующие кардиоспецифичные маркеры - миозин медленной мышцы и тропонин I.

4. Дифференцировочный потенциал ММСК из органов гемопоэза и иммуногенеза зависел от сайта выделения. Показано, что, мультипотентность ММСК селезенки ограничена по сравнению с ММСК из других органов гемопоэза и иммуногенеза. ММСК селезенки дифференцировались в остеогенную, хондрогенную и адипогенную линии, но не обладали способностью ни к спонтанной ни к направленной (5-азацитидин) миогенной дифференцировке.

5. Через 24 дня после трансплантации крысам с моделированным инфарктом миокарда мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга экспрессировали кардиомиогенные маркеры (тропонин I). Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки селезенки, не обладающие способностью к миогенной дифференцировке in vitro, in vivo также не проявляли признаков дифференцировки.

128

Заключение

ММСК - мультипотентные клетки, способные к клональному росту в культуре и дифференцировке в различные клеточные типы: остеобласты, хондробласты и адипобласты [26,72,37].

ММСК обладают большим терапевтическим потенциалом благодаря своей способности к самообновлению и дифференцировке в различные ткани. ММСК костного мозга взрослых доноров пересаживали в различные органы, и была показана ткане-специфичная дифференцировка. ММСК также способствовали выживанию гемопоэтических клеток после котрансплантации на животных моделях.

Первоначально ММСК были получены из костного мозга взрослых доноров по способности прикрепляться к пластику [48]. Сейчас многочисленные исследователи показали, что мультипотентные клетки могут быть выделены из различных тканей и могут дифференцироваться во множество клеточных линий, включая хондробласты, остеобласты, адипобласты, миобласты, гепатоциты [26,72,37,45]. Эти клетки могут так же давать рост стромальным клеткам, способным поддерживать in vivo и ex vivo гематопоэз, продуцируя компоненты матрикса, цитокины и факторы роста, вовлеченные в хоуминг, пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических клеток.

В пренатальный период развития человека пролиферация и дифференцировка гемопоэтических стволовых\прогениторных клеток происходит в гистологически различном микроокружении - печени, селезенке, тимусе и костном мозге. Изолирование и характеристика пренатальных ММСК может способствовать пониманию онтогенеза этих клеток и откроет новые возможности в клеточной и генной терапии. Van den Heuvel и коллеги [135] показали, что количество фибробластных колониеобразующих единиц в мышиных фетальной печени, селезенке и костном мозге становится максимальным в то время, когда начинается гемопоэз в соответствующем сайте. Klein [73] и соавторы обнаружили большое количество колониеобразующих единиц в костном мозге собаки перед появлением гемопоэтических клеток.

Наименьшее количество колониеобразующих единиц фибробластов л

КОЕ-Ф) мы получили из печени (16-25 на 2*10 стромальных клеток), а наибольшее - из костного мозга (78-155 на 2*10 стромальных клеток). Наши результаты сходны с данными, полученными in't Anker и коллегами [64] при сравнении частоты ММСК человека из пренатальных печени

0,28/103), селезенки (1,72/10 ) и костного мозга (2,5/10 ) плодов второго триместра методом лимитирующих разведений (LDA). Campagnoli и коллеги [27] определяли частоту ММСК человека, полученных из печени, костного мозга и крови плодов первого триместра гестации подсчетом образовавшихся колоний на первом пассаже. Они нашли, что частота ММСК составляла 11,3±2/106 ядросодержащих клеток для печени, 12,6±3,6/106 для костного мозга и 8, 2±0,6 для крови. По мнению in't Anker более низкая частота ММСК, полученная Campagnoli связана с тем, что количество ММСК возрастает с увеличением срока гестации. На наш взгляд это связано с тем, что Campagnoli подсчитывал количество колониеобразующих единиц на общее число ядросодержащих клеток крови, тогда как in't Anker и мы подсчитывали КОЕ-Ф на общее количество выделенных стромальных клеток. Поскольку, во всех трех случаях использовались разные методы оценки, разный материал и среды, то сравнивать результаты довольно сложно. Однако в обоих исследованиях, как и в нашем, показано наибольшее количество КОЕ-Ф для костного мозга и наименьшее для печени. Erices [43] и коллеги показали, что количество циркулирующих в крови таких клеток уменьшается во время 2 триместра гестации. Возможно, это связано с миграцией ММСК из одного гемопоэтического сайта к другому во время онтогенеза, конечная цель, которой - колонизация костного мозга.

