Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Защита эндотелиальных клеток сосудов челока от повреждения при ишемии in vitro: роль белка теплового шока HSP27

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Защита эндотелиальных клеток сосудов челока от повреждения при ишемии in vitro: роль белка теплового шока HSP27"

V' г)

ЛОКТИОНОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

ЗАЩИТА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА ОТ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПРИ ИШЕМИИ IN VITRO: РОЛЬ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP27

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛОКТИОНОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

ЗАЩИТА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА ОТ ПОВРЕЖДЕНИЯ ПРИ ИШЕМИИ IN VITRO: РОЛЬ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА HSP27

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии НИИ экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук Л.Е. Кабаков

доктор медицинских наук,

профессор

Э.М. Тарарак

доктор медицинских наук И.Ю. Малышев

кандидат биологических наук В.П. Ширинский

Российски й Государствен н ьгй Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова

Защита состоится 16 декабря 1998 года в 11.00 на заседании диссертационного совета К 074.22.02 в РК НПК МЗ РФ (Москва, 121552, 3-я Черепковская ул., д. 15 а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ

Автореферат разослан 12 ноября 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Т.И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Ишемия - состояние, при котором из-за спазма или тромбоза сосудов кровоснабжение части органа оказывается недостаточным для обеспечения метаболизма, является причиной таких патологий как инфаркт миокарда и инсульт головного мозга. Известно, что клетки млекопитающих способны адаптироваться к ишемическому состоянию. Предобработка клеток и органов коротким ишемическим стрессом, тепловым шоком или гипоксией [Currie et al., 1988; 1990; 1993; Меерсон и др., 1990; Donnelly 1992; Yellon 1992; Marber 1993] уменьшает их чувствительность к повреждающему действию последующей ишемии. Таким образом, существует реальная возможность, используя внутренние ресурсы клеток, сохранить их жизнеспособность в течение острого ишемического приступа. В связи с этим особую актуальность приобретает раскрытие эндогенных механизмов клеточной защиты, использование которых позволило бы разработать методы уменьшения структурных и функциональных повреждений клеток в период недостаточного кровоснабжения органа.

Эндотелий является избирательно проницаемым барьером между кровью и подлежащими тканями. Известно, что ишемия вызывает повышение проницаемости эндотелиального монослоя для макромолекул и клеток крови [Sumergen and Rovetto, 1987; Svendsen et al., 1991], что, в свою очередь, приводит к отеку и тромбозу сосудов и усугубляет ишемическое повреждение органов. Тем не менее, исследований эндогенных механизмов защиты эндотелиальных клеток от ишемии проводится очень мало. Таким образом, выбор эндотелиальных клеток сосудов человека в качестве объекта исследования является актуальным.

Исследования последних лет, направленные на выявление эндогенных механизмов ослабления ишемического стресса показали участие стресс-белков или белков теплового шока (HSPs) в защите клеток от гибели при ишемии/реперфузии. Так гиперэкспрессия HSP70, HSP27, альфа В-кристаллина и совместная гиперэкспрессия HSP60 и HSP10 способны защитить клетки от ишемического повреждения [Marber et al., 1995; Plumier et al., 1995; Martin et al.,1997; Lau et al., 1996]. Известно также, что клетки, подвергшиеся тепловому шоку, после определенного периода восстановления оказываются менее чувствительными к повреждающему действию ишемии [Currie et al., 1988; 1990; 1993; Donnelly et al., 1992; Yellon, 1992; Marber et al., 1993]. Период защиты тепловым прекондиционированием совпадает со временем накопления в клетках индуцибельной формы HSP70 (HSP70Í), а также ряда других HSPs. Таким образом, феномен такой перекрестной толерантности, по крайней мере частично, может быть обусловлен индукцией HSP генов. Однако точный молекулярный механизм защиты клеток стресс-белками от ишемического повреждения остается не ясным.

Одним из существенных повреждений клеток ишемическим стрессом является разрушение актинового цитоскелета [Armstrong and Gannote, 1993]. В то же время, было показано, что стресс-белок HSP27 влияет как на полимеризацию актина, так и на его резистентность к различным стрессам, причем эти функции HSP27 определяются его уровнем экспрессии, степенью фосфорилирования и структурной организацией. Нефосфорилироваиные мономеры HSP27 способны кзпировать актиновые филаменты [Benndorf et al., 1994], а гиперэкспрессия мутантного неспособного фосфорилироваться HSP27 коррелирует с пониженным содержанием кортикального F-актина в трансфицированных клетках [Lavoie et al., 1993а; Piotrowicz et al., 1997]. С другой стороны, повышенная экспрессия фосфорилируемого HSP27 снижает чувствительность клеток к повреждающему действию теплового шока [Lavoie et al., 1993b; 1995], окислителей [Huot et al., 1995; 1996] и цитохалазина D [Lavoie et al., 1993a; Guay et al., 1997]. Исходя из этого, а также принимая во внимание, что гиперэкспрессия HSP27 защищает трансфицированные кардиомиоциты от гибели при истощении АТФ [Martin et al., 1997], нам представлялось актуальным проверить способен ли HSP27 защищать актиновые филаменты от разрушения ишемическим стрессом, а также выяснить зависит ли осуществление этой функции HSP27 от степени его фосфорилирования. Решение этой задачи приблизит понимание эндогенных механизмов защиты клеток от повреждения при ишемии, а также позволит указать возможные пути искусственной адаптации тканей и органов к ишемическорлу состоянию.

Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы является исследование роли HSP27 в механизмах защиты ЭК от ишемического повреждения. 8 работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную in vitro модель ишемического повреждения ЭК сосудов человека.

2. Показать, как реагирует HSP27 в ЭК на имитирующий ишемию метаболический стресс.

3. Установить связано ли изменение степени фосфорилирования, структурной организации и локализации HSP27 с состоянием актинового цитоскелета в ЭК при экспериментальной ишемии in vitro.

4. Исследовать, как влияет предварительное накопление HSP27 в ЭК на их устойчивость к ишемическому повреждению.

Научная новизна и практическая значимость работы. Разработана экспериментальная модель ишемического повреждения ЭК сосудов человека /л vitro.

Впервые показано влияние истощения АТФ на изоформный спектр, структурную организации и локализацию HSP27 в клетках.