Колониеобразующие единицы пренатального тимуса человека не исследованы. ММСК тимуса представляют особый интерес, поскольку в отличие от ММСК селезенки, печени и костного мозга, имеющих мезодермальное происхождение, происходят из эктомезенхимы. Хотя эти клетки морфологически сходны с мезенхимальными клетками, которые происходят из мезодермы, они имеют функциональные особенности. Эктомезенхимальные клетки должны взаимодействовать посредством контакта или через секретируемые сигнальные молекулы с эпителием, стимулируя процессы его пролиферации, созревания и дифференциации [20,

129]. В условиях обеспечения микроокружения эпителиальной стромы, в котором происходит пролиферация тимоцитов и созревание Т-клеток, фетальный тимус становится компетентным для привлечения клеток-предшественников лимфоидной системы из кровяного русла [148]. В то время как эпителиальные и лимфоидные компоненты тимуса in vivo и in vitro давно находятся в области научного интереса многих исследователей, клетки тимической эктомезенхимы как in vivo, так и in vitro практически не изучены.

Впервые удалось выделить колониеобразующую популяцию мезенхимальных клеток стромы тимуса, морфологически сходную с ММСК костного мозга. Отобранные клеточные популяции пренатальных селезенки и печени костного мозга, также оказались сходны с ММСК из костного мозга взрослых доноров. Полученные культуры имели сходную морфологию и иммунофенотип. Они явно не являлись гемопоэтическими или эндотелиальными клетками - CD45", CD34", CD 14", CD3 Г, CD38", а так же не несли маркеров комплекса гистосовместимости II класса (HLA-DR). ММСК из всех источников экспрессировали высокий уровень мезенхимальных маркеров Н-САМ (CD44), Thy-1 (CD90), CD 105. Иммунофенотип пренатальных ММСК различался только в уровне экспрессии ICAM1 -растворимой молекулы межклеточной адгезии I (CD54) и HLA-A,B,C -антигенов комплекса гистосовместимости I класса. ММСК из тимуса имели наиболее низкий уровень экспрессии антигенов МНС I (5 - 30%) по сравнению с аналогично выделенными культурами из других фетальных источников, в том числе костного мозга. Что делает этот тип клеток очень привлекательными для применения в клеточной заместительной терапии.

Подобно постнатальным ММСК, пренатальные были способны дифференцироваться, по крайней мере, в 3 различные ткани: жир, кость и хрящ. Оценивали эту способность добавлением дифференцирующих сред к культурам клеток.

Выращенные при исходной плотности 6-30 клеток\см ММСК печени, тимуса и костного мозга, обладали способностью к дифференцировке в миобласты без добавления индуцирующих агентов. Необходимым условием спонтанного миогенеза в колониях данного типа являлось временное торможение пролиферации. Миогенез выявляли в фазовом контрасте по образованию миотуб и окраской на миогенные маркеры - MyoD и миогенин. Миогенез наблюдали во всех исследуемых клеточных культурах, кроме ММСК из селезенки. Поскольку в литературе не описана спонтанная миогенная дифференцировка, мы предположили, что это связано с фетальным происхождением клеток. Чтобы проверить это предположение клонировали ММСК из костного мозга 6-ти взрослых доноров, и так же получили миогенную дифференцировку.

Известно, что одним из компонентов тимической стромы являются миоидные клетки [119]. Данная популяция имеет характеристики эпителиальных клеток (позитивные маркеры - ЕМА, цитокератины) и экспрессирует миоспецифические белки: тропонин Т, десмин и рецептор ацетилхолина (AchR) [87, 119]. Иммунофенотип миоидных клеток достаточно стабилен и выявляется как in vivo (в том числе, в биопсиях опухолей тимуса), так и в иммортализованной клеточной линии MITC [42,109,142].

Клеточные популяции, выделенные нами, по-видимому, миоидными клетками не являются, так как: 1) они позитивны в отношении маркеров мезенхимы (CD90, CD44, CD105, виментин); 2) последовательно окрашивались сначала на маркер раннего миогенеза - MyoD, а затем на маркер позднего миогенеза - миогенин; 3) требуют создания определенных условий для проявления миогенной дифференцировки. Культуры крупных стромальных клеток, которые выращивали в плотности 103 клеток в 1см2 и выше в отсутствии bFGF, миотубы не образовывали.

Примерно через месяц после начала миогенеза в тех же культурах наблюдали образование автономно сокращающихся кардиомиоцитоподобных структур. Культуры, в которых образовывались подобные структуры, позитивно окрашивались на тяжелую цепь миозина медленной мышцы и тропонин I. Таким образом, впервые показана спонтанная кардиомиогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. До сих пор преобразование ММСК в кардиомиоциты достигали только с помощью индуцирующих агентов. В статье Макино и соавторов [151] показано сокращение непосредственно миотуб, образованных дифференцировавшимися под действием 5-азацитидина ММСК. В нашей работе, при спонтанной дифференцировке ММСК, наблюдали образование клоноподобных структур, схожих с теми, которые образуются при кардиомиогенной дифференцировке эмбриональных стволовых клеток.

Несколько исследователей сообщают, что спонтанная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток, происходящая в отсутствии клеточной агрегации, может инициироваться высокой плотностью, такой же, как для клеточных агрегатов [99]. Однако, при выращивании в высокой плотности

3 2

4*10 клеток/см и больше) и в неклонированной культуре, формирование миотуб не выявляли. Возможно, это связано с тем, что при такой плотности не удавалось отобрать популяции клеток, которые способны давать миогенную дифференцировку.

Поскольку события, происходящие in vitro, не всегда коррелируют с морфорегуляторными процессами, происходящими in vivo, провели эксперименты на лабораторных животных с моделированным инфарктом миокарда, которые позволили оценить способность выделенных клеточных культур к миогенной дифференцировке in vivo.

Кардиомиоциты в миокарде взрослых особей после повреждения реплицируются незначительно для замещения дефекта. Поэтому сердце привлекательная мишень для репарации поврежденного миокарда и восстановления сердечной функции с помощью клеточной терапии. В эксперименте in vitro была показана способность к миогенной дифференцировке ММСК костного мозга, тимуса и печени. ММСК селезенки такой способностью не обладали. Исходя из этого, в эксперименте in vivo сравнили ММСК костного мозга и ММСК селезенки. Клетки, меченные бисбензимидом, пересаживали крысам через 6 дней после моделированного инфаркта миокарда, результаты оценивали через 14 дней и через 24 дня. На 6 сутки инфаркта, через 14 дней после трансплантации клеток на срезах поврежденного миокарда крыс обнаружили флуоресцентно меченные донорские клетки. Экспрессия белка специфичного для кардиомиоцитов -тропонина I была негативной. Через 24 дня после трансплантации ММСК костного мозга в бисбензимид-меченых клетках выявляли экспрессию тропонина I. Трансплантированные ММСК селезенки были негативны на тропонин I.

Таким образом, ММСК костного мозга, способные к спонтанной миогенной дифференцировке in vitro, проявляли признаки кардиодифференцировки in vivo. Однако аналогично выделенные ММСК селезенки, не показавшие способности к миогенезу in vitro, не обладали способностью к кардиомиогенной дифференцировке in vivo. Из чего следует, что, несмотря на сходный иммунофенотип и морфологию, ММСК из разных источников обладают различным дифференцировочным потенциалом. Будучи имплантированы в сердце, стволовые клетки подвергаются воздействию окружения, что приводит их к дифференциации в кардиомиоциты [133,144,14]. Эффективность этого превращения и его вероятность может зависеть от типа имплантированных стволовых клеток, а также качественных и количественных отличий в локальных условиях в момент трансплантации.

Эти сигналы, однако, могут быть недостаточно сильны для того, чтобы эффективно направлять клетки в кардиоспецифическую дифференцировку в области инфаркта [133, 144,19]. Кроме того, до сих пор не ясно, влияет ли экспансия стволовых клеток ex vivo на их способность отвечать на кардиомиогенные сигналы. Если это так, то, возможно, необходимо будет искусственно усиливать сигналы in vivo или использовать клетки, которые уже частично пошли по пути кардиодифференцировки вместо недифференцированных клеток [133,19,132]. Предифференциация in vitro недифференцированных стволовых клеток в кардиомиогенную клеточную линию была достигнута культивированием стволовых клеток вместе с кардиомиоцитами и клетками END-2 или использованием миогенных агентов, например, 5-азацитидина и других соединений [83,89]. Однако на сегодняшний день безопасность такой предифференциации не доказана, как и не известно, будет ли она негативно сказываться на способности стволовых клеток к хоумингу, делению, альтернативной дифференциации в не кардиомиоцитные типы, такие как эндотелиальные клетки, являющиеся важной составляющей нормальной сердечной ткани.

Нами была показана возможность выделения клеточной популяции, способной к кардиоспецифической дифференцировке ex vivo и in vivo без предварительной индукции специфическими средами. Мы также оценили способность наших клеток к направленной миогенной дифференцировке 5-азацитидином. В культуре ММСК селезенки, которая, как нами было показано, не обладала способностью к спонтанной миогенной дифференцировке, при обработке 5-азацитидином также не было выявлено признаков кардиомиогенной дифференцировки. ММСК костного мозга, под действием 5-азацитидина проявляли признаки кардиодифференцировки. В целом, при индукции 5-азацитидином неклонированных ММСК костного мозга мы получали менее выраженный миогенез, чем при спонтанной дифференцировке клонированных клеток. Это проявлялось в том, что на направленную дифференцировку требовалось больше времени (4 недели против 7 дней), при этом получая меньший процент дифференцировавшихся клеток (20-30% против 40-50%). Таким образом, клонирование и отбор ММСК позволяют избежать обработки культуры токсичным 5-азацитидином для получения кардиомиогенной дифференцировки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Горностаева, Светлана Николаевна, Москва

1. Большакова Г.Б. Межтканевые взаимоотношения в развитии сердца. Москва, изд-во «Наука», 1991.