Обнаружено существование раннего периода защиты ЭК тепловым шоком,

характеризующегося нормальной морфологией клеток и целостностью эндотелиального монослоя, а также сохранением пула F-актина при ишемическом стрессе, проведенном в первые три часа после теплового шока. Исследование возможного механизма защитного эффекта тепловой предобработки клеток выявило участие в нем тирозиновых киназ.

Для ЭК впервые показано, что тепловой шок с последующим периодом восстановления делает их толерантными к ишемическому стрессу. Показано, что феномен позднего периода защиты, по крайней мере, частично, обусловлен накоплением индуцибельных HSPs в клетках. Установлено, что для приобретения эндотелиальными клетками толерантности к ишемическому повреждению гиперэкспрессии одного только индуцибельного HSP70 не достаточно.

Обнаружено, что ингибиторы фосфатазы 2А, отвечающей за дефосфорилирование HSP27 in vivo, Na3V04, кантаридин и окадаиковая кислота защищают ЭК от ишемического стресса.

Показано существование положительной корреляции между разрушением актинового цитоскелета ЭК и дефосфорилированием/грануляцией HSP27. Эти данные позволяют предполагать, что сохранение содержания фосфорилированного HSP27 выше некоего порогового уровня защищает актиновые микрофиламенты от разрушения при истощении АТФ.

Результаты проведенных исследований могут быть в дальнейшем использованы в медицине, так как указывают две стратегии адаптации клеток к ишемическому состоянию: 1) путем ингибирования дефосфорилирования HSP27 ингибиторами протеинфосфатазы 2А непосредственно во время ишемического состояния (при инфарктах, инсультах, операциях по трансплантации), 2) путем повышения уровня HSPs тепловым прекондиционированием перед ишемическим стрессом (например, для повышения жизнеспособности пересаживаемых органов).

Апробация работы: Результаты работы были представлены на 5-ом Всемирном конгрессе по сердечной недостаточности (Вашингтон, май 1997), на XI Международном симпозиуме по атеросклерозу (Париж, октябрь 1997), на Кистоунском симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии (Lake Tahoe, Калифорния, март 1998), на симпозиуме "Сосудистая биология' 98" (Сан Франциско, апрель 1998) и конференции "Molecular chaperones and heat shock response" (Cold Spring Harbor, май 1993). Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 131

странице машинописного текста, содержит 34 рисунка и 1 таблицу. Список литературы включает 294 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Все эксперименты были поставлены на культивируемых ЭК 0-3 пассажей, полученных из аорты и пупочной вены человека.

Выделение, культивирование и идентификация в культуре эндотелиальных клеток сосудов человека. Выделение ЭК из пупочной вены человека осуществляли по методу M.Gimbrone (1976) в модификации, описанной А.Антоновым и др. (1981). Выделение ЭК из аорты человека проводили по методу A.Antonov et al. (1986). Для этого использовался аутопсийный материал - грудные отделы аорт человека, полученные не позднее шести часов после смерти. В обоих случаях использовался 0,15% раствор диспазы на среде 199. После инкубации с ферментом, отмывания и осаждения с помощью центрифуги клетки высаживали с плотностью 3,5x104 клеток/см2 на чашки Петри, покрытые 0,2% раствором желатина Культивирование ЭК сосудов человека проводили в среде роста 199 , содержащей 20 мМ HEPES, 2мМ L-глутамин, 1мМ пируват натрия, пенициллин (50 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мп), 10% эмбриональной бычьей сыворотки, фактор роста ЭК (ECGF) (200 мкг/мл) и гепарин (100 мкг/мл) в инкубаторе (37°С, 5% С02,). Идентификацию ЭК в культуре проводили при помощи иммунофлуоресцентного выявления маркера ЭК - VIII фактора свертывания крови (фактора фон Виллебранда) с использованием поликлональных антител (Sigma). Чистота популяции ЭК в первичной культуре составляла 94-98%.

Имитирующий ишемию метаболический стресс. Для имитации ишемического состояния, характеризующегося нехваткой глюкозы, гипоксией и истощением АТФ, клетки инкубировали при 37°С в среде DMEM без глюкозы с добавлением 3% эмбриональной бычьей сыворотки в присутствии 20 мкМ карбонилцианид .т>-хлорофенилгидразона (разобщителя окислительного фосфорилироеания) или 20 мкМ ротенона (ингибитора дыхательной цепи митохондрий).

Предобработки клеток. Тепловой шок проводили при 45° С в течение 10 мин. Для этого герметично закрытые культурапьные чашки погружали в водяную баню. Последующее восстановление клеток проводили при обычных условиях культивирования после смены среды в культурах. Для ингибирования фосфатаз in vivo культуры клеток инкубировали с 1мкМ окадаиковой кислотой, с 0,2 мкМ кантаридином или со 100 мкМ Na3V04 в течение 20 минут перед проведением ишемического стресса и во время последнего. Перед проведением экспериментальной ишемии инкубации проводили в среде роста, во время ишемического стресса ингибиторы вносили вместе с СССР в среде без глюкозы. Для активации протеинкиназ. увеличивающих фосфорилирование

HSP27 клетки инкубировали с тромбином (2 ед/мл) или гистамином (20 мкг/мл) в среде роста в течение 20 минут непосредственно перед инкубацией с разобщителем. Специфический ингибитор р38 MAP киназы SB203580 вносили в среде роста за час до проведения теплового шока в концентрации 25 мкМ. Для подавления индуцированного тепловым шоком синтеза HSPs при смене среды после тепловой предобработки вносили 50 мкМ циклогексимид или 30 мкМ кверцетин. Селективное повышение уровня HSP70 в ЭК достигалось инкубацией клеток с гербимицином А (2 мкл на 1 мл полной среды роста) в течение ночи, а также вирусной трансфекцией (инкубация с вирусной конструкцией проводилась в среде роста в течение 24-39 часов).