2. Гансбургский А.Н., Павлов А.В. Эмбриональное развитие и гистофизиология органов детей и подростков. Ярославль, изд-во. ЯГМА, 1999,40с

3. Лурия Е.А., Чахава О.В., Фриденштейн А.Я. Происхождение фибробластоподобных клеток в культуре костного мозга. Цитология, 1996, 1: 115-119.

4. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Латыкина К.С. О фибробластоподобных клетках в культурах кроветворной ткани морских свинок. Цитология, 1970, 9: 1147-1155.

5. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В. Пролиферативные и дифференцировочные потенции скелетогенных костномозговых колониеобразующих клеток. Цитология 1986, XXYIII, 3: 341-439

6. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А. Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для восстановления сократительной функции миокарда. Российский кардиологический журнал 2003, 5

7. Aguila H.L., Weissman I.L. Hematopoietic stem cells are not direct cytotoxic targets of natural killer cells. Blood 1996; 87:1225-1231.

8. Asahara Т., Masuda H., Takahashi Т. et al. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res. 1999, 85(3):221-8.

9. Awad H.A., Butler D.L., Boivin G.P. et al. Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon. Tissue Eng 1999, 5: 267-277.

10. Badorff C, Brandes RP, Popp R. et al. Transdifferentiation of blood-derived human adult endothelial progenitor cells into functionally active cardiomyocytes. Circulation. 2003; 107(7): 1024-32.

11. Baksh D., Davies J.E., Zandstra P.W. Adult human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells are capable of adhesion-independent survival and expansion. Exp. Hematol.2003, 31: 723-732.

12. Baksh D., L. Song, R. S. Tuan. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J. Cell. Mol. Med., 2004, 8 (3): 301-316.

13. Bartunek J, Dimmeler S, Drexler H. et al. The consensus of the task force of the European Society of Cardiology concerning the clinical investigation of the use of autologous adult stem cells for repair of the heart. Eur Heart J. 2006

14. Behfar A, Zingman LV, Hodgson D. et al. Stem cell differentiation requires a paracrine pathway in the heart. FASEB J. 2002, 16(12): 1558-66.

15. Beltrami AP, Barlucchi L, Torella D. et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 2003, 114(6):763-76.

16. Bianchi G., Banfi A., Mastrogiacomo M. et al. Ex vivo enrichment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2. Exp. Cell Res.2003, 287: 98-105.

17. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells 2001, 19: 180-192.

18. Bischoff R, Heintz C. Enhancement of skeletal muscle regeneration. Dev Dyn. 1994, 201(l):41-54.

19. Bittira B, Kuang JQ, Al-Khaldi A. et al. In vitro preprogramming of marrow stromal cells for myocardial regeneration. Ann Thorac Surg. 2002; 74(4): 1154-9.

20. Blackburn C.C and Nancy R.Manley. Developing new paradigm for thymus organogenesis. Nature 2004, 4.

21. Blau HM, Brazelton TR, Weimann JM. The evolving concept of a stem cell: entity or function. Cell 2001, 105(7):829-41.

22. Blau HM. A twist of fate. Nature. 2002, 419(6906):437.

23. Bradfute SB, Gallardo TD, Nakamura T. et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100(21): 12313-8.

24. Brehm M, Strauer BE. Stem cell therapy in postinfarction chronic coronary heart disease. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 2006 Mar; 3 Suppl 1:S 101-4.

25. Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E. Growthkinetics, self-renewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cellsduring extensive subcultivation and following cryopreservation, J. CellBiochem. 1997, 64: 278-294.

26. Bruder S.P., Kurth A.A., Shea M.et al. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells, J Orthop. Res. 1998, 16: 155-162, 1998.

27. Campagnoli C., Roberts I. A., Kumar S. et al. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. Blood 2001, 98: 2396-2402.

28. Caparrelli D.J., Shake J.G., Baumgartner W.A., Conte J.V. Heterotopic abdominal heart transplantation: the answer to the donor shortage. J Heart Lung Transplant. 2001; 20(2):187-188.

29. Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 2000 Apr; 6(4):389-95.

30. Castro-Malaspina H., Gay R.E. et all. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. Blood 1980;56:289-301.

31. Charbord P., Tavian M., Humeau L., Peault B. Early ontogeny of the human marrow from long bones: an immunohistochemical study of hematopoiesis and its microenvironment. Blood. 1996; 87:4109-4119.

32. Choi S.C., Yoon J., Shim W.J. et al. 5-azacytidine induces cardiac differentiation of P19 embryonic stem cells. Exp Mol Med. 2004; 36(6):515-23.

33. Colter D.C., Class R., DiGirolamo C.M., Prockop D.J. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2000, 97: 3213-3218.

34. Cornelison D.D., Wold В J. Single-cell analysis of regulatory gene expression in quiescent and activated mouse skeletal muscle satellite cells. Dev Biol. 1997 Nov 15; 191(2):270-83.

35. De Bari C., Dell'Accio F., Vandenabeele F. et al. Skeletal muscle repair by adult human mesenchymal stem cells from synovial membrane. J Cell Biol. 2003; 160(6):909-18.

36. Deb A., Wang S., Skelding K.A., Miller D., Simper D., Caplice N. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation 2003; 107(9): 1247-9.

37. Dennis J.E., Merriam A., Awadallah A., Yoo J.U.,Johnstone В., Caplan A.I. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse. J. Bone Miner. Res., 14: 700-709, 1999.

38. Doi M., Nagano A., Nakamura Y. Molecular cloning and characterization of a novel gene, EMILIN-5, and its possible involvement in skeletal development. Biochem.Biophys. Res. Commun.2004, 313: 888-893.

39. Dormady S.P., Bashayan О., Dougherty R. et al. Immortalized multipotential mesenchymal cells and the hematopoietic microenvironment. J. Hematother. Stem Cell Res., 10: 125-140, 2001

40. Drukker M., Katz G., Urbach A. et al. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99:9864-9869.

41. Eimoto Т., Kitaoka M. et al. Thymic sarcomatoid carcinoma with skeletal muscle differentiation: report of two cases, one with cytogenetic analysis. Histopatology 2002, 40(1), 46.

42. Erices A., Conget P., Minguell J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood. Br J Haemotol. 2000; 109:235-242.

43. Etzion S., Kedes L.H., Kloner R., Leor J. Myocardial regeneration: present and future trends. Am J Cardiovasc Drugs. 2001; l(4):233-44.

44. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 1998,279: 1528-1530.

45. Forrester J.S., Price M.J., Makkar R.R. Stem cell repair of infarcted myocardium: an overview for clinicians. Circulation. 2003; 108(9): 1139-45.

46. Frangogiannis N.G., Smith C.W., Entman M.L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc. Res. 2002; 53(1):31-47.

47. Friedenstein A.J, Kulagina N.N. et all. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay. Exp.Hematology 1974; 2;83-92.

48. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Latsinik N.V. et al. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hematopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation 1974; 17: 331-40.

49. Fukuda K., Fujita J. Mesenchymal, but not hematopoietic, stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction in mice. Kidney Int. 2005 Nov; 68(5):1940-3.

50. Fukuda K. Use of adult marrow mesenchymal stem cells for regeneration of cardiomyocytes. Bone Marrow Transplant. 2003 Aug; 32 Suppl l:S25-7.

51. Galmiche M.C., Koteliansky V.E., Briere J., Herve P.,Charbord P., Stromal cells from human long-term marrow cultures are mesenchymal cells that differentiate followinga vascular smooth muscle differentiation pathway. Blood 1993, 82: 66-76.

52. Ghostine S., Carrion C., Souza L. et al. Long-term efficacy of myoblast transplantation on regional structure and function after myocardial infarction. Circulation 2002, 106(12 Suppl l):I131-6.

53. Gotherstrom C., Ringden O., Tammik C. et al. Immunologic properties of human fetal mesenchymal stem cells. American Journal of Obstetrics and Gynecology 2004, Volume 190, Issue 1, Pages 239-245.

54. Gregory C.A., Singh H., Perry A.S., Prockop D.J. The Wnt signaling inhibitor dickkopf-1 is required for reentry into the cell cycle of human adult stem cells from bone marrow. J Biol Chem. 2003; 278:28067-28078.

55. Gronthos S., Zannettino A.C., Hay S.J. et al. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J. Cell Sci. 2003, 116: 1827-1835.

56. Harada S., Rodan G.A. Control of osteoblast function and regulation of bone mass. Nature 2003, 423: 349-355.

57. Hassink R.J., Brutel de la Riviere A. et al. Transplantation of cells for cardiac repair. J. Am Coll Cardiol. 2003; 41(5):711-7.

58. Hasty P., Bradley A., Morris J. et al. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene.Nature. 1993; 364(6437):501-6.

59. Holden C. Stem cell research. Cells find destiny though merger. Science 2003; 300(5616):35.

60. Horvitz E., Le Blanc K, Dominici M. et al. Clarification of nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytoterapy 2005; 7(5):393-5.

61. Hughes S. Cardiac stem cells. J Pathol. 2002; 197:468-78.

62. Iijima Y., Nagai Т., Mizukami M. et al. Beating is necessary for transdifferentiation of skeletal muscle-derived cells into cardiomyocytes. FASEB J. 2003;17(10):1361-3.