Измерение уровня АТФ в клетках. Определение уровня АТФ в культивируемых ЭК проводили при помощи люциферин-люциферазного метода (Kabakov and Gabai, 1995). Определение содержания АТФ в пробах проводили на люминометре (Wallac 1251, Финляндия), используя люциферин-люциферазный кит (Calbiochem). Измерение внутриклеточного Саг*. Измерение концентрации внутриклеточного Ca2* производилось по методу, описанному для ЭК аорты свиньи, с использованием флуоресцентного индикатора Ca2* фура-2 [Kühne et al., 1993]. Клетки сажали на покровные стекла и по достижении культурой конфлуентного состояния загружали индикатором. Образцы анализировали на спектрофлуориметре (Shimadzu, Japan) (ex -340-380 нм, em-510 нм).

Флуоресцентная микроскопия. Иммунофлуоресцентное исследование проводилось на клетках, растущих на покровных стеклах. После фиксации культур смесью 3,7% формальдегида и 0,1% Тритона Х-100 на PBS в течение 7 минут их обрабатывали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина на PBS. Затем клетки инкубировали с первыми антителами к HSP27 в течение 60 минут при комнатной температуре и со вторыми антителами, коньюгированными с техасским красным. Флуоресцентное выявление F-актина производили с использованием фаллоидина, связанного с ТРИТЦ или ФИТЦ. Препараты заключали в смесь глицерин/PBS (1:1), исследовали и фотографировали на флуоресцентном микроскопе (Opton III, Karl Zeiss, Germany). Определение концентрации F-актина в ЭК на спектрофлуориметре. Культуры клеток выращивали на чашках с диаметром 35 см2. После экспериментов клетки фиксировали смесью 3,7% формальдегида и 0,1% Тритона Х-100 на PBS в течение 7 минут, отмывали буфером и инкубировали о ФИТЦ-фаллоидином в течение часа при комнатной температуре. Затем клетки трижды отмывали, механически снимали с пластика в 1 мл буфера, переносили в кюветы и анализировали на спектрофлуориметре (Shimadzu, Japan) (ex - 494 нм, ет-518нм).

Клеточное фракционирование неионным детергентом Тритоном Х-100. Клетки,

растущие на культуральных чашках с диаметром 35 мм лизировали на холоду в 100 мкл фосфатного буфера (PBS, рН 7,4), содержащего 1% Triton Х-100 и 1 мМ фенилметилсульфонилфлуорид. Клеточные лизаты центрифугировали при 4°С на 12000 g в течение 10 минут. Супернатант отбирали, вносили буфер для электрофореза, прогревали при 95°С в течение 3 минут и замораживали. Осадок отмывали в лизирующем буфере, центрифугировали, как описано выше, сливали супернатант, в осадок добавляли буфер для электрофореза, пипетировали, прогревали при 95°С до растворения осадка и замораживали. Далее ставили электрофорез и иммуноблоттинг с антителами к HSP27.

Электрофорез и иммуноблоттинг. SDS-электрофорез проводили в системе Laemmli с 4% концентрирующим и 12,5% разделяющим полиакриламидными гелями. Иммуноблоттинг ставили с анти-НЗР27 антителами кролика или aHTn-HSP70i мыши. После отмывок блоты инкубировали с анти-кроличьими IgG или анти-мышиными IgG, коньюгированными с пероксидазой. Для визуализации блоты обрабатывали диаминобензидином (ДАБ) или применяли ECL-метод. Для количественного определения HSPs в пробах блоты сканировали.

Анализ изоформного спектра HSP27. Клетки лизировали в 100 мкл раствора, содержащего 8 М мочевину, 1% нонидет Р40, 2% бетта-меркаптоэтанол и 100 мкМ ортованадат №. Изозлектрическое фокуссирование (ИЭФ) образцов проводилось в трубочках с 5% полиакриламидным гелем, содержащим 8 М мочевину, 2% нонидет Р-40 и 2% амфолины (рН 5-7). ИЭФ проводилось при 500 V в течение ночи и в течение 1 часа при 1000 V. Затем, осуществлялся перенос белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр [Zhou et al. 1993] и ставился иммуноблоттинг с антителами к HSP27. Статистическая обработка результатов. Все данные были получены в нескольких независимых экспериментах на культурах клеток из аорты и пупочной вены человека. При количественном определении содержания АТФ, Са2\ F-актина, белков HSP27 и HSP70 (при сканировании бпотов) брали среднее значение + стандартная ошибка среднего. Достоверность различия между средними значениями устанавливалась по непарному (-критерию Стъюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Архитектура актинового цитоскелета, распределение и статус HSP27 в культивируемых зндотелиальных клетках сосудов человека.

ЭК кровеносных сосудов образуют монослой, выполняющий функцию селективного барьера между кровью и подлежащими тканями, осуществление которой контролируется их актиновым цитоскелетом [Gotlieb et al., 1991; Garcia et al., 1995). Известно, что in vivo актиновый цитоскелет ЭК артерий человека представлен в виде

кольца микрофиламентов, окаймляющих клетку по периметру (кортикальный F-актин) и расположенных параллельно. направлению кровотока, закрепленных на мембране стресс-фибрилл [Drenckhahn and Ness, 1997]. В наших экспериментах в контрольных культивируемых ЭК строение актинового цитоскелета соответствовало таковому in vivo: окрашивание фаппоидином, коньюгированным с флуоресцентным красителем ТРИТЦ, выявляло одновременное присутствие кортикального F-актина и стресс-фибрилл.

Иммунофлуоресцентное выявление HSP27 в ЭК показало диффузное распределение белка в ядре и цитоплазме, а также образование им многочисленных мелких гранул в эндоплазме. При экстракции клеток неионным детергентом Тритоном X-100 основное количество HSP27 выявлялось в детергент-растворимой фракции и незначительная часть HSP27 - в детергент-нерастворимой фракции. Анализ изоформного спектра HSP27 при помощи ИЭФ/иммуноблоттинга показал присутствие в клетках четырех изоформ, что соответствует описанным в литературе данным [Lavoie et al. 1995]. В нестрессированных клетках доля фосфорилированных изоформ HSP27 составляла более 50% (рис.4).

Блокада энергетического метаболизма как in vitro модель ишемического повреждения эндотелия сосудов человека.

Все проведенные до настоящего времени работы по имитации ишемического повреждения эндотелия in vitro были выполнены на ЭК животных и не проводились на эндотелии сосудов человека. Используемые модели ишемического повреждения эндотелия in vitro основаны на снижении уровня АТФ в клетках путем ингибирования окислительного фосфорилирования при одновременном подавлении гликолиза. [Watanabe et al., 1991; Hinshavv et al., 1993; Kühne et al., 1993]. В нашей модели мы использовали карбонилцианид /л-хлорфенилгидразон (разобщитель окислительного фосфорилирования) или ротенон (ингибитор дыхательной цепи митохондрий), добавляя их в инкубационную среду без глюкозы. В отличие от KCN или азида выбранные нами ингибиторы энергетического метаболизма высоко специфичны и сами по себе не вызывали сильных и необратимых повреждений клеток. Использование же двух ингибиторов энергетического метаболизма с различным механизмом действия позволяет исключить ситуацию, когда обнаруживаемые эффекты обусловлены специфическим действием одного из них. В нашей модели мы не использовали 2-деоксиглкжозу, так как происходящее в результате эндогенного гликолиза накопление лактата вносит дополнительный вклад в стресс-индуцируемый ацидоз, что более адекватно имитирует ишемическое повреждение in vivo [Kabakov and Gabai, 1997].

В наших экспериментах на культивируемых ЭК при имитирующем ишемию стрессе

происходило довольно быстрое падение АТФ. Так через 20 минут действия 20 мкМ СССР уровень АТФ в ЭК снижался на 65% и составлял примерно 5% от исходного через два часа (рис. 1). При этом падение уровня АТФ было обратимым, он быстро возрастал почти до контрольного при добавлении в инкубационную среду глюкозы. Истощение клеточного АТФ под действием метаболических ингибиторов, так же как при ишемии in vivo, вызывало нарушение ионного баланса ЭК, в частности, рост внутриклеточного свободного Ca2*. Через 2,5 часа имитирующего ишемию стресса содержание свободного Ca2* в цитозоле повышалось почти в десять раз (рис. 2). Наши результаты согласуются С полученными ранее Hinshaw et al. (1988; 1993) и Kühne et al. (1993) в моделях ишемического повреждения in vitro на ЭК сосудов животных.

100

е

I-<

р

. х

©

m

о £

контроль ранняя защита поздняя защита

2.5 h

Начальный Время имитирующего ишемию метаболического уровень стресса

Рис. 1. Изменения уровня АТФ в ЭК при имитирующем ишемию метаболическом стрессе.

800 -

600 -

400 -

200

dm

контроль ранняя защита поздняя защита

Начальная Время имитирующего ишемию метаболического точка стресса

Рис. 2. Изменения содержания внутриклеточного Ca метаболическом стрессе.

в ЭК при имитирующем ишемию

Изменения морфологии, актиноеого цитоскелета и статуса HSP27 в ЭК сосудов человека, подвергнутых ишемическому стрессу in vitro.

Истощение клеточного АТФ в ЭК в течение 1,5-2 часов вызывало разрушение актинового цитоскелета: разрыв стресс-фибрилл с образованием более коротких фрагментов и дальнейшую деградацию последних, а также образование агрегатов F-актина (рис. 5). Количественный анализ содержания F-актина показал его достоверное снижение за это время на 40% (рис. 3). Полученные нами результаты согласуются с многочисленными литературными данными о влиянии истощения АТФ на целостность актинового цитоскелета в культивируемых клетках, в частности, в ЭК [Hirishaw et at., 1988; 1993; Watanabe et al., 1991; Kühne et al., 1993], и отражают характерное для ишемии in vivo разрушение микрофиламентов [Ganóte and Armstrong, 1993].

Из литературы известно, что разрушение актинового цитоскелета в ЭК приводит к ретракции цитоплазмы, что, в свою очередь, нарушает барьерные свойства эндотелиального монослоя, делает его тромбогенным и повышает его проницаемость для макромолекул и клеток крови [Gotlieb et al., 1991; Watanabe et al., 1991; Garcia et al., 1995]. В наших экспериментах при имитирующем ишемию стрессе также происходили видимые нарушения клеточной морфологии. Наблюдалась ретракция цитоплазмы ЭК, края клеток становились фестончатыми, что приводило к дезинтеграции эндотелиального монослоя. Через 2,5-3 часа истощения АТФ клетки начинали ошариваться и отрываться от подложки.

Нами впервые показано, что истощение клеточного АТФ влияет на статус конститутивного HSP27. В наших экспериментах при имитирующем ишемию стрессе происходило дефосфорилирование HSP27, а также его перераспределение в клетках. В лизатах клеток, подвергавшихся действию метаболических ингибиторов в течение 2 часов, методом ИЭФ/иммуноблоттинга выявлялось исчезновение ди- и трифосфорилированных cud- изоформ, уменьшение монофосфорилированной Ь-изоформы и накопление нефосфорилированной а-изоформы HSP27, а доля фосфорилированных изоформ HSP27 снижалась до 20% (рис. 4). Иммунофлуоресцентное исследование показало изменение локализации и структурной организации HSP27 в ЭК при истощении АТФ: перераспределение HSP27 из цитоплазмы

в ядро с образованием крупных сферической формы гранул (рис. 6). %

120

12 3 4

Рис. 3. Количественная оценка содержания F-актина в ЭК. Подпись см. в рис. 4 .

%

80 60 АО 20 0

Рис. 4. Изменение уровня фосфорилированного HSP27 в ЭК.

□

ЭК до истощения АТФ

ЭК через 2 часа истощения АТФ

1 - нетолерантные ЭК

2 - ранняя защита

3 - поздняя защита

4 - ЭК, предобработанные кантарндином

Гранулы HSP27 начинали появляться через 60-90 минут имитирующего ишемию стресса, и к 2 часам воздействия они обнаруживались в 95% ядер (от 3-5 до 10 гранул в ядре). Грануляция HSP27 была обратимой: после восстановления ЭК в обычной среде роста в течение 1,5-2 часов гранулы исчезали. Феномен образования Н5Р27-содержащих гранул в ядрах энергетически истощенных клеток описан нами впервые. Так как внутриядерная грануляция HSP27 не наблюдалась при каких-либо других состояниях, ее можно считать характерным in situ маркером длительного истощения АТФ в ЭК. Результаты иммунофлуоресцентного выявления HSP27 хорошо коррелируют с данными, полученными при фракционировании ЭК неионным детергентом Тритоном Х-100: в период грануляции происходило увеличение количества HSP27 в Тритон-нерастворимой фракции и соответствующее уменьшение в Тритон-растворимой фракции.