63. In't Ancer P., Noort W., Scherjon S. et al. Mesenchymal stem sells in human second-trimaster bone marrow, liver, lung and spleen exhibit a similar immunofenotip but heterogeneous multilineage differentiation potential. Haematologica 2003, 88:845-852.

64. Isner J.M. Myocardial gene therapy .Nature 2002 Jan 10; 415(6868):234-9.

65. Izadpanah R., Joswig Т., Tsien F. et al. Characterization of multipotent mesenchymal stem cells from the bone marrow of rhesus macaques. Stem Cells Dev 2005 Aug;14(4):440-51.

66. Jain M., DerSimonian H., Brenner D. et al. Cell therapy attenuates deleterious ventricular remodeling and improves cardiac performance after myocardial infarction. Circulation 2001; 103(14): 1920-7.

67. Jenkinson E.J., Graham Anderson. Differential requirement for mesenchyme in the proliferation and maturation of thymic epithelial progenitors. The Journal of Experimental Medicine 2003, 198(2), 325-332.

68. Jiang Y., Vaessen В., Lenvik Т., Blackstad M., Reyes M., Verfaillie C.M. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp Hematol. 2002; 30:896-904.

69. Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002, 418:4149.

70. Johnstone В., Yoo J.U., Autologous mesenchymal progenitor cells in articular cartilage repair. Clin. Orthop.1999, 367: S156-S162.

71. Kadiyala S., Young R.G., Thiede M.A., Bruder S.P. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro, CellTransplant. 1997, 6: 125-134.

72. Klein А.К., Dyck J.A., Stitzel K. et al. Characterization of canine fetal lymphohematopoiesis: studies of CFU-GM, CFU-L, and CFU-F. Exp Hematol. 1983; 11:263-274.

73. Kocher A.A., Schuster M.D., Szabolcs M.J. et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nat Med. 2001 Apr; 7(4):430-6.

74. Kuznetsov S.A., Krebsbach P.H., Satomura K. et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. J. Bone Miner. Res. 1997, 12:1335-1347.

75. LaBarge M.A., Blau H.M., Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury, Cell, 111:589-601,2002.

76. Leferovich J.M., Bedelbaeva K., Samulewicz S. et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98(17):9830-5. (128)

77. Li R.K., Jia Z.Q., Weisel R.D. et al. Cardiomyocyte transplantation improves heart function. Ann Thorac Surg. 1996; 62(3):654-60.

78. Li R.K., Mickle D.A., Weisel R.D. et al. Optimal time for cardiomyocyte transplantation to maximize myocardial function after left ventricular injury. Ann Thorac Surg. 2001 Dec; 72(6): 1957-63.

79. Liechty K.W., MacKenzie T.C., Shaaban A.F. et al. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep. Nat Med. 2000 Nov; 6(11): 1282-6.

80. Madras N., Gibbs A.L., Zhou Y et al. Modeling stem cell development by retrospective analysis of gene expression profiles in single progenitorderived colonies. Stem Cells 2002, 20: 230-240.

81. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D. et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. J Cell Physiol. 1998; 176:57-66.

82. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J Clin Invest. 1999;103(5):697-705.

83. Manley N. Thymus organogenesis and molecular mechanisms of thymic epithelial cell differentiation. Seminars in immunology 2000, 12:421-428

84. McBeath R., Pirone D.M., Nelson C.M. et al. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cel 2004, 6: 483-495.

85. Mesnard-Rouiller L., Bismuth J., Wakkach A. et al. Thymic myoid cells express high levels of muscle genes. J. Nevroimmunology 2004, Vol 148, Pages 97-105.

86. Mets Т., Verdonk G. Mech. In vitro aging of human bone marrow derived stromal cells. Ageing Dev. 1981; 16:81-9.

87. Mummery С., Ward-van Oostwaard D., Doevendans P. et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation 2003 Jun 3; 107(21):2733-40.

88. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 2000; 113:1161-1166.

89. Nakahara H., Dennis J., Bruder S., Haynworth S., Caplan A.I. In vitro differentiation of bone and hyetrophic cartilage from periosteal-derived cells. Exp. Cell Res. 1994, 195:492-503.

90. Ohgushi H., Caplan A.I., Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineering, J. Biomed. Mater. Res. 1999, 48: 913-927.

91. Onnik Agbulut, Susanne Vandervelde, Nawwar Al Attar et al. Comparison of human skeletal myoblasts and bone marrow-derived CD 133+ progenitors for the repair of infarcted myocardium. J Am Coll Cardiol. 2004 Jul 21; 44(2):458-63.

92. Orkin S.H., Zon L.I. Hematopoiesis and stem cells: plasticity versus developmental heterogeneity. Nat Immunol. 2002 Apr; 3 (4):323-8.

93. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001 Apr 5; 410(6829):701-5.

94. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Aug 28; 98(18): 10344-9.