Известно, что HSP27 склонен образовывать в клетках большие олигомерные комплексы и мультимерные частицы (гранулы) [Arrigo et al.,1994; Benndorf et al., 1994] Грануляция HSP27 in vivo является результатом его дефосфорилирования [Benndorf et al., 1994], и наоборот, фосфорилирование HSP27 приводит к диссоциации его мультимерных комплексов [Kato et al., 1994; Lavoie et al., 1995]. Таким образом, внутриядерная грануляция эндотелиального. HSP27 может быть результатом его дефосфорилирования во время энергетического голодания. Показано, что свойства HSP27 как молекулярного шаперона не зависят от его фосфорилирования [Knauf et al.,

1993; 1994]. Считается также, что в шаперонинге он участвует совместно с HSP70, удерживая на себе денатурированный белок и предоставляя его HSP70 для дальнейшей укладки [Ehrnsperger and Buchner, 1997], причем предполагается, что для осуществления этой функции HSP27 должен присутствовать в виде мультимерных комплексов. В работе A.Kabakov и V.Gabai (1997) было показано перераспределение цитоплазматического HSP70 в ядро в энергетически истощенных ЭК. Эти процессы могут быть существенными для восстановления клеток после ишемии, когда необходимый уровень АТФ позволит нормально функционировать HSP70. В работах последних лет показано также, что мультимерные комплексы нефосфорилированного HSP25 защищают клетки от окислительного стресса [Mehlen et al., 1997; Preville et al., 1998]. Поскольку окислительный стресс следует за ишемией при реперфузии, гранулы HSP27 в ядрах ЭК могут выполнять защитную функцию в этот период.

Ранние эффекты теплового шока но HSP27, актин и устойчивость эндотелиальных клеток к ишемии in vitro.

Ранее было установлено, что тепловой шок вызывает фосфорилирование HSP27 [Arrigo and Landry, 1994; Rouse et al., 1994; Van den IJssel et al., 1998]. Поэтому, мы использовали тепловую предобработку клеток, чтобы выяснить как повлияет предварительное повышение фосфорилирования HSP27 на поведение актинового цитоскелета при последующем ишемическом стрессе.

Для оценки повреждения клеток тепловым шоком ЭК после прогрева при 43, 44 и 45°С в течение различных отрезков времени помещали в обычные условия культивирования (после смены среды роста) и через 6 и 16 часов подсчитывали количество открепившихся клеток. Результаты этого опыта показали, что нагревание при 45°С в течение 10 мин не вызывает открепления и гибели клеток при последующем восстановлении. Эти условия теплового шока были использованы нами в дальнейших экспериментах.

Обработка ЭК тепловым шоком (45°С, 10 мин) сопровождалась незначительными колебаниями уровня АТФ (рис. 1) и некоторым ростом внутриклеточного свободного Ca2* (рис. 2). Короткое тепловое воздействие не вызывало изменений морфологии ЭК и нарушения целостности зндотепиального мокослоя, а окрашивание F-актина фаллоидином, коньюгированным с флуоресцентным красителем показало сохранение нормальной архитектуры акгиновых филаментов. При более длительном нагревании клеток структура микрофиламентов нарушалась.

Подвергнув ЭК нагреванию непосредственно перед ишемическим стрессом мы обнаружили, что такая предобработка делала их толерантными к последующему

истощению АТФ. Феномен существования раннего периода защиты тепловым шоком описан нами впервые. Он характеризуется предотвращением ретракции цитоплазмы клеток и сохранением целостности эндотелиального монослоя при ишемическом стрессе, проведенном в первые три часа после прогрева.

ДО ИСТОЩЕНИЯ АТФ

Нетолерантные Ранняя Генистеин, ЗВ203580, ЭК защита тепловой шок тепловой

шок

ЧЕРЕЗ 1 ЧАСА ИСТОЩЕНИЯ ЛТФ

Поздняя защита

■ > .

) \

I \

Ингибиторы фосфатаз

Рис. 5. Поведение актинового цитоскелета в контрольных и предобработанных ЭК при ишемии ¡п \zitro.

ЭК, имеющая нормальную * ' морфологию и стресс-фибриллы ''"С,

ЭК с нормальной морфологией и реорганизованным цитоскелетом

Ретракция цитоплазмы ЭК и разрушение цитоскелета

Защита ЭК, наблюдавшаяся на клеточном уровне, сопровождалась существенными изменениями в организации актинового цитоскелета: в течение 30 мин ишемического стресса в клетках происходило усиление кольца кортикальных актиновых филаментов при одновременном исчезновении стресс-фибрилл. Деградация стресс-

фибрилл не сопровождалась их фрагментацией и агрегацией F-актина, характерными для ищем.ического повреждения нетолерантных ЭК. Новая организация микрофиламентов сохранялась неизменной на протяжении 2-3 часов метаболического стресса. При этом содержание F-актина в толерантных ЭК было выше, чем в нетолерантных клетках (рис. 5).

Известно, что активация тирозиновых киназ в клетках линии ЗТЗ приводит к диссоциации стресс-фибрилл и увеличению кортикального F-актина [Ridley and Hall, 1992; Nobes and Hall, 1995]. Также показано, что а культивируемых ЭК аорты человека после гипоксии происходит сходная реорганизация актинового цитоскелета, которая может быть подавлена предобработкой клеток ингибитором тирозиновых киназ генистеином {Crawford et al. 1996]. В наших экспериментах предобработка ЭК 200 мкМ генистеином в течение 1 часа перед тепловым шоком частично ингибировала перестройку микрофиламентов при ишемическом стрессе, что сопровождалось ретракцией цитоплазмы и нарушением целостности эндотелиального монослоя (рис.5).

Иммунофлуоресцентный анализ выявил, что при снижении уровня АТФ в предобработанных тепловым шоком клетках, в отличие от контрольных ЭК, не происходило образование гранул HSP27 в ядрах (рис. 6). В то же время, в толерантных ЭК дефосфорилирование. HSP27 происходило значительно медленнее (рис. 4) и к 2 часам ишемического стресса примерно половина белка еще присутствовала в виде фосфорилированных Ь- и с-изоформ.

Феномен ранней защиты не был обусловлен замедлением падения клеточного АТФ (рис. 1) и роста внутриклеточного Са2+ в предварительно прогретых клетках (рис. 2). Отсутствие грануляции HSP27 и защита актинового цитоскелета при ишемическом стрессе в толерантных ЭК могут быть результатом сохранения пула фосфорилированного HSP27 в этих клетках.

Ранее было показано, что тепловой шок запускает MAP киназный каскад, приводящий к фосфорилированию HSP27 [Zhou et al., 1993; Rouse et al., 1994; Engel et al., 1995]. Так как в наших экспериментах тепловая обработка клеток также приводила к временному усилению фосфорилирования HSP27 (рис. 4), мы попытались предотвратить раннюю защиту, селективно ингибируя эту модификацию HSP27. Для этого мы использовали специфический ингибитор р38 MAP киназы, SB203580, который, как показано на культуре ЭК аорты быка, в концентрации 25 мкМ блокирует опосредованную р35 MAP киназой активацию МАРКАР киназы 2/3, что предотвращает индуцированное окислительным стрессом фосфорилирование HSP27 [Huot et al., 1997]. В наших экспериментах 25 мкМ SB203580 блокировал индуцированное тепловым шоком фосфорилирование HSP27, но не отменял ранний защитный эффект тепловой

предобработки: после его добавления к прогретым клеткам при энергетическом истощении наблюдалось сохранение нормальной морфологии, перестройка актинового цитоскелета и отмена грануляции НБР27 также, как и в прогретых культурах без ингибитора (рис. 5,6).

ДО ИСТОЩЕНИЯ АТФ

Нетолерантные ЭК

Ранняя защита

SB203580,

тепловой

шок

Поздняя защита

Ингибиторы фосфатаз

ЧЕРЕЗ 2 ЧАСА ИСТОЩЕНИЯ АТФ

- ' -

~ i S

•f V'

Рис. 6. Распределение HSP27 в контрольных и предобработанных ЭК при ишемии in vitro.

Диффузное распределение HSP27 в цитоплазме и ядре ЭК

л v Перераспределение HSP27 Мз /* цитоплазмы в ядро с v w образованием гранул

Кроме того, предобработка клеток тромбином или гистамином, которые,, как известно, увеличивают фосфорилирование HSP27 [Mendelsohn et al., 1991; Santell et.al., 1992], не предотвращали образование гранул этого белка в ядрах и разрушения актинового цитоскелета через 2 часа истощения АТФ. Таким образом, ранняя защита не связана с вызываемым нагреванием гиперфосфорилированием HSP27, но может быть обусловлена подавлением его дефосфорилирования во время ишемического стресса.

Индуцированная тепловым шоком "поздняя" толерантность эндотелиальных клеток к ишемии in vitro.

Ранее было показано, что тепловое прекондиционирование делает клетки более устойчивыми к последующему ишемическому повреждению. Такая перекрестная толерантность показана для многих клеток и тканей и может быть, по крайней мере частично, опосредована накоплением HSPs. Установлено, что HSP70 участвует в защите кардиомиоцитов [Hutter et al., 1994; M est til et al., 1994} от ишемического стресса. Известно также, что гиперэкспрессия HSP27 защищает трансфицированные крысиные кардиомиоциты от летального ишемического повреждения [Martin et al., 1997]. С другой стороны, повышенная экспрессия HSP27 предотвращает разрушение актиновых микрофиламентов при тепловом шоке, окислительном стрессе и действии цитохалазина D [Lavoie et al., 1993а; 1995; Huot et al., 1995; 1996; Guay et al., 1997]. В нашей работе мы использовали тепловое прекондиционирование, чтобы выяснить: 1) защищает ли тепловой шок (с последующим восстановлением) ЭК сосудов человека при ишемии in vitro', 2) как повлияет накопление HSPs в предварительно прогретых клетках на стабильность актинового цитоскелета при ишемии in vitro.

Предобработка ЭК тепловым шоком (45°С, 10 мин) с последующим восстановлением в течение 12-18 ч в полной среде роста при обычных условиях культивирования не вызывала изменений в клеточной морфологии, архитектуре актинового цитоскелета, в распределении и фосфорилировании HSP27. Адаптированные таким образом клетки оказывались менее чувствительны к имитирующему ишемию стрессу - они дольше контрольных ЭК сохраняли нормальную морфологию и неповрежденный актиновый цитоскелет. При имитирующем ишемию стрессе в толерантных ЭК не происходило перераспределения и грануляции HSP27 {рис. 6). Фракционирование клеток Тритоном Х-100 показало, что при истощении АТФ толерантные клетки сохраняют в Тритон-растворимой фракции значительно больше HSP27, чем контрольные. В толерантных ЗК при энергетическом голодании также подавлялось дефосфорилирование HSP27: через 2 часа истощения АТФ в клетках присутствовали все три фосфорилированные изоформы белка, а доля фосфорилированных изоформ HSP27 составляла 52,1% (рис. 4).

Измерения уровня АТФ и концентрации внутриклеточного свободного Са}* показали, что прекондиционирование ЭК тепловым шоком не предотвращало вызываемого ишемией падения АТФ (рис. 1) и роста [Саг*] (рис. 2), что сопоставимо с данными литературы. Так в ряде работ на опухолевых клетках было показано, что предварительно индуцированная термотоперантность (устойчивость к тепловому шоку) не замедляет падения клеточного АТФ при энергетическом голодании [Gabai and

Kabakov, 1993; Kabakovand Gabai, 1995; 1997].

В период восстановления ЭК после повышения температуры происходило накопление HSPs. Иммуноблоттингом было обнаружено появление индуцибельной формы HSP70Í уже через 6-9 часов после нагревания. В интервале времени, соответствующем периоду поздней защиты, содержание HSP70Í в клетках по сравнению с 9 часами после теплового шока было в 2,4+0,4 раза выше (по данным сканирования). Также в этот период в 1,9+0,3 раза был повышен уровень экспрессии HSP27, по сравнению с контрольным. Соотношение же в составе изоформ HSP27 через 18 часов восстановления соответствовало таковому в образцах нестрессированных клеток. Конец периода поздней толерантности (26-30 часов после прогрева) совпадал с полным исчезновением HSP70Í и уменьшением содержания HSP27 до начального уровня.