95. Osyczka A.M., Noth U., O'Connor J. et al. Multilineage differentiation of adult human bone marrow progenitor cells transduced with human papilloma virus type 16 E6/E7 genes. Calcif. Tissue Int.2002, 71: 447-458.

96. Owen M. Marrow stromal stem cells. J. Cell Sci. 1988; 10 (Suppl): S63-76.

97. Paquin J., Danalache B.A., Jankowski M. et al. Oxytocin induces differentiation of P19 embryonic stem cells to cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Jul 9;99(14):9550-5.

98. Pittenger M.F., Bradley J. Martin. Mesenchymal Stem Cells and Their Potential as Cardiac Therapeutics. Circ Res. 2004; 95:9-20.

99. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science 1999, 284: 143-147.

100. Pittenger M.F., Mackay A.M. Multipotential human mesenchymal stem cells. Graft. 2000;3:288-294.

101. Pittenger M.F., Mosca J.D., Mcintosh K.R. Human mesenchymal stem cells: progenitor cells for cartilage, bone, fat and stroma. Curr Top Microbiol Immunol. 2000;251:3-11.

102. Poulsom R., Alison M.R., Forbes S.J., Wright N.A. Adult stem cell plasticity. J. Pathol. 2002; 197(4):441-56.

103. Prockop D.J., Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues, Science 1997, 276: 71-74.

104. Prockop D.J., Gregory C.A., Spees J.L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proc Natl Acad Sci US A. 2003 Sep 30; 100 Suppl 1:11917-23.

105. Prockop D.J., Sekiya I., Colter D.C. Isolation and characterization of rapidly self-renewing stem cells from cultures of human marrow stromal cells. Cytotherapy. 2001;3:393-396.

106. Prockop DJ. Further proof of the plasticity of adult stem cells and their role in tissue repair. J Cell Biol. 2003; 60:807-809.

107. Puchtler H, Meloan SN, Branch BW, Gropp S. Myoepithelial cells in human thymus: staining, polarization and fluorescence microscopic studies. Histochemistry 1975,45:163-176.

108. Qi H, Aguiar D.J., Williams S.M., La Pean A., Pan W., Verfaillie C.M. Identification of genes responsible for osteoblast differentiation from human mesodermal progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100: 33053310.

109. Rangappa S., J.W. C. Entwistle, A.S. Wechsle, Yasha Kresh. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 2003; 126(1): 124-132.

110. Ren G, Michael LH, Entman ML, Frangogiannis NG. Morphological characteristics of the microvasculature in healing myocardial infarcts. J. Histochem Cytochem. 2002; 50(l):71-9.

111. Reyes M, Dudek A, Jahagirdar B. et al. Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. J Clin Invest. 2002; 109:337-346.

112. Reyes M, Lund T, Lenvik T, Aguiar D, Koodie L, Verfaillie CM. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood. 2001; 98:2615-2625.

113. Richards M., Huibregtse B.A., Caplan A.I. et al. Marrow-derived progenitor cell injections enhance new bone formation during distraction, J Orthop. Res, 17: 900-908, 1999.

114. Rubart M, Pasumarthi KB, Nakajima H. et al. Physiological coupling of donor and host cardiomyocytes after cellular transplantation. Circ Res. 2003; 92(11): 1217-24.

115. Sabourin LA, Rudnicki MA. The molecular regulation of myogenesis.Clin Genet. 2000; 57(l):16-25.

116. Saito T, Kuang JQ, Bittira B. et al. Xenotransplant cardiac .chimera: immune tolerance of adult stem cells. Ann Thorac Surg. 2002; 74(1): 19-24.

117. Schluep M, Willcox N, Vincent A. et al. Acetylcholine receptors in human thymic myoid cells in situ: an immunohistological study. Ann Neurol 1987, 22:212-222.

118. Sekiya I., Larson B.L., Smith J.R., Pochampally R., Cui J.G., Prockop D.J., Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality. Stem Cells 2002, 20: 530-541.

119. Shake JG, Gruber PJ, Baumgartner WA. et al. Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects. Ann Thorac Surg. 2002 Jun;73(6): 1919-25.

120. Shi W, Zakhartchenko V, Wolf E. Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer. Differentiation 2003; 71(2):91-113.

121. Shim WS, Jiang S, Wong P. et al. Ex vivo differentiation of human adult bone marrow stem cells into cardiomyocyte-like cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 324(2):481-8.

122. Song L., Tuan R.S., Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow. FASEB J.2004, 18: 980-982.

123. Sottile V, Halleux C, Bassilana F. et al. Stem cell characteristics of human trabecular bone-derived cells. Bone. 2002; 30: 699-704.

124. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Kostering M et al. Repair of infarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bone marrow cell transplantation in humans//Nat. Med., 2001; 7(4):430-6.