Чтобы ответить на вопрос, является ли повышенное содержание HSPs фактором, обусловливающим феномен поздней защиты, были использованы ингибиторы белкового синтеза циклогексимид и кверцетин. Антибиотик циклогексимид ингибирует трансляцию на эукариотических рибосомах (т. е. цитоплазматический синтез белков). Кверцетин является специфическим ингибитором транскрипции генов HSPs [Nagai et al. 1995]. Для обоих ингибиторов ранее было показано блокирование обусловленной индукцией HSPs защиты клеток от стрессов [Kabakov and Gabai, 1995;, Wang et al., 1996; Trautinger et al., 1995; Wishmeyer et al., 1997]. В нашем исследовании добавление ингибиторов в нетоксичных концентрациях (50 мкМ циклогексимид или 30 мкМ кверцетин) в среду культивирования ЭК после тепловой предобработки блокировало накопление HSP70Í и HSP27. При этом применение ингибиторов полностью отменяло сохранение нормальной морфологии клеток и нативной структуры актиновых филаментов, а также предотвращение грануляции HSP27 при истощении АТФ в ЭК'. Таким образом, накопление индуцибельных HSPs необходимо для появления поздней защиты.

В ряде работ показано, что ингибитор тирозиновых киназ гербимицин А (ГА) является "нестрессовым" индуктором HSPs. Он индуцирует экспрессию HSP70 в культуре опухолевых клеток человека [Murakami et al., 1991]. На различных клеточных линиях мышей показана индукция ГА целого ряда HSPs: HSP28, HSP70Í, HSP78, HSP90. При этом, предобработанные ГА мышиные клетки приобретают термотолерантный фенотип [Hegde et al., 1995], а индукция этим антибиотиком HSP70 в крысиных клетках миогенного происхождения защищает последние от имитирующего ишемию стресса [Morris et al., 1996; Conde et al., 1997]. В нашей работе инкубация ЭК в среде культивирования с ГА (1 мкг/мл) в течение 16-18 часов приводила к значительному накоплению HSP70Í, при этом уровень HSP27 не изменялся. Предобработанные таким образом клетки несколько отличались от контрольных по ответу на имитирующий

ишемию стресс, чуть дольше сохраняя нормальную морфологию и нативные стресс-фибриллы. Однако, наблюдаемый защитный эффект был гораздо слабее, чем в толерантных клетках. В отличие от толерантных ЭК, в клетках, предобработанных ГА, при энергетическом голодании происходило характерное перераспределение/грануляция HSP27. Избирательное повышение содержания HSP70Í в ЭК было также получено нами в результате вирусной трансфекции. Через 24 часа после трансфекции более 95% ЭК гиперэкспрессировали HSP70Í. При последующем проведении на таких культурах имитирующего ишемию стресса мы не обнаружили каких-либо отличий в морфологии клеток, разрушении цитоскелета и перераспределении/грануляции HSP27 по сравнению с неинфицированными ЭК или клетками, зараженными вирусом без гена HSP70L Наши результаты несколько расходятся с данными, полученными на других клеточных линиях, в которых продемонстрирована защита клеток гиперэкспрессированным HSP70Í от ишемии [Williams et al., 1993; Mesiril et al., 1994]. Тем не менее, они хорошо согласуются с нашими данными, полученными при повышении уровня HSP70Í "нестрессовым" индуктором HSP70Í ГА, и позволяют прийти к заключению, что для защиты ЭК от ишемии гиперэкспрессии одного только HSP70Í недостаточно.

Ингибиторы протеинфосфатаз защищают эндотелиапьные клетки при ишемическом стрессе in vitro.

Для обоих индуцируемых тепловым шоком периодов защиты было характерным сохранение пула F-актина при имитирующем ишемию стрессе и, вероятно, связанное с этим поддержание нормальной морфологии ЭК. Наблюдаемый защитный эффект не был обусловлен сохранением уровня АТФ в предобработанных тепловым шоком клетках (рис. 1). Также не было различий в росте внутриклеточного свободного Са2* в контрольных и толерантных ЭК в ходе метаболического стресса (рис. 2). В то же время, тепловое прекондиционирование в обеих фазах защиты подавляло дефосфорилирование HSP27 (рис. 4) и его перераспределение в ядро с образованием детергент-нерастворимых гранул (рис. 6). Такое ингибирование дефосфорилирования HSP27 могло блокировать образование им гранул в ядре, характерных для энергетически истощенных нетолерантных клеток и предотвращать разрушение актиновых филаментов. Для проверки этого предположения мы использовали ингибиторы протеинфосфатаз, которые могли бы блокировать дефосфорилирование HSP27 in vivo: 1) ортованадат Na (Na3V04), известный как ингибитор тирозиновых фосфатаз, и способный ингибировать фосфатазу 2А, блокируя ее дефосфорилирование, 2) окадаиковую кислоту, ингибирующую фосфатазы 1 и 2А и 3) кантаридин, описанный как более сильный ингибитор фосфатазы 2А [Cairns et al., 1994; Li and Casida, 1992]. Ингибиторы добавлялись в инкубационную

среду до и/или непосредственно во время метаболического стресса. Во всех случаях наблюдалась имитация поздних эффектов теплового шока: блокировалось дефосфорилирование (рис. 4) и грануляция (рис. 6) HSP27, а фракционирование неионным детергентом Тритоном Х-100 показало ослабление перехода HSP27 в детергент-нерастворимую фракцию.

Показательно, что параллельно с вызванным ингибиторами протеинфосфатаз подавлением дефосфорилирования/перераспределения HSP27 обнаруживалось замедление разрушения актинового цитоскелета. Через 2 часа ишемии /л vitro предобработанные ингибиторами протеинфосфатаз клетки сохраняли большую часть стресс-фибрилл, а содержание в них F-актина было выше, чем в контрольных ишемизированных ЭК (рис. 3,5). Поддержание целостности актинового цитоскелета ингибиторами фосфатаз сопровождалось более долгим сохранением нормальной морфологии клеток при имитирующем ишемию стрессе. Наши данные согласуются с результатами Armstrong и Ganóte (1992), полученными на крысиных кардиомиоцитах, обработанных окадаиковой кислотой, и демонстрирующими повышение выживаемости этих клеток при ишемическом стрессе.

Ранее показано, что использованные в нашей работе ингибиторы протеинфосфатаз не влияют на скорость падения АТФ в клетках при имитирующем ишемию стрессе (Armstrong and Ganóte, 1992]. Можно предположить, что защитный механизм действия ингибиторов фосфатаз при энергетическом голодании заключается в предотвращении дефосфорилирования HSP27, что, в свою очередь, опосредует сохранение целостности актинового цитоскелета и нормальной морфологии ЭК. Феномен толерантности предварительно прогретых ЭК к истощению клеточного АТФ, в свою очередь, может быть обусловлен предотвращением в толерантных клетках дефосфорилирования HSP27. Однако, не ясно, каким образом в толерантных ЭК при истощении АТФ сохраняется изоформный спектр HSP27 и подавляется его грануляция. Можно предположить, что теплозой шок запускает синтез некоего индуцибельного HSP -гипотетического ингибитора протеинфосфатаз. Этот HSP может действовать аналогично ингибиторам протеинфосфатазы 2А, предотвращая дефосфорилирование HSP27 и разрушение эктиноеого цитоскелета в лишенных АТФ ЭК. Можно предположить также, что индуцированный тепловым шоком гипотетический ингибитор фосфатаз (или ингибиторы фосфатаз) будет активироваться при падении АТФ и поддерживать киназно/фосфатазный баланс клетки, предотвращая несбалансированное дефосфорилирование клеточных белков, которое может быть критическим для актинового цитоскелета.

Остается также открытым вопрос: как фосфорилированный HSP27 защищает

микрофиламенты, не связываясь с ними. Падение АТФ и рост свободного Ca2* в клетке могут приводить к активации F-актин-разрезающих белков. Так известно, что способность Са2*-активируемого белка гельзолина разрезать актиновые филаменты может увеличиваться в энергетически истощенных клетках [Kühne et al., 1993; Laham et al., 1995]. Можно предположить, что фосфорилированный HSP27 инактивирует гельзолин (и/или другие актин-разрезающие белки). Возможно, также, что фосфорилированный HSP27 способствует быстрому доращиванию фрагментов F-актина в АТФ-истощенных клетках, предотвращая фатальное разрушение цитоскелета.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная in vitro модель ишемического повреждения эндотелиальных клеток сосудов человека.

2. Падение уровня АТФ в эндотелиальных клетках вызывает дефосфорилирование HSP27, а также перераспределение этого стресс-белка из цитоплазмы в ядра клеток и образование там крупных сферических гранул. Образование гранул в ядрах эндотелиальных клеток может служить in situ маркером длительного истощения АТФ.

3. Обнаружен ранний период индуцируемой тепловым шоком защиты эндотелиальных клеток от ишемического стресса, проведенного в пределах первых трех часов после теплового шока.

4. Поздний период защиты эндотелиальных клеток тепловым шоком совпадает со временем накопления HSPs, в частности HSP27 и HSP70. Ингибиторы синтеза белка отменяют защитный эффект теплового прекондиционирования. При этом, гиперэкспрессии одного только HSP70 не достаточно для защиты ЭК от ишемического повреждения.

5. Существует положительная корреляция между целостностью актиновых филаментов и поддержанием пупа фосфорипированного HSP27 в лишенных АТФ эндотелиальных клетках. Ингибиторы протеинфосфатаз, блокирующие дефосфорилирование HSP27 in vivo, предотвращают образование гранул HSP27 в ядрах, разрушение актинового цитоскелета и повреждение нормальной морфологии ЭК при ишемическом стрессе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Loktionova S.A., llyinskaya О.P., Gabai V.L., Kabakov A E. Distinct effects of heat shock and ATP depletion on distribution and isoform patterns of human HSP27 in endothelial cells // FEBS Letters.- 1996.-V. 392,- P. 100-104.

2) Loktionova S., Kabakov A., llyinskaya O., Tararak E. Heat preconditioning prevents disruption of actin microfilaments and granulation of HSP27 in human vascular endothelial cells undergoing simulated ischemia II J. Heart Failure - 1997.-V. 4,- P. 85.

3} Loktionova S., Kabakov A., llyinskaya O. Heat preconditioning of endothelial cells to simulated ischemia protects actin filaments: involvement of HSP27 //Atherosclerosis.- 1997,- V. 134,- P. 247.

4) Loktionova S., Bryantsev A., llyinskaya O., Tararak E., Kabakov A. Heat shock-induced actin reorganization in ischemia-stressed endothelial cells // Abstracts. Keystone symposia on Molecular and Cellular Biology (Endothelium). Lake Tahoe, USA, March 22-28 1998,- P. 99.

5) Loktionova S., Bryantsev A., llyinskaya O., Tararak E, Kabakov A. Heat preconditioning causes F-actin reorganization and attenuates HSP27 dephosphorylation in human endothelial

cells during simulated ischemia // Abstracts. Vascular Biology'98. San Francisco, USA, April 15-18 1998,- P. 25.

6) Loktionova S., Kabakov A., Bryantsev A., Ilyinskaya O. Suppression of HSP27 dephosphorylation in ATP-depleted endothelial cells stabilizes actin microfilaments II Abstracts, Molecular chaperones and the heat shock response. Cold Spring Harbor, USA, May 6-10 1998, P. 156.

7) Loktionova S.A., Kabakov A.E. Protein phosphatase inhibitors and heat preconditioning prevent HSP27 dephosphorylation, F-actin disruption and deterioration of morphology in ATP-depleted endothelial cells // FEBS Letters.-1998,- V. 433,- P. 294-300.

8) Loktionova S.A., Ilyinskaya O.P., Kabakov A.E. Early and delayed tolerance to simulated ischemia in heat-preconditioned endothelial cells: a role for HSP27 II Am. J. Physiol.- 1993 - V. 275. (in press).

Отпечатано в фотомножительной мастерской Геологического ф-та МГУ Тираж 7г?экз. Заказ № 16?