125. Strem BM, Hicok КС, Zhu M. et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med 2005 Sep; 54(3): 132-41.

126. Sun Y, Kiani MF, Postlethwaite AE, Weber KT. Infarct scar as living tissue. Basic Res Cardiol. 2002 Sep; 97(5):343-7.

127. Suniara R., Jenkinson E., Owen J.T. An Essential Role for Thymic Mesenchyme in Early T Cell Development. The Journal of Experimental Medicine 2000, Volume 191, Number 6, 1051-1056.

128. Tavian M, Hallais MF, Peault B. Emergence of intraembryonic hematopoietic precursors in the pre-liver human embryo. Development. 1999; 126:793-803.

129. Toma С, Pittenger MF, Cahill KS. et al. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 2002;105(l):93-8.

130. Tomita S, Li RK, Weisel RD, Mickle DA. et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation 1999 Nov 9; 100(19 Suppl):II247-56.

131. Tomita S, Mickle DA, Weisel R. et al. Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. 2002 Jun; 123(6): 1132-40.

132. Tondreau T, Lagneaux L, Dejeneffe M. et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy 2004; 6(4):372-9.

133. Van den Heuvel R, Versele SR, Schoeters GE, Vanderborght OL. Stromal stem cells (CFU-f) in yolk sac, liver, spleen and bone marrow of pre- and postnatal mice. Br J Haematol. 1987; 66:15-20.

134. Vassilopoulos G, Wang PR, Russell DW. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion. Nature. 2003; 422(6934):901-4.

135. Verfaillie CM, Schwartz R, Reyes M, Jiang Y. Unexpected potential of adult stem cells. AnnN Y Acad Sci. 2003;996:231-234.

136. Verfaillie CM. Adult stem cells: assessing the case for pluripotency. Trends Cell Biol. 2002;12:502-508.

137. Vilches С, Parham P. KIR: diverse, rapidly evolving receptorsof innate and adaptive immunity. Annu Rev Immunol 2002; 20:217-251.

138. Waddington R.J., Roberts H.C., Sugars R.V., Schonherr E. Differential roles for small leucine-rich proteoglycans in bone formation. Eur. Cell Mater.2003, 6: 12-21.

139. Wakitani S, Saito T Caplan Al. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve 1995; 18; 1417-26.

140. Wakkach A, Poea S, Chastre E, et al. Establishment of a human thymic myoid cell line. Phenotypic and functional characteristics. Am J Pathol. 1999;155:1229-1240.

141. Wang JS, Shum-Tim D, Chedrawy E, Chiu RC. The coronary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration: pathophysiologic and therapeutic implications.J Thorac Cardiovasc Surg. 2001 Oct; 122(4):699-705.

142. Wang JS, Shum-Tim D, Galipeau J. et al. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages. J Thorac Cardiovasc Surg. 2000; 120(5):999-1005.

143. Wang T, Xu Z, Jiang W, Ma A. Cell-to-cell contact induces mesenchymal stem cell to differentiate into cardiomyocyte and smooth muscle cell. Int J Cardiol 2005.

144. Wang X, Willenbring H, Akkari Y. et al. Cell fusion is the principal source of bone-marrow-derived hepatocytes. Nature 2003; 422(6934):897-901.

145. Wilkinson В., J. J. T. Owen and E. J. Jenkinson. Factors Regulating Stem Cell Recruitment to the Fetal Thymus. The J. of Immunology, 1999, 162:3873-3881.

146. Wu GD, Nolta JA, Jin YS. et al. Migration of mesenchymal stem cells to heart allografts during chronic rejection. Transplantation 2003; 75(5):679-85.

147. Wurmser AE, Gage FH. Stem cells: cell fusion causes confusion. Nature 2002; 416(6880):485-7.

148. Yablonka-Reuveni Z, Rivera AJ. Temporal expression of regulatory and structural muscle proteins during myogenesis of satellite cells on isolated adult rat fibers. Dev Biol. 1994 Aug; 164(2):588-603.

149. Yaghoobi MM, Mowla SJ, Tiraihi T. Nucleostemin, a coordinator of self-renewal, is expressed in rat marrow stromal cells and turns off after induction of neural differentiation. Neurosci Lett 2005 Aug 31.

150. Young R.G., Butler D.L., Weber W. et al. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair. J. Orthop.Res.1998, 16: 406-413.

151. Zhang M, Methot D, Poppa V. et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. J Mol Cell Cardiol. 2001 May; 33(5):907-21.

152. Zhao L.R., Duan W.M., Reyes M., Keene C.D., Verfaillie C.M., Low W.C. Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats. Exp. Neurol.2002, 174: 11-20.

153. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 2002; 13:4279-4295.

154. Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G, et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals, Arthritis Res. 2000, 2: 477-488.

Информация о работе

Горностаева, Светлана Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.25

Диссертация

Миогенная дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro и in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